CN106365207A - 丙型肝炎病毒超灵敏磁性纳米检测技术 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种对磁性Fe3O4纳米微球表面功能化处理的方法，以产生活性基团与丙型肝炎(HCV)抗体偶联，构建了一种简单、低廉、方便的高灵敏度新型HCV病毒检测技术。采用悬浮乳液聚合法合成超顺磁性聚丙烯酸甲酯微球，在微球表面修饰了羧基并偶联了丙肝抗体，该偶联后的磁珠富集丙肝病毒的效率是94.50％。本发明提供了一种免疫磁珠结合荧光PCR检测丙型肝炎病毒的方法，属于卫生检疫领域。
Description
技术领域
本发明涉及针对丙肝病毒检测方面的重大需求，利用磁性Fe3O4纳米微球用表面高分子化学反应等方法构建超顺磁性聚合物纳米球并对微米球表面功能化产生活性基团，通过与丙型肝炎(HCV)抗体偶联对其微球表面进行生物修饰，构建了一种简单、低廉、方便的高灵敏度新型HCV血清中病毒的检测技术。属于检验检疫领域。
背景技术
丙型肝炎是由丙肝病毒(HCV)引起的一种全球性传染病，全世界大约有1％的普通人群感染。丙型肝炎病毒(HCV)慢性感染可导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC)，对患者的健康和生命危害极大，已成为严重的社会和公共卫生问题。
面对巨大的人员、货物通关量和多种有害病毒快速、准确检测的重大需求，传统的检测手段已不能满足要求。提升出入境口岸检测的科技含量，发展新技术和新手段实现口岸对多种有毒有害物质快速、灵敏检验，以达到有效地拒其于国门之外的目的，是全国人民交给科技工作者的一个迫切任务。磁分离技术是指通过外磁场的作用，将体系中的磁性物质与非磁性物质分离开来，磁性物质能够对外磁场做出响应，便于操控，构成了磁分离技术的基础。利用外磁场操控磁性物质或者磁性标记的生物体，从而实现样品处理、分离纯化和检测鉴定的高度集成的新型分析技术的发展受到人们的广泛关注。磁分离技术因具有高效、快速、非玷污、集分离及富集于一体等诸多优点而应用于核酸提取、基因测序、细胞分离、免疫分析、固定化酶、手性分离等生命科学研究的重要领域。生物磁分离技术的发展趋势是微型化、平行化和自动化，其核心问题在于制备出粒径大小均匀、分散性好、磁性强和制备简便的磁性微球，以保证生物分离过程的高效性、重现性和可控性。
磁性纳米粒子通常可以分为铁氧化合物(Fe3O4和Y-Fe2O3)、纯金属(Fe和Co)、尖晶石型铁磁体(MgFe2O4、MnFe2O4和CoFe2O4)以及合金(CoPt3和FePt)。金属及合金的纳米粒子具有良好的结构和磁学性能，但其磁学性能会由于金属及合金的氧化而改变，除此之外，其明显的毒性也使得其不适用于在活体内的应用。人体内含有铁离子，氧化铁在体内也可以顺利代谢，不会产生蓄积毒性，所以铁氧化合物(Fe3O4和Y-Fe2O3)相对于金属及合金的磁性纳米粒子更广泛地应用在生物医学活体实验中，并处在临床应用的不同试验期。因纳米材料和器件具有独特的物理化学性质，其巨大的比表面积，特异的反应活性和纳米效应，使其大异于传统的材料，因此在发展高灵敏度、高选择性检测技术和传感手段方面具有无穷的潜力，将是解决这一问题的有力武器。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是利用磁性Fe3O4纳米微球用表面高分子化学反应等方法构建超顺磁性聚合物纳米球并对微米球进行表面功能产生活性基团。
本发明要解决的第二个技术问题是与丙型肝炎(HCV)抗体偶联对其微球表面进行生物修饰，构建了一种简单、低廉、方便的高灵敏度新型HCV血清中病毒的检测技术。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种采用悬浮乳液聚合法合成了超顺磁性聚丙烯酸甲酯微球，并对微米球进行表面功能产生活性基团，其步骤如下：
