CN117720656A - 一种抗人白介素12p70抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种抗人白介素12P70单克隆抗体，及包含所述抗体的CBA试剂盒及其检测方法。具体来说，本申请提供了抗人白介素12P70的抗体、包括该抗体的CBA试剂盒，分别用作CBA方法中的包被抗体和检测抗体。本申请提供的试剂盒可完成人白介素12P70的定量检测，具有较高的特异性和检测灵敏度，开发及应用前景良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域。具体地说，本发明涉及一种抗人白介素12P70抗体及其应用。
背景技术
白介素12P70(IL-12P70)是一种多生物学活性的细胞因子，其在抗瘤免疫中的重要作用是通过巨噬细胞、NK细胞调节的自然抵抗力以及通过Th1细胞、NK1.1+TCRint细胞、CTL细胞介导的获得性免疫之间建立联系的。白介素12P70调节肿瘤患者的免疫应答是肿瘤治疗的一个新的、有前途的策略。因此开发一种高灵敏度的白介素12P70蛋白检测方法学，具有非常重要的临床意义。
IL-12P70在正常人体内含量极低(小于100ng/L)，目前市场上的检测方法均为ELISA法，比如R&D公司的IL-12ELISA试剂盒检测灵敏度为15ng/L，线性区间为31.2-2,000ng/L，批内CV％大于5.5。对于低于31.2ng/L和高于2,000ng/L的患者难以准确测定。因此，本领域需要建立一种高灵敏宽检测区间的IL-12P70的检测方法。
此外，目前市场上的部分检测方法为CBA(Cytometric Bead Array)法。以BD公司的IL-12P70 CBAkit为例，其灵敏度为10ng/L，线性区间为20-5000ng/L。其灵敏度和线性范围仍有待提高。更重要的是，人体中除IL-12P70外还存在IL-12P40、IL-23、IL-35等与IL-12P70具有高度同源性的物质，在检测时容易出现假阳性。
为了提高CBA检测方法的特异性和灵敏度，目前业内的共识是采取抗白介素12P70的单克隆抗体对来开发相应的CBA检测试剂盒。但是，目前市面上针对白介素12P70的CBA检测试剂盒，其灵敏度和特异性普遍较低。并且所使用的小鼠单克隆抗体依赖于传统的杂交瘤方法开发和生产，制备工艺相较于重组单抗更为复杂，也存在较大批间差。因此，利用小鼠单抗所开发ELISA检测试剂盒存在着灵敏度不高、线性范围窄、批间差较难控制等挑战。
现有技术(CN201410837988.7)公开了一种IL-12检测试剂盒，其利用Alphalisa技术进行检测。虽然较ELISA法进行了改进提高了灵敏度、线性范围有所加宽，但是仍存在可以改进的空间。
因此，本领域需要建立一种高灵敏、宽检测区间、高特异性的IL-12P70的检测方法。
发明内容
本发明的目的就是提供一种高灵敏、宽检测区间、高特异性的IL-12P70的检测方法。
本发明提供了一种抗人白介素12P70抗体和抗体组合。
本发明提供了包含抗人白介素12P70抗体组合的检测试剂盒及其应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗人白介素12P70蛋白的抗体，所述的抗体包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区HCVR，所述的轻链包括轻链可变区LCVR，其中，所述的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的CDR-H1；
氨基酸序列如SEQ ID No:3所示的CDR-H2；
氨基酸序列如SEQ ID No:5所示的CDR-H3；
所述的轻链可变区包括以下互补决定区CDR
氨基酸序列如SEQ ID No:7所示的CDR-L1；
氨基酸序列如SEQ ID No:9所示的CDR-L2；
氨基酸序列如SEQ ID No:11所示的CDR-L3。
在另一优选例中，所述重链可变区和轻链可变区分别进一步包括骨架区(FR)。
在另一优选例中，所述的轻重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由骨架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，所述抗体的HCVR氨基酸序列如SEQ ID No:13所示，或与其具有≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗体的LCVR氨基酸序列如SEQ ID No:15所示，或与其具有≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗体的HCVR具有如序列SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，和/或LCVR具有如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链和/或重链进一步包括恒定区。
在另一优选例中，所述的恒定区为人源恒定区。
在另一优选例中，所述抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No:17所示，或与其具有≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID No:19或与其具有≥85％、≥90％、≥95％、≥96％、≥97％、≥98％或≥99％的序列同一性。
在另一优选例中，所述抗体的重链具有如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，和/或轻链具有如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留人白介素12P70蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的30％，较佳地为20％，更佳地为10％。
在另一优选例中，所述的抗体为动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单链抗体、双链抗体、或抗原结合片段。
在本发明的第二方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包括：
(1)如本发明第一方面所述的抗体；和
(2)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述标签包括Fc标签、FLAG标签、6His标签，或其组合。
在本发明的第三方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如本发明第一方面所述的抗体或如本发明第二方面所述的融合蛋白。
在本发明的第四方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统，或其组合。优选地，所述表达载体包括病毒载体，如慢病毒、腺病毒、AAV病毒、逆转录病毒，或其组合。
