CN101165487A - 利用纳米金磁微粒进行生物分子检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物检测领域，尤其是一种利用纳米金磁微粒进行生物分子检测的方法。其技术解决方案为：该方法包括以下步骤：1)生物分子的固定；2)封闭已固定的生物分子；3)目标分子的检测。本发明利用这种粒径在5～100nm的金磁微粒所具有特征吸收光谱的特点，以及基于金磁微粒具有外加磁场的可分离性、较好的单分散性、稳定性以及生物分子或者非生物分子在其表面快速修饰等特性，建立利用纳米金磁微粒进行生物分子检测的方法，通过待测物质与纳米金磁微粒表面固定的特定分子反应后表现出颜色的变化或者纳米金磁微粒特征吸收光谱的变化来辨别未知溶液中的成分，其具有快速、方便且检测结果准确的特点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其是一种利用纳米金磁微粒进行生物分子检测的方法。
背景技术
纳米技术在科技高速发展的今天，其应用领域日益广泛，纳米材料的光学性质用于生物分子的检测已逐渐走上科技的舞台。目前利用纳米金粒子的特征光学吸收、荧光物质的标记技术以及利用量子点的荧光特性对生物分子进行检测已有较多的报道，但其存在着纳米金粒子标记生物分子的不方便分离及荧光物质对生物分子标记条件的苛刻性，加之量子点的荧光波长与其粒径有关，以目前的工艺很难得到粒径和晶体缺陷均一的量子点，且量子点荧光寿命短、价格昂贵等缺陷。
组装型磁性复合微粒和核/壳型超顺磁性复合微粒的制备方法以及结构组成已经在中国专利ZL 03153486.4和ZL 03124061.5分别进行了公开，但未涉及纳米级磁性复合微粒的光学性质，也未涉及以该光学性质进行生物分子检测的方法。
发明内容
本发明为背景技术中存在的上述技术问题，而提供一种快速、方便且检测结果准确的利用纳米金磁微粒进行生物分子检测的方法。
本发明的技术解决方案是：本发明为一种利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特殊之处在于该方法包括以下步骤：
1)生物分子的固定；
1.1)取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；
1.2)反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子；
2)封闭：加入500μL～2mL的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分混匀20min～12h进行封闭；
3)目标分子的检测；
3.1)将固定好生物分子且已封闭的金磁微粒和待测溶液加入到偶联缓冲液中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；
3.2)反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，并将金磁微粒复合物保存在保存缓冲液中；
3.3)根据反应结果确定待测溶液是否含有待检测的目标分子。
上述步骤3.3)中是根据金磁微粒复合物的溶液最终呈现的颜色是否变化，是则待测溶液含有待检测的目标分子，否则待测溶液未含有待检测的目标分子。
上述步骤3.3)中是根据金磁微粒复合物溶液在光学仪器下观察特征吸收峰是否偏移，是则待测溶液含有待检测的目标分子，否则待测溶液未含有待检测的目标分子。
上述步骤3.3)后还包括步骤3.4)根据特征吸收峰的偏移量对照标准曲线确定目标分子的含量。
上述偶联缓冲液为pH7.0～8.0，5mM～0.08M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0，0.5～0.8×PBS缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的TE缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的TBS缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的STE缓冲液、pH9.0～11.0，5mM～0.08M的CBS缓冲液、pH3.6～5.6，5mM～0.08M的醋酸盐缓冲液、pH3.6～6.0，5mM～0.08 M的乙酸钠乙酸缓冲液、pH3.0～6.0，5mM～0.08M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.0，0.1～0.8×SSC缓冲液。
