CN117368493B - 基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的试剂盒及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的试剂盒及方法，针对12种细胞因子，分别筛选和优化12种细胞因子的抗体1序列和抗体2序列，经真核细胞表达系统表达制备人源化的重组抗体；其中抗体1用于制备偶联微球的抗体溶液，抗体2用于制备荧光标记的抗体溶液；并针对其中最难检测的IL‑17A抗体序列进行多次突变筛选和重链轻链组合配对筛选，获得最优选的IL‑17A抗体1和IL‑17A抗体2序列。制备的试剂盒经流式细胞仪实现同时检测12种细胞因子，检测过程只需一次孵育一次洗涤，且能提高检测的准确性和灵敏度，控制批间差，对血清样品和血浆样品都实现精确检测。

Description

基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的试剂盒及方法
技术领域
本发明涉及流式细胞技术领域，具体涉及一种基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的试剂盒及方法。
背景技术
细胞因子由免疫细胞和某些非免疫细胞经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子的分泌在病理条件下会发生改变，如各种感染性疾病等。细胞因子的检测为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学辅助依据。
辅助性T细胞（Th）是T细胞的亚群之一，通常指一类具有协助体液免疫和细胞免疫应答能力的T细胞亚群。根据所分泌细胞因子的不同，Th细胞可分为Th1、Th2等细胞亚群。目前，研究较多的分泌细胞因子的细胞为Th1和Th2细胞。Th1细胞主要分泌促炎细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α，它们有利于B细胞产生有调理作用的抗体（IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IgA）和与补体相结合的抗体（IgM、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ），能够刺激巨噬细胞、NK细胞、CD8+细胞毒性T细胞对抗细胞内病原体，引起T淋巴细胞介导的细胞毒作用和细胞免疫。以Th1为主的免疫应答主要引起依赖于吞噬细胞的炎症。此外，Th1反应通过激活CD8+细胞毒性T淋巴细胞参与肿瘤清除。Th2细胞主要分泌IL-4、IL-6和IL-10，它们引起较强的抗体反应（包括IgE），促进嗜酸性粒细胞的分化与活化，产生一种不依赖于吞噬细胞的炎症。Th2细胞参与防御细胞外寄生虫（例如蠕虫）和刺激体液反应（通过B细胞）。在病理条件下，这些细胞负责几种炎症，例如过敏反应、哮喘、特应性皮炎等。Th1细胞可分泌IFN-γ而不分泌IL-4，Th2细胞可分泌IL-4而不分泌IFN-γ，通常以这两种细胞因子作为鉴别Th1和Th2的标志。测定Th1、Th2细胞的调节对维持机体正常的免疫功能至关重要。Th1、Th2的失衡与自身免疫病、过敏性疾病、肿瘤、移植排斥反应以及感染性疾病的发生发展有密切的关系。
IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17、IFN-γ、TNF-α、IFN-α等因子为人体免疫中常见的细胞炎症因子，在人体免疫调节中发挥着重要作用。例如，IL-1β、IL-6、TNF-α在骨性关节炎、冠状动脉粥样硬化综合征及及脑梗死中发挥作用，IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IFN-γ等由辅助性T细胞Th1和Th2细胞分泌，参与调节Th1和Th2细胞功能的动态平衡，维持机体正常的细胞免疫和体液免疫功能，当机体受到异己抗原攻击导致机体免疫功能平衡发生变化时，Th1和Th2细胞中某一亚群功能升高，另一亚群功能降低，从而Th1和Th2分泌的各的细胞因子浓度也会产生相对应的变化。在IL-17家族的六个成员中IL-17A是IL-17的原型，IL-17A结合受体，诱导促炎细胞分泌趋化因子或细胞因子，参与组织重塑，参与急性期反应。进而参与机体各类疾病。IL-17A主要由参与固有免疫和某些炎症的发生，IL-17A具有强大的招募中性粒细胞的独特之处及促进多种细胞因子释放的作用，参与了机体多种炎性疾病的发生。其具有强大的致炎性，是炎症反应的微调因子，它能促进机体局部产生趋化因子，如IL-8、单核细胞趋化蛋白（MCP-1）、生长调节因子-α，从而使得单核细胞和中性粒细胞的迅速增多，能够刺激产生IL-6和前列腺素-2，增强局部炎症。IL-8、IL-12p70、IFN-α等表达水平则在病毒性感染、尖锐湿疣患者血清中显著增高。
流式细胞技术的多重蛋白定量检测是集ELISA和细胞流式技术优点为一身的液相蛋白检测技术，整合了免疫微球、激光检测、信号处理及计算机运算等功能，能够对样本中的多个指标进行定性、定量检测。
目前市场上检测IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α等细胞因子的试剂盒操作较为复杂，需要多次孵育和洗涤，准确性不高，灵敏度低，很多阳性病例无法检出，且耗时较长，不利于稀有样本的检测。
如公开号为CN115015561A的专利提供了一种流式细胞仪同时检测十二种细胞因子的方法，其检测过程必须通过生物素来放大信号，且孵育过程需要多次孵育，多次涡旋震荡，非常繁琐。
公开号为CN114636824A的专利提供了一种围产期脐带血中细胞因子和免疫细胞联合检测的试剂盒及其使用方法，同样需要多次孵育，多次涡旋，多次洗涤，繁琐的前处理过程很容易导致带入其他杂质，必然会影响检测结果的准确性和批间重复性。
另外，现有技术提供的检测十二种细胞因子的方法，都只能针对血清样品进行检测，无法实现同时对血清样品和血浆样品进行精确检测，对样品采集方面也就有了更多的限制。
因此，有必要提供一种新型的细胞因子联合检测试剂盒及其制备方法和使用方法以解决现有技术中存在的上述问题。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的试剂盒及方法，针对12种细胞因子，分别筛选和优化12种细胞因子的抗体1序列和抗体2序列，经真核细胞表达系统表达制备重组抗体；其中抗体1用于制备偶联微球的抗体溶液，抗体2用于制备荧光标记的抗体溶液；并针对其中最难检测的IL-17A抗体序列进行多次突变筛选和重链（H链）轻链（L链）组合配对筛选，获得最优选的IL-17A抗体1和IL-17A抗体2序列。制备的试剂盒经流式细胞仪实现同时检测12种细胞因子，检测过程只需一次孵育一次洗涤，且能提高检测的准确性和灵敏度，控制批间差，对血清样品和血浆样品都实现精确检测，有助于全面评估患者的免疫功能状况，综合判断机体的免疫状态，为疾病的辅助诊断、指导用药、监督疗效以及预后提供重要参考。
现有的用于细胞因子检测的抗体基本都是采用传统的淋巴细胞杂交瘤技术制备获得。杂交瘤细胞生产的单克隆抗体，可以特异性识别人类血液中的细胞因子，但是会存在以下三个问题：1、杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体产量会随着细胞传代次数的增加逐渐降低，最终可能造成细胞株的丢失；2、制备的单克隆抗体存在批间差，从而影响检测结果的准确性；3、用传统的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体具有完整的小鼠抗体序列，用于检测人类血液中的细胞因子时可能与人类血液中的成分发生非特异反应，干扰检测结果的准确性和灵敏度，并进一步影响医疗诊断结果。
另外，现有的细胞因子检测试剂盒，在前处理过程中需要多次孵育和洗涤，准确性不高，灵敏度低，很多阳性病例无法检出，且耗时较长，不利于稀有样本的检测，同时只能针对一种血浆或一种血清样本进行检测，难以实现同时对血清样品和血浆样品进行精确检测。
因此本发明尝试制备12种细胞因子的人源化重组抗体，重组抗体的序列由小鼠单克隆抗体的可变区序列和人类抗体IgG1的恒定区序列组成，既保留了小鼠单克隆抗体的特异性抗原识别能力，又避免了和人类血清或血浆中的成分发生非特性反应造成假阳性的检测结果，提高了检测的准确度和灵敏度。
本发明将抗体原始的H链和L链信号肽序列替换为筛选优化后的H链和L链信号肽序列，与可变区序列连接。进行编码抗体对的H链和L链核苷酸序列进行密码子优化，合成DNA序列并构建pcDNA3.4重组载体。将前述的编码抗体H链和L链的含有目的DNA的质粒转染Expi293F细胞进行表达，收集培养基上清液。通过Protein A介质纯化获得重组抗体。人类抗体IgG1的恒定区与纯化抗体的Protein A介质具有更强的结合能力，提高了纯化抗体的效率。
一方面，本发明提供了一种基于流式细胞仪检测12种细胞因子的试剂盒，所述试剂盒包括：偶联微球的抗体溶液，荧光标记的抗体溶液，微球缓冲液和洗涤缓冲液；所述抗体包括IL-1β抗体、IL-2抗体、IL-4抗体、IL-5抗体、IL-6抗体、IL-8抗体、IL-10抗体、IL-12p70抗体、IL-17A抗体、IFN-γ抗体、TNF-α抗体、IFN-α抗体中的任意一种或多种。
进一步地，所述偶联微球的抗体为抗体1，荧光标记的抗体为抗体2；所述抗体1包括抗体1包括IL-1β抗体1、IL-2抗体1、IL-4抗体1、IL-5抗体1、IL-6抗体1、IL-8抗体1、IL-10抗体1、IL-12p70抗体1、IL-17A抗体1、IFN-γ抗体1、TNF-α抗体1、IFN-α抗体1中的任意一种或多种；抗体2包括IL-1β抗体2、IL-2抗体2、IL-4抗体2、IL-5抗体2、IL-6抗体2、IL-8抗体2、IL-10抗体2、IL-12p70抗体2、IL-17A抗体2、IFN-γ抗体2、TNF-α抗体2、IFN-α抗体2中的任意一种或多种。
试剂盒中的偶联微球的抗体溶液和荧光标记的抗体溶液，都需要用到抗体，研究证明偶联微球的抗体，和荧光标记的抗体都采用不同抗体，且选择更合适的抗体组合，能显著提高12种细胞因子的检测灵敏度和准确性，并且整个检测过程只需一次孵育，一次洗涤。
进一步地，所述IL-17A抗体1的重链的CDR3区的氨基酸序列如Seq ID NO:193所示，轻链的CDR3区的氨基酸序列如Seq ID NO:223所示；IL-17A抗体2的重链的CDR3区的氨基酸序列如Seq ID NO:263所示，轻链的CDR3区的氨基酸序列如Seq ID NO:279所示。
进一步地，所述IL-17A抗体1的重链具有如Seq ID NO:116所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:117所示的氨基酸序列，IL-17A抗体2的重链具有如Seq ID NO:118所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:119所示的氨基酸序列。
在12种细胞因子中，IL-17A最难检测，其原因可能是由杂交瘤细胞分泌的IL-17A抗体亲和度相对较低，因此在12种细胞因子共同检测的过程中，容易出现IL-17A抗原的检测灵敏度低于其他抗原。
本发明通过优化IL-17A抗体的可变区序列的方法，改变了IL-17A抗体的氨基酸序列，提高IL-17A抗体的亲和度，防止检测过程中的非特异性结合，有效地提高了定量检测IL-17A抗原的灵敏度和准确度。
