CN106066316A - 一种基于核壳型上转换发光标记与氧化石墨烯发光共振能量转移检测赭曲霉毒素a的方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于核壳型上转换发光标记与氧化石墨烯发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法，用于啤酒中赭曲霉毒素A(OTA)含量的检测。首先将核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料通过EDC/NHS反应偶联亲和素，再修饰生物素化赭曲霉毒素A适配体，制成核壳型能量供体探针；将能量供体探针先与OTA孵育，OTA适配体优先结合靶标OTA，然后加入氧化石墨烯，利用氧化石墨烯吸收光谱与核壳上转换发光纳米材料发光光谱重叠和吸附DNA的特性，与OTA结合的能量供体探针不会被GO吸附到表面，541nm处发光得以保留，从而实现对OTA的定量检测。线性范围为0.001‑250ng/mL，检出限为0.001ng/mL，本发明用于OTA检测具有灵敏度高、快速简便的优点，并应用于啤酒样品的检测，结果准确可靠。

Description

一种基于核壳型上转换发光标记与氧化石墨烯发光共振能量 转移检测赭曲霉毒素A的方法
技术领域
一种基于核壳型上转换发光纳米材料与氧化石墨烯发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法，涉及纳米材料和分析化学技术领域，用于对食品中赭曲霉毒素A进行检测。
背景技术
赭曲霉毒素A(Ochratoxins A，OTA)主要由纯绿青霉(Penicillium Verrucosum)、赭曲霉(Aspergillus achraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)三种真菌产生，由异香豆素连接到β-苯丙氨酸上的衍生物,其中OTA分子式为C20H18ClNO6,它是一种稳定的无色结晶化合物。由于OTA可以直接污染谷类、水果等农作物,人和动物通过摄入污染的植物性食物而吸收进入体内,同时也可因OTA在动物体内的蓄积作用而通过摄入动物性食物进入人体内。OTA具有较强的肝脏、肾脏和神经毒性和致畸、致癌、致突变作用，对人类身体健康和食品安全造成很大的危害。因此，建立准确、灵敏、快速的OTA检测技术对于食品安全具有重大意义。
赭曲霉毒素A的含量通常很低,所以检测手段要求较高,目前检测OTA的主要方法有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)等方法对其进行检测和分析。薄层层析法虽然方法简单,使用的试剂价格便宜,但是存在灵敏度较差,所需试剂繁多,检测周期长,重现性不好和无法实现自动化等缺点；而ELISA主要基于抗原抗体亲和反应，常用于OTA现场快速检测和大批量样品筛选。但抗体易受外界条件影响，而且抗体的制备需要经过动物或者细胞实验，繁琐费时，成本较高；而基于仪器的分析方法则需要大量的人力和财力投入，常常只用于实验室分析。所以开发一种快速方便，稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的新型检测方法是很有必要的。
核酸适配体(Aptamer)通过指数富集配体系统进化(systematic evolution ofligands by exponential enrichment，SELEX)技术从体外筛选得到的，能与相应配体专一性紧密结合的一类单链寡核苷酸序列。由于适配体与相应靶标结合具有较高的特异性和亲和力，靶分子范围广，体外筛选，分子较小，对温度不敏感，容易保存，生产技术及分子稳定性方面的优势可与抗体媲美，被广泛应用于临床诊断、临床治疗、药物运输、蛋白质组研究和食品安全中。
上转换发光纳米材料(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)是近年来备受关注的纳米材料之一，其发光机制是基于双光子或者多光子过程，是一种将红外光转变成可见光的有效途径。相对于传统的有机荧光染料和其他荧光纳米材料，上转换发光纳米材料作为完全惰性的无机发光材料具有很大的优势，光化学性质稳定，单色性强，具有较长的发光寿命，可以选择不同的基质材料和掺杂离子来调节上转换发光，真正实现单激发多发射，有利于生物体系中多组分标记同时检测。但是，限制上转换发光纳米材料进一步应用的关键是其较低的量子产率，通过包覆一层NaYF4基质可以很好地改善其表面缺陷，提高量子产率。鉴于上述优点，上转换发光纳米材料已成为一种优秀的生物标记材料被广泛的用于生物监测分析领域。
