CN117866061A

CN117866061A - 一种重组链格孢菌致敏蛋白Alt a 1的制备及应用

Info

Publication number: CN117866061A
Application number: CN202311751812.5A
Authority: CN
Inventors: 陈博阳; 李文波; 潘维华; 丁俊杰; 施启尧
Original assignee: Wuxi Jinlian Biotechnology Co ltd; Jiangsu Sanlian Bioengineering Co ltd
Current assignee: Wuxi Jinlian Biotechnology Co ltd; Jiangsu Sanlian Bioengineering Co ltd
Priority date: 2023-12-18
Filing date: 2023-12-18
Publication date: 2024-04-12

Abstract

本发明公开了一种重组链格孢菌致敏蛋白Alt a 1的制备及应用，属于体外诊断领域。所述案例通过基因工程技术链格孢菌主要致敏蛋白Alt a 1‑Fc的编码基因构建至真核表达载体，瞬时转染至HEK293细胞，从而实现了体外重组表达链格孢菌主要致敏蛋白Alt a 1，相比于天然蛋白具有具有均一性好、批间差异小、易放大、成本低、来源清晰、安全性高、稳定性良好等优点，结合公司微阵列化学发光平台能够开发出一款高灵敏、高通量、成本低的体外诊断产品，可以应用于过敏性疾病的快速诊断，对于过敏性疾病的筛查和定量检测具有重要的意义。

Description

一种重组链格孢菌致敏蛋白Alt a 1的制备及应用

技术领域

本发明涉及一种重组链格孢菌致敏蛋白Alt a 1的制备及应用，属于体外诊断领域。

背景技术

链格孢属(Alternaria Nees)是一种在自然界广泛分布的暗色真菌，是土壤、植物、食品、工业材料上常见的腐生菌，也是实验室常见污染菌。链格孢菌(Alternariaalternata)是一种在空气和土壤中均有大量分布的气传真菌，是国内外多个重要城市的优势环境过敏原，它可引发多种过敏性疾病，严重者可危及生命。研究表明，对链格孢霉过敏患者可能会出现致命性哮喘,也可能有过敏性鼻炎的风险。此外，研究人员还证实，链格孢霉环境污染是诱发急诊门诊中儿童哮喘急性发作的因素。此外，相较于对链格孢霉不过敏患者，过敏儿童的哮喘症状持续到11岁以后。皮肤接触真菌后可能会产生湿疹，在过敏性湿疹患者中可能会爆发炎症性皮疹。现有技术对链格孢菌导致的过敏性反应多利用血清特异性IgE和皮肤特异性IgE的测定方法，但是，由于真菌提取物的生产和标准化还缺少具体的评价方法，因此流行病学研究的结果不可避免地存在差异。霉菌提取不规范也可能导致特异性免疫治疗的转归不佳。此外，表皮或皮内试验评估皮肤特异性IgE不一定能够准确或充分地评估链格孢霉的反应性，因为霉菌过敏可能比免疫球蛋白(Ig)E介导的I型即刻超敏反应免疫机制更加复杂。

在过去的几十年里，过敏原提取物的特征描述和标准化以及检测技术都得到了提高。比如ImmunoCAP IgE检测方法(Thermo Fisher Scientific/Phadia,Uppsala,Sweden)可以进行单一(ImmunoCAP)检测，或多重(免疫固相变应原芯片[ISAC])检测。ImmunoCAP的主要优点是获得定量的过敏原特异性IgE抗体水平，且不受过敏原特异性IgG抗体的干扰。然而，ImmunoCAP过敏原提取物受提取物成分的限制，过敏原分子的引入对分析特异性和过敏诊断产生了重要影响。ISAC的主要优点是用微量血清获得的综合IgE图谱，缺点是它只能半定量检测，线性范围较窄，以及每次检测的成本较高。虽然过敏原提取物的特征描述和标准化以及检测技术都得到了提高，但是提取物的批间差、稳定性等仍具有较大的差异，对于开发高通量、高灵敏、低成本的过敏原筛查试剂仍存在较大的挑战。

