CN112142841B - 一种新的抗人il-17a单克隆抗体、包含其的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种新的抗人il-17a单克隆抗体、包含其的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种新的抗人IL‑17A单克隆抗体，以及包含所述抗体的人IL‑17A ELISA试剂盒及其检测方法。具体来说，本申请所述的抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO 9和10所示，所述人IL‑17A ELISA试剂盒包括一对抗体，其中，第一抗体为QX002N，用作改良的双抗夹心ELISA方法中的包被抗体，和第二抗体为本申请的抗人IL‑17A单克隆抗体，用作改良的双抗夹心ELISA方法中的检测抗体。本申请利用该试剂盒可成功完成人IL‑17A的定量检测，具有较高的检测灵敏度和良好的检测特异性，开发及应用前景良好。

Description

一种新的抗人IL-17A单克隆抗体、包含其的试剂盒及其检测 方法
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体地，涉及一种新的抗人IL-17A单克隆抗体，使用该抗体定量检测人IL-17A的人IL-17A ELISA试剂盒，以及利用该试剂盒进行定量检测的方法。
背景技术
迄今为止，白介素-17(Interleukin-17，IL-17)家族已有六个成员被发现：IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(又名IL-25)和IL-17F。IL-17A是IL-17家族的原型，也是其家族中最具代表性的成员。IL-17F与IL-17A有最高的同源性(约50％)，其编码基因定位于染色体的同一区段6p12。IL-17B～E与IL-17A的同源性较差(16％～30％)，且定位在不同的染色体上。
IL-17A是一种重要的促炎症性细胞因子，主要由活化的记忆性CD4+T淋巴细胞分泌而来。IL-17A通过与受体特异性结合，发挥着促进炎症发展、免疫应答、造血等多种功能，参与了多种自身免疫性疾病(如银屑病、类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、类风湿性心脏病等)的发生。当机体受到感染或损伤时，迁移过来的淋巴细胞会分泌IL-17A。一方面，IL-17A会诱导炎症因子以及趋化因子的表达，从而招募更多的免疫细胞到达炎症部位加剧机体的炎症反应，另一方面，IL-17A还会诱导一些组织修复相关因子的表达，从而加速机体的恢复。虽然IL-17A在宿主抗感染和组织修复过程中起到扩大免疫防御反应保护自身机体的作用，但是在很多自身免疫病病人和肿瘤病人当中，IL-17A又是高表达的，由于它可以诱导很多炎症因子的表达，过高的IL-17A水平对于疾病的病理发展起到恶化作用。很多动物实验也证明，IL-17A缺失或者抗体中和IL-17A，可以有效的抑制多种自身免疫病病理程度。
目前市场上测定IL-17A含量的试剂盒产品类型少，且价格昂贵。本发明中的ELISA试剂盒可定量检测细胞培养基中IL-17A的含量，操作简单方便，灵敏度高，且具有良好的特异性，对IL-17A相关的自身免疫性疾病的发病机制以及药物模型等的研究具有重要的意义。
发明内容
基于上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种抗人IL-17A单克隆抗体，包含该抗体的一种基于ELISA方法研制的改良的双抗夹心ELISA试剂盒，并利用该试剂盒成功完成了人IL-17A的定量检测。
具体来说，本发明涉及以下内容：
1.一种抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含：
a)抗体重链互补决定区，其包含：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，其中：
CDR-H1具有序列SEQ ID NO 1:SYYYMC的氨基酸序列，
CDR-H2具有序列SEQ ID NO 2:CIHTGNGYPYYANWAKG的氨基酸序列，
CDR-H3具有序列SEQ ID NO 3:PVGGYDYAMDL的氨基酸序列；
b)抗体轻链互补决定区，其包含：CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：
CDR-L1具有序列SEQ ID NO 4:QASEDISSQLS的氨基酸序列，
CDR-L2具有序列SEQ ID NO 5:KASTLAS的氨基酸序列，
CDR-L3具有序列SEQ ID NO 6:QQSASYFNVANT的氨基酸序列。
2.根据项1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含抗体重链可变区HCVR和抗体轻链可变区LCVR，其中：
HCVR具有序列SEQ ID NO 7:QSLEESGGDLVQPEGSLALTCKASGFDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIHTGNGYPYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQLTSLTVADTATYFCARPVGGYDYAMDLWGPGTLVTVSS的氨基酸序列；
LCVR具有序列SEQ ID NO 8:AYDMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDISSQLSWYQQRPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQQSASYFNVANTFGGGTEVVVK的氨基酸序列。
3.根据项1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含重链和轻链，其中：
所述重链氨基酸序列选自SEQ ID NO 9:QSLEESGGDLVQPEGSLALTCKASGFDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIHTGNGYPYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQLTSLTVADTATYFCARPVGGYDYAMDLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK的氨基酸序列；
所述轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO 10:AYDMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDISSQLSWYQQRPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQQSASYFNVANTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC的氨基酸序列。
3-1.项1所述的抗人IL-17A单克隆抗体在制备用于检测人IL-17A的试剂盒中的用途。
3-2.根据项3-1所述的用途，其中，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第二抗体是项1所述的抗人IL-17A单克隆抗体。
