CN102012372A

CN102012372A - 利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法

Info

Publication number: CN102012372A
Application number: CN 201010538733
Authority: CN
Inventors: 赵冰; 丁兰; 郭志男; 王旭; 阮伟东; 宋薇; 徐蔚青
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2010-11-10
Filing date: 2010-11-10
Publication date: 2011-04-13
Anticipated expiration: 2030-11-10
Also published as: CN102012372B

Abstract

本发明涉及一种利用表面增强拉曼光谱技术在磁性印迹固定化基质上直接对药物分子进行检测的方法。本发明以Fe₃O₄为核分子、印迹聚合物为壳的具有核壳结构的纳米粒子，很好的将分子印迹技术和磁性分离技术结合到一起，进而可以达到对混合体系中的药物分子迅速高效的提取和分离的目的。并且应用表面增强拉曼光谱技术可以在不对印有药物分子的分子印迹聚合物做任何处理的前提下直接对印迹在该分子印迹聚合物固定基质上的药物分子进行原位的、高灵敏的检测，得到相关的光谱信息。本发明是将分子印迹技术、磁性分离技术和表面增强拉曼光谱技术这三种技术结合到一起，为药物分子的检测提供了一种高提取效率、分离简单、灵敏度高的方法。

Description

利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法

技术领域

本发明属于药物分子分析检测技术领域，特别涉及一种利用表面增强拉曼光谱技术在磁性印迹固定化基质上直接对药物分子进行检测的方法。

背景技术

很多药物分子以其广泛的抗菌作用和重要的经济价值被广泛应用于临床治疗和疾病的预防，抗生素的出现在人类的防病治病等方面起到了重要的作用，但也给人类带来了一定的危害，比如动物性食品中药物分子的残留，再比如植物性食品中药物分子的残留。因此，痕量药物分子的分析检测具有重要的意义。

分子印迹技术是一种制备对特定分子具有专一识别性能聚合物的技术，分子印迹聚合物对模板分子的识别具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性。并且，基于分子印迹技术制备的分子印迹聚合物具有亲和性和选择性高、抗恶劣环境能力强、稳定性好、使用寿命长、应用范围广等优点而在分离提纯、免疫测定、生物模拟、仿生传感以及痕量分析等领域显示出广阔的应用前景。

表面增强拉曼散射(SERS)光谱技术在研究药物分子组成结构方面具有独特的优势，其原位和实时检测以及极高的检测灵敏度等特点，给研究药物分子的结构和相互作用提供了诱人的解决方案。表面增强拉曼散射光谱技术与分子印迹技术和磁性分离定位技术等分析手段的联用不仅将在药物分子检测中发挥重要作用，而且会推动其他相关学科的发展。

与本发明相近的技术是2008年2月27日公开的中国专利“一种四环素分子印迹聚合物及其应用”，公开号CN101130580。该发明提供了一种四环素类药物分子印迹聚合物，由模板盐酸四环素分子、功能单体甲基丙烯酸、交联剂二甲基丙烯酸乙二醇酯、引发剂偶氮二异丁睛按照质量之比1～5∶2～10∶80∶0.1～0.5混合，再经原位聚合得到。本发明的四环素类药物分子印迹聚合物，对四环素类药物模板分子的立体结构具有“记忆”功能，对于残留分析样品溶液中的四环素、土霉素等四环素类药物分子具有高选择性分离富集的特性；用该发明四环素类药物分子印迹聚合物填装到聚丙烯外壳的小柱内，得到的四环素分子印迹固相萃取柱，比OasisHLB固相萃取柱更为简单、快速、高效，富集、净化效率更高。但是利用该方法无法实现直接对吸附到分子印迹分离介质上的分子进行分析的目的，必须用一定方法将吸附到分子印迹分离介质上的分子从分子印记介质上分离出来才能进行对该分子的后续分析。本专利能够很好的解决这一问题，可在印迹分离介质上直接对吸附在该介质上的分子进行分析和研究，不仅可以完成对待分析分子的从混合样品中的提取和分离，而且还可以得到该分子的结构信息，这样大大的节省对相关分子的提取、分离和检测的操作步骤，为以后药物分子的检测提供一种简便的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，这种方法主要是基于在印迹固定化基质上利用表面增强拉曼光谱直接对药物分子进行检测，并且将这种可以印迹药物分子的固定化基质与磁性纳米粒子相结合，可以达到对混合样中的药物分子实现快速提取和分离的目的。