发明内容

开发一种重组Alt a 1将会对Alternaria alternata引起的过敏性疾病的诊断具有重要推动作用。本发明涉及的重组Alt a 1蛋白WHO/IUIS Allergen Nomenclature Sub-Committee报道对于Alternaria alternata阳性病人具有82％的阳性检出率，而Alternaria alternata的其他过敏组分(Alt a 2、Alt a 3、Alt a 4、Alt a 5、Alt a 6、Alt a 7、Alt a 8、Alt a 10、Alt a 12、Alt a 13、Alt a 14、Alt a 15)均具有较低的阳性检出率，适用于Alternaria alternata引起的过敏性疾病的诊断。

本发明利用真核表达系统HEK293细胞重组表达了链格孢菌致敏蛋白Alt a 1，具有均一性好、批间差异小、易放大、成本低、来源清晰、安全性高、稳定性良好等优点，结合公司高通量微阵列化学发光平台能够开发出一款高灵敏、高通量、成本低的体外诊断产品，可以应用于过敏性疾病的快速诊断，对于过敏性疾病的筛查和定量检测具有重要的意义。

本发明提供了一种提高链格孢菌致敏蛋白Alt a 1表达量的方法，以pcDNA3.1为初始载体，表达SEQ ID No.1所示的Alt a 1蛋白，所述Alt a 1蛋白的N端连接SEQ ID No.3所示的信号肽，所述Alt a 1蛋白的C端连接SEQ ID No.5所示的人抗体Fc片段。

在一种实施方式中，编码所述Alt a 1蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码所述人抗体Fc片段的核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示。

本发明还提供了所述方法构建的重组细胞。

在一种实施方式中，宿主细胞包括原核细胞、真核细胞或动物细胞。

在一种实施方式中，宿主细胞为HEK 293细胞。

本发明还提供了一种制备链格孢菌致敏蛋白Alt a 1的方法，培养所述重组细胞，并将培养液进行纯化。

在一种实施方式中，所述重组细胞的培养条件为35-40℃，4-8％CO₂，90-130rpm。

在一种实施方式中，所述纯化的方法为proteinA亲和层析纯化。

本发明还提供了所述提高链格孢菌致敏蛋白Alt a 1表达量的方法，或所述重组细胞，或所述制备链格孢菌致敏蛋白Alt a 1的方法在制备链格孢菌致敏蛋白Alt a 1中的应用。

本发明还提供了所述提高链格孢菌致敏蛋白Alt a 1表达量的方法，或所述重组细胞，或所述制备链格孢菌致敏蛋白Alt a 1的方法在制备体外诊断链格孢菌过敏的产品中的应用。

有益效果

本发明用真核HEK293细胞重组表达Alt a 1蛋白，能够得到正确构象的重组蛋白。在HEK 293细胞中重组表达融合致敏蛋白Alt a 1-Fc，所述蛋白来源清晰，批间差异小，纯度大于90％，适用于过敏性疾病诊断产品的开发。

本发明产生的重组融合致敏蛋白Alt a 1结合高通量微阵列化学发光平台，将能够结合其他过敏原指标如D1、D2、E1、F2、F4、M3、I6、M6、W1等等，开发出一款多指标联检的过敏性疾病诊断产品，阳性检测准确率达到98％，阴性检测准确率达到100％，极大的提高过敏性疾病的诊断效率并降低检测成本，减轻病人负担。

附图说明

图1为实施例1的目的基因PCR鉴定图，1、2、3、4分别代表pcDNA3.1-S-Alt a 1-Fc、pcDNA3.1-Alt a 1-Fc、pcDNA3.1-S-Alt a 1、pcDNA3.1-Alt a 1 4种表达载体；

