CN112444628A - 基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，登革病毒纳米磁珠‑抗体探针的制备；纳米磁珠试纸条的组装；使用纳米磁珠试纸条对登革病毒的检测，利用纳米磁珠的磁富集分离功能以及具有颜色信号可供肉眼观察的特性，建立基于纳米磁珠免疫层析技术的登革病毒检测新方法，能有效提高检测灵敏度，方法简便易于操作，可用于大规模快速诊断。

Description

基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法
技术领域
本发明涉及纳米磁珠免疫层析技术领域。具体地说是基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法。
背景技术
登革热(Dengue Fever)是由黄病毒属的登革病毒(Dengue Vi rus，DENV)引起的急性传染病。登革病毒通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播引起登革热，在全世界热带和亚热带地区普遍存在，轻症表现为持续发热、头痛、关节疼痛、肌肉痛等，重症为死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。由于全球变暖和城市盲目扩张等因素，在过去的50年中，这种传播速度相当快的病毒性疾病，在全球发病率增长了30倍。据统计，全球每年在100多个流行国家中有3.9亿人感染登革病毒，并且进一步蔓延到以前未受影响的国家和地区。同时，每年出现数10万重症病例，包括2万人死亡。在我国广东、广西、云南、海南、江西等地也曾多次暴发登革疫情，造成严重的公共卫生问题，引起广大研究人员的高度重视。
有效的登革疫苗需要同时对所有血清型登革病毒具备均衡且持久的抗性，制备登革疫苗的平衡免疫应答并且保证持久力非常困难，目前尚无有效成熟的登革疫苗。我国每年流行的登革热基本均为输入性病例，如果不采取有效的检测及防控措施，输入病例通过本地蚊媒介导传播，能造成快速的本地疫情爆发。因此，对登革热的早期诊断尤其重要。登革热防控的黄金窗口期一般为两周左右，发展高灵敏的登革病毒检测方法，在窗口期内对病毒感染者做出快速识别、诊断，对患者及时采取相应的治疗措施，启动传染源隔离、消杀灭蚊等措施，避免形成大规模的爆发和流行。
由于登革检测与其他黄病毒存在交叉反应，所以在目前来说还没有血清学检测方法的金标准。目前实验室常用的登革热检测技术有病毒分离、实时荧光逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和酶联吸附试验(ELISA)、胶体金法等。其中病毒分离操作繁琐，敏感度低，不适于早期诊断；RT-PCR方法需要专业的仪器设备，过程复杂，成本高，不利于大规模检测；ELISA方法操作复杂，灵敏度和特异性都低于RT-PCR方法；胶体金法灵敏度和特异性比ELISA方法还略低，成本又高于ELISA。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高灵敏度、操作简单、可用于大规模快速诊断的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，包括如下步骤：
(1)登革病毒纳米磁珠-抗体探针的制备；
(2)纳米磁珠试纸条的组装；
(3)使用纳米磁珠试纸条对登革病毒的检测。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，在步骤(1)中，纳米磁珠为市购纳米磁珠，粒径为50nm。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，在步骤(1)中：
(1-1)制备活化的纳米磁珠：纳米磁珠用去离子水洗涤三次，离心后弃上清，用pH为6的MES缓冲溶液重悬，同时加入活化剂，摇床摇匀，进行活化反应，然后使用MES缓冲溶液洗涤1次，最后用MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米磁珠溶液，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物；
(1-2)登革病毒鼠单克隆标记抗体与活化的纳米磁珠溶液4℃过夜孵育，之后用pH为7.2的Tris缓冲液室温孵育30分钟以终止反应，采用纳米磁珠分离装置磁分离后重悬于0.5mL BSA-Tris缓冲液中，得到登革病毒纳米磁珠-抗体探针。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述纳米磁珠分离装置包括主体机构、供料机构、清洗机构、震动机构、抽气机构和磁体机构；
所述供料机构与主体机构流体连通，所述清洗机构与主体机构流体连通，且所述供料机构与清洗机构均位于主体机构的顶部，所述震动机构固定安装在主体机构的外表面，所述抽气机构设置在主体机构的底部，所述磁体机构滑动安装在主体机构的上表面。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述主体机构包括安装板、第一通孔、钢化玻璃管、进料软管、第一阀门、供料软管和第二阀门；
所述安装板内部垂直贯穿开设有第一通孔，所述第一通孔的直径大于钢化玻璃管的直径，所述第一通孔的数量不仅可以有三个，还可以根据实际再对其进行增加；所述钢化玻璃管贯穿第一通孔，所述钢化玻璃管采用强度高、抗拉性强、抗冲击性强的钢化玻璃制成，且所述钢化玻璃管的数量根据第一通孔的数量或实际需要决定；
