CN101706505A

CN101706505A - 一种磁性免疫检测方法

Info

Publication number: CN101706505A
Application number: CN200910238431A
Authority: CN
Inventors: 赖仙红; 官月平; 谢立; 刘刚; 戈莹
Original assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Current assignee: University of Science and Technology Beijing USTB
Priority date: 2009-11-20
Filing date: 2009-11-20
Publication date: 2010-05-12

Abstract

本发明涉及一种抗原(抗体)的磁性免疫检测方法。步骤包括(1)分别将抗体(抗原)偶联于磁性聚合物微球和微孔板表面；(2)将受检抗原(抗体)滴加到微孔板中；(3)清洗微孔板后再加入磁性聚合物微球；(4)再次清洗微孔板后将磁阻传感器的磁头伸入微孔板孔中，根据磁阻传感器的前后输出电压变化来确定微孔板表面上的磁性微球数量，进而确定病毒抗原(抗体)的有无及浓度。本方法具有检测步骤少、速度快、灵敏度和准确性高、成本低等特点。

Description

一种磁性免疫检测方法

技术领域

本发明涉及一种抗原(抗体)的免疫检测方法，特别涉及一种利用磁阻原理检测抗原(抗体)的磁性免疫检测方法。

背景技术

免疫检测技术是指利用免疫反应特异性的原理，建立各种检测与分析的技术。免疫反应是指抗原与抗体结合而发生的各种特异性反应。目前的免疫检测标记技术包括酶、胶体金、荧光和化学发光等技术。

酶免疫测定方法是20世纪70年代初发展起来的免疫学技术。酶免疫测定方法把酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来，达到对许多物质进行测定的目的。酶免疫测定方法是以酶标记抗原或抗体作为示踪物，由高活性的酶催化底物显色或发光的一种免疫学技术。酶免疫测定方法是目前国内外医学、生物、检疫、食品和环境等领域使用最为普遍的一种生化检测方法。

与本发明相关的酶联免疫检测法(参见A.Mortazavi et al./Food Control 19(2008)551-556)的操作过程为：测定时受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，根据呈色的深浅进行定性或定量分析。然而，采用酶标板作为固相载体，受检抗原与仅仅偶联于酶标板表面的抗体接触面积有限，导致了抗原-抗体结合效率不是很高，影响灵敏度；采用酶来标记抗原，而单个酶催化底物后显色不明显，不能被观察出来，故此法只能检测若干抗原而对单个抗原无能为力，也影响灵敏度。此外，酶价格昂贵，酶标仪复杂、笨重也是一大缺点。

与本发明相近的磁性分离酶联免疫检测法(参见《右江民族医学院学报》.Vol.20(4)，623-624，1998)用表面偶联有抗体的磁性聚合物微球代替传统酶联免疫检测技术中的酶标板，通过与待测抗原的免疫反应与酶联抗体结合，而后通过磁场分离出结合物，进行酶促反应显色，再利用特定酶标仪比色进行抗原的定性或定量检测。由于使用磁性聚合物微球作为固相分离载体，增大了载体表面抗体的偶联量，加快了免疫反应速度，反应后产物又比较容易磁性分离，与传统酶联免疫方法相比，在一定程度上提高了检测的灵敏度，但是，这种方法仍然采用酶促底物显色来标记，检测灵敏度难以大幅度提高，而且，复杂的酶标仪问题也没有解决。

发明内容

本发明的目的就是针对上述酶联免疫检测法灵敏度不高、检测步骤繁琐、酶价格昂贵、酶标仪复杂笨重等缺陷，提出了一种全新的磁性免疫检测法。其核心是取消酶联免疫检测技术中的“酶标记和酶显色检测技术”，代之以新的“磁性标记和磁性检测技术”，磁性微球兼具分离载体和磁性标记的双重功能。

本发明的目的通过以下主要技术方案实现：

本发明包括磁性聚合物微球、微孔板与磁阻传感器表面抗体(抗原)的偶联，抗原抗体之间的特异性反应，以及磁阻传感器对磁性聚合物微球和受检抗原(抗体)浓度的确定等步骤，主要包括以下两个方案。