图2为实施例3的重组Alt a 1-Fc蛋白和Alt a 1SDS-PAGE图；

图3为实施例4的HEK293来源的Alt a 1-Fc蛋白检测结果；

图4为实施例4的HEK293来源的Alt a 1蛋白检测结果；

图5为对照例1的Pichia pastoris来源的Alt a 1蛋白检测结果；

图6为对照例1的E.coli来源的Alt a 1蛋白检测结果；

图7为不同宿主来源的蛋白检测灵敏度比较。

具体实施方式

[相关术语解释]

“重组蛋白”是指应用重组DNA或重组RNA技术而获得的蛋白质。重组蛋白工程先应用基因克隆或化学合成技术获得目的基因，连接到适合的表达载体，导入到特定的宿主细胞，利用宿主细胞的遗传系统，表达出有功能的蛋白质分子。

“抗体”是一类能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。一般地，抗体以一个或者多个Y字形单体存在，每个Y字形单体由4条多肽链组成，包含两条相同的重链和两条相同的轻链，轻链和重链是根据它们的分子量大小来命名的。Y字形结构的顶端是可变区，为抗原结合部位。每个重链有两个区即恒定区和可变区，所有同一型的抗体其恒定区都是相同的，不同型的抗体之间则存在差异。每条轻链也有两个前后相连的结构域，即一个恒定区和一个可变区。

“表达载体”是指可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。

“宿主细胞”是指可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如S2果蝇细胞或Sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK 293细胞或人细胞等的动物细胞。

“蛋白芯片”是指一种玻璃材料的硬基质芯片，蛋白质、抗体等生物分子稀释至点样液中之后能够通过仪器包被至该蛋白芯片的表面，从而可以应用于芯片阅读仪进行待测样本的定量分析。

“高通量微阵列化学发光平台”是利用利用“蛋白芯片”的技术原理将多种指标的蛋白或抗体包被于“蛋白芯片”，然后利用抗原抗体特异性识别以及化学发光技术从而实现同一张“蛋白芯片”检测多种靶标的技术。

下述实施例中使用的链格孢菌特异的IgE来自经过试剂盒定量筛选的样本(Phadia ImmunoCAP Allergen，14-4106-01)。

实施例1表达载体的构建

经过Human宿主密码子偏好性优化的Alt a 1蛋白编码基因需要装载于真核表达载体。

产品制备过程：

首先，将SEQ ID No.1所示的Alt a 1蛋白进行Human宿主密码子偏好性优化并人工合成(由江苏赛索飞生物科技有限公司完成)，所述密码子优化后的Alt a 1蛋白编码基因序列如SEQ ID No.2所示；在目的蛋白N端添加SEQ ID No.3所示的信号肽序列能够引导蛋白质表达完成后分泌至细胞外，编码所述信号肽的基因序列如Seq ID No.4所示；在目的蛋白C端添加SEQ ID No.5所示的人抗体Fc片段能够便于纯化和后期的蛋白芯片包被试验，编码所述Fc片段的基因序列如SEQ ID No.6所示。

人工合成连接上述信号肽和人抗体Fc片段的Alt a 1蛋白基因片段，将目的片段分别用BamHI和XhoI限制性内切酶切割，然后和相同酶切的pcDNA3.1载体进行连接，连接产物转化至TOP10感受态细胞之后，37℃培养15h，挑取单克隆菌落进行电泳PCR鉴定，阳性克隆命名为pcDNA3.1-S-Alt a 1-Fc送样品至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定，测序正确的表达载体进行质粒大提，提取之后的质粒经过0.22μm滤膜过滤除菌，然后-20℃保存。

此外，为了对比研究信号肽序列和融合表达的人Fc蛋白片段对于蛋白质性能的影响，分别基因合成了不包含信号肽的融合表达载体pcDNA3.1-Alt a 1-Fc，包含信号肽但不包含人Fc的表达载体pcDNA3.1-S-Alt a 1，不包含信号肽和人Fc的表达载体pcDNA3.1-Alta 1，如表1。不包含人Fc蛋白的Alt a 1需要融合6*组氨酸序列用于下游纯化，其氨基酸序列如SEQ IDNo.7，基因序列如SEQ ID No.8。