本发明对IL-17A抗体1、IL-17A抗体2的重链和轻链都设计了多种单个或多个氨基酸的突变，再经组合配对，从中挑选出最适合用于制备抗体1的配对序列，和最适合用于制备抗体2的配对序列。
除了IL-17A抗体以外，其余11种细胞因子抗体可变区的氨基酸序列相对于免疫动物获得的单克隆抗体并没有发生改变，但是本发明通过将原始抗体序列的恒定区替换为人类抗体的对应序列，构成重组的嵌合抗体，从而使制备的12种细胞因子抗体1和抗体2用于检测时，能消除非特异性结合，防止交叉影响，降低批间差，提高重复性，其原因是采用本发明提供的编码的抗体，不易与人类血清或血浆中的成分发生非特异性反应，从而能使12种细胞因子的检测结果更加准确。
进一步地，用于编码所述抗体1和抗体2的轻链和重链的核苷酸序列如表1所示：
表1、编码抗体1和抗体2的轻链和重链的核苷酸序列
进一步地，所述荧光标记的抗体溶液为藻红蛋白标记的抗体溶液；所述微球缓冲液包括KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、KCl、BSA、ProClin300、Tween-20和PVP-k30。
进一步地，所述微球缓冲液包括0.2~0.3%KH2PO4（质量比）、3~4%Na2HPO4·12H2O（质量比）、0.5~1.0%NaCl（质量比）、0.1~0.5%KCl（质量比）、2~4%BSA（质量比）、0.1~0.2%ProClin300（体积比）、0.05~0.1%Tween-20（体积比）和0.1~0.3%PVP-k30（体积比）。
进一步地，所述洗涤缓冲液包括Tris、NaCl、BSA、ProClin300、Tween-20和道康宁-1520。
进一步地，所述洗涤缓冲液包括0.3~0.4%Tris（质量比）、0.8~1.2%NaCl（质量比）、1.5~3%BSA（质量比）、0.08~0.12%ProClin300（体积比）、0.05~0.1%Tween-20（体积比）和0.01~0.02%道康宁-1520（体积比）。
本发明还优化了微球缓冲液和洗涤缓冲液的配方，采用优化后的微球缓冲液和洗涤缓冲液，能显著提高12种细胞因子的检测灵敏度，使检测结果更加准确。
再一方面，本发明提供了一种基于流式细胞仪检测12种细胞因子的试剂盒的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤（1）：构建含有抗体重链和轻链的重组载体，经真核表达系统表达，制备重组抗体，所述重组抗体包括抗体1和抗体2，所述抗体1包括IL-1β抗体1、IL-2抗体1、IL-4抗体1、IL-5抗体1、IL-6抗体1、IL-8抗体1、IL-10抗体1、IL-12p70抗体1、IL-17A抗体1、IFN-γ抗体1、TNF-α抗体1和IFN-α抗体1；抗体2包括IL-1β抗体2、IL-2抗体2、IL-4抗体2、IL-5抗体2、IL-6抗体2、IL-8抗体2、IL-10抗体2、IL-12p70抗体2、IL-17A抗体2、IFN-γ抗体2、TNF-α抗体2和IFN-α抗体2；所述IL-17A抗体1的重链具有如Seq ID NO:116所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:117所示的氨基酸序列，IL-17A抗体2的重链具有如Seq ID NO:118所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:119所示的氨基酸序列；
步骤（2）：利用重组抗体，配制偶联微球的抗体溶液和荧光标记的抗体溶液。
进一步地，所述偶联微球的抗体为抗体1，荧光标记的抗体为抗体2，所述编码抗体1和抗体2的轻链和重链的如表1所示。
在一些方式中，步骤（1）所述构建含有抗体重链和轻链的重组载体，经真核表达系统表达，制备重组抗体，基本流程如下：
a、提取mRNA：首先通过从分泌细胞因子单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA。
b、逆转录cDNA：逆转录酶MMLV从mRNA的3’端开始复制第一链cDNA，随后逆转录酶MMLV在cDNA链5’端添加多个胞嘧啶脱氧核糖核苷酸（C）。通用延长引物的3’端有3个鸟嘌呤核糖核苷酸（G）与cDNA链5’端的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸（C）形成互补。由于逆转录酶MMLV以mRNA为模板复制cDNA，在3个鸟嘌呤核糖核苷酸（G）的介导下，逆转录酶MMLV调换模板序列，以通用延长引物为模板在cDNA链5’端添加一段通用PCR扩增序列。这种方法可以获取包括信号肽序列在内，尽可能完整的抗体可变区序列。
c、PCR扩增cDNA：以通用的5’端引物和3’端引物（Kappa链/Lambda链/H链），PCR扩增以上步骤获得的第一链cDNA，获得编码抗体H链或L链可变区的双链DNA。
对PCR产物进行电泳纯化，使用Sanger测序，再利用IMGT数据库分析序列，定位抗体H链和L链的信号肽序列，以及包括互补决定区（CDR区）和结构（FR区）在内的可变区序列。
d、将抗体原始的H链和L链信号肽序列替换为优化后的H链和L链信号肽序列，与可变区序列连接，5’端/3’端分别增加限制性内切酶位点EcoRⅠ/HindⅢ，进行密码子优化，合成DNA序列并构建pcDNA3.4重组载体。
e、将前述的抗体H链和L链质粒转染Expi293F细胞进行表达，收集培养基上清液。通过Protein A介质纯化获得重组抗体。
另外，针对IL-17A抗体1，IL-17A抗体2可变区中的互补决定区（CDR3）序列进行优化，构建包含不同突变序列的多个重组IL-17A抗体1，IL-17A抗体2，选择抗原检测结果最优的一组抗体。
再一方面，本发明提供了一种基于流式细胞仪检测12种细胞因子的方法，所述方法采用一步孵育法，包括以下步骤：
步骤（a）：取待测样品，分别加入偶联微球的抗体溶液，荧光标记的抗体溶液，和微球缓冲液，孵育；
步骤（b）：加入洗涤缓冲液清洗，离心，待检测。
采用淋巴细胞杂交瘤技术制备获得的抗体，用于流式细胞仪检测12种细胞因子时，还存在一个较难解决的问题，就是孵育过程非常繁杂，需要多步孵育，比如由于IL-17A抗体较难检测，因此在前处理中需要将IL-17A抗体与其他细胞因子抗体分开孵育来保证IL-17A检测结果的准确性；还有TNF-α也需要分开孵育，导致需要至少1.5步孵育才能实现12种细胞因子的检测。本发明通过筛选合适的抗体1和抗体2，在检测12种细胞因子时，仅需一步孵育即可完成前处理，极大得简化了操作过程，也有助于提高检测结果的准确性。
进一步地，所述待测样品为血浆样品、血清样品、校准品中的一种或多种。
再一方面，本发明提供了一组重组抗体用于制备基于流式细胞仪经一步孵育法同时检测血液样品中的12种细胞因子的试剂的用途，所述重组抗体包括抗体1和抗体2；所述编码抗体1和抗体2的轻链和重链的如表1所示。
进一步地，所述血液样品为血浆样品和/或血清样品。
再一方面，本发明提供了一组IL-17A重组抗体用于制备基于流式细胞仪经一步孵育法同时检测血液样品中的12种细胞因子的试剂的用途，所述IL-17A重组抗体包括IL-17A抗体1和IL-17A抗体2，所述IL-17A抗体1的重链具有如Seq ID NO:116所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:117所示的氨基酸序列，IL-17A抗体2的重链具有如Seq ID NO:118所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:119所示的氨基酸序列。
再一方面，本发明提供了一组IL-17A重组抗体用于制备提高流式细胞仪同时检测血液样品中的12种细胞因子的准确性的试剂的用途，所述IL-17A重组抗体包括IL-17A抗体1和IL-17A抗体2，所述IL-17A抗体1的重链具有如Seq ID NO:116所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:117所示的氨基酸序列，IL-17A抗体2的重链具有如Seq ID NO:118所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:119所示的氨基酸序列。
再一方面，本发明提供了一组重组抗体用于制备提高流式细胞仪同时检测血液样品中的12种细胞因子的准确性的试剂的用途，所述重组抗体包括抗体1和抗体2；所述编码抗体1和抗体2的轻链和重链的核苷酸序列如表1所示。
本发明构建的基于流式细胞仪检测12种细胞因子的试剂盒及其检测方法，具有以下有益效果：
1、基于流式细胞仪能够实现IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α 12种细胞因子的同时精准检测；
2、针对12种细胞因子，分别筛选和优化12种细胞因子的抗体1和抗体2的核苷酸序列，经真核细胞表达系统表达制备重组抗体；其中抗体1用于制备偶联微球的抗体溶液，抗体2用于制备荧光标记的抗体溶液；
3、针对其中最难检测的IL-17A抗体序列进行多次突变筛选和重链轻链组合配对筛选，获得最优选的IL-17A抗体1和IL-17A抗体2的核苷酸序列和氨基酸序列；
4、将单克隆抗体的mRNA序列提取出来并克隆到质粒中，适合长期保存，不会丢失；
5、将小鼠抗体的恒定区序列替换为人类抗体IgG1的恒定区序列，形成重组的嵌合抗体，在一定程度上避免与人类血液中的成分发非特异反应，提高了检测抗原的准确性和灵敏度，且抗干扰能力更强；
6、人类抗体IgG1的恒定区与纯化抗体的Protein A介质具有更强的结合能力，提高了纯化抗体的效率；
7、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α 12种细胞因子的检测灵敏度空白限均在1pg/mL以下，检出限均在1.25pg/mL以下，批间差控制在7%以内；
8、检测过程只需一次孵育一次洗涤，且能提高检测的准确性和灵敏度，控制批间差，对血清样品和血浆样品都实现精确检测，有助于全面评估患者的免疫功能状况，综合判断机体的免疫状态，为疾病的辅助诊断、指导用药、监督疗效以及预后提供重要参考。
附图说明
图1为实施例1中的RNA电泳结果图；
图2为实施例1中的PCR产物电泳结果图；
图3为实施例1中的24种抗体的序列优化流程图；
图4为实施例1中的SDS-PAGE电泳结果图；
图5为实施例1中的基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的试剂盒的检测原理示意图，其中10为聚苯乙烯微球，20为偶联微球的抗体1，30为待测样本，40为荧光标记的抗体2，50为藻红蛋白；
图6为实施例1提供的样本检测的捕获微球分布情况；
图7为实施例1提供的基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的校准曲线；
图8为实施例1提供的IL-1β的线性评价结果；
图9为实施例1提供的IL-2的线性评价结果；
图10为实施例1提供的IL-4的线性评价结果；
图11为实施例1提供的IL-5的线性评价结果；
图12为实施例1提供的IL-6的线性评价结果；
图13为实施例1提供的IL-8的线性评价结果；
图14为实施例1提供的IL-10的线性评价结果；
图15为实施例1提供的IL-12p70的线性评价结果；
图16为实施例1提供的IL-17A的线性评价结果；
图17为实施例1提供的IFN-γ的线性评价结果；
图18为实施例1提供的TNF-α的线性评价结果；
图19为实施例1提供的IFN-α的线性评价结果。
具体实施方式