采用共沉淀法合成油酸包覆的磁流体。将n(Fe2+)∶n(Fe3+)＝1∶2的铁盐水溶液置于80度水浴中，加入醋酸，接着滴加一定量的氨水，恒温反应后，经30min去离子水反复清洗得到黑色的Fe3O4块状凝胶。
聚丙烯酸甲酯微球的制备和表面化学修饰用文献的方法进行。将2g磁流体溶入9ml丙烯酸甲酯中，加入DVB，制成油相。将油相加入到浓度为2％的PVA溶液中，超声分散后倒入装有机械搅拌器的三口烧瓶中，加入1gBPO，调节转速，于60℃反应2h，升温至60℃，反应4h。反应结束后，磁分离所得磁性高分子微球，用乙醇和去离子水反复洗涤多次，真空干燥。于120℃搅拌下反应12h。磁分离后，用去离子水反复洗涤磁性微球，得到表面含有羧基的磁性聚丙烯酸甲酯微球(PMA-COOH)。图1为为振动样品磁强计在室温下测定的微球的磁化曲线，由磁化曲线可知，微球的比饱和磁化强度为7.181A.m2/kg，外加磁场为0时，剩磁和矫顽力都为0，表明所制备的聚丙烯酸甲酯微球具有超顺磁性，在外加磁场作用下，微球具有很好的磁响应性，撤去外加磁场后，没有剩磁，不会产生团聚，分散性好，便于分离(详见图1，2，3)。
本发明还提供一种丙型肝炎(HCV)抗体的制备，优化抗体特异性，其步骤如下：
1)单克隆抗体制备：取HCV重组抗原蛋白300mg/L与完全福氏佐剂等量混合制成乳化剂，加入搅拌子后于4度搅拌过夜，共免疫Balb/c小鼠5只。第1次免疫100ug/只，皮下多点注射。2周后用不完全福氏佐剂第2次免疫，剂量、途径同第1次。2周后尾静脉取血通过间接ELISA测定效价，抗-HCV效价达1∶1000～1∶5000时供融合用。融合前3d每只计量100ug用抗原直接腹腔脾区加强免疫1次。分离免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，以HAT选择培养基铺板7块96孔细胞培养板培养。采用常规间接ELISA法测定抗-HCV：包被聚苯乙烯板的纯化重组HCAg浓度为5mg/L，酶标记抗体为羊抗鼠IgG(Sigma公司产品，工作浓度为1∶5000)，酶标仪450nm波长测定OD值。P/N值≥2.1倍为阳性，＜2.1倍为阴性(N值＜0.05，按0.05计算。
2)细胞融合及克隆化和腹水制备
3)抗-HCVMcAb鉴定
亚类鉴定：使用Roche Mouse IgG ELISA进行抗体分型鉴定
特异性检测：以重组HCV基因工程表达抗原、大肠杆菌BL-21菌体和HDV重组蛋白分别被聚苯乙烯包裹，置4度过夜。用2％BSA-PBS封闭后，分别加入不同株细胞培养上清液，室温2h后，加入抗IgG-HRP标记物，室温1h，洗涤后显色，观察各细胞株与不同抗原有无交叉反应。
4)蛋白亲和纯化：亲和层析介质5mL装填在层析柱内。把层析柱架在直铁架上，使用平衡缓冲液冲洗5-10倍柱体积，准备注入样本。除去胶面上方的缓冲液，并取出样本(样本预先用平衡缓冲液3倍稀释，并用0.22um滤膜过滤)(IEX)使其回到室温，使用蠕动泵上样，同时收集流出液，样品上样完成后用平衡缓冲液冲洗至无蛋白留出，之后使用解离缓冲液解离抗体，解离约两倍柱体积。接着以平衡缓冲液流洗5-10倍柱体积，所有收集均定量蛋白质并检测(详见图4，5)。
本发明还提供一种是与丙型肝炎(HCV)抗体偶联对其微球表面进行生物修饰，构建了一种简单、低廉、方便的高灵敏度新型HCV血清中病毒的检测技术，优化了丙型肝炎病毒抗体量与羧基修饰磁珠偶联，制备出特异性丙肝免疫磁珠。包括以下步骤：A.血清病毒DNA提取方法评价
B.磁性微球表面生物修饰
C.磁性免疫检测
D.偶联最佳抗体量的活化磁珠富集病毒效率
取6份1mg活化磁珠分别至2ml离心管中，各加入丙肝病毒单克隆抗体(1mg/ml)10、25、50、75、100、250ug，用PBS缓冲液补齐至500ul，用旋涡混合仪混匀，固定在静音混合器上，37℃偶联2h。用磁分离器分离磁珠，收集各管上清液。用BCA试剂盒检测上述各管上清液中剩余抗体量，用酶标仪测定其A562nm值，可得1mg磁珠偶联抗体的量，计算偶联效率。