3-3.根据项3-2所述的用途，其中，所述第一抗体是QX002N。
3-4.根据项3-2所述的用途，其中，所述第一抗体固定至固相载体上，所述第二抗体经生物素标记。
3-5.根据项4所述的用途，其特征在于，所述固相载体为酶标板。
3-6.根据项3-2所述的用途，其特征在于，还包括：过氧化物酶标记的链霉亲和素、重组人IL-17A蛋白标准品、底物、包被抗体稀释液、洗液、封闭液/样品稀释液和终止液。
3-7.根据项3-1～3-6中任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒是酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
3-8.根据项3-1～3-7中任一项所述的用途，其特征在于，所述试剂盒是改良的双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
4.一种检测人IL-17A的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，
所述第一抗体为QX002N；其包含重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：
所述第一抗体QX002N的CDR-H1具有序列SEQ ID NO 11:LFYMS的氨基酸序列，CDR-H2具有序列SEQ ID NO 12:TIHEVASSYYASWAKG的氨基酸序列，CDR-H3具有序列SEQ ID NO13:ETYSSRYPYPNI的氨基酸序列；CDR-L1具有序列SEQ ID NO 14:QASQNIGGSLA的氨基酸序列，CDR-L2具有序列SEQ ID NO 15:GASSLAS的氨基酸序列，CDR-L3具有序列SEQ ID NO 16:QSYNTISTYGLA的氨基酸序列；
所述第二抗体为抗人IL-17A单克隆抗体，其包含重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：
所述第二抗体的CDR-H1具有序列SEQ ID NO 1:SYYYMC的氨基酸序列，CDR-H2具有序列SEQ ID NO 2:CIHTGNGYPYYANWAKG的氨基酸序列，CDR-H3具有序列SEQ ID NO 3:PVGGYDYAMDL的氨基酸序列；CDR-L1具有序列SEQ ID NO 4:QASEDISSQLS的氨基酸序列，CDR-L2具有序列SEQ ID NO 5:KASTLAS的氨基酸序列，CDR-L3具有序列SEQ ID NO 6:QQSASYFNVANT的氨基酸序列。
5.根据项4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体固定至固相载体上，所述第二抗体经生物素标记。
6.根据项5所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板。
7.根据项5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：过氧化物酶标记的链霉亲和素、重组人IL-17A蛋白标准品、底物、包被抗体稀释液、洗液、封闭液/样品稀释液和终止液。
8.根据项4～7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
9.根据项4～8中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是改良的双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
10.一种定量检测IL-17A含量的方法，其特征在于，使用QX002N为第一抗体，使用项1～3中所述抗体为第二抗体，利用改良的双抗夹心法进行ELISA检测，其中，
所述QX002N包含重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，
以及CDR-H1具有序列SEQ ID NO 11:LFYMS的氨基酸序列，CDR-H2具有序列SEQ IDNO 12:TIHEVASSYYASWAKG的氨基酸序列，CDR-H3具有序列SEQ ID NO 13:ETYSSRYPYPNI的氨基酸序列；CDR-L1具有序列SEQ ID NO 14:QASQNIGGSLA的氨基酸序列，CDR-L2具有序列SEQ ID NO 15:GASSLAS的氨基酸序列，CDR-L3具有序列SEQ ID NO 16:QSYNTISTYGLA的氨基酸序列。
11.根据项10所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用第一抗体包被固相载体；
将被测样品加入已包被的固相载体，孵育；
将经生物素标记的第二抗体加入到固相载体，孵育；
将过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释，加入到固相载体，孵育；
将底物加入固相载体，避光孵育后加入终止液，测定OD值；
利用重组人IL-17A蛋白标准品的OD值拟合出标准曲线，并将被测样品的OD值代入方程计算出被测样品中人IL-17A的含量。
本申请提供了一种包含抗人IL-17A单克隆抗体的人IL-17A ELISA试剂盒。本试剂盒应利用改良的双抗夹心ELISA试剂盒测定样本中IL-17A的水平，并对抗人IL-17A单克隆抗体进行生物素标记，从而可以与酶标二抗形成生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin-System，BAS)，其高亲合力的牢固结合可以起到生物反应多级放大的效应，使本申请的试剂盒不仅具有较高的检测灵敏度，并且具有较好的检测特异性，开发及应用前景良好。
附图说明
图1为QX002N(第一抗体)和抗人IL-17A单克隆抗体(第二抗体)与人IL-17A的结合情况。
图2为QX002N(第一抗体)和抗人IL-17A单克隆抗体(第二抗体)与抗原人IL-17A结合位点的竞争抑制作用。
图3为人IL-17A在OD450的吸光度的标准曲线图。
图4为人IL-17A ELISA试剂盒特异性考察。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本申请做进一步的详细描述，给出的实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然而所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
一般而言，本说明书中采用的术语具有如下含义。
在本说明书中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
在本说明书中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测量亲和力。
在本说明书中，人白介素17A(Human Interleukin-17A，hIL-17A)表示一种源自人的蛋白。IL-17A是一种由Th17细胞产生的促炎性细胞因子，通过结合其受体而刺激细胞产生细胞因子，参与和促进多种由异常免疫反应介导的疾病。本申请的单克隆抗体是特异性识别IL-17A的中和性抗体，其能够与IL-17A特异性结合。
