TW202144435A - 一種抗cd19抗體的抗體及其製備和應用 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種標靶CD19抗體的抗體、其製備方法和用途。具體地，本發明公開了一種新的標靶CD19抗體的抗體。本發明還公開了製備所述的單株抗體的方法。本發明的單株抗體能夠高特異性地結合CD19抗體並阻斷CD19抗體的功能。

Description

一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用
本發明涉及生物醫藥領域，更具體地涉及一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用。
抗體是生物體在抗原刺激下產生的具有保護作用的蛋白質，由漿細胞分泌到血液等體液中。抗體可以與抗原特異性結合，起到中和毒素、阻止病原體入侵等作用。根據抗體與抗原特異結合的特性，可以開發針對疾病特異性生物標的的抗體藥物用於治療疾病。抗體藥已經應用到抗腫瘤領域和自體免疫的治療，同時在抗病毒和細菌感染、心腦血管、糖尿病以及罕見病治療等領域也發揮越來越重要的作用，是當前生物藥中複合增長率最高的一類藥物。
CD19是簇分化抗原的一種，是B細胞增殖、分化、活化及抗體產生有關的重要膜抗原。絕大多數的B細胞性惡性腫瘤表面都高度表現CD19，多個中心獨立開展的利用嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)修飾的T細胞標靶表現CD19的B細胞復發、難治性惡性腫瘤取得了前所未有的成功。以CAR-T爲首的免疫療法給無數患者帶來了“治癒癌症”的希望，但CAR-T在具有突出有效性的同時，也有著一個亟待解决的問題，那就是嚴重的副作用——細胞激素風暴(CRS)。
細胞激素風暴是指在對人體完成CAR-T輸液後，T淋巴細胞在體內被活化並快速增殖，引起了TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12等細胞激素過度的級聯釋放。這些細胞激素會媒介多種免疫反應，引起患者高燒、低血壓、肌痛、凝血障礙、呼吸困難、終末器官障礙等臨床表現，有可能對人體的組織器官造成嚴重的永久性損傷或衰竭，甚至導致死亡。簡而言之，細胞激素風暴就是在CAR-T治療過程中，體內免疫細胞爆發性分泌大量的細胞激素所造成的嚴重非特異性發炎反應。
然而，在體內標的細胞(癌細胞)的刺激下，CAR-T細胞才會快速增殖、釋放大量的細胞激素，從而透過細胞激素毒殺標的細胞。因此，細胞激素風暴不可片面的認定爲CAR-T的副作用，也是CAR-T在體內有效的臨床表現。目前，在CAR-T臨床治療中，尚無法避免細胞激素風暴的產生，只能依靠密切觀察、積極應對等常規對症治療手段。
綜上，本領域迫切需要開發能夠應對CAR-T治療後的細胞激素風暴的藥物和方法。
本發明的目的在於提供一種抗CD19抗體的抗體及其製備和應用。
在本發明的第一方面，提供了一種抗體的重鏈可變區，所述的重鏈可變區包括以下三個互補决定區CDR： SEQ ID NO: 1所示的CDR1， SEQ ID NO: 2所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 3所示的CDR3； 或者， SEQ ID NO: 4的CDR1， SEQ ID NO: 5所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 6所示的CDR3， 或者， SEQ ID NO: 7所示的CDR1， SEQ ID NO: 8所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 9所示的CDR3； 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留對CD19抗體的結合親和力的衍生序列。
在另一優選例中，所述重鏈可變區還包括人源的FR區或鼠源的FR區。
在另一優選例中，所述重鏈可變區CDR如SEQ ID NO: 19所示的胺基酸序列的第50-54、69-85、118-130位所示。
在另一優選例中，所述重鏈可變區CDR如SEQ ID NO: 21所示的胺基酸序列的第50-54、69-85、118-123位所示。
在另一優選例中，所述重鏈可變區CDR如SEQ ID NO: 23所示的胺基酸序列的第50-54、69-85、118-129位所示。
在另一優選例中，所述重鏈可變區的胺基酸序列SEQ ID NO: 25、27、29、31、33所示。
在本發明的第二方面，提供了一種抗體的重鏈，所述的重鏈具有本發明第一方面所述的重鏈可變區。
在另一優選例中，所述的抗體的重鏈還包括重鏈恆定區。
在另一優選例中，所述的重鏈恆定區爲人源、鼠源或兔源的。
在另一優選例中，所述重鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 19、21或23所示(重鏈恆定區爲人源)。
在本發明的第三方面，提供了一種抗體的輕鏈可變區，所述輕鏈可變區包括以下三個互補决定區CDR： SEQ ID NO: 10所示的CDR1’， SEQ ID NO: 11所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 12所示的CDR3’； 或者， SEQ ID NO: 13所示的CDR1’， SEQ ID NO: 14所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 15所示的CDR3’； 或者， SEQ ID NO: 16所示的CDR1’， SEQ ID NO: 17所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 18所示的CDR3’； 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留對CD19抗體的結合親和力的衍生序列。
在另一優選例中，所述輕鏈可變區還包括人源的FR區或鼠源的FR區。
在另一優選例中，所述輕鏈可變區CDR如SEQ ID NO: 20所示的胺基酸序列的第46-56、72-78、114-119位所示。
在另一優選例中，所述輕鏈可變區CDR如SEQ ID NO: 22所示的胺基酸序列的第46-61、77-83、119-124位所示。
在另一優選例中，所述輕鏈可變區CDR如SEQ ID NO: 24所示的胺基酸序列的第46-60、76-82、115-123位所示。
在另一優選例中，所述輕鏈可變區的胺基酸序列如SEQ ID NO: 26、28、30、32、34所示。
在本發明的第四方面，提供了一種抗體的輕鏈，所述的輕鏈具有本發明第三方面所述的輕鏈可變區。
在另一優選例中，所述的抗體的輕鏈還包括輕鏈恆定區。
在另一優選例中，所述的輕鏈恆定區爲人源、鼠源或兔源的。
在另一優選例中，所述輕鏈的胺基酸序列如SEQ ID NO: 20、22或24所示(輕鏈恆定區爲人源)。
在本發明的第五方面，提供了一種抗體，所述抗體具有： (1) 本發明第一方面所述的重鏈可變區；和/或 (2) 本發明第三方面所述的輕鏈可變區； 或者，所述抗體具有：本發明第二方面所述的重鏈；和/或本發明第四方面所述的輕鏈。
在另一優選例中，所述抗體選自：動物源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、或其組合。
在另一優選例中，所述人源化抗體的CDR區包含1、2、或3個胺基酸的變化。
在另一優選例中，所述的動物爲非人哺乳動物，較佳地爲鼠、羊、兔。
在另一優選例中，所述的抗體爲雙鏈抗體、或單鏈抗體。
在另一優選例中，所述的抗體爲單株抗體。
在另一優選例中，所述的抗體是部分或全人源化的單株抗體。
在另一優選例中，所述的抗體爲IgG1同種類型抗體。
在另一優選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量，不超過初始胺基酸序列總胺基酸數量的40%，較佳地爲20%，更佳地爲10%。
在另一優選例中，所述添加、缺失、修飾和/或取代的胺基酸數量爲1-7個，較佳地爲1-3個，更佳地爲1個。