清洗缓冲液为上述偶联缓冲液或含0.02～2％吐温的上述偶联缓冲液
封闭剂为含有1-10％的牛血清白蛋白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清或山羊血清中的一种或多种成分的上述偶联缓冲液。
杂交缓冲液为：pH7.0～9.0的5～100mM的Tris-HCl，30～750mM的NaCl；
保存缓冲液为加入防腐剂0.01～0.1％的叠氮钠或0.01～0.1％的硫柳汞和保护剂0.05～1％BSA，0.05～1％的动物血清或蛋白酶抑制剂的上述偶联缓冲液。
上述纳米金磁微粒的粒径范围为5nm～100nm为佳。
上述光学仪器为紫外可见分光光度计或荧光分光光度计。
上述生物分子为蛋白或多糖。
上述生物分子为核酸时，所述步骤3.2)和步骤3.3)之间还包括有杂交步骤：将待测的核酸片段与表面已固定有与其杂交互补段的金磁微粒加入到杂交缓冲液中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器反应10～50min，充分杂交。
上述步骤1)至4)中优选的偶联缓冲液为：若偶联的生物分子为蛋白时选pH7.0～8.0，0.01mM～0.08M的Tris-HCl缓冲液或pH7.0～8.0，1～5×PBS缓冲液；若偶联的生物分子为多糖时选pH 5.0～6.0，0.008mM～0.08M的乙酸钠乙酸缓冲液；
优选的清洗缓冲液为：pH7.0～8.0，5mM～0.08M的STE缓冲液或1×PBST缓冲液；
优选的封闭剂为：含1～10％脱脂奶粉的上述偶联缓冲液；
优选的保存缓冲液为：加入防腐剂0.01～0.05％的叠氮钠和保护剂0.05～1％BSA的上述偶联缓冲液；
本发明利用这种粒径在5～100nm的金磁微粒所具有特征吸收光谱的特点，以及基于金磁微粒具有外加磁场的可分离性、较好的单分散性、稳定性以及生物分子或者非生物分子在其表面快速修饰等特性，建立利用纳米金磁微粒进行生物分子检测的方法，通过待测物质与纳米金磁微粒表面固定的特定分子反应后表现出颜色的变化或者纳米金磁微粒特征吸收光谱的变化来辨别未知溶液中的成分，其具有快速、方便且检测结果准确的特点。
附图说明
图1为不同粒径的纳米金磁微粒表现出不同的颜色及特有的超顺磁性的示意图；
图2为不同粒径的纳米金磁微粒的吸收光谱图；
图3为纳米金磁微粒及纳米金磁微粒偶联抗体及与待测生物分子反应后的吸收光谱图。
具体实施方式
参见图1，不同粒径的纳米金磁微粒会表现出不同的颜色及特有的超顺磁性。
参见图2，不同粒径的纳米金磁微粒的吸收光谱不同。
本发明的具体方法如下：
下面结合具体实施例本发明做进一步的详细说明
1.1)取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；
1.2)反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子；
2)封闭：加入500μL～2mL的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分混匀20min～12h进行封闭；
3)目标分子的检测；
3.1)将固定好生物分子且已封闭的金磁微粒和待测溶液混合，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；
3.2)反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，并将金磁微粒复合物保存在保存缓冲液中；
3.3)根据反应结果确定待测溶液是否含有待检测的目标分子，有两种方式判断：方式一：若金磁微粒复合物的溶液最终呈现颜色的变化，则待测溶液含有待检测的目标分子，否则待测溶液不含有待检测的目标分子。方式二将金磁微粒复合物的溶液在光学仪器下观察其特征吸收峰是否偏移，若发生偏移则待测溶液含有待检测的目标分子，否则待测溶液不含有待检测的目标分子。
3.4)根据特征吸收峰的偏移量对照标准曲线确定目标分子的含量。
以上生物分子为蛋白或多糖。
当生物分子为核酸时，步骤3.2)和步骤3.3)之间还应包括有杂交步骤：将待测的核酸片段与表面已固定有与其杂交互补段的金磁微粒加入到杂交缓冲液中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器反应10～50min，充分杂交。