本发明利用分子印迹技术对不同的药物分子进行印迹，由于分子印迹聚合物中所具有的功能单体的特定基团可以和药物分子之间发生一定的相互作用，再加上分子印迹聚合中所存有的孔洞与待印迹的药物分子的大小相配，导致了该分子印迹聚合物对待测的药物分子有很高的提取效率。将分子印迹技术和磁性分离技术结合在一起，可以大大简化对药物分子的提取分离过程。本发明制备出来了以Fe₃O₄为核分子印迹聚合物为壳的具有核壳结构的纳米粒子，很好的将分子印迹技术和磁性分离技术结合到一起，进而可以达到对混合体系中的药物分子迅速高效的提取和分离的目的。并且应用表面增强拉曼光谱技术可以在不对印有药物分子的分子印迹聚合物做任何处理的前提下直接对印迹在该分子印迹聚合物固定基质上的药物分子进行原位的、高灵敏的检测，得到相关的光谱信息。故本发明是将分子印迹技术、磁性分离技术和表面增强拉曼光谱技术这三种技术结合到一起，为药物分子的检测提供了一种高提取效率、分离简单、灵敏度高的方法。在药物分子的检测方面具有巨大的应用潜力，可为药物分子的研究提供新的检测手段。

本发明所述一种利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其步骤如下：(a)制备直径在20～400nm的Fe₃O₄纳米粒子，然后用油酸将其表面进行改性；(b)制备药物分子与功能单体的预组装溶液；(c)制备Fe₃O₄磁性印迹聚合物的预聚合溶液；(d)制备Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物；(e)洗脱掉制备出来的磁性分子印迹聚合物中的药物分子，并在50～80℃的真空干燥箱中干燥保存，得到干燥的粉末状分子印迹聚合物；(f)将洗脱掉药物分子的磁性分子印迹聚合物与需要检测的药物分子的水溶液混合，然后用磁铁将印有药物分子的磁性分子印迹聚合物分离出来；(g)将上步骤得到的印有药物分子的磁性分子印迹聚合物与银溶胶混合，然后再用磁铁将带有药物分子的磁性分子印迹聚合物和银溶胶的组装体分离出来，进行表面增强拉曼检测，将得到的拉曼谱图与标准谱图相对照，可实现对药物分子的检测。

上述步骤中，(a)步骤的Fe₃O₄是通过水热合成的方法合成的，合成出来的Fe₃O₄与油酸混合，使油酸分子包裹在Fe₃O₄纳米粒子的表面，对Fe₃O₄纳米粒子进行改性，然后用乙醇洗去多余的油酸；

步骤(b)的预组装溶液是将药物分子和功能单体按摩尔比1∶6～1∶10的比例溶解在水中，经过分子间氢键作用形成预组装体，功能单体可以是甲基丙烯酸，也可以根据待测印迹药物分子的需要改成4-乙烯吡啶或者4-乙烯苯基硼酸；

步骤(c)中制备Fe₃O₄印迹聚合物的预聚合溶液，是将表面油酸改性的Fe₃O₄纳米粒子、药物分子与功能单体的预组装溶液、交联剂混合后超声，所选的交联剂可以是二甲基丙烯酸乙二醇酯，也可以是二乙烯基苯，交联剂与功能单体的摩尔比是5∶1～2∶1，表面油酸改性的Fe₃O₄纳米粒子质量和交联剂体积的比为1g∶0.45mL～1g∶11.35mL；