表1表达载体列表

具体的应用检测过程：

实施例1中的检测过程包括PCR扩增之后的琼脂糖电泳鉴定和构建完成后的测序检测，用特异性引物(SEQ ID No.9和SEQ ID No.10)扩增之后能够扩增出目的基因片段，琼脂糖电泳检测过程如图1所示，即扩增的目的片段分别在1170bp、1110bp、495bp、435bp位置，片段大小和理论目的基因片段相符(1、2、3、4分别代表pcDNA3.1-S-Alt a 1-Fc、pcDNA3.1-Alt a 1-Fc、pcDNA3.1-S-Alt a 1、pcDNA3.1-Alt a 1 4种表达载体)。经过基因测序分析该表达载体上的目的基因，经过DNAMAN软件分析，其测序结果预期序列100％匹配。经过上述两种检测方法对比，四种Alt a 1蛋白编码基因表达载体构建成功，命名如表1。

实施例2重组表达载体转染HEK293细胞并表达Alt a 1蛋白

产品制备过程：

使用PEI转染试剂(Polysciences,23966,1mg/ml)将构建好的重组表达载体pcDNA3.1-S-Alt a 1-Fc、pcDNA3.1-Alt a 1-Fc、pcDNA3.1-S-Alt a 1、pcDNA3.1-Alt a 1转染HEK293细胞，进行Alt a 1蛋白的重组表达。准备OPM-293CD05培养基(上海奥浦迈生物科技股份有限公司，81075-001)培养的悬浮HEK293细胞(37℃110rpm 6％CO₂)，转染前24小时将细胞用新鲜的OPM-293CD05培养基接种至4瓶1000mL透气盖培养瓶(784011，无锡耐思生物科技有限公司)体积240mL，细胞密度2×10⁶个/mL。转染当天37℃预热16mL的OPM-293CD05培养基，然后分别加入240μg的上述表达载体，轻轻混匀后分别加入480μg的PEI转染试剂(Polysciences,23966,1mg/mL)，颠倒混匀之后室温静置20min，然后将所得DNA和PEI混合物缓缓加入培养的细胞中，计为第1天。于培养第2和第4天分别同时补加终浓度50mM的葡萄糖(生工生物工程(上海)股份有限公司，A610219-0500，2M)和终浓度4mM的谷氨酰胺溶液(Thermo Fisher Scientific，25030149，200mM),培养6-7天时收集细胞表达上清，进行蛋白纯化。

实施例3Alt a 1蛋白的分离纯化

产品制备过程：

表达结束后3000×g，30min离心收集上述细胞培养上清。

包含Fc标签的蛋白用ProteinA填料层析，首先将rProteinA亲和层析柱(GLK-gelproteinA，无锡加莱克色谱科技有限公司)连接于AKTA pure 150L(Cytiva)设备上，用5CV的平衡缓冲液(PBS，pH 7.4)进行柱平衡，然后细胞培养上清进行rProteinA亲和层析填料结合，上样结束后继续用平衡缓冲液平衡至UV基线平稳。用20mM的柠檬酸(pH 3.0)的洗脱层析柱上的抗体，收集洗脱峰，用pH 9.0的Tris-HCl调节洗脱液pH至7.4，然后用7kDa透析袋(北京经科宏达生物技术有限公司，300858026)将抗体的缓冲Buffer进行置换，置换至pH7.4的PBS中。

不包含Fc标签的蛋白用Ni-TED填料层析，首先将Ni-TED亲和层析柱(嘉兴千纯生物科技有限公司，A42302-06)连接于AKTA pure 150L蛋白纯化仪上，用5CV的平衡缓冲液(1*PBS，pH 7.4)进行柱平衡，然后用细胞表达上清进行上样，上样结束后继续用平衡缓冲液平衡至UV基线平稳。用洗脱液(1*PBS，250mM咪唑，pH 7.4)洗脱层析柱上的蛋白，收集洗脱峰，然后用7kDa透析袋(北京经科宏达生物技术有限公司，300858026)将蛋白的缓冲Buffer进行置换，置换至pH7.4的PBS中。