为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技术方案进行详细说明。这些说明仅仅是表明本发明是如何实现的，并不能限定本发明的具体范围。本发明的范围在权利要求中限定。
实施例1：试剂盒的制备、使用与效果评价
一、试剂盒的制备
具体组成如表2所示：
表2、试剂盒组成
其制备方法如下：
1、 抗体的制备
试剂：逆转录酶（SMART® MMLV Reverse Transcriptase，宝日医生物技术（北京）有限公司，货号639522），通用核糖核酸提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit，宝日医生物技术（北京）有限公司，货号9767），高保真脱氧核糖核酸聚合酶（Hieff Canace® Gold High-Fidelity DNA Polymerase，翌圣生物科技(上海)股份有限公司，货号10148ES60），蛋白A亲和层析介质（AT Protein A Diamond，博格隆公司，货号AA0272），Expi293™ 表达培养基（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号A1435101），ExpiFectamine™ 293 转染试剂盒（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号A14524）。
a、提取mRNA：首先通过从分泌细胞因子单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA。
前期已通过细胞因子重组蛋白免疫Balb/c小鼠并筛选获得可以分泌抗体的单克隆细胞株（免疫后获得多株单克隆细胞株，针对每种抗原，筛选出两株效价最高的单克隆细胞株用于制备抗体），取106个/mL处于对数生长期的单克隆细胞株（IL-2抗体1，IL-2抗体2，IL-4抗体1，IL-4抗体2，IL-6抗体1，IL-6抗体2，IL-10抗体1，IL-10抗体2，TNF-α抗体1，TNF-α抗体2，IFN-γ抗体1，IFN-γ抗体2，IL-17A抗体1，IL-17A抗体2，IL-1β抗体1，IL-1β抗体2，IL-5抗体1，IL-5抗体2，IL-12p70抗体1，IL-12p70抗体2，IFN-α抗体1，IFN-α抗体2，IL-8抗体1，IL-8抗体2），确保细胞活率大于90%，300G离心5分钟，弃上清保留细胞。
使用核糖核酸提取试剂盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit，货号9767）提取RNA。RNA提取的质量合格标准是，电泳可见28S和18S条带的比例大约是2：1，电泳结果如图1所示。
b、逆转录cDNA：使用逆转录酶由mRNA逆转录第一链cDNA。逆转录反应体系设置如下：
（1）向200μL PCR反应管中加1μg的上述RNA；
（2）分别加2.5μL的20μM浓度的逆转录正向引物和逆向引物（三选一），加水至总体积11.5μL；
（3）70℃孵育3分钟，立即置于冰上冷却；
（4）加4μL的5×第一链合成缓冲液（First-Strand Buffer），2μL的dNTP Mix，2μL的100 mM DTT，混匀；
（5）加0.5μL的逆转录酶，混匀；
（6）42℃孵育60分钟；
（7）终止反应：70℃孵育15分钟。
采用的引物如表3所示。逆转录引物oligo(dT)可以代替本实施例使用的抗体特异性引物和通用延长引物，但逆转录引物oligo(dT)会产生许多非特异性复制的cDNA，在随后的PCR扩增中，需使用多种不同序列的5’端引物来穷举出正确的序列。复制产生的DNA片段可能不包括完整的抗体可变区和信号肽序列，操作更耗时，工作量更大。
表3、逆转录正向引物和逆向引物
逆转录酶MMLV从mRNA的3’端开始复制第一链cDNA，随后逆转录酶MMLV在cDNA链5’端添加多个胞嘧啶脱氧核糖核苷酸（C）。通用延长引物的3’端有3个鸟嘌呤核糖核苷酸（G）与cDNA链5’端的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸（C）形成互补。由于逆转录酶MMLV以mRNA为模板复制cDNA，在3个鸟嘌呤核糖核苷酸（G）的介导下，逆转录酶MMLV调换模板序列，以通用延长引物为模板在cDNA链5’端添加一段通用PCR扩增序列。这种方法可以获取包括信号肽序列在内，尽可能完整的抗体可变区序列。
c、PCR扩增cDNA，获得双链DNA：
以通用的5’端引物和3’端引物（Kappa链/Lambda链/H链），PCR扩增以上步骤获得的第一链cDNA，获得编码抗体H链或L链可变区的双链DNA。设计的PCR引物如表4所示，PCR反应体系如表5和表6所示。
表4、PCR正向引物和逆向引物
表5、PCR反应设置
表6、PCR循环设置
对PCR产物进行电泳纯化，电泳结果如图2所示，可以看出成功获得抗体的H链和L链。
d、设计重组的嵌合抗体序列：
前述步骤获得的DNA片段使用Sanger测序，获得24个抗体的原序列（表9），输入数据库IgBlast分析，定位抗体H链和L链的信号肽序列，以及包括互补决定区（CDR区）和结构（FR区）在内的可变区序列。
由前述的序列中截取H链/L链可变区序列，在可变区序列5’端增加优化的H链/L链信号肽序列（表7），在可变区序列3’端增加人类IgG1恒定区H链/L链序列（表8），获得重组的H链/L链基因序列（优化得到表1所示的24个重组抗体的H链/L链基因序列）。其中，若小鼠抗体的可变区属于Kappa链，则连接人类Kappa链恒定区；若小鼠抗体的可变区属于Lambda链，则连接人类Lambda链恒定区。
在重组的H链/L链基因5’端/3’端分别增加限制性内切酶位点EcoRⅠ/HindⅢ，使用金斯瑞公司提供的密码子优化服务，合成重组抗体的H链/L链基因，载体质粒为pcDNA3.4（Seq ID NO:103，金斯瑞公司提供），构建pcDNA3.4重组载体（金斯瑞公司提供）。
表7、H链/L链信号肽序列
表8、人类IgG1恒定区H链/L链序列
表9、24个抗体的H链/L链基因的原序列
氨基酸序列优化后的IL-17A抗体1的重链具有如Seq ID NO:116所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:117所示的氨基酸序列，IL-17A抗体2的重链具有如Seq ID NO:118所示的氨基酸序列，轻链具有如Seq ID NO:119所示的氨基酸序列，优化前的IL-17A抗体1和IL-17A抗体2的轻重链具有如Seq ID NO:120- Seq ID NO:123所示的氨基酸序列，及22种抗体的轻重链具有如Seq ID NO:124- Seq ID NO:167所示的氨基酸序列，详见表10。24种抗体的序列优化流程图见图3。
表10、22种抗体的氨基酸序列
e、真核表达重组抗体：转染当天将处于对数生长期的Expi293F细胞密度调整到2.5×106/mL，使用的培养基为Expi293™ 表达培养基（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，A1435101）。转染100mL细胞需使用100μg质粒（其中H链质粒35.5μg，L链质粒64.5μg），加270μL转染试剂ExpiFectamine™ 293 （赛默飞世尔科技（中国）有限公司，A14524）。在37℃，8%二氧化碳条件下培养4-5天后，3000G离心20分钟收集培养基，0.22μM滤膜过滤。
f、抗体纯化，以100mL培养基为例：
（1）使用1mL的AT Protein A Diamond亲和层析介质（博格隆公司，AA0272），装入层析柱；
（2）通过5倍柱体积的20mM PBS（pH7.4）；
（3）通过100mL培养基（pH7.0-8.0）；
（4）通过10倍柱体积的20mM PBS（pH7.4）；
（5）通过10倍柱体积的100mM甘氨酸（pH3.1），收集含抗体的洗脱液。
（6）SDS-PAGE电泳抗体纯化产物，电泳图如图4所示。由图4可以看出，抗体纯度良好；
（7）10mM PBS（pH7.4）透析抗体，取出后保存在-20℃，抗体制备完成。
2、配制偶联微球的抗体溶液
取浓度5×107个/mL荧光微球（厂家Polysciences，型号BLI239C-20,BLI250C-10）0.1mL，加入PBST缓冲液清洗2次，在清洗后的第一荧光微球中加入100μg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和50μg的N-羟基硫代琥珀酰亚胺（NHS）放置30分钟以活化微球，加入100μg IL-1β抗体1在室温旋转反应5小时，清洗第一荧光微球去除多余抗体后加入质量分数为5％的脱脂奶粉封闭30分钟，去除脱脂奶粉后加入pH为7.2的Tris缓冲液保存，制得包被有IL-1β抗体1的聚苯乙烯微球溶液0.5mL；
按照同样方法分别配制包被有IL-4抗体1、IL-5抗体1、IL-6抗体1、IL-8抗体1、IL-10抗体1、IL-12p70抗体1、IL-17A抗体1、IFN-γ抗体1、TNF-α抗体1、IFN-α抗体1的聚苯乙烯微球溶液0.5mL；
配制微球缓冲液：将2.4g磷酸二氢钾（KH2PO4）、36.32g十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、8g氯化钠（NaCl）、2g氯化钾（KCl）溶于1000mL纯水中，加入25g牛血清白蛋白（BSA）、加入1.2mL ProClin300、加入0.6mL吐温20，加入2mL聚乙烯吡咯烷酮K30（PVP-k30）（购自aladdin，英文名RNase-free PVP k30 Solution，CAS号9003-39-8）备用。
取188μL的微球缓冲液，分别加入包被有IL-1β抗体1、IL-4抗体1、IL-5抗体1、IL-6抗体1、IL-8抗体1、IL-10抗体1、IL-12p70抗体1、IL-17A抗体1、IFN-γ抗体1、TNF-α抗体1、IFN-α抗体1的聚苯乙烯微球溶液各1μL，配制成偶联微球的抗体溶液。
3、配制荧光标记的抗体溶液
取IL-1β抗体2、IL-2抗体2、IL-4抗体2、IL-5抗体2、IL-6抗体2、IL-8抗体2、IL-10抗体2、IL-12p70抗体2、IL-17A抗体2、IFN-γ抗体2、TNF-α抗体2、IFN-α抗体2，分别以抗体2与藻红蛋白荧光素的摩尔比为1:30添加藻红蛋白荧光素，在室温下震荡孵育5小时后，以50K超滤管添加浓度为0.01mol/L的PBS溶液清洗3次以去除多余未结合藻红蛋白荧光素，得到藻红蛋白荧光素标记的IL-1β抗体2、IL-2抗体2、IL-4抗体2、IL-5抗体2、IL-6抗体2、IL-8抗体2、IL-10抗体2、IL-12p70抗体2、IL-17A抗体2、IFN-γ抗体2、TNF-α抗体2、IFN-α抗体2，用0.01mol/L的PBS溶液分别稀释藻红蛋白荧光素标记的IL-1β抗体2、IL-2抗体2、IL-4抗体2、IL-5抗体2、IL-6抗体2、IL-8抗体2、IL-10抗体2、IL-12p70抗体2、IL-17A抗体2、IFN-γ抗体2、TNF-α抗体2、IFN-α抗体2至2μg/mL。
各取稀释后浓度为2μg/mL的藻红蛋白荧光素标记的IL-1β抗体2、IL-2抗体2、IL-4抗体2、IL-5抗体2、IL-6抗体2、IL-8抗体2、IL-10抗体2、IL-12p70抗体2、IL-17A抗体2、IFN-γ抗体2、TNF-α抗体2、IFN-α抗体2 25mL混合，配制成荧光标记的抗体溶液，则每种藻红蛋白荧光素标记抗体的浓度为0.5μg/mL。
4、制备样品稀释液