所述钢化玻璃管的顶端与进料软管固定连接，且钢化玻璃管的顶端设置有第一阀门，所述第一阀门由控制器控制，所述第一阀门与进料软管相连接，所述进料软管采用生物化学惰性材料制成；所述多个进料软管的顶端均与同一根供料软管相连接，所述供料软管与进料软管所用材质相同；
所述钢化玻璃管上设置有第二阀门，所述第二阀门位于安装板的底部；其中所述安装板平行于地面放置，所述钢化玻璃管垂直与安装板或倾斜与安装板设置；
所述供料机构包括混合箱、抽液管、第一微泵和第三阀门；
所述混合箱内放置有样品液与纳米磁珠的混合液，所述抽液管的一端放置于混合箱内的底部位置，且所述抽液管的另一端与供料软管相连接，所述抽液管与供料软管的材质相同；
所述抽液管靠近供料软管的地方设置有第一微泵，所述第一微泵采用精密注射泵；所述抽液管与供料软管相连接的地方设置有第三阀门，所述第一微泵与第三阀门均由控制器控制。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述清洗机构包括洗涤箱、第一连接管、第四阀门、洗脱箱、第二连接管、第五阀门、第二微泵、第六阀门、水箱、第三连接管、第七阀门和高压泵；
所述洗涤箱内装有洗涤液，所述洗涤箱通过第一连接管与第二微泵相连接，所述第一连接管上设置有第四阀门，且所述第一连接管与供料软管的材质相同；所述洗脱箱内装有洗脱液，所述洗脱箱通过第二连接管与第二微泵相连接，所述第二连接管上设置有第五阀门，且所述第二连接管与供料软管材质相同；所述第四阀门和第五阀门均由控制器控制；
所述第二微泵有两个进液口，且两个进液口互不相通，所述两个进液口分别于第一连接管和第二连接管相连接，所述第二微泵与第一微泵一样采用精密注射泵，所述第二微泵的出液口与供料软管相连通，且供料软管靠近第二微泵的位置设置有第六阀门，且所述第六阀门有多个，分别设置于供料软管上位于每两个进料软管之间；所述第二微泵与第六阀门均由控制器控制；
所述水箱通过第三连接管与供料软管相连接，且第三连接管与供料软管相连接的地方位于最右侧进料软管与第六阀门之间，所述水箱内装有清水；
所述第三连接管靠近供料软管的一端设置有第七阀门，所述第三连接管上设置有高压泵，所述高压泵位于第七阀门与水箱之间。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述震动机构包括环形振动器、弹簧、固定块和第二通孔；
所述环形振动器环孔的直径大于第一通孔的直径，且环形振动器与第一通孔同轴设置，所述环形振动器数量由钢化玻璃管的数量决定，所述环形振动器的竖切面为L型，所述环形振动器由控制器控制；
所述环形振动器的L型底板上设置有多个弹簧，所述多个弹簧的顶端均固定安装有固定块，所述固定块的竖切面为T型，所述固定块与环形振动器的环孔相契合，所述固定块位于环形振动器的环孔内，且环形振动器与固定块之间留有一定空隙；
所述固定块的中心处贯穿开设有第二通孔，所述第二通孔、固定块和环形振动器均为同轴设置，所述第二通孔的内部贯穿固定有钢化玻璃管。
上述纳米磁珠与液态分离装置，所述抽气机构包括双轴电机、第一皮带、第一滑槽、第一滑块、气动伸缩杆、连接杆、抽气孔、抽气机、密封环和密封槽；
所述双轴电机固定安装在安装板的背面，且所述双轴电机位于钢化玻璃管的正后方；所述安装板的下表面开设有第一滑槽，且所述第一滑槽的形状为T型；所述第一滑槽的内部滑动安装有第一滑块，且所述第一滑块的形状为工型；所述双轴电机的底部输出端通过第一皮带与第一滑块相连接，所述双轴电机由控制器控制；
所述第一滑块的底部中心位置处固定安装有气动伸缩杆，所述气动伸缩杆由控制器控制，所述气动伸缩杆的正面底部固定安装有连接杆，所述连接杆的形状为L型；所述连接杆的竖直部分贯穿开设有抽气孔；所述抽气孔的底部固定安装有抽气机，且抽气机的抽气口与抽气孔相吻合；
所述连接杆竖直部分的顶端固定安装有密封环，所述密封环上开设有与抽气孔相连通的通孔，且所述密封环的上表面开设有与钢化玻璃管相吻合的密封槽。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述抽气机构包括双轴电机、第一皮带、第一滑槽、第一滑块、气动伸缩杆、连接杆、抽气孔、抽气机、密封环和密封槽；
所述双轴电机固定安装在安装板的背面，且所述双轴电机位于钢化玻璃管的正后方；所述安装板的下表面开设有第一滑槽，且所述第一滑槽的形状为T型；所述第一滑槽的内部滑动安装有第一滑块，且所述第一滑块的形状为工型；所述双轴电机的底部输出端通过第一皮带与第一滑块相连接，所述双轴电机由控制器控制；
所述第一滑块的底部中心位置处固定安装有气动伸缩杆，所述气动伸缩杆由控制器控制，所述气动伸缩杆的正面底部固定安装有连接杆，所述连接杆的形状为L型；所述连接杆的竖直部分贯穿开设有抽气孔；所述抽气孔的底部固定安装有抽气机，且抽气机的抽气口与抽气孔相吻合；
所述连接杆竖直部分的顶端固定安装有密封环，所述密封环上开设有与抽气孔相连通的通孔，且所述密封环的上表面开设有与钢化玻璃管相吻合的密封槽；
所述磁体机构包括第二滑槽、第二滑块、第二皮带、支撑杆和永磁条；
所述安装板的上表面开设有与第一滑槽相对称的第二滑槽，所述第二滑槽的内部滑动安装有与第一滑块形状大小相同的第二滑块；所述双轴电机的顶部输出端通过第二皮带与第二滑块相连接；
所述第二滑块的上表面中心处固定安装有支撑杆，所述支撑杆靠近钢化玻璃管的一侧固定安装有永磁条，所述永磁条的底端与固定块的上表面平齐，且所述永磁条的顶端优选与钢化玻璃管的顶端平齐。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，在步骤(2)中，