具体的应用检测过程：

经过rProteinA亲和层析和Ni-TED亲和层析纯化4种蛋白，结果发现包含信号肽的两种表达载体(pcDNA3.1-S-Alt a 1-Fc和pcDNA3.1-S-Alt a 1)表达的蛋白均纯化成功，洗脱出目的蛋白，与此对应的不包含信号肽的两种表达载体(pcDNA3.1-Alt a 1-Fc和pcDNA3.1-Alt a 1)均未能洗脱到目的蛋白，其原因可能是由于信号肽介导的蛋白能够引导目的蛋白分泌至胞外，而不包含信号肽的目的蛋白未能成功表达或分泌至胞外。

通过SDS-PAGE质控目的蛋白的纯度，分析如图2所示，经过SDS-PAGE分析该蛋白的纯度能够大于90％以上，经过计算本次纯化共计得到Alt a 1-Fc蛋白11.2mg，蛋白产量约46mg/L，Alt a 1蛋白7.3mg，蛋白产量约30mg/L，分子量分别为42kDa和16kDa，符合理论分子量大小，可以用于下游的生物活性研究。

实施例4Alt a 1蛋白的生物活性评价

将本案例的链格孢菌重组融合致敏蛋白Alt a 1用点样液稀释(20mM Tris-HCl，30％甘油，pH8.0)至0.5mg/mL，然后用点样仪点样该重组Alt a 1至硬基质芯片(南通国光光学玻璃有限公司，SL-1)，点样完成后用2％的BSA进行封闭(200μL/芯片)，完成后包装成成品蛋白芯片用于实验。全自动生物芯片阅读仪SLXP-001B(江苏三联生物工程股份有限公司)被用于芯片的检测，将上一步骤准备好的芯片装载于芯片盘，将链格孢菌过敏患者的阳性血清样本及阴性对照样本(阳性样本：链格孢菌特异的IgE含量介于0.41-95.4IU/mL，阴性样本：IgE含量介于0.01-0.35IU/mL)加入样品盘，将HRP标记的鼠抗人IgE二抗(Peroxidase IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Human IgE(ME.114))，209-032-241)用2％的BSA稀释至0.05mg/mL，和ECL鲁米诺化学发光试剂(常州天地人和生物科技有限公司，S32020)同时载入全自动生物芯片阅读仪SLXP-001B相应试剂位置，仪器自检后即可开始全自动的分析实验，本次实验重复进行三次，求取平均值。

具体检测结果如图3及表2所示，通过数据分析，本案例中Alt a 1-Fc蛋白检测的49例阳性样本检出48例，阳性检出率达到98.0％，99例阴性样本全部检出，阴性符合率达到100.0％，通过线性拟合本案产品和阳性样本之间的相关性，R²＝0.9852，具有很好的线性相关性。如图4所示，Alt a 1蛋白检测的49例阳性样本检出47例，阳性检出率达到95.9％，99例阴性样本全部检出，阴性符合率达到100.0％，通过线性拟合本案产品和阳性样本之间的相关性，该组检测在R²＝0.9473。此外，Alt a 1-Fc组在0.41-94.8IU/ml样本浓度之间均具有良好的线性相关性，而Alt a 1组在40IU/ml以内检测线性相关性较好，大于40IU/ml时线性相关性变差。Alt a 1-Fc组相比于Alt a 1组在信噪比值方面也具有较好的表现，因此本案产品Alt a 1-Fc具有很好的应用价值，具有检出率高、无假阳性、可定量等优势，能够用于高通量的体外诊断试剂盒开发。

