CN105929181A - 一种基于纳米材料的生物检材中海洛因的检验方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于纳米材料的生物检材中海洛因的检验方法。该方法包括分别制备纳米金复合材料和磁性纳米复合材料，并将它们与生物检材混合，通过检测混合液的紫外可见吸收光谱的强度变化，定性定量分析生物检材中海洛因的存在或其含量。本发明的纳米材料检验方法反应效率高、选择性好、环境适应性强、稳定性高，可达到国标中低限量的检测水平。
Description
技术领域
本发明属于毒品快速检测领域，具体涉及一种利用纳米材料检测生物检材中的海洛因。
背景技术
毒品泛滥已成为世界性严重的社会问题，与艾滋病、恐怖活动并列成为地球上人为的三大公害，同时毒品犯罪还是诱发其他犯罪的根源之一。根据近几年全球毒品报告的数据，全球吸毒人数从2009年的1.67亿增长到2012年的3.24亿，并呈现出低龄化趋势；2014年度《世界毒品报告》指出，毒品的市场正在扩大，生产量、缉获量和消费量均在增加，而新的市场更在发展之中。毒品种类以鸦片类、可卡因类、大麻类、苯丙胺类等为主，新精神活性物质种类激增。
现在常用的海洛因检测分析方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱法等，这些常用的仪器分析方法具有高准确度和高灵敏度的优点，但是往往需要昂贵的仪器设备、复杂的操作方法、较长时间的前处理过程，检测过程中使用的试剂污染环境，不适用于大规模的现场批量检测分析。因此目前一些快速的检测方法应运而生，如免疫层析法，但是这类方法只能进行定性检验，而不能进行定量检验，并且可检生物检材种类单一、检测灵敏度极为有限。
纳米材料的尺寸一般在1-100nm，其表面效应，量子尺寸效应，小尺寸效应等独特的物理效应使得纳米材料展现出普通材料难以比拟的光学，电学和磁学等性能，从而使纳米材料的研究成为分析技术研发领域中最具活力、最有潜力、研究内涵最丰富的一个分支。在众多纳米材料中，纳米金等纳米球由于具有优异的光学、电学等物理化学性质以及良好的生物相容性和易于进行表面修饰等特点，在分析化学领域得到广泛应用。紫外可见光谱中，纳米金所产生的吸收峰的位置与粒子之间的距离、颗粒大小和形状有关，且吸收峰的强度与溶液中纳米金的浓度存在定量关系。纳米金在聚集时发生颜色变化，可进行比色分析，但这个过程不稳定，聚集状态、颜色随着时间的变化而变化，因此检测稳定性不高。同时，纳米金对溶液pH值、溶液盐浓度等环境条件敏感，而唾液、尿液、血清等生物检材pH值因人而异，其中存在着大量的盐、蛋白质等，会导致纳米金聚沉，因此需要对纳米金进行修饰，提高其稳定性。纳米金的摩尔吸收系数高达，纳米金在开发定量分析方法方面具有独特的优势。该方法简单可行，经济高效并且绿色环保。
发明内容
本发明的目的是克服现有快速毒品检验技术的缺陷，利用纳米材料修饰提高其稳定性，并加入磁性纳米复合材料优化吸光峰强度与海洛因浓度的关系，提供一种简单、环保、经济、高效检测生物检材中海洛因的新方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于纳米材料的生物检材中海洛因的检验方法，该方法包括分别制备纳米金复合材料和磁性纳米复合材料，并将它们与生物检材混合，通过检测混合液的紫外可见吸收光谱的强度变化，定性定量分析生物检材中海洛因的存在或其含量。
进一步地，所述纳米金复合材料的制备方法为：将含有1％醋酸的0.2％ 壳聚糖溶液在95-100℃条件下加热，然后加入0.1M氯金酸溶液，搅拌反应10-20min，温度降至室温，继续搅拌10-30min，得纳米金溶液；将所述纳米金溶液调节至pH 7-9，加入2mg/mL海洛因牛血清白蛋白溶液在室温条件下振荡混合30-60min，生理盐水洗涤数次，再加入5％牛血清白蛋白溶液封闭纳米金表面60-120min，离心弃去上清液后，加入1/5原体积的生理盐水即得纳米金复合材料。
其中，优选地，所述含有1％醋酸的0.2％壳聚糖溶液与0.1M氯金酸溶液的体积比为1000:1-400:1(例如1000:1，900:1，800:1，700:1，600:1，500:1，400:1等)。所述纳米金溶液与海洛因牛血清白蛋白溶液的体积比为20:1-2:1(例如20:1，15:1，10:1，5:1，2:1等)。
在本发明中，所述壳聚糖既是还原剂，又是纳米金的稳定剂。