步骤(d)中制备Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物，是将步骤(c)得到的预聚合溶液加入到含聚合反应引发剂偶氮二异丁氰和表面活性剂聚乙烯基吡咯烷酮的乙醇溶液中，其中交联剂、引发剂和表面活性剂的质量比为1∶0.05∶0.01～1∶0.2∶0.05，溶剂乙醇和交联剂的体积比为25∶1～50∶1，在温度为50～80℃有氮气保护的条件下使反应体系中的交联剂和功能单体一起发生自由基聚合反应，反应18～36小时后即得到磁性分子印迹聚合物，即将分子印迹聚合物包裹在磁性Fe₃O₄纳米粒子表面上，进而达到分子印迹技术和磁性分离技术相结合的目的；

步骤(e)洗脱合成出来的磁性分子印迹聚合物中的药物分子的方法是将磁性分子印迹聚合物经洗涤后加入到总体积80～150ml、乙酸和甲醇体积比为1∶2～1∶5的混合溶液中搅拌，通过破坏药物分子和功能单体之间的氢键相互作用，进而达到洗脱掉磁性分子印迹聚合物中的药物分子的目的，最后用磁铁将洗脱掉药物分子的磁性分子印迹聚合物从溶液中分离出来，洗涤后存放在50～80℃的真空干燥箱内，进而得到干燥的固体粉末状的样品；

步骤(f)是配制摩尔浓度为10^-3～10^-7摩尔每升的药物分子溶液，取0.01～0.10克经(e)步骤处理过的磁性分子印迹聚合物加入到1～5毫升药物分子溶液中混合10～30分钟，经此过程磁性分子印迹聚合物将溶液中的药物分子吸附到其具有功能单体的孔洞内，然后用磁铁将其从溶液中分离出来，洗涤除去磁性分子印迹聚合物表面残留的药物分子；

步骤(g)中所说的与银溶胶混合是将吸附有药物分子的磁性分子印迹聚合物浸泡到银溶胶中10～50分钟，此过程中磁性分子印迹聚合物和银溶胶中银纳米粒子的质量比为1∶0.1～1∶0.05，这样会使银纳米粒子物理吸附在印有药物分子的磁性分子印迹聚合物表面。

银溶胶是硝酸银溶液在微沸的状态下被柠檬酸钠还原制得的，银纳米粒子大多呈球形，平均粒径为70纳米。所用的光谱仪可以是共聚焦拉曼光谱仪，可采用激发光源的波长范围为400～1000纳米。

上述方法中所说的药物分子主要包括含有羧基类的药物分子，其中包括抗生素类药物，如金霉素、土霉素、四环素，还有环丙沙星等药物分子。具有羧基基团的这一类药物分子可以与分子印迹聚合中的功能单体之间，如甲基丙烯酸发生氢键作用，进而可以吸附到分子印迹聚合物中，达到被分子印迹聚合物提取的目的；

上述方法中步骤(f)中所说的药物分子溶液，也可以是药物分子的水溶液、药物分子的乙醇溶液，或是用一些其他的有机溶剂，如氯仿、甲醇等来溶解药物分子。

本发明在药物分子研究的高通量检测方面具有巨大的应用潜力，可为药物分子研究提供新的检测手段。本发明在检测动物性食物残留的药物分子和植物性食物中残留的药物分子有巨大的应用潜力，为痕量或单分子检测研究体系中的药物分子提供可能。

附图说明

图1：本发明所述的具有核壳结构的磁性分子印迹聚合物粒子透射电镜图；

图2：实施例1所述的从不同浓度的环丙沙星水溶液中提取出来的环丙沙星的表面增强拉曼光谱图。其中图的上半部分是磁性分子印迹聚合物在10-3～10-7摩尔每升的环丙沙星水溶液中提取出环丙沙星后所得到的表面增强拉曼谱图，下半部分是环丙沙星粉末的正常拉曼谱图。

从图1中可以看出合成出来的磁性分子印迹聚合物是具有核壳结构的纳米粒子，其中Fe₃O₄为核，分子印迹聚合为壳。从图2中可以看出这种方法的最低检测限可以达到10^-7摩尔每升。

