CN115015562A - 一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒 - Google Patents

一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115015562A
CN115015562A CN202210811036.2A CN202210811036A CN115015562A CN 115015562 A CN115015562 A CN 115015562A CN 202210811036 A CN202210811036 A CN 202210811036A CN 115015562 A CN115015562 A CN 115015562A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sample
tube
liquid
microspheres
taking
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202210811036.2A
Other languages
English (en)
Inventor
郭爱龙
元卿
李娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Jiusheng Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hangzhou Jiusheng Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Jiusheng Biotechnology Co ltd filed Critical Hangzhou Jiusheng Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210811036.2A priority Critical patent/CN115015562A/zh
Publication of CN115015562A publication Critical patent/CN115015562A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6869—Interleukin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5406—IL-4
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5412—IL-6
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5428—IL-10
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/55—IL-2
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/56—IFN-alpha
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒，包括包被七种细胞因子抗体的微球混合液、检测抗体、细胞因子标准品、样品稀释液和洗液，所述的七种细胞因子为IL‑2、IL‑4、IL‑6、IL‑10、IL‑17、TNF‑α和IFN‑γ，本发明能同时检测出样本中IL‑2、IL‑4、IL‑6、IL‑10、IL‑17、TNF‑α、IFN‑γ七种细胞因子的浓度，解决检测一个样本中七种细胞因子需要单独用七种检测试剂检测的问题，实现单样本多重定量检测、节约时间和成本、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作、效率更高。

Description

一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及体外免疫检测技术领域，具体是指一种应用流式荧光发光法同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒。
背景技术
细胞因子(cytokine，CK)是由免疫细胞(单核细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，参与机体免疫反应和炎症反应。根据产生细胞因子的细胞种类不同分类：白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。
