CN107328933A - 磁微粒增强免疫比浊检测盒及其应用 - Google Patents

磁微粒增强免疫比浊检测盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出的磁微粒增强免疫比浊检测盒，与胶乳增强免疫比浊试剂相比：胶乳微粒需要高速离心进行分离，而磁微粒能通过磁场快速分离，缩短制备时间，降低试剂制造成本。同时，磁微粒由于具有超顺磁性，磁场存在时能迅速聚集，磁场撤离后，磁微粒能快速分散，对磁微粒上抗体活性的影响较小。检测盒与化学发光免疫检测试剂相比：可应用于全自动生化分析仪，不需特定检测仪器，操作简单，检测速度快，稳定性好。同时，没有使用发光检测体系，试剂成本更低。

Description

磁微粒增强免疫比浊检测盒及其应用
技术领域
本发明涉及到生物检测领域，特别是涉及到一种磁微粒增强免疫比浊检测盒及其应用。
背景技术
现有的采用免疫比浊检测试剂检测血清的方法，一般使用胶乳增强技术，将抗体连接到胶乳微粒上，样本中的抗原与抗体发生免疫反应结合后，胶乳微粒亦产生聚集，放大了免疫反应的信号，从而达到增强体系检测信号的目的，在全自动生化分析仪上完成样本的检测。
而采用化学发光免疫检测试剂检测血清的方法，则采用磁微粒增强技术，将抗体连接到磁微粒上，样本中的抗原与抗体发生免疫反应结合后，利用磁微粒超顺磁性，将结合物分离下来，除去未结合杂质，加入化学发光检测物质(如酶标记抗体和酶催化的化学发光底物或发光物质直接标记的抗体)，通过检测发光强度达到检测的目的，需在化学发光分析仪上完成样本的检测。
然而现有的这两种检测血清的方法都有其缺点。例如使用胶乳增强免疫比浊试剂检测血清的方法，由于采用小粒径的胶乳微粒分离需高速冷冻离心机，分离时间长(30min-60min)，导致制造成本高。同时，由于离心时间长，离心后胶乳微粒需通过超声或均质机才能达到均匀分散的目的，过程中可能会破坏胶乳微粒上抗体的活性。
而采用化学发光免疫检测试剂检测血清的方法，则需特定检测仪器，发光检测体系价格高，试剂成本高。
发明内容
本发明的主要目的为提供一种磁微粒增强免疫比浊检测盒及其应用，能以较低的成本检测血清浓度，同时提高血清的检测效率。
本发明提出了一种磁微粒增强免疫比浊检测盒，包括R1试剂、R2试剂和校准品；
所述R1试剂包括第一缓冲液、增强剂、第一稳定剂和第一防腐剂；
所述R2试剂包括第二缓冲液，包括磁微粒-抗体复合物、第二稳定剂和第二防腐剂。
优选地，所述第一缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、MOPSO缓冲液、Good’s缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种。
优选地，所述第一缓冲液包括0.02M的PBS缓冲液，其pH为7.4。
优选地，所述第一增强剂包括PEG-300、PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000和PEG-8000中的一种或几种。
优选地，所述第一增强剂包括5％的PEG-6000。
优选地，所述第一稳定剂或第二稳定剂包括蛋白质、非离子表面活性剂中的一种或几种。
优选地，所述第一稳定剂包括0.5％BSA、0.1M甘氨酸，0.5％的曲拉通-100；
所述第二稳定剂包括0.5％BSA，0.1M甘氨酸。
优选地，所述第一防腐剂或第二防腐剂包括叠氮钠、Proclin300、抗生素中的一种或几种，所述抗生素包括四环素、庆大霉素、甲氧青霉素。
优选地，所述第一防腐剂包括0.1％的Proclin300；
所述第二防腐剂包括0.05％的Proclin300。