在本发明的第五方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体、或基因组中整合有外源的如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞。
在本发明的第六方面，提供了一种抗体偶联物，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分为如本发明第一方面所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合。
在另一优选例中，所述抗体部分与所述可检测标记物通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中，所述可检测标记物选自下组：荧光或发光标记物、生物素、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂，或能够产生可检测产物的酶、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、或任何形式的纳米颗粒。
在另一优选例中，所述的可检测标记物为生物素。
在另一优选例中，所述的药物为小分子药物、生物因子、或其组合。
在另一优选例中，所述的药物为细胞毒性药物(毒素)。
在另一优选例中，所述的细胞毒性药物选自下组：抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、或其组合。
在本发明的第七方面，提供了一种抗人白介素12P70蛋白的抗体组合，所述抗体组合包括：
抗体S1，所述S1为如本发明第一方面所述的抗体；和
抗体S2，所述抗体S2的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的CDR-H1，
氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的CDR-H2，
氨基酸序列如SEQ ID No:6所示的CDR-H3；
抗体S2的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
氨基酸序列如SEQ ID No:8所示的CDR-L1，
氨基酸序列如SEQ ID No:10所示的CDR-L2，
氨基酸序列如SEQ ID No:12所示的CDR-L3。
在另一优选例中，所述重链可变区和轻链可变区分别进一步包括骨架区(FR)。
在另一优选例中，所述的轻重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3分别由骨架区FR1、FR2、FR3和FR4所隔开。
在另一优选例中，抗体S1的HCVR具有如序列SEQ ID No:13所示的氨基酸序列和/或LCVR具有如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，抗体S2的HCRV具有如序列SEQ ID No:14所示的氨基酸序列和/或LCVR具有如SEQ ID No:16所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的抗体的轻链和/或重链进一步包括恒定区。
在另一优选例中，所述的恒定区为人源恒定区。
在另一优选例中，抗体S1的重链具有如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，和/或轻链具有如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，抗体S2的重链具有如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列，和/或轻链具有如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，上述氨基酸序列中任意一种还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留人白介素12P70蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的30％，较佳地为20％，更佳地为10％。
在另一优选例中，所述的抗体为动物源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
在另一优选例中，所述的抗体为单链抗体、双链抗体、或抗原结合片段。
在本发明的第八方面，提供了如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第三方面所述的多核苷酸、如本发明第四方面所述的载体、如本发明第五方面所述的宿主细胞、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的抗体组合的用途，用于制备：
i)检测人白介素12P70蛋白的试剂或试剂盒；
ii)治疗人白介素12P70相关疾病的制剂或药物。
在另一优选例中，所述人白介素12P70相关疾病选自下组：炎症相关疾病、肿瘤、自身免疫疾病、或其组合。
在另一优选例中，所述的制剂或药物为液体剂型，较佳地为注射剂。
在另一优选例中，所述的药物为细胞治疗药物。
在本发明的第九方面，提供了一种人白介素12P70蛋白检测试剂盒，所述试剂盒包含如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的抗体组合。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒用于双抗夹心法检测。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒用于CBA检测、ELISA检测和/或胶体金检测。
在另一优选例中，所述的试剂盒为CBA试剂盒。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒包含如本发明第六方面所述的抗体组合，其中，抗体S1固定于载体并用于捕获人白介素12P70蛋白，抗体S2偶联检测标记物。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒中包含微球(如荧光微球)，所述微球包被有所述抗体S1。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒中包括带有生物素的抗体S2。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒进一步包括人白介素12P70蛋白标准品。
在另一优选例中，所述的检测试剂盒进一步包括选自下组的组分：荧光蛋白标记的链霉亲和素、冻干白介素12P70标准品、洗液、样品稀释液、基质缓冲液、或其组合。
在另一优选例中，所述的荧光蛋白为藻红蛋白。
在本发明的第十方面，提供了一种检测样品中白介素12P70的方法，使用如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、如本发明第七方面所述的抗体组合、或如本发明第九方面所述的检测试剂盒进行检测。