将2.38g的4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）溶于1000mL纯水制成浓度0.01mol/L的HEPES溶液，加入8.0gNaCl、质量浓度为0.05%的ProClin300以及质量浓度为10%人血清，调节pH至7.4备用。
5、制备洗涤缓冲液(10×)
取3.0275g三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）和9.0g氯化钠，溶于800毫升纯水，加入0.8mLProClin300防腐剂、加入0.6 mL吐温20（Tween-20）、0.1mL道康宁-1520（购自美国道康宁，型号AFE-1520），加入20克牛血清白蛋白（简称为BSA），调节pH值至7.4，获得洗涤缓冲液（10×）备用。将洗涤缓冲液（10×）稳定到室温，待所有盐溶解，取10mL的洗涤缓冲液（10×）加入到90mL纯水中，获得洗涤缓冲液（1×）。
6、校准品：校准品采用样品稀释液梯度稀释到不同浓度的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α重组蛋白溶液，用以建立检测时的校准曲线。配制方法如下：
①向校准品冻干粉中加入2mL样品稀释液，使冻干粉完全溶解；
②室温下静置15min，此溶液浓度为最高浓度，将其标记为C1；
③准备14只空流式管，分别标记为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C0；
④每只管中加入300μL样品稀释液，并进行2倍的配比稀释，即取300μL C1溶液到C2中，充分混匀；
⑤同样的方法进行稀释，分别得到C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13校准品。C0中只加入样品稀释液。
7、质控品：IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-12p70、IL-1β、IL-5、IL-8、IFN-α蛋白冻干品，用样品稀释液配制成浓度高中低的质控品。
8、用于配制校准品、质控品的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-12p70、IL-1β、IL-5、IL-8、IFN-α重组蛋白的制备。
由于每种细胞因子重组蛋白的制备过程一致，本实施例仅以IL-2重组蛋白的制备步骤进行举例，其它11个细胞因子的重组蛋白分别采用各自不同基因序列，制备方法相同，不做一一列举。
试剂：Expi293™ 表达培养基（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号A1435101）
ExpiFectamine™ 293 转染试剂盒（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，货号A14524）
Ni-NTA 亲和层析介质（金斯瑞公司，货号L00250）
8.1基因的设计和合成
查找NCBI已公开的人类IL-2基因的mRNA序列，在编码信号肽的基因序列：ATGTATAGAATGCAGCTGCTCTCCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCTCTGGTGACCAACAGC（Seq ID NO:182）后插入以CACCACCACCACCACCACCACCACCACCAC（Seq ID NO:183）编码的His-Tag序列，按照人类细胞真核表达系统密码子偏好性，进行密码子优化，获得如Seq ID NO：104所示的IL-2重组蛋白基因编码序列，由金斯瑞公司进行合成，并克隆到pcDNA3.4载体（Seq ID NO：103），构建重组质粒。
IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-12p70、IL-1β、IL-5、IL-8、IFN-α重组蛋白的基因编码序列分别如Seq ID NO：104~ Seq ID NO：115所示。
8.2真核表达重组蛋白
转染当天将处于对数生长期的Expi293F细胞密度调整到2.5×106/mL，使用的培养基为Expi293™ 表达培养基（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，A1435101）。转染100mL细胞需使用100μg前述的重组质粒，加270μL转染试剂ExpiFectamine™ 293（赛默飞世尔科技（中国）有限公司，A14524）。在37℃，8%二氧化碳条件下培养4-5天后，3000G离心20分钟收集培养基，0.22μM滤膜过滤。再用Ni-NTA亲和层析介质（金斯瑞公司，货号L00250）纯化获得重组蛋白。
二、试剂盒的使用方法
采用本实施例制备的试剂盒，使用方法如下：
（1）分别向每管中加入25μL偶联微球的抗体溶液，25μL样本（血浆样品或是血清样品或是校准品），25μL荧光标记的抗体溶液，充分混合均匀，室温避光静置2.5h（一步孵育）；
（2）加入1000μL的1×洗涤缓冲液（一次洗涤），通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，离心去上清震荡器震荡30秒以上，加入300μL的1×洗涤缓冲液在迈瑞公司生产的BriCyte E6流式细胞仪上检测荧光类型和荧光信号强度，具体的检测过程为本领域技术人员的常规技术手段，在此不做赘述。
采用试剂盒进行检测的原理如图5所示，其中10为聚苯乙烯微球，20为偶联微球的抗体1，30为待测样本，40为荧光标记的抗体2，50为藻红蛋白。首先固定于聚苯乙烯微球10上的抗体与待测样本30之间特异性结合，然后与藻红蛋白偶联抗体之间特异性结合。
当流式细胞仪发射的两束不同波长激发光照射免疫复合体，由不同荧光微球的荧光强度确定检测指标类型、由藻红蛋白的荧光强度确定各项检测指标含量。
图6为样本检测的捕获微球分布情况。参照图6，以APC-CY7（聚苯乙烯微球中包含不同含量的别藻蓝蛋白偶联Cy7染料）为纵坐标，APC（聚苯乙烯微球中包含不同含量的别藻蓝蛋白）为横坐标。纵坐标区分不同微球所带APC-CY7荧光强度，横坐标区分不同微球所带APC荧光强度，图6可以区分十二种结合了IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-12p70、IL-1β、IL-5、IL-8和IFN-α偶联抗体微球，其中P1代表IL-2偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P2代表本IL-4偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P3代表IL-6偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P4代表IL-10偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P5代表TNF-α偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P6代表IFN-γ偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P7代表IL-1β偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P8代表IL-5偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P9代表IL-8偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P10代表IL-12p70偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P11代表IL-17A偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布，P12代表IFN-α偶联抗体微球的APC和APC-CY7分布。
三、检测结果分析
1、校准曲线
使用本发明提供的试剂盒建立IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α的12种细胞因子的校准曲线，在流式细胞仪上分别检测IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α的不同浓度的校准品，得到图7的校准曲线。
2、线性、空白限、检出限评价
线性评价：选取线性范围上限的高浓度样本稀释成至少7个不同浓度(xi)的样本，每个浓度测试3次，分别求出检测结果的均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(R)。
图8为本实施例的IL-1β的线性评价结果，图9为本实施例的IL-2的线性评价结果，图10为本实施例的IL-4的线性评价结果，图11为本实施例的IL-5的线性评价结果，图12为本实施例的IL-6的线性评价结果，图13为本实施例的IL-8的线性评价结果，图14为本实施例的IL-10的线性评价结果，图15为本实施例的IL-12p70的线性评价结果，图16为本实施例的IL-17A的线性评价结果，图17为本实施例的IFN-γ的线性评价结果，图18为本实施例的TNF-α的线性评价结果，图19为本实施例的IFN-α的线性评价结果。
参照图8-图19，IL-1β线性回归方程为y=87.189x+732.44，R2＝0.9999；IL-2线性回归方程为y=71.459x+1090.8，R2＝0.9997；IL-4线性回归方程为y=96.061x+2743.8，R2＝0.9989；IL-5线性回归方程为y=114.85x+2709.1，R2＝0.9996；IL-6线性回归方程为y=33.055x+329.03，R2＝0.9999；IL-8线性回归方程为y=77.68x+1914.4，R2＝0.9995；IL-10线性回归方程为y=91.989x-1750.1，R2＝0.9997；IL-12p70线性回归方程为y=69.711x+1608.5，R2＝0.9997；IL-17A线性回归方程为y=67.168x+2046.1，R2＝0.9995；IFN-γ线性回归方程为y=77.922x+1262.7，R2＝0.9998；TNF-α线性回归方程为y=79.312x+885.84，R2＝0.9999；IFN-α线性回归方程为y=46.949x+716.61，R2＝0.9998。
采用本实施例提供的试剂盒，可以检测到的IL-1β线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IL-2线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IL-4线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IL-5线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IL-6线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IL-8线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IL-10线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IL-12p70线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IL-17A线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IFN-γ线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，TNF-α线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，IFN-α线性区间不窄于1.25~5000pg/mL，线性区间内，线性相关系数∣R∣不小于0.990。