在本说明书中，“抗人IL-17A单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人白介素17A，使得所述单克隆抗体可用于鉴定/检测人白介素17A。
在本说明书中，“酶联免疫吸附测定(EILSA)”是指利用抗体分子能与抗原分子特异性结合的特点，将游离的杂蛋白和结合于固相载体的目的蛋白结合，并利用特殊的标记物对其定性或定量分析的一种检测方法。其原理是：抗原或抗体能物理性地吸附于固相表面，并且保持其免疫活性；抗原或抗体能与酶通过共价键形成酶结合物，同时保持各自的免疫活性或酶活性；酶结合物与相应的抗原或抗体结合后，能通过加入底物的颜色反应来确定免疫反应的发生，颜色反应的深浅与标本中相应抗原或抗体的量成正比。根据待检测物质以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法，双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法。其是将含有已知抗体的抗血清吸附在微量滴定板上的小孔里，洗涤一次；加待测抗原，如两者是特异的，则发生结合，然后把多余抗体洗除；加入与待测抗原呈特异反应的酶联抗体，使形成"夹心"；加入该酶的底物，若看到有色的酶解产物产生，说明在存在相应的抗原。
在本说明书中，“亲和素(avidin)”是一种糖蛋白，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素(streptavidin)。
在本说明书中，“生物素(biotin)”又称维生素H。用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯(biotin-hydroxysuccinimide，BNHS)可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA结合起来，就可大大提高ELISA的灵敏度。
生物素-亲合素系统在ELISA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶偶联物，以放大反应信号。
本申请涉及一种抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含：a)抗体重链互补决定区，其包含：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，其中：CDR-H1具有序列SEQ ID NO 1:SYYYMC的氨基酸序列，CDR-H2具有序列SEQ ID NO 2:CIHTGNGYPYYANWAKG的氨基酸序列，CDR-H3具有序列SEQ ID NO 3:PVGGYDYAMDL的氨基酸序列；b)抗体轻链互补决定区，其包含：CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：CDR-L1具有序列SEQ ID NO 4:QASEDISSQLS的氨基酸序列，CDR-L2具有序列SEQ ID NO 5:KASTLAS的氨基酸序列，CDR-L3具有序列SEQ ID NO 6:QQSASYFNVANT的氨基酸序列。
在一个具体的实施方式中，上述抗体包含抗体重链可变区HCVR和抗体轻链可变区LCVR，其中：HCVR具有序列SEQ ID NO 7:QSLEESGGDLVQPEGSLALTCKASGFDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIHTGNGYPYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQLTSLTVADTATYFCARPVGGYDYAMDLWGPGTLVTVSS的氨基酸序列；LCVR具有序列SEQ ID NO 8:AYDMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDISSQLSWYQQRPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQQSASYFNVANTFGGGTEVVVK的氨基酸序列。
在一个具体的实施方式中，上述抗体包含重链和轻链，其中：
所述重链氨基酸序列选自SEQ ID NO 9:QSLEESGGDLVQPEGSLALTCKASGFDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIHTGNGYPYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQLTSLTVADTATYFCARPVGGYDYAMDLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK的氨基酸序列；所述轻链的氨基酸序列选自SEQ ID NO10:AYDMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDISSQLSWYQQRPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQQSASYFNVANTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC的氨基酸序列。
本申请涉及一种检测人IL-17A的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为QX002N；其包含重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：所述第一抗体QX002N的CDR-H1具有序列SEQID NO11:LFYMS的氨基酸序列，CDR-H2具有序列SEQ ID NO 12:TIHEVASSYYASWAKG的氨基酸序列，CDR-H3具有序列SEQ ID NO 13:ETYSSRYPYPNI的氨基酸序列；CDR-L1具有序列SEQ IDNO 14:QASQNIGGSLA的氨基酸序列，CDR-L2具有序列SEQ ID NO 15:GASSLAS的氨基酸序列，CDR-L3具有序列SEQ ID NO 16:QSYNTISTYGLA的氨基酸序列；所述第二抗体为抗人IL-17A单克隆抗体，其包含重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：所述第二抗体的CDR-H1具有序列SEQ ID NO 1:SYYYMC的氨基酸序列，CDR-H2具有序列SEQ ID NO 2:CIHTGNGYPYYANWAKG的氨基酸序列，CDR-H3具有序列SEQID NO 3:PVGGYDYAMDL的氨基酸序列；CDR-L1具有序列SEQ ID NO 4:QASEDISSQLS的氨基酸序列，CDR-L2具有序列SEQ ID NO 5:KASTLAS的氨基酸序列，CDR-L3具有序列SEQ ID NO 6:QQSASYFNVANT的氨基酸序列。
在一个具体的实施方式中，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为QX002N；其包含重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 17所示；且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 18所示。
SEQ ID NO 17:
