CN112094351B - 一种抗vegfr-2单克隆抗体的检测性抗体、应用及检测方法 - Google Patents

一种抗vegfr-2单克隆抗体的检测性抗体、应用及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗VEGFR‑2单克隆抗体的检测性抗体、应用及检测方法，检测性抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8；轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。本发明筛选得到了一种针对抗VEGFR‑2单克隆抗体的检测性抗体，该抗体可以快速、灵敏、准确的检测体液中抗VEGFR‑2单克隆抗体的药物浓度，为协助抗VEGFR‑2的单克隆抗体临床诊断和临床试验的药理、药代分析提供了可靠的研究方法。

Description

一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体、应用及检测方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体、应用及检测方法。
背景技术
肿瘤生长依赖新生血管的形成已经在肿瘤生物学上研究的比较透彻。新生血管生成是指从预先存在的毛细血管以出芽方式形成新的血管的过程。这一过程是由多种因子来激发和调控的，包括碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,BFGF)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、血管生成素-1(angiopoietin-1)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)、转移生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)等。其中，VEGF是目前发现的最为强大和专一的刺激内皮细胞增生的因子，此外，它还有增加血管通透性，趋化血管内皮细胞等功能。迄今为止,已发现的VEGF信号转导的主要受体包括fms样酪氨酸激酶VEGFR-1(Fms–liketyrosine即Flt-1)、胎儿肝激酶插入区受体VEGFR–2(Kinase insert domain-containingreceptor即KDR/Flk-1)和VEGFR–3(Flt-4)，三者均具有酪氨酸活性。其中，VEGFR-2主要分布在血管内皮细胞，也分布在造血干细胞、巨噬细胞等，它的主要作用是介导VEGF的血管内皮细胞增生，趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能，因此，其是VEGF的主要功能受体。深入理解VEGFR-2的结构与功能以及它在新生血管生成过程中的调控机制有利于理解相关病理生理现象，并对相关疾病的治疗起指导作用。
人VEGFR-2又名激酶插入区受体(kinase domain receptor,KDR)，其编码基因位于4q12，编码了1356个氨基酸，是一分子量为230kD的跨膜糖蛋白。VEGFR-2是一酪氨酸激酶跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞内激酶活性区，其胞外区有7个免疫球蛋白样的结构区域(Ig-like domain)，这7个区分别有着不同的功能。VEGF和VEGFR-2受体作为关键的血管内皮细胞特异因子信号传导途径的分子参与肿瘤新生血管的生成，VEGF的主要生物学功能都是通过VEGFR-2实现，VEGFR-2和VEGF结合后发生二聚体化，并且VEGFR-2胞内的酪氨酸残基自身磷酸化，从而激活并将细胞膜/细胞质激酶级联反应信号传递到细胞核，可引发内皮细胞的一系列变化，包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移以及基因表达等，并最终引起血管增生。
目前，由于VEGF/VEGFR2信号通路在肿瘤的发生发展中的关键作用，越来越多的生物医药公司投入抗VEGFR-2单克隆抗体的研发，目前公开的专利有很多，例如美国专利申请号为US10/506997，专利名称为：Human antibodies specific to KDR and uses thereof；中国专利CN201210533178.3，专利名称为：人源抗人血管内皮细胞生长因子抗体及其应用；中国专利CN 201710130518.0，专利名称为：一种改进的抗VEGFR-2单克隆抗体等，上述专利均是针对抗VEGFR-2单克隆抗体研发，并没有专门针对某种抗VEGFR-2单克隆抗体的药物浓度检测方案的研究，这对抗体在临床诊断和临床试验的药理、药代分析中存在不便，因此，本发明在现有专利CN201710130518.0提供的一种改进的抗VEGFR-2单克隆抗体(抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ NO:1、SEQ NO:2或SEQ NO:3中的任一种；重链可变区的氨基酸序列为SEQ NO:4)的基础上，研制了一种专门用于检测该专利中抗VEGFR-2单克隆抗体的药物浓度的检测性抗体。
发明内容
为了更加灵敏、快速、可靠的检测抗VEGFR-2单克隆抗体的药物浓度，本发明在现有专利CN201710130518.0提供的一种改进的抗VEGFR-2单克隆抗体的基础上，提供了一种能够灵敏快速地检测该专利提供的抗VEGFR-2抗体的药物浓度的检测性抗体、应用和检测方法，为该专利提供的抗VEGFR-2单克隆抗体的临床试验药理、药代分析提供了可靠的研究方法，同时可用于临床试验中血清或其他体液中抗VEGFR-2单克隆抗体的浓度检测。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供了一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体，所述检测性抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8；所述轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12。
进一步的，所述检测性抗体选自以下任意一种：
(A-1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(A-2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(A-3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11；
(A-4)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:12。
进一步的，所述检测性抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列选自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b；所述轻链恒定区的氨基酸序列为人或鼠的Cκ；
优选的，所述重链恒定区的氨基酸序列为人的IgG4，所述轻链恒定区的氨基酸序列为人的Cκ。
本发明还提供了一种多肽或蛋白，所述多肽或所述蛋白包含所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体。
本发明进一步的提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，所述重组DNA表达载体包含所述的多核苷酸分子。