与优化前序列制备的试剂盒（表9，直接由杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体）相比，优化后序列制备的试剂盒对12种细胞因子检测的灵敏度大大提升。优化后序列IL-17A的检出限达到0.416pg/mL，优化后序列IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IFN-γ、TNF-α、IFN-α检出限分别为0.563pg/mL、0.401pg/mL、0.474pg/mL、0.395pg/mL、0.479pg/mL、0.534pg/mL、0.531pg/mL、0.554pg/mL、0.566pg/mL、0.473pg/mL、0.468pg/mL。
空白限的检测方法：用零浓度校准品作为样本进行检测，重复测定20次，根据试剂盒所用校准品的曲线方程得出20次测量结果的浓度值，计算其平均值(M)和标准差(SD)，得出M+2SD，即为空白限值。
检出限的检测方法：对5份浓度近似检出限的低值样本（近似检出限按照所得空白限值进行估计，略高于空白限）进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，低于空白限数值的检测结果的数量应小于或等于3个。
按照上述方法测定得到的空白限与检出限结果如表11所示，表中的单位为pg/mL。
表11、空白限、检出限结果(单位为pg/mL)
3、回收率评价
将已知浓度的高水平待测物校准品加入到样品稀释液中，所加待测物与样品稀释液之间的体积比例不大于1：9，采用本实施例提供的试剂盒（抗体序列优化后），各重复检测3次，取平均值。表12为回收率试验(pg/mL，n＝3)结果，根据表12，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α回收率均在95%-105%之间。
表12、回收率检测结果
4、重复性与批间差评价
重复性：检测2份不同浓度水平的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α校准品，平行检测10次，计算变异系数CV。表13~表15为重复性试验(pg/mL)结果。
表13、重复性检测结果（单位为pg/mL）
表14、重复性检测结果（单位为pg/mL）
表15、重复性检测结果（单位为pg/mL）
由表13~表15可以看出，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α高值、低值校准品重复性变异系数CV均在5%以内。
批间差：取三个批次的试剂盒，每个批次10份，分别重复检测同1份参考品，计算30次测量结果的平均值和标准差SD，计算变异系数CV。批间差检测结果见表16~表18。
表16、批间差评估结果（单位为pg/mL）
表17、批间差评估结果（单位为pg/mL）
表18、批间差评估结果（单位为pg/mL）
根据表16~表18，IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α的3个批次批间差CV均在7％以内。
通过重复性与批间差评价可知，本发明试剂盒具有较好的重复性和批间差，批内实验的变异系数(CV)不大于5％，批间差CV不大于7％。
5、临床样本检测
使用本实施例中的试剂盒检测健康人与革兰氏阴性菌重症感染患者样本各1例，并进行比对分析。表19为检测健康人与革兰氏阴性菌重症感染患者样本比对试验(pg/mL)的结果。参照表19，患者样本中的IL-2、IL-6、IL-8、IL-10、IFN-γ各项高于所测1例的健康人样本，其中IL-6最为明显，且测值均显著升高＞10倍，与“感染相关生物标志物临床意义解读专家共识”所述一致。
表19、临床样本检测
由上述实例可知本发明提供的流式荧光技术的同时检测12种细胞因子的试剂盒能够用于不同样本中IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IFN-γ、TNF-α、IFN-α浓度的测定，更方便了临床的检测和应用，提高检测的准确性。
6、与质谱检测结果的比较
针对同样的样本，分别采用本实施例提供的试剂盒和质谱分析仪进行检测，质谱仪（购自岛津，型号LC-MS/8040），采用0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈作为流动相，使用ESI离子源，雾化气压（GS1）：45Psi，辅助气压：45Psi，气帘气压：35Psi，温度：650℃，喷雾电压：5000V（正离子模式），梯度洗脱，检测的样本为校准品，检测结果如表20所示。
表20、本实施例提供的试剂盒和质谱检测结果比较（单位为pg/mL）
实施例2：抗体可变区序列的优化
由于IL-17A最难检测，且容易与其他细胞因子产生交叉影响，本实施例针对IL-17A抗体1，IL-17A抗体2举例，将可变区中的互补决定区（CDR3）序列进行优化，构建包含不同突变序列的多个重组IL-17A抗体1，IL-17A抗体2，从中找到抗原检测的准确度，灵敏度最优，且交叉反应较低的一组抗体。
1、设计抗体氨基酸序列的突变
将IL-17A抗体的抗体1、IL-17A抗体的抗体2的原始序列（表9）输入数据库IgBlast，分别获得所有H/L链的CDR3区序列，随后参考IMGT数据库中相似性较高的序列对CDR3区设计10-15种单个或多个氨基酸突变。
针对重组IL-17A抗体1的H链 DNA序列，CDR3区对应碱基位置为346-384，设计了10种突变，其他区序列不变，如表21所示。
表21、IL-17A抗体1的H链突变序列表
针对重组IL-17A抗体1的L链DNA序列，CDR3区对应碱基位置为337-363，设计了15种突变，如表22所示。
表22、IL-17A抗体1的L链突变序列表
针对重组IL-17A抗体2的H链 DNA序列，CDR3区对应碱基位置为346-384，设计了13种突变，如表23所示。
表23、IL-17A抗体2的H链突变序列表
针对重组IL-17A抗体2的L链的DNA序列，CDR3区对应碱基位置为337-363，设计了14种突变，如表24所示。
表24、IL-17A抗体2的L链突变序列表
2、抗体氨基酸序列的筛选
将含有原始序列和不同突变序列的抗体的H/L链两两组合，共转染表达（方法参照实施例1），获得176种IL-17A抗体1和210种IL-17A抗体2，组合方式见表25和表26。
2.1筛选IL-17A抗体1
每次从176种IL-17A抗体1中抽取1种进行检测，包括IL-17A抗体2在内的其余23种抗体均未进行氨基酸序列优化（Seq ID NO:122，Seq ID NO:123，Seq ID NO:124- Seq IDNO:167）。采用实施例1提供的方法制备的试剂盒，并按照实施例1提供的方法进行检测。检测校准品的浓度分别为5000pg/mL 、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312pg/mL、156pg/mL、80pg/mL、40pg/mL、20pg/mL、10pg/mL、5pg/mL、2.5pg/mL、1.25pg/mL、0pg/mL。每个校准品浓度测试5次，分别求出检测结果的均值(yi)。以校准品浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程，计算线性回归的相关系数∣R∣。将检测校准品浓度为5000.00pg/mL的结果进行归一化，定义为：归一化检测结果=突变序列抗体配对获得的检测结果/未经序列优化抗体获得的检测结果。表25展示了每种IL-17A抗体1对校准品浓度为5000.00pg/mL的检测结果，表27展示了由每种IL-17A抗体1的检测结果，计算线性回归的相关系数∣R∣。
根据表25和表27，最优选的轻链和重链组合（IL-17A抗体1-1）为：H链的CDR3区氨基酸序列为1H-4（Seq ID NO:193），L链的CDR3区氨基酸序列为1L-8（Seq ID NO:223），组合获得的IL-17A抗体1对校准品浓度为5000.00pg/mL的检测结果最高，且对其余较低的校准品浓度均有最高的检测结果（不展示其余校准品浓度的检测结果，仅展示IL-17A的5000.00pg/mL的检测结果），显示了该抗体具有最高的亲和度。线性回归的相关系数∣R∣相对于其他突变序列抗体配对的结果显著更高，说明了该抗体的检测结果随校准品浓度呈现更规则的线性变化。
其次的轻链和重链组合（IL-17A抗体1-2）为：H链的CDR3区氨基酸序列为1H-2（SeqID NO:189），L链的CDR3区氨基酸序列为1L-8（Seq ID NO:223），组合获得的IL-17A抗体1对校准品浓度为5000.00pg/mL的检测结果也较高，且对其余较低的校准品浓度均有较好的检测结果（不展示其余校准品浓度的检测结果，仅展示IL-17A的5000.00pg/mL的检测结果），显示了该抗体具有较高的亲和度，线性回归的相关系数∣R∣也较高，说明了该抗体的检测结果明显优于突变前的抗体。
综合以上两点，可以确定该两组抗体的检测准确度相比优化前有较大提升。由此选定了两组轻链和重链组合：最优选为：IL-17A抗体1-1：H链氨基酸序列为1H-4（Seq IDNO:116），L链氨基酸序列为1L-8（Seq ID NO:117）；其次为IL-17A抗体1-2：H链氨基酸序列为1H-2（Seq ID NO:168），L链氨基酸序列为1L-8（Seq ID NO:117）。
2.2筛选IL-17A抗体2
每次从210种IL-17A抗体2中抽取1种进行检测，IL-17A抗体1使用前述筛选得到的序列（Seq ID NO:116、Seq ID NO:117），其余22种抗体均未进行氨基酸序列优化（Seq IDNO:124- Seq ID NO:167）。采用与前述的筛选IL-17A抗体1相同的方法来筛选IL-17A抗体2。
表26展示了每种IL-17A抗体2对校准品浓度为5000.00pg/mL的检测结果，表28展示了由每种IL-17A抗体2的检测结果，计算线性回归的相关系数∣R∣。
根据表26和表28，最优选的轻链和重链组合（IL-17A抗体2-1）为：H链的CDR3区氨基酸序列为2H-12（Seq ID NO:263），L链的CDR3区氨基酸序列为2L-6（Seq ID NO:279），组合获得的IL-17A抗体2对校准品浓度为5000.00pg/mL的检测结果最高，且对其余较低的校准品浓度均有最高的检测结果（不展示其余校准品浓度的检测结果，仅展示5000.00pg/mL的检测结果），显示了该抗体具有最高的亲和度。线性回归的相关系数∣R∣相对于其他突变序列抗体配对的结果较为理想，也略微高于未进行优化的抗体，显示了该抗体的检测结果随校准品浓度呈线性变化。
其次的轻链和重链组合（IL-17A抗体2-2）为：H链的CDR3区氨基酸序列为2H-11（Seq ID NO:261），L链的CDR3区氨基酸序列为2L-6（Seq ID NO:279），组合获得的IL-17A抗体2对校准品浓度为5000.00pg/mL的检测结果也较高，且对其余较低的校准品浓度均有较好的检测结果（不展示其余校准品浓度的检测结果，仅展示IL-17A的5000.00pg/mL的检测结果），显示了该抗体具有较高的亲和度，线性回归的相关系数∣R∣也较高，说明了该抗体的检测结果明显优于突变前的抗体。