优选地，所述磁微粒-抗体复合物中的磁微粒的粒径为50nm-300nm。
优选地，所述校准样包括稀释液和重组蛋白，稀释液添加有稳定剂和防腐剂。
本发明还提出了R2试剂的制备方法，包括以下步骤：
将磁微粒放在磁力架上，吸附磁微粒，去掉保存液，用一定浓度缓冲液重悬磁微粒，使其均匀分散；
将EDC和Sulfo-NHS平衡至室温，配成指定浓度的溶液，按一定比例加入到重悬后的磁微粒中，震荡活化，获得活化的磁微粒；
将所述活化的磁微粒与抗体偶联，获得磁微粒-抗体复合物；
向所述磁微粒-抗体复合物中加入一定体积的封闭液，震荡混匀，在指定温度下反应指定时间；
反应后的磁微粒-抗体复合物经磁场分离后，去掉上层清液，用保存缓冲液清洗；
用保存缓冲液重悬清洗后的磁微粒-抗体复合物，得到R2试剂。
优选地，所述活化的磁微粒大小为50nm-300nm。
优选地，所述活化的磁微粒大小为100nm。
优选地，所述MES缓冲液浓度为0.02M-0.2M，pH为5.0-6.5。
优选地，所述MES缓冲液浓度为0.05M，pH为6.0。
优选地，加入的EDC和Sulfo-NHS与磁微粒的质量比为1:50至1:1。
优选地，加入的EDC和Sulfo-NHS与磁微粒的质量比为1:20。
优选地，所述将所述活化的磁微粒与抗体偶联，获得磁微粒-抗体复合物的步骤，包括：
用偶联缓冲液重悬所述活化的磁微粒，使其均匀分散；
向所述偶联缓冲液中加入一定比例的抗体溶液，震荡混匀，放入指定温度保温箱中反应指定时间；
磁场分离，去掉上层清液，得到磁微粒-抗体复合物。
优选地，所述偶联缓冲液包括Good’s缓冲液、PBS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或多种。
优选地，所述偶联缓冲液包括0.02M，pH为7.4的PBS缓冲液。
优选地，所述抗体溶液与磁微粒的质量比为1:100至1:1。
优选地，所述抗体溶液与磁微粒的质量比为1:10。
优选地，所述封闭液包括BSA、脱脂奶粉或酪蛋白。
优选地，所述封闭液包括3％的BSA。
本发明还提及了上述任意一项的磁微粒增强免疫比浊检测盒在测定β2-MG(β2-微球蛋白)方面的应用。
本发明提出的磁微粒增强免疫比浊检测盒，与胶乳增强免疫比浊试剂相比：胶乳微粒需要高速离心进行分离，而磁微粒能通过磁场快速分离，缩短制备时间，降低试剂制造成本。同时，磁微粒由于具有超顺磁性，磁场存在时能迅速聚集，磁场撤离后，磁微粒能快速分散，对磁微粒上抗体活性的影响较小。检测盒与化学发光免疫检测试剂相比：可应用于全自动生化分析仪，不需特定检测仪器，操作简单，检测速度快，稳定性好。同时，没有使用发光检测体系，试剂成本更低。
附图说明
图1为本发明磁微粒增强免疫比浊检测盒一实施例的校准品校准曲线；
图2为本发明磁微粒增强免疫比浊检测盒一实施例的检测结果与胶乳增强免疫比浊试剂检测结果的比较。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提出一种磁微粒增强免疫比浊检测盒，包括R1试剂、R2试剂和校准品；
所述R1试剂包括第一缓冲液、增强剂、第一稳定剂和第一防腐剂；
所述R2试剂包括第二缓冲液，包括磁微粒-抗体复合物、第二稳定剂和第二防腐剂。
本实施例中，检测盒使用的校准品，用含有稳定剂和防腐剂稀释液溶解重组蛋白制得。
R1试剂中，第一缓冲液可为PBS缓冲液(磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffersaline)、Tris缓冲液(三羟甲基氨基甲烷，2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propanediol)、MOPSO缓冲液(3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸，
