CN114720694A - 一种多项细胞因子联合检测方法及其试剂盒 - Google Patents

一种多项细胞因子联合检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，一种多项细胞因子联合检测方法及其试剂盒。本发明提供的检测方法采用多项荧光编码微球分别标记多项细胞因子的捕获抗体，用荧光素标记多项细胞因子的检测抗体，用冻干技术制备冻干标准品，通过测定标准品绘制标准曲线，最后通过流式细胞仪对样本检测后各项荧光编码微球的荧光强度与标准曲线的对比计算出样品中各项细胞因子的浓度。从而本发明提供的检测方法高效快速地在样本需求少的情况下实现多项细胞因子联合检测。本发明提供的试剂盒高度集成，适用于多种细胞因子的多种组合的检测，应用范围广泛。

Description

一种多项细胞因子联合检测方法及其试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，一种多项细胞因子联合检测方法及其试剂盒。
背景技术
细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白。细胞因子能介导细胞间的相互作用，具有多种生物学功能，如调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等。所有白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子、造血因子、生长因子、趋化因子等统称为细胞因子。细胞因子的分析可以为临床上预防、诊断、治疗疾病提供科学基础，人体各细胞因子的检测可以从多种方面来判断人体的免疫状态，另外还能监测疾病的进程，辅助疾病的治疗，监测疾病的治疗效果和预后调整治疗方案。现有的细胞因子检测技术为单项细胞因子检测方法，如ELISA或化学发光法等，单次检测只能完成单项细胞因子检测，存在检测通量小，效率低，需要样本量大等缺点，此外ELISA法检测不同样本孔之间有一定概率发生交叉污染，使得结果的可靠性受到影响。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明提供了一种多项细胞因子联合检测方法，目的是为了解决现有的细胞因子检测技术为单项细胞因子检测方法，单次检测只能完成单项细胞因子检测，存在检测通量小，效率低，需要样本量大等缺点，同时检测不同样本孔之间有一定概率发生交叉污染，影响结果的可靠性的技术问题。
本发明提供的一种多项细胞因子联合检测方法，具体技术方案如下：
一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，制备捕获试剂，所述捕获抗体为待测细胞因子的捕获抗体，所述荧光编码微球的种类与所述待测细胞因子的种类一一相对应；
S2，采用荧光染料标记检测抗体，制备检测试剂，所述检测抗体与所述捕获抗体为配对抗体，检测抗体试剂不局限于制成液体形式试剂，也可以制成冻干品形式试剂提供使用；
S3，配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号；
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
在某些实施方式中，在步骤S1中，制备捕获试剂的具体步骤如下：所述荧光编码微球进行活化后，再与所述捕获抗体混匀进行旋转反应制备捕获微球浓缩液，将浓缩液混匀并稀释成所需浓度，即为捕获微球试剂。
具体地，所述荧光编码微球活化的方法如下：所述荧光编码微球加入用pH＝7.4的10mM PBS溶解的EDC，使得EDC终浓度为10mg/mL，反应约30min。
在某些实施方式中，步骤S2中，通过荧光染料与检测抗体交联获得浓缩检测抗体，将制备的各项目浓缩检测抗体混匀并稀释，制成所述检测试剂。
具体地，制备检测试剂的具体步骤如下：将所述荧光染料通过透析进行脱盐处理后，与SMCC混合反应，再通过透析进行脱盐处理后，获得活化的荧光染料。将所述检测抗体与DTT混合反应，再通过透析进行脱盐处理后加入所述活化的荧光染料中进行混合反应后脱盐处理，得浓缩检测抗体，将浓缩检测抗体混匀并稀释至所需浓度，制成所需检测试剂，也可以根据用量将检测试剂按每人份形式分装制备成冻干管形式使用。
在某些实施方式中，在步骤S3中，配制不同浓度的标准品溶液的方法如下：将细胞因子的重组抗原制备为冻干珠，再将上述冻干珠溶解后，再逐级梯度稀释，获得不同浓度的标准品溶液。使用冻干珠形式保存标准品，能更稳定地保存各检测项目的标准品，也使得使用更加方便。
步骤S4中，流式细胞仪根据编码微球固有属性识别各细胞因子项目编码微球，利用不同浓度的各项细胞因子标准品溶液与各项编码微球反应后的产生的检测抗体荧光信号绘制各项目标准曲线，依据这些标准曲线和样本反应后各项编码微球产生的检测抗体的信号强度即可获得待测样本中各项细胞因子的浓度。
本发明基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。