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGIDLSLFYMSWIRQPPGKGLEWIGTIHEVASSYYASWAKGRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETYSSRYPYPNIWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO 18:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIGGSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYNTISTYGLAFGGGTKVEIK
所述第二抗体为抗人IL-17A单克隆抗体，其包含重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO 7所示；且轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO 8所示。
SEQ ID NO 7:
QSLEESGGDLVQPEGSLALTCKASGFDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIHTGNGYPYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQLTSLTVADTATYFCARPVGGYDYAMDLWGPGTLVTVSS
SEQ ID NO 8:
AYDMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDISSQLSWYQQRPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQQSASYFNVANTFGGGTEVVVK
在一个具体的实施方式中，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，所述第一抗体为QX002N；其包含重链的氨基酸序列如SEQ ID NO 19所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO20所示。
SEQ ID NO 19:
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGIDLSLFYMSWIRQPPGKGLEWIGTIHEVASSYYASWAKGRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETYSSRYPYPNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO 20:
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIGGSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYNTISTYGLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
所述第二抗体为抗人IL-17A单克隆抗体，其包含重链的氨基酸序列如SEQ ID NO9所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO 10所示。
SEQ ID NO 9:
QSLEESGGDLVQPEGSLALTCKASGFDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIHTGNGYPYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQLTSLTVADTATYFCARPVGGYDYAMDLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
SEQ ID NO 10:
AYDMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDISSQLSWYQQRPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQQSASYFNVANTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
在一个具体的实施方式中，所述第一抗体固定至固相载体上，所述第二抗体经生物素标记。
在一个具体的实施方式中，所述试剂盒还包括：过氧化物酶标记的链霉亲和素、重组人IL-17A蛋白标准品、酶标二抗、底物、包被抗体稀释液、洗液、封闭液/样品稀释液和终止液。
在一个具体的实施方式中，所述固相载体为酶标板。优选为96孔酶标板，具体采用美国Corning Coster的聚苯乙烯塑料板。所述生物素为：Biotin。所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶(HRP)，其标记的链霉亲和素为链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(SA-HRP)。底物为3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)；包被抗体稀释液为磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4；洗液为磷酸盐缓冲液(PBS)含0.05％Tween20；封闭液/样品稀释液为磷酸盐缓冲液(PBS)含0.5％BSA、0.05％Tween20和0.05％Proclin300；终止液为磷酸。
在一个具体的实施方式中，所述ELISA试剂盒包括：
1)固相载体：酶标板，1块；
2)包被抗体：第一抗体QX002N，10μg/管，1管；
3)检测抗体：第二抗体抗人IL-17A单克隆抗体(以生物素标记)，10μg/管，1管；
4)标准品：重组人IL-17A蛋白，10ng/管，1管；
5)过氧化物酶标记的链霉亲和素：链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(Streptavidin-HRP，简称SA-HRP)，500ng/管，1管；
6)底物：3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，5ml/管，A液、B液各1管；
7)包被抗体稀释液：磷酸盐缓冲液(PBS)，pH 7.4，50ml/瓶，1瓶；
8)洗液：磷酸盐缓冲液(PBS)，含0.05％Tween20，200ml/瓶，1瓶；
9)封闭液/样品稀释液：磷酸盐缓冲液(PBS)含0.5％BSA、0.05％Tween20和0.05％Proclin300，200ml/瓶，1瓶；
10)终止液：1M磷酸，10ml/管，1管。
在一个具体的实施方式中，所述试剂盒是酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。优选地，所述试剂盒是改良的双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
