CN101545902A - 自动化进样分辨的化学发光多组分免疫检测系统及分析方法 - Google Patents

Abstract

一种自动化进样分辨的化学发光多组分免疫检测系统及分析方法。该检测系统的温育体系由试管(1)、搅拌子(2)、磁珠(3)和恒温磁力搅拌器(11)组成；多通道进样体系由进样通道(4)、磁铁(12)和玻璃管(13)组成；溶液传输体系由蠕动泵(14)、连接管(10)、多功能注射阀(15)和多位阀(16)组成；信号采集体系由检测通道(9)、平面镜(17)和光电倍增管(18)组成；该方法是在功能化的磁珠表面固定多种捕获抗体，和待测物以及示踪抗体特异性地反应，形成夹心复合物；用磁铁收集并洗去过量的酶标抗体后通入化学发光底物液，再将其顺序注射进检测通道进行检测。该方法具有简便、快速、重现性好灵敏度高和成本低等特点，可应用于临床诊断、环境监测、食品安全等领域。

Description

自动化进样分辨的化学发光多组分免疫检测系统及分析方法

一、技术领域

本发明为进样分辨多组分化学发光免疫分析技术，涉及近同时检测同一样品中多种待测物的免疫分析方法。使用磁珠作为免疫反应载体，并结合了化学发光与流动分析技术；本发明还涉及用于多组分化学发光免疫分析的自动化检测仪器系统。

二、背景技术

免疫分析具有选择性高、灵敏度高、普适性好等优点，在食品安全、环境监测、临床诊断、药物分析和微生物检验等领域有着广泛的应用。将免疫应用于实际领域时，常需要测定复杂样品中多种组分的含量，如在癌症诊断中，对多种肿瘤标记物的同时测定为诊断提供了有力的依据。又如在食品安全领域，常需要同时检测多种抗生素的含量，以综合评价食品安全水平。

测定复杂体系中的多种组分的含量，可以采用传统的单组分分析法。即每个分析流程只测定单一组分，经过多个分析流程，最后得到所有待测组分的含量。这种分析模式具有所需时间长，试剂消耗多，劳动量大的缺点。近年来兴起的多组分免疫分析技术可以在单个分析流程中同时或者近同时实现多种组分的检测，具有分析通量高、所需时间短、样品消耗少、分析成本低等优点。目前多组分免疫分析技术可以通过同时检测和顺序检测多个组分来实现。同时检测的方法是将空间分辨技术与阵列型的检测器相结合，或者将标记物分辨技术与基于波长分辨、时间分辨、电位分辨以及质量分辨的检测器相结合，从而实现多组分免疫分析。这些方法受到仪器空间、可用的标记物和检测器通道等因素的限制，可检测的组分数量是有限的；增加检测器通道数或者使用昂贵的成像检测器会提高仪器的生产成本；不同标记物的最适合的检测条件往往不同，使得在同一分析体系中同时检测只能选择一种折衷性条件，导致分析效果降低。尽管不同标记物产生的信号可以通过波长或者电位等参数进行分辨，但是其分辨效率往往有限，会产生信号重叠的问题。顺序检测的方法可采用空间分辨的模式，顺序检测不同空间位置上信号来实现；或者结合毛细管电泳或者液相色谱分离技术，顺序检测经过分离后物质产生的信号；或者将通道分辨技术，底物区带分辨技术与流动注射化学发光分析相结合，通过顺序检测流通池的不同通道的信号，或者通过顺序注入不同标记物的底物区带来检测多种组分。

由于常用的免疫分析技术通常涉及到多次加样、温育、洗涤以及反应，最后检测的过程。操作多为手动完成，劳动量大，且所需时间大多在2小时以上，不适合高通量快速自动化分析。流动注射分析技术具有重现性好、自动化程度高、分析速度快等优点，是实现高通量快速自动化分析的有效手段之一。而化学发光分析技术是一种高灵敏度的分析技术之一，并且仪器便宜、操作简便、环境友好，特别适合于痕量物质的检测。