此6份1mg免疫磁珠封闭后各加300μl浓度为8×105的丙肝病毒，用涡旋仪混匀，并室温固定在混合器中孵育2h。用磁分离器分离磁珠，弃上清液后加入PBS缓冲液500μl洗涤3次(每次洗涤需要在混合器中充分洗涤，以除去吸附病毒)。提取免疫磁珠吸附病毒的核酸，检测吸附不同抗体量免疫磁珠吸附丙肝病毒的效率。
E.HCV荧光定量PCR检测
标准曲线：用含有丙肝病毒基因组中编码VP1-VP3蛋白区域片段的标准品质粒制作荧光定量PCR标准曲线，取浓度范围9.27×101-9.27×107拷贝/ul的7个点。
实时荧光定量PCR采用7500 fast Realtime-PCR仪(ABI公司)对上述获得的cDNA进行检测。并优化PCR反应条件发现普通RT-PCR在60℃3sec-72℃11sec-80℃3sec有44个循环，miRNA RT-PCR在95℃15s-60℃1min有40个循环。
本发明的优点是：本发明利用磁性Fe3O4纳米微球用表面高分子化学反应等方法构建超顺磁性聚合物纳米球，优化磁珠偶联抗体量，利用RT-PCR检测，建立了一种简单、低廉、方便的高灵敏度新型HCV血清中病毒的检测技术，取得了优异的技术效果：
1)快速：从血清中提取病毒DNA到PT-PCR的检测，磁珠偶联抗体检测可快速获得结果；
2)灵敏：相应于其他检测，采用抗体偶联与RT-PCR的结合，可以使检测灵敏度大大提高，最低可达50拷贝/ml。
3)特异：采用的Taqman技术具有引物和探针的双重特异性，即反应的特异性是由两段引物和一段探针来决定，因而特异性大为提高。
4)不易污染：本发明在PCR反应时采用一步法的闭管操作，同时使用了dUTP/UNG防污染系统；另外磁珠法病毒核酸提取操作简便，无频繁移管过程，这都最大限度地减少了污染，保证结果准确可靠。
5)基于Taqman探针的荧光定量PCR方法，结果显示，该方法基线平直无波动，拐点清晰，曲线之间平行性好，表明PCR反应十分稳定。另外病毒核酸提取采用磁珠法，也是重复性好的保障之一。
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
附图说明
图1为磁性聚丙烯酸甲酯微球的磁化曲线
图2为磁性聚丙烯酸甲酯微球的生物显微镜照片
图3为磁性微球的Zeta电位表征
图4为4株抗HCV McAb腹水和亲和纯化产物特异性分析
1：Marker，2：抗-HCV1腹水，3：抗-HCV2腹水，4：抗-HCV3腹水
5：抗-HCV4腹水，6：抗-HCV1抗体纯化后，7：抗-HCV2抗体纯化后
8：抗-HCV3抗体纯化后，9：抗-HCV4抗体纯化后
图5为HCV NS4蛋白的免疫荧光测定
图6(a)为免疫反应后载玻片上阳性反应区(黑色颗粒为磁性微球)，(b)为免疫反应后载玻片上阴性反应区(没有磁性微球)
表1为免疫磁珠吸附不同丙肝病毒的富集效率
表2为HCV高拷贝样品重复性检测
表3为HCV低拷贝样品重复性检测
具体实施方式
本发明所用病毒与核酸及来源详见表3。
实施例1检测病毒中microRNA表达情况
一、磁珠法提取血清病毒DNA
1.将200ul HCV血清样品加入到1.5ml的EP管中，然后加入20ul蛋白酶K(10mg/ml)和40ul裂解液[50mM Tris-HCI(pH8.0)，2.5％SDS，2.5％TritonX-100等]，混匀。
注意：提前向裂解液中加入酵母tRNA(每一反应加4ug酵母tRNA)
2.向反应管中加入400ul结合液[5M GuSCN，20mMTris-HCI(pH6.6)，10％乙醇等]和25ul硅化磁珠，涡旋振荡后，室温温育3分钟。
3.将反应管置于磁力架上约30秒，用移液枪吸去上清。
4.向管中加入750ul洗液[20mMNaCI，2mMTris-HCI(pH7.5)，50％乙醇]，混匀后置于磁力架上，弃上清。
5.重复4.