目前常用的细胞因子检测方法有：酶联免疫检测(ELISA)、放射性免疫检测(RIA)、化学发光免疫检测(CLIA)、免疫印迹法(Westernblot)等。酶联免疫检测(ELISA)一次只能检测单一样本，检测通量小、成本高等不足。放射性免疫检测(RIA)由于具有放射性污染，已经很少用。化学发光免疫检测(CLIA)也不能同时对单个样本中的多个指标进行检测。
流式细胞术是利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数高通量检测、快速定量分析和分选的高新技术。流式荧光发光法是一种基于流式细胞检测的多重蛋白定量分析的检测方法，能够同时对单个样本中的多个指标进行检测。把不同的捕获抗体包被在不同大小的荧光编码微球上，与待测样本、检测抗体混合孵育，形成捕获微球-抗原-检测抗体复合结构。通过对微球和报告分子的检测实现同时对样本中的不同细胞因子的定量检测。然而其他的细胞因子检测方法，比如酶联免疫检测、化学发光免疫检测等方法无法对同一个样本在同一个反应体系中区分不同的检测分子信号。因此，有必要开发一种能够同时检测多种细胞因子的试剂盒，以克服现有技术中亟待解决的问题。
发明内容
本发明要解决上述技术问题，提供一种能够同时检测多种细胞因子、检测灵敏度高、高通量、样品用量少、检测浓度范围广的方法及试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种同时检测七种细胞因子的试剂盒，包括包被七种细胞因子抗体的微球混合液、检测抗体、细胞因子标准品、样品稀释液和洗液，所述的七种细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和IFN-γ；
其中，所述的微球混合液为4um和5um不同荧光编码的聚苯乙烯羧基化微球分别与七种细胞因子捕获抗体偶联，得到七种细胞因子抗体捕获微球，按照每人份每种微球2000个制备七种细胞因子抗体捕获的微球混合液；
其中，所述的检测抗体为把七种细胞因子的检测抗体用藻红蛋白进行标记，用SANH与检测抗体反应，得到活化的检测抗体-SANH，用SFB与PE反应，得到活化的PE-SFB，把活化的检测抗体-SANH和活化的PE-SFB混合反应，得到检测抗体-PE偶联混合物，利用分子筛，采用AKTA进行纯化，得到检测抗体-PE；
其中，所述的细胞因子标准品通过NIBSC标准品对IL-10、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子重组蛋白溶液分别校准，校准后的细胞因子重组蛋白溶液，用蛋白保存液稀释至终浓度10000pg/ml，混合一起，用冻干机冻干细胞因子重组蛋白混合液制成冻干粉；
其中，所述的样品稀释液为向0.01M磷酸盐缓冲液中加入1％牛血清白蛋白和0.2％Proclin950,充分混匀；
其中，所述的洗液为向0.1M磷酸缓冲液中加入0.5％Tween-20和0.2％Proclin950,充分混匀。
采用以上结构后，本发明具有如下优点：
1、本发明将细胞因子捕获抗体包被于不同尺寸和不同荧光强度的微球表面获得细胞因子特异性抗体捕获微球，与待测样本、检测抗体混合孵育，如果待测样本中含有捕获微球所对应的抗原，则会被微球吸附。检测抗体与捕获抗体微球针对不同抗原表位，因此会形成捕获微球-抗原-检测抗体复合结构。通过对微球和检测分子的检测实现同时对样本中的不同细胞因子的定量检测；
2、本发明能同时检测出样本中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α、IFN-γ七种细胞因子的浓度，解决检测一个样本中七种细胞因子需要单独用七种检测试剂检测的问题，实现单样本多重定量检测、节约时间和成本、检测浓度范围广、需要样本量少、步骤简单易操作、效率更高。
作为改进，所述的4μm微球制备IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ捕获微球，所述的5μm微球制备IL-4和IL-17捕获微球。
作为改进，所述的磷酸盐缓冲液的PH值为7-7.5。
一种同时检测七种细胞因子的方法，其特征在于：所述方法包括以下操作步骤：