(2-1)纳米磁珠免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫及底板组成；
(2-2)利用XYZ三维划膜喷金仪以浓度为1mg/mL的羊抗兔抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控带C线，以浓度为1mg/mL的登革病毒鼠单克隆标记抗体Ⅱ+Ⅲ在硝酸纤维素膜上划线作为检测带T线，质控带C线和检测带T线的间距为7mm；划线后，将硝酸纤维素膜置于恒温箱中干燥1h；
(2-3)在结合垫上喷涂偶联后的登革病毒纳米磁珠-抗体探针，喷涂参数为0.25μL/mm，然后将结合垫置于恒温箱中干燥1h；
(2-4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫从底板一端至另一端依次叠加铺设在底板上，组成层析条，其中硝酸纤维素膜上的检测带T线靠近结合垫；
(2-5)采用切条机切成宽度为4mm的试纸条，外加卡壳即组装完成，最后将组装好的试纸条置于密封袋中室温干燥保存；其中外加卡壳的读取孔正对着硝酸纤维素膜，外加卡壳的加样孔正对着样品垫。
上述基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，在步骤(3)中，
(3-1)取500μL登革病毒抗原待测样品与1μL的登革病毒纳米磁珠-抗体探针；反应5分钟后磁吸附分离，弃去上清液，然后加入100μL的稀释液，得到革病毒抗原样品溶液；
(3-2)取出纳米磁珠检测条卡壳，在加样孔中加入步骤(3-1)得到革病毒抗原样品溶液，开始层析检测，计时10分钟；
(3-3)若质控带C线和检测带T线同时显色，则登革病毒抗原待测样品含有登革病毒，若质控带C线显色而检测带T线不显色，则登革病毒抗原待测样品不含有登革病毒。
本发明的技术方案取得了如下有益的技术效果：
1、利用纳米磁珠的磁富集分离功能以及具有颜色信号可供肉眼观察的特性，建立基于纳米磁珠免疫层析技术的登革病毒检测新方法，能有效提高检测灵敏度，方法简便易于操作，可用于大规模快速诊断。
2、采用50nm的磁珠，研制了纳米磁珠免疫层析技术，该技术首先利用了纳米磁珠具有磁性的特性，可以对待检样品进行浓缩和富集分离，步骤简单易行，这种特性对于增强检测信号提高灵敏度非常有利。另外，在制备成本方面，纳米磁珠制备简便，成本低廉。利用磁珠的富集分离以及其本身带有的颜色可以提供检测信号，本研究研制的纳米磁珠免疫层析试纸条检测登革病毒，实验结果表明该方法比目前市场上商品化的胶体金试纸条检测灵敏度提高10倍。
3、本申请采用纳米磁珠分离装置对登革病毒纳米磁珠-抗体探针进行磁分离、清洗和重悬，解决了操作复杂的问题，通过纳米磁珠分离装置可以一次实现。
通过设置多个钢化玻璃管和第一阀门，可以使纳米磁珠分离装置可以连续不间断进行工作，进而提高工作效率；在安装板上设置多个钢化玻璃管，在开始工作前，先控制第一滑块向前运动，直至密封环到钢化玻璃管的正下方，然后控制气动伸缩杆，使钢化玻璃管的底端插入密封槽内，将每个钢化玻璃管内的空气抽出，使钢化玻璃管内呈现真空状态，然后控制第二阀门拧紧，防止进气，每个第一滑块都可以单独运行，然后启动第一微泵，再同时打开第三阀门和其中一个第一阀门，并打开供料软管上第三阀门和这个第一阀门之间的所有第六阀门，就可以将混合箱内的混合液抽入其中一个钢化玻璃管内，然后关闭这个第一阀门和这个第一阀门左侧最近的一个第六阀门，第二个第一阀门打开，重复第一个的步骤，在第一个第一阀门关闭后，对应的第二滑块带动对应的永磁条紧贴在钢化玻璃管的外表面，然后相对应的环形振动器带动第一个钢化玻璃管进行震动，使钢化玻璃管内的纳米磁珠和目标物的结合体充分的吸附在钢化玻璃管靠近永磁条一侧的内表面，一段时间后，打开第二阀门，放出吸附目标物后的废液，然后打开这个第一阀门、第四阀门和最右侧的一个第六阀门，再打开第二微泵，会将洗涤箱内的洗涤液抽入这个钢化玻璃管内对目标结合物进行冲洗，将结合物表面的废液冲掉，然后打开这个第一阀门、第四阀门和最右侧的一个第六阀门，再打开第二微泵，会将洗涤箱内的洗涤液抽入这个钢化玻璃管内对目标结合物进行冲洗，将结合物表面的废液冲掉，最后打开第二阀门，将吸附登革病毒纳米磁珠-抗体探针放出。后边的钢化玻璃管依照此过程可连续运行，由于其中大多都是通过控制器控制，将控制器调试好后，即可一键启动和关闭，不仅操作方便，而且工作效率高，一个一个的钢化玻璃管依次进行分离，可以对目标物的获取量进行控制，并且能够及时停止工作，即使造成浪费，也不会浪费太多；并且多个钢化玻璃管可同时运行，操作更简单。
通过设置水箱和高压泵，在纳米磁珠分离装置使用结束后可以启动高压泵对钢化玻璃管进行强力清洗，方便下次使用不会收到上次目标物的污染。
通过设置抽气机构，可以在装置进行运作前使钢化玻璃管内处于真空状态，可以保证所得目标物的纯净，防止空气中的杂质对目标物造成污染。
通过设置钢化玻璃管，使工作人员在进行工作的时候能够对钢化玻璃管的内部变化情况及时观察，可以有效防止内部出现情况而工作人员不知情的状况；并且钢化玻璃管内部光滑，便于事后进行清理，而且钢化玻璃管质地坚硬，不会因为纳米磁珠的挤压而开裂。