3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid)、Good’s缓冲液、
HEPES缓冲液(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，分子式:C8H18N2O4S)的一种或几种。优选0.02M，pH7.4的PBS缓冲液。其中，Good’s缓冲液是常用于生物研究的氨基乙烷和氨基丙烷磺酸，Good’s缓冲液具有如下特性：高水溶性；低细胞膜通透性；稳定的酸碱离解常数；低金属螯合能力；高化学稳定性；在紫外和可见光区中的低吸收光谱。
第一增强剂为PEG-300、PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000和PEG-8000中的一种或几种，优选5％的PEG-6000。聚乙二醇又名α-氢-ω-羟基(氧-1,2-乙二基)的聚合物、聚氧化乙烯(PEO-LS)，是平均分子量在高于200的乙二醇高聚物的总称。聚乙二醇的品种很多，例如聚乙二醇300(PEG300)、聚乙二醇600(PEG600)、聚乙二醇20000(PEG20M)，PEG后面数字表示平均分子量。
第一稳定剂为蛋白质、非离子表面活性剂中的一种或几种，优选0.5％BSA(牛血清白蛋白)，0.1M甘氨酸，0.5％的曲拉通-100。
第一防腐剂为叠氮钠、Proclin300、抗生素(四环素、庆大霉素、甲氧青霉素等)中的一种或几种，优选0.1％的Proclin300。其中，ProClin300是SUPELCO公司提供的一种高效生物防腐剂。
R2试剂中，制备方法中磁微粒大小为50nm-300nm，优选100nm。本实施例中所指的磁微粒，一般是指羧基磁微粒。R2试剂的制备方法将在下文详述。
校准品为高浓度单点校准品，优选浓度为18.00mg/L，使用时用生理盐水进行稀释，配成6个浓度点。溶解重组蛋白的稀释液包含稳定剂和防腐剂。稳定剂为蛋白质、表面活性剂中的一种或几种，优选0.05％BSA。防腐剂为叠氮钠、Proclin300、抗生素(四环素、庆大霉素、甲氧青霉素等)中的一种或几种，优选0.1％的Proclin300。
实施例1
R1试剂：
R2试剂：
制备过程中使用的缓冲液：
校准品：
用稀释液将重组蛋白配成18.00mg/L，即为高值校准品。
实施例2
R1试剂：
R2试剂：
制备过程中使用的缓冲液：
校准品：
用稀释液将重组蛋白配成18.00mg/L，即为高值校准品。
实施例3
R1试剂：
R2试剂：
制备过程中使用的缓冲液：
校准品：
用稀释液将重组蛋白配成18.00mg/L，即为高值校准品。
本发明实施例还提供了一种R2试剂的制备方法，包括以下步骤：
将活化的磁微粒与抗体偶联，获得磁微粒-抗体复合物；
向所述磁微粒-抗体复合物中加入一定体积的封闭液，震荡混匀，在指定温度下反应指定时间；
反应后的磁微粒-抗体复合物经磁场分离后，去掉上层清液，用保存缓冲液清洗；
用保存缓冲液重悬清洗后的磁微粒-抗体复合物，得到R2试剂。
本实施例中，若采用羧基磁微粒，则需将其活化为磺酸基活化的磁微粒。如采用已磺酸基活化的磁微粒，则活化步骤可以省略。磺酸基活化磁微粒大小为50nm-300nm，优选100nm。
羧基磁微粒的活化过程如下：
1、更换磁微粒的缓冲液：将商品化的羧基磁微粒放在磁力架(含有强磁场)上，吸附磁微粒，去掉保存液，用一定浓度的MES缓冲液重悬磁微粒，浓度为10mg/mL，使其分散均匀。此步骤中，MES缓冲液为0.02M-0.2M，pH为5.0-6.5。优选0.05M，pH6.0的MES。