三、发明内容

本发明的内容是：以多通道进样分辨模式为基础，以免疫磁珠为载体，结合化学发光检测和流动注射分析技术，提供一种自动化的进样分辨化学发光多组分免疫分析方法；本发明的另一个目的还在于提供一套自动化的进样分辨化学发光多组分免疫检测系统。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种自动化进样分辨的化学发光多组分免疫检测系统，其特征在于该系统由温育体系、多通道进样体系、溶液传输体系、信号采集体系和计算机构成。其中温育体系由1至4个内置微型搅拌子(2)和磁珠(3)的微型玻璃试管(1)与恒温磁力搅拌器(11)所组成，微型玻璃试管(1)放在恒温磁力搅拌器(9)中，在37℃恒温水浴的条件下进行免疫反应；多通道的进样体系由进样通道(4)、磁铁(12)和玻璃管(13)组成，磁铁(12)放置在玻璃管(13)下，用来收集反应后的磁珠(3)；溶液传输体系由双向多通道蠕动泵(14)、连接管(10)、多功能注射阀(15)和多位阀(16)组成，连接管连接进样体系，通过双向多通道蠕动泵(14)和多功能注射阀(15)的一个通道，与洗涤缓冲液(21)，盐酸洗涤液(22)共同连接到多位阀(16)上，通过出口(6)与另一个多位阀的入口(7)相连，入口(7)与出口(8)以及底物液(19)、洗涤缓冲液(20)相连，多功能注射阀(15)的另一通道与废液试管(5)相连；信号采集体系由检测通道(9)、平面镜(17)和光电倍增管(18)组成，检测通道(9)的一头与多位阀的出口(8)相连，另一头与回收试管(23)相连，用于回收磁珠(3)。溶液传输体系与信号采集体系由计算机(24)自动控制。

上述的温育体系在37℃恒温水浴并对反应试剂进行搅拌的条件下进行免疫反应，加快了免疫反应的速度。双向多通道蠕动泵(14)的转速、流体流速、和流动的方向通过计算机(24)进行自动调节。多功能注射阀(15)通过转换通道使过量的反应试剂流入废液试管(5)中。多位阀(16)由计算机(17)控制转动实现不同流路的切换，它的中心入(出)口，可通过切换阀位分别与四周的六个入(出)口相通。

上述的磁铁(12)用于收集温育反应后的悬浮液中的磁珠(3)，连接管(10)可用内径0.8毫米的聚四氟乙烯制成。多通道的进样体系通过多位阀控制的顺序注射来进行多通道检测。

一种自动化进样分辨的化学发光多组分免疫分析方法，其分析步骤如下：

①将样品、固定了对应抗体的磁珠(3)与碱性磷酸酶标记的抗体加入到温育体系的玻璃试管(1)中，于37℃恒温水浴中搅拌温育，形成免疫夹心复合物；

②用蠕动泵(14)把磁珠(3)悬浮液经进样通道(4)通入玻璃管(13)中，在磁铁(12)的作用下收集磁珠(3)，并将过量的反应试剂通过多功能注射阀(15)的一个通道流入废液试管(5)中；

③调节多功能注射阀(15)，使用其另一通道。并使蠕动泵(14)反转，将洗涤缓冲液(20)经由多位阀(16)流经各个玻璃管(13)对收集的磁珠(3)进行洗涤。将底物液(19)由相同的管道注入到各个玻璃管中，在撤去磁铁的情况下于磁珠(3)混合形成悬浮液，并引发化学发光反应；

④磁珠(3)悬浮液在进行化学发光反应的同时，将蠕动泵(14)反转，使一个通道的悬浮液通过多功能注射阀(15)、多位阀(16)的出口(8)流过检测通道(9)，由化学发光的强度来检测相应待测组分的浓度。调节多位阀(16)，先后将盐酸洗涤液(22)和洗涤缓冲液(21)通入检测通道以消除前一组分的信号残留，再调节多位阀(16)，以同样的方法检测另一通道待测物。检测后的磁珠(3)悬浮液流入回收试管(23)进行回收。

⑤完成全检测过程后，将系统调节到初始状态，进入下一分析循环，统一收集使用后的磁珠(3)，用再生缓冲液处理以重复使用。

上述步骤③中的洗涤缓冲液(20)以及步骤④中的洗涤缓冲液(21)为0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4，含0.05％吐温-20；步骤④中的盐酸洗涤液为0.1M盐酸溶液。

上述步骤③中的底物液(19)为：disodium 3-(4-methoxyspiro{1，2-dioxetane-3，2’-(5’-chloro)tricyclo[3.3.1.1^3，7]decan}-4-yl)phenyl phosphate，CSPD；步骤⑤中使用的再生缓冲液为0.1M甘氨酸/盐酸缓冲液，pH2.0。

上述免疫分析系统所用的免疫反应载体为免疫磁珠，表面固定待测物相应的抗体。

上述检测系统和全部分析过程，包括温育、进样、洗涤、检测及排出磁珠皆由计算机进行自动化控制，测得化学发光信号值亦从计算机中输出。

本检测系统的工作原理：

本检测系统是基于传统的顺序检测模式，结合多通道进样和流动注射分析技术，可以在一个流程中测定多种物质。在功能化的磁珠表面分别共价结合不同组分的捕获抗体作为免疫分析的载体；固定了不同抗体的磁珠，与样品以及相应的酶标记的示踪抗体混合后，在37℃水浴搅拌的条件下温育反应，形成夹心复合物；多通道的进样技术将不同组分相应的磁珠悬浮液通入不同的管道中，并用磁铁收集磁珠；以冲洗缓冲液洗去过量的免疫试剂；通入发光底物，产生酶催化的化学发光反应；化学发光信号的采集是通过将不同通道内的磁珠悬浮液，在进行化学发光反应的同时，顺序流入检测通道进行检测；测定一个通道的信号完成后，以盐酸洗涤液，以及洗涤缓冲液洗涤检测通道并且排出磁珠，以进行下一个通道的检测；排出的磁珠统一收集后以再生缓冲液处理，可实现免疫磁珠的反复使用。