4、在研究过程中，发现这种免疫层析新方法在测试高浓度登革病毒抗原时，条带显色反而比较弱，而在中等浓度存在时信号条带清晰明显。分析推测这是由于产生了钩状效应即HOOK效应，即由于抗原抗体比例不合适而导致假阴性的现象，在双抗夹心的检测过程中，两个抗体都与抗原结合，如果第一个抗体量太大的话，就会造成与抗原结合的位点就太多，结合位点都被第一个抗体占据了，有可能就会影响后面抗体与抗原的结合，所以有时候前面抗体结合的太饱和了，就会影响后面抗体的结合，反而会造成接触位点减少，条带反而显色较弱。
附图说明
图1采用纳米磁珠免疫层系技术检测登革热病毒的灵敏度结果图；
图2采用登革热胶体金技术检测登革热病毒的灵敏度结果图；
图3登革病毒纳米磁珠免疫层析试纸条特异性实验结果图(1.Dengue；2.WestNile；3.Zika；4.Ebola；5.H1N1)；
图4纳米磁珠分离装置结构示意图；
图5纳米磁珠分离装置的环形振动器剖视结构示意图；
图6纳米磁珠分离装置的侧视结构示意图；
图7纳米磁珠分离装置的安装板剖视结构示意图；
图8纳米磁珠分离装置的密封环俯视结构示意图。
图中附图标记表示为：100-主体机构；200-供料机构；300-清洗机构；400-震动机构；500-抽气机构；600-磁体机构；101-安装板；102-第一通孔；103-钢化玻璃管；104-进料软管；105-第一阀门；106-供料软管；107-第二阀门；201-混合箱；202-抽液管；203-第一微泵；204-第三阀门；301-洗涤箱；302-第一连接管；303-第四阀门；304-洗脱箱；305-第二连接管；306-第五阀门；307-第二微泵；308-第六阀门；309-水箱；310-第三连接管；311-第七阀门；312-高压泵；401-环形振动器；402-弹簧；403-固定块；404-第二通孔；501-双轴电机；502-第一皮带；503-第一滑槽；504-第一滑块；505-气动伸缩杆；506-连接杆；507-抽气孔；508-抽气机；509-密封环；510-密封槽；601-第二滑槽；602-第二滑块；603-第二皮带；604-支撑杆；605-永磁条。
具体实施方式
实施例1
1材料、方法和技术路线
1.1病毒
本研究所用登革病毒重组蛋白NS1(E.coli)，寨卡病毒(ZIKV)、流感病毒和血清标本由北京大弘生物技术有限公司提供。
1.2材料和仪器
醋酸钠、FeCl3·6H2O、乙醇、乙二醇(北京化学试剂厂)，10mg/mLN-
(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺.盐酸盐(EDC)、10mg/ml N-羟基硫代琥珀酰亚胺.钠盐(NHS)、0.1M Tris、5％BSA、1％BSA、10mM PB、DAB显色液(中杉金桥)，磁珠(金准智造生物科技公司，粒径50nm)，透射电镜(JEOL2000FX 20\0KV，日本电子公司)，高温烘箱(天津泰斯特)，酶联免疫分析仪(Bio-Rad)，PVDF膜(Millipore)，割流喷膜划线机(Arista，USA)，切条机(天津科炬生物)，XYZ三维划膜喷金仪(上海金标)。台式离心机、螺旋混匀器、程序混匀器、XYZ三维划膜喷金仪、微电脑斩切机。
2、检测方法
2.1、登革病毒纳米磁珠-抗体探针的制备
(1-1)制备活化的纳米磁珠：5mg纳米磁珠用1mL去离子水洗涤三次，离心后弃上清，用pH为6的MES缓冲溶液重悬，同时加入活化剂，摇床摇匀，进行活化反应30min，然后使用MES缓冲溶液洗涤1次，最后用1mLMES缓冲溶液重悬，得到浓度为5mg/mL的活化的纳米磁珠溶液；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC的体积为50μL，浓度为0.4M，N-羟基琥珀酰亚胺NHS的体积为50μL，浓度为0.4M；
(1-2)50μg登革病毒鼠单克隆标记抗体与活化的纳米磁珠溶液4℃过夜孵育，之后用pH为7.2的Tris缓冲液室温孵育30分钟以终止反应，采用纳米磁珠分离装置磁分离后重悬于0.5mL BSA-Tris缓冲液中，得到登革病毒纳米磁珠-抗体探针。
所述纳米磁珠分离装置，包括主体机构100、供料机构200、清洗机构300、震动机构400、抽气机构500和磁体机构600；供料机构200与主体机构100流体连通，清洗机构300与主体机构100流体连通，且供料机构200与清洗机构300均位于主体机构100的顶部，震动机构400固定安装在主体机构100的外表面，抽气机构500设置在主体机构100的底部，磁体机构600滑动安装在主体机构100的上表面。
如图4-5所示，纳米磁珠与液态分离装置，主体机构100包括安装板101、第一通孔102、钢化玻璃管103、进料软管104、第一阀门105、供料软管106和第二阀门107；安装板101内部垂直贯穿开设有第一通孔102，第一通孔102的直径大于钢化玻璃管103的直径，第一通孔102的数量不仅可以有三个，还可以根据实际再对其进行增加；钢化玻璃管103贯穿第一通孔102，钢化玻璃管103采用强度高、抗拉性强、抗冲击性强的钢化玻璃制成，且钢化玻璃管103的数量根据第一通孔102的数量或实际需要决定；钢化玻璃管103的顶端与进料软管104固定连接，且钢化玻璃管103的顶端设置有第一阀门105，第一阀门105由控制器控制，第一阀门105与进料软管104相连接，进料软管104采用生物化学惰性材料制成；多个进料软管104的顶端均与同一根供料软管106相连接，供料软管106与进料软管104所用材质相同；钢化玻璃管103上设置有第二阀门107，第二阀门107位于安装板101的底部；其中安装板101平行于地面放置，钢化玻璃管103垂直与安装板101或倾斜与安装板101设置；供料机构200包括混合箱201、抽液管202、第一