2、磁微粒的羧基活化：将EDC和Sulfo-NHS平衡至室温，用MES缓冲液溶解，配成10mg/mL的溶液，按一定比例分别加入到磁微粒中，室温震荡活化30min。此步骤中，加入的EDC和Sulfo-NHS与磁微粒的质量比为1:50至1:1，优选1:20。
经活化后，通过磁场分离磁微粒，去掉上层清液。然后将磁微粒与抗体偶联，具体为：用偶联缓冲液重悬磁微粒，使其均匀分散；向磁微粒中加入一定比例的抗体的溶液，震荡混匀，放入37℃保温箱中反应4h。磁场分离，去掉层上层清液液，得到磁微粒-抗体复合物。偶联缓冲液可为Good’s缓冲液、PBS缓冲液、MOPSO缓冲液、HEPES缓冲液。优选0.02M，pH7.4的PBS。加入的抗体与磁微粒的质量比为1:100至1:1，优选1:10。
然后对磁微粒-抗体复合物进行封闭。具体如下：向磁微粒-抗体复合物中加入一定体积的封闭液，震荡混匀，放入37℃保温箱中反应4h。磁场分离，去掉上层清液，用保存缓冲液清洗3遍。封闭液为BSA、脱脂奶粉或酪蛋白。优选3％的BSA。
保存缓冲液中缓冲液与R1试剂相同，稳定剂为蛋白质、非离子表面活性剂中的一种或几种，优选0.5％BSA.0.1M甘氨酸。防腐剂为叠氮钠、Proclin300、抗生素(四环素、庆大霉素、甲氧青霉素等)中的一种或几种，优选0.05％的Proclin300。
最后用保存缓冲液重悬磁微粒-抗体复合物，得到R2试剂。
以下为一实施例的R2试剂制备过程：
取1mL，20mg/mL的羧基磁微粒放在磁力架(含有强磁场)上，吸附磁微粒，去掉保存液，加入2mL MES缓冲液重悬磁微粒，使其浓度为10mg/mL，均匀分散。将EDC和Sulfo-NHS平衡至室温，用MES缓冲液溶解，配成10mg/mL的溶液，分别加入200μL于磁微粒中，室温震荡活化30min。磁场分离，去掉上层清液，用2mL偶联缓冲液重悬磁微粒，使其均匀分散。向磁微粒中加入100μL，5mg/mL的抗体的溶液，震荡混匀，放入37℃保温箱中反应4h。磁场分离，去掉上层清液，得到磁微粒-抗体复合物。向磁微粒-抗体复合物中加入2mL的封闭液，震荡混匀，放入37℃保温箱中反应4h。磁场分离，去掉上层清液，用2mL保存缓冲液清洗3遍。最后用20mL保存缓冲液重悬磁微粒-抗体复合物，得到R2试剂。
本发明还提及了上述任意一项的磁微粒增强免疫比浊检测盒在测定β2-MG方面的应用。
采用实施例1的检测盒对血清样本进行检测。
试剂盒的校准
用生理盐水将校准品分别稀释为浓度0.00、1.80、4.50、9.00、13.50和18.00mg/L，用本发明实施例的检测盒测试定标。
测试仪器：日立7180全自动生化分析仪
测试参数：主波长：546nm，样本试剂比：S∶R1∶R2＝3∶236∶59
校准曲线如图1所示，在0.00-18.00mg/L范围内，定标曲线拟合良好，呈线性趋势。
样本测试对比
将商品化胶乳增强免疫比浊试剂用配套校准品定标，与检测盒分别测试40个血清样本，每个样本重复测试两次，将平均值进行比对，结果如图2所示，相关系数R2为0.997，斜率为0.945，说明磁微粒增强免疫比浊检测盒能够用于血清样本的检测，准确度高。
本发明用磁微粒代替胶乳微粒，建立一种磁微粒增强免疫比浊检测盒，测定β2-MG，利用磁微粒超顺磁性(在磁场作用下迅速分离的特性，磁场撤离后磁性消失)达到快速分离的目的，从而减少试剂的制造成本；此外，没有使用磁微粒化学发光免疫检测试剂的高成本发光检测体系，直接可以在生化分析仪上通过免疫透射比浊技术实现检测，从而降低了试剂的检测成本。