进一步地，本发明中所述磁性纳米复合材料的制备方法为：所述磁性纳米复合材料的制备方法为：在0.2mol/L三氯化铁、0.1mol/L硫酸亚铁溶液中通入氮气30min，加入28％氨水调节pH值至10，60-90℃条件下加热反应20-40min，然后离心弃去上清液，加入原体积的生理盐水得到磁性颗粒溶液；
再向所述磁性颗粒溶液中加入等体积的0.2％聚赖氨酸溶液，室温超声过夜，然后离心弃去上清液，加入生理盐水得到聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液，其中，所述生理盐水的加入量与加入的0.2％聚赖氨酸溶液的体积相等；
再向所述聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液中加入5％戊二醛溶液和10mg/mL抗海洛因抗体溶液，4℃下振荡反应60-120min，然后加入5％牛血清白蛋白溶液室温振荡反应30min(起封闭作用)，离心弃去上清液，加入1/10原聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液体积的生理盐水即得到磁性纳米复合材料。
其中，优选地，聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液与5％戊二醛溶液的体积比为500:1-200:1(例如500:1，400:1，300:1，200:1等)。所述聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液与抗海洛因抗体溶液体积比为100:1-10:1(例如100:1，90:1，80:1，70:1，60:1，50:1，40:1，30:1，20:1，10:1等)。所述抗海洛因抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
在本发明中，聚赖氨酸的使用起到了增加抗体修饰量和稳定磁性纳米材料的作用。
进一步地，上述检验方法中，所述纳米金复合材料、磁性纳米复合材料与生物检材混合后，在磁铁作用下搅拌反应2min，检测混合溶液的526nm处紫外吸收强度变化，定性定量分析生物检材中海洛因的存在或其含量。
在上述技术方案中，可以裸眼观察检验结果，所述反应溶液颜色为无色时，待测生物检材溶液中不含海洛因；上述反应溶液为浅红或红色时，生物检材中含有海洛因，其含量通过检测溶液在526nm处紫外吸收强度进行计算，吸收强度与生物检材中海洛因浓度成正比，依据工作曲线，检测混合溶液在526nm处紫外吸收强度，定量分析确定生物检材中海洛因的浓度。
本发明的设计原理和理论基础：
1、纳米金是指直径在1-100nm尺寸的微小金颗粒，有很高的消光系数和很强的表面等离子体共振性能，紫外可见吸收光谱的检测灵敏度很高，检验设备便携且廉价方便，易于在公安工作中推广应用。纳米金颗粒的特征等离子体吸收峰在510-550nm处，根据朗格比尔定律，吸收峰强度与纳米金颗粒浓度成正比。纳米金在颗粒大小、距离发生变化后其紫外吸收情况会发生变化且该过程后纳米金的吸收峰在数分钟内可能会发生吸收波长和强度的同时变化，相对不稳定。而上述单分散的纳米金溶液在室温下稳定，检验结果既可使用紫外可见吸收光谱仪检测，又可裸眼观察后再送到实验室进行仪器定量测试或者使用比色卡进行半定量检验。
2、磁性纳米材料具有超顺磁性质，同时通过聚赖氨酸的修饰，生物相容性好，其表面-NH2通过戊二醛与抗海洛因抗体结合，且聚赖氨酸修饰后磁性纳米颗粒不会与生物检材中蛋白质、多肽等物质发生非特异结合，使磁性纳米颗粒对海洛因具有特异性结合能力。同时，磁性纳米颗粒在磁铁的作用下，还可以在溶液中快速移动，可以克服唾液、尿液、血清、血浆等生物检材粘度不同而导致的反应速度差异，并提高免疫反应速度。在反应结束后，通过磁铁作用可以将发生免疫反应的磁性纳米复合材料、纳米金复合材料或者生物检材中的海洛因从溶液体系中快速分离出来，实现快速检验。
本发明的有益效果如下：
(1)通过不同性能纳米材料的组合使用，可以实现不同生物检材中海洛因的快速检验，本方法检验灵敏度高，最低检测限为10ng/mL，远高于目前海洛因现场检验500ng/mL的最低检测限。
(2)纳米金的光学性能，使检验结果可以通过裸眼观察、比色卡对照、紫外可见光谱检验等方式解读，并对检验结果报告时间没有严格要求，可以多次检验。检测方法简单、快捷，不需要借助复杂昂贵的大型仪器，成本低廉，适用于大规模的现场快速检测。
(3)本发明中磁性纳米材料的使用，提高了反应速度，缩短反应时间， 并在检验时，不需要额外溶液置换等过程，检验过程简单。