具体实施方式

实施例1：对环丙沙星水溶液中的环丙沙星进行提取、分离和SERS检测

1)取3.24克六水和三氯化铁和8.64克无水乙酸钠溶解在120毫升乙二醇中，搅拌。待反应物充分溶解后装入反应釜中，在200摄氏度下进行水热合成反应8小时。然后将釜取出，用200毫升无水乙醇洗涤制备出来的直径为200纳米的Fe₃O₄三次，之后向洗涤后的Fe₃O₄加入2毫升油酸混合，对Fe₃O₄表面进行改性，混合10分钟后用50毫升乙醇将多余的油酸出去，便得到由油酸改性后的Fe₃O₄纳米粒子。

2)药物分子与功能单体的预组装溶液的制备，是将0.0736克(0.2毫摩)的环丙沙星溶于2毫升去离子水中，然后加入0.08毫升甲基丙烯酸混合，搅拌30分钟，进行环丙沙星和功能单体的预组装，得到预组装溶液。

3)磁性印迹聚合物的预聚合溶液的制备，是向步骤1)制得的表面改性过的Fe₃O₄纳米粒子中加入0.8毫升二甲基丙烯酸乙二醇脂，然后再加入步骤2)制得的预组装溶液，超声30分钟得到预聚合溶液。

4)将步骤3)得到的预聚合溶液加入到含有0.08克聚乙烯吡咯烷酮的200毫升乙醇中，然后加入0.002克偶氮二异腈，通N₂除O₂，以300转/分钟的转速搅拌，升温至60摄氏度进行聚合反应24小时，得到带有环丙沙星的磁性分子印迹聚合物。

5)制备出来的磁性分子印记聚合物的处理是借助磁铁的磁性分离来完成的。先用100ml甲醇洗涤步骤4)合成出来的带有环丙沙星的磁性分子印迹聚合物纳米粒子1次，再用去离子水洗涤5次，再用甲醇洗涤2次，然后将洗涤后的带有环丙沙星的磁性分子印迹聚合物纳米粒子加入到100毫升体积浓度为20％的乙酸的甲醇溶液中搅拌2小时。之后再分别用100毫升去离子水和甲醇洗涤两次。最后在60摄氏度的真空干燥箱中保存，得到干燥的固体粉末状的不带有环丙沙星的磁性分子印迹聚合物纳米粒子。其透射电镜为图1。

6)分别配制浓度为1×10^-3摩尔每升、1×10^-4摩尔每升、1×10^-5摩尔每升、1×10^-6摩尔每升、1×10^-7摩尔每升的环丙沙星水溶液，再分别取0.05克合成出来并处理过的磁性分子印迹聚合物加入到上述不同浓度的3毫升环丙沙星水溶液中对环丙沙星进行提取。然后用磁铁将再次印有环丙沙星分子的磁性分子印迹聚合物分离出来，分别依次用50毫升去离子水和50毫升乙醇洗涤磁性分子印迹聚合物表面残留的药物分子。

7)将步骤6)分离出来的印有环丙沙星的磁性分子印迹聚合物与2毫升质量浓度为1.14×10^-4克每毫升银溶胶混合，混合时间为20分钟，再利用磁铁将吸附有环丙沙星的磁性分子印迹聚合物分离出来，然后放在干净的玻璃片上直接进行拉曼光谱检测。所用的拉曼光谱仪是共聚焦拉曼光谱仪，检测采用的激发光源波长范围为400～1000纳米。最后得到SERS光谱，见图2。从该图中可以看出环丙沙星表面增强拉曼光谱的主要峰位可以和其正常粉末拉曼光谱的峰位相对应，并且从整个提取检测过程可以发现，随着被提取溶液的浓度下降，提取后印有环丙沙星的磁性分子印迹聚合物表面增强拉曼光谱的强度也随之减弱。从图2中可以看出这种方法的最低检测限可以达到10^-7摩尔每升。

Claims

1.利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其步骤如下：

(a)制备直径在20～400nm的Fe₃O₄纳米粒子，然后用油酸将其表面进行改性；

(b)制备药物分子与功能单体的预组装溶液；

(c)将表面油酸改性的Fe₃O₄纳米粒子、药物分子与功能单体的预组装溶液、交联剂混合后超声，制备Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物的预聚合溶液；