在另一优选例中，所述的方法包括以下步骤：
1)将抗体S1固定于载体上；
2)使用可检测标记物标记抗体S2；
3)将所述抗体S1、S2和待测样品共同孵育，从而使抗体S1、S2与样品中的白介素12P70结合；
4)洗去未结合于载体的试剂，检测所述可检测标记物，从而检测白介素12P70。
在另一优选例中，所述的检测为定量检测。
在另一优选例中，所述的载体为微球，较佳地为荧光微球。
在另一优选例中，所述的可检测标记物为生物素。
在另一优选例中，步骤4)中，包括步骤：
加入荧光蛋白标记的亲和素并孵育从而连接抗体S2上的生物素，并对所述荧光蛋白进行检测。
在另一优选例中，所述的亲和素为链霉亲和素。
在另一优选例中，所述的荧光蛋白为藻红蛋白。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：对白介素12P70标准品进行检测从而获得标准曲线，根据标准曲线计算被测样品中白介素12P70的含量。
在另一优选例中，所述的所述白介素12P70为人白介素12P70。
在另一优选例中，所述的待测样品选自下组：细胞培养液、全血、血清、血浆、体液、或其组合。
在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，其含有：
(i)如本发明第一方面所述的抗体、如本发明第三方面所述的多核苷酸、如本发明第四方面所述的载体、如本发明第五方面所述的宿主细胞、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的抗体组合、或其组合；和
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物中还含有其他的治疗炎症相关疾病、肿瘤、或自身免疫疾病的药物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示人IL-12P70免疫小鼠的结果。
图2显示抗人白介素单克隆抗体1#和2#与抗原人IL-12P70、IL-23、IL-35、IL-12P40、IL-12P35结合结果。
图3显示人IL-12P70浓度检测标准曲线图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种抗人白介素12P70抗体及其应用。具体地，本发明提供了一种抗人白介素12P70单克隆抗体及包含该抗体的人白介素12P70 CBA检测试剂盒。本发明的试剂盒具有更高的灵敏度、更宽的检测范围。该试剂盒还具有极高的特异性，能够避免人白介素12P40、人白介素12P35、人白介素23、人白介素35的干扰，使检测更准确，开发及应用前景良好。在此基础上，完成了本发明。
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“治疗有效量”，是指对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。本领域的普通技术人员应该理解，所述的“治疗有效量”可随着药物组合物的形式、给药途径、所用药物的辅料、疾病的严重程度以及与其他药物联合用药等情况的不同而有所不同。
白介素12P70
在本说明书中，属于“人白介素12P70(Human interleukin 12P70，hIL-12P70)”是指一种源自人的蛋白，是由p35和p40两个亚基组成的异源二聚体。P35氨基酸序列如SEQ IDNO:21所示，p40氨基酸序列如SEQ ID No:22所示，其中，下划线部分表示信号肽。
SEQ ID No:21：
MCPARSLLLVATLVLLDHLSLARNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS
SEQ ID No:22:
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
白介素12P70是一种多活性细胞因子，其靶细胞是T细胞，NK细胞和骨髓祖细胞。白介素12P70能促进激活的T细胞和NK细胞增殖，增强T细胞、NK细胞细胞毒活性并诱导其产生γ干扰素(interferon-gamma,IFN-γ)、β肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor beta，TNF-β)等。白介素12P70在Th1/Th2应答平衡中有重要作用，白介素12P70可诱导T母细胞(Thnaive)转化为Th1细胞，并刺激Th1细胞的发育和增殖，从而在细胞介导免疫中发挥重要作用。
IL-12P70是细胞介导免疫中非常重要的细胞因子。其主要免疫调节作用是诱导早期辅助性T母细胞(Th naive)分化为Th1细胞，并促进Th1细胞的发育和增殖。辅助性T细胞(helper T cell，Th)是细胞介导免疫应答和B淋巴细胞产生抗体所必需的，可分为Th1和Th2两个亚群。前者产生IL-2、IL-3、IFN-γ和淋巴毒素及粒细胞2巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等，参与细胞免疫；而后者则产生IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等细胞因子，辅助B细胞产生抗体，参与体液免疫。IL-12P70能促进T细胞和NK细胞的增殖。对外周血分离T细胞、培养T细胞克隆、CTL细胞系和TIL细胞都有启动生长增殖效应，IL-12P70还可刺激CD4+和CD8+的TCR-αβ+T细胞或TCR-γδ+淋巴母细胞的增殖，该效应独立于IL-2。IL－12P70还可刺激NK细胞和T细胞产生IFN-γ，发挥免疫调节功能。
本发明提供了用于检测白介素12P70(特别是人白介素12P70)的抗体、检测试剂盒及检测方法。
抗体
在本申请中，术语“抗体”应作最广泛的意义上的解释，具有各种抗体结构，包括但不限于Y型抗体、所谓的全长抗体、Y型抗体的抗原结合部分，以及它们的遗传学或化学修饰。其中，“抗原结合部分”是指Y型抗体的一个或多个部分或片段，可以保留该抗体与小鼠白介素12P70p70特异性结合的能力。
在本申请中，术语“单克隆抗体”(mAb)包括具有基本相同的抗原决定簇的高度同质的抗体群。即在该抗体群中，单个抗体基本上是相同的，除了可能自然发生的少量突变。单克隆抗体可以对抗原上的特定表位显示出单一的结合特异性和亲和力。与通常包含针对不同表位的多克隆抗体相比，每个单克隆抗体可以针对抗原上相同或基本相同的表位。修饰词“单克隆”表示抗体的特性是从一个基本同质的抗体群体中获得的，并且不能被解释为需要通过任何特定的方法制得的抗体。该抗体可以通过多种方法制备，包括但仅限于杂交瘤法、重组DNA法、噬菌体抗体库以及类似的方法制得。