S1：标准曲线准备：①取出标准品管，瞬时离心，加入样品稀释液，轻柔震荡后静置5～10分钟，作为标准曲线最高浓度，标记为S1；②取7个新的离心管，标记为S2～S7，每管加入样品稀释液，从S1管中取一定量的液体，加入S2管中混匀，从S2管中取一定量的液体加入S3管中混匀，从S3管中取一定量的液体加入S4管中混匀，从S4管中取一定量的液体加入S5管中混匀，从S5管中取一定量的液体加入S6管中混匀，从S6管中取一定量的液体加入S7管中混匀，进行倍比稀释，记作S1-S7不同浓度的样品稀释混合液；
S2：检测试剂准备：根据制备标准曲线的管数和待测样本的管数计算所需1×洗液的量，将洗液用超纯水按比例稀释即得；
S3：样本制备：样本如为冷冻保存，应提前取出，缓慢融化，恢复至室温；样本如为血液，离心后轻轻取上清；
S3：根据标准品管和待测样本数量，准备适量流式管，每管加入捕获微球混合液和样品稀释液；
S4：取8个流式管，分别标记A1～A8，其中A1～A7管加入S1步骤中对应梯度S1-S7样品管中的样品稀释混合液，A8管加入样品稀释液，作为空白管，待测样本管加入样本；
S5：A1～A8管加入生物素标记的检测试剂，涡旋震荡混匀，室温避光震荡孵育；
S6：孵育结束后，每管加入链霉亲和素-PE，室温避光震荡孵育；
S7：孵育结束后，每管加入检测试剂，涡旋震荡混匀，离心，弃上清；
S8：每管加入检测试剂，涡旋振荡，重悬微球；
S9：设置实验方案：取捕获微球混合液，加入检测试剂混匀，上机建立模板，具体步骤如下：
①建立X轴为FSC、Y轴为SSC的线性散点图，根据FSC，圈中微球；
②建立PE即X轴和APC即Y轴的对数散点图，显示圈中的微球；
③低速采集微球，调节PE通道电压，使微球位于左侧，不要压线；
④保存模板和条件；
S10：采集数据：依次检测标准品和样本。
作为改进，所述S3中，捕获微球混合液在加入前先进行涡旋处理。
附图说明
图1是本发明的七种包被微球混合液的不同大小微球(4um和5um)FSC-SSC散点图。
图2是本发明的4um微球的五种细胞因子对应的荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
图3是本发明的5um微球的两种细胞因子对应的荧光编码微球与荧光信号强度的散点图。
图4是本发明的同时检测七种细胞因子流式细胞仪分析结果图(待测样本为血清)。
图5是本发明的IL-10抗体对、细胞因子重组蛋白间交叉反应测试流式结果图。
图6是本发明的IL-6抗体对、细胞因子重组蛋白间交叉反应测试流式结果图。
图7是本发明的TNF-α抗体对、细胞因子重组蛋白间交叉反应测试流式结果图。
图8是本发明的IL-2抗体对、细胞因子重组蛋白间交叉反应测试流式结果图。
图9是本发明的IFN-γ抗体对、细胞因子重组蛋白间交叉反应测试流式结果图。
图10是本发明的IL-4抗体对、细胞因子重组蛋白间交叉反应测试流式结果图。
图11是本发明的IL-17抗体对、细胞因子重组蛋白间交叉反应测试流式结果图。
具体实施方式
下面结合全文对本发明做进一步的详细说明。
结合附图1-图10，
一种同时检测七种细胞因子的试剂盒，其特征在于，包括包被七种细胞因子抗体的微球混合液、检测抗体、细胞因子标准品、样品稀释液和洗液，所述的七种细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和IFN-γ；
其中，所述的微球混合液为4um和5um不同荧光编码的聚苯乙烯羧基化微球分别与七种细胞因子捕获抗体偶联，得到七种细胞因子抗体捕获微球，按照每人份每种微球2000个制备七种细胞因子抗体捕获的微球混合液；
其中，所述的检测抗体为把七种细胞因子的检测抗体用藻红蛋白进行标记，用SANH与检测抗体反应，得到活化的检测抗体-SANH，用SFB与PE反应，得到活化的PE-SFB，把活化的检测抗体-SANH和活化的PE-SFB混合反应，得到检测抗体-PE偶联混合物，利用分子筛，采用AKTA进行纯化，得到检测抗体-PE；
其中，所述的细胞因子标准品通过NIBSC标准品对IL-10、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子重组蛋白溶液分别校准，校准后的细胞因子重组蛋白溶液，用蛋白保存液稀释至终浓度10000pg/ml，混合一起，用冻干机冻干细胞因子重组蛋白混合液制成冻干粉；
其中，所述的样品稀释液为向0.01M磷酸盐缓冲液中加入1％牛血清白蛋白和0.2％Proclin950,充分混匀；
其中，所述的洗液为向0.1M磷酸缓冲液中加入0.5％Tween-20和0.2％Proclin950,充分混匀。
所述的4μm微球制备IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ捕获微球，所述的5μm微球制备IL-4和IL-17捕获微球。