本发明进一步的提供了一种转染所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或原核细胞；
优选的，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或所述试剂盒均包括所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体。
进一步的，本发明还提供了一种所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体用于检测体液中抗VEGFR-2单克隆抗体药物浓度的应用。
本发明还提供了一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1、用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体的全抗体至2μg/ml，以100μl/孔加到96孔酶标板中；4℃过夜包被，用300μl/孔PBST洗涤三次，再加入4％milk-PBST，在37℃封闭1h；
S2、加入含抗VEGFR-2单克隆抗体的血清样品和对应梯度稀释的不同浓度的抗VEGFR-2单克隆抗体的标准品，所述标准品中的抗体浓度分别为240ng/ml、120ng/ml、60ng/ml、30ng/ml、15ng/ml、7.5ng/ml、3.75ng/ml、1.875ng/ml、0ng/ml，37℃孵育1-2h；用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1:5000稀释的HRP标记的小鼠抗人的IgG1，37℃孵育1h；
S3、用300μl/孔PBST洗涤八次，TMB显色试剂盒室温显色10min，用2M H2SO4终止显色，50μl/孔；450nm/630nm读数；
S4、根据所述标准品的浓度和读数制作标准曲线，将所述血清样品的读数代入所述标准曲线公式计算抗VEGFR-2单克隆抗体的浓度。
本发明所述检测方法为定量检测法，所述检测法的线性范围为3.75～240ng/ml。
本发明的有益效果如下：本发明通过全合成噬菌体抗体库的筛选技术，筛选得到了一种专门针对现有专利CN 201710130518.0提供的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体，该抗体可以与抗VEGFR-2单克隆抗体特异性结合，从而可以快速、灵敏、准确的检测体液中抗VEGFR-2单克隆抗体的药物浓度，尤其是用于血药浓度的检测，解决了抗VEGFR-2单克隆抗体浓度检测的技术难题，为协助抗VEGFR-2的单克隆抗体临床诊断和临床试验的药理、药代分析提供了可靠的研究方法，可广泛应用于临床试验中血清及其他体液中抗VEGFR-2的单克隆抗体的药物浓度检测。
附图说明
图1、本发明实施例1提供的pScFvDisb-s质粒图谱；
图2、本发明实施例4提供的梯度稀释phage ELISA比较抗VEGFR-2抗体的单链抗体亲和力线条图；
图3、本发明实施例5提供的pTSE质粒图谱；
图4、本发明实施例6提供的全抗体水平上检测性抗体的结合特异性分析图；
图5、本发明实施例6提供的不同浓度的检测性抗体与抗VEGFR-2单克隆抗体的亲和力比较图；
图6、本发明实施例6提供的不同抗VEGFR-2抗体包被量时检测性抗体的亲和力比较图；
图7、本发明实施例7提供的血清中抗VEGFR-2单克隆抗体浓度检测的典型标准曲线图。
具体实施方式
本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可由商业途径获得。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。下面结合以下实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
本发明实施例1提供了一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体，检测性抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQID NO:7或SEQ ID NO:8；轻链可变区的氨基酸序列选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11或SEQ ID NO:12。
本发明通过全合成噬菌体抗体库的筛选技术，筛选得到了一种专门针对现有专利CN 201710130518.0提供的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体，其中，抗VEGFR-2单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ NO:1、SEQ NO:2或SEQ NO:3中的任一种；重链可变区的氨基酸序列为SEQ NO:4，具体序列如下：
SEQ NO:1(抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQAIDNWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGSNLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK；
SEQ NO:2(抗VEGFR-2单克隆抗体(N-2)的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASDAIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEASNLDTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK；
SEQ NO:3(抗VEGFR-2单克隆抗体(N-3)的轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRASQGIDQWLGWYQQKPGKAPKLLIYEGSNLNTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQANQFAVYFCQQAKSFPPTFGGGTKVDIK；
SEQ NO:4(抗VEGFR-2单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列)：
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASAFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSISSSSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVTDAFDLWGQGTMVTVSS。
检测性抗体的具体生物淘选方法如下：
步骤一：采用一系列基因克隆的方法对载体pcomb3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库。