在本申请中，术语“鼠抗体”或“抗人白介素12P70p70单克隆抗体”或者类似术语中的修饰词“鼠”表示该抗体的互补决定区(CDR)来源于鼠源免疫球蛋白序列。在其中一个实施例中，抗人白介素12P70p70鼠单克隆抗体可以包含来自兔源免疫球蛋白序列的抗体的CDR和骨架区(FR)。在其中一个实施例中，抗人白介素12P70p70的鼠抗体或鼠单克隆抗体可以包含来自鼠源免疫球蛋白序列的抗体的CDR。在其中一个实施例中，抗人白介素12P70p70鼠单克隆抗体可以为CDR区来源于鼠源免疫球蛋白序列、而FR来自于其他哺乳动物的种系免疫球蛋白序列(如小鼠或人类)的一种抗体。术语“抗人白介素12P70p70鼠单克隆抗体”也可能包含具有非兔源免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基的抗体，例如，由体外随机突变或点特异性突变引入的、或体内体细胞突变引入的突变。然而，术语“抗人白介素12P70p70鼠单克隆抗体”并不包括CDR区来自其他哺乳动物的种系(如人)的抗体。
在本申请中，术语“抗体”是指，由四条异源性多肽链组成的免疫球蛋白分子，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。重链可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，分别占重链和轻链的1/4和1/2；将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，分别占重链和轻链的3/4和1/2。
重链和轻链的V区分别称为VH和VL。VH和VL中各含有3个氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域，称为高变区(hypervariable region，HVR)或互补决定区(complementaritydetermining region，CDR)，包括HVRl(CDRl)、HVR2(CDR2)和HVR3(CDR3)，其中，HVR3(CDR3)变化程度更高。VH和VL的3个CDR共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性，是抗体识别及结合抗原的部位。在V区中，CDR之外区域的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)。VH或VL各有四个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示。
重链和轻链的C区分别称为CH和CL。不同型(κ或λ)Ig的CL长度基本一致，但是不同类Ig的CH长度不同，如IgG、IgA和IgD包括CH1、CH2和CH3，而IgM和IgE则包括CHl、CH2、CH3和CH4。
在本申请中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。特异性结合相互作用的强度或亲和力可以用该相互作用的平衡解离常数(KD)表示。在本申请中，术语“KD”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。
在本申请中，术语“载体”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可以含有多种控制表达的元件，包括但不限于，启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。
在本申请中，术语“保守性置换”意指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白/多肽的预期性质的氨基酸置换。保守氨基酸置换包括用具有相似侧链的氨基酸残基替代氨基酸残基的置换，例如用在物理学上或功能上与相应的氨基酸残基相似(具有相似大小、形状、电荷、化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等)的残基进行的置换。这些保守性置换最好根据下表进行氨基酸替换而产生。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
如本文所用，术语“载体”、“表达体系”或“表达载体”是指以可操作的连接含有所需的编码序列和控制序列的核酸序列，以使得用这些序列转化的宿主能产生编码的蛋白质。为实现转化，该表达体系可包含在载体上；然而，相关核酸分子可随后也整合在宿主染色体中。
如本文所用，术语“宿主细胞”是一种细胞，其可支持表达载体的复制或表达。宿主细胞可为原核细胞如大肠杆菌，或真核细胞如酵母细胞，昆虫细胞，两栖动物细胞，或哺乳动物细胞。
如本文所用，术语“转染”、“稳转”或“瞬时转染”是指表达载体被宿主细胞吸收，无论任何编码序列是否实际被表达。本领域技术人员已知多种转染方法。例如，转染在表达载体和高浓度的磷酸钙的存在下，通过电穿孔，通过使用噬菌体或病毒表达载体以插入宿主细胞，通过机械插入核酸，甚至通过在未包装的(unpackaged)核酸片段的存在下培养宿主细胞而完成。通常当操作感兴趣的载体的任何指示在宿主细胞中出现时确认转染成功。
抗人白介素12P70单克隆抗体
本申请提供了一种分离的抗人白介素12P70单克隆抗体，所述单克隆抗体包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)，其中：
CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示；
CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示；
CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示；
CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示；
CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID No:9所示；
CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID No:11所示。
在一个具体的实施方式中，上述单克隆抗体包含抗体重链可变区HCVR和抗体轻链可变区LCVR，其中：
HCVR的氨基酸序列如SEQ ID No:13所示；
LCVR的氨基酸序列如SEQ ID No:15所示。
在一个具体的实施方式中，本申请的抗人白介素12P70单克隆抗体为抗人白介素12P70单克隆抗体1#，其重链具有如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，其轻链具有如SEQ IDNo:19所示的氨基酸序列。
本发明还提供了一种抗体组合，其包括本发明第一方面所述的抗体(S1)和第二抗体S2。在一个具体的实施方式中，第二抗体的CDR-H1具有如SEQ IDNo:2所示的氨基酸序列，
CDR-H2具有如SEQ ID No:4所示的氨基酸序列，
CDR-H3具有如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列，
CDR-L1具有如SEQ ID No:8所示的氨基酸序列，