方案一，具体步骤如下：

1)在磁性聚合物微球表面偶联抗体(抗原)；

2)在微孔板表面偶联抗体(抗原)；

3)将含受检抗原(抗体)的血清样本滴加到微孔板中，抗原与抗体发生特异性反应；

4)用缓冲液充分清洗微孔板，将未与微孔板中抗体(抗原)结合的抗原(抗体)去除；

5)将磁性微球滴加到微孔板中，抗原与抗体发生特异性反应；

6)用缓冲液充分清洗微孔板，将未与微孔板表面结合的磁性微球去除；

7)将合适的磁阻传感器的磁头伸入微孔板中，根据传感器前后输出电压变化确定磁性微球的有无及浓度，进而确定抗原(抗体)的有无及浓度。

方案二，将磁阻传感器的磁头直接偶连抗体(抗原)，取代微孔板，具体步骤如下：

1)在磁性聚合物微球表面偶联抗体(抗原)；

2)选择合适的磁阻传感器，并在其磁头表面偶联抗体(抗原)；

3)将受检抗原(抗体)的血清样本滴加到磁阻传感器磁头表面，抗原与抗体发生特异性反应；

4)用缓冲液充分清洗磁阻传感器磁头，将未与磁阻传感器磁头表面抗体(抗原)结合的抗原(抗体)去除；

5)将磁性微球滴加到磁阻传感器磁头表面，抗原与抗体发生特异性反应；

6)用缓冲液充分清洗磁阻传感器磁头，将未与磁阻传感器磁头表面结合的磁性微球去除；

7)根据磁阻传感器前后输出电压变化确定磁性微球的有无及浓度，进而确定抗原(抗体)的有无及浓度。

在方案一步骤2中所述的微孔板也可以为其它类似的带凹孔的固相载体替代。

所述的聚合物是一种亲油性烯类单体形成的聚合物，如苯乙烯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯或醋酸乙烯酯等。

所述的磁阻传感器是指利用磁阻效应原理工作的传感器，如巨磁阻传感器、隧道磁电阻传感器、各向异性磁电阻传感器或磁通门传感器等。

所述的抗原或抗体包括丙肝、甲肝、乙肝、艾滋病、禽流感、SARS或性病等对应的抗原或抗体。

在上述方案二的步骤3中，还可以将受检抗原或抗体的血清样本滴加到磁性微球溶液中，使抗原与抗体发生特异性反应；

在上述方案二的步骤4中，通过磁性分离，将未与磁性微球表面抗体或抗原结合的抗原或抗体去除；

在上述方案二的步骤5中，将磁阻传感器的磁头伸入磁性微球溶液中，使抗原与抗体发生特异性反应.

本发明的优点在于：检测灵敏度和准确性提高；检测步骤减少，检测速度明显加快；成本大大降低，有望实现便携化。

附图说明

附图1：本发明磁性免疫检测法方案一的操作示意图，

附图2：本发明磁性免疫检测法方案二的操作示意图。

其中

1抗体、2受检抗原、3磁阻传感器、4磁性微球、5微孔板。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的描述：

图1是本发明磁性免疫检测法方案一的操作示意图，如图所示，从左向右操作步骤依次为：

1)在微孔板表面偶联抗体1；

2)制备含受检抗原2的血清样本

3)将上述受检抗原2的血清样本滴加到微孔板5中，抗原2与抗体1发生特异性反应后清洗微孔板；

4)在磁性聚合物微球4表面偶联抗体1；

5)将磁性微球4滴加到微孔板5中，抗原与抗体发生特异性反应后清洗微孔板；将合适的磁阻传感器3的磁头伸入微孔板5中，确定抗原的有无及浓度。

图2是本发明磁性免疫检测法方案二的操作示意图。如图所示，从左向右操作步骤依次为：

1)选择合适的磁阻传感器3，并在其磁头表面偶联抗体1；

2)制备含受检抗原2的血清样本；

3)将受检抗原2的血清样本滴加到磁阻传感器3的磁头表面，抗原与抗体发生特异性反应后清洗磁头；

4)在磁性聚合物微球4表面偶联抗体1；

5)将磁性微球4滴加到磁阻传感器3的磁头表面，抗原与抗体发生特异性反应后清洗磁头，根据磁阻传感器3前后输出电压变化确定磁性微球4的有无及浓度，进而确定抗原的有无及浓度。

实施例1.

预先在表面氨基化的磁性甲基丙烯酸甲酯微球上偶联好丙肝抗体，在微孔板内表面上也偶联好丙肝抗体。将50uL一定浓度含丙肝抗原的血清样本加入到微孔板中，37℃反应5min，用0.02MPBST(Tween20，0.5％)洗5次，洗去未与微孔板上丙肝抗体反应的丙肝抗原。加入20uL偶联有丙肝抗体的磁性甲基丙烯酸甲酯微球溶液(浓度为35mg/mL)，37℃反应5min，用0.02MPBST(Tween20，0.5％)洗5次，洗去未与微孔板结合的磁性微球。将中山大学自行研发的巨磁阻生物传感器的磁头伸入微孔板中，根据巨磁阻生物传感器的前后输出电压变化确定微孔板表面上磁性微球的有无及浓度，从而确定丙肝抗原的浓度。

实施例2.