在某些实施方式中，所述荧光编码微球即为步骤S1中所使用的荧光编码微球，所述荧光编码微球的直径为0.5-50μm。所述荧光编码微球携带的荧光素，可激发产生固有特征荧光信号，激发后在流式细胞仪FITC，PE通道上接受不到或可接受微弱的荧光信号，该荧光素可以但不局限为以下荧光素：APC，APC-Cy7，APC-H7，PerCP，CF系列(如CF790)，ATTO系列(如ATTO647)，Brilliant系列荧光素(如Brilliant Violet 786)等。所述荧光编码微球携带活性基团，可以活化后交联蛋白分子，活性基团可以为羧基、氨基等。所述荧光编码微球材料可以但不局限为聚苯乙烯微珠或磁珠等。不同的荧光编码微球携带的荧光素可以为不同水平，如水平1(L1)～水平24(L24)，可作为24种荧光编码微球，作为24个检测项目的荧光编码微球。其中，所述项目可以指代细胞因子的种类。
所述荧光染料即为步骤S2中所使用的荧光染料，荧光染料的荧光素不同于步骤S1中的荧光编码微球携带的荧光素。所述荧光染料的荧光素可以但不局限于FITC、PE等。所述捕获抗体为待测细胞因子的捕获抗体，所述荧光编码微球的种类与所述待测细胞因子的项目相对应。同样地，检测抗体为所述待测细胞因子相应的抗体。
在某些实施方式中，其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
所述微球稀释液为含0.02％-0.2％Proclin300，0.05-2.0％的惰性蛋白，pH＝7.0-8.0的10mM的缓冲液。其中，所述惰性蛋白为BSA、明胶或酪蛋白。所述缓冲液为PBS溶液、Tirs溶液或HEPES溶液。
所述样本稀释液为含0.02％-0.2％Proclin300，0.05-2.0％的惰性蛋白，pH＝7.0-8.0的10mM的缓冲液。其中，所述惰性蛋白为BSA、明胶或酪蛋白。所述缓冲液为PBS溶液、Tirs溶液或HEPES溶液。在具体的实施方式中，上述微球稀释液和样本稀释液的组分相同，但是各类物质的含量可以相同也可以不相同。
所述微球重悬缓冲液含0.02％-0.2％Proclin300，0.1-2.5％SDS，0.05-2.0％的惰性蛋白，pH＝7.0-8.0的10mM的缓冲液。其中，所述惰性蛋白为BSA、明胶或酪蛋白。所述缓冲液为PBS溶液、Tirs溶液或HEPES溶液。
本发明中的待检测的细胞因子可以但不限于IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ，本发明的检测方法可以实现上述任意多项细胞因子的联检。
本发明具有以下有益效果：本发明提供的检测方法采用多项荧光编码微球分别标记多项细胞因子的捕获抗体，用荧光素标记多项细胞因子的检测抗体，用冻干技术制备冻干标准品，通过测定标准品绘制标准曲线，最后通过流式细胞仪对样本检测后各项荧光编码微球的荧光强度与标准曲线的对比计算出样品中各细胞因子的浓度。从而本发明提供的检测方法高效快速地在样本需求少的情况下实现多项细胞因子联合检测。本发明提供的试剂盒高度集成，适用于多种细胞因子的多种组合的检测，应用范围广泛。
附图说明
图1是本发明提供的一种多项细胞因子联合检测方法的流程图；
图2是本发明实施例1中各项目荧光编码微球图示；
图3是本发明实施例1中各检测项目编码微球三维信号图示。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图1，对本发明进一步详细说明。
实施例1
本实施例提供的一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
一、制备捕获微球
选择粒径为8μm，APC荧光信号水平为L1-L7和粒径为4μm，APC荧光信号水平为L1-L6的编码微球共13种，分别按照以下方法逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目捕获抗体。
用移液器吸取1mL1％固含量编码微球至离心管中，加入用pH＝7.4的10mM PBS溶解的EDC，使得EDC终浓度为10mg/mL，反应约30min，然后离心去除上清，重悬上述荧光编码微球，加入1mg捕获抗体混匀连续旋转反应约2小时，离心去除上清，得捕获微球浓缩液。
依据此方法制备以上各项目捕获微球浓缩液，将各浓缩液混匀并稀释，获得捕获微球试剂。
二、制备检测试剂
本实施例所选的荧光染料为藻红蛋白(PE)，用PE分别按照以下方案标记制备IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目的检测试剂。
用移液器吸取1.6mg藻红蛋白溶液至离心管，10000rpm离心10min(可根据实际的情况对离心参数进行调整)，去除上清液。用pH＝7.4的10mM PBS溶解，转入节流分子量为30k的透析袋中，1000mL pH＝7.4的10mM PBS透析3次，完成脱盐处理。将脱盐的藻红蛋白转移至离心管中，往离心管中加入10mg/mL的SMCC 4.5μL，连续混匀反应2小时后，按照上诉透析方法脱盐，去除多余的SMCC并转移至离心管中(该管内为活化的藻红蛋白)，吸取1mg检测抗体至另一离心管中，加入10mg/mL的DTT溶液20.6μL，连续旋转混匀反应30分钟，按照上诉透析袋脱盐方法去除多余DTT。