本申请还涉及一种定量检测IL-17A含量的方法，其特征在于，使用QX002N为第一抗体，使用抗人IL-17A单克隆抗体为第二抗体，利用改良的双抗夹心法进行ELISA检测，包括以下步骤：使用第一抗体包被固相载体；将被测样品加入已包被的固相载体，孵育；将经生物素标记的第二抗体加入到固相载体，孵育；将过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释，加入到固相载体，孵育；将底物加入酶标板，避光孵育后加入终止液，测定OD值；利用重组人IL-17A蛋白标准品的OD值拟合出标准曲线，并将被测样品的OD值代入方程计算出被测样品中人IL-17A的含量。
在一个具体实施方式中，可采用本申请所述的ELISA试剂盒定量检测样品中的人IL-17A的含量，包括以下步骤：
1)包被：采用包被抗体稀释液将包被抗体QX002N(第一抗体)配制成浓度为1μg/ml的包被抗体工作液，然后按照50μl/孔的用量加入到酶标板(96孔Coster酶标板)中，于2～8℃静置过夜；
2)封闭：弃掉酶标板中的包被抗体工作液，用洗液(磷酸盐缓冲液(PBS)含0.05％Tween20)洗板3次，然后按照100μl/孔的用量加入封闭液(磷酸盐缓冲液(PBS)含0.5％BSA、0.05％Tween20和0.05％Proclin300)，置于摇床(120rpm)室温封闭2小时；
3)蛋白标准品配制：取8个EP管并依次编号，从第2管起每管加入100μl样品稀释液并置于EP管架上；用样品稀释液将重组人IL-17A蛋白标准品配制成浓度为10ng/ml的液体，吸取200μl加入到第1个EP管中，然后从第1个EP管中吸取100μl液体，加入到第2个EP管中进行二倍稀释，依此类推至第7个EP管(最后一管浓度为0)；
(4)质控样品配制：取5个EP管，分别从25ng/ml取样，配制成12.5ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、0.2ng/ml、0.098ng/ml的质控样品；
(5)加样：弃掉酶标板中的封闭液，用洗液洗板3次，然后按照50μl/孔的用量加重组人IL-17A蛋白标准标准液和质控样品，置于摇床(120rpm)室温孵育2小时；
(6)加检测抗体：弃掉酶标板中的蛋白标准液和待测样品，用洗液洗板3次，用样品稀释液将检测抗体抗人IL-17A单克隆抗体(生物素标记)配制成浓度为0.2μg/ml的检测抗体工作液，然后按照50μl/孔的用量加入酶标板中，置于摇床(120rpm)孵育反应2小时；
(7)加酶标二抗：弃掉酶标板中的检测抗体工作液，用洗液洗板3次，用样品稀释液将酶标二抗(链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(SA-HRP))配制成浓度为100ng/ml的酶标二抗工作液，然后按照50μl/孔的用量加入酶标板中，置于摇床(120rpm)室温孵育1小时；
(8)显色：将底物的A液和B液(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)，5ml/管，A液、B液各1管)等体积混合；弃掉酶标板中的酶标二抗工作液，用洗液洗板3次，然后按照50μl/孔的用量加入底物，室温避光反应5～10分钟；
(9)终止显色：将终止液按50μl/孔的用量加入酶标板中终止反应，然后应用酶标仪在450nm波长下测定酶标板中各孔的OD值，根据标准品的OD值拟合出标准曲线，并将质控样品的OD值代入方程，计算出质控样品的浓度。
实施例
实施例1QX002N(第一抗体)和抗人IL-17A单克隆抗体(第二抗体)的制备
第一抗体为QX002N，其制备方法在专利号：CN1086409918中公开。
第二抗体为抗人IL-17A单克隆抗体。其制备方法如下：将序列正确的第二抗体重链表达质粒和轻链表达质粒共转染ExpiCHO-S细胞。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×106个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6×106个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞悬液，等待转染。在孔1和孔2中分别加入920μl OptiPRO SFM(购自Gibco)，然后在孔1中加入12.5μg重链和轻链质粒，在孔2中加入80μl ExpiFectamine CHO试剂(购自Gibco)。将孔2转移到孔1中混匀，静置1分钟后加入到细胞中。转染后第一天，加入150μlEnhancer(购自Gibco)和6ml Feed培养液(购自Gibco)。转染后第六天，收获培养上清，用Protein A(
Figure BDA0002704463990000141
A，购自Merck)进行一步纯化，所获得的便为第二抗体。本发明获得的第二抗体为兔单克隆抗体，未进行人源化改造。
通过测序(委托生工生物)获得第二抗体的重轻链完整序列，然后根据Kabat规则(参考文献：Kabat E.A.,Wu T.T.,Bilofsky H.Attempts to locate residues incomplementarity-determining regions of antibody combining sites that makecontact with antigen.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.1976；73:617–619.)即可得到其CDR序列。
实施例2第一抗体和第二抗体特性鉴定
1、第一抗体和第二抗体与人IL-17A的结合实验：
分别用第一抗体和第二抗体包被酶标板(购自Costar)，封闭后加入梯度稀释的人IL-17A(His-tag，购自Novoprotein)，于室温孵育2小时。洗板后加入检测抗体HRP标记的Anti-his抗体(购自Genscript)最后洗板后进行显色，并读取OD450处的吸光度。结果如图1所示，第一抗体和第二抗体均能与人IL-17A特异性结合。
2、抗体识别抗原位点的竞争性抑制实验：
用第一抗体包被酶标板，封闭后先后加入等体积的梯度稀释的第一抗体和第二抗体及一定浓度的人IL-17A，于室温孵育2小时。洗板后加入检测抗体HRP标记的Anti-his抗体，于室温孵育1小时。最后洗板后进行显色，并读取OD450处的吸光度。结果如图2所示，第一抗体和第二抗体与人IL-17A抗原的结合位点不竞争，可将第二抗体作为人IL-17A ELISA试剂盒的检测抗体。
3、检测抗体(第二抗体)生物素标记：
检测抗体的生物素标记使用
Figure BDA0002704463990000152
Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒(购自Thermo)，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。标记完成后，使用ZtbaTM旋转脱盐柱(SpinDesalting Colum)过滤除去游离的生物素，所得溶液即为生物素标记的检测抗体(第二抗体)。
实施例3人IL-17A ELISA定量检测试剂盒
人IL-17A ELISA定量检测试剂盒的组成、规格、来源以及贮存条件等信息如下表1所示。
表1
Figure BDA0002704463990000151
Figure BDA0002704463990000161
实施例4利用实施例3的人IL-17A ELISA试剂盒进行细胞培养液中IL-17A的定量检测
1、样品处理：
