CN110568190A - 登革热病毒抗原、检测试剂、检测试纸、检测试剂盒及其使用方法 - Google Patents
登革热病毒抗原、检测试剂、检测试纸、检测试剂盒及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种登革热病毒抗原、检测试剂、检测试纸、检测试剂盒及其使用方法。该登革热病毒抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽及氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽中的至少一种。上述登革热病毒抗原能够与登革热病毒抗体特异性结合，灵敏度和特异性均较高，并且在检测登革热病毒时，样本使用量较少、检测周期短且成本低。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，特别是涉及一种登革热病毒抗原、检测试剂、检测试纸、检测试剂盒及其使用方法。
背景技术
登革病毒(Dengue Virus，DENV)是一种在全球广泛传播的蚊媒传染病毒，主要由埃及伊蚊和白纹伊蚊传播，可引起登革热、登革出血热和登革休克综合征，对人类的健康有着巨大的威胁。
目前临床上检测DENV感染的主要方法是血清法，也即是使用DENV重组蛋白作为包被抗原检测血清中抗登革病毒抗体，但血清法检测DENV时存在样本使用量较大、检测时间较长的问题。此外，DENV重组蛋白的制作工艺较为复杂，检测成本较高，限制了其在经济条件较差地域的使用。
发明内容
基于此，有必要提供一种能够减少样本使用量、缩短检测时间且成本较低的登革病毒抗原。
此外，还提供一种样本使用量少、检测时间短且成本低的登革热病毒的检测试剂、检测试纸、检测试剂盒及其使用方法。
一种登革热病毒抗原，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽及氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽中的至少一种。
上述登革热病毒抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽及氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽中的至少一种。经研究，DENV及其亚型的特异性表位主要位于包膜蛋白的结构域I和结构域III上。氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽针对DENV包膜蛋白的结构域I设计，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽针对DENV包膜蛋白的结构域III设计。
经过证实，上述登革热病毒抗原能够与登革热病毒抗体特异性结合，灵敏度和特异性均较高，并且在检测登革热病毒时，样本使用量较少、检测周期短。此外，上述登革热病毒抗原能够通过人工合成，工艺较为成熟简便，生产成本较低。
上述登革热病毒抗原在制备登革热病毒的检测试剂、制备登革热病毒的检测试纸或制备登革热病毒的检测试剂盒中的应用。
一种登革热病毒的检测试剂，包括上述登革热病毒抗原。
在其中一个实施例中，所述检测试剂是磁珠试剂，所述登革热病毒抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽，所述登革热病毒抗原包被在磁珠上。
一种登革热病毒的检测试纸，包括衬底及设在所述衬底上的登革热病毒抗原，所述登革热病毒抗原为上述登革热病毒抗原。
在其中一个实施例中，所述包被膜上同时包被有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的抗原。
一种登革热病毒的检测试剂盒，包括：
上述登革热病毒抗原；或
上述登革热病毒的检测试剂；或
上述登革热病毒的检测试纸。
在其中一个实施例中，还包括样本稀释液、包被液、封闭液、洗涤液及显色液中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述样本稀释液选自碳酸盐缓冲液、PBS缓冲液及TBS缓冲液中的一种。
一种登革热病毒的检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
将待测样品与包被在固相载体上的登革热病毒抗原混合后温育，然后加入检测抗体，继续温育，其中，所述登革热病毒抗原为上述登革热病毒抗原，所述检测抗体能够与登革热病毒抗体结合且带有检测标记；及
