CN108640991A - 抗人白介素17a单克隆抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗人白介素17A单克隆抗体及其应用。本发明的抗人白介素17A单克隆抗体具有SEQ ID NO：1～3所示的重链互补决定区和SEQ ID NO：4～6所示的轻链互补决定区。

Description

抗人白介素17A单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体药物领域。具体地，本发明涉及针对人白介素17A的单克隆抗体及其应用。
背景技术
白介素17(IL-17)，也称为CTLA-8或IL-17A，是促炎细胞因子，其刺激诸如成纤维细胞、角质细胞、上皮和内皮细胞、滑膜细胞等非免疫细胞分泌IL-6、IL-8、PGE2、MCP-1、CXCL-1和G-CSF等多种细胞因子，并且还具有诱导ICAM-1表面表达、T细胞增殖等生物学效应。IL-17A主要由一类激活的称之为Th17的CD4+T细胞产生并通过结合IL-17RA和IL-17RC的复合物而发挥作用(Toy等，2006，J.Immunol.177(11)；36-39)。
迄今为止，IL-17家族已发现IL-17A(IL-17)、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(IL-25)、IL-17F六个成员。这些白介素-17细胞因子可以结合到相应受体上，从而介导不同的炎症反应。
其中，IL-17A是由155个氨基酸的两条链通过二硫键连接的同源二聚体，分子量为35kDa。IL-17的结构由23个氨基酸组成的信号肽(AA)及132个氨基酸链区域构成。
过高表达的IL-17A可引起诸多炎症疾病。如IL-17A作用于巨噬细胞，DC细胞，诱发IL-1，IL-6，TNF，CRP的高表达，导致炎症反应，参与银屑病和移植排斥的病理过程；IL-17A作用于内皮细胞，诱发IL-6，MMP，凝血因子的高表达，导致血管活化，参与再灌注损伤、血栓和动脉粥样硬化的病理过程；IL-17A作用于成纤维细胞，诱发IL-6，趋化因子，生长因子，MMP的高表达，导致基质破坏，参与多发性硬化症、克罗恩病的病理过程；IL-17A作用于成骨细胞和软骨细胞，诱导RANKL、MMP、破骨细胞生成、导致骨侵蚀、软骨损伤，参与风湿性关节炎、牙周病的病理过程(N Engl J Med.2009Aug 27；361(9):888-98.Nat Rev DrugDiscov.2012Oct；11(10):763-76.Semin Arthritis Rheum.2013Oct；43(2):158-70.Trends Mol Med.2016Mar；22(3):230-41.)。
IL-17A中和抗体可以抑制自身免疫性疾病患者体内高表达IL-17A，并降低重要炎症因子IL-6的产生(Chabaud M,Durand JM,Buchs N,et al.Arthritis Rheum.1999,42:963-70)。很多自身免疫疾病的动物模型实验证明，使用抗体中和IL-17A，可有效抑制炎症的病理发展(Lubberts E,Koenders MI,Oppers-Walgreen B,et al.Arthritis Rheum.,2004,50:650-659)。
目前，IL-17A相关抗体药物已经被批准上市，分别是Secukinumab(IL-17A靶向抗体，SEC)用于治疗斑块银屑病、强直性脊柱炎及银屑病关节炎、Ixekizumab(IL-17A靶向抗体，IXE)，用于治疗斑块银屑病及银屑病关节炎。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的抗人白介素17A单克隆抗体、包含该单克隆抗体的药物组合物以及该单克隆抗体的制药用途。
即，本发明包括：
1.一种分离的抗人白介素17A单克隆抗体，其包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，其中：
(a)CDR-H1(在本说明书中CDR-H1表示重链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：1(LFYMS)所示；
(b)CDR-H2(在本说明书中CDR-H2表示重链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：2(TIHEVASSYYASWAKG)所示；
(c)CDR-H3(在本说明书中CDR-H3表示重链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：3(ETYSSRYPYPNI)所示；
(d)CDR-L1(在本说明书中CDR-L1表示轻链CDR1)的氨基酸序列如SEQ ID NO：4(QASQNIGGSLA)所示；
(e)CDR-L2(在本说明书中CDR-L2表示轻链CDR2)的氨基酸序列如SEQ ID NO：5(GASSLAS)所示；且
(f)CDR-L3(在本说明书中CDR-L3表示轻链CDR3)的氨基酸序列如SEQ ID NO：6(QSYNTISTYGLA)所示。
2.根据项1所述的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7(EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGIDLSLFYMSWIRQPPGKGLEWIGTIHEVASSYYASWAKGRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETYSSRYPYPNIWGQGTLVTVSS)所示；且，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8(DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIGGSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYNTISTYGLAFGGGTKVEIK)所示。
3.根据项1或2所述的单克隆抗体，其结合人白介素17A中包括第78位的天冬酰胺(N78)的抗原表位。据发明人所知，其它抗人白介素17A单克隆抗体所结合的人白介素17A的抗原表位均不包含第78位的天冬酰胺(N78)。
4.一种分离的核酸，其编码根据项1～3中任一项所述的单克隆抗体。
5.一种宿主细胞，其包含根据项4所述的核酸。
所述核酸可以存在于载体上。载体可以属于任意类型，例如，重组载体诸如表达载体。可以使用多种宿主细胞中的任一种。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如，大肠杆菌(E.coli)。在另一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
6.一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养根据项5所述的宿主细胞从而生产根据项1～3中任一项所述的单克隆抗体。
所述方法包括在合适的宿主细胞中表达编码所述抗人白介素17A单克隆抗体的重组载体，从而生产所述单克隆抗体。在某些实施方案中，所述方法包括培养包含编码所述抗人白介素17A单克隆抗体的核酸的宿主细胞，从而表达所述核酸。所述方法可以进一步包括从宿主细胞培养物或宿主细胞培养基回收所述抗人白介素17A单克隆抗体。
7.一种药物组合物，其包含根据项1～3中任一项所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
所述药物组合物可以进一步包含另外的治疗剂(例如，不同的抗人白介素17A抗体)。
8.根据项7所述的药物组合物，其用于治疗自身免疫性疾病。
9.根据项8所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩病、多发性硬化、银屑病性关节炎、斑块性银屑病和/或强直性脊柱炎。