在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代的至少一個胺基酸序列爲同源性爲至少80%的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的衍生序列具有抑制CD19抗體活性的功能。
在另一優選例中，抗CD19抗體的抗體的衍生序列對CD19抗體的親和力EC50爲0.2-0.3 nM，較佳地爲0.01-10 nM，更佳地爲0.001-100 nM。
在另一優選例中，抗CD19抗體的抗體可以與標靶CD19的CAR和CAR-T細胞結合。
在另一優選例中，抗CD19抗體的抗體可以抑制標靶CD19的CAR和CAR-T細胞的功能。
在另一優選例中，所述的CD19抗體包括FMC63、人源化FMC63。
在另一優選例中，所述的CD19抗體包括FMC63及其衍生序列，所述的衍生序列是在FMC63的胺基酸序列的基礎上，經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸獲得的序列。
在另一優選例中，所述的FMC63衍生序列保留對CD19的結合親和力。
在另一優選例中，所述的CD19抗體包括CD19雙鏈抗體、或CD19單鏈抗體。
本發明的第六方面，提供了一種重組蛋白，所述的重組蛋白具有： (i)  如本發明第一方面所述的重鏈可變區、如本發明第二方面所述的重鏈、如本發明第三方面所述的輕鏈可變區、如本發明第四方面所述的輕鏈、或本發明第五方面所述的抗體；以及 (ii) 任選的協助表現和/或純化的標籤序列。
在另一優選例中，所述的標籤序列包括6His標籤。
在另一優選例中，所述的重組蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一優選例中，所述的重組蛋白爲單體、二聚體、或多聚體。
本發明的第七方面，提供了一種CAR建構物，所述的CAR建構物的抗原結合結構域的scFv段爲特異性結合於CD19抗體的結合區，並且所述scFv具有如本發明第一方面所述的重鏈可變區和如本發明第三方面所述的輕鏈可變區。
本發明的第八方面，提供了一種重組的免疫細胞，所述的免疫細胞表現外源的如本發明第七方面所述的CAR建構物。
本發明的第九方面，提供了一種抗體藥物偶聯物，所述的抗體藥物偶聯物含有： (a) 抗體部分，所述抗體部分選自下組：本發明第一方面所述的重鏈可變區、本發明第二方面所述的重鏈、本發明第三方面所述的輕鏈可變區、本發明第四方面所述的輕鏈、或本發明第五方面所述的抗體、或其組合；和 (b) 與所述抗體部分偶聯的偶聯部分，所述偶聯部分選自下組：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、放射性核種、酵素、或其組合。
在另一優選例中，所述的抗體部分與所述的偶聯部分透過化學鍵或連接子進行偶聯。
本發明的第十方面，提供了一種活性成分的用途，所述活性成分選自下組：本發明第一方面所述的重鏈可變區、本發明第二方面所述的重鏈、本發明第三方面所述的輕鏈可變區、本發明第四方面所述的輕鏈、或本發明第五方面所述的抗體、本發明第六方面所述的重組蛋白、本發明第八方面所述的免疫細胞、本發明第九方面所述的抗體藥物偶聯物、或其組合，所述活性成分用於(a)製備檢測試劑、檢測盤或套組；和/或(b)製備預防和/或治療CD19相關疾病的藥物。
在另一優選例中，所述檢測試劑、檢測盤或套組用於： (1)  檢測樣品中的CD19抗體；和/或 (2)  檢測免疫細胞表面的CD19抗體；和/或 (3)  檢測表現CD19抗體的免疫細胞。
在另一優選例中，所述檢測試劑、檢測盤或套組用於檢測表現標靶CD19的CAR的免疫細胞。
在另一優選例中，所述的免疫細胞選自下組：NK細胞、T細胞、B細胞。
在另一優選例中，所述的免疫細胞來自人或非人哺乳動物(如鼠)。
在另一優選例中，所述檢測試劑、檢測盤或套組用於ELISA檢測、FACS檢測、電化學發光檢測、酵素連結免疫分析法。其中在ELISA檢測中mAb06 (26E7D2)、mAb023 (75H6C7)親和力最優，mAb020 (52H8C4)在FACS檢測中親和力最優。
在另一優選例中，所述檢測試劑爲ADA檢測的陽性抗體，標準品。
在另一優選例中，所述的藥物用於清除CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的免疫細胞。
在另一優選例中，所述的藥物用於阻斷CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的免疫細胞功能。其中mAb019、mAb020、mAb021阻斷效果最優。
在另一優選例中，所述的藥物輔助治療CD19相關疾病。
在另一優選例中，所述CD19相關疾病選自下組：癌症、自體免疫疾病、代謝相關疾病、感染疾病、或其組合。
在另一優選例中，所述的癌症包括實體瘤、血液癌。
在另一優選例中，所述的癌症爲CD19高度表現的腫瘤。
在另一優選例中，所述的CD19高度表現的腫瘤指腫瘤組織中CD19轉錄本和/或蛋白的位準L1與正常組織中轉錄本和/或蛋白的位準L0之比，L1/L0≥2，較佳地≥3。
在另一優選例中，所述代謝相關疾病包括：糖尿病、食源性肥胖和脂肪發炎。
在另一優選例中，所述感染疾病包括：細菌和病毒感染。
本發明的第十一方面，提供了一種藥物組成物，所述的藥物組成物含有： (i)  活性成分，所述活性成分選自下組：本發明第一方面所述的重鏈可變區、本發明第二方面所述的重鏈、本發明第三方面所述的輕鏈可變區、本發明第四方面所述的輕鏈、或本發明第五方面所述的抗體、本發明第六方面所述的重組蛋白、本發明第八方面所述的免疫細胞、本發明第九方面所述的抗體藥物偶聯物、或其組合；以及 (ii) 藥學上可接受的載劑。
在另一優選例中，所述的藥物組成物爲液態製劑。
在另一優選例中，所述的藥物組成物爲注射劑。
本發明的第十二方面，提供了一種多核苷酸，所述的多核苷酸編碼選自下組的多肽： (1)  本發明第一方面所述的重鏈可變區、本發明第二方面所述的重鏈、本發明第三方面所述的輕鏈可變區、本發明第四方面所述的輕鏈、或本發明第五方面所述的抗體；或 (2)  本發明第六方面所述的重組蛋白； (3)  本發明第七方面所述的CAR建構物。
本發明的第十三方面，提供了一種載體，所述的載體含有本發明第十二方面所述的多核苷酸。
在另一優選例中，所述的載體包括：細菌質體、噬菌體、酵母質體、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒、或其他載體。
本發明的第十四方面，提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，所述的宿主細胞含有本發明第十三方面所述的載體或基因組中併入有本發明第十二方面所述的多核苷酸。
本發明的第十五方面，提供了一種體外檢測(包括診斷性或非診斷性)樣品中CD19抗體的方法，所述方法包括步驟： (1) 在體外，將所述樣品與本發明第五方面所述的抗體接觸； (2) 檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD19抗體。
本發明的第十六方面，提供了一種檢測盤，所述的檢測盤包括：基板(支撑盤)和測試條，所述的測試條含有本發明第五方面所述的抗體或本發明第九方面所述的免疫偶聯物。
本發明的第十七方面，提供了一種套組，所述套組中包括： (1) 第一容器，所述第一容器中含有本發明第五方面所述的抗體；和/或 (2) 第二容器，所述第二容器中含有抗本發明第五方面所述的抗體的二抗； 或者，所述套組含有本發明第十六方面所述的檢測盤。
本發明的第十八方面，提供了一種重組多肽的製備方法，所述方法包括： (a)  在適合表現的條件下，培養本發明第十四方面所述的宿主細胞； (b)  從培養物中分離出重組多肽，所述的重組多肽是本發明第五方面所述的抗體或本發明第六方面所述的重組蛋白。
本發明的第十九方面，提供了一種清除CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的免疫細胞的方法，所述方法包括：給需要的對象施用本發明第五方面所述的抗體、所述抗體的抗體-藥物偶聯物、或表現所述抗體的CAR-T細胞、或其組合。
在另一優選例中，所述的方法還包括：給需要的對象施用其他藥物或治療方法進行聯合治療。
在另一優選例中，所述的其他藥物或治療方法包括：抗腫瘤免疫治療藥物、腫瘤標靶藥物、腫瘤化療藥物、腫瘤放射治療。