(4)本发明可以检验尿液、唾液、血清、血浆等生物检材，即使血液溶血、血尿或有色唾液，也不影响检验结果，检验特异性强，抗干扰能力强。
(5)本发明的检测结果具有可视化、选择性好、灵敏度高、检测时间短、成本低廉等优点。
另外注意的是，如果没有特别说明，本发明所记载的任何范围包括端值以及端值之间的任何数值以及以端值或者端值之间的任意数值所构成的任意子范围。
附图说明
图 1：基于纳米材料的海洛因检验工作曲线。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例对本发明做进一步的说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1纳米金复合材料的制备
取100mL含有1％醋酸的0.2％壳聚糖溶液盛放在圆底烧瓶中，加热至100℃保持沸腾并剧烈搅拌，迅速向剧烈沸腾的溶液中加入0.2mL 0.1M的氯金酸水溶液，搅拌后，停止加热，自然冷却至室温，取出10mL调pH值至7-9，然后与0.5mL 2mg/mL海洛因牛血清白蛋白在室温条件下振荡混合30-60min，生理盐水洗涤数次，离心弃去上清液后，加入2mL生理盐水即得纳米金复合材料。
实施例2纳米金复合材料的制备
取200mL含有1％醋酸的0.2％壳聚糖溶液盛放在圆底烧瓶中，加热至100℃保持沸腾并剧烈搅拌，迅速向剧烈沸腾的溶液中加入0.2mL 0.1M的氯金酸水溶液，搅拌后，停止加热，自然冷却至室温，取出5mL调pH值至7-9，然后与0.5mL 2mg/mL海洛因牛血清白蛋白在室温条件下振荡混合30-60min，生理盐水洗涤数次，离心弃去上清液后，加入1mL生理盐水即得纳米金复合材料。
实施例3磁性纳米复合材料的制备
取0.2mol/L三氯化铁、0.1mol/L硫酸亚铁混合溶液100mL中通入氮气 30min，加入28％氨水调节pH值至10，60-90℃下加热反应20-40min，然后8000rpm离心20min，弃去上清液后，加入100mL生理盐水得到磁性颗粒溶液，然后加入100mL 0.2％聚赖氨酸溶液，室温超声过夜，8000rpm离心20min弃去上清液后，加入100mL生理盐水复悬溶液。在上述溶液中加入0.5mL 5％戊二醛溶液和1mL 10mg/mL抗海洛因抗体溶液，4℃下振荡反应60-120min，然后加入5mL5％牛血清白蛋白溶液室温振荡反应30min，8000rpm离心20min，弃去上清液后，加入10mL生理盐水即得到磁性纳米复合材料。
实施例4磁性纳米复合材料的制备
取0.2mol/L三氯化铁、0.1mol/L硫酸亚铁混合溶液100mL中通入氮气30min，加入28％氨水调节pH值至10，60-90℃下加热反应20-40min，然后8000rpm离心20min，弃去上清液后，加入100mL生理盐水得到磁性颗粒溶液，然后加入100mL 0.2％聚赖氨酸溶液，室温超声过夜，8000rpm离心20min弃去上清液后，加入100mL生理盐水复悬溶液得到聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液。在上述溶液中加入0.2mL 5％戊二醛溶液和1mL 10mg/mL抗海洛因抗体溶液，4℃下振荡反应60-120min，然后加入5mL5％牛血清白蛋白溶液室温振荡反应30min，8000rpm离心20min，弃去上清液后，加入10mL生理盐水即得到磁性纳米复合材料。
实施例5样品测定
工作曲线的绘制：配制血清、唾液、尿液以体积比1:1:1混合的生物检材样本，添加1mg/mL的海洛因标准品溶液，分别配制海洛因浓度为0、10ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL的生物检材按照如下步骤处理，绘制工作曲线。取两份相同体积1mL生物检材，第一份加入0.5mL实施例1制备的纳米金复合材料和0.5mL实施例3制备的磁性纳米复合材料，第二份加入1mL生理盐水，磁铁上下作用搅拌2min后，将磁铁置于溶液液面上方，使用光谱仪测定两份溶液在526nm处吸光度之差，其中第一份溶液的吸光度为A1，第二份溶液的吸光度为A2，根据A1-A2的大小与海洛因浓度的关系绘制工作曲线(图 1)。工作曲线最低浓度是10ng/ml，对应吸光度之差在0.012。