综合以上两点，也可以确定该两组抗体的检测准确度相比优化前有一定程度的改善。由此选定了两组轻链和重链组合：最优选为：IL-17A抗体2-1：H链氨基酸序列为2H-12（Seq ID NO:118），L链氨基酸序列为2L-6（Seq ID NO:119）；其次为IL-17A抗体2-2：H链氨基酸序列为2H-11（Seq ID NO:169），L链氨基酸序列为2L-6（Seq ID NO:119）。
表25、IL-17A抗体1的突变序列配对检测5000.00pg/mL校准品的结果（归一化）
表26、IL-17A抗体2的突变序列配对检测5000.00pg/mL校准品的结果（归一化）
表27、IL-17A抗体1的突变序列配对检测结果的相关系数∣R∣
表28、IL-17A抗体2的突变序列配对检测结果的相关系数∣R∣
3、检测灵敏度测试
使用前述的氨基酸序列优化前（Seq ID NO:120- Seq ID NO:123）和优化后四组IL-17A抗体1，IL-17A抗体2：（1）IL-17A抗体1-1，IL-17A抗体2-1，（2）IL-17A抗体1-2，IL-17A抗体2-1，（3）IL-17A抗体1-1，IL-17A抗体2-2，（4）IL-17A抗体1-2，IL-17A抗体2-2。采用实施例1提供的方法制备的试剂盒，按照实施例1提供的方法测试并计算出空白限、检出限结果（表29）。氨基酸序列优化后的空白限结果明显变小，检出限结果由2.762pg/mL降低到和其他细胞因子的结果类似的水平。因此，可以判断氨基酸序列优化使得IL-17A抗体1，IL-17A抗体2的检测灵敏度有较大提升。
表29、空白限、检出限结果
根据表29可以看出，最优选的抗体组合为IL-17A抗体1-1，IL-17A抗体2-1（Seq IDNO:116~ Seq ID NO:119），检测灵敏度和准确性更高。
4、交叉反应测试
采用以下三组进行交叉反应测试：
（1）取优化后的11个细胞因子抗体（表1）以及12种重组蛋白（Seq ID NO：104~ SeqID NO：115）；
（2）取优化后的11个细胞因子抗体（表1）以及12种重组蛋白（Seq ID NO：104~ SeqID NO：115），使用前述的氨基酸序列优化前（Seq ID NO:120- Seq ID NO:123）的IL-17A抗体1，IL-17A抗体2；
（3）取优化后的11个细胞因子抗体以及12种重组蛋白，使用前述的氨基酸序列优化后（Seq ID NO:116- Seq ID NO:119）的IL-17A抗体1，IL-17A抗体2；
采用实施例1提供的方法制备的试剂盒，并按照实施例1提供的方法进行检测。12个细胞因子检测校准品的浓度分别为5000pg/mL 、2500pg/mL、1250pg/mL、625pg/mL、312pg/mL、156pg/mL、80pg/mL、40pg/mL、20pg/mL、10pg/mL、5pg/mL、2.5pg/mL、1.25pg/mL、0pg/mL。每个校准品浓度测试5次，分别求出检测结果的均值。测试IL-17A氨基酸序列优化前后，对11个细胞因子的测试结果影响，如表30-1所示，经核苷酸序列优化后的其它11个细胞因子之间已经没有交叉；如表30-2所示，氨基酸序列突变前的IL-17A对IL-6、IL-1β依然有交叉反应（0浓度时，检测荧光信号值(MFI)已经大于1000）；如表30-3所示，氨基酸序列突变后的IL-17A对其他11个细胞因子没有交叉反应。
表30-1、其他11个细胞因子的无交叉反应结果（MFI）
表30-2、氨基酸序列优化前的IL-17A抗体1和IL-17A抗体2对其他11个细胞因子的交叉反应结果（MFI）
表30-3、氨基酸序列优化后的IL-17A抗体1和IL-17A抗体2对其他11个细胞因子的交叉反应结果（MFI）
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实施例3、抗体1、抗体2的筛选
本发明提供的同时检测12种细胞因子的试剂盒，试剂盒中的偶联微球的抗体溶液和荧光标记的抗体溶液，都需要用到抗体，研究证明偶联微球的抗体，和荧光标记的抗体都尽量采用不同抗体，本实施例分别采用实施例2筛选获得的最优的两种抗体，但是究竟哪种抗体用于制备偶联微球的抗体溶液，哪种抗体用于制备荧光标记的抗体溶液，还需要进一步摸索。
本实施例分别采用以下两种方式制备试剂盒：1、抗体1偶联微球，抗体2偶联藻红蛋白荧光素；2、抗体2偶联微球，抗体1偶联藻红蛋白荧光素。其余制备方法与实施例1一致，采用实施例1提供的方法进行检测，检测样品为各细胞因子的浓度为40pg/mL的校准品，检测结果见表31。
表31、抗体1、抗体2的筛选(单位为pg/mL)
根据表31可以看出，采用方式1的搭配选择，对12种细胞因子的检测结果明显更加精确，能显著提高12种细胞因子的检测灵敏度和准确性，能真正实现整个检测过程只需一次孵育，一次洗涤，因此优选采用抗体1偶联微球，抗体2偶联藻红蛋白荧光素。
实施例4：24种抗体序列优化前后对12种细胞因子检测结果的影响
本实施例分别采用实施例1中经序列优化的重组抗体制备的试剂盒（实施例1中的表1），与用原始序列抗体制备的试剂盒（实施例1中的表9，直接由杂交瘤细胞株制备的单克隆抗体），进行12种细胞因子的检测，其中孵育工艺分别采用一步孵育法（实施例1），每组进行10次重复检测，考察重复性，检测样品为血浆样本（经质谱检测，12种细胞因子含量都在0.39~21.56pg/mL之间），检测结果见表32。
表32、优化前后检测结果比较(pg/mL)
根据表32可以看出，序列优化前的抗体制备试剂盒进行12种细胞因子检测时，有些细胞因子容易出现假阳性（如IL-1β、IL-4、IL-6等，检测结果偏高），其原因主要是出现非特异性结合，有些细胞因子不容易准确检测（如IL-10、IL-17A、IFN-α等，检测结果偏低），而且检测结果不稳定，重复性差，从而影响检测结果的准确性。采用序列优化后的抗体制备的试剂盒，能显著提高12种细胞因子检测结果的准确性，并消除批间差，提高重复检测的准确性。
实施例5：一步法孵育工艺的选择
本实施例分别采用实施例1制备的试剂盒，用原序列制备的试剂盒（实施例1中的表9），及市面购买的试剂盒（青岛瑞斯凯尔生物科技有限公司生产的12项细胞因子检测试剂盒（多重微球流式免疫荧光发光法）、天津旷博同生生物技术有限公司生产的IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-17F、IL-22、TNFα、TNFβ检测试剂盒（免疫荧光发光法）、南京艾拓生命科技有限公司生产的细胞因子十二项检测试剂盒（磁微粒发光法）、重庆博生特生物技术有限公司生产的十二项细胞因子测定试剂盒（流式荧光发光法）），进行12种细胞因子的检测，其中孵育工艺分别采用一步孵育法（实施例1），和两步孵育法。
两步孵育法操作步骤如下：（1）分别向每管中加入25μL偶联微球的抗体溶液，25μL样本，充分混合均匀，室温避光静置1.5h；
（2）加入1000μL的1×洗涤缓冲液（一次洗涤），通过涡旋将微球重悬，充分混合均匀，离心去上清；
（3）每管中加25μL荧光标记的抗体溶液，充分混合均匀，室温避光静置1.5h，（两步孵育）；
检测样品为血浆样本（经质谱检测含量为20.01pg/mL），检测结果如表33所示，由于12种细胞因子中，对IL-17A的影响最明显，这里以IL-17A的检测结果示例，并进行10次重复检测，并取平均值。
表33、不同孵育法的检测结果(pg/mL)
根据表33可以看出，本发明制备的试剂盒，采用一步孵育法就能准确检测，而市面购买的试剂盒一步孵育检测结果严重偏低，即使采用两步孵育法也依然不能达到本发明试剂盒一步孵育的效果。
实施例6：血浆样品和血清样品对检测结果的影响
本实施例分别采用实施例1制备的试剂盒，用原序列制备的试剂盒（实施例1中的表9），及市面购买的试剂盒（湖南唯公生物科技有限公司生产的十二项细胞因子检测试剂盒（流式荧光发光法）、南京艾拓生命科技有限公司生产的细胞因子十二项检测试剂盒（磁微粒发光法），进行12种细胞因子的检测，其中检测的样品分别采用血浆样品或血清样品两种。其中血浆样品的制备方法为EDTA抗凝剂，血清样品的制备方法为Orsin促凝剂。
检测样品为浓度为40.05pg/mL（质谱检测）的同源血浆及血清样品。检测结果如表34所示，由于12种细胞因子中，对IL-17A的影响最明显，这里以IL-17A的检测结果示例，并进行10次重复检测，并取平均值。
表34、血浆样品和血清样品对检测结果的影响（pg/mL）
根据表34可以看出，本发明制备的试剂盒，采用血浆样品或血清样品都能准确检测，而市面购买的试剂盒，血浆样品和血清样品的检测结果存在明显差异，无法实现血浆样品和血清样品的同时检测。可见本发明提供的试剂盒，由于优化了抗体序列，使抗体和待测蛋白之间的结合力更强，并且减少了交叉影响，能够实现血浆样品和血清样品的同时检测，为临床检测提供了更多的便利性。
实施例7：微球缓冲液的选择
本实施例按照实施例1提供的方法制备基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的试剂盒，针对优化后的微球偶联抗体溶液，还需进一步优化微球缓冲液的配方。微球缓冲液分别采用如表35所示的不同配方的微球缓冲液，待测样品为各细胞因子浓度为40pg/mL的校准品及5份浓度近似检出限的低值样本，按照实施例1提供的一步孵育法进行检测，考察不同微球缓冲液对12种细胞因子检测结果的影响，由于12种细胞因子的检测结果趋势较一致，本实施例以IL-17A的检测结果进行举例说明，并进行10次重复检测，考察重复性。
表35、不同微球缓冲液对检测结果的影响（缓冲液浓度按照实施例1）
根据表35可以看出，在优化24种抗体序列后，微球缓冲液的配方也需要进一步优化，才能达到更好的检测灵敏度。因此最优选的微球缓冲液配方为：KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaCl、KCl、BSA、ProClin300、Tween-20和PVP-k30。
实施例8：洗涤缓冲液的选择
本实施例按照实施例1提供的方法制备基于流式细胞仪同时检测12种细胞因子的试剂盒，进一步优化了洗涤缓冲液的配方。洗涤缓冲液分别采用如表36所示的不同配方的洗涤缓冲液，待测样品为各细胞因子浓度40pg/mL的校准品及5份浓度近似检出限的低值样本，按照实施例1提供的一步孵育法进行检测，考察不同洗涤缓冲液对12种细胞因子检测结果的影响，由于12种细胞因子的检测结果趋势较一致，本实施例以IL-17A的检测结果进行举例说明，并进行10次重复检测，考察重复性。
表36、不同洗涤缓冲液对检测结果的影响（缓冲液浓度按照实施例1）
根据表36可以看出，在优化24种抗体序列后，洗涤缓冲液的配方也需要进一步优化，才能达到更好的检测灵敏度，本实施例经研究发现，洗涤缓冲液加入消泡剂，有助于提高检测灵敏度。其原因是洗涤缓冲液中含有BSA，加入洗涤缓冲液后涡旋混匀过程中会出现气泡，进而导致流式管壁上有残留，吸入的体积会有误差，而加入消泡剂可以避免产生这一部分的气泡，有助于减小误差提高检测灵敏度，且经对比发现相比与其他消泡剂（如A504007（非离子型T-F复合型发酵用消泡剂）），采用道康宁-1520更有助于提高12种细胞因子的检测灵敏度。因此最优选的洗涤缓冲液配方为：Tris、NaCl、BSA、ProClin300、Tween-20、道康宁-1520。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (8)