CDR-L2具有如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列，
CDR-L3具有如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列。
在一个具体的实施方式中，抗体S2包含抗体重链可变区HCVR和抗体轻链可变区LCVR，其中：
HCVR的氨基酸序列如SEQ ID No:14所示；
LCVR的氨基酸序列如SEQ ID No:16所示。
在一个具体的实施方式中，抗体S2为抗人白介素12P70单克隆抗体2#，其重链具有如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列，其轻链具有如SEQ ID No:20所示的氨基酸序列。
在本说明书中，“分离的”抗体是已经与它的天然环境的组分分离的抗体。在某些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来确定。关于评价抗体纯度的方法，是本技术领域公知的，例如可以参见：Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
在本说明书中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
在本说明书中，“抗人白介素12P70单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人白介素12P70，使得所述单克隆抗体可用作靶向人白介素12P70的疾病诊断剂和/或治疗剂。
在本说明书中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(K D)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测量亲和力。
本申请的抗人白介素12P70(IL-12)单克隆抗体和与靶标无关的蛋白不结合。这里，“无关的蛋白”是指除作为靶标的人白介素12P70以外的其他蛋白；这里，“不结合”是指：在将本发明的抗人白介素12P70(IL-12)单克隆抗体与作为其靶标的人白介素12P70的结合能力作为100％的情况下，本申请的抗人白介素12P70(IL-12)单克隆抗体与所述无关蛋白的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
本申请的抗人白介素12P70(IL-12)单克隆抗体与其他动物种属的白介素12P70不结合。这里，“其他动物种属”是指除人以外的其他动物种属，例如恒河猴、食蟹猴、大鼠、小鼠等；这里，“不结合”是指：在将本发明的抗人白介素12P70(IL-12)单克隆抗体与作为其靶标的人白介素12P70的结合能力作为100％的情况下，本发明的抗人白介素12P70(IL-12)单克隆抗体与其他动物种属的白介素12P70的结合能力小于10％，例如9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或者0。
本申请的抗人白介素12P70(IL-12)单克隆抗体对于人白介素12P70具有≤1μM、≤100nM、≤50nM、或≤40nM的平衡解离常数(KD)。
本申请的抗人白介素12P70(IL-12)单克隆抗体在诸多生物活性方面与上市同类单抗产品相当、或优于上市同类单抗产品。所述生物活性例如抑制IL-12诱导的细胞中STAT3磷酸化的活性、抑制IL-12诱导的小鼠脾脏细胞释放IL-17A的活性、抑制IL-12诱导的人NK细胞释放IFN-γ活性。
进一步的，本申请中的抗人白介素12P70单克隆抗体均为鼠单克隆抗体。
CBA
Cytometric Bead Array(CBA)，即细胞因子微球检测技术。是一种基于流式细胞检测系统的多重蛋白定量检测方法，它能够同时对单个样品中的多个指标进行检测。BD公司利用流式细胞仪可对荧光信号进行级数放大的特性，将受检的可溶性因子附着于一些具有近似细胞直径的微粒上，即可对受检样品中的各种可溶性因子进行检测。CBA的基本原理近似于ELISA的检测，即利用微小、分散的颗粒捕获液体待测物，并利用流式细胞仪检测类似“三明治”的颗粒——待测物复合体所散发的荧光，从而测定待测物的数量。
每个CBA微球大小一致，具有特定的荧光强度，包被有适用于特定分析(如其它抗体或者可溶性蛋白)的特异性捕获抗体(Capture Antibody)，提供了类似ELISA孔板的捕获表面。当微球和待测样品溶液混合后，微球上的特异性抗体就与样品(血清、血浆或者细胞培养液)中相应的抗原或蛋白结合，然后加入荧光标记的检测抗体，就会形成“三明治”夹心复合物。最后通过流式细胞仪对特异性目的蛋白进行检测。CBA的每种微球携带有不同强度的红色荧光，在流式细胞仪的FL3通道通过检测微球荧光强度的差异对目的蛋白定性；检测抗体带有PE荧光素标记，在流式细胞仪的FL2通道检测，通过检测抗体的PE荧光强度定量目的蛋白。
在本说明书中，“亲和素(avidin)”是一种糖蛋白，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素(streptavidin)。
在本说明书中，生物素是动植物体内广发分布的一种小分子生长因子，又名辅酶R或维生素H。亲和素是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白，对生物素有非常高的亲和力。结合了酶的亲和素分子与结合有特异性抗体的生物素分子产生反应，既起到了多级放大作用，又由于酶在遇到相应底物时的催化作用而显色，达到测定其所结合的抗体量的作用。因此把亲和素和生物素与CBA结合起来，就可大大提高CBA的灵敏度。生物素-亲合素系统在CBA中的应用有多种形式，可用于间接包被，亦可用于终反应放大。在常规CBA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素-酶偶联物，以放大反应信号。
检测试剂盒
本发明提供了用于检测人白介素12P70的检测试剂盒，其包含本发明的抗体或抗体组合。
在一种实施方式中，检测试剂盒使用双抗体夹心法(三明治法)进行检测。本发明的检测方法可以使用CBA检测。
在一个具体的实施方式中，本申请的试剂盒中的抗人白介素单克隆抗体包括第一抗体和第二抗体，其中第一抗体为包被抗体，其已固定至固相载体(如微球)上；第二抗体为检测抗体，其由生物素进行标记。优选的，所述微球粒径为荧光微球。进一步优选的，粒径为5μm。在具体的实施方式中，可以采用中国纳微的聚苯乙烯微球。
在一个具体的实施方式中，所述第一抗体和第二抗体为本申请的抗人白介素12P70单克隆抗体。
在一个具体的实施方式中，所述CBA试剂盒中的第一抗体为抗人白介素12P70单克隆抗体1#，其重链具有如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列，轻链具有如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列；第二抗体为抗人白介素12P70单克隆抗体2#，其重链具有如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列，轻链具有如SEQ IDNo:20所示的氨基酸序列。