本发明首先制备了核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料，使其克服表面缺陷的缺点实现发光增强，利用氧化石墨烯(GO)在紫外可见光区有吸收能够与上转换的发光光谱实现重叠和能够吸附单链DNA的特点，将其作为能量受体，来猝灭上转换发光。核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换纳米材料修饰赭曲霉毒素A适配体之后作为能量供体，当能量供体探针先与赭曲霉毒素A进行孵育，适配体优先与OTA结合，加入GO之后，与OTA结合的能量供体探针不会被GO吸附到表面，部分发光得以保留，从而实现对OTA的定量检测。
发明内容：
一种基于核壳型上转换发光纳米材料与氧化石墨烯发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法：将核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料通过EDC/NHS反应偶联亲和素，利用亲和素和生物素之间的高亲和力偶联生物素化OTA适配体，利用GO在紫外可见光区有吸收和能够吸附单链DNA的特点，将能量供体探针先与OTA孵育，由于OTA适配体与OTA的特异性识别结合，OTA适配体优先结合靶标OTA，然后加入GO，与OTA结合的能量供体探针不会被GO吸附到表面，部分发光得以保留，从而实现对OTA的定量检测；步骤为：
(1)通过高温热解法技术，核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料，并对其做表面修饰。称取YCl3·6H2O，YbCl3·6H2O，ErCl3·6H2O(Ln:80mol％Y3+，18mol％Yb3+，2mol％Er3+；总共1mmol)加入到100mL三口烧瓶中，加入6mL油酸以及15mL 1-十八烯。在搅拌下，逐渐升温至160℃，待形成均一的溶液后，自然冷却至室温。准确称取2.5mmolNaOH和4mmol NH4F溶于10mL甲醇溶液中。将上述溶液缓慢加入到三口烧瓶中，磁力搅拌30min。再将溶液缓慢加热去除甲醇，氩气保护下加热到300℃，并且持续1h。反应结束后，自然冷却至室温，用水和乙醇离心所得材料清洗三次，储存备用，即为NaYF4:Yb0.18,Er0.02上转换发光纳米材料。
称取1mmoL YCl3·6H2O于三口烧瓶中，加入3mL OA以及17mL 1-ODE。磁力搅拌条件下，逐渐升高温度至160℃，待混合液形成均一的溶液后，自然冷却至80℃，加入NaYF4:Yb0.18,Er0.02上转换纳米颗粒环己烷溶液，待环己烷完全除去后，自然冷却到室温，加入10mL2.5mmol NaOH和4mmol NH4F甲醇溶液，混合搅拌30min后，缓慢蒸发甲醇，脱气后，将混合液加热至300℃，持续1h。反应结束后，自然冷却至室温，离心收集材料，用环己烷和乙醇清洗三次，储存备用，即为核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料。
(2)利用配体交换法对上转换发光纳米颗粒进行表面羧基化修饰。将10mL 1％聚丙烯酸(相对分子量2000)乙醇溶液和5mL 1％油酸修饰核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料氯仿溶液搅拌过夜，在7600×g下离心30min，离心收集材料，用乙醇和水清洗三遍，储存备用。
(3)利用EDC/NHS法将羧基化上转换发光纳米材料与亲和素(Avidin)偶联。称取5mg聚丙烯酸修饰的核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料分散于5mL10mmol/L MES(pH5.6)缓冲液中， 充分超声分散，加入0.6mL 2mg/mL EDC溶液和0.2mL2mg/mL NHS溶液，37℃摇床中活化2h。离心收集材料，用磷酸缓冲液清洗三次。然后分散于磷酸缓冲液中，加入1mL 0.5mg/mL亲和素溶液，在37℃摇床中反应12h。离心收集材料和上清，测定亲和素反应前后的紫外吸收。
(4)利用通过亲和素(Avidin)与生物素(Biotin)之间的特异性结合将表面修饰亲和素的核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料与生物素(Biotin)修饰的赭曲霉毒素A适配体DNA单链。具体方法为：将核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料分散于磷酸缓冲液中，加入一定量的生物素化OTA适配体，在37℃摇床中孵育12h，离心收集材料和上清，用磷酸缓冲液清洗三次，将最后得到的核壳型能量供体探针分散于BB缓冲液(10mM Tris，pH8.5，120mM NaCl，5mM KCl和20mMCaCl2)中。