1.一种基于流式细胞仪检测12种细胞因子的试剂盒，其特征在于，包括：偶联微球的抗体溶液，荧光标记的抗体溶液，微球缓冲液、样品稀释液和洗涤缓冲液；所述偶联微球的抗体溶液中的抗体为抗体1，荧光标记的抗体溶液中的抗体为抗体2；所述抗体1包括IL-1β抗体1、IL-2抗体1、IL-4抗体1、IL-5抗体1、IL-6抗体1、IL-8抗体1、IL-10抗体1、IL-12p70抗体1、IL-17A抗体1、IFN-γ抗体1、TNF-α抗体1和IFN-α抗体1；抗体2包括IL-1β抗体2、IL-2抗体2、IL-4抗体2、IL-5抗体2、IL-6抗体2、IL-8抗体2、IL-10抗体2、IL-12p70抗体2、IL-17A抗体2、IFN-γ抗体2、TNF-α抗体2和IFN-α抗体2；所述IL-17A抗体1的重链的CDR3区的氨基酸序列如Seq ID NO:193所示，轻链的CDR3区的氨基酸序列如Seq ID NO:223所示；IL-17A抗体2的重链的CDR3区的氨基酸序列如Seq ID NO:263所示，轻链的CDR3区的氨基酸序列如SeqID NO:279所示；所述IL-17A抗体1的重链的氨基酸序列如Seq ID NO:116所示，轻链的氨基酸序列如Seq ID NO:117所示，IL-17A抗体2的重链的氨基酸序列如Seq ID NO:118所示，轻链的氨基酸序列如Seq ID NO:119所示；用于编码所述抗体1和抗体2的重链与轻链的核苷酸序列如下：
编码IL-1β抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:1所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:2所示；
编码IL-1β抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:3所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:4所示；
编码IL-2抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:5所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:6所示；
编码IL-2抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:7所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:8所示；
编码IL-4抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:9所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:10所示；
编码IL-4抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:11所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:12所示；
编码IL-5抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:13所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:14所示；
编码IL-5抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:15所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:16所示；
编码IL-6抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:17所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:18所示；
编码IL-6抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:19所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:20所示；
编码IL-8抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:21所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:22所示；
编码IL-8抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:23所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:24所示；
编码IL-10抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:25所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:26所示；
编码IL-10抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:27所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:28所示；
编码IL-12p70抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:29所示，轻链的核苷酸序列如Seq ID NO:30所示；
编码IL-12p70抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:31所示，轻链的核苷酸序列如Seq ID NO:32所示；
编码IL-17A抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:33所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:34所示；
编码IL-17A抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:35所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:36所示；
编码IFN-γ抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:37所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:38所示；
编码IFN-γ抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:39所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:40所示；
编码TNF-α抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:41所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:42所示；
编码TNF-α抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:43所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:44所示；
编码IFN-α抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:45所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:46所示；
编码IFN-α抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:47所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:48所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光标记的抗体溶液为藻红蛋白标记的抗体溶液；所述微球缓冲液包括0.2~0.3%KH2PO4、3~4%Na2HPO4·12H2O、0.5~1.0%NaCl、0.1~0.5%KCl、2~4%BSA、0.1~0.2%ProClin300、0.05~0.1%Tween-20和0.1~0.3%PVP-k30。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述洗涤缓冲液包括0.3~0.4%Tris、0.8~1.2%NaCl、1.5~3%BSA、0.08~0.12%ProClin300、0.05~0.1%Tween-20和0.01~0.02%道康宁-1520。
4.如权利要求3所述的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1）：构建含有抗体的重链和轻链的重组载体，经真核表达系统表达，制备重组抗体，所述重组抗体包括抗体1和抗体2，所述抗体1包括IL-1β抗体1、IL-2抗体1、IL-4抗体1、IL-5抗体1、IL-6抗体1、IL-8抗体1、IL-10抗体1、IL-12p70抗体1、IL-17A抗体1、IFN-γ抗体1、TNF-α抗体1和IFN-α抗体1；抗体2包括IL-1β抗体2、IL-2抗体2、IL-4抗体2、IL-5抗体2、IL-6抗体2、IL-8抗体2、IL-10抗体2、IL-12p70抗体2、IL-17A抗体2、IFN-γ抗体2、TNF-α抗体2和IFN-α抗体2；
步骤（2）：利用重组抗体，配制偶联微球的抗体溶液和荧光标记的抗体溶液，所述偶联微球的抗体溶液的抗体为抗体1，荧光标记的抗体溶液的抗体为抗体2。
5.一种基于流式细胞仪检测12种细胞因子的方法，其特征在于，采用如权利要求4所述的试剂盒进行一步孵育法，包括以下步骤：
步骤（a）：取待测样品，分别加入偶联微球的抗体溶液，荧光标记的抗体溶液，和微球缓冲液，孵育；
步骤（b）：加入洗涤缓冲液清洗，离心，待检测。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待测样品为血浆样品、血清样品中的一种或两种。
7.一组重组抗体用于制备基于流式细胞仪经一步孵育法同时检测血液样品的12种细胞因子的试剂的用途，其特征在于，所述重组抗体包括抗体1和抗体2；用于编码所述抗体1和抗体2的轻链与重链的核苷酸序列如下：
编码IL-1β抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:1所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:2所示；
编码IL-1β抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:3所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:4所示；
编码IL-2抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:5所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:6所示；