微泵203和第三阀门204；混合箱201内放置有样品液与纳米磁珠的混合液，抽液管202的一端放置于混合箱201内的底部位置，且抽液管202的另一端与供料软管106相连接，抽液管202与供料软管106的材质相同；抽液管202靠近供料软管106的地方设置有第一微泵203，第一微泵203采用精密注射泵；抽液管202与供料软管106相连接的地方设置有第三阀门204，第一微泵203与第三阀门204均由控制器控制；清洗机构300包括洗涤箱301、第一连接管302、第四阀门303、洗脱箱304、第二连接管305、第五阀门306、第二微泵307、第六阀门308、水箱309、第三连接管310、第七阀门311和高压泵312；洗涤箱301内装有洗涤液，洗涤箱301通过第一连接管302与第二微泵307相连接，第一连接管302上设置有第四阀门303，且第一连接管302与供料软管106的材质相同；洗脱箱304内装有洗脱液，洗脱箱304通过第二连接管305与第二微泵307相连接，第二连接管305上设置有第五阀门306，且第二连接管305与供料软管106材质相同；第四阀门303和第五阀门306均由控制器控制；第二微泵307有两个进液口，且两个进液口互不相通，两个进液口分别于第一连接管302和第二连接管305相连接，第二微泵307与第一微泵203一样采用精密注射泵，第二微泵307的出液口与供料软管106相连通，且供料软管106靠近第二微泵307的位置设置有第六阀门308，且第六阀门308有多个，分别设置于供料软管106上位于每两个进料软管104之间；第二微泵307与第六阀门308均由控制器控制；水箱309通过第三连接管310与供料软管106相连接，且第三连接管310与供料软管310相连接的地方位于最右侧进料软管104与第六阀门308之间，水箱309内装有清水；第三连接管310靠近供料软管106的一端设置有第七阀门311，第三连接管310上设置有高压泵312，高压泵312位于第七阀门311与水箱309之间；震动机构400包括环形振动器401、弹簧402、固定块403和第二通孔404；环形振动器401环孔的直径大于第一通孔102的直径，且环形振动器401与第一通孔102同轴设置，环形振动器401数量由钢化玻璃管103的数量决定，环形振动器401的竖切面为L型，环形振动器401由控制器控制；环形振动器401的L型底板上设置有多个弹簧402，多个弹簧402的顶端均固定安装有固定块403，固定块403的竖切面为T型，固定块403与环形振动器401的环孔相契合，固定块403位于环形振动器401的环孔内，且环形振动器401与固定块403之间留有一定空隙；固定块403的中心处贯穿开设有第二通孔404，第二通孔404、固定块403和环形振动器401均为同轴设置，第二通孔404的内部贯穿固定有钢化玻璃管103。
如图6-8所示，抽气机构500包括双轴电机501、第一皮带502、第一滑槽503、第一滑块504、气动伸缩杆505、连接杆506、抽气孔507、抽气机508、密封环509和密封槽510；双轴电机501固定安装在安装板101的背面，且双轴电机501位于钢化玻璃管103的正后方；安装板101的下表面开设有第一滑槽503，且第一滑槽503的形状为T型；第一滑槽503的内部滑动安装有第一滑块504，且第一滑块504的形状为工型；双轴电机501的底部输出端通过第一皮带502与第一滑块504相连接，双轴电机501由控制器控制；第一滑块504的底部中心位置处固定安装有气动伸缩杆505，气动伸缩杆505由控制器控制，气动伸缩杆505的正面底部固定安装有连接杆506，连接杆506的形状为L型；连接杆506的竖直部分贯穿开设有抽气孔507；抽气孔507的底部固定安装有抽气机508，且抽气机508的抽气口与抽气孔507相吻合；连接杆506竖直部分的顶端固定安装有密封环509，密封环509上开设有与抽气孔507相连通的通孔，且密封环509的上表面开设有与钢化玻璃管103相吻合的密封槽510；磁体机构600包括第二滑槽601、第二滑块602、第二皮带603、支撑杆604和永磁条605；安装板101的上表面开设有与第一滑槽503相对称的第二滑槽601，第二滑槽601的内部滑动安装有与第一滑块504形状大小相同的第二滑块502；双轴电机501的顶部输出端通过第二皮带603与第二滑块602相连接；第二滑块602的上表面中心处固定安装有支撑杆604，支撑杆604靠近钢化玻璃管103的一侧固定安装有永磁条605，永磁条605的底端与固定块403的上表面平齐，且永磁条605的顶端优选与钢化玻璃管103的顶端平齐。
在安装板101上设置多个钢化玻璃管103，在开始工作前，先控制第一滑块504向前运动，直至密封环509到钢化玻璃管103的正下方，然后控制气动伸缩杆505，使钢化玻璃管103的底端插入密封槽510内，将每个钢化玻璃管103内的空气抽出，使钢化玻璃管103内呈现真空状态，然后控制第二阀门107拧紧，防止进气，每个第一滑块504都可以单独运行，然后启动第一微泵203，再同时打开第三阀门204和其中一个第一阀门105，并打开供料软管106上第三阀门204和这个第一阀门105之间的所有第六阀门308，就可以将混合箱201内的混合液抽入其中一个钢化玻璃管103内，然后关闭这个第一阀门105和这个第一阀门105左侧最近的一个第六阀门308，第二个第一阀门105打开，重复第一个的步骤，在第一个第一阀门105关闭后，对应的第二滑块602带动对应的永磁条605紧贴在钢化玻璃管103的外表面，然后相对应的环形振动器401带动第一个钢化玻璃管103进行震动，使钢化玻璃管103内的登革病毒纳米磁珠-抗体探针充分的吸附在钢化玻璃管103靠近永磁条605一侧的内表面，一段时间后，打开第二阀门107，放出吸附目标物后的废液，然后打开这个第一阀门105、第四阀门303和最右侧的一个第六阀门308，再打开第二微泵307，会将洗涤箱301内的洗涤液抽入这个钢化玻璃管103内对目标结合物进行冲洗，将结合物表面的废液冲掉，移开这个永磁条605，打开第二阀门107，将目标物放出即可得到登革病毒纳米磁珠-抗体探针。