进一步的，所述CBA试剂盒中还包括对于检测白介素12P70所必需的装置或试剂。
具体的，所述CBA试剂盒中还包括过氧化物酶或荧光蛋白标记的链霉亲和素、白介素12P70标准品、底物、包被抗体稀释液、洗液、封闭液/样品稀释液和终止液。
在一个具体的实施方式中，所述荧光蛋白优选为藻红蛋白(PE)，其标记的链霉亲和素为链霉亲和素-藻红蛋白偶联物(SA-PE)。
在一个具体的实施方式中，所述试剂盒中的白介素12P70标准品为人IL-12蛋白；包被抗体稀释液为磷酸盐缓冲液(PBS)pH7.4；洗液为磷酸盐缓冲液(PBS)含0.05％Tween20；封闭液/样品稀释液为磷酸盐缓冲液(PBS)含0.5％BSA、0.05％Tween20和0.05％Proclin300。
优选的，所述CBA试剂盒包括以下成分：
1)预包被抗体的微球：抗人白介素12P70单克隆抗体1#(即第一抗体)，2.5mL/管，1管；
2)检测抗体：抗人白介素12P70单克隆抗体2#(即第二抗体)(以生物素标记)，2.5mL/管，1管；
3)标准品：冻干人IL-12P70蛋白，10ng/管，1管；
4)链霉亲和素-藻红蛋白偶联物(Streptavidin-PE，简称SA-PE)，2.5mL/管，1管；
5)基质缓冲液：2.5ml/管，1管；
6)洗涤缓冲液：磷酸盐缓冲液(10XPBST)，pH 7.4，5ml/瓶，1瓶；
检测方法
本发明还提供了利用本发明的抗体或试剂盒进行白介素12P70检测的方法。本发明的检测方法可以是双抗体夹心法。本发明的检测方法可以使用CBA检测。
本发明通过对抗人白介素12P70单克隆抗体进行生物素标记，从而可以与藻红蛋白标记链霉亲和素形成抗体-生物素-亲合素系统(Antibody-Biotin-Avidin-System，ABAS)，其高亲合力的牢固结合可以起到多级放大效应，使本申请的试剂盒具有更高的灵敏度、更宽的检测范围。
一种具体的方法为，将已知量的第一抗体，与固相载体表面结合。然后将被测样品施加至所述表面，使得其中所存在的任何细胞和/或血清中的白介素12P70物质被已固定的第一抗体俘获。通过一个或多个洗涤步骤优选地移除未结合的物质。然后加入由生物素进行标记的第二抗体，即检测抗体，并且允许结合被所述第一抗体所俘获的任何细胞和/或血清中的白介素12P70物质，使每一单位的白介素12P70同时结合两种抗体形成“夹心”。然后在直接或间接检测方法中测定所结合的第二抗体的量。具体的，标记或酶可以直接地或经由诸如生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素连结之类的连结间接地连接至所述第二抗体。
在一种实施方式中，本发明的检测方法包括以下步骤，
使用抗人白介素12P70单克隆抗体1#(即第一抗体)包被荧光微球；
将生物素标记于抗人白介素12P70单克隆抗体2#(即第二抗体)上；
将已包被第一抗体的微球、被测样品以及生物素标记的第二抗体依次加入流式管，孵育；
将藻红蛋白标记的链霉亲和素加入到流式管，孵育；
利用白介素12P70标准品的MFI值拟合出标准曲线，并将被测样品的MFI值代入方程计算出被测样品中白介素12P70的含量。
在一个具体的实施方式中，采用本申请的CBA试剂盒定量检测样品中的人白介素12P70含量大方法包括以下步骤：
(1)包被：采用包被抗体稀释液(磷酸盐缓冲液(PBS)，pH 7.4)将包被抗体抗人白介素12P70单克隆抗体1#(即第一抗体)配制成浓度为1g/L的包被抗体工作液，然后按照10μg/1E7个微球的比例混匀于干净EP中，室温孵育2小时；
(2)封闭：离心弃掉EP管中的包被抗体工作液，用洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲液(PBS)含0.05％Tween20)洗涤2次，然后按照100μL/孔的用量加入封闭液(磷酸盐缓冲液(PBS)含0.5％BSA、0.05％Tween20和0.05％Proclin300)，置于摇床(120rpm)室温封闭2小时；
(3)蛋白标准品配制：取7个EP管并依次编号，第1-6管每管加入150μL样品稀释液并置于EP管架上；用样品稀释液将标准品蛋白(人IL-12P70蛋白)配制成浓度为10μg/L的液体，吸取50μL加入到第1个EP管中，然后从第1个EP管中吸取50μL液体，加入到第2个EP管中进行四倍稀释，依此类推至第6个EP管，其浓度依次为10000pg/mL、2500pg/mL、625pg/mL、156.3pg/mL、39.6pg/mL、9.7pg/mL、2.4pg/mL；
(4)加样：按照25μL/管的用量依次加入包被第一抗体的微球、蛋白标准液、生物素标记的第二抗体，置于摇床(500rpm)室温孵育2小时；
(5)加SA-PE：按照25μL/管的用量加入EP中，置于摇床(500rpm)孵育反应0.5小时；
(6)洗涤：离心弃掉EP管中的反应液，用洗液洗涤2次，用样品稀释液将微球重悬；
(7)检测：应用流式细胞仪在585nm波长下测定各EP管的MFI值，根据标准品的OD值拟合出标准曲线。
本申请的抗体、检测试剂盒以及检测方法可以应用于检测细胞培养液、或人体血清中白介素12P70的用途。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可含有与本发明抗人白介素12P70抗体连接的任意抗肿瘤药物(如抗肿瘤抗体)，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
1)本发明提供了特异性靶向人白介素12P70的抗体和抗体对，其用于CBA试剂盒检测人白介素12P70能够大幅扩大检测范围，提升检测灵敏度。多次重复检测显示其具有高准确度。
2)本发明的抗体和组合不与人白介素12P40、人白介素12P35、人白介素23、人白介素35交叉反应，避免了相似细胞因子的干扰，提升了检测特异性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1抗人白介素12P70单克隆抗体的筛选和制备
制备人白介素12P70(IL-12)，用于免疫Balb/c小鼠，免疫效价达标后收集制备B细胞悬液，用于分选。图1显示了人IL-12P70免疫小鼠的结果，横坐标为采集不同小鼠尾静脉血清后进行稀释的倍数，纵坐标为OD50值，结果表明免疫效价均达到了预期，挑选其中一只小鼠进行单B细胞分选。首先，利用细胞表面Marker及抗原筛选出特异性记忆B细胞。随后利用DeepLight On-chip Cell Screening平台进行分选，获得特异性浆细胞，挑选出与IL-12P70结合的单B细胞，经过短期培养后用Binding ELISA进行正/反向筛选检测，挑选出与IL-12P70结合并且与IL-12P40、IL-23、IL-35无结合活性的单克隆，从而筛选获得第一抗体和第二抗体。所获得的第一抗体和第二抗体为鼠单克隆抗体，并进行人鼠抗体嵌合。以上免疫和筛选过程委托给德泰生物完成。
