CN111929445A - 新型冠状病毒抗体的检测试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种新型冠状病毒抗体的检测试剂，属于病毒检测领域，尤其涉及GMR芯片检测技术在新冠病毒抗体检测中的应用。本发明的检测试剂包括His‑8标记的SARS‑Cov‑2免疫表位蛋白、抗人IgG/IgM抗体、超顺磁性磁珠；所述His‑8标记的SARS‑Cov‑2免疫表位蛋白或抗人IgG抗体被亲和分子A标记，超顺磁性磁珠被亲和分子B标记；所述亲和分子A和亲和分子B相互间可特异性结合。本发明的检测试剂中，His‑8标记的SARS‑Cov‑2免疫表位蛋白，结合抗体效率高，检测准确。

Description

新型冠状病毒抗体的检测试剂
技术领域
本发明属于病毒检测领域，尤其涉及GMR芯片检测技术在新冠病毒抗体检测中的应用。
背景技术
新型冠状病毒，简称“新冠病毒”，即SARS-Cov-2。
在新冠病毒疫情防控的检测过程中，除了直接检测病毒本身以外，还可以检测机体对病毒产生的抗体(大部分是IgG，也包括部分IgM)，病毒抗体水平高，则表明被检对象被病毒感染。
POCT(point-of-care testing)，指在采样现场进行的、利用便携式分析仪器及配套试剂快速得到检测结果的一种检测方式。POCT含义可从两方面进行理解：空间上，在患者身边进行的检验，即“床旁检验”；时间上，可进行“即时检验”。
目前市场上的POCT检测技术主要基于免疫层析技术富集靶标分子，再以胶体金或荧光试剂来进行检测。免疫层析要用到的层析膜本身存在孔隙大小、孔隙占比不均匀的问题，且膜的性质容易受到环境温度、湿度的影响，导致结果可重复性较差，影响结果的可信度。
GMR(Giant Magneto Resistance，巨磁阻)芯片无需借助层析膜，能很好的解决这一问题。
GMR芯片主要包括2部分：芯片内部的GMR传感器和外部的聚合物外壳，聚合物外壳可连接生物探针(核酸探针、抗体、抗原蛋白等)；以检测抗体为例，其检测的原理是：GMR芯片表面修饰抗原阵列，当待检测试液流过GMR 芯片表面，试液中具有与抗原特异性结合作用的IgG/IgM抗体时会被抗原阵列俘获，在芯片表面形成抗原抗体的结合体。此后再加入抗人IgG/IgM抗体 (简称“二抗”)，结合后，形成抗原-抗体-二抗的“三明治”结构，再加入表面修饰有特异性结合二抗的超顺磁性磁珠，结合到前述三明治结构(抗原和抗人IgG/IgM抗体可调换位置)。超顺磁性使得磁珠在磁场中表现出磁性而离开磁场后失去磁性。采用磁场等手段洗去未参与标记的多余磁珠，以减小背景噪声。最后，施加激励磁场磁化磁珠产生感应磁场，芯片中的GMR传感器能够检测磁珠的微弱感应场，传感器信号的强度和位置反应了样品中生物分子的浓度和类型。将依赖蛋白类探针(抗原/抗体作为生物探针，而非核酸探针)的GMR芯片用于检测抗体/抗原的技术平台也被成为“磁敏免疫平台”。
目前还没有检测新冠病毒抗体的GMR芯片检测试剂，更未见将“磁敏免疫平台”应用于新冠病毒抗体检测的报道。
发明内容
本发明要解决的问题是：提供一种新冠病毒SARS-Cov-2抗体的GMR芯片检测试剂。
本发明的技术方案如下：
一种SARS-Cov-2抗体的GMR芯片检测试剂，所述检测试剂包括His-8 标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白、抗人IgG和/或IgM的抗体、超顺磁性磁珠；
所述His-8标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白或抗人IgG抗体被亲和分子A标记，超顺磁性磁珠被亲和分子B标记；
所述亲和分子A和亲和分子B相互间可特异性结合。
如前述的检测试剂，所述SARS-Cov-2免疫表位蛋白为S1蛋白的RBD 段和N蛋白中的一种或两种。
如前述的检测试剂，所述亲和分子A为生物素，亲和分子B为链霉亲和素。
如前述的检测试剂，所述亲和分子B为生物素，亲和分子A为链霉亲和素。
His-8标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白用于制备SARS-Cov-2抗体的 GMR芯片检测试剂的用途；所述GMR芯片检测试剂还包括：抗人IgG和/ 或IgM的抗体，及超顺磁性磁珠；
所述His-8标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白或抗人IgG抗体被亲和分子A标记，超顺磁性磁珠被亲和分子B标记；
所述亲和分子A和亲和分子B相互间可特异性结合。
如前述的用途，所述SARS-Cov-2免疫表位蛋白为S1蛋白的RBD段和 N蛋白中的一种或两种。
如前述的用途，所述亲和分子A为生物素，亲和分子B为链霉亲和素。
如前述的用途，所述亲和分子B为生物素，亲和分子A为链霉亲和素。
术语“His-8”指8个组氨酸连接而成的短肽。
术语“His-8标记”指在蛋白的N端或C端通过肽键连接His-8。