与胶乳增强免疫比浊试剂测量法相比，胶乳增强免疫比浊试剂测量法采用小粒径的胶乳微粒分离，需使用高速冷冻离心机，分离时间长(30min-60min)，导致成本高。同时，过长的分离时间可能会破坏胶乳微粒上抗体的活性。本发明的磁微粒增强免疫比浊检测盒通过磁场分离，仅需2-10min便可完成检测，降低了时间成本。由于微粒重悬速度快，降低了微粒上抗体的活性被破坏的风险。
与化学发光免疫检测试剂测量法比较，化学发光免疫检测试剂测量法需特定检测仪器，发光检测体系的设备昂贵，消耗的试剂成本高。本发明磁微粒增强免疫比浊检测盒通过在全自动生化分析上使用免疫比浊法进行检测，降低了试剂成本和检测成本。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的权利要求范围之内。

Claims (10)

1.一种磁微粒增强免疫比浊检测盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂和校准品；
所述R1试剂包括第一缓冲液、增强剂、第一稳定剂和第一防腐剂；
所述R2试剂包括第二缓冲液，包括磁微粒-抗体复合物、第二稳定剂和第二防腐剂。
2.根据权利要求1所述的磁微粒增强免疫比浊检测盒，其特征在于，所述第一缓冲液包括PBS缓冲液、Tris缓冲液、MOPSO缓冲液、Good’s缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种，所述PBS缓冲液的浓度为0.02M，pH为7.4。
3.根据权利要求1所述的磁微粒增强免疫比浊检测盒，其特征在于，所述第一增强剂包括PEG-300、PEG-2000、PEG-4000、PEG-6000和PEG-8000中的一种或几种，所述PEG-6000的添加量为5％。
4.根据权利要求1所述的磁微粒增强免疫比浊检测盒，其特征在于，所述第一稳定剂包括蛋白质、非离子表面活性剂中的一种或几种；
所述第二稳定剂包括0.5％BSA，0.1M甘氨酸；
所述第一防腐剂或第二防腐剂包括叠氮钠、Proclin300、抗生素中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的磁微粒增强免疫比浊检测盒，其特征在于，所述磁微粒-抗体复合物中的磁微粒的粒径为50nm-300nm。
6.R2试剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将磁微粒放在磁力架上，吸附磁微粒，去掉保存液，用一定浓度缓冲液重悬磁微粒，使其均匀分散；
将EDC和Sulfo-NHS平衡至室温，配成指定浓度的溶液，按一定比例加入到重悬后的磁微粒中，震荡活化，获得活化的磁微粒；
将所述活化的磁微粒与抗体偶联，获得磁微粒-抗体复合物；
向所述磁微粒-抗体复合物中加入一定体积的封闭液，震荡混匀，在指定温度下反应指定时间；
反应后的磁微粒-抗体复合物经磁场分离后，去掉上层清液，用保存缓冲液清洗；
用保存缓冲液重悬清洗后的磁微粒-抗体复合物，得到R2试剂。
7.根据权利要求6所述的R2试剂的制备方法，其特征在于，所述活化的磁微粒粒径大小为50nm-300nm。
8.根据权利要求6所述的R2试剂的制备方法，其特征在于，加入的EDC和Sulfo-NHS与磁微粒的质量比为1:50至1:1。
9.根据权利要求6所述的R2试剂的制备方法，其特征在于，所述封闭液包括BSA、脱脂奶粉或酪蛋白，所述BSA的添加量为3％。
10.权利要求1-5任意一项所述的磁微粒增强免疫比浊检测盒在测定β2-MG方面的应用。
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