在本發明的第二十方面，提供了一種製備嵌合抗體的方法，包括步驟： 將本發明第一方面所述的重鏈可變區和/或本發明第三方面所述的輕鏈可變區的核苷酸序列選殖入含有人抗體恆定區的核苷酸序列的表現載體後，透過轉染動物細胞表現人-鼠嵌合抗體。
在本發明的第二十一方面，提供了一種製備人源化抗體的方法，包括步驟： 將本發明第一方面所述的重鏈可變區和/或本發明第三方面所述的輕鏈可變區中的CDR區的核苷酸序列植入含人源抗體FR區的核苷酸序列模板，再將其選殖入含有人抗體恆定區的表現載體後，透過轉染動物細胞表現人源化抗體。
在本發明的第二十二方面，提供了一種雙特異性抗體，所述的雙特異性抗體包括：本發明第五方面所述抗體和第二抗體，所述的第二抗體選自下組：CD3、CD47、PD-1、PD-L1抗體，以及抗BCMA、CD20、CD22、CD33、CD123抗抗體。
應理解，在本發明範圍內中，本發明的上述各技術特徵和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特徵之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限於篇幅，在此不再一一累述。
具體實施方式
本發明人經過廣泛而深入地研究，首次意外地發現一種人源化抗CD19抗體的抗體。具體地，本發明透過使用合成的CD19抗體(scFv)免疫小鼠，取小鼠脾臟製備雜交瘤細胞，篩選得到鼠源抗CD19抗體的抗體，並經過替換人Fc段獲得到人源化的抗CD19抗體的抗體。人源化的抗CD19抗體的抗體可以應用於檢測CD19抗體、製備抗體藥、製備標靶CD19抗體的CAR-T細胞。術語
本發明中，“VH”指重鏈可變區，“VL”指輕鏈可變區。“VH-CDR1”指重鏈可變區的CDR1；“VH-CDR2”指重鏈可變區的CDR2；“VH-CDR3”指重鏈可變區的CDR3。“VL-CDR1”指輕鏈可變區的CDR1；“VL-CDR2”指輕鏈可變區的CDR2；“VL-CDR3”指輕鏈可變區的CDR3。FMC63
FMC63是一種鼠源抗CD19的IgG2a抗體。利用FMC63設計的CAR-T細胞藥物已經成功上市，在治療B-ALL和NHL上有較好的療效。
FMC63 scFv胺基酸序列如下： 1 DIQMTQTTSS LSASLGDRVT ISCRASQDIS KYLNWYQQKP DGTVKLLIYH TSRLHSGVPS 61 RFSGSGSGTD YSLTISNLEQ EDIATYFCQQ GNTLPYTFGG GTKLEITGST SGSGKPGSGE 121 GSTKGEVKLQ ESGPGLVAPS QSLSVTCTVS GVSLPDYGVS WIRQPPRKGL EWLGVIWGSE 181 TTYYNSALKS RLTIIKDNSK SQVFLKMNSL QTDDTAIYYC AKHYYYGGSY AMDYWGQGTS 241 VTVSSAAA (SEQ ID NO: 50)抗體
如本文所用，術語“抗體”或“免疫球蛋白”是有相同結構特徵的約150000道爾頓的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈(L)和兩個相同的重鏈(H)組成。每條輕鏈透過一個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區(VH)，其後是多個恆定區。每條輕鏈的一端有可變區(VL)，另一端有恆定區；輕鏈的恆定區與重鏈的第一個恆定區相對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的胺基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形成界面。
如本文所用，術語“可變”表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形成了各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性並不均勻地分布在整個抗體可變區中。它集中於輕鏈和重鏈可變區中稱爲互補决定區(CDR)或超變區中的三個片段中。可變區中較保守的部分稱爲框架區(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個CDR相連，在某些情况下可形成部分β折疊結構。每條鏈中的CDR透過FR區緊密地靠在一起並與另一鏈的CDR一起形成了抗體的抗原結合部位。恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。
脊椎動物抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可根據其恆定區的胺基酸序列歸爲明顯不同的兩類(稱爲κ和λ)中的一類。根據其重鏈恆定區的胺基酸序列，免疫球蛋白可以分爲不同的種類。主要有5類免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些還可進一步分成亞型(同種型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應於不同類免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱爲α、δ、ε、γ、和μ。不同類免疫球蛋白的次單元結構和三維構型是本領域人員所熟知的。
一般，抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱爲可變區域(CDR)，將該段間隔成4個框架區域(FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。這些CDR形成環狀結構，透過其間的FR形成的β折疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位址。可以透過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定是哪些胺基酸構成了FR或CDR區域。
本發明不僅包括完整的抗體，還包括具有免疫活性的抗體的片段或抗體與其他序列形成的融合蛋白。因此，本發明還包括所述抗體的片段、衍生物和類似物。
在本發明中，抗體包括用本領域技術人員熟知技術所製備的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗體。重組抗體，例如嵌合的和人源化的單株抗體，包括人的和非人的部分，可以透過標準的DNA重組技術獲得，它們都是有用的抗體。嵌合抗體是一個分子，其中不同的部分來自不同的動物種，例如具有來自鼠的單株抗體的可變區，和來自人免疫球蛋白的恆定區的嵌合抗體(見例如美國專利4,816,567和美國專利4,816,397，在此透過引用方式整體引入本文)。人源化的抗體是指來源於非人物種的抗體分子，具有一個或多個來源於非人物種的互補决定區(CDRs)和來源於人免疫球蛋白分子的框架區域(見美國專利5,585,089，在此透過引用方式整體引入本文)。這些嵌合和人源化的單株抗體可以採用本領域熟知的DNA重組技術製備。
在本發明中，抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性、或者更多的多重特異性。
在本發明中，本發明的抗體還包括其保守性變異體，指與本發明抗體的胺基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個胺基酸被性質相似或相近的胺基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表A進行胺基酸替換而產生。
表A
最初的殘基 代表性的取代 優選的取代
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gln (Q) Asn Asn
Glu (E) Asp Asp
Gly (G) Pro; Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe Leu
Leu (L) Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Leu