本发明将His-8标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白用于捕获病毒抗体，相比使用未被His-8标记的病毒抗原蛋白捕获病毒，捕获效率更高，显著提高了 GMR芯片检测的灵敏度。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：本发明试剂盒的工作原理示意图。
图2：临床检测样品中IgG水平对比图；横坐标1.00为阴性样本，横坐标 2.00为阳性样本。
具体实施方式
实施例1新冠病毒抗体的检测试剂(工作模式如图1中模型1所示)
His-8标记的S1蛋白的RBD段(下文简称“His-8-RBD”)和His-8标记的N蛋白(下文简称“His-8-N”)均可合成或购买，生物素标记的鼠抗人IgG 抗体(和/或鼠抗人IgM抗体)，链霉亲和素标记的超顺磁性磁珠(磁颗粒)。
RBD段蛋白序列(SEQ ID NO.1)：
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG
N蛋白序列(SEQ ID NO.2)：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKF PRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWV ATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSS RGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKA YNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTY TGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADL DDFSKQLQQSMSSADSTQA
His-8-RBD和His-8-N在使用时固定在GMR芯片上。
检测原理：将GMR芯片表面的检测区固定新冠病毒免疫表位蛋白 (His-8-RBD和His-8-N)；样本溶液在驱动装置的作用下沿着微流体通道流经试剂冻干区，试剂冻干区储存着修饰有生物素的鼠抗人IgG抗体和鼠抗人 IgM抗体干粉，检测样本中的抗新冠病毒抗体会与鼠抗人IgG抗体和鼠抗人 IgM抗体结合，形成抗体-二抗复合物；溶液继续流动，到达检测区，分别与固定在芯片表面上的新冠病毒免疫表位蛋白进行结合。经过清洗液清洗芯片表面之后，表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米颗粒流入反应区，与生物素进行特异性结合，在GMR生物芯片表面上可以形成“新冠病毒免疫表位蛋白—新冠病毒IgG/IgM—抗人IgG/IgM抗体-生物素-链霉亲和素-磁颗粒”的链式结构。芯片表面的磁颗粒数量与新冠病毒IgG/IgM含量具有正相关性，通过检测磁信号大小，即可检测新冠病毒IgG/IgM含量。检测可在M16磁敏检测仪中进行，检测全程只需10min。
实施例2新冠病毒抗体的检测试剂(工作模式如图1中模型2所示)
带有生物素的His-8标记的S1蛋白的RBD段(下文简称“His-8-RBD”) 和His-8标记的N蛋白(下文简称“His-8-N”)，鼠抗人IgG抗体(和/或鼠抗人IgM抗体)，链霉亲和素标记的超顺磁性磁珠(磁颗粒)。
RBD段蛋白序列和N蛋白序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。
检测原理：将GMR芯片表面独立的检测区分别固定鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体；样本溶液(一滴血，约50μl)在驱动装置的作用下沿着微流体通道流经试剂冻干区，试剂冻干区储存着修饰有生物素的新冠病毒免疫表位蛋白(His-8-RBD和His-8-N)干粉，检测样本中的抗新冠病毒抗体会与新冠病毒免疫表位蛋白结合，形成抗体-抗原复合物；溶液继续流动，到达检测区，分别与固定在芯片表面上的鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM抗体进行结合。经过清洗液清洗芯片表面之后，表面修饰有链霉亲和素的磁性纳米颗粒流入反应区，与生物素进行特异性结合，在GMR生物芯片表面上可以形成“抗人IgG/IgM抗体—新冠病毒IgG/IgM—新冠病毒免疫表位蛋白-生物素 -链霉亲和素-磁颗粒”的链式结构。芯片表面的磁颗粒数量与新冠病毒 IgG/IgM含量具有正相关性，通过检测磁信号大小，即可检测新冠病毒IgG/IgM含量。检测可在M16磁敏检测仪中进行，检测全程只需10min。
为了进一步体现本发明的有益效果，公开如下实验例。
实验例1临床检测
对已经确诊新冠病毒感染的47例阳性样本，以及明确排除新冠病毒感染的37例阴性样本，使用实施例2的试剂进行检测。