用移液器吸取1.6mg藻红蛋白溶液至离心管，高速离心去除上清液，复溶后转入节流分子量为30k的透析袋中，1000mL pH＝7.4的10mM PBS透析3次，完成脱盐处理。将脱盐的藻红蛋白转移至离心管中，往离心管中加入10mg/mL的SMCC 4.5μL，连续旋转混匀反应2小时后，按照上述透析方法脱盐，去除多余的SMCC并转移至离心管中(该管内为活化的藻红蛋白)。
吸取1mg检测抗体至另一离心管中，加入10mg/mL的DTT溶液20.6μL，连续旋转混匀反应30分钟，按照上述透析袋脱盐方法去除多余DTT。
将上述处理后的检测抗体加入活化的藻红蛋白离心管中，连续旋转混匀反应2小时，加入10mg/mL的NEM溶液10μL终止反应。按照上述透析袋脱盐方法去除多余物质，得浓缩检测抗体，将浓缩检测抗体混匀并稀释，制成所需检测试剂。
三、获取荧光信号
(1)定量标准品的制备
将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目细胞因子的重组抗原分别用缓冲液稀释成所需浓度，用液态氮自动点液系统分别点成冰冻小球。再将上述冰冻小球分别经过冷冻干燥机干燥制备成各个检测项目的冻干珠，分别取1颗每个项目的冻干珠加入标准品瓶中，制备成定量标准品。
(2)标准品溶液的配制
用样本稀释液(本实施例中样本稀释液为含0.05％Proclin300，0.2％BSA的pH＝7.4的10mM PBS溶液)溶解定量标准品中的冻干珠，再逐级稀释成不同浓度的标准品溶液。
(3)捕获微球溶液配制
用微球稀释液(本实施例中的微球稀释液含0.05％Proclin300，0.2％BSA的pH＝7.4的10mM PBS溶液)稀释捕获微球试剂，然后将稀释后的捕获微球溶液分装至各个流式管中(12.5-100μL每管)。
(4)荧光免疫反应
按照序号分别向(3)步骤中的流式管中加入各浓度标准品以及待测样本溶液，添加量为12.5-100μL每管(与微球添加相同体积)，再向每个流式管内添加步骤二制备的检测抗体12.5-100μL(与微球添加相同体积)避光孵育反应约2小时，离心去除上清液，用微球重悬缓冲液(本实施例中的微球重悬缓冲液为含0.05％Proclin300，1％SDS，0.2％BSA的pH＝7.4的10mM PBS溶液)重悬微球，然后上机检测各管中编码微球荧光信号。
四、获得检测结果
通过流式细胞仪对样品中各编码微球信号的收集，以及通过软件的分析可计算出各样本中多项细胞因子浓度。如图2所示，可以根据流式细胞仪收集的数据区分微球的粒径(SSC信息)以及荧光强度(APC信息)从而将编码微球区分，实现多个项目同时检测。如图3所示，在检测反应完后，通过流式细胞仪对每个微球的大小(SSC)，固有荧光(APC)，以及检测试剂荧光(PE)三维信号记录和分析，可以对每个样本中的以上所有项目的检测结果进行定量检测。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表1所示。
表1本实施中5个血清样本的细胞因子含量
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.4 2.5 1.4 2.5
2 IL-2 0.5 1.0 3.4 2.0 4.7
3 IL-4 3.0 2.4 1.4 2.3 1.4
4 IL-5 2.6 0.9 2.5 1.8 2.9
5 IL-6 13.4 10.1 4.8 5.8 24.2
6 IL-8 1.1 0.4 1.0 1.7 2.4
7 IL-10 0.8 2.9 0.2 0.8 2.2
8 IL-12p70 0.2 1.3 0.5 1.9 1.0
9 IL-17A 1.1 1.1 1.3 0.5 2.8
10 TNF-α 0.1 1.8 1.1 0.6 2.8
11 TNF-β 0.6 2.5 1.0 3.0 1.0
12 IFN-α 1.0 0.6 1.2 1.6 1.9
13 IFN-γ 1.6 1.6 2.1 1.1 2.3
完成上述检测只需要5个测试管，每个样本最少只需要12.5μL。而化学发光法或酶联免疫检测试剂盒则每个样本需要约650-1300μL血液样本。另外检测效率方面本发明检测方法也有绝对优势。
实施例2
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即选择粒径0.5μmAPC荧光素水平L1-L7共计7种编码磁珠微球逐一标记IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ7个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料(PE)逐一标记IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ7个项目检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α、IFN-γ7个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测，数据如表2所示。
表2本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-2 0.5 0.9 3.3 2.1 5.0
2 IL-4 2.8 2.5 1.4 2.4 1.3