得到的登革病毒纳米磁珠-抗体探针使用0.5mL BSA-Tris缓冲液重悬。
后边的钢化玻璃管103依照此过程可连续运行，由于其中大多都是通过控制器控制，将控制器调试好后，即可一键启动和关闭，不仅操作方便，而且工作效率高，一个一个的钢化玻璃管103依次进行分离，可以对目标物的获取量进行控制，并且能够及时停止工作，即使造成浪费，也不会浪费太多；并且多个钢化玻璃管103可同时运行，操作更简单，不需要控制器，人为即可完成。
另外这个纳米磁珠分离装置还可以根据需求对纳米磁珠和上面的抗体或生物材料进行分离，可以关闭第四阀门303和这个第一阀门105，移开这个永磁条605，打开第五阀门306，抽入洗脱液，环形振动器401震动，将目标物从纳米磁珠上充分洗掉，洗脱液和从纳米磁珠上洗掉的物质就是目标物提纯物，再将永磁条605移入，纳米磁珠会吸附在钢化玻璃管103内表面，打开第二阀门107，将目标物放出即可，然后可以实现纳米磁珠与生物识别材料的分离。
2.2、纳米磁珠试纸条的组装
(2-1)纳米磁珠免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫及底板组成；
(2-2)利用XYZ三维划膜喷金仪以浓度为1mg/mL的羊抗兔抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控带C线，以浓度为1mg/mL的登革病毒鼠单克隆标记抗体Ⅱ+Ⅲ在硝酸纤维素膜上划线作为检测带T线，质控带C线和检测带T线的间距为7mm；划线后，将硝酸纤维素膜置于恒温箱中干燥1h；
(2-3)在结合垫上喷涂偶联后的登革病毒纳米磁珠-抗体探针，喷涂参数为0.25μL/mm，然后将结合垫置于恒温箱中干燥1h；
(2-4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫从底板一端至另一端依次叠加铺设在底板上，组成层析条，其中硝酸纤维素膜上的检测带T线靠近结合垫；
(2-5)采用切条机切成宽度为4mm的试纸条，外加卡壳即组装完成，最后将组装好的试纸条置于密封袋中室温干燥保存；其中外加卡壳的读取孔正对着硝酸纤维素膜，外加卡壳的加样孔正对着样品垫。
2.3、使用纳米磁珠试纸条对登革病毒的检测
首先将登革病毒抗原待测样品(病毒裂解液，滴度105)，分别稀释100倍(10-2)、200倍(2×10-2)、500倍(5×10-2)、1000倍(10-3)、10000倍(10-4)、100000倍(10-5)。
然后取500μL上述样品稀释液，加入1μL上述制备的纳米磁珠-抗体探针，反应5分钟后磁吸附分离，弃去上清液，然后加入100μL的样品稀释液，取出纳米磁珠检测条卡壳，在加样孔中加入100μL稀释液。开始层析检测，计时10分钟。
若质控带C线和检测带T线同时显色，则登革病毒抗原待测样品含有登革病毒，若质控带C线显色而检测带T线不显色，则登革病毒抗原待测样品不含有登革病毒。
同时测试胶体金试纸条(广州万孚)对登革抗原的检测，按产品说明书操作。
从图1和图2可以看出，在抗原浓度检测梯度中，纳米磁珠免疫层析试纸条的最低抗原检测浓度是待测样品稀释10000倍(10-4，病毒滴度102)，而商业化胶体金试纸条的最低抗原检测浓度是待测样品稀释1000倍(10-3，病毒滴度102)，相比于商品化的胶体金试纸条，其对登革病毒抗原的检测灵敏度提高了约1个数量级。
2.5、纳米磁珠试纸条的特异性检测
采用同样的检测条件，使用制备的登革病毒纳米磁珠免疫层析试纸条检测西尼罗病毒、寨卡病毒、埃博拉病毒以及H1N1流感病毒，从而对登革病毒纳米磁珠免疫层析试纸条的特异性进行研究。
如图3所示，制备的登革病毒纳米磁珠免疫层析试纸条能够特异性检出登革病毒，对于其他病毒不能检测出，说明所制备的纳米磁珠试纸条对登革病毒的检测特异性非常好。
基于免疫层析技术，应用纳米磁珠，建立登革病毒抗原快速检测新方法。能有效提高检测灵敏度，方法简单便易于操作，可用于大规模快速诊断。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本专利申请权利要求的保护范围之中。

Claims (10)

1.基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)登革病毒纳米磁珠-抗体探针的制备；
(2)纳米磁珠试纸条的组装；
(3)使用纳米磁珠试纸条对登革病毒的检测。
2.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，纳米磁珠为市购纳米磁珠，粒径为50nm。
3.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤(1)中：
(1-1)制备活化的纳米磁珠：纳米磁珠用去离子水洗涤三次，离心后弃上清，用pH为6的MES缓冲溶液重悬，同时加入活化剂，摇床摇匀，进行活化反应，然后使用MES缓冲溶液洗涤1次，最后用MES缓冲溶液重悬，得到活化的纳米磁珠溶液，所述活化剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺EDC和N-羟基琥珀酰亚胺NHS的混合物；