对比例1：不同宿主来源的Alt a 1检出率比较

对照蛋白的包被方法参考实施例4，区别在于，以E.coli细胞表达的重组融合致敏蛋白Alt a 1(Sino Biological,Inc，69006-ANAE)或Pichia pastoris细胞表达的重组融合致敏蛋白Alt a 1(INDOOR biotechnologies,Inc，RP-AA1-1)替换HEK293细胞表达的重组融合致敏蛋白Alt a 1-Fc。

对比检测结果如表2所示，HEK293细胞来源的重组Alt a 1蛋白从阳性检出率和阴性符合率均优于E.coli和Pichia pastoris来源的重组Alt a 1蛋白。且HEK293细胞来源的重组Alt a 1实验组在信噪比方面具有更好的线性相关性和更高的信噪比(如图5和图6)，信噪比更高意味着其检测的灵敏度会更好。

表2

对比例2：不同宿主来源的Alt a 1检测灵敏度比较

分别将Alt a 1-Fc(HEK293)、Alt a 1(E.coli)、Alt a 1(Pichia pastoris)蛋白包被于蛋白芯片，方法参考实施例4，然后将阳性样本用PBS缓冲液以2倍梯度稀释13次获取一系列梯度样本，未稀释样本和稀释样本共计14组，将样本孵育于包被了3种重组蛋白的芯片，检测方法同实施例4。结果如图7所示，就检测信噪比方面比较，HEK293表达的Alt a 1-Fc组的检测信噪比远高于另外两组蛋白(Alt a 1(E.coli)、Alt a 1(Pichia pastoris))，较高的信噪比意味着灵敏度较高，具有较好的检测范围，本案种的Alt a 1-Fc组最低可以检测至样本稀释1024倍，而另外两组分别检测到样本稀释128倍和256倍。本案中的Alt a1-Fc由于融合表达标签Fc之间形成二硫键，使得本案例中Alt a 1-Fc蛋白具有稳定的二聚体结构，也使得Alt a 1蛋白之间的链间二硫键更加稳定不易断裂，因此，这种稳定的二聚体结构和天然状态下的Alt a 1二聚体结构更为接近。融合标签的串联表达不仅有利于提高了蛋白的稳定性，也使得在包被于芯片时的目标蛋白更容易充分暴露出与抗体结合的表位。另外两种来源的蛋白(Alt a 1(E.coli)、Alt a 1(Pichia pastoris))根据SDS-PAGE结果分析，其结构均为单体形式，并未在重组表达时形成二聚体结构，这可能是和本案产品差距较大的原因。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种提高链格孢菌致敏蛋白Alt a 1表达量的方法，其特征在于，以pcDNA3.1为初始载体，表达SEQ ID No.1所示的Alt a 1蛋白，所述Alt a 1蛋白的N端连接SEQ ID No.3所示的信号肽，所述Alt a 1蛋白的C端连接SEQ ID No.5所示的人抗体Fc片段。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述Alt a 1蛋白的核苷酸序列如SEQID No.2所示，编码所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，编码所述人抗体Fc片段的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

3.由权利要求1或2所述方法构建的重组细胞。

4.根据权利要求3所述的重组细胞，其特征在于，宿主细胞包括原核细胞、真核细胞或动物细胞。

5.根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于，宿主细胞为HEK 293细胞。

6.一种制备链格孢菌致敏蛋白Alt a 1的方法，其特征在于，培养权利要求3～5任一所述重组细胞，并将培养液进行纯化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组细胞的培养条件为35-40℃，4-8％CO₂，90-130rpm。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述纯化的方法为proteinA亲和层析纯化。

9.权利要求1或2所述方法，或权利要求3～5任一所述重组细胞，或权利要求6～8任一所述方法在制备链格孢菌致敏蛋白Alt a 1中的应用。

10.权利要求1或2所述方法，或权利要求3～5任一所述重组细胞，或权利要求6～8任一所述方法在制备体外诊断链格孢菌过敏的产品中的应用。