步骤二：以抗VEGFR-2单克隆抗体(轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ NO:1；重链可变区的氨基酸序列为SEQ NO:4)为抗原包被免疫管，抗原包被量为5μg/500μl/管，4℃包被过夜。再用4％milk-PBST分别封闭免疫管和全合成噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109～1012个，室温反应1h。PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，0.1M pH 2.2的Glycine-HCl洗脱，用1.5M pH 8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至pH 7.0左右。
步骤三：将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量，剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
步骤四：将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13K07辅助噬菌体超感染，28℃培养过夜扩增噬菌体，PEG6000-NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选。
步骤五：噬菌体单链抗体阳性克隆的鉴定；
经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，37℃，220rpm培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，37℃静止感染30min。4000rpm，4℃离心15min，弃去上清，菌体用2YTAKA重悬沉淀，28℃，220rpm培养过夜；吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定，筛选得到亲和力较高的检测性抗体，分别命名为A-1、A-2、A-3、A-4，将上述得到的检测性抗体经基因测序确定为正确的抗体序列。
经过测序，上述筛选的4株检测性抗体序列如下，而且本发明保护的检测性抗体选自以下任意一种：
(A-1)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:9；
(A-2)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:10；
(A-3)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:11；
(A-4)重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:8，轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO:12。
具体的，SEQ ID NO:5(A-1中重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYTFSDYNVHWVRQAPGQGLVWMGRINPDSGDAIYAQSFRGRVTMTRDTSTSTAYMDLNNLRSDDTAIYFCARGEGGYYKSWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:6(A-2中重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVESGGDLVQPGRSLRLSCVASGFNFGEYAMHWVRRAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNSVYLQMNSLKSEDTAVYYCARPRDNSLYMDVWGKGTTVTVSS；
SEQ ID NO:7(A-3中重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGDTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGLNPADGGTIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEGGYYKSWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:8(A-4中重链可变区的氨基酸序列)：
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGDTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGLNPADGGTIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEGGYYKSWGQGTLVTVSS；
SEQ ID NO:9(A-1中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVNNWLDWYQQKPGKAPKLLIYAASNRETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNSNGPSTFGQGTKGEIK；
SEQ ID NO:10(A-2中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIHSYLDWYQQKPGKAPKLLIYDASSRASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGFNEPTTFGQDTKVEIK；
SEQ ID NO:11(A-3中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIDNLLDWYQQKPGKAPKLLIYAASNRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQQGHDPNTFGQGTKVEIK；
SEQ ID NO:12(A-4中轻链可变区的氨基酸序列)：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIDNLLDWYQQKPGKAPKLLIYAASNRESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQQGHDPNTFGQGTKVEIK。
进一步的，检测性抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，重链恒定区的氨基酸序列选自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b；轻链恒定区的氨基酸序列为人或鼠的Cκ。
优选的，重链恒定区的氨基酸序列为人的IgG4，轻链恒定区的氨基酸序列为人的Cκ。
实施例2
本发明实施例2在实施例1的基础上进一步还提供了一种多肽或蛋白，多肽或蛋白包含实施例1中提供的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体。
本发明进一步的还提供了一种多核苷酸分子，多核苷酸分子编码实施例1中提供的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体的氨基酸序列。
本发明还提供了一种重组DNA表达载体，重组DNA表达载体包含上述多核苷酸分子。
本发明进一步的提供了一种转染的重组DNA表达载体的宿主细胞，宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或原核细胞；
优选的，宿主细胞为哺乳动物细胞，哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