(1-2)登革病毒鼠单克隆标记抗体与活化的纳米磁珠溶液4℃过夜孵育，之后用pH为7.2的Tris缓冲液室温孵育30分钟以终止反应，采用纳米磁珠分离装置磁分离后重悬于0.5mL BSA-Tris缓冲液中，得到登革病毒纳米磁珠-抗体探针。
4.根据权利要求3所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，所述纳米磁珠分离装置包括主体机构(100)、供料机构(200)、清洗机构(300)、震动机构(400)、抽气机构(500)和磁体机构(600)；所述供料机构(200)与主体机构(100)流体连通，所述清洗机构(300)与主体机构(100)流体连通，且所述供料机构(200)与清洗机构(300)均位于主体机构(100)的顶部，所述震动机构(400)固定安装在主体机构(100)的外表面，所述抽气机构(500)设置在主体机构(100)的底部，所述磁体机构(600)滑动安装在主体机构(100)的上表面。
5.根据权利要求4所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，所述主体机构(100)包括安装板(101)、第一通孔(102)、钢化玻璃管(103)、进料软管(104)、第一阀门(105)、供料软管(106)和第二阀门(107)；
所述安装板(101)内部垂直贯穿开设有第一通孔(102)，所述第一通孔(102)的直径大于钢化玻璃管(103)的直径，所述第一通孔(102)的数量不仅可以有三个，还可以根据实际再对其进行增加；所述钢化玻璃管(103)贯穿第一通孔(102)，所述钢化玻璃管(103)采用强度高、抗拉性强、抗冲击性强的钢化玻璃制成，且所述钢化玻璃管(103)的数量根据第一通孔(102)的数量或实际需要决定；
所述钢化玻璃管(103)的顶端与进料软管(104)固定连接，且钢化玻璃管(103)的顶端设置有第一阀门(105)，所述第一阀门(105)由控制器控制，所述第一阀门(105)与进料软管(104)相连接，所述进料软管(104)采用生物化学惰性材料制成；所述多个进料软管(104)的顶端均与同一根供料软管(106)相连接，所述供料软管(106)与进料软管(104)所用材质相同；
所述钢化玻璃管(103)上设置有第二阀门(107)，所述第二阀门(107)位于安装板(101)的底部；其中所述安装板(101)平行于地面放置，所述钢化玻璃管(103)垂直与安装板(101)或倾斜与安装板(101)设置；
所述供料机构(200)包括混合箱(201)、抽液管(202)、第一微泵(203)和第三阀门(204)；
所述混合箱(201)内放置有样品液与纳米磁珠的混合液，所述抽液管(202)的一端放置于混合箱(201)内的底部位置，且所述抽液管(202)的另一端与供料软管(106)相连接，所述抽液管(202)与供料软管(106)的材质相同；
所述抽液管(202)靠近供料软管(106)的地方设置有第一微泵(203)，所述第一微泵(203)采用精密注射泵；所述抽液管(202)与供料软管(106)相连接的地方设置有第三阀门(204)，所述第一微泵(203)与第三阀门(204)均由控制器控制。
6.根据权利要求4所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，所述清洗机构(300)包括洗涤箱(301)、第一连接管(302)、第四阀门(303)、洗脱箱(304)、第二连接管(305)、第五阀门(306)、第二微泵(307)、第六阀门(308)、水箱(309)、第三连接管(310)、第七阀门(311)和高压泵(312)；
所述洗涤箱(301)内装有洗涤液，所述洗涤箱(301)通过第一连接管(302)与第二微泵(307)相连接，所述第一连接管(302)上设置有第四阀门(303)，且所述第一连接管(302)与供料软管(106)的材质相同；所述洗脱箱(304)内装有洗脱液，所述洗脱箱(304)通过第二连接管(305)与第二微泵(307)相连接，所述第二连接管(305)上设置有第五阀门(306)，且所述第二连接管(305)与供料软管(106)材质相同；所述第四阀门(303)和第五阀门(306)均由控制器控制；
所述第二微泵(307)有两个进液口，且两个进液口互不相通，所述两个进液口分别于第一连接管(302)和第二连接管(305)相连接，所述第二微泵(307)与第一微泵(203)一样采用精密注射泵，所述第二微泵(307)的出液口与供料软管(106)相连通，且供料软管(106)靠近第二微泵(307)的位置设置有第六阀门(308)，且所述第六阀门(308)有多个，分别设置于供料软管(106)上位于每两个进料软管(104)之间；所述第二微泵(307)与第六阀门(308)均由控制器控制；
所述水箱(309)通过第三连接管(310)与供料软管(106)相连接，且第三连接管(310)与供料软管(310)相连接的地方位于最右侧进料软管(104)与第六阀门(308)之间，所述水箱(309)内装有清水；
所述第三连接管(310)靠近供料软管(106)的一端设置有第七阀门(311)，所述第三连接管(310)上设置有高压泵(312)，所述高压泵(312)位于第七阀门(311)与水箱(309)之间。