所述的磷酸盐缓冲液的PH值为7-7.5。
一种同时检测七种细胞因子的方法，所述方法包括以下操作步骤：
S1：标准曲线准备：①取出标准品管，瞬时离心，加入样品稀释液，轻柔震荡后静置5～10分钟，作为标准曲线最高浓度，标记为S1；②取7个新的离心管，标记为S2～S7，每管加入样品稀释液，从S1管中取一定量的液体，加入S2管中混匀，从S2管中取一定量的液体加入S3管中混匀，从S3管中取一定量的液体加入S4管中混匀，从S4管中取一定量的液体加入S5管中混匀，从S5管中取一定量的液体加入S6管中混匀，从S6管中取一定量的液体加入S7管中混匀，进行倍比稀释，记作S1-S7不同浓度的样品稀释混合液；
S2：检测试剂准备：根据制备标准曲线的管数和待测样本的管数计算所需1×洗液的量，将洗液用超纯水按比例稀释即得；
S3：样本制备：样本如为冷冻保存，应提前取出，缓慢融化，恢复至室温；样本如为血液，离心后轻轻取上清；
S3：根据标准品管和待测样本数量，准备适量流式管，每管加入捕获微球混合液和样品稀释液；
S4：取8个流式管，分别标记A1～A8，其中A1～A7管加入S1步骤中对应梯度S1-S7样品管中的样品稀释混合液，A8管加入样品稀释液，作为空白管，待测样本管加入样本；
S5：A1～A8管加入生物素标记的检测试剂，涡旋震荡混匀，室温避光震荡孵育；
S6：孵育结束后，每管加入链霉亲和素-PE，室温避光震荡孵育；
S7：孵育结束后，每管加入检测试剂，涡旋震荡混匀，离心，弃上清；
S8：每管加入检测试剂，涡旋振荡，重悬微球；
S9：设置实验方案：取捕获微球混合液，加入检测试剂混匀，上机建立模板，具体步骤如下：
①建立X轴为FSC、Y轴为SSC的线性散点图，根据FSC，圈中微球；
②建立PE即X轴和APC即Y轴的对数散点图，显示圈中的微球；
③低速采集微球，调节PE通道电压，使微球位于左侧，不要压线；
④保存模板和条件；
S10：采集数据：依次检测标准品和样本。
所述S3中，捕获微球混合液在加入前先进行涡旋处理。
实施例一：
1、抗体的信息，采用的细胞因子特异性抗体如表1所示。表1为七种细胞因子特异性抗体的信息。
细胞因子 厂家 货号
IL-10 Thermofisher 14-7108-85
IL-6 Thermofisher 14-7069-85
TNF-α R&D 840119
IL-2 Thermofisher 13-7029-85
IFN-γ Thermofisher 14-7317-85
IL17 Thermofisher 14-7178-85
IL4 Thermofisher 14-7049-85
表1
2、捕获微球混合液制备：
微球获取：分别取聚苯乙烯羧基化荧光编码微球(大约1×107个)于7个离心管中，5000g离心5min，弃上清。
微球洗涤：加入500μl0.1M磷酸盐缓冲液，涡旋振荡混匀后，5000g离心5min，弃上清。重复洗涤2次。
微球重悬：加入100μl0.1M磷酸盐缓液重悬微球，涡旋振荡混匀。
微球活化：加入50μlEDC(50mg/ml)和NHS(50mg/ml)溶液，涡旋振荡混匀，室温避光振荡孵育20min。孵育结束后，5000g离心5min,弃上清。
活化后微球洗涤：加入500μl0.05MMES，涡旋振荡混匀，5000g离心5min，弃上清。重复洗涤2次。
活化后微球重悬：加入500μl0.05MMES，涡旋振荡混匀。
活化微球包被：按照每106个微球加入10μg细胞因子捕获抗体，室温避光振荡孵育2h。孵育结束后，5000g离心5min弃上清。
封闭：加入500μl0.01M磷酸盐缓冲液(含1％BSA)，涡旋振荡混匀，室温避光振荡孵育30min。孵育结束后，5000g离心5min弃上清。
包被后微球洗涤：加入500ul0.01M磷酸盐缓冲液(含1％BSA)，涡旋振荡混匀，5000g离心5min弃上清。重复洗涤2次。
包被后微球重悬计数：加入适当0.01M磷酸盐缓冲液(含1％BSA)，涡旋振荡混匀，流式细胞仪计数，调整微球浓度为5000个/ul，4℃避光保存。
捕获微球混合液：按照每人份每种微球2000个制备七种细胞因子捕获微球混合液(图1)。使用4μm微球制备IL-10、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ捕获微球(图2)，使用5μm微球制备IL-4、IL-17捕获微球(图3)。
检测抗体混合液制备：