检测，得到检测结果。
附图说明
图1为实施例1的E1～E10针对的登革热病毒的包膜蛋白的位置示意如图；
图2为E1～E10的间接CLEIA实验结果图；
图3为实施例3中E1作为包被抗原检测抗DENV IgM的ROC曲线；
图4为实施例3中E1作为包被抗原检测抗DENV IgM水平的散点图；
图5为实施例3中E7作为包被抗原检测抗DENV IgM的ROC曲线；
图6为实施例3中E7作为包被抗原检测抗DENV IgM水平的散点图；
图7为实施例3中E1/E7作为包被抗原检测抗DENV IgM的ROC曲线；
图8为实施例3中E1/E7作为包被抗原检测抗DENV IgM水平的散点图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的部分实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种登革热病毒抗原，该登革热病毒抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽及氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽中的至少一种。具体地，如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列为：TMAKDKPTLDIELLKTEVTNPAVLRKLCIE。如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列为：FKLEKEVAETQHGTVLVQVKYEGTDAPCKI。
在其中一个实施例中，登革热病毒抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽。进一步地，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽的质量比例为1：10～10:1。
经研究，登革病毒(DENV)及其亚型的特异性表位主要位于包膜蛋白的结构域I和结构域III上。氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽针对DENV包膜蛋白的结构域I设计，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽针对DENV包膜蛋白的结构域III设计。
经过证实，上述登革热病毒抗原能够与登革热病毒抗体特异性结合，灵敏度和特异性均较高，并且在检测登革热病毒的过程中，样本使用量较少且检测快速。另外，上述登革热病毒抗原能够通过人工合成，与DENV重组蛋白的合成相比，工艺较为成熟简便，生产成本较低。
上述登革热病毒抗原在制备登革热病毒的检测试剂、制备登革热病毒的检测试纸或制备登革热病毒的检测试剂盒中的应用。
本发明一实施方式还提供了一种登革热病毒的检测试剂，该登革热病毒的检测试剂包括上述登革热病毒抗原。
具体地，上述登革热病毒抗原可以作为包被抗原，用于与待测样品中的登革热病毒抗体结合。当然，上述登革热病毒抗原还可以作为检测抗体，用于检测与待测样品中登革热病毒抗体与包被抗原结合情况。
在其中一个实施例中，登革热病毒的检测试剂为磁珠试剂，上述登革热病毒抗原包被在磁珠上。
进一步地，磁珠上包被有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原或氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的抗原。
进一步地，磁珠上同时包被有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的抗原。同时包被有两种抗原的磁珠使用时更简便。
上述登革热病毒的检测试剂由于包括上述登革热病毒抗原，在检测登革热病毒时，能够特异性地与登革热病毒抗体结合，并且灵敏度高、特异性好、样本使用量较少、检测快速、成本低。
本发明一实施方式还提供了一种登革热病毒的检测试纸。该登革热病毒的检测试纸包括衬底及设在衬底上的设有上述登革热病毒抗原。
在其中一个实施例中，衬底为多孔板状，上述登革热病毒抗原包被于孔内。
在其中一个实施例中，该登革热病毒的检测试纸包括衬底及设在衬底上的包被膜，包被膜上设有上述登革热病毒抗原。进一步地，包被膜为硝酸纤维素膜。
上述登革热病毒的检测试纸包括上述登革热病毒抗原，在检测登革热病毒时，能够特异性地与登革热病毒抗体结合，并且灵敏度高、特异性好、样本使用量较少、检测快速、成本低。