本发明还提供了一种检测试剂或试剂盒，所述检测试剂或所述试剂盒均包括所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体。
实施例3
本发明实施例3在实施例1的基础上提供了一种的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体用于检测体液中抗VEGFR-2单克隆抗体药物浓度的应用，药物浓度包括但不限于血清中的血药浓度。
实施例4、梯度稀释phage Elisa比较单链抗体的亲和力
将实施例1中获得的检测性抗体(A-1、A-2、A-3、A-4)进行单克隆phage的展示和纯化，同时进行phage梯度稀释ELISA实验鉴定phage-abs的亲和力。
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被现有专利CN 201710130518.0提供的抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)，200ng/孔/100μl，4℃包被过夜，PBST洗涤三次，4％milk-PBST 37℃封闭1h，纯化后的Phage初始浓度为6.25×1012pfu/mL，再用4％milk-PBST五倍梯度稀释，每孔加入100μl稀释后的样品，室温静置1h，用PBST洗涤ELISA板，将4％milk-PBST稀释后的HRP-anti-M13单克隆抗体加入ELISA板中，室温放置1h，TMB显色试剂盒显色，室温显色10min，用2M H2SO4终止显色，50μl/孔，450nm/630nm读数，数据如下表1，结果如图2所示。
表1梯度稀释phage Elisa比较单链抗体的亲和力数据表
Figure BDA0002677002360000091
通过表1和图2所示，筛选出的4株不同的检测性抗体均能与抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)进行结合，检测性抗体(A-2)的亲和力最高。
实施例5、抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体的全抗体的制备
将实施例1筛选得到的4株检测性抗体(A-1、A-2、A-3、A-4)的重链可变区基因和轻链可变区基因分别克隆至装有重链恒定区基因和轻链恒定区基因的载体pTSE(如图3所示)上，重链恒定区为人恒定区γ4(氨基酸序列为SEQ ID NO:13)，轻链恒定区为κ链(氨基酸序列为SEQ ID NO:14)，载体pTSE以PTT载体为基础改造获得，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段，瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达，使用AKTA仪器protein A亲和柱纯化获得全抗体蛋白。使用BCA试剂盒进行蛋白浓度的测定。其中，检测性抗体A-1的完整重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:15；检测性抗体A-1的完整轻链的氨基酸序列为SEQID NO:16；检测性抗体A-2的完整重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:17；检测性抗体A-2的完整轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:18；检测性抗体A-3的完整重链的氨基酸序列为SEQ IDNO:19；检测性抗体A-3的完整轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:20；检测性抗体A-4的完整重链的氨基酸序列为SEQ ID NO:21；检测性抗体A-4的完整轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:22。
SEQ ID NO:13(重链恒定区的氨基酸序列)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK；
SEQ ID NO:14(轻链恒定区的氨基酸序列)
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。
实施例6、全抗体与抗VEGFR-2单克隆抗体的结合实验
6.1、全抗体水平上的结合特异性分析
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被现有专利CN 201710130518.0提供的抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1、N-2、N-3)、KDR-ECD-his、IgG1–Fc、IgG1和BSA，各100ng/孔/100μl，4℃过夜包被。用300μl/孔PBST洗三次，再加入4％milk-PBST在37℃封闭1h。分别加入10μg/ml的实施例5制备的检测性抗体(A-1、A-2、A-3、A-4)的全抗体，37℃孵育1-2h，用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用4％milk-PBST 1:5000稀释的HRP标记的小鼠抗人IgG4，37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗涤八次，TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止显色，50μl/孔，450nm/630nm读数，实验结果如表2和图4所示。
表2全抗体与抗VEGFR-2单克隆抗体的特异性结合能力数据表
Figure BDA0002677002360000101
结果显示，4株检测性抗体(A-1、A-2、A-3、A-4)均都能够同时与抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1、N-2、N-3)结合，但不会与抗VEGFR-2单克隆抗体以外的蛋白结合，例如通过表2和图4所示，检测性抗体与BSA、IgG1-Fc、IgG1、KDR-ECD-his等蛋白结合能力较低，所以4株检测性抗体(A-1、A-2、A-3、A-4)均能够用来检测体液中抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1、N-2、N-3)的药物浓度，此外，通过上述数据得知，检测性抗体A-2的结合特异性及亲和力最高。
6.2、检测性抗体A-2与不同的抗VEGFR-2单克隆抗体的亲和力比较
用pH9.6的碳酸盐缓冲液分别包被抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1、N-2、N-3)，100ng/孔/100μl，4℃过夜包被，用300μl/孔PBST洗涤三次，再加入4％milk-PBST在37℃封闭1h。加入不同稀释度的检测性抗体A-2全抗体，全抗体最高浓度是100μg/ml，5倍稀释下做8个梯度，在37℃条件下孵育1-2h；用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用4％milk-PBST，1:5000稀释的HRP标记的小鼠抗人IgG4，在37℃条件下孵育1h，用300μl/孔PBST洗涤八次，然后用TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止显色，50μl/孔，450nm/630nm读数，实验结果如表3和图5所示。