检测抗体活化：利用脱盐柱对检测抗体脱盐处理，调整浓度为5mg/ml。将交联剂SANH溶解于DMSO中配制10mg/ml母液。按照检测抗体与SANH摩尔比1:15加入SANH母液。室温避光反应2小时。反应结束后用脱盐柱除去未结合的SANH。
PE活化：取5mgPE溶液于1.5ml离心管中，12000rpm离心10min，弃上清。加入磷酸盐缓冲液重悬沉淀，利用脱盐柱对PE脱盐处理，调整浓度为5mg/ml。将交联剂SFB溶解于DMSO中配制10mg/ml母液。按照PE与SFB摩尔比1:10加入SFB母液。室温避光反应2小时。反应结束后用脱盐柱除去未结合的SFB。
检测抗体-SANH与PE-SFB共价偶联：按照检测抗体-SANH与PE-SFB摩尔比1:1.5-2混合，振荡混匀后加入苯胺至终浓度10mM，室温避光孵育2h。
检测抗体-PE偶联产物纯化：采用AKTA进行纯化，纯化柱型号HiLoad16/600Superdex200pg，流动相1×PBS，pH7.4，检测波长280nm。洗脱顺序依次为检测抗体-PE偶联物、未反应的PE、未反应的检测抗体。收集洗脱的检测抗体-PE偶联物，利用紫外分光光度计测定收集的检测抗体-PE偶联物的浓度。
检测抗体制备：利用抗体稀释液将纯化得到的检测抗体-PE稀释至终浓度0.5ug/ml，即为检测抗体-PE试剂。
检测反应体系：捕获微球+标准品或待测样本溶液+样品稀释液+检测抗体
将捕获微球、待测样本、检测抗体混合后，形成捕获微球-细胞因子-检测抗体的双抗夹心复合结构。通过流式细胞仪对微球和PE荧光强度检测，利用软件分析标准曲线和待测样本即可计算出每种细胞因子的浓度。
3、标准品制备：
采用的细胞因子标准品中重组蛋白如表2所示。
表2：七种细胞因子标准品中重组蛋白的信息。
Figure BDA0003738969200000071
Figure BDA0003738969200000081
表2
通过NIBSC标准品对IL-10、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-17细胞因子重组蛋白溶液分别校准。
校准后的细胞因子重组蛋白溶液，用蛋白保存液稀释至终浓度10000pg/ml，混合一起后，用冻干机冻干细胞因子重组蛋白混合液制成冻干粉，即为细胞因子标准品。
4、样品稀释液制备：
向0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液中加入1％牛血清白蛋白和0.2％Proclin950,充分混匀。
5、洗液制备:
向0.1MpH7.2磷酸缓冲液中加入0.5％Tween-20和0.2％Proclin950,充分混匀。
实施例二：
用本发明的试剂盒定量检测细胞因子：
1、标准曲线准备：
1.1，取出标准品管，2000×g瞬时离心。加入125μl样品稀释液，轻柔震荡后静置5-10分钟，作为标准曲线最高浓度10,000pg/ml，标记为S1。
1.2，取7个新的离心管，标记为S2～S7，每管加入150μl样品稀释液，从S1管中取50μl的液体，加入S2管中混匀，从S2管中取50μl的液体加入S3管中混匀，从S3管中取50μl的液体加入S4管中混匀，从S4管中取50μl的液体加入S5管中混匀，从S5管中取50μl的液体加入S6管中混匀，从S6管中取50μl的液体加入S7管中混匀，进行倍比稀释，记作S1-S7不同浓度的样品稀释混合液。
2、试剂准备
1×洗液：根据制备标准曲线的管数和待测样本的管数计算所需1×洗液的量，按每管需1ml洗液进行计算，配制适量1×洗液。将10×洗液用超纯水按1:9稀释为1×工作液。
3、样本准备
3.1，样本如为冷冻保存，应提前取出，缓慢融化，恢复至室温。
3.2，样本如为血液,3000rpm离心15min，轻轻取上清。
4、操作步骤
4.1，根据标准品管和待测样本数量，准备适量流式管。每管加入25μl捕获微球混合液(微球加入前涡旋45秒)和25μl样品稀释液。
4.2，取8个流式管，分别标记A1～A8，其中A1～A7管加入25μl的S1步骤中对应梯度S1-S7样品管中的样品稀释混合液，A8管加入25μl样品稀释液，作为空白管，待测样本管加入25μl样本。
4.3，A1～A8管加入25μl生物素标记的检测试剂,涡旋震荡混匀,室温避光震荡孵育2h。
4.4，孵育结束后，每管加入25μl链霉亲和素-PE，室温避光震荡孵育30min。
4.5，孵育结束后，每管加入600μl1×洗液，涡旋震荡混匀，500×g离心5分钟，弃上清。
4.6，每管加入100ul1×洗液，涡旋振荡，重悬微球。
4.7，设置实验方案
4.7.1，建立X轴为FSC、Y轴为SSC的线性散点图，根据FSC，圈中微球。