3 IL-6 13.9 11.1 4.6 5.7 24.9
4 IL-10 0.8 2.7 0.2 0.9 2.4
5 IL-17A 1.1 1.2 1.2 0.5 2.9
6 TNF-α 0.1 1.7 1.0 0.6 2.5
7 IFN-γ 1.6 1.5 2.1 1.1 2.1
实施例3
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即选择粒径10μmAPC-CY7荧光素水平L1-L7和粒径50μm APC-CY7荧光素水平L1-L6，共计13种编码微球，逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料(PE)逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表3所示。
表3本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.5 2.7 1.3 2.6
2 IL-2 0.5 0.9 3.4 2.2 4.5
3 IL-4 3.2 2.2 1.3 2.1 1.5
4 IL-5 2.7 0.9 2.5 1.9 2.6
5 IL-6 14.6 9.7 4.5 6.2 22.5
6 IL-8 1.1 0.4 1.0 1.7 2.4
7 IL-10 0.8 2.9 0.2 0.7 2.4
8 IL-12p70 0.2 1.4 0.5 2.0 1.0
9 IL-17A 1.0 1.1 1.4 0.5 2.8
10 TNF-α 0.1 1.6 1.1 0.6 3.0
11 TNF-β 0.6 2.7 1.0 2.8 1.0
12 IFN-α 1.1 0.6 1.3 1.7 1.7
13 IFN-γ 1.5 1.7 2.2 1.1 2.4
实施例4
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即选择粒径8μmAPC-H7荧光素水平L1-L7和粒径4μm APC-H7荧光素水平L1-L6，共计13种编码微球，逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料(PE)逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表4所示。
表4本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.6 2.7 1.3 2.7
2 IL-2 0.5 1.0 3.1 2.0 4.8
3 IL-4 2.9 2.6 1.3 2.4 1.5
4 IL-5 2.6 1.0 2.7 1.9 2.8
5 IL-6 14.3 10.5 5.1 5.5 24.2
6 IL-8 1.0 0.4 1.1 1.8 2.6
7 IL-10 0.8 3.2 0.2 0.7 2.3
8 IL-12p70 0.2 1.3 0.5 1.9 1.0
9 IL-17A 1.1 1.2 1.3 0.5 2.9
10 TNF-α 0.1 2.0 1.1 0.7 2.7
11 TNF-β 0.6 2.4 1.0 3.2 1.0
12 IFN-α 1.0 0.6 1.3 1.7 1.8
13 IFN-γ 1.6 1.6 2.3 1.0 2.4
实施例5
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即选择粒径8μmPerCP荧光素水平L1-L7和粒径4μm PerCP荧光素水平L1-L6，共计13种编码微球，逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料(PE)逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表5所示。
表5本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.6 2.3 1.4 2.6
2 IL-2 0.5 1.0 3.6 2.0 4.3
3 IL-4 2.7 2.3 1.5 2.5 1.5
4 IL-5 2.9 0.9 2.4 2.0 2.9
5 IL-6 12.3 9.2 5.2 5.9 22.3
6 IL-8 1.2 0.4 0.9 1.9 2.5
7 IL-10 0.9 3.2 0.2 0.8 2.4
8 IL-12p70 0.2 1.4 0.5 1.8 1.0
9 IL-17A 1.0 1.0 1.4 0.5 2.8
10 TNF-α 0.1 1.8 1.0 0.6 2.5
11 TNF-β 0.6 2.5 1.0 2.8 1.0
12 IFN-α 1.0 0.6 1.1 1.8 1.7
13 IFN-γ 1.7 1.5 2.0 1.1 2.4
实施例6
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即选择粒径8μmCF790荧光素水平L1-L7和粒径4μm CF790荧光素水平L1-L6，共计13种编码微球，逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表6所示。