上述偶联缓冲液为pH7.0～8.0，5mM～0.08M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0，0.5～0.8×PBS缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的TE缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的TBS缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的STE缓冲液、pH9.0～11.0，5mM～0.08M的CBS缓冲液、pH3.6～5.6，5mM～0.08M的醋酸盐缓冲液、pH3.6～6.0，5mM～0.08M的乙酸钠乙酸缓冲液、pH3.0～6.0，5mM～0.08M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.0，0.1～0.8×SSC缓冲液。
清洗缓冲液为上述偶联缓冲液或含0.02～2％吐温的上述偶联缓冲液
封闭剂为含有1-10％的牛血清白蛋白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清或山羊血清中的一种或多种成分的上述偶联缓冲液。
杂交缓冲液为：pH7.0～9.0的5～100mM的Tris-HCl，30～750mM的NaCl；
保存缓冲液为加入防腐剂0.01～0.1％的叠氮钠或0.01～0.1％的硫柳汞和保护剂0.05～1％BSA，0.05～1％的动物血清或蛋白酶抑制剂的上述偶联缓冲液。
光学仪器为紫外可见分光光度计或荧光分光光度计。
参见图3纳米金磁微粒及纳米金磁微粒偶联抗体及与待测生物分子反应后呈现不同的吸收光谱，曲线a为纳米金磁微粒的吸收光谱，曲线b为偶联抗体后的吸收光谱，曲线c为捕获目标分子后的吸收光谱。
实施例1
本实施例旨在阐明本发明中在金磁微粒表面固定抗体，再在外加磁场的操控下捕获待测目标分子，利用纳米金磁微粒光学性质的一种快速可视化直观的检测。
1、金磁微粒的预处理：取约50nm、500μL(500μg)的金磁微粒在磁分离器上进行磁分离，弃上清，用偶联缓冲液将其清洗2次并保存在偶联缓冲液中，并于紫外可见分光光度计上测定金磁微粒吸收峰的位置；
2、将抗体固定在金磁微粒的表面：将300μg人IgG加入在0.05M pH为7.4的Tris-HCl偶联缓冲液的金磁微粒中，置于37℃、150r/min的空气恒温振荡器中充分反应30min；
3、清洗：反应完毕后，在磁性分离器上分离3min，用1×STE清洗缓冲液500μL清洗两次，并于紫外可见分光光度计上测定金磁微粒吸收峰的位置；(以下简称清洗)
4、封闭：加入1mL 5％脱脂奶粉的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于37℃、150r/min的空气恒温振荡器中充分混匀30min进行封闭，用500μL 1 ×PBST清洗，并保存在保存缓冲液中；
5、目标分子的捕获：将含有羊抗人IgG的溶液和表面已固定有人IgG的金磁微粒加入到0.05M pH为7.4的Tris-HCl偶联缓冲液中，置于37℃、150r/min的空气恒温振荡器中充分反应30min，用500μL 1 ×PBST清洗，弃上清，保存在0.05M pH7.4(含0.05％NaN3)的PBS保存缓冲溶液中；
6、检测：当捕获目标分子后目视即可观察到约50nm金磁微粒的紫红色转变为紫蓝色，亦可在紫外可见分光光度计上测定金磁微粒吸收光谱的变化。
实施例2
本实施例旨在阐明本发明中在金磁微粒表面固定核酸，再在外加磁场的操控下与待测目标核酸片段杂交，利用纳米金磁微粒光学性质的一种快速可视化直观的检测。
1、金磁微粒的预处理：取约50nm、500μL(500μg)的金磁微粒在磁分离器上进行磁分离，弃上清，用偶联缓冲液将其清洗2次并保存在偶联缓冲液中，并于紫外可见分光光度计上测定金磁微粒吸收峰的位置；
2、将核酸固定在金磁微粒的表面：
2.1、取200μg鼠抗生物素抗体加入在0.05M pH为7.4的Tris-HCl缓冲体系的金磁微粒中，置于37℃、180r/min的空气恒温振荡器中充分反应40min；
2.2、清洗：反应完毕后，在磁性分离器上分离3min，用500μL 1×STE清洗缓冲液500μL清洗两次；(以下简称清洗)