分析过程中，所有溶液由双向蠕动泵上的连接管传输进入分析系统，通过阀实现不同流路的切换，全过程由计算机进行程序化自动控制，信号亦由软件自动读出和记录。

相对于其他多组分免疫分析方法，具有以下特点：

(1)操作简单，全分析过程在流动体系完成，以计算机及软件进行自动化控制，手工操作极少，无需熟练操作人员。

(2)分析时间短，全过程包括加样、温育、洗涤、检测仅需12分钟，不仅是目前最快速的多组分免疫分析方法之一，也大大快于普通的单组分免疫分析方法。

(3)仪器设备简单，成本低廉，整个分析系统由廉价的蠕动泵、阀、聚四氟乙烯连接管、磁铁和化学发光检测器所组成，无需多组分免疫分析中常用的昂贵设备。

(4)检测后的磁珠用再生缓冲液处理，可以反复使用，与常规免疫分析方法相比，大大节约了昂贵的抗体，进一步降低了分析成本。

(5)由于采用了灵敏的酶催化化学发光分析方法，本方法可以检测出极低浓度的样品，满足绝大多数的分析需求。

(6)由于采用了自动化的流动分析技术，使得本方法的重现性相对于传统手动操作大为提高，有利于相关标准的制定。

四、附图说明：

图1自动化进样分辨化学发光多组分免疫检测系统得结构示意图

1-微型玻璃试管 2-搅拌子，3-磁珠，4-进样通道，5-废液试管，6-多位阀出口，7-多位阀入口，8-多位阀出口，9-恒温磁力搅拌器，10-连接管，11-恒温磁力搅拌器，12-磁铁，13-玻璃管，14-双向多通道蠕动泵，15-多功能注射阀，16-多位阀，17-平面镜，18-光电倍增管，19-底物液，20-洗涤缓冲液，21-洗涤缓冲液，22-盐酸洗涤液，23-回收试管，24-计算机。

五、具体实施方式：

实施例1：结合附图1对四组分检测系统作进一步说明：

该检测系统由温育体系、多通道进样体系、信号分辨采集体系和计算机所构成。对于四组分检测，温育体系由四个直径为0.8厘米，高度2厘米，内径为0.5厘米的装有微型搅拌子的玻璃试管和恒温水浴磁力搅拌器组成，玻璃试管置于磁力搅拌器的恒温水浴槽内；多通道进样体系由进样通道、磁铁和玻璃管组成，进样通道为内径为0.8毫米的聚四氟乙烯管，磁铁放置在玻璃管下，用来收集温育反应后的磁珠；溶液传输体系由双向多通道蠕动泵、0.8毫米的聚四氟乙烯连接管、八道多功能注射阀和六对一口的多位阀组成，连接管连接进样体系、双向多通道蠕动泵和多功能注射阀；信号采集体系由检测通道、平面镜和光电倍增管组成，检测通道为内径1毫米，长度为5厘米的石英管，其一头与多位阀的出口相连，另一头与回收试管相连，用于回收磁珠。全分析系统由计算机自动控制。

实施例2：化学发光四组分免疫分析方法：

具体分析流程如表1所示。

所有分析步骤由计算机进行程序化自动控制，测得化学发光信号从计算机中输出。分析步骤完成后统一收集固定了抗体的磁珠，浸泡在pH2.2的甘氨酸/盐酸缓冲液中10分钟，并用0.01M磷酸缓冲液(pH7.4)洗涤，以备再次使用。

实施例3：以在肿瘤的临床诊断上有显著意义的四种标志物：甲胎蛋白(AFP)、癌抗原125(CA125)、癌抗原CA199(CA199)、癌胚抗原(CEA)为例，说明该自动化进样分辨化学发光多组分免疫分析方法的应用。

使用环氧基活化的磁珠作为免疫反应的载体，分别共价固定鼠单克隆AFP抗体、鼠单克隆CA125抗体、鼠单克隆CA199抗体、鼠单克隆CEA抗体，以牛血清白蛋白封闭残余活性位点。示踪抗体为碱性磷酸酶标记的羊多克隆AFP、CA125、CA199、CEA抗体。