编码IL-2抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:7所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:8所示；
编码IL-4抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:9所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:10所示；
编码IL-4抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:11所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:12所示；
编码IL-5抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:13所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:14所示；
编码IL-5抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:15所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:16所示；
编码IL-6抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:17所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:18所示；
编码IL-6抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:19所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:20所示；
编码IL-8抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:21所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:22所示；
编码IL-8抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:23所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:24所示；
编码IL-10抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:25所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:26所示；
编码IL-10抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:27所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:28所示；
编码IL-12p70抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:29所示，轻链的核苷酸序列如Seq ID NO:30所示；
编码IL-12p70抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:31所示，轻链的核苷酸序列如Seq ID NO:32所示；
编码IL-17A抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:33所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:34所示；
编码IL-17A抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:35所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:36所示；
编码IFN-γ抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:37所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:38所示；
编码IFN-γ抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:39所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:40所示；
编码TNF-α抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:41所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:42所示；
编码TNF-α抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:43所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:44所示；
编码IFN-α抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:45所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:46所示；
编码IFN-α抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:47所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:48所示。
8.一组重组抗体用于制备提高流式细胞仪同时检测血液样品中的12种细胞因子的准确性的试剂的用途，其特征在于，所述重组抗体包括抗体1和抗体2；用于编码所述抗体1和抗体2的轻链与重链的核苷酸序列如下：
编码IL-1β抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:1所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:2所示；
编码IL-1β抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:3所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:4所示；
编码IL-2抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:5所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:6所示；
编码IL-2抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:7所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:8所示；
编码IL-4抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:9所示，轻链的核苷酸序列如Seq IDNO:10所示；
编码IL-4抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:11所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:12所示；
编码IL-5抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:13所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:14所示；
编码IL-5抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:15所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:16所示；
编码IL-6抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:17所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:18所示；
编码IL-6抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:19所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:20所示；
编码IL-8抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:21所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:22所示；
编码IL-8抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:23所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:24所示；
编码IL-10抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:25所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:26所示；
编码IL-10抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:27所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:28所示；
编码IL-12p70抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:29所示，轻链的核苷酸序列如Seq ID NO:30所示；
编码IL-12p70抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:31所示，轻链的核苷酸序列如Seq ID NO:32所示；
编码IL-17A抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:33所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:34所示；
编码IL-17A抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:35所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:36所示；
编码IFN-γ抗体1的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:37所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:38所示；
编码IFN-γ抗体2的重链的核苷酸序列如Seq ID NO:39所示，轻链的核苷酸序列如SeqID NO:40所示；
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