表6本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.5 2.6 1.5 2.3
2 IL-2 0.5 1.0 3.2 2.0 4.9
3 IL-4 3.2 2.4 1.4 2.5 1.5
4 IL-5 2.7 0.8 2.3 1.9 3.1
5 IL-6 13.5 9.3 4.7 5.3 25.4
6 IL-8 1.1 0.4 1.1 1.7 2.5
7 IL-10 0.7 3.1 0.2 0.7 2.1
8 IL-12p70 0.2 1.3 0.5 1.8 0.9
9 IL-17A 1.2 1.1 1.4 0.5 2.9
10 TNF-α 0.1 1.9 1.1 0.6 2.7
11 TNF-β 0.6 2.4 1.0 3.3 0.9
12 IFN-α 1.0 0.6 1.1 1.6 2.1
13 IFN-γ 1.6 1.7 2.1 1.2 2.2
实施例7
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即选8μm ATTO647荧光素水平L1-L7和粒径4μm ATTO647荧光素水平L1-L6，共计13种编码微球，逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表7所示。
表7本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.2 2.6 1.4 2.5
2 IL-2 0.5 0.9 3.5 2.1 4.8
3 IL-4 3.1 2.3 1.4 2.5 1.5
4 IL-5 2.3 1.0 2.4 1.7 2.7
5 IL-6 13.8 9.3 4.7 5.9 26.6
6 IL-8 1.1 0.4 1.1 1.9 2.4
7 IL-10 0.9 2.8 0.2 0.8 2.2
8 IL-12p70 0.2 1.4 0.5 2.1 1.1
9 IL-17A 1.1 1.2 1.3 0.5 2.7
10 TNF-α 0.1 1.9 1.1 0.6 2.7
11 TNF-β 0.6 2.5 1.1 3.0 0.9
12 IFN-α 1.0 0.6 1.2 1.6 1.8
13 IFN-γ 1.6 1.5 2.1 1.2 2.3
实施例8
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即选择粒径8μmBrilliant Violet 786荧光素水平L1-L7和粒径4μm Brilliant Violet 786荧光素水平L1-L6，共计13种编码微球，逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表8所示。
表8本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.5 2.4 1.4 2.4
2 IL-2 0.5 1.0 3.6 2.1 4.2
3 IL-4 3.1 2.3 1.5 2.4 1.4
4 IL-5 2.9 0.9 2.5 1.7 2.7
5 IL-6 12.2 9.2 4.4 5.6 23.0
6 IL-8 1.2 0.4 1.1 1.9 2.2
7 IL-10 0.8 3.1 0.2 0.8 2.3
8 IL-12p70 0.2 1.2 0.5 1.8 0.9
9 IL-17A 1.1 1.1 1.2 0.5 2.8
10 TNF-α 0.1 1.8 1.1 0.6 2.6
11 TNF-β 0.6 2.5 1.0 2.7 0.9
12 IFN-α 1.1 0.7 1.1 1.6 2.0
13 IFN-γ 1.5 1.6 2.0 1.1 2.2
实施例9
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即8μm APC荧光素水平L1-L7和粒径4μm APC荧光素水平L1-L6，共计13种编码微球，逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α、IFN-γ13个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表9所示。
表9本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
Figure BDA0002933978960000121
Figure BDA0002933978960000131
实施例10
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即用12种荧光编码微球逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、IFN-α、TNF-α12个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料逐一标记IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、TNF-β、IFN-α12个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、IFN-α、TNF-α12个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表10所示。