如表1所示流程，以临床血清样品中四种肿瘤标志物为检测对象，进行四组分化学发光免疫分析，得出待测样品中AFP、CA125、CA199、CEA的浓度。

Claims (9)

1.一种自动化进样分辨的化学发光多组分免疫检测系统，其特征在于该系统由温育体系、多通道进样体系、溶液传输体系、信号采集体系和计算机所构成。其中温育体系由1至4个内置微型搅拌子(2)和磁珠(3)的微型玻璃试管(1)与恒温磁力搅拌器(11)组成，微型玻璃试管(1)放在恒温磁力搅拌器(9)中，在37℃恒温水浴的条件下进行免疫反应；多通道的进样体系由进样通道(4)、磁铁(12)和玻璃管(13)组成，磁铁(12)放置在玻璃管(13)下，用来收集反应后的磁珠(3)；溶液传输体系由双向多通道蠕动泵(14)、连接管(10)、多功能注射阀(15)和多位阀(16)组成，连接管连接进样体系，通过双向多通道蠕动泵(14)和多功能注射阀(15)的一个通道，与洗涤缓冲液(21)和盐酸洗涤液(22)共同连接到多位阀(16)上，通过出口(6)与另一个多位阀的入口(7)相连，入口(7)与出口(8)以及底物液(19)、洗涤缓冲液(20)相连。多功能注射阀(15)的另一通道与废液试管(5)相连；信号采集体系由检测通道(9)、平面镜(17)和光电倍增管(18)组成，检测通道(9)的一头与多位阀的出口(8)相连，另一头与回收试管(23)相连，用于回收磁珠(3)。溶液传输系统与信号采集系统由计算机(24)自动控制。

2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的温育体系在37℃恒温水浴并对反应试剂进行搅拌的条件下进行免疫反应，加快了免疫反应的速度。

3.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的双向多通道蠕动泵(14)的转速、流体流速、和流动的方向通过计算机(24)进行自动调节。

4.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的多功能注射阀(15)可在计算机的控制下，通过转换通道使过量的反应试剂流入废液试管(5)中。

5.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的多位阀(16)可通过转动实现不同流路的切换。多位阀(16)的转动由计算机(17)控制。

6.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的磁铁(12)用于收集温育反应后的悬浮液中的磁珠(3)。

7.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于所述的多通道的进样体系是通过多位阀控制的顺序注射来进行多通道检测的。平面镜(17)用于反射向四周发射的光，从而增加检测器所能接受的光信号。

8.一种自动化进样分辨的化学发光多组分免疫分析方法，其分析步骤如下：

①将样品、固定了对应抗体的磁珠(3)与碱性磷酸酶标记的抗体加入到温育体系的玻璃试管(1)中，于37℃恒温水浴中搅拌温育，形成免疫夹心复合物；

②用蠕动泵(14)把磁珠(3)悬浮液经进样通道(4)通入玻璃管(13)中，在磁铁(12)的作用下收集磁珠(3)，并将过量的反应试剂通过多功能注射阀(15)的一个通道流入废液试管(5)中；

③调节多功能注射阀(15)，使用其另一通道。并使蠕动泵(14)反转，将洗涤缓冲液(20)经由多位阀(16)流经各个玻璃管(13)对收集的磁珠(3)进行洗涤。再将底物液(19)由相同的管道注入到各个玻璃管中，在撤去磁铁的情况下底物与磁珠(3)混合形成悬浮液，并引发化学发光反应；

④磁珠(3)悬浮液在进行化学发光反应的同时，将蠕动泵(14)反转，使一个通道的悬浮液通过多功能注射阀(15)、多位阀(16)的出口(8)流过检测通道(9)，由化学发光的强度来检测相应待测组分的浓度。调节多位阀(16)，先后将盐酸洗涤液(22)和洗涤缓冲液(21)通入检测通道以消除前一组分的信号残留，再调节多位阀(16)，以同样的方法检测另一通道待测物。检测后的磁珠(3)悬浮液流入回收试管(23)进行回收。

⑤完成全检测过程后，将系统调节到初始状态，进入下一分析循环，统一收集使用后的磁珠(3)，用再生缓冲液处理以重复使用。

9.根据权利要求8所述的分析方法，其特征在于步骤③中的洗涤缓冲液(20)以及步骤④中的洗涤缓冲液(21)为0.01M磷酸盐缓冲液，pH7.4，含0.05％吐温-20；步骤④中的盐酸洗涤液为0.1M盐酸溶液；步骤③中底物液(19)为disodium3-(4-methoxyspiro{1，2-dioxetane-3，2’-(5’-chloro)tricyclo[3.3.1.1^3，7]decan}-4-yl)phenylphosphate，CSPD；步骤⑤中使用的再生缓冲液为0.1M甘氨酸/盐酸缓冲液，pH2.0。

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