本发明一实施方式还提供了一种登革热病毒的检测试剂盒，该登革热病毒的检测试剂盒包括：上述登革热病毒抗原；或者上述登革热病毒的检测试剂；或者登革热病毒抗原的检测试纸。
在其中一个实施例中，上述登革热病毒的检测试剂还包括样本稀释液、包被液、封闭液、洗涤液及显色液中的至少一种。
具体地，样本稀释液选自碳酸盐缓冲液、PBS缓冲液及TBS缓冲液中的至少一种。进一步地，样本稀释液是碳酸盐缓冲液及PBS缓冲液中的一种。当然，可以理解的是，在其他一些实施方式中，样本稀释液还可以是本领域常见的其他样本稀释液。
具体地，包被液选自碳酸盐缓冲液、PBS缓冲液及TBS缓冲液中的至少一种。进一步地，包被液选自碳酸盐缓冲液及PBS中的一种。当然，可以理解的是，在其他一些实施方式中，包被液还可以是本领域常见的其他包被液。
具体地，封闭液选自含1％～3％(v/v)BSA的PBS溶液、含1％～3％(v/v)BSA的Casein溶液及10％(v/v)马血清溶液中的至少一种。进一步地，封闭液选自含3％(v/v)BSA的PBS溶液及含3％(v/v)BSA的Casein溶液中的一种。当然，可以理解的是，在其他一些实施方式中，封闭液还可以是本领域常见的其他封闭液。
具体地，洗涤液选自含0.05％～0.2％(v/v)Tween-20的PBST、含0.05％～0.2％(v/v)Tween-20的TBS和10％Triton中的至少一种。进一步地，洗涤液为含有0.05％～0.1％(v/v)Tween-20的PBST(磷酸盐吐温缓冲液)。当然，可以理解的是，在其他一些实施方式中，洗涤液还可以是本领域常见的其他洗涤液。
具体地，检测抗体能够与登革热病毒抗体结合，并且带有检测标记。检测标记可以是酶标记、荧光素标记、生物素标记和胶体金标记中的任意一种。进一步地，检测抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgM-μ链。
具体地，显色液根据检测抗体的标记类型进行选择。
上述登革热病毒的检测试剂盒的使用方法，包括步骤S110～步骤S150。具体地：
步骤S110、将上述登革热病毒抗原包被到固相载体上。
具体地，将上述登革热病毒抗原用稀释液稀释后与固相载体混合，或者将稀释后的上述登革热病毒抗原加到固相载体上，然后加入包被液，在2℃～4℃的温度下8h～16h。然后弃去多余的包被液，并用洗涤液清洗，接着加入封闭液，在37℃下温育1h～3h，弃去多余的封闭液，并用洗涤液清洗，得到包被好的登革热病毒抗原。进一步地，固相载体可以为磁珠、乳胶微球、聚苯乙烯板或硝酸纤维素膜。当然，上述登革热病毒抗原需能够包被到固相载体上。例如固相载体上具有能够与上述登革热病毒抗原结合的基团。
在其中一个实施例中，上述登革热病毒抗原的包被浓度为5μg/mL～20μg/mL。进一步地，上述登革热病毒抗原的包被浓度为8μg/mL～15μg/mL。
在其中一个实施例中，固相载体为磁珠。进一步地，固相载体为免疫磁珠。上述登革热病毒抗原与磁珠混合后将上述登革热病毒抗原包被到磁珠上，得到包被好的登革热病毒抗原。
在其中一个实施例中，固相载体为聚苯乙烯板，聚苯乙烯板上间隔设有多个孔。孔内已经表面处理，能够将上述登革热病毒抗原包被到孔中，得到包被好的登革热病毒抗原。
当然，在一些实施方式中，包被上述登革热病毒抗原的步骤在制备上述登革热病毒的检测试剂盒时已经完成，此时，使用该检测试剂盒时即可省略。
步骤S130、将待测样品与包被在固相载体上的登革热病毒抗原混合后温育，然后加入检测抗体，继续温育。
具体地，将待测样品为血清。将待测样品稀释200倍～800倍后与包被好的登革热病毒抗原混合，并在37℃下温育20min～45min。进一步地，待测样品与登革热病毒抗原的温育的时间为25min～35min。然后，弃掉未结合的物质，并用洗涤液清洗，然后加入检测抗体，并在37℃下温育20min～45min。进一步地，检测抗体的温育时间为25min～35min。进一步地，待测样品的稀释倍数为300倍～400倍。检测抗体的稀释倍数为8万倍至32万倍，也即是检测抗体的浓度为3.125ng/mL～12.5ng/mL。
步骤S150、检测，得到检测结果。
具体地，弃掉未结合的检测抗体，并用洗涤液清洗。然后加入与检测抗体的标记对应的显色液进行显色。显色结束后，进行检测，得到检测结果。
上述登革热病毒的检测试剂盒的使用方法简捷。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
委托吉尔生化(上海)有限公司合成表1所示的登革热病毒抗原。其中：
编号E1的登革热病毒抗原(简称E1)针对DENV包膜蛋白的结构域I设计，编号E7和编号E10的登革热病毒抗原(简称E7)针对DENV包膜蛋白的结构域III设计。