4.7.2，建立PE(X轴)和APC(Y轴)的对数散点图，显示圈中的微球。
4.7.3，低速采集微球，调节PE通道电压，使微球位于左侧，不要压线。
4.8，采集数据
依次检测标准品和样本，上机前涡旋10-20秒，每个样本收集1400个微球，每种微球大约200个。
实施例3：用本发明的试剂盒定量检测细胞因子的数据分析。
用本发明试剂盒检测标准品和8个血清样品的荧光强度读数分别如表3和表4。
Figure BDA0003738969200000091
表3：标准曲线中四倍梯度稀释的标准品荧光强度数值
Figure BDA0003738969200000092
Figure BDA0003738969200000101
表4：8个血清样品的荧光强度数值
根据表3中标准曲线各个浓度细胞因子相对应的荧光强度数值计算出表4中8个血清样品各个细胞因子的浓度如表5。
样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8
IL-10 2.58 10.33 1374 1.98 5.99 17.15 2.96 2.21
IL-6 22.98 546.68 36.96 2.08 14.26 51.02 2.76 2.01
TNF-α 2.48 5.02 2.80 2.93 1.84 12.88 2.23 2.21
IL-2 1.65 0.62 1.21 4.65 1.37 16.14 2.24 1.79
IFN-γ 2.39 1.65 2.71 2.53 161.80 34.81 2.29 1.79
IL-4 1.17 1.22 1.12 1.45 1.33 7.91 1.63 1.45
IL-17 4.78 2.12 1.70 15.23 1.95 1.85 3.26 2.02
表5：8个血清样品各个细胞因子的浓度(pg/ml)。
实施例4：本试剂盒特异性测试。
抗体对间、细胞因子重组蛋白特异性反应测试：七种细胞因子捕获微球混合液分别与单个细胞因子重组蛋白及检测抗体反应，流式上机检测，各个细胞因子检测结果流式图如图5-图11所示。
实验结果表明每种细胞因子抗体对可以特异性的识别对应的细胞因子重组蛋白，与其他细胞因子没有交叉反应。
实施例5：本试剂盒准确度的测试。
为了测试本试剂盒的准确度，在相同条件下用进口试剂盒与本试剂盒检测8个未知浓度的血清样品。检测结果如表6。
Figure BDA0003738969200000102
Figure BDA0003738969200000111
表6：本试剂盒与进口试剂盒检测8个相同样品中IL-6的浓度
其他细胞因子也采用相同的比较方式，结果表明本试剂盒与进口试剂盒检测结果具有明显的相关性。
以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性，全文中所示的也只是本发明的实施方式之一，实际的结构并不局限于此。总而言之如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似的结构方式及实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种同时检测七种细胞因子的试剂盒，其特征在于，包括包被七种细胞因子抗体的微球混合液、检测抗体、细胞因子标准品、样品稀释液和洗液，所述的七种细胞因子为IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17、TNF-α和IFN-γ；
其中，所述的微球混合液为4um和5um不同荧光编码的聚苯乙烯羧基化微球分别与七种细胞因子捕获抗体偶联，得到七种细胞因子抗体捕获微球，按照每人份每种微球2000个制备七种细胞因子抗体捕获的微球混合液；
其中，所述的检测抗体为把七种细胞因子的检测抗体用藻红蛋白进行标记，用SANH与检测抗体反应，得到活化的检测抗体-SANH，用SFB与PE反应，得到活化的PE-SFB，把活化的检测抗体-SANH和活化的PE-SFB混合反应，得到检测抗体-PE偶联混合物，利用分子筛，采用AKTA进行纯化，得到检测抗体-PE；
其中，所述的细胞因子标准品通过NIBSC标准品对IL-10、IL-6、TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-4和IL-17细胞因子重组蛋白溶液分别校准，校准后的细胞因子重组蛋白溶液，用蛋白保存液稀释至终浓度10000pg/ml，混合一起，用冻干机冻干细胞因子重组蛋白混合液制成冻干粉；