分别用样品稀释液和细胞培养液(90％RPMI 1640(购自Hyclone)+10％FBS(购自Gibco))稀释重组人IL-17A蛋白标准品，将用细胞培养液稀释的重组人IL-17A蛋白标准品作为待检样品，根据样品稀释液稀释的重组人IL-17A蛋白标准品的吸光值拟合出标准曲线。将待检样品的OD值代入标准曲线，得出待检样品中人IL-17A的理论浓度值，然后计算出待检样品的回收率(回收率＝理论浓度值/实际浓度值*100)，从而分析实施例3中的ELISA试剂盒用于细胞培养液中人IL-17A的定量检测的可行性。
2、定量检测操作步骤：
(1)包被：采用包被抗体稀释液将包被抗体配制成浓度为1μg/ml的包被抗体工作液，然后按照50μl/孔的用量加入到酶标板中，于4℃静置过夜；
(2)封闭：弃掉酶标板中的包被抗体工作液，用洗液洗板3次，然后按照100μl/孔的用量加入封闭液，置于摇床(120rpm)室温封闭2小时；
(3)重组人IL-17A蛋白标准品配制：取8个EP管并依次编号，从第2管起每管加入100μl样品稀释液并置于EP管架上；用样品稀释液将标准品蛋白配制成浓度为10ng/ml的液体，吸取200μl加入到第1个EP管中，然后从第1个EP管中吸取100μl液体，加入到第2个EP管中进行二倍稀释，依此类推至第7个EP管(最后一管浓度为0)；
(4)加待测样品和标准品：弃掉酶标板中的封闭液，用洗液洗板3次，然后按照50μl/孔的用量加入蛋白标准液和待测样品，置于摇床(120rpm)室温孵育2小时；
(5)加检测抗体：弃掉酶标板中的蛋白标准液和待测样品，用洗液洗板3次，用样品稀释液将检测抗体(生物素标记)配制成浓度为1μg/ml的检测抗体工作液，然后按照50μl/孔的用量加入到酶标板中，置于摇床(120rpm)孵育反应2小时；
(6)加酶标二抗：弃掉酶标板中的检测抗体工作液，用洗液洗板3次，用样品稀释液将酶标二抗配制成浓度为50ng/ml的酶标二抗工作液，然后按照50μl/孔的用量加入到酶标板中，置于摇床(120rpm)室温孵育1小时；
(7)显色：将底物的A液和B液等体积混合；弃掉酶标板中的酶标二抗工作液，用洗液洗板3次，然后按照50μl/孔的用量加入底物，室温避光反应10～15分钟；
(8)终止显色：将终止液按照50μl/孔的用量加入到酶标板中终止反应，然后应用酶标仪在450nm波长下测定酶标板中各孔的OD值，根据标准品的OD值拟合出标准曲线，并将待测样品的OD值代入方程，计算出待测样品中人IL-17A的浓度，即可完成定量检测。
3、检测结果：
(1)重组人IL-17A标准品的检测数据如下表2所示：
表2
Figure BDA0002704463990000171
(2)曲线方程：4-P Fit：y＝(0.105-2.3)/(1+(x/2.28)^1.31+2.3，R2＝0.998(见图3)。
(3)细胞培养液稀释的待测样品检测数据如下表3所示：
表3
Figure BDA0002704463990000181
各个浓度点回收率均在95％～105％之间，表明细胞培养液对实验结果没有影响，该ELISA方法可适用于细胞培养液体系中人IL-17A的含量测定。
4、准确性考察：
(1)在3次不同的实验中，将用细胞培养液稀释的三个已知浓度的人IL-17A(8、2、0.5ng/ml)作为待测样品，分别设置2个复孔，进行人IL-17A的定量检测，分析该试剂盒的准确性。准确性用变异系数CV％表示，等于SD/平均值×100。
(2)结果与讨论如下表4：
表4
Figure BDA0002704463990000182
变异系数CV<10％，表明该检测方法具有良好的准确性。
5、特异性考察：
将不同浓度梯度的人IL-17A、人IL-6和人IL-23蛋白(10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625、0ng/ml)分别加入第一抗体预包被的ELISA试剂盒的检测孔，用实施例4中建立的ELISA检测方法测定每种蛋白在不同浓度的吸光值。结果如图4所示，人IL-17A蛋白组的OD450在不同浓度间呈现出显著的剂量依赖效应，OD450吸光值随着蛋白浓度的增高而升高，而人IL-6和人IL-23蛋白组的吸光值均接近于0，且无剂量依赖效应。实验结果表明，使用实施例3的人IL-17A ELISA试剂盒的检测方法具有良好的特异性。
以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作任何形式的限制。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。
序列表
<110> 江苏荃信生物医药有限公司
<120> 一种新的抗人IL-17A单克隆抗体、包含其的试剂盒及其检测方法
<130> TPD01055
<141> 2020-09-27
<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ser Tyr Tyr Tyr Met Cys
1 5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 2
Cys Ile His Thr Gly Asn Gly Tyr Pro Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
Pro Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Leu
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 4
Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Gln Leu Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 5
Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 6
Gln Gln Ser Ala Ser Tyr Phe Asn Val Ala Asn Thr
1 5 10
<210> 7
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 7
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile His Thr Gly Asn Gly Tyr Pro Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Pro Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Ser Tyr Phe Asn
85 90 95
Val Ala Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 442
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Glu Gly Ser
1 5 10 15
Leu Ala Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Leu Ser Ser Tyr Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Ala Cys Ile His Thr Gly Asn Gly Tyr Pro Tyr Tyr Ala Asn Trp Ala