(7)对赭曲霉毒素A标准品进行检测，建立标准曲线。利用氧化石墨烯(GO)在紫外可见光区有吸收能够与上转换的发光光谱实现重叠和能够吸附单链DNA的特点，将其作为能量受体。首先将0.5mg/mL能量供体探针与OTA在37℃下孵育2h，TA的特异性识别结合，OTA适配体优先结合靶标OTA，然后加入0.4mg/mL GO，与OTA结合的能量供体探针不会被GO吸附到表面，部分发光得以保留，从而实现对OTA的定量检测。根据发光保留值与对应的赭曲霉毒素A标准品浓度建立标准曲线，实验结果在0.001-250ng/mL区间内得到良好线性关系。
(8)对赭曲霉毒素A样品进行检测：对样品做简单的处理，随后直接加入到上述纳米复合物体系中37℃孵育70min后，直接在980nm激光下激发得到541nm处的上转换发光信号，从标准曲线中求得对应的赭曲霉毒素A的浓度。
本发明的优点是：
(1)利用适配体对被检测物质实现特异性捕获，有效提高了检测的稳定性和准确性。
(2)利用高温热解法制备了核壳型上转换发光纳米材料，改善了材料的表面缺陷，提高了材料量子产率，实现发光增强，有利于方法灵敏度的提高。
(3)利用激光诱导上转换发光，检测背景低大大提高了检测的灵敏度。
附图说明
图1：基于核壳型上转换发光纳米材料与氧化石墨烯发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法的实验原理图
图2：NaYF4:Yb0.18,Er0.02上转换发光纳米材料的电镜图(a)；核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料的电镜图(b)；聚丙烯酸修饰核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料的电镜图(c)
图3：NaYF4:Yb0.18,Er0.02上转换发光纳米材料和核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料的发光光谱
图4：核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料发光光谱(a)和氧化石墨烯紫外可见吸收光谱(b)的光谱重叠图
图5：核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料的XRD图
图6：上转换发光强度随赭曲霉毒素A变化叠加图(a)；赭曲霉毒素A检测标准曲线图(b)，浓度范围在0.001-250ng/mL。
具体实施方式
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或者局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。
实施例1：啤酒实际样品中赭曲霉毒素A检测标准曲线建立及检测样品预处理：啤酒样品置于4℃冰箱冷藏30min，超声脱气。取脱气后啤酒样品20g，置于25mL容量瓶中，加2％碳酸氢钠和15％氯化钠混合提取液至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过滤至澄清，收集滤液备用。
从本地超市购买5中不同类别的啤酒，利用本发明方法和酶联免疫方法分别测定其中赭曲霉毒素A的含量，结果见表一。两种方法检测结果一致，无明显差异。
表一：啤酒实际样品检测，本发明方法与ELISA方法对比
注：ND为未检出
实施例2：啤酒实际样品中赭曲霉毒素A的检测及加标回收率实验样品预处理同实施例1。
以实施例1得到的一种啤酒赭曲霉毒素A浓度数据为本底值，分别向其中加入9种不同浓度的OTA标准品，同样利用本发明方法再次检测其中OTA的含量，得到检测值。回收率％＝(检测值-本底值)/添加量×100％。从表二数据可以看到回收率在86.0％～110.0％，说明本发明稳定，灵敏，准确，适用于啤酒实际样品中OTA的检测。
表二：啤酒实际样品中赭曲霉毒素A的检测及加标回收率

Claims (1)

1.一种基于核壳型上转换发光纳米材料与氧化石墨烯发光共振能量转移检测赭曲霉毒素A的方法，其特征在于：核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料是裸核NaYF4:Yb0.18,Er0.02上转换发光纳米材料的发光强度的2.74倍；将赭曲霉毒素A(OTA)适配体与核壳型NaYF4:Yb0.18,Er0.02@NaYF4上转换发光纳米材料偶联形成核壳型能量供体探针，核壳型上转换发光纳米材料的发光光谱与氧化石墨烯(GO)的吸收光谱能有效重叠，因此利用氧化石墨烯作为能量受体探针；将核壳型能量供体探针先与OTA进行孵育，适配体优先与OTA结合；当加入GO之后，与OTA结合的核壳型能量供体探针不会被GO吸附到表面，未与OTA结合的核壳型能量供体探针在541nm处部分发光得以保留，在0.001-250ng/mL浓度内，OTA的浓度与541nm上转换发光信号变化呈正相关，建立标准曲线，从而实现对OTA的定量检测，该方法能够用于啤酒中OTA的检测。
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