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala Leu
抗 CD19 抗體的抗體
本發明中，所述抗體爲抗CD19抗體的抗體，所述的CD19抗體包括FMC63及其衍生序列。本發明的抗體包括重鏈和輕鏈，所述重鏈含有重鏈可變區(VH)胺基酸序列，所述輕鏈含有輕鏈可變區(VL)胺基酸序列。
優選地， 所述的重鏈可變區(VH)具有選自下組的互補决定區CDR： SEQ ID NO: 1所示的CDR1， SEQ ID NO: 2所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 3所示的CDR3； 或者， SEQ ID NO: 4的CDR1， SEQ ID NO: 5所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 6所示的CDR3， 或者， SEQ ID NO: 7所示的CDR1， SEQ ID NO: 8所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 9所示的CDR3； 所述的輕鏈可變區(VL)具有選自下組的互補决定區CDR： SEQ ID NO: 10所示的CDR1’， SEQ ID NO: 11所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 12所示的CDR3’； 或者， SEQ ID NO: 13所示的CDR1’， SEQ ID NO: 14所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 15所示的CDR3’； 或者， SEQ ID NO: 16所示的CDR1’， SEQ ID NO: 17所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 18所示的CDR3’； 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留對CD19抗體的結合親和力的衍生序列。
在另一優選例中，所述經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸序列所形成的序列優選爲同源性或序列相同性爲至少80%，較佳地至少85%，更佳地至少爲90%，最佳地至少95%的胺基酸序列。
本領域普通技術人員公知的測定序列同源性或相同性的方法包括但不限於：計算分子生物學(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.編，牛津大學出版社，紐約，1988；計算生物學：資訊學和基因組計畫(Biocomputing: Informatics and Genome Projects)，Smith, D.W.編，學術出版社，紐約，1993；序列數據的電腦分析(Computer Analysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin, A.M.和Griffin, H.G.編，Humana Press，新澤西，1994；分子生物學中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinje，G.，學術出版社，1987和序列分析引子(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.與Devereux, J.編M Stockton Press，紐約，1991和Carillo, H.與Lipman, D.，SIAM J. Applied Math.，48:1073 (1988)。測定相同性的優選方法要在測試的序列之間得到最大的匹配。測定相同性的方法編譯在公眾可獲得的電腦程式中。優選的測定兩條序列之間相同性的電腦程式方法包括但不限於：GCG程式包 (Devereux, J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul, S. F.等，1990)。公眾可從NCBI和其它來源得到BLASTX程式(BLAST手册，Altschul, S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul, S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用於測定相同性。
本發明的抗體可以是選自動物源抗體、嵌合抗體、人源化抗體，更優選爲人源化抗體、人-動物嵌合抗體，更優選爲全人源化抗體。
其中，所述動物優選爲哺乳動物，如鼠。
本發明所述抗體衍生物可以是單鏈抗體、和/或抗體片段，如：Fab、Fab’、(Fab’)2或該領域內其他已知的抗體衍生物等，以及IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM抗體或其他亞型的抗體中的任意一種或幾種。
本發明抗體可以是標靶CD19抗體的嵌合抗體、人源化抗體、CDR嫁接和/或修飾的抗體。
在另一優選例中，所述抗體的重鏈可變區含有SEQ ID NO: 19、21或23所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述抗體的輕鏈可變區含有SEQ ID NO: 20、22或24所示的胺基酸序列。
本發明抗體可以是抗體全長蛋白、抗原抗體結合域蛋白質片段、雙特異性抗體、多特異性抗體、單鏈抗體(single chain antibody fragment, scFv)、單域抗體(single domain antibody，sdAb)和單區抗體(Single-domain antibody)中的一種或多種，以及上述抗體所製得的單株抗體或多株抗體。所述單株抗體可以由多種途徑和技術進行研製，包括雜交瘤技術、噬菌體展示技術、單淋巴細胞基因轉殖技術等，主流是透過雜交瘤技術從野生型或基因轉殖小鼠製備單株抗體。
所述的抗體全長蛋白爲本領域常規的抗體全長蛋白，其包括重鏈可變區、輕鏈可變區、重鏈恆定區和輕鏈恆定區。所述的蛋白質的重鏈可變區和輕鏈可變區與人源重鏈恆定區和人源輕鏈恆定區構成全人源抗體全長蛋白。較佳地，所述的抗體全長蛋白爲IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
所述的單鏈抗體爲本領域常規的單鏈抗體，其包括重鏈可變區、輕鏈可變區和15-20個胺基酸的短鏈胜肽。
所述的抗原抗體結合域蛋白質片段爲本領域常規的抗原抗體結合域蛋白質片段，其包括輕鏈可變區、輕鏈恆定區和重鏈恆定區的Fd段。較佳地，所述的抗原抗體結合域蛋白質片段爲Fab和F(ab’)。
所述的單域抗體爲本領域常規的單域抗體，其包括重鏈可變區和重鏈恆定區。
所述的單區抗體爲本領域常規的單區抗體，其僅包括重鏈可變區。
其中，所述重組蛋白的製備方法爲本領域常規的製備方法。所述製備方法較佳地爲：從重組表現該蛋白質的表現轉形株中分離獲得或者透過人工合成蛋白質序列獲得。所述的從重組表現該蛋白質的表現轉形株中分離獲得優選如下方法：將編碼所述蛋白質並且帶有點突變的核酸分子選殖到重組載體中，將所得重組載體轉形到轉形株中，得到重組表現轉形株，透過培養所得重組表現轉形株，即可分離純化獲得所述重組蛋白。核酸
本發明還提供一種核酸，其編碼上述的抗體或重組蛋白或抗CD19抗體的抗體的重鏈可變區或輕鏈可變區。
所述核酸的製備方法爲本領域常規的製備方法，較佳地，包括以下的步驟：透過基因轉殖技術獲得編碼上述蛋白質的核酸分子，或者透過人工全序列合成的方法得到編碼上述蛋白質的核酸分子。
本領域技術人員知曉，編碼上述蛋白質的胺基酸序列的鹼基序列可以適當引入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的同系物可以透過對編碼該蛋白序列基因的一個或多個鹼基在保持抗體活性範圍內進行替換、缺失或增加來製得。載體
本發明還提供一種包含所述核酸的重組表現載體。
其中所述重組表現載體可透過本領域常規方法獲得，即：將本發明所述的核酸分子連接於各種表現載體上建構而成。所述的表現載體爲本領域常規的各種載體，只要其能夠容載前述核酸分子即可。所述載體較佳地包括：各種質體、黏接質體、噬菌體或病毒載體等。
本發明還提供一種包含上述重組表現載體的重組表現轉形株。