表10本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
Figure BDA0002933978960000132
Figure BDA0002933978960000141
实施例11
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即用8种荧光编码微球逐一标记IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-γ这8个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料逐一标记IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-γ这8个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12p70、IL-17A、TNF-α、IFN-γ这8个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表11所示。
表11本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
Figure BDA0002933978960000142
实施例12
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即用6种荧光编码微球逐一标记IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ这6个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料逐一标记IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ这6个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ这6个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表12所示。
表12本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-2 0.5 1.0 3.7 1.9 4.3
2 IL-4 2.8 2.4 1.4 2.3 1.4
3 IL-6 12.7 10.1 4.6 6.1 22.5
4 IL-10 0.8 2.8 0.2 0.8 2.0
5 TNF-α 0.1 1.8 1.2 0.6 2.6
6 IFN-γ 1.5 1.6 2.0 1.1 2.4
实施例13
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即用5种荧光编码微球逐一标记IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ这5个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料逐一标记IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ这5个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ这5个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表13所示。
表13本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-4 3.1 2.6 1.3 2.4 1.4
2 IL-6 14.1 9.3 4.9 5.7 22.7
3 IL-10 0.8 2.8 0.2 0.9 2.2
4 TNF-α 0.1 1.8 1.1 0.5 3.0
5 IFN-γ 1.5 1.7 2.0 1.0 2.5
实施例14
在本实施例提供一种多项细胞因子联合检测方法，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，即用4种荧光编码微球逐一标记IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ这4个项目捕获抗体，制备捕获试剂。
S2，采用荧光染料逐一标记IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ这4个项目的检测抗体，制备检测试剂。
S3，将IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ这4个项目细胞因子的重组抗原配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号。