2.3、再将2nM生物素标记的寡核苷酸和带有鼠抗生物素抗体金磁微粒加入到0.05M pH为7.4的PBS缓冲体系，置于37℃、150r/min的空气恒温振荡器中充分反应30min，反应完毕后，在磁性分离器上分离3min，用500μL 1×STE清洗缓冲液500μL清洗两次；
3、封闭：加入1mL 3％脱脂奶粉的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于37℃、150r/min的空气恒温振荡器中充分混匀30min进行封闭，用500μL 1×PBST清洗；
4、杂交：将表面固定有生物素标记的寡核苷酸的金磁微粒与待测目标核酸片段加入到pH7.4的0.05M的Tris-HCl，0.08M的NaCl的杂交缓冲液中，置于37℃、150r/min的空气恒温振荡器中充分反应40min，用500μL1×STE清洗，并保存在0.05M pH7.4并含0.05％NaN3的PBS保存缓冲溶液中；
5、检测：当捕获目标分子后目视即可观察到约50nm金磁微粒的紫红色转变为紫蓝色，亦可在紫外可见分光光度计上测定金磁微粒吸收光谱的变化。
实施例3
本实施例旨在阐明本发明中在金磁微粒表面固定多糖，再在外加磁场的操控下捕获待测目标分子，利用纳米金磁微粒光学性质的一种快速可视化直观的检测。
1、金磁微粒的预处理：取约50nm、5mL(5mg)的金磁微粒在磁分离器上进行磁分离，弃上清，用0.05M，pH6.0的乙酸钠乙酸偶联缓冲液将其清洗2次并保存在偶联缓冲液中，于紫外可见分光光度计上测定金磁微粒吸收峰的位置；
2、将多糖固定在金磁微粒的表面：将经修饰带有氨基100mM、1mL的甘露糖加入在0.05M，pH6.0的乙酸钠乙酸偶联缓冲液的金磁微粒中，置于室温、150r/min的空气恒温振荡器中充分反应5h；
3、清洗：反应完毕后，在磁性分离器上分离3min，用上述偶联缓冲液1mL清洗两次，并于紫外可见分光光度计上测定金磁微粒吸收峰的位置(以下简称清洗)；
4、封闭：加入1mL 5％脱脂奶粉的封闭剂到表面已固定有多糖的金磁微粒中，置于室温、150r/min的空气恒温振荡器中充分混匀60min进行封闭，用1mL 1×PBST清洗；
5、目标分子的捕获：将含有血凝素ConA的溶液和表面已固定有甘露糖的金磁微粒加入到0.05M pH为7.0的PBS偶联缓冲液中，置于室温、150r/min的空气恒温振荡器中充分反应过夜，清洗，并保存在0.05M pH7.0并含0.05％NaN3的PBS保存缓冲溶液中；
6、检测：当捕获目标分子后目视即可观察到约50nm金磁微粒的紫红色转变为紫蓝色，亦可在紫外可见分光光度计上测定金磁微粒吸收光谱的变化。
金磁微粒是指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面包覆单质金、银等贵金属壳层形成的磁性复合微粒，也指以磁性纳米粒子或磁性纳米粒子的聚集体为核，在核表面组装纳米金、银等贵金属粒子形成的磁性复合微粒。所述磁性纳米粒子包括Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子，单质Fe、Co、Ni粒子，或由Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子；磁性纳米粒子的聚集体是指经修饰后形成的Fe3O4、γ-Fe2O3等铁的氧化物粒子聚集体，经修饰后形成的单质Fe、Co、Ni粒子聚集体，或经修饰后形成的Fe与其它金属元素形成的正铁酸盐粒子聚集体。纳米金磁微粒因其具有特征的光学性质可被用于本专利发明的生物分子检测方法。
Claims (10)
1.一种利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：
1)生物分子的固定；
1.1)取金磁微粒，用偶联缓冲液平衡3次，将生物分子按20～500μg/mg金磁微粒的比例加入经平衡处理的金磁微粒中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；
1.2)反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，弃上清，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子；
2)封闭：加入500μL～2mL的封闭剂到表面已固定生物分子的金磁微粒中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分混匀20min～12h进行封闭；
3)目标分子的检测；