其中，所述重組表現轉形株的製備方法爲本領域常規的製備方法，較佳地爲：將上述重組表現載體轉形至宿主細胞中製得。所述的宿主細胞爲本領域常規的各種宿主細胞，只要能滿足使上述重組表現載體穩定地自行複製，且所攜帶所述的核酸可被有效表現即可。較佳地，所述宿主細胞爲E.coli TG1或E.coli BL21細胞(表現單鏈抗體或Fab抗體)，或者HEK293或CHO細胞(表現全長IgG抗體)。將前述重組表現質體轉形至宿主細胞中，即可得本發明優選的重組表現轉形株。其中所述轉形方法爲本領域常規轉形方法，較佳地爲化學轉形法，熱休克法或電穿孔法。抗體的製備
本發明抗體或其片段的DNA分子的序列可以用常規技術，比如利用PCR擴增或基因組庫篩選等方法獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其選殖入載體，再轉入細胞，然後透過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，透過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全透過化學合成來得到編碼所述的本發明的抗體(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可透過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啓動子或者控制序列的載體。這些載體可以用於轉形適當的宿主細胞，以使其能夠表現蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。優選的動物細胞包括(但並不限於)：CHO-S、HEK-293細胞。
通常，在適合本發明抗體表現的條件下，培養轉形所得的宿主細胞。然後用常規的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose、羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化得到本發明的抗體。
所得單株抗體可用常規手段來鑑定。比如，單株抗體的結合特異性可用免疫沉澱或體外結合試驗(如放射免疫分析(RIA)或酵素連結免疫吸附分析法(ELISA))來測定。單株抗體的結合親和力例如可用Munson等, Anal. Biochem.,107:220s (1980)的Scatchard分析來測定。
本發明的抗體可在細胞內、或在細胞膜上表現、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性透過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但並不限於：常規的復性處理、用蛋白沉澱劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超音波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。抗體 - 藥物偶聯物 (ADC)
本發明還提供了基於本發明抗體的抗體偶聯藥物(antibody-drug conjugate, ADC)。
典型地，所述抗體偶聯藥物包括所述抗體、以及效應分子，所述抗體與所述效應分子偶聯，並優選爲化學偶聯。其中，所述效應分子優選爲具有治療活性的藥物。此外，所述效應分子可以是毒蛋白、化療藥物、小分子藥物或放射性核種中的一種或多種。
本發明抗體與所述效應分子之間可以是透過偶聯劑進行偶聯。所述偶聯劑的例子可以是非選擇性偶聯劑、利用羧基的偶聯劑、肽鏈、利用二硫鍵的偶聯劑中的任意一種或幾種。所述非選擇性偶聯劑是指使效應分子和抗體形成共價鍵連接的化合物，如戊二醛等。所述利用羧基的偶聯劑可以是順烏頭酸酐類偶聯劑(如順烏頭酸酐)、醯基腙類偶聯劑(偶聯位址爲醯基腙)中的任意一種或幾種。
抗體上某些殘基(如Cys或Lys等)用於與多種功能基團相連，其中包括成像試劑(例如發色基團和螢光基團)，診斷試劑(例如MRI對比劑和放射性同位素)，穩定劑(例如乙二醇聚合物)和治療劑。抗體可以被偶聯到功能劑以形成抗體-功能劑的偶聯物。功能劑(例如藥物，檢測試劑，穩定劑)被偶聯(共價連接)至抗體上。功能劑可以直接地、或者是透過連接子間接地連接於抗體。
抗體可以偶聯藥物從而形成抗體藥物偶聯物(ADCs)。典型地，ADC包含位於藥物和抗體之間的連接子。連接子可以是可降解的或者是不可降解的連接子。可降解的連接子典型地在細胞內環境下容易降解，例如在目標位址處連接子發生降解，從而使藥物從抗體上釋放出來。合適的可降解的連接子包括，例如酵素降解的連接子，其中包括可以被細胞內蛋白酶(例如溶酶體蛋白酶或者胞內體蛋白酶)降解的含有肽基的連接子，或者糖連接子例如，可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的連接子。肽基連接子可以包括，例如二肽，例如纈胺酸-瓜胺酸，苯丙胺酸-離胺酸或者纈胺酸-丙胺酸。其它合適的可降解的連接子包括，例如，pH敏感連接子(例如pH小於5.5時水解的連接子，例如腙連接子)和在還原條件下會降解的連接子(例如二硫鍵連接子)。不可降解的連接子典型地在抗體被蛋白酶水解的條件下釋放藥物。
在一些實施方式中，抗體藥物偶聯物ADC如下分子式所示：
Figure 02_image001
其中： Ab是抗體， LU是連接子； D是藥物； 而且下標p是選自1到8的值。嵌合抗原受體 T 細胞
CAR-T，全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell，指的是嵌合抗原受體T細胞，其中嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件，賦予T細胞HLA非依賴的方式辨識腫瘤抗原的能力，這使得經過CAR改造的T細胞相較於天然T細胞表面受體TCR能夠辨識更廣泛的目標。CAR的基礎設計中包括一個腫瘤相關抗原(tumor-associated antigen, TAA)結合區(通常來源於單株抗體抗原結合區域的scFv段)，一個胞外樞紐區，一個跨膜區和一個胞內信號區。CARs的設計經歷了以下過程：第一代CAR只有一個胞內信號組份CD3ζ或者FcγRI分子，由於胞內只有一個活化結構域，因此它只能引起短暫的T細胞增殖和較少的細胞激素分泌，而並不能提供長時間的T細胞增殖信號和持續的體內抗腫瘤效應，所以並沒有取得很好地臨床療效。第二代CARs在原有結構基礎上引入一個共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，與一代CARs相比功能有很大提高，進一步加强CAR-T細胞的持續性和對腫瘤細胞的毒殺能力。在二代CARs基礎上串聯一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，發展成爲三代和四代CARs。檢測用途和套組
本發明的抗體或其ADC可用於檢測應用，例如用於檢測樣本，從而提供診斷資訊。
本發明中，所採用的樣本(樣品)包括細胞、組織樣本和活體組織切片標本。本發明使用的術語“活體組織切片”應包括本領域技術人員已知的所有種類的活體組織切片。因此本發明中使用的活體組織切片可以包括例如腫瘤的切除樣本、透過內窺鏡方法或器官的穿刺或針刺活體組織切片製備的組織樣本。
本發明中使用的樣本包括固定的或保存的細胞或組織樣本。
本發明還提供了一種指含有本發明的抗體(或其片段)的套組，在本發明的一個優選例中，所述的套組還包括容器、使用說明書、緩衝劑等。在優選例中，本發明的抗體可以固定於檢測盤。藥物組成物
本發明還提供了一種組成物。在優選例中，所述的組成物是藥物組成物，它含有上述的抗體或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相應的免疫細胞，以及藥學上可接受的載劑。通常，可將這些物質配製於無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載劑介質中，其中pH通常約爲5-8，較佳地pH約爲6-8，儘管pH值可隨被配製物質的性質以及待治療的病症而有所變化。