表3检测性抗体A-2与不同抗VEGFR-2单克隆抗体的亲和力数据表
Figure BDA0002677002360000111
通过表3和图5所示，检测性抗体A-2全抗体与不同的抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1、N-2、N-3)均有结合，且亲和力都较高，所以检测性抗体可以很灵敏准确的检测这三种不同的抗VEGFR-2单克隆抗体的药物浓度。
6.3、不同抗VEGFR-2单克隆抗体包被量时检测性抗体A-2的亲和力比较
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被不同浓度的抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)，抗VEGFR-2单克隆抗体最高浓度为2μg/ml，2倍梯度稀释8个梯度，100μl/孔，4℃过夜包被。用300μl/孔PBST洗涤三次，再加入4％milk-PBST，在37℃封闭1h。加入不同稀释度的全抗体；检测性抗体A-2全抗体最高浓度是100μg/ml，5倍稀释做8个梯度，37℃孵育1-2h，用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用4％milk-PBST，1:5000稀释的HRP标记的小鼠抗人IgG4，37℃孵育1h，用300μl/孔PBST洗涤八次，TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色10min，然后用2M H2SO4终止显色，50μl/孔，450nm/630nm读数，数据结果如表4和图6所示。
表4不同抗VEGFR-2单克隆抗体包被量时检测性抗体A-2的亲和力数据表
Figure BDA0002677002360000121
通过上述表4和图6表明，当抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)浓度较低时，检测性抗体A-2仍然具有较高的亲和力，可以快速与抗VEGFR-2单克隆抗体结合，能够有效用于检测抗VEGFR-2单克隆抗体，所以可以说明本发明提供的检测性抗体可以灵敏、准确的检测体液中抗VEGFR-2单克隆抗体的药物浓度。
实施例7、血清中抗VEGFR-2抗体浓度ELISA检测方法
本发明实施例7在实施例1的基础上提供了一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测方法，检测方法包括以下步骤：
S1、用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体A-2的全抗体至2μg/ml，以100μl/孔加到96孔酶标板中；4℃过夜包被，用300μl/孔PBST洗涤三次，再加入4％milk-PBST，在37℃封闭1h。
S2、加入含抗VEGFR-2单克隆抗体的血清样品和对应梯度稀释的不同浓度的抗VEGFR-2单克隆抗体的标准品，所述标准品的抗体终浓度分别为240ng/ml、120ng/ml、60ng/ml、30ng/ml、15ng/ml、7.5ng/ml、3.75ng/ml、1.875ng/ml、0ng/ml，37℃孵育1-2h；用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1:5000稀释的HRP标记的小鼠抗人的IgG1，37℃孵育1h。
S3、用300μl/孔PBST洗涤八次，TMB显色试剂盒室温显色10min，用2M H2SO4终止显色，50μl/孔；450nm/630nm读数。
S4、根据所述标准品的浓度和读数制作标准曲线，将所述血清样品的读数代入所述标准曲线公式计算抗VEGFR-2单克隆抗体的浓度。
实施例八、ELISA检测方法学验证
用0.2％空白血清梯度稀释的抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)标准品，使标准曲线上的各浓度点的终浓度分别为240ng/ml、120ng/ml、60ng/ml、30ng/ml、15ng/ml、7.5ng/ml、3.75ng/ml、1.875ng/ml和0ng/ml的浓度点，用于标准曲线本底值参照；用0.2％空白血清样品稀释液稀释的抗VEGFR-2单克隆抗体样品，制备质控高、中、低三种浓度的抗体样品120ng/ml、30ng/ml、6ng/ml，每个浓度品性进行6个样品的测定，质控样品与标准曲线同时进行测定，以同批次的标准曲线计算质控样品浓度。
以0.2％空白血清梯度稀释的抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)的标准品浓度(取log)为横坐标，浓度对应的OD450nm值为纵坐标；采用四参数法y＝(A-D/(1+X/C^B))+D进行计算，获得标准曲线，典型的标准曲线图如图7所示。定量下线是标准曲线上的最低浓度点，质控的高中低浓度分别为120ng/ml、30ng/ml和6ng/ml。根据质控样品的读数结果及标准曲线计算质控样品浓度，求算该批次的精密度及准确度。
重复进行三批实验，每批实验的质控样品和标准曲线同时进行测定，以同批次的标准曲线计算质控样品浓度，求算各批次的精密度及准确度。综合三批实验数据进行方法的精密度和准确度的计算。精密度要求高中低浓度点批内和批间相对标准偏差不超过15％；高中低浓度点准确度的均值在±15％以内。
如图7所示，图7中读数与抗VEGFR-2单克隆抗体的浓度呈较好线性关系，得到的标准曲线公式如下：
y＝104.9x-5.7718，其中，y为抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)的浓度，x为OD值；
将所述血清样品的读数代入所述标准曲线公式，计算抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)的浓度，数据如下表5：
表5检测0.2％血清样品中抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)分析方法的准确度和精密度
Figure BDA0002677002360000131
Figure BDA0002677002360000141
通过上述表5数据得知，本发明提供的检测性抗体能够灵敏、准确的检测血清中抗VEGFR-2单克隆抗体(N-1)的血药浓度，检测精准度较高，检测精密度和准确度均在要求范围内，符合药物浓度检测要求，因此，可以说明本发明筛选得到的检测性抗体可以准确、灵敏、高效的用于抗VEGFR-2单克隆抗体的药物浓度检测。
本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京东方百泰生物科技股份有限公司
北京精益泰翔技术发展有限公司
<120> 一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体、应用及检测方法
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 107
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Asp Asn Trp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Ser Asn Leu Asn Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Asp Ala Ile Asp Gln Trp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asn Gln Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 107