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
本实施例检测方法其余的步骤内容与实施例1相同，此处不再重复赘述。
本实施例基于上述的检测方法，还提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。
利用本实施例提供的试剂盒结合本实施例提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表14所示。
表14本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-4 3.2 2.4 1.3 2.3 1.3
2 IL-6 12.2 9.9 4.9 5.5 24.0
3 IL-10 0.8 2.6 0.2 0.8 2.3
4 IFN-γ 1.6 1.4 2.1 1.1 2.3
实施例15
本实施例提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体，且均与实施例1中的荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体和检测抗体相同。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。本实施例中微球稀释液为含0.02％Proclin300，0.05％BSA的pH＝7.0的10mM Tirs溶液，样本稀释液为含0.02％Proclin300，0.05％BSA的pH＝7.0的10mM Tirs溶液，微球重悬缓冲液为含0.02％Proclin300，0.1％SDS，0.05％的BSA的pH＝7.0的10mM Tirs溶液。
利用本实施例提供的试剂盒结合实施例1提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表15所示。
表15本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.3 2.6 1.5 2.6
2 IL-2 0.5 0.9 3.6 1.8 4.8
3 IL-4 2.8 2.2 1.4 2.3 1.5
4 IL-5 2.8 0.8 2.7 1.6 2.6
5 IL-6 12.2 9.8 5.2 6.2 21.8
6 IL-8 1.1 0.4 1.1 1.8 2.4
7 IL-10 0.8 2.8 0.2 0.8 2.4
8 IL-12p70 0.2 1.3 0.5 2.1 1.0
9 IL-17A 1.0 1.2 1.2 0.5 2.8
10 TNF-α 0.1 1.8 1.0 0.6 2.8
11 TNF-β 0.6 2.6 1.1 2.9 1.1
12 IFN-α 1.0 0.6 1.2 1.5 1.9
13 IFN-γ 1.6 1.6 2.2 1.2 2.1
实施例16
本实施例提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体，且均与实施例1中的荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体和检测抗体相同。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。本实施例中微球稀释液为含0.1％Proclin300，1.0％明胶的pH＝7.5的10mM PBS溶液，样本稀释液为含0.1％Proclin300，1.0％明胶的pH＝7.5的10mM PBS溶，微球重悬缓冲液为含0.1％Proclin300，1.5％SDS，1.0％的明胶的pH＝7.0-8.0的10mM PBS溶液。
利用本实施例提供的试剂盒结合实施例1提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表16所示。
表16本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
Figure BDA0002933978960000171
Figure BDA0002933978960000181
实施例17
本实施例提供了一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体，且均与实施例1中的荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体和检测抗体相同。其中本发明提供的试剂盒还包括微球稀释液，定量标准品，样本稀释液以及微球重悬缓冲液。本实施例中微球稀释液为含0.2％Proclin300，2.0％酪蛋白的pH＝8.0的10mM HEPES溶液，样本稀释液为含0.2％Proclin300，2.0％酪蛋白的pH＝8.0的10mM HEPES溶液，微球重悬缓冲液为含0.2％Proclin300，2.5％SDS，2.0％酪蛋白的pH＝8.0的10mM HEPES溶液。
利用本实施例提供的试剂盒结合实施例1提供的检测方法对5个血清样本进行检测数据如表17所示。
表17本实施中5个血清样本细胞因子的检测结果