配製好的藥物組成物可以透過常規途徑進行給藥，其中包括(但並不限於)：瘤內、腹膜內、靜脈內、或局部給藥。典型地，本發明所述的藥物組成物的給藥途徑較佳地爲注射給藥或口服給藥。所述注射給藥較佳地包括靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮內注射或皮下注射等途徑。所述的藥物組成物爲本領域常規的各種劑型，較佳地爲固體、半固體或液體的形式，可以爲水溶液、非水溶液或懸浮液，更佳地爲片劑、膠囊、顆粒劑、注射劑或輸液劑等。
本發明所述抗體也可以是由核苷酸序列在細胞內表現用於細胞治療，比如，所述抗體用於嵌合抗原受體T細胞免疫療法(CAR-T)等。
本發明的藥物組成物可直接用於結合CD19抗體或標靶CD19的CAR-T細胞，因而可用於輔助治療腫瘤等疾病。
本發明的藥物組成物含有安全有效量(如0.001-99 wt%，較佳地0.01-90 wt%，更佳地0.1-80 wt%)的本發明上述的單株抗體(或其偶聯物)以及藥學上可接受的載劑或賦形劑。這類載劑包括(但並不限於)：鹽水、緩衝液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組成物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液透過常規方法進行製備。藥物組成物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
本發明中，較佳地，本發明所述的藥物組成物還包括一種或多種藥用載劑。所述的藥用載劑爲本領域常規藥用載劑，所述的藥用載劑可以爲任意合適的生理學或藥學上可接受的藥物輔料。所述的藥物輔料爲本領域常規的藥物輔料，較佳的包括藥學上可接受的賦形劑、填充劑或稀釋劑等。更佳地，所述的藥物組成物包括0.01～99.99%的上述蛋白質和0.01～99.99%的藥用載劑，所述百分比爲占所述藥物組成物的質量百分比。
本發明中，較佳地，所述的藥物組成物的施用量爲有效量，所述有效量爲能夠緩解或延遲疾病、退化性或損傷性病症進展的量。所述有效量可以以個體基礎來測定，並將部分基於待治療症狀和所尋求結果的考慮。本領域技術人員可以透過使用個體基礎等上述因素和使用不超過常規的實驗來確定有效量。
使用藥物組成物時，是將安全有效量的免疫偶聯物施用於哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情况下不超過約50毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約20毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀况等因素，這些都是熟練醫師技能範圍之內的。本發明的主要優點包括：
(a)本發明的抗體能夠用於檢測CD19抗體，如用於ELISA檢測、FACS檢測等。
(b)本發明的抗體能夠阻斷CD19抗體，如FMC63的功能。
(c)本發明的抗體與標靶CD19的CAR-T結合，從而阻斷CAR-T的功能，抑制細胞激素風暴、神經毒性和其它CAR-T相關毒副作用的發生發展。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子選殖：實驗室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
除非另外說明，實施例中的所有載體、細胞、試劑等均爲常規市售的。實施例中涉及的核苷酸序列(FMC63 scFv CAR、FMC63-scFv-mFc)均由第三方基因合成公司合成。實施例 1 建構表現 FMC63scFv CAR 的單選殖株細胞 (Jurkat-FMC63 scFv)
將FMC63 scFv CAR (GMCSF信號胜肽-FMC63 scFv-Flag-CD28樞紐-CD28跨膜區-CD28共刺激區-CD3z)的核苷酸序列併入到慢病毒載體中，塗佈FMC63 scFv CAR慢病毒載體，感染Jurkat細胞，篩選得到穩定表現的FMC63 scFv CAR的單選殖株Jurkat-FMC63 scFv細胞，使用流式細胞術鑑定單選殖株細胞。
結果顯示，成功獲得表現FMC63scFv CAR的單選殖株細胞(Jurkat-FMC63 scFv細胞)。實施例 2  FMC63-scFv-mFc 免疫小鼠
將FMC63-scFv-mFc(FMC63抗體的一條鏈)的核苷酸序列併入到真核細胞表現載體中，使用PEI將攜帶FMC63核苷酸的表現載體轉入293細胞中，使其表現FMC63蛋白，使用protein A管柱純化得到FMC63蛋白(FMC63-scFv-mFc蛋白)。
按照下表1所示方法免疫小鼠。
表1 小鼠免疫方法
第0天 1×107 的Jurkat-FMC63 scFv 細胞IP注射免疫小鼠
第14天 1×107 的Jurkat-FMC63 scFv 細胞IP注射免疫小鼠
第35天 1×107 的Jurkat-FMC63 scFv 細胞IP注射免疫小鼠
第56天 25 µg FMC63-scFv-mFc蛋白 IP注射免疫小鼠
結果如圖1所示，Jurkat-FMC63 scFv 細胞免疫後的小鼠血清與FMC63-scFv-mFc有結合訊號，說明小鼠免疫成功，可以繼續進行篩選。實施例 3 雜交瘤 獲取與篩選
透過ELISA/FACS篩選免疫有反應的小鼠，取小鼠脾臟淋巴細胞與Sp2/0-Ag14細胞融合獲得雜交瘤細胞，將雜交瘤細胞平盤培養至96孔培養盤中進行生長，10-14天後取上清用ELISA/FACS篩選細胞、解離速率常數，選擇高特異的亞選殖株進行擴大培養以及凍存。
ELISA檢測方法如下：使用100 µl 1 µg/ml FMC63-scFv-mFc塗佈培養盤，四度培育過夜；PBST洗三次，1%BSA於37℃封阻1小時；PBST洗三次，每孔加入50 µl mAb抗抗體(40 µg/ml)和生物素標記FMC63-scFv-mFc；於37℃培育1小時，PBST洗三次；每孔加100 µl二抗，37℃培育1小時；PBST洗五次，每孔加100 µl TMB；每孔加入50 µl 1M的HCl終止反應；酵素標示讀取儀450nm波長下讀培養盤；
FACS檢測方法如下：將mAb與Jurkat-FMC63 scFv細胞混合，室溫培育30分鐘後DPBS洗一次，加抗鼠Fc抗體室溫培育30分鐘，DPBS洗一次後流式細胞儀上機檢測。
根據初步的ELISA結果，D value ＞ 10，得到103個選殖株進行二次篩選。使用ELISA和FACS方法對103個選殖株進行進一步篩選，得到23個單選殖株細胞表現結合FMC63的抗體(對應表2中的mAb01-mAb023)。
ELISA和FACS檢測結果如圖2-3和表2-4所示。
結果顯示，mAb06 (26E7D2)、mAb023 (75H6C7)在ELISA檢測中效果最優，mAb020 (52H8C4)在FACS中檢測中效果最優。
表2 ELISA檢測抗FMC63抗體的親和力(EC50)數值
抗體 選殖株號 EC50 (µg/ml) 抗體 選殖株號 EC50 (µg/ml)
mAb01 4C5E2 0.03479 mAb013 9H2G1 0.03986
mAb02 8B3H4 0.02298 mAb014 20H5D10 0.0628
mAb03 14A10E7 0.8218 mAb015 22G8F7 53629
mAb04 17F10D3 0.02273 mAb016 40F12E5 0.04888
mAb05 26E2F11 0.0714 mAb017 35H8C4 0.05389
mAb06 26E7D2 0.0299 mAb018 24E8E11 0.08629
mAb07 27C5E11 0.09905 mAb019 66B2A9 0.06981
mAb08 28B6F7 0.07226 mAb020 52H8C4 0.113
mAb09 28E12C3 0.05664 mAb021 47H1B3 0.04839
mAb010 35G7G6 0.059 mAb022 42C10G2 0.1716
mAb011 36A11E3 0.06001 mAb023 75H6C7 0.05115
mAb012 39D4C5 0.05607      
表3 FACS檢測抗FMC63抗體的親和力(EC50)數值
mAbs 選殖株號 EC 50 (nM) Emax (MFI)
mAb 01 4C5E2 0.5757 4123
mAb 02 8B3H4 0.6395 4135