其中，所述的样品稀释液为向0.01M磷酸盐缓冲液中加入1％牛血清白蛋白和0.2％Proclin950,充分混匀；
其中，所述的洗液为向0.1M磷酸缓冲液中加入0.5％Tween-20和0.2％Proclin950,充分混匀。
2.根据权利要求1所述的一种同时检测七种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述的4μm微球制备IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ捕获微球，所述的5μm微球制备IL-4和IL-17捕获微球。
3.根据权利要求1所述的一种同时检测七种细胞因子的试剂盒，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液的PH值为7-7.5。
4.一种同时检测七种细胞因子的方法，其特征在于：所述方法包括以下操作步骤：
S1：标准曲线准备：①取出标准品管，瞬时离心，加入样品稀释液，轻柔震荡后静置5～10分钟，作为标准曲线最高浓度，标记为S1；②取7个新的离心管，标记为S2～S7，每管加入样品稀释液，从S1管中取一定量的液体，加入S2管中混匀，从S2管中取一定量的液体加入S3管中混匀，从S3管中取一定量的液体加入S4管中混匀，从S4管中取一定量的液体加入S5管中混匀，从S5管中取一定量的液体加入S6管中混匀，从S6管中取一定量的液体加入S7管中混匀，进行倍比稀释，记作S1-S7不同浓度的样品稀释混合液；
S2：检测试剂准备：根据制备标准曲线的管数和待测样本的管数计算所需1×洗液的量，将洗液用超纯水按比例稀释即得；
S3：样本制备：样本如为冷冻保存，应提前取出，缓慢融化，恢复至室温；样本如为血液，离心后轻轻取上清；
S3：根据标准品管和待测样本数量，准备适量流式管，每管加入捕获微球混合液和样品稀释液；
S4：取8个流式管，分别标记A1～A8，其中A1～A7管加入S1步骤中对应梯度S1-S7样品管中的样品稀释混合液，A8管加入样品稀释液，作为空白管，待测样本管加入样本；
S5：A1～A8管加入生物素标记的检测试剂，涡旋震荡混匀，室温避光震荡孵育；
S6：孵育结束后，每管加入链霉亲和素-PE，室温避光震荡孵育；
S7：孵育结束后，每管加入检测试剂，涡旋震荡混匀，离心，弃上清；
S8：每管加入检测试剂，涡旋振荡，重悬微球；
S9：设置实验方案：取捕获微球混合液，加入检测试剂混匀，上机建立模板，具体步骤如下：
①建立X轴为FSC、Y轴为SSC的线性散点图，根据FSC，圈中微球；
②建立PE即X轴和APC即Y轴的对数散点图，显示圈中的微球；
③低速采集微球，调节PE通道电压，使微球位于左侧，不要压线；
④保存模板和条件；
S10：采集数据：依次检测标准品和样本。
5.根据权利要求4所述的一种同时定量检测十二种细胞因子的方法，其特征在于：所述S3中，捕获微球混合液在加入前先进行涡旋处理。
CN202210811036.2A 2022-07-11 2022-07-11 一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒 Withdrawn CN115015562A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210811036.2A CN115015562A (zh) 2022-07-11 2022-07-11 一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210811036.2A CN115015562A (zh) 2022-07-11 2022-07-11 一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115015562A true CN115015562A (zh) 2022-09-06

Family

ID=83081404