6.加入50ul洗脱液[10mM Tris-HCI(pH8.0)]悬浮磁珠，65℃温育2分钟，将上清转入另一干净管中。
(注：如果提取的血清样本量增加，则需要相应增加裂解液、结合液的体积。如提取400ul的血清，则需要加80ul的裂解液，40ul的蛋白酶K，800ul的结合液)。取5ul进行荧光定量PCR进行定量检测，同时以101-106的标准品为模板进行PCR构建标准曲线。
二、磁性微球表面生物修饰
活化：取2mg(25mg/ml)充分摇匀的羧基磁珠至于2ml离心管中，加1ml浓度为0.01M的2-(4-吗啉)乙磺酸(MEST，pH5.0，0.05％Tweeb-20)活化缓冲液洗涤磁珠3遍，用磁分离器分离后，分别加入300ul浓度为5mg/ml的活化试剂碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS(均使用0.01M pHS.0的MES缓冲液配制)溶液，经涡旋混合仪混匀，固定在静音混合器上，37℃活化45min。用磁分离器分离磁珠，弃去上清液，加500ul pH＝7.4PBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤需在混合器上充分混合洗涤，再加入200ul PBS缓冲液，悬浮磁珠。
偶联：取1mg(100ul)活化磁珠至2ml离心管中，加入适量丙肝病毒单克隆抗体，用PBS 缓冲液补齐至500ul，用涡旋混合仪混匀，固定在静音混合器上，37℃偶联2h。用磁分离器分离磁珠，弃去上清液，加入500ulPBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤需在混合器上充分混合洗涤，去除未结合的抗体。
封闭：在上述装有磁珠的离心管中，加入500ul1％的BSA封闭液，经涡旋混合仪混匀，固定在静音混合器上，37℃封闭1h(或4℃封闭过夜)。用磁分离器分离磁珠，弃去上清液，加入500ulPBS缓冲液洗涤3次，再加入300ulPBS缓冲液，悬浮磁珠，置于4℃备用。
三、结果判定
结果分析条件设定，读取检验结果。与75ug丙肝病毒单克隆抗体偶联时，有最大抗体偶联量，其富集丙肝病毒效率可达94.50％；另外，单位质量免疫磁珠可使病毒浓度为1.48×106拷贝/ul的300ul丙肝病毒样本富集效率达92.57％，其HCV高拷贝与低拷贝样品重复性好，特异性强。
表1 免疫磁珠吸附不同丙肝病毒的富集效率
表2 HCV高拷贝样品重复性检测
表3 HCV低拷贝样品重复性检测
Claims (4)
1.采用化学共沉淀法制备超顺磁性Fe3O4纳米颗粒，用表面高分子化学反应等方法对超顺磁性聚合物纳米球和微米球进行表面功能化以产生活性基团，并与丙型肝炎(HCV)抗体偶联并优化最佳抗体偶联量，对磁性微球表面生物修饰建立磁性免疫检测系统，检测HCV病人人血清标本，对其灵敏性、检测速度、准确性、特异性、重复性和稳定性等指标进行全面评价。
2.根据权利要求1所述，首先制备了Fe3O4纳米颗粒，用表面高分子化学反应等方法对超顺磁性聚合物纳米球的合成和微米球进行表面化学修饰，其步骤如下：
采用共沉淀法合成油酸包覆的磁流体。将n(Fe2+)∶n(Fe3+)＝1∶2的铁盐水溶液置于80度水浴中，加入浓醋酸，接着滴加一定量的氨水，恒温反应后，经30min去离子水反复清洗得到黑色的Fe3O4块状凝胶。