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 3
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Gln Trp
20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Glu Gly Ser Asn Leu Asn Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala
65 70 75 80
Asn Gln Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
100 105
<210> 4
<211> 116
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 4
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ala Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 117
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Val Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asp Ser Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Gln Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Asn Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Lys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Glu Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Arg Asp Asn Ser Leu Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Leu Asn Pro Ala Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Lys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 117
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Leu Asn Pro Ala Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Lys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 9
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Gly Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Gly Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile His Ser Tyr
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Asn Glu Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Asp Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Asn Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Gly His Asp Pro Asn
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 107
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 12
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Asn Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Gly His Asp Pro Asn
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<210> 13
<211> 327
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 13
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 14
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<212> PRT
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<400> 14
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
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Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 15
<211> 444
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Asn Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Val Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asp Ser Gly Asp Ala Ile Tyr Ala Gln Ser Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Asn Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Lys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 16
<211> 214
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ser Asn Gly Pro Ser
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Gly Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 17
<211> 446
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asn Phe Gly Glu Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Arg Asp Asn Ser Leu Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 18
<211> 214
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile His Ser Tyr
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Asn Glu Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Asp Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 19
<211> 444
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Leu Asn Pro Ala Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Lys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 20
<211> 214
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Asn Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Gly His Asp Pro Asn
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 21
<211> 444
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Leu Thr Glu Leu
20 25 30
Ser Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Leu Asn Pro Ala Asp Gly Gly Thr Ile Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Gly Gly Tyr Tyr Lys Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> SIPOSequenceListing 1.0
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Asn Leu
20 25 30
Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Gly His Asp Pro Asn
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210

Claims (11)

1.一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体，其特征在于，所述检测性抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述检测性抗体选自以下任意一种：
(A-1)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:5，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:9；
(A-2)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:6，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:10；
(A-3)所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:7，所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO:11。
2.如权利要求1所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体，其特征在于，所述检测性抗体还包括重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区的氨基酸序列选自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b；所述轻链恒定区的氨基酸序列为人或鼠的Cκ。
3.如权利要求2所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体，其特征在于，所述重链恒定区的氨基酸序列为人的IgG4，所述轻链恒定区的氨基酸序列为人的Cκ。
4.一种多肽或蛋白，其特征在于，所述多肽或所述蛋白包含权利要求1-3任一项所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体。
5.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1-3任一项所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体的氨基酸序列。
6.一种重组DNA表达载体，其特征在于，所述重组DNA表达载体包含权利要求5所述的多核苷酸分子。
7.一种转染如权利要求6所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或原核细胞。
8.一种转染如权利要求7所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞为HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
9.一种检测试剂或试剂盒，其特征在于，所述检测试剂或所述试剂盒均包括权利要求1-3任一项所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体。
10.一种如权利要求1-3任一项所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体用于检测体液中抗VEGFR-2单克隆抗体药物浓度的应用。
11.一种抗VEGFR-2单克隆抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
S1、用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释权利要求1-3任一项所述的抗VEGFR-2单克隆抗体的检测性抗体的全抗体至2μg/ml，以100μl/孔加到96孔酶标板中；4℃过夜包被，用300μl/孔PBST洗涤三次，再加入4％milk-PBST，在37℃封闭1h；
S2、加入含抗VEGFR-2单克隆抗体的血清样品和对应梯度稀释的不同浓度的抗VEGFR-2单克隆抗体的标准品，所述标准品中的抗体浓度分别为240ng/ml、120ng/ml、60ng/ml、30ng/ml、15ng/ml、7.5ng/ml、3.75ng/ml、1.875ng/ml、0ng/ml，37℃孵育1-2h；用300μl/孔PBST洗涤五次，再加入用1:5000稀释的HRP标记的小鼠抗人的IgG1，37℃孵育1h；
S3、用300μl/孔PBST洗涤八次，TMB显色试剂盒室温显色10min，用2M H2SO4终止显色，50μl/孔；450nm/630nm读数；
S4、根据所述标准品的浓度和读数制作标准曲线，将所述血清样品的读数代入所述标准曲线公式计算抗VEGFR-2单克隆抗体的浓度。
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