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210811036.2A Withdrawn CN115015562A (zh) 2022-07-11 2022-07-11 一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115015562A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116908466A (zh) * 2023-06-14 2023-10-20 广州医科大学附属市八医院(广州市第八人民医院、广州市肝病医院、广州市传染病研究所) 与艾滋病合并活动性结核有关的细胞因子的定量检测试剂的应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116908466A (zh) * 2023-06-14 2023-10-20 广州医科大学附属市八医院(广州市第八人民医院、广州市肝病医院、广州市传染病研究所) 与艾滋病合并活动性结核有关的细胞因子的定量检测试剂的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111679086B (zh) 一种hbp的磁微粒化学发光法检测试剂盒及其制备方法
Khan et al. Multiplex bead array assays for detection of soluble cytokines: comparisons of sensitivity and quantitative values among kits from multiple manufacturers
US20190219569A1 (en) Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof
CN102323422A (zh) 半定量同时检测cTnI和Myo的免疫层析试纸条及其制备
CN109239361B (zh) 一种心肌肌钙蛋白i的检测试剂盒及其制备方法
CN111381025A (zh) 用于多重检测的免疫检测试剂盒、应用以及多重检测方法
CN115015562A (zh) 一种同时检测七种细胞因子的方法及试剂盒
CN111381027A (zh) 免疫捕获组合物及其制备方法和应用、免疫检测试剂盒
CN202916286U (zh) 一种定量检测降钙素原pct的胶乳增强免疫比浊试剂盒
CN113804896A (zh) 测定人体血清中白介素-8含量的磁微粒化学发光试剂盒
WO2019088142A1 (ja) バイオアッセイのための検出剤及びそれを用いたシグナルの増幅方法
CN114720684A (zh) 一种白介素细胞因子多重流式荧光检测试剂盒、检测方法及应用
CN113433329A (zh) 基于量子点荧光微球的pct/il-6二联检测试剂盒及其制备方法
CN116794313B (zh) 基于流式细胞仪同时检测三项肿瘤标志物的试剂盒及方法
CN108333347B (zh) 抗核抗体靶抗原偶联物试剂、其制备方法、包含其的试剂盒及应用
HU216876B (hu) Eljárás ellenanyag kimutatására kemilumineszcens jelőlőanyaghoz és biotinhoz kötött ligandum alkalmazásával
CN117470819A (zh) 自身免疫性肌炎病检测试剂盒及其检测方法
CN115015561A (zh) 一种同时定量检测十二种细胞因子的方法及试剂盒
CN115586337A (zh) 检测肿瘤伴随诊断相关因子的试剂盒及其制备方法
CN113702362A (zh) 一种使用化学发光方法定量检测IFN-γ浓度的方法及其检测试剂盒
CN114720694A (zh) 一种多项细胞因子联合检测方法及其试剂盒
CN113189343A (zh) 一种同时检测血清和尿液中视黄醇结合蛋白的试剂盒
CN112147342A (zh) 一种基于降钙素原pct的免疫分析试剂盒及其制备方法和检测方法
CN114371292A (zh) 一种检测可溶性st2蛋白的试剂盒
CN112505183A (zh) 他克莫司单个核细胞内药物浓度的检测方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Guo Ailong

Inventor before: Guo Ailong

Inventor before: Yuan Qing

Inventor before: Li Na

CB03 Change of inventor or designer information
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20220906

WW01 Invention patent application withdrawn after publication