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu
65 70 75 80
Gln Leu Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Pro Val Gly Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Leu Trp Gly Pro Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser
180 185 190
Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Met Cys
210 215 220
Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp
260 265 270
Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu
275 280 285
Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn
305 310 315 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly
325 330 335
Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu
340 345 350
Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp
405 410 415
Val Phe Thr Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
1 5 10 15
Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Glu Asp Ile Ser Ser Gln
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ala Ser Tyr Phe Asn
85 90 95
Val Ala Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp
100 105 110
Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val
115 120 125
Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro
130 135 140
Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly
145 150 155 160
Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys
180 185 190
Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Asp Cys
210
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Leu Phe Tyr Met Ser
1 5
<210> 12
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 12
Thr Ile His Glu Val Ala Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly
1 5 10 15
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 13
Glu Thr Tyr Ser Ser Arg Tyr Pro Tyr Pro Asn Ile
1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 14
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 15
Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 16
Gln Ser Tyr Asn Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Leu Ala
1 5 10
<210> 17
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 17
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Leu Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile His Glu Val Ala Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Thr Tyr Ser Ser Arg Tyr Pro Tyr Pro Asn Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 18
<211> 110
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asn Thr Ile Ser Thr
85 90 95
Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 450
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 19
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Leu Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile His Glu Val Ala Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Thr Tyr Ser Ser Arg Tyr Pro Tyr Pro Asn Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 20
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asn Thr Ile Ser Thr
85 90 95
Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (11)

1.一种抗人IL-17A单克隆抗体，其特征在于，所述抗体包含：
a)抗体重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3，其中：
CDR-H1如序列SEQ ID NO 1: SYYYMC所示的氨基酸序列，
CDR-H2如序列SEQ ID NO 2: CIHTGNGYPYYANWAKG所示的氨基酸序列，
CDR-H3如序列SEQ ID NO 3: PVGGYDYAMDL所示的氨基酸序列；