mAb 06 26E7D2 0.6767 2865
mAb 07 27C5E11 0.5332 4194
mAb 010 35G7G6 0.5571 4120
mAb 019 66B2A9 0.5368 5081
mAb 020 52H8C4 0.1956 5267
mAb 021 47H1B3 0.4959 5258
mAb 022 42C10G2 - -
mAb 023 75H6C7 - -
表4 ELISA和FACS篩選後的抗FMC63抗體
融合篩選 亞選殖株
抗體 亞型 選殖株號 ELISA FACS (MFI) ELISA FACS (MFI)
mAb 01 IgG2c,κ 4C5E2 2.72 2469.6 1.4 2245.4
mAb 02 IgG2b,κ 8B3H4 3.09 3439.8 2.19 1979
mAb 06 IgG1,κ 26E7D2 3.27 2215.3 3.38 1207.7
mAb 07 IgG2c,κ 27C5E11 3.14 3367 1.25 1864.6
mAb 010 IgG2c,κ 35G7G6 3.03 3618.4 1.6 2167.3
mAb 019 IgG2c,κ 66B2A9 0.61 3701 2.27 4470
mAb 020 IgG2c,κ 52H8C4 0.34 1660 2.69 4536
mAb 021 IgG2c,κ 47H1B3 0.93 3674 2.59 4600
mAb 022 IgG1,κ 42C10G2 2.78 767 3.02 917
mAb 023 IgG1,κ 75H6C7 3.09 169 3.27 123
實施例 4 抗 FMC63 抗體表位檢測
使用競爭性ELISA檢測抗體結合表位。使用100 µl 1 µg/ml抗FMC63抗體塗佈培養盤，四度培育過夜；PBST洗三次，1% BSA於37℃封阻1小時；PBST洗三次，每孔加入50 µl抗抗體(40 µg/ml)和FMC63-scFv-mFc (EC80)；於37℃培育1小時，PBST洗三次；每孔加100 µl二抗，37℃培育1小時；PBST洗五次，每孔加100 µl TMB；每孔加入50 µl 1M的HCl終止反應；酵素標示讀取儀450nm波長下讀培養盤。
將結合FMC63不同表位的抗體分類，結果如表5所示。
表5 抗FMC63抗體表位分類
FMC63表位 抗FMC63抗體(mAb)
表位1 mAb01,mAb02,mAb03,mAb04,mAb05,mAb06,mAb07,mAb08,mAb09,mAb010,mAb011,mAb012,mAb013,mAb014,mAb016, mAb017,mAb018
表位2 mAb019, mAb020, mAb021
表位3 mAb022
表位4 mAb023
實施例 5 單選殖株定序
選取單選殖株細胞mAb02(8B3H4)、mAb06(26E7D2)、mAb07(27C5E11)、mAb020 (52H8C4)、mAb023(75H6C7)進行DNA定序，定序後得到的抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的胺基酸序列如表6所示，表6還顯示了抗體定序分析後得到的CDR區。
表6 mAb抗體CDR區序列和重鏈、輕鏈可變區序列
抗體編號 選殖株號 重鏈 輕鏈
CDR1 CDR2 CDR3 重鏈可變區 CDR1 CDR2 CDR3 輕鏈可變區
mAb02 8B3H4 1 2 3 25 10 11 12 26
mAb06 26E7D2 4 5 6 27 13 14 15 28
mAb07 27C5E11 35 36 3 29 37 38 12 30
mAb020 52H8C4 7 8 9 31 16 17 18 32
mAb023 75H6C7 39 40 41 33 42 43 44 34
實施例 7 抗 FMC63 抗體應用於抗抗體檢測方法
選用結合FMC63不同表位的抗體組合(mAb01, mAb02, mAb07, mAb10, mAb011, mAb021, mAb022, mAb023)等濃度混合後作爲陽性品(PC)，設計抗抗體檢測實驗。向MSD培養盤中加入300 µl封阻液封阻2小時，把配置好的混合PC，一定濃度的biotin-FMC63-scFv與一定濃度的sulfo-tag-FMC63-scFv的混合液吸取100 µl在另一塊培養盤中培育1小時。把MSD培養盤中的封阻液丟棄並洗培養盤3次。把培育的混合液以及每孔50 µl的體積轉移至MSD培養盤中培育1小時。把MSD培養盤的混合液丟棄並洗培養盤3次。加入150 µl每孔2x read buffer讀培養盤。
結果如圖4和表7所示，MSD檢測結果顯示抗FMC63抗體可以與FMC63-scFv按照劑量依賴的方式結合，說明抗FMC63抗體可以應用到MSD方法中。
表7 抗FMC63抗體組合應用到MSD方法檢測原始數據
抗FMC63抗體組合濃度 MSD讀值-重複孔1 MSD讀值-重複孔2
300 ng/ml 3481 3890
100 ng/ml 1405 1114
4 ng/ml 125 123
1 ng/ml 85 95
0 ng/ml 69 69
實施例 8 抗體的功能檢測
將表2所示的23種抗體與生物素標記的CD19蛋白混合後，加入到Jurkat-FMC63 scFv細胞培育1小時，DPBS洗一次，加入鏈黴親和素-APC培育30分鐘，DPBS洗一次後流式細胞儀上機檢測CD19蛋白結合。
將表2所示的23種抗體與FMC63-CAR-T細胞共培育1小時，將培育後的FMC63-CAR-T細胞添加到鋪有Hela-CD19的RTCA培養盤中，觀察與抗體結合後的CAR-T對標的細胞的毒殺功能變化，從而篩選得到可以阻斷FMC63-CAR-T功能的抗體。
將表2所示的23種抗體加入到FMC63-CAR-T細胞，在不同時間點檢測FMC63-CAR-T細胞的密度和數量。結果如圖6、7、8顯示，抗FMC63抗體可以促進FMC63-CAR-T細胞的增殖、活化和細胞激素釋放。
結果如圖5所示，mAb019、mAb020可以干擾CD19蛋白與Jurkat-FMC63 scFv細胞的結合，從而阻斷CAR與標的CD19結合發揮作用。實施例 9 人源化 抗 FMC63 抗體的製備
將鼠源抗FMC63抗體mAb02、mAb06和mAb020的Fc段更換爲人源Fc，得到人鼠嵌合抗體。人源化的mAb02、mAb06和mAb020抗體的重鏈胺基酸序列分別如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23，輕鏈的胺基酸序列分別如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24。實施例 10 標靶 CD19 抗體的 CAR-T 的製備
利用抗FMC63抗體的抗體mAb02、mAb06、mAb07、mAb020和mAb023製備CAR-T，結構爲信號胜肽-anti-FMC63 scFv-CD8樞紐-CD8跨膜區-CD137共刺激區-CD3z，胺基酸序列分別如SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49。
具體方法如下：
細胞復甦：取PBMC於37℃水浴鍋中解凍約2 min，將細胞懸浮液轉移至30 mL已預熱的CAR-T基礎培養基(含1% HSA的X-vivo15)中，混勻後，取樣計數，剩餘細胞300g離心10分鐘。 T細胞接種與活化
室溫下，將分選後的陽性細胞300 g離心8 min，棄上清，用適量CAR-T基礎培養基重新懸浮細胞沉澱。按照CD3/CD28 dynabeads與細胞數量1:1加入適當體積CD3/CD28 dynabeads，補加等體積CAR-T基礎培養基洗滌磁珠，置於DynaMag50上靜置1 min，棄上清，用1-5mL CAR-T基礎培養基重新懸浮磁珠，並轉移至細胞懸浮液中，混勻後補加適量CAR-T基礎培養基使細胞密度達到2×106 /mL，並補加1/1000體積的IMC0003。混勻後，取2-3 mL細胞懸浮液於6孔培養盤中作爲陰性對照細胞，剩餘細胞用於CAR-T細胞製備。 T細胞病毒感染(Day1)