(d)制备Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物；

(e)洗脱掉制备出来的磁性分子印迹聚合物中的药物分子，并在50～80℃的真空干燥箱中干燥保存，得到干燥的粉末状Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物；

(f)将洗脱掉药物分子的粉末状Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物与需要检测的药物分子的溶液混合，然后用磁铁将印有药物分子的磁性分子印迹聚合物分离出来；

(g)将上步骤得到的印有药物分子的磁性分子印迹聚合物与银溶胶混合，然后再用磁铁将带有药物分子的磁性分子印迹聚合物和银溶胶的组装体分离出来，进行表面增强拉曼检测，将得到的拉曼谱图与标准谱图相对照，可实现对药物分子的检测。

2.如权利要求1所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：步骤(a)中的Fe₃O₄纳米粒子是通过水热合成的方法合成的，合成出来的Fe₃O₄与油酸混合，使油酸分子包裹在Fe₃O₄纳米粒子的表面，对Fe₃O₄纳米粒子进行改性，然后用乙醇洗去多余的油酸。

3.如权利要求1所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：步骤(b)的预组装溶液是将药物分子和功能单体按摩尔比1∶6～1∶10的比例溶解在水中，经过分子间氢键作用形成预组装体溶液。

4.如权利要求1或3所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：步骤(b)中的药物分子是金霉素、土霉素、四环素或环丙沙星；功能单体是甲基丙烯酸、4-乙烯吡啶或4-乙烯苯基硼酸。

5.如权利要求1所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：步骤(c)中交联剂是二甲基丙烯酸乙二醇酯或二乙烯基苯，交联剂与功能单体的摩尔比是5∶1～2∶1，表面油酸改性的Fe₃O₄纳米粒子质量和交联剂体积的比为1g∶0.45mL～1g∶11.35mL。

6.如权利要求1所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：步骤(d)中制备Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物，是将步骤(c)得到的预聚合溶液加入到含有引发剂偶氮二异丁氰和表面活性剂聚乙烯基吡咯烷酮的乙醇溶液中，其中交联剂、引发剂和表面活性剂的质量比为1∶0.05∶0.01～1∶0.2∶0.05，乙醇和交联剂的体积比为25∶1～50∶1；然后在温度为50～80℃有氮气保护的条件下使反应体系中的交联剂和功能单体一起发生自由基聚合反应，反应18～36小时后即得到Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物。

7.如权利要求1所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：步骤(e)洗脱掉制备出来的Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物中的药物分子的方法是将Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物加入到总体积80～150ml、乙酸和甲醇体积比为1∶2～1∶5的混合溶液中搅拌，通过破坏药物分子和功能单体之间的氢键相互作用，进而达到洗脱掉Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物中的药物分子的目的，最后用磁铁将洗脱掉药物分子的Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物从溶液中分离出来，存放在50～80℃的真空干燥箱内，进而得到干燥的粉末状Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物。

8.如权利要求1所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：步骤(f)是先配制摩尔浓度为10^-3～10^-7摩尔每升的药物分子的溶液，然后取0.01～0.10克经步骤(e)处理过的Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物加入到1～5毫升药物分子的溶液中，混合10～30分钟，经此过程Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物将溶液中的药物分子吸附到其具有功能单体的孔洞内，然后用磁铁将Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物从溶液中分离出来，洗涤除去Fe₃O₄磁性分子印迹聚合物表面残留的药物分子。

9.如权利要求8所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：药物分子的溶液是药物分子的水溶液、药物分子的乙醇溶液、药物分子的氯仿溶液或药物分子的甲醇溶液。

10.如权利要求1所述的利用磁性印迹表面增强拉曼光谱技术检测药物分子的方法，其特征在于：步骤(g)中所说的与银溶胶混合是将吸附有药物分子的磁性分子印迹聚合物浸泡到银溶胶中10～50分钟，吸附有药物分子的磁性分子印迹聚合物和银溶胶中银纳米粒子的质量比为1∶0.1～1∶0.05，使银纳米粒子物理吸附在印有药物分子的磁性分子印迹聚合物表面。