检测结果得到47例阳性和37例阴性，与实际情况完全吻合。阳性样本和阴性样本之间的IgG水平具有极显著差异，如图2所示。
结论：本发明检测试剂准确度高。
在实验例1之前，发明人还做了仅仅使用His-8-RBD或His-8-N(择一) 作为免疫表位蛋白，借助GMR芯片检测新型冠状病毒抗体，其结果比同时使用His-8-RBD和His-8-N的准确度低(免疫表位蛋白总量相等)。
His-8标记对检测结果也有影响，发明人前期研究过程中没有对抗原加入 His-8标签，直接将RBD和N蛋白作为免疫表位蛋白，借助GMR芯片检测新型冠状病毒抗体，其结果也明显不如实施例1和2的准确度高。
综上，本发明的检测试剂准确度高，具有良好的应用前景。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 新型冠状病毒抗体的检测试剂
<130> GYKH1094-2020P0111483CCZ20JS018
<150> 202010359806.5
<151> 2020-04-29
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 227
<212> PRT
<213> 新型冠状病毒(SARS-Cov-2)
<400> 1
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1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
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Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
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195 200 205
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Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
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Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
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Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala

Claims (8)

1.一种SARS-Cov-2抗体的GMR芯片检测试剂，其特征在于：
所述检测试剂包括His-8标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白、抗人IgG和/或IgM的抗体、超顺磁性磁珠；
所述His-8标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白或抗人IgG抗体被亲和分子A标记，超顺磁性磁珠被亲和分子B标记；
所述亲和分子A和亲和分子B相互间可特异性结合。
2.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述SARS-Cov-2免疫表位蛋白为S1蛋白的RBD段和N蛋白中的一种或两种。
3.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述亲和分子A为生物素，亲和分子B为链霉亲和素。
4.如权利要求1所述的检测试剂，其特征在于：所述亲和分子B为生物素，亲和分子A为链霉亲和素。
5.His-8标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白用于制备SARS-Cov-2抗体的GMR芯片检测试剂的用途；所述GMR芯片检测试剂还包括：抗人IgG和/或IgM的抗体，及超顺磁性磁珠；
所述His-8标记的SARS-Cov-2免疫表位蛋白或抗人IgG抗体被亲和分子A标记，超顺磁性磁珠被亲和分子B标记；
所述亲和分子A和亲和分子B相互间可特异性结合。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述SARS-Cov-2免疫表位蛋白为S1蛋白的RBD段和N蛋白中的一种或两种。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述亲和分子A为生物素，亲和分子B为链霉亲和素。
8.如权利要求5所述的用途，其特征在于：所述亲和分子B为生物素，亲和分子A为链霉亲和素。
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