將細胞取出，混勻後取樣計數，並根據細胞體積計算細胞量，收集細胞懸浮液300 g離心8分鐘。按照2×106 /mL密度計算接種體積，並根據公式“慢病毒載體體積=MOI*細胞量/生物效價”計算慢病毒載體體積。棄上清，用適當CAR-T基礎培養基(體積=接種體積-慢病毒載體體積)重新懸浮細胞沉澱，補加1/1000接種體積的IL2，並將復甦後病毒加入細胞懸浮液中，進行感染。 CAR-T細胞擴增培養(Day8)
CAR-T細胞，吸沖混勻後，取樣計數，取約0.5×106 細胞進行陽性率檢測，補加CART基礎培養基繼續培養。在CAR胞外結構中包含DYKDDDDK的胺基酸序列，使用抗Flag抗體檢測CAR+陽性率。結果如圖9顯示，CAR成功表現在T細胞上。 CAR-T細胞毒性檢測
將CAR-T與標的細胞(Hela-FMC63、K562-FMC63)按照效應細胞-標的細胞比1:1培育；使用即時無標記動態細胞分析技術、流式細胞儀檢測標的細胞的活性，得出CAR-T的活化和細胞毒性作用效果。同時取細胞上清檢測細胞激素釋放，包括IL2、IFNγ。
結果顯示，標靶CD19抗體的CAR-T可以對標的細胞Hela-FMC63產生細胞毒性作用，如圖10；標靶CD19抗體的CAR-T可以被標的細胞K562-FMC63活化並且釋放細胞激素IFNγ和IL2，如圖11和圖12。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作爲參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作爲參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附申請專利範圍所限定的範圍。
圖1顯示了免疫小鼠血清與FMC63結合的ELISA測試結果。圖中，四位數字編號(7267-7274)表示小鼠編號，TB3表示小鼠共進行3次免疫， 圖2顯示了ELISA檢測的抗FMC63抗體的親和力(EC50)。 圖3顯示了FACS檢測的抗FMC63抗體的親和力。 圖4顯示了抗FMC63抗體組合應用到抗抗體方法的檢測結果。 圖5顯示抗FMC63抗體可以阻斷CD19 CAR-T細胞與CD19標的的結合，其中，橫座標表示mAb編號。 圖6顯示了抗FMC63抗體可以促進CD19 CAR-T細胞的增殖。 圖7顯示了抗FMC63抗體可以促進CD19 CAR-T細胞的細胞激素釋放。 圖8顯示了抗FMC63抗體可以活化CD19 CAR-T細胞。 圖9顯示了標靶FMC63的CAR-T細胞的CAR陽性率。 圖10顯示了標靶FMC63的CAR-T細胞可以毒殺表現標的抗原的細胞。 圖11顯示了標靶FMC63的CAR-T細胞在表現標的抗原的細胞刺激下細胞激素釋放。 圖12顯示了標靶FMC63的CAR-T細胞可以被表現標的抗原的細胞活化。
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Claims (15)

  1. 一種抗體的重鏈可變區，其特徵在於，所述的重鏈可變區包括以下三個互補决定區CDR： SEQ ID NO: 7所示的CDR1， SEQ ID NO: 8所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 9所示的CDR3； 或者， SEQ ID NO: 4的CDR1， SEQ ID NO: 5所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 6所示的CDR3， 或者， SEQ ID NO: 1所示的CDR1， SEQ ID NO: 2所示的CDR2，和 SEQ ID NO: 3所示的CDR3； 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留對CD19抗體的結合親和力的衍生序列。
  2. 一種抗體的重鏈，其特徵在於，所述的重鏈具有如請求項1所述的重鏈可變區。
  3. 一種抗體的輕鏈可變區，其特徵在於，所述的輕鏈可變區包括以下三個互補决定區CDR： SEQ ID NO: 16所示的CDR1’， SEQ ID NO: 17所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 18所示的CDR3’； 或者， SEQ ID NO: 13所示的CDR1’， SEQ ID NO: 14所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 15所示的CDR3’； 或者， SEQ ID NO: 10所示的CDR1’， SEQ ID NO: 11所示的CDR2’，和 SEQ ID NO: 12所示的CDR3’； 其中，上述胺基酸序列中任意一種胺基酸序列還包括任選地經過添加、缺失、修飾和/或取代至少一個胺基酸的，並能夠保留對CD19抗體的結合親和力的衍生序列。
  4. 一種抗體的輕鏈，其特徵在於，所述的輕鏈具有如請求項3所述的輕鏈可變區。
  5. 一種抗體，其特徵在於，所述抗體具有： (1) 如請求項1所述的重鏈可變區；和/或 (2) 如請求項3所述的輕鏈可變區； 或者，所述抗體具有：如請求項2所述的重鏈；和/或如請求項4所述的輕鏈。
  6. 一種重組蛋白，其特徵在於，所述的重組蛋白具有： (i) 如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、或如請求項5所述的抗體；以及 (ii) 任選的協助表現和/或純化的標籤序列。
  7. 一種抗體藥物偶聯物，其特徵在於，所述的抗體藥物偶聯物含有： (a) 抗體部分，所述抗體部分選自下組：如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、或如請求項5所述的抗體、或其組合；和 (b) 與所述抗體部分偶聯的偶聯部分，所述偶聯部分選自下組：可檢測標記物、藥物、毒素、細胞激素、酵素、或其組合。
  8. 一種CAR建構物，其特徵在於，所述的CAR建構物的抗原結合結構域包含如請求項1所述的重鏈可變區和如請求項3所述的輕鏈可變區，較佳地，所述嵌合抗原受體構成還包含：樞紐區、跨膜區、共刺激信號區和CD3z。
  9. 一種工程化免疫細胞，其特徵在於，所述的工程化免疫細胞表現外源的如請求項8所述的CAR建構物。
  10. 一種活性成分的用途，其特徵在於，所述活性成分選自下組：如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、如請求項5所述的抗體、如請求項7所述的抗體藥物偶聯物、如請求項9所述的工程化免疫細胞、或其組合，所述活性成分用於(a)製備檢測試劑、檢測盤或套組；和/或(b)製備藥物，和/或(c)用於刺激標靶CD19的CAR的免疫細胞擴增；和/或(d)用於分離純化標靶CD19的CAR的免疫細胞。
  11. 如請求項10所述的用途，其特徵在於，所述的藥物用於中和CD19抗體或用於封阻在細胞上表現的標靶CD19的CAR。
  12. 如請求項11所述的用途，其特徵在於，所述細胞包括表現標靶CD19的CAR的腫瘤細胞或免疫細胞，較佳地爲表現標靶CD19的CAR的腫瘤B細胞和表現標靶CD19的CAR的T細胞。
  13. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述的藥物組成物含有： (i)  活性成分，所述活性成分選自下組：如請求項1所述的重鏈可變區、如請求項2所述的重鏈、如請求項3所述的輕鏈可變區、如請求項4所述的輕鏈、如請求項5所述的抗體、如請求項7所述的抗體藥物偶聯物、如請求項9所述的工程化免疫細胞、或其組合；以及 (ii) 藥學上可接受的載劑。
  14. 一種在體內中和CD19抗體或中和在細胞上表現的標靶CD19的CAR的方法，所述方法包括：給需要的對象施用如請求項5所述的抗體、如請求項7所述的抗體藥物偶聯物、如請求項9所述的工程化免疫細胞、或其組合。
  15. 一種體外檢測樣品中CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的細胞的方法，所述方法包括步驟： (1)  在體外，將所述樣品與請求項5所述的抗體接觸； (2)  檢測是否形成抗原-抗體複合物，其中形成複合物就表示樣品中存在CD19抗體或表現標靶CD19的CAR的細胞。
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