通过测序获得第一抗体和第二抗体的重轻链可变区序列，根据Kabat规则定义其CDR序列。抗体序列如表1所示。
表1抗体序列
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实施例2抗人白介素12P70单克隆抗体的特性鉴定
1、抗体识别抗原特异性实验：
用包被液稀释人IL-23、IL-35、IL-12P40、IL-12P35至10μg/mL，2-8℃包被酶标板过夜，次日室温封闭2h。洗板后加入稀释的细胞培养上清100μL，室温孵育1小时。洗板后加入稀释好的酶标二抗，室温孵育1小时。最后洗板后进行显色，并读取OD 450处的吸光度。结果如图2所示，1#和2#抗体和人IL-23、IL-35、IL-12P40、IL-12P35抗原没有结合，说明1#和2#抗体对IL-12P70蛋白具有很好的特异性。可将这部分抗体进行配对实验。其中抗体1#和2#的检测结果如表2所示。
表2抗体特异性检测
2、抗人IL-12P70抗体配对实验
使用Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒对2株抗体进行生物素标记，具体步骤严格按照试剂盒说明书进行。标记完成后，使用透析袋透析除去游离的生物素，所得溶液即为生物素标记的抗体。
用包被液分别稀释2株抗体至10μg/mL，2-8℃包被荧光微球，室温孵育2h。离心后加入封闭液，室温封闭2小时。洗涤后加入保存液，计数备用。
依次加入基质缓冲液、人IL-12P70蛋白、包被抗体的微球、生物素标记的抗体，室温孵育2小时。随后加入稀释好的藻红蛋白标记链霉亲和素，室温孵育0.5小时。最后洗涤后使用流式细胞仪读取荧光值。结果如下表3所示，抗体1#和抗体2#可配对用于组装检测人IL-12P70 CBA定量检测试剂盒。
表3抗体配对检测结果
实施例3人IL-12P70 CBA定量检测试剂盒的组成
将所述抗体1#包被荧光微球作为捕获抗体、所述抗体2#进行生物素标记作为检测抗体制备CBA试剂盒，该试剂盒中的试剂组成、规格、来源以及贮存条件等信息如表4所示。
1)预包被抗体的微球：抗人白介素12P70单克隆抗体1#(即第一抗体)，2.5mL/管，1管；
2)检测抗体：抗人白介素12P70单克隆抗体2#(即第二抗体)(以生物素标记)，2.5mL/管，1管；
3)标准品：冻干人IL-12P70蛋白，10ng/管，1管；
4)链霉亲和素-藻红蛋白偶联物(Streptavidin-PE，简称SA-PE)，2.5mL/管，1管；
5)基质缓冲液：2.5mL/管，1管；
6)洗涤换成液：磷酸盐缓冲液(10XPBST)，pH 7.4，5mL/瓶，1瓶；
组分如下表4所示：
表4 CBA试剂盒成分组成
| 组份 | 主要成分 | 含量 | 贮存 |
| 捕获抗体 | 抗体1#包被的荧光微球 | 2.5Ml，1瓶 | 2-8℃1年 |
| 检测抗体 | 生物素标记的抗体2# | 2.5Ml，1瓶 | 2-8℃1年 |
| 标准品 | 人IL-12P70蛋白 | 10ng，1管 | -20℃1年 |
| SA-PE | 链霉亲和素-藻红蛋白偶联物 | 2.5Ml，1瓶 | 2-8℃1年 |
| 基质缓冲液 | BSA、蛋白保护剂 | 5Ml，1瓶 | -20℃1年 |
| 洗涤缓冲液 | 10XPBST | 5Ml，1瓶 | 室温1年 |
实施例4人IL-12P70 CBA试剂盒性能指标评估
采用实施例3中的人IL-12P70 CBA试剂盒对质控样品中的人IL-12P70进行定量检测。
1、线性范围：
(1)用样品稀释液稀释人IL-12P70蛋白配制蛋白标准品，用细胞培养液稀释人IL-12P70蛋白配制质控样品作为待检样品。根据蛋白标准品的吸光值拟合出标准曲线。将待检样品的MFI值代入标准曲线，得出待检样品中人IL-12P70的理论浓度值，然后计算出待检样品的回收率(回收率＝理论浓度值/实际浓度值*100％)，从而分析实施例3中的CBA试剂盒用于细胞培养液中人IL-12P70的定量检测效果。
(2)定量检测操作步骤：
1)蛋白标准品配制：取8个EP管并依次编号，从第2管起每管加入300μL样品稀释液并置于EP管架上；用样品稀释液将标准品蛋白配制成浓度为10ng/mL于第1管，吸取100μL加入到第2个EP管中，进行四倍稀释，依此类推至第7个EP管。浓度依次为10000pg/mL、2500pg/mL、625pg/mL、156.3pg/mL、39.6pg/mL、9.7pg/mL、2.4pg/mL；
2)质控样品配制：取5个EP管，分别从10000pg/mL取样，配制成6250pg/mL、1250pg/mL、250pg/mL、50pg/mL、10pg/mL、2pg/mL的质控样品；
3)加样：按照25μL/管的用量依次加入基质缓冲液、蛋白标准液、包被第一抗体的微球、生物素标记的第二抗体，置于摇床(500rpm)室温孵育2小时；
4)加SA-PE：按照25μL/管的用量加入EP中，置于摇床(500rpm)孵育反应0.5小时；
5)洗涤：离心弃掉EP管中的反应液，用洗液洗涤2次，用样品稀释液将微球重悬；
6)检测：应用流式细胞仪在585nm波长下测定各EP管的MFI值，根据标准品的OD值拟合出标准曲线，并将质控样品的OD值代入方程，计算出质控样品的浓度。
(3)结果与讨论
1)人IL-12P70标准品的线性范围检测数据如表5所示：
表5人IL-12P70标准品的检测数据
| pg/mL | 检测1 | 检测2 | 检测3 | 平均值(M) | 回收率(％) |
| 0.0 | 307 | 290 | 312 | 303 | / |
| 2.4 | 532 | 542 | 535 | 536 | 90.7 |
| 9.8 | 1280 | 1187 | 1284 | 1250 | 95.9 |
| 39.1 | 4264 | 4113 | 4275 | 4217 | 100.0 |
| 156.3 | 14841 | 16035 | 15892 | 15589 | 103.0 |
| 625 | 57637 | 57687 | 58064 | 57796 | 105.0 |
| 2500 | 196262 | 187406 | 187765 | 190478 | 102.8 |
| 10000 | 485144 | 495746 | 49357 | 491488 | 99.6 |
人IL-12P70的检测曲线在2.4～10000pg/mL浓度范围均能够回收。
2)曲线方程如图3所示：4-P Fit：Log10(y)＝-0.0084{Log10(x)}4+0.0305{Log10(x)}3+0.077{Log10(x)}2+0.5415{Log10(x)}+2.491，R2＝0.9999。
2.特异性
(1)取不同的细胞因子稀释到浓度为10ng/mL，按照试剂盒操作检测其浓度。试剂盒的特异性用交叉反应率(％)表示。其计算方法为：交叉反应率(％)＝检测浓度/名义浓度×100％。
(2)人IL-12P70试剂盒特异性检测数据如表6所示。
表6
| 细胞因子名称 | 浓度 | 检测1 | 检测2 | 检测3 | 平均值 | 交叉反应率 |