3.1)将固定好生物分子且已封闭的金磁微粒和待测溶液加入到偶联缓冲液中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器中充分反应10min～12h；
3.2)反应完毕，在磁性分离器上分离2～3min，用清洗缓冲液清洗，去除非特异性结合的分子，并将金磁微粒复合物保存在保存缓冲液中；
3.3)根据反应结果确定待测溶液是否含有待检测的目标分子。
2.根据权利要求1所述的利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：所述步骤3.3)中是根据金磁微粒复合物的溶液最终呈现的颜色是否变化，是则待测溶液含有待检测的目标分子，否则待测溶液未含有待检测的目标分子。
3.根据权利要求1所述的利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：所述步骤3.3)中是根据金磁微粒复合物的溶液在光学仪器下观察特征吸收光谱是否偏移，是则待测溶液含有待检测的目标分子，否则待测溶液未含有待检测的目标分子。
4.根据权利要求3所述的利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：所述步骤3.3)后还包括步骤3.4)根据特征吸收光谱的偏移量对照标准曲线确定待测目标分子的含量。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：所述偶联缓冲液为pH7.0～8.0，5mM～0.08M的Tris-HCl缓冲液、pH5.0～8.0，0.5～0.8×PBS缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的TE缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的TBS缓冲液、pH7.0～8.0，5mM～0.08M的STE缓冲液、pH9.0～11.0，5mM～0.08M的CBS缓冲液、pH3.6～5.6，5mM～0.08M的醋酸盐缓冲液、pH3.6～6.0，5mM～0.08M的乙酸钠乙酸缓冲液、pH3.0～6.0，5mM～0.08M的柠檬酸盐缓冲液、pH7.0～9.0，0.1～0.8×SSC缓冲液。
所述清洗缓冲液为上述偶联缓冲液或含0.02～2％吐温的上述偶联缓冲液
所述封闭剂为含有1-10％的牛血清白蛋白(BSA)、赖氨酸(Lys)、脱脂奶粉、乙醇胺、小牛血清或山羊血清中的一种或多种成分的上述偶联缓冲液。
所述保存缓冲液为加入防腐剂0.01～0.1％的叠氮钠或0.01～0.1％的硫柳汞和保护剂0.05～1％BSA，0.05～1％的动物血清或蛋白酶抑制剂的上述偶联缓冲液。
6.根据权利要求5所述的利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：所述纳米金磁微粒的粒径范围为5nm～100nm。
7.根据权利要求5所述的利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：所述光学仪器为紫外可见分光光度计，荧光分光光度计。
8.根据权利要求5所述的利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：所述生物分子为蛋白或多糖。
9.根据权利要求5所述的利用纳米金磁微粒进行生物分子成分检测的方法，其特征在于：所述生物分子为核酸时，所述步骤3.2)和步骤3.3)之间还包括有杂交步骤：将待测的目标核酸片段与表面已固定有与其杂交互补段的金磁微粒加入到杂交缓冲液中，置于20～40℃、50～220r/min的空气恒温振荡器反应10～50min，充分杂交。
10.根据权利要求5所述所用缓冲液或封闭剂，其特征在于：所述步骤1)至4)中优选的偶联缓冲液为：pH7.0～8.0，0.01mM～0.08M的Tris-HCl缓冲液；pH7.0～8.0，1～5×PBS缓冲液；pH5.0～6.0，0.008mM～0.08M的乙酸钠乙酸缓冲液；
优选的清洗缓冲液为：pH7.0～8.0，5mM～0.08M的STE缓冲液或1×PBST缓冲液；
优选的封闭剂：为含1～10％脱脂奶粉的上述偶联缓冲液；
优选的保存缓冲液：为加入防腐剂0.01～0.05％的叠氮钠和保护剂0.05～1％BSA的上述偶联缓冲液。
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