编号E2的登革热病毒抗原(简称E2)的氨基酸序列与登革热病毒包膜蛋白第65～104位的氨基酸序列相同；编号E3的登革热病毒抗原(简称E3)的氨基酸序列与登革热病毒包膜蛋白第125位～161位的氨基酸序列相同；编号E4的登革热病毒抗原(简称E4)的氨基酸序列与登革热病毒包膜蛋白的第144位～176位的氨基酸序列相同；编号E5的登革热病毒抗原(简称E5)的氨基酸序列与登革热病毒包膜蛋白的第185位～212位的氨基酸序列相同；编号E6的登革热病毒抗原(简称E6)的氨基酸序列与登革热病毒包膜蛋白的第220位～249位的氨基酸序列相同；编号E8的登革热病毒抗原(简称E8)的氨基酸序列与登革热病毒包膜蛋白的第324位～353位的氨基酸序列相同；编号E9的登革热病毒抗原(简称E9)的氨基酸序列与登革热病毒包膜蛋白的第336位～375位的氨基酸序列相同；编号E10的登革热病毒抗原(简称E10)的氨基酸序列与登革热病毒包膜蛋白的第371位～400位的氨基酸序列相同。
表1
E1～E10所针对的登革热病毒的包膜蛋白的位置示意如图1所示。
在图1中，Alpha Regions Garnier-Robson为Garnier-Robson法分析的肽段二级结构Alpha螺旋区域；Alpha Regions Chou-Fasman为Chou-Fasman法分析的肽段二级结构Alpha螺旋区域；Beta Regions Garnier-Robson为Garnier-Robson法分析的肽段二级结构Beta折叠区域；Beta Regions Chou-Fasman为Chou-Fasman法分析的肽段二级结构Beta折叠区域；Turn Regions Garnier-Robson为Garnier-Robson法分析的肽段二级结构转角区域；Turn Regions Chou-Fasman为Chou-Fasman法分析的肽段二级结构转角区域；CoilRegions Garnier-Robson为Garnier-Robson法分析的肽段二级结构无规则卷曲区域；Hydrophilicity of Kyte-Doolittle为Kyte-Doolittle法分析的肽段的亲水性；AlphaAmphipathic Regions Eiserberg为Eiserberg法分析的肽段的两性Alpha螺旋区域；BataAmphipathic Regions Eiserberg为Eiserberg法分析的肽段的两性Bata折叠区域；Flexibility of Karplus-Schulz为Karplus-Schulz分析的肽段的可塑性；AntigenicIndex of Jameson-wolf为ameson-wolf分析的肽段的抗原指数；Surface Probability ofEmini为Emini法分析的肽段的表面可及性参数。
实施例2
将实施例1合成的10条登革热病毒抗原分别作为包被抗原进行间接化学发光酶免疫法(Chemiluminescence Enzyme Immunoassay,CLEIA)实验，以验证10条多肽的特异性。即将10条登革热病毒抗原分别包被到微孔板(Costar，Corning，USA)后，取经Panbio登革IgM捕获ELISA(Dengue IgM Capture)试剂盒(澳大利亚Panbio公司)确定的2个阳性血清和2个阴性血清进行测试。通过比较10条登革热病毒抗原测试这4个样本的P/N值，评估10条登革热病毒抗原的特异性。P/N值越大表示该条多肽的灵敏度和特异性越好。其中，每条登革热病毒抗原作为包被抗原进行间接CLEIA法的操作步骤均如下：
(1)抗原的稀释和包被：将登革热病毒抗原溶液与0.05mol pH 9.6碳酸盐缓冲液混合，配制成登革热病毒抗原的浓度为10μg/mL的包被液。然后向微孔板的微孔中加入包被液，加入量为100μL/孔。接着在4℃的温度下过夜。
(2)微孔板的封闭：弃去抗原包被液后，用含有0.05％(v/v)Tween-20的PBST洗涤液将每个孔洗涤5次，然后每孔加入200uL含3％BSA的PBS封闭液，在37℃下温育2h。
(3)加血清：倒去封闭液，用含有0.05％(v/v)Tween-20的PBST洗涤液将每个孔洗涤5次；用PBS将血清稀释400倍，然后每孔加入100μL稀释后的血清，震荡混匀后，将微孔板在37℃下温育30min。
(4)加检测抗体：倒去血清，用含有0.05％(v/v)Tween-20的PBST洗涤液将每个孔洗涤5次；用PBS将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgM-μ链(美国abcam公司，以下简称酶标二抗)稀释16万倍，每孔加100μL稀释后的酶标二抗，震荡混匀后，将微孔板在37℃下温育30min。