| IL-12P40 | 10ng/mL | 0.0003 | 0.0002 | 0.0003 | 0.0003 | 0.003％ |
| IL-12P35 | 10ng/mL | 0.0002 | 0.0003 | 0.0002 | 0.0002 | 0.002％ |
| IL-23 | 10ng/mL | 0.0003 | 0.0005 | 0.0003 | 0.0003 | 0.003％ |
| IL-35 | 10ng/mL | 0.0005 | 0.0004 | 0.0002 | 0.0003 | 0.003％ |
(3)结果与讨论：
表6结果显示，相关细胞因子的交叉反应率≤0.005％。上述结果表明，使用本申请提供的人IL-12P70 CBA试剂盒定量检测样品的人IL-12P70时，不受样本中相关细胞因子的干扰，说明本申请提供的检测方法具有良好的特异性。
3、准确度：
(1)在3批不同的实验中，每个分析批包含3套待测样品，每套待测样品包含6个浓度(2、10、50、250、1250、6250pg/mL)。方法的精密度用变异系数CV％表示，CV％＝SD/平均值×100。准确度用相对误差RE％表示，RE％＝(平均观测浓度-名义浓度)/名义浓度×100。通过上述参数分析该试剂盒检测的准确性。分析结果如表7所示。
表7待测样品检测数据
(2)结果与讨论：
表7结果显示，6个浓度水平的批内变异系数CV％≤5％。准确度(RE％)≤5％。上述结果表明，使用本申请提供的人IL-12P70 CBA试剂盒定量检测样品的人IL-12P70可以满足批内变异系数≤5％和准确度(RE％)≤5％，说明本申请提供的检测方法具有良好的准确性。
4、精密度：
(1)在3批不同的实验中，每个分析批包含3套待测样品，每套待测样品包含6个浓度(2、10、50、250、1250、6250ng/L)。方法的精密度用批间变异系数CV％表示，CV％＝SD/平均值×100％。通过上述参数分析该试剂盒检测的再现性。分析结果如表8所示。
表8对人IL-12P70的定量检测精密度实验数据
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(2)结果与讨论：
表8结果显示，6个浓度水平(包含了低、中、高各2个浓度)的批间变异系数CV％≤5％。上述结果表明，使用本申请提供的人IL-12P70 CBA试剂盒定量检测样品的人IL-12P70可以满足批间变异系数≤5％，说明本申请提供的检测方法具有良好的再现性。
5、灵敏度：
(1)在3批不同试剂盒的实验中，每个分析批分别检测20次样品稀释液。灵敏度计算方法为：计算测定结果平均值M、标准差SD，将平均值M加上2倍标准差SD的数值带入实施例4中的标准曲线，计算得到的结果即为灵敏度。分析结果如表9所示。
表9人IL-12P70CBA检测试剂盒灵敏度实验数据
| 检测1 | 检测2 | 检测3 | |
| MFI均值(M) | 303.9 | 287.0 | 309.8 |
| 标准差SD | 8.2 | 7.7 | 8.6 |
| M+2SD | 320.3 | 302.4 | 327.0 |
| 灵敏度(pg/mL) | 0.14 | 0.13 | 0.16 |
(2)结果与讨论：
表9结果显示，2个批次的试剂盒的灵敏度均≤0.5pg/mL。上述结果表明，本申请提供的试剂盒具有良好的灵敏性。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种抗人白介素12P70蛋白的抗体，其特征在于，所述的抗体包括重链和轻链，所述的重链包括重链可变区HCVR，所述的轻链包括轻链可变区LCVR，其中，所述的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的CDR-H1；
氨基酸序列如SEQ ID No:3所示的CDR-H2；
氨基酸序列如SEQ ID No:5所示的CDR-H3；
所述的轻链可变区包括以下互补决定区CDR
氨基酸序列如SEQ ID No:7所示的CDR-L1；
氨基酸序列如SEQ ID No:9所示的CDR-L2；
氨基酸序列如SEQ ID No:11所示的CDR-L3。
2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的HCVR具有如序列SEQ ID No:13所示的氨基酸序列，和/或LCVR具有如SEQ ID No:15所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，所述抗体的重链具有如SEQ IDNo:17所示的氨基酸序列，和/或轻链具有如SEQ ID No:19所示的氨基酸序列。
4.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括：
(1)如权利要求1所述的抗体；和
(2)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1所述的抗体或如权利要求4所述的融合蛋白。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有如权利要求6所述的载体、或基因组中整合有外源的如权利要求5所述的多核苷酸。
8.一种抗体偶联物，其特征在于，该抗体偶联物含有：
(a)抗体部分，所述抗体部分为如权利要求1所述的抗体；和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、或其组合。
9.一种抗人白介素12P70蛋白的抗体组合，其特征在于，所述抗体组合包括：
抗体S1，所述S1为如权利要求1所述的抗体；和
抗体S2，所述抗体S2的重链可变区包括以下互补决定区CDR：
氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的CDR-H1，
氨基酸序列如SEQ ID No:4所示的CDR-H2，
氨基酸序列如SEQ ID No:6所示的CDR-H3；
抗体S2的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：
氨基酸序列如SEQ ID No:8所示的CDR-L1，
氨基酸序列如SEQ ID No:10所示的CDR-L2，
氨基酸序列如SEQ ID No:12所示的CDR-L3。
10.如权利要求1所述的抗体、如权利要求5所述的多核苷酸、如权利要求6所述的载体、如权利要求7所述的宿主细胞、如权利要求8所述的抗体偶联物、或如权利要求9所述的抗体组合的用途，其特征在于，用于制备：
i)检测人白介素12P70蛋白的试剂或试剂盒；
ii)治疗人白介素12P70相关疾病的制剂或药物。
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| CN (1) | CN117720656A (zh) |
-
2023
- 2023-12-28 CN CN202311836939.7A patent/CN117720656A/zh active Pending
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