b)抗体轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：
CDR-L1如序列SEQ ID NO 4: QASEDISSQLS所示的氨基酸序列，
CDR-L2如序列SEQ ID NO 5: KASTLAS所示的氨基酸序列，
CDR-L3如序列SEQ ID NO 6: QQSASYFNVANT所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含抗体重链可变区HCVR和抗体轻链可变区LCVR，其中：
HCVR如序列SEQ ID NO 7: QSLEESGGDLVQPEGSLALTCKASGFDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIHTGNGYPYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQLTSLTVADTATYFCARPVGGYDYAMDLWGPGTLVTVSS所示的氨基酸序列；
LCVR如序列SEQ ID NO 8: AYDMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDISSQLSWYQQRPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQQSASYFNVANTFGGGTEVVVK所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体包含重链和轻链，其中：
所述重链氨基酸序列如SEQ ID NO 9: QSLEESGGDLVQPEGSLALTCKASGFDLSSYYYMCWVRQAPGKGLEWIACIHTGNGYPYYANWAKGRFTISKTSSTTVTLQLTSLTVADTATYFCARPVGGYDYAMDLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPMCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPTVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK所示的氨基酸序列；
所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO 10: AYDMTQTPASVSAAVGGTVTINCQASEDISSQLSWYQQRPGQPPKLLIYKASTLASGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGVQCADAATYYCQQSASYFNVANTFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC所示的氨基酸序列。
4.一种检测人IL-17A的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一抗体和第二抗体，
所述第一抗体为QX002N；其包含重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：
所述第一抗体QX002N的CDR-H1如序列SEQ ID NO 11: LFYMS所示的氨基酸序列，CDR-H2如序列SEQ ID NO 12: TIHEVASSYYASWAKG所示的氨基酸序列，CDR-H3如序列SEQ ID NO13: ETYSSRYPYPNI所示的氨基酸序列；CDR-L1如序列SEQ ID NO 14: QASQNIGGSLA所示的氨基酸序列，CDR-L2如序列SEQ ID NO 15: GASSLAS所示的氨基酸序列，CDR-L3如序列SEQID NO 16: QSYNTISTYGLA所示的氨基酸序列；
所述第二抗体为抗人IL-17A单克隆抗体，其包含重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，其中：
所述第二抗体的CDR-H1如序列SEQ ID NO 1: SYYYMC所示的氨基酸序列，CDR-H2如序列SEQ ID NO 2: CIHTGNGYPYYANWAKG所示的氨基酸序列，CDR-H3如序列SEQ ID NO 3:PVGGYDYAMDL所示的氨基酸序列；CDR-L1如序列SEQ ID NO 4: QASEDISSQLS所示的氨基酸序列，CDR-L2如序列SEQ ID NO 5: KASTLAS所示的氨基酸序列，CDR-L3如序列SEQ ID NO6: QQSASYFNVANT所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述第一抗体固定至固相载体上，所述第二抗体经生物素标记。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为酶标板。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括：过氧化物酶标记的链霉亲和素、重组人IL-17A蛋白标准品、底物、包被抗体稀释液、洗液、封闭液/样品稀释液和终止液。
8.根据权利要求4~7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
9.根据权利要求4~7中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是改良的双抗夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒。
10.一种定量检测IL-17A含量的方法，其特征在于，使用QX002N为第一抗体，使用权利要求1~3中所述抗体为第二抗体，利用改良的双抗夹心法进行ELISA检测，其中，该方法不涉及疾病的诊断和治疗，
所述QX002N包含重链互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和轻链互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3，
以及CDR-H1如序列SEQ ID NO 11: LFYMS所示的氨基酸序列，CDR-H2如序列SEQ ID NO12: TIHEVASSYYASWAKG所示的氨基酸序列，CDR-H3如序列SEQ ID NO 13: ETYSSRYPYPNI所示的氨基酸序列；CDR-L1如序列SEQ ID NO 14: QASQNIGGSLA所示的氨基酸序列，CDR-L2如序列SEQ ID NO 15: GASSLAS所示的氨基酸序列，CDR-L3如序列SEQ ID NO 16:QSYNTISTYGLA所示的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用第一抗体包被固相载体；
将被测样品加入已包被的固相载体，孵育；
将经生物素标记的第二抗体加入到固相载体，孵育；
将过氧化物酶标记的链霉亲和素稀释，加入到固相载体，孵育；
将底物加入固相载体，避光孵育后加入终止液，测定OD值；
利用重组人IL-17A蛋白标准品的OD值拟合出标准曲线，并将被测样品的OD值代入方程计算出被测样品中人IL-17A的含量，
其中，该方法不涉及疾病的诊断和治疗。
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