样品测定：在离心管中分别取两份0.5mL待测尿液，第一份向其中各加入0.25mL实施例1制备的纳米金复合材料和实施例3制备的磁性纳米复合材料，第二份加入0.5mL生理盐水，磁铁上下作用搅拌2min后，将磁铁置于溶液液面上方，测定两份溶液526nm处吸光度之差A1-A2＝0.307，结合工作曲线(图 1)判定尿液检材中海洛因的浓度为795ng/mL。
实施例6样品测定
在离心管中分别取两份0.2mL待测唾液，一份向其中各加入0.1mL实施例2制备的纳米金复合材料和实施例4制备的磁性纳米复合材料，另一份加入0.2mL生理盐水，磁铁上下作用搅拌2min后，将磁铁置于溶液液面上方，测定两份溶液526nm处吸光度之差A1-A2＝0.103，结合工作曲线(图 1)判定唾液中海洛因的浓度为267ng/mL。
实施例7样品测定
在离心管中分别取两份1mL待测血清，一份向其中各加入0.5mL实施例1制备的纳米金复合材料和实施例3制备的磁性纳米复合材料，另一份加入2mL生理盐水，磁铁上下作用搅拌2min后，将磁铁置于溶液液面上方，测定两份溶液526nm处吸光度之差A1-A2＝0.721，结合工作曲线(图 1)判定血清中海洛因的浓度为1866ng/mL。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
Claims (9)
1.一种基于纳米材料的生物检材中海洛因的检验方法，其特征在于，该方法包括分别制备纳米金复合材料和磁性纳米复合材料，并将它们与生物检材混合，通过检测混合液的紫外可见吸收光谱的强度变化，定性定量分析生物检材中海洛因的存在或其含量。
2.根据权利要求1所述的检验方法，其特征在于，所述纳米金复合材料的制备方法为：将含有1％醋酸的0.2％壳聚糖溶液在95-100℃条件下加热，然后加入0.1M氯金酸溶液，搅拌反应10-20min，温度降至室温，继续搅拌10-30min，得纳米金溶液；
将所述纳米金溶液调节至pH 7-9，加入2mg/mL海洛因牛血清白蛋白溶液在室温条件下振荡混合30-60min，生理盐水洗涤数次，再加入5％牛血清白蛋白溶液封闭纳米金表面60-120min，离心弃去上清液后，加入1/5原体积的生理盐水即得纳米金复合材料。
3.根据权利要求1所述的检验方法，其特征在于，所述磁性纳米复合材料的制备方法为：在0.2mol/L三氯化铁、0.1mol/L硫酸亚铁溶液中通入氮气30min，加入28％氨水调节pH值至10，60-90℃条件下加热反应20-40min，然后离心弃去上清液，加入原体积的生理盐水得到磁性颗粒溶液；
再向所述磁性颗粒溶液中加入等体积的0.2％聚赖氨酸溶液，室温超声过夜，然后离心弃去上清液，加入生理盐水得到聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液，其中，所述生理盐水的加入量与加入的0.2％聚赖氨酸溶液的体积相等；
再向所述聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液中加入5％戊二醛溶液和10mg/mL抗海洛因抗体溶液，4℃下振荡反应60-120min，然后加入5％牛血清白蛋白溶液室温振荡反应30min，离心弃去上清液，加入1/10原聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液体积的生理盐水即得到磁性纳米复合材料。
4.根据权利要求2所述的检验方法，其特征在于，所述含有1％醋酸的0.2％壳聚糖溶液与0.1M氯金酸溶液的体积比为1000:1-400:1。
5.根据权利要求2所述的检验方法，其特征在于，所述纳米金溶液与海洛因牛血清白蛋白溶液的体积比为20:1-2:1。
6.根据权利要求3所述的检验方法，其特征在于，所述聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液与5％戊二醛溶液的体积比为500:1-200:1。
7.根据权利要求3所述的检验方法，其特征在于，所述聚赖氨酸修饰的磁性颗粒溶液与抗海洛因抗体溶液体积比为100:1-10:1。
8.根据权利要求3所述的检验方法，其特征在于，所述抗海洛因抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
9.根据权利要求1所述的检验方法，其特征在于，所述纳米金复合材料、磁性纳米复合材料与生物检材混合后，在磁铁作用下搅拌反应2min，检测混合溶液的526nm处紫外吸收强度变化，定性定量分析生物检材中海洛因的存在或其含量。
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