(5)显色：弃掉酶标二抗，用含有0.05％(v/v)Tween-20的PBST洗涤液将每个孔洗涤5次。将SuperSignal(R)ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate显色液(以下简称显色液)从4℃取出。取等量的显色液的A液和B液混匀；然后每孔加入混合后的底物液50uL，加完后震荡混匀。
(6)测试：加入混合后的A液和B液，并混匀后，使用多功能酶标仪(EnSpire，PerkinElmer，USA)，在425nm读取发光强度。
10条登革热病毒抗原的间接CLEIA实验结果如表2及图2所示。
表2中IgM+血清1表示IgM阳性血清1，IgM+血清2表示IgM阳性血清2，IgM-血清1表示IgM阴性血清1，IgM-血清2表示IgM阴性血清2。
图2中DENV IgM+sample1表示IgM阳性血清1，DENV IgM+sample2表示IgM阳性血清2；DENV IgM-sample1表示IgM阴性血清1；DENV IgM-sample2表示IgM阴性血清2。
表2
由表2中可以看出，10条的登革热病毒抗原测试的2个DENV IgM+血清样品发光强度之和与2个DENV IgM-血清样品发光强度之和的比值分别是：4.55、1.95、2.08、1.61、1.62、1.86、4.9、1.24、1.89和2.12。这些结果表明，E1和E7具有更高的抗原性。
由图2也同样可以看出，E1和E7具有更高的抗原性。
实施例3
(1)使用由广州市第八人民医院、深圳国际旅行卫生保健中心和广东省佛山市南海区第三人民医院提供的176例血清样本，评估E1、E7、E1与E7的混合物(简称E1/E7，其中，E1与E7的质量比例为1：1)在间接CLEIA法中的灵敏度和特异性。该176个血清样本中，120例血清样本为anti-DENV IgM抗体阳性，56例血清标本为anti-DENV IgM抗体阴性。间接CLEIA法的操作与实施例2的大致相同，其不同在于，实施例3使用的血清样本与实施例2使用的血清样本不同。
(2)采用受试者工作特征(ROC)曲线对176例血清样本的结果进行分析，确定cut-off值，并计算将E1、E7和E1/E7的特异性和灵敏度。结果如表3及图3～图7所示。图3、图5和图7分别是使用E1、E7和E1/E7作为包被抗原检测抗DENV IgM的ROC曲线；图4、图6和图8分别是使用E1、E7和E1/E7作为包被抗原检测抗DENV IgM水平的散点图；图4、图6和图8中的水平虚线表示cut-off值。
由图3可知，E1的灵敏度为82.8％、特异性为94.64、AUC(Area Under Curve，ROC曲线下方的面积大小)为0.913。由图5可知，E7的灵敏度为79.17％、特异性为92.86、AUC(AreaUnder Curve，ROC曲线下方的面积大小)为0.898。由图7可知，E1/E7的灵敏度为85％、特异性为96.43、AUC(Area Under Curve，ROC曲线下方的面积大小)为0.916。
表3
| 项目 | E1 | E7 | E1/E7 |
| 灵敏度(％) | 82.50 | 79.17 | 85.00 |
| 特异性(％) | 94.64 | 92.86 | 96.43 |
由表3和图3～图8可知，E1、E7和E1/E7均有良好的灵敏度和特异性，其中E1/E7的灵敏度和特异性较E1和E7更好。
实施例4
将E1、E7和E1/E7的灵敏度、特异性、样本使用量、检测时间及价格与其他检测方法及涉及的检测试剂进行对比，结果如表4所示。
表4
参考文献[1]为：Vazquez S,Hafner G,Ruiz D,et al.Evaluation ofimmunoglobulin M and G capture enzyme-linked immunosorbent assay Panbio kitsfor diagnostic dengue infections.[J].Journal of Clinical Virology,2007,39(3):194-198。
参考文献[2]为：Hunsperger E A,Yoksan S,Buchy P,et al.Evaluation ofcommercially available anti-dengue virus immunoglobulin M tests.[J].EmergingInfectious Diseases,2009,15(3):436.