序号 检测项目 样本1 样本2 样本3 样本4 样本5
1 IL-1β 0.2 2.4 2.8 1.5 2.4
2 IL-2 0.5 0.9 3.1 2.1 4.7
3 IL-4 2.8 2.6 1.4 2.4 1.5
4 IL-5 2.7 0.9 2.5 1.7 2.7
5 IL-6 12.6 9.1 4.6 5.5 24.0
6 IL-8 1.1 0.4 0.9 1.8 2.4
7 IL-10 0.8 3.1 0.2 0.7 2.3
8 IL-12p70 0.2 1.4 0.5 1.8 1.1
9 IL-17A 1.1 1.2 1.2 0.5 3.1
10 TNF-α 0.1 1.7 1.1 0.6 3.1
11 TNF-β 0.6 2.7 0.9 2.9 1.0
12 IFN-α 1.1 0.6 1.2 1.5 1.7
13 IFN-γ 1.7 1.6 2.0 1.0 2.1
上述仅本发明较佳可行实施例，并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的技术人员，在本发明的实质范围内，所作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种多项细胞因子联合检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，采用多个荧光编码微球分别一一对应标记多个捕获抗体，制备捕获微球试剂，所述捕获抗体为待测细胞因子的捕获抗体，所述荧光编码微球的种类与所述待测细胞因子的种类一一相对应；
S2，采用荧光染料标记检测抗体，制备检测试剂，所述检测抗体与所述捕获抗体为配对抗体；
S3，配制不同浓度的标准品溶液，将不同浓度的标准品溶液以及待测样本溶液分别添加至步骤S1中的捕获微球试剂中，再加入步骤S2的检测试剂形成整体反应体系，将整体反应体系避光孵育后，读取荧光信号；
S4，通过步骤S3中的荧光信号绘制各项细胞因子的标准曲线，以及通过标准曲线计算出各待测样本中各细胞因子的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种多项细胞因子联合检测方法，其特征在于，步骤S1中，对所述荧光编码微球进行活化后，再与所述捕获抗体混匀进行旋转反应制备捕获微球试剂浓缩液，将制备的各项目捕获微球试剂浓缩液混匀并稀释，即为所述捕获微球试剂。
3.根据权利要求2所述的一种多项细胞因子联合检测方法，其特征在于，所述荧光编码微球活化的方法如下：所述荧光编码微球加入用pH＝7.4的10mM PBS溶解的EDC，使得EDC终浓度为10mg/mL，反应约30min。
4.根据权利要求1所述的一种多项细胞因子联合检测方法，其特征在于，步骤S2中，通过荧光染料与检测抗体交联获得浓缩检测抗体，将制备的各项目浓缩检测抗体混匀并稀释，制成所述检测试剂。
5.根据权利要求4所述的一种多项细胞因子联合检测方法，其特征在于，所述荧光染料与所述检测抗体交联的方法如下：将所述荧光染料通过透析进行脱盐处理后，与SMCC混合反应，再通过透析进行脱盐处理后，获得活化的荧光染料，将所述检测抗体与DTT混合反应，再通过透析进行脱盐处理后加入所述活化的荧光染料中进行混合反应后脱盐处理，得浓缩检测抗体。
6.根据权利要求1所述的一种多项细胞因子联合检测方法，其特征在于，在步骤S3中，配制不同浓度的标准品溶液的方法如下：将细胞因子的重组抗原制备为冻干珠，再将上述冻干珠溶解后，再逐级梯度稀释，获得不同浓度的标准品溶液。
7.一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，基于权利要求1-6所述的一种多项细胞因子联合检测方法，其特征在于，包括荧光编码微球、荧光染料、捕获抗体、与所述捕获抗体配对的检测抗体。
8.根据权利要求7所述的一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，其特征在于，所述荧光编码微球的直径为0.5-50μm，所述荧光编码微球的荧光素为APC、APC-Cy7、APC-H7、PerCP、CF系列、ATTO系列或Brilliant系列荧光素；所述荧光染料的荧光素为FITC或PE。
9.根据权利要求7所述的一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，其特征在于，还包括微球稀释液，定量标准品、样本稀释液和微球重悬缓冲液；所述微球稀释液为含0.02％-0.2％Proclin300，0.05-2.0％的惰性蛋白，pH＝7.0-8.0的10mM的缓冲液；所述样本稀释液为含0.02％-0.2％Proclin300，0.05-2.0％的惰性蛋白，pH＝7.0-8.0的10mM的缓冲液；所述微球重悬缓冲液含0.02％-0.2％Proclin300，0.1-2.5％SDS，0.05-2.0％的惰性蛋白，pH＝7.0-8.0的10mM的缓冲液。
10.根据权利要求9所述的一种多项细胞因子联合检测的试剂盒，其特征在于，所述惰性蛋白为BSA、明胶或酪蛋白；所述缓冲液为PBS溶液、Tirs溶液或HEPES溶液。
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