聚丙烯酸甲酯微球的制备和表面化学修饰用文献的方法进行。将2g磁流体溶入9ml丙烯酸甲酯中，加入DVB，制成油相。将油相加入到浓度为2％的PVA溶液中，超声分散后倒入装有机械搅拌器的三口烧瓶中，加入1gBPO，调节转速，于60℃反应2h，升温至60℃，反应4h。反应结束后，磁分离所得磁性高分子微球，用乙醇和去离子水反复洗涤多次，真空干燥。于120℃搅拌下反应12h。磁分离后，用去离子水反复洗涤磁性微球，得到表面含有羧基的磁性聚丙烯酸甲酯微球(PMA-COOH)。
同时对免疫磁性微球进行分析和表征检测：取2g氯乙酸钠溶入100ml去离子水中，加入约0.4mL(浓度约为0.94g/mL)的磁性微球和2g碳酸钠，用0.1mol/L的氢氧化钠调节PH值到11左右，装上机械搅拌器，调节到一定转速，于80度水浴反应6h。反应结束后用去离子水和稀氢氧化钠溶液清洗，加入0.1mol/L的硫酸铜50ml，室温摇床反应3h。反应结束后用去离子水清洗上青液至无色，加0.1mol/L的乙二胺四乙酸二钠25ml，磁性分离后用原子吸收光谱仪检测上清液中铜离子浓度。用振动样品磁强计测定磁性微球的磁化曲线，用生物显微镜观测磁性微球的尺寸大小和表面形态。
3.根据权利要求1所述，磁珠与丙型肝炎(HCV)抗体偶联，对磁性微球表面进行生物修饰并建立磁性免疫检测系统，其修饰步骤如下：
a.活化：取2mg(25mg/ml)充分摇匀的羧基磁珠至于2ml离心管中，加1ml浓度为0.01M的2-(4-吗啉)乙磺酸(MEST，pH5.0，0.05％Tweeb-20)活化缓冲液洗涤磁珠3遍，用磁分离器分离后，分别加入300ul浓度为5mg/ml的活化试剂碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS(均使用0.01M pH5.0的MES缓冲液配制)溶液，经涡旋混合仪混匀，固定在静音混合器上，37℃活化45min。用磁分离器分离磁珠，弃去上清液，加500ul pH＝7.4PBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤需在混合器上充分混合洗涤，再加入200ul PBS缓冲液，悬浮磁珠。
b.偶联：取1mg(100ul)活化磁珠至2ml离心管中，加入适量丙肝病毒单克隆抗体，用PBS缓冲液补齐至500ul，用涡旋混合仪混匀，固定在静音混合器上，37℃偶联2h。用磁分离器分离磁珠，弃去上清液，加入500ulPBS缓冲液洗涤3次，每次洗涤需在混合器上充分混合洗涤，去除未结合的抗体。
c.封闭：在上述装有磁珠的离心管中，加入500ul1％的BSA封闭液，经涡旋混合仪混匀，固定在静音混合器上，37℃封闭1h(或4℃封闭过夜)。用磁分离器分离磁珠，弃去上清液，加入500ulPBS缓冲液洗涤3次，再加入300ulPBS缓冲液，悬浮磁珠，置于4℃备用。
4.根据权利要求1所述，偶联抗体量的活化磁珠富集病毒的效率获得最佳效率，其优化过程如下：
取6份1mg活化磁珠分别至2ml离心管中，各加入丙肝病毒单克隆抗体(1mg/ml)10、25、50、75、100、250ug，用PBS缓冲液补齐至500ul，用旋涡混合仪混匀，固定在静音混合器上，37℃偶联2h。用磁分离器分离磁珠，收集各管上清液。用BCA试剂盒检测上述各管上清液中剩余抗体量，用酶标仪测定其A562nm值，可得1mg磁珠偶联抗体的量，计算偶联效率。
此6份1mg免疫磁珠封闭后各加300μl浓度为8×105的丙肝病毒，用涡旋仪混匀，并室温固定在混合器中孵育2h。用磁分离器分离磁珠，弃上清液后加入PBS缓冲液500μl洗涤3次(每次洗涤需要在混合器中充分洗涤，以除去吸附病毒)。提取免疫磁珠吸附病毒的核酸，检测吸附不同抗体量免疫磁珠吸附丙肝病毒的效率。
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