参考文献[3]为：Najioullah F,Viron F,Césaire R.Evaluation of fourcommercial real-time RT-PCR kits for the detection of dengue viruses inclinical samples[J].Virology Journal,2014,11(1):164。
参考文献[4]为：Kumarasamy V,Chua S K,Hassan Z,et al.Evaluating thesensitivity of a commercial dengue NS1 antigen-capture ELISA for earlydiagnosis of acute dengue virus infection.[J].Singapore Medical Journal,2007,48(7):669。
参考文献[5]为：Kittigul L,Meethien N,Sujirarat D,et al.Comparison ofdengue virus antigens in sera and peripheral blood mononuclear cells fromdengue infected patients[J].Asian Pacific Journal of Allergy&Immunology,1997,15(4):187-91。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳国际旅行卫生保健中心
南方医科大学珠江医院
深圳市基音生物科技有限公司
<120> 登革热病毒抗原、检测试剂、检测试纸、检测试剂盒及其使用方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Thr Met Ala Lys Asp Lys Pro Thr Leu Asp Ile Glu Leu Leu Lys Thr
1 5 10 15
Glu Val Thr Asn Pro Ala Val Leu Arg Lys Leu Cys Ile Glu
20 25 30
<210> 2
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Phe Lys Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu
1 5 10 15
Val Gln Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile
20 25 30
<210> 3
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Ala
1 5 10 15
Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn Phe Val Cys Arg Arg Thr Phe
20 25 30
Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly
35 40
<210> 4
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Glu Gly Lys Ile Val Gln Tyr Glu Asn Leu Lys Tyr Ser Val Ile
1 5 10 15
Val Thr Val His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr
20 25 30
Glu His Gly Thr Thr
35
<210> 5
<211> 33
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
His Thr Gly Asp Gln His Gln Val Gly Asn Glu Thr Thr Glu His Gly
1 5 10 15
Thr Thr Ala Thr Ile Thr Pro Gln Ala Pro Thr Ser Glu Ile Gln Leu
20 25 30
Thr
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Thr
1 5 10 15
Met Lys Lys Lys Ser Trp Leu Val His Lys Gln Trp
20 25
<210> 7
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Trp Thr Ser Gly Ala Ser Thr Ser Gln Glu Thr Trp Asn Arg Gln Asp
1 5 10 15
Leu Leu Val Thr Phe Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu
20 25 30
<210> 8
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser Ser
1 5 10 15
Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu Ile Thr
20 25 30
<210> 9
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Pro Phe Ser Ser Gln Asp Glu Lys Gly Val Thr Gln Asn Gly Arg Leu
1 5 10 15
Ile Thr Ala Asn Pro Ile Val Thr Asp Lys Glu Lys Pro Val Asn Ile
20 25 30
Glu Ala Glu Pro Pro Phe Gly Glu
35 40
<210> 10
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Pro Pro Phe Gly Glu Ser Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Glu Lys Ala
1 5 10 15
Leu Lys Leu Ser Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Lys
20 25 30
Claims (10)
1.一种登革热病毒抗原，其特征在于，包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽及氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的多肽中的至少一种。
2.权利要求1所述的登革热病毒抗原在制备登革热病毒的检测试剂、制备登革热病毒的检测试纸或制备登革热病毒的检测试剂盒中的应用。
3.一种登革热病毒的检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的登革热病毒抗原。
4.根据权利要求3所述的登革热病毒的检测试剂，其特征在于，所述检测试剂是磁珠试剂，所述登革热病毒抗原包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽和氨基酸序列如SEQID NO.2所示的多肽，所述登革热病毒抗原包被在磁珠上。
5.一种登革热病毒的检测试纸，其特征在于，包括衬底及设在所述衬底上的登革热病毒抗原，所述登革热病毒抗原为权利要求1所述的登革热病毒抗原。
6.根据权利要求5所述的登革热病毒的检测试纸，其特征在于，所述包被膜上同时包被有氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的抗原和氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的抗原。
7.一种登革热病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求1所述的登革热病毒抗原；或
权利要求3～4任一项所述的登革热病毒的检测试剂；或
权利要求5～6任一项所述的登革热病毒的检测试纸。
8.根据权利要求7所述的登革热病毒的检测试剂盒，其特征在于，还包括样本稀释液、包被液、封闭液、洗涤液及显色液中的至少一种。
9.根据权利要求7所述的登革热病毒的检测试剂盒，其特征在于，所述样本稀释液选自碳酸盐缓冲液、PBS缓冲液及TBS缓冲液中的一种。
10.一种登革热病毒的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品与包被在固相载体上的登革热病毒抗原混合后温育，然后加入检测抗体，继续温育，其中，所述登革热病毒抗原为权利要求1所述的登革热病毒抗原，所述检测抗体能够与登革热病毒抗体结合且带有检测标记；及
检测，得到检测结果。
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