预先在表面氨基化的磁性丙烯酸甲酯微球上偶联好甲肝抗体，在隧道磁电阻传感器磁电阻膜面上也偶联好甲肝抗体。用微量进样器抽取3滴(约0.9uL)一定浓度含甲肝抗原的血清样本滴加到传感器磁电阻膜面上，37℃反应5min，用0.02MPBST(Tween20，0.5％)洗5次，洗去未与膜面上甲肝抗体反应的甲肝抗原。再用微量进样器抽取3滴(约0.9uL)磁性丙烯酸甲酯微球溶液(浓度为30mg/mL)，滴加到传感器磁电阻膜面上，37℃反应5min，用0.02MPBST(Tween20，0.5％)洗5次，洗去未与膜面上甲肝抗体偶联的磁性微球。根据隧道磁电阻传感器前后输出电压变化确定磁电阻膜面上磁性微球的有无及浓度，从而确定甲肝抗原的浓度。

实施例3.

预先在表面氨基化的磁性聚苯乙烯微球上偶联好乙肝抗体，在中山大学自行研发的巨磁阻生物传感器磁头表面也偶联好乙肝抗体。将50uL一定浓度含乙肝抗原的血清加入到20uL偶联有乙肝抗体的磁性聚苯乙烯微球溶液中(浓度为40.5mg/mL)，37℃反应5min，磁性分离掉未与磁性微球表面上乙肝抗体反应的乙肝抗原。将磁阻传感器的磁头伸入磁性微球溶液中，37℃反应5min，用0.02MPBST(Tween20，0.5％)洗5次，洗去未与磁头表面上丙肝抗体偶联的磁性微球。根据巨磁阻生物传感器的前后输出电压变化确定磁头表面上的磁性微球的有无及浓度，从而确定乙肝抗原的浓度。

Claims

1.一种磁性免疫检测方法，其特征在于包括步骤：

1)在磁性聚合物微球表面偶联抗体或抗原；

2)在微孔板表面偶联抗体或抗原；

3)将含受检抗体或抗原的血清样本滴加到微孔板中，抗原与抗体发生特异性反应；

4)用缓冲液充分清洗微孔板，将未与微孔板中抗体或抗原结合的抗原或抗体去除；

7)将合适的磁阻传感器的磁头伸入微孔板中，根据传感器前后输出电压变化确定磁性微球的有无及浓度，进而确定抗原或抗体的有无及浓度。

2.按权利要求1所述的磁性免疫检测方法，其特征在于：

在步骤2中，选择磁阻传感器替代所述的微孔板，并在所述磁阻传感器的磁头表面偶联抗体或抗原；

在步骤3中，将受检抗原或抗体的血清样本滴加到所述磁阻传感器磁头表面；

在步骤4中，用缓冲液充分清洗所述磁阻传感器磁头，将未与磁阻传感器磁头表面抗体或抗原结合的抗原或抗体去除；

在步骤5中，将磁性微球滴加到所述磁阻传感器磁头表面；

在步骤6中，用缓冲液充分清洗所述磁阻传感器磁头，将未与所述磁阻传感器磁头表面结合的所述磁性微球去除；

在步骤7中，根据所述磁阻传感器前后输出电压变化确定所述磁性微球的有无及浓度，进而确定抗原或抗体的有无及浓度。

3.按权利要求1所述的磁性免疫检测方法，其特征在于，步骤2中所述的微孔板为带凹孔的固相载体。

4.按权利要求1或2所述的磁性免疫检测方法，其特征在于，所述磁性聚合物是一种亲油性烯类单体形成的聚合物。

5.按权利要求4所述的磁性免疫检测方法，其特征在于，所述的亲油性烯类单体形成的聚合物为苯乙烯、丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯或醋酸乙烯酯。

6.按权利要求1或2所述的磁性免疫检测方法，其特征在于，所述的磁阻传感器是指利用磁阻效应原理工作的传感器。

7.按权利要求1或2所述的磁性免疫检测方法，其特征在于，所述的传感器为巨磁阻传感器、隧道磁电阻传感器、各向异性磁电阻传感器或磁通门传感器。

8.按权利要求1或2所述的磁性免疫检测方法，其特征在于，所述的抗原或抗体包括丙肝、甲肝、乙肝、艾滋病、禽流感、SARS或性病对应的抗原或抗体。

9.按权利要求2所述的磁性免疫检测方法，其特征在于：

在步骤3中，将受检抗原或抗体的血清样本滴加到磁性微球溶液中，使抗原与抗体发生特异性反应；

在步骤4中，通过磁性分离，将未与磁性微球表面抗体或抗原结合的抗原或抗体去除；

在步骤5中，将磁阻传感器的磁头伸入磁性微球溶液中，使抗原与抗体发生特异性反应。