7.根据权利要求4所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，所述震动机构(400)包括环形振动器(401)、弹簧(402)、固定块(403)和第二通孔(404)；
所述环形振动器(401)环孔的直径大于第一通孔(102)的直径，且环形振动器(401)与第一通孔(102)同轴设置，所述环形振动器(401)数量由钢化玻璃管(103)的数量决定，所述环形振动器(401)的竖切面为L型，所述环形振动器(401)由控制器控制；
所述环形振动器(401)的L型底板上设置有多个弹簧(402)，所述多个弹簧(402)的顶端均固定安装有固定块(403)，所述固定块(403)的竖切面为T型，所述固定块(403)与环形振动器(401)的环孔相契合，所述固定块(403)位于环形振动器(401)的环孔内，且环形振动器(401)与固定块(403)之间留有一定空隙；
所述固定块(403)的中心处贯穿开设有第二通孔(404)，所述第二通孔(404)、固定块(403)和环形振动器(401)均为同轴设置，所述第二通孔(404)的内部贯穿固定有钢化玻璃管(103)。
8.根据权利要求4所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，所述抽气机构(500)包括双轴电机(501)、第一皮带(502)、第一滑槽(503)、第一滑块(504)、气动伸缩杆(505)、连接杆(506)、抽气孔(507)、抽气机(508)、密封环(509)和密封槽(510)；
所述双轴电机(501)固定安装在安装板(101)的背面，且所述双轴电机(501)位于钢化玻璃管(103)的正后方；所述安装板(101)的下表面开设有第一滑槽(503)，且所述第一滑槽(503)的形状为T型；所述第一滑槽(503)的内部滑动安装有第一滑块(504)，且所述第一滑块(504)的形状为工型；所述双轴电机(501)的底部输出端通过第一皮带(502)与第一滑块(504)相连接，所述双轴电机(501)由控制器控制；
所述第一滑块(504)的底部中心位置处固定安装有气动伸缩杆(505)，所述气动伸缩杆(505)由控制器控制，所述气动伸缩杆(505)的正面底部固定安装有连接杆(506)，所述连接杆(506)的形状为L型；所述连接杆(506)的竖直部分贯穿开设有抽气孔(507)；所述抽气孔(507)的底部固定安装有抽气机(508)，且抽气机(508)的抽气口与抽气孔(507)相吻合；
所述连接杆(506)竖直部分的顶端固定安装有密封环(509)，所述密封环(509)上开设有与抽气孔(507)相连通的通孔，且所述密封环(509)的上表面开设有与钢化玻璃管(103)相吻合的密封槽(510)；
所述磁体机构(600)包括第二滑槽(601)、第二滑块(602)、第二皮带(603)、支撑杆(604)和永磁条(605)；
所述安装板(101)的上表面开设有与第一滑槽(503)相对称的第二滑槽(601)，所述第二滑槽(601)的内部滑动安装有与第一滑块(504)形状大小相同的第二滑块(502)；所述双轴电机(501)的顶部输出端通过第二皮带(603)与第二滑块(602)相连接；
所述第二滑块(602)的上表面中心处固定安装有支撑杆(604)，所述支撑杆(604)靠近钢化玻璃管(103)的一侧固定安装有永磁条(605)，所述永磁条(605)的底端与固定块(403)的上表面平齐，且所述永磁条(605)的顶端优选与钢化玻璃管(103)的顶端平齐。
9.根据权利要求1所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，
(2-1)纳米磁珠免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸收垫及底板组成；
(2-2)利用XYZ三维划膜喷金仪以浓度为1mg/mL的羊抗兔抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控带C线，以浓度为1mg/mL的登革病毒鼠单克隆标记抗体Ⅱ+Ⅲ在硝酸纤维素膜上划线作为检测带T线，质控带C线和检测带T线的间距为7mm；划线后，将硝酸纤维素膜置于恒温箱中干燥1h；
(2-3)在结合垫上喷涂偶联后的登革病毒纳米磁珠-抗体探针，喷涂参数为0.25μL/mm，然后将结合垫置于恒温箱中干燥1h；
(2-4)将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫从底板一端至另一端依次叠加铺设在底板上，组成层析条，其中硝酸纤维素膜上的检测带T线靠近结合垫；
(2-5)采用切条机切成宽度为4mm的试纸条，外加卡壳即组装完成，最后将组装好的试纸条置于密封袋中室温干燥保存；其中外加卡壳的读取孔正对着硝酸纤维素膜，外加卡壳的加样孔正对着样品垫。
10.根据权利要求9所述的基于纳米磁珠免疫层析技术建立登革病毒高灵敏检测方法，其特征在于，在步骤(3)中，
(3-1)取500μL登革病毒抗原待测样品与1μL的登革病毒纳米磁珠-抗体探针；反应5分钟后磁吸附分离，弃去上清液，然后加入100μL的稀释液，得到革病毒抗原样品溶液；
(3-2)取出纳米磁珠检测条卡壳，在加样孔中加入步骤(3-1)得到革病毒抗原样品溶液，开始层析检测，计时10分钟；
(3-3)若质控带C线和检测带T线同时显色，则登革病毒抗原待测样品含有登革病毒，若质控带C线显色而检测带T线不显色，则登革病毒抗原待测样品不含有登革病毒。
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