10.根据项1～3中任一项所述的单克隆抗体在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
11.根据项10所述的用途，其中，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、银屑病性关节炎、斑块性银屑病和/或强直性脊柱炎的药物中的用途。
发明的效果
本发明提供了一种新的抗人白介素17A单克隆抗体，其与现有的抗人白介素17A单克隆抗体相比，与IL-17A结合的亲和力相当或更高。
附图说明
图1是核酸电泳的结果图，其中，M：Marker；条带1：pHZDCH，HindIII/NheI；条带2：pUC57-37VH-Hu5，HindIII/NheI；条带3：pHZDCK，HindIII/BsiWI；条带4：pUC57-37VK-Hu2，HindIII/BsiWI。
图2是瞬转表达流程图。
图3是蛋白电泳检测图。
图4是显示QX002N抑制hIL-17A、hIL-17A突变体(N78A)诱导SEAP释放的结果的图
图5是显示人、恒河猴和食蟹猴的IL-17A氨基酸序列比对结果的图。
图6为显示QX002N抑制IL-17A诱导小鼠体内KC的释放的实验结果的图。
具体实施方式
本说明书中提及的科技术语具有与本领域技术人员通常理解的含义相同的含义，如有冲突以本说明书中的定义为准。
一般而言，本说明书中采用的术语具有如下含义。
在本说明书中，“分离的”抗体是已经与它的天然环境的组分分离的抗体。在某些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，所述纯度通过例如电泳(例如，SDS-PAGE等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)来确定。关于评价抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman等人，J.Chromatogr.B848：79-87(2007)。
在本说明书中，“单克隆抗体”表示得自基本上同源的抗体的群体的抗体，即，构成所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制品的生产过程中产生)以外，这样的变体通常以微量存在。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品不同，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因而，修饰语“单克隆”指示所述抗体得自基本上同源的抗体群体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产所述抗体。例如，要根据本发明使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，所述技术包括、但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法、和使用包含人免疫球蛋白基因座的全部或部分的转基因动物的方法，本文描述了这样的方法和其它示例性的制备单克隆抗体的方法。
在本说明书中，“亲和力”表示分子(例如，抗体)的单个结合位点和它的结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指出，否则本说明书中使用的“结合亲和力”表示反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1∶1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力通常可以由平衡解离常数(KD)表示。通过本领域已知的常见方法，可以测量亲和力。
在本说明书中，人白介素17A(Human Interleukin-17A，hIL-17A)表示一种源自人的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，其中，下划线部分表示信号肽。
SEQ ID NO：9：
MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNPKRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEILVLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA
IL-17A是一种由Th17细胞产生的促炎性细胞因子，通过结合其受体IL-17RA和IL-17RC而刺激诸如角质细胞、成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、关节滑膜细胞等产生IL-6、IL-8、G-CSF、GM-CSF、CXCL-1、CXCL-2、CCL-8、CCL-2、CCL-7等细胞因子，参与和促进多种由异常免疫反应介导的疾病，比如类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、银屑病性关节炎、斑块性银屑病、强直性脊柱炎等。
本发明的单克隆抗体是特异性识别IL-17A的中和性抗体，其通过与IL-17A的结合，进而阻断IL-17A通过其受体转导信号和介导生物学效应，从而预防和治疗由IL-17A介导的自身异常免疫性疾病。
在本说明书中，“抗人白介素17A单克隆抗体”表示这样的单克隆抗体：其能够以足够的亲和力结合人白介素17A，使得所述单克隆抗体可用作靶向人白介素17A的诊断剂和/或治疗剂。
在一个实施方案中，例如通过放射免疫测定(RIA)所测得的，抗人白介素17A单克隆抗体与无关的、非人白介素17A蛋白的结合的程度小于所述单克隆抗体与人白介素17A蛋白的结合的例如约10％。
在某些实施方案中，结合人白介素17A的单克隆抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更低，10-8M至10-13M，10-9M至10-13M)的平衡解离常数(KD)。
在一个实施方式中，本发明的抗人白介素17A单克隆抗体的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。SEQ ID NO：10
EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGIDLSLFYMSWIRQPPGKGLEWIGTIHEVASSYYASWAKGRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARETYSSRYPYPNIWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：11
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQNIGGSLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQSYNTISTYGLAFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
其中，SEQ ID NO：10和11均为经人源化的序列。
在本说明书中，“分离的”核酸表示已经与它的天然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括通常含有核酸分子的细胞中包含的核酸分子，但是所述核酸分子存在于染色体外或在不同于其天然染色体位置的染色体位置。
在本说明书中，“分离的编码抗人白介素17A单克隆抗体的核酸”表示编码抗体重链和轻链的一个或多个核酸分子，包括在单个载体或分开的载体中的这样的核酸分子、以及存在于宿主细胞中的一个或多个位置的这样的核酸分子。
在本说明书中，“载体”表示能够扩增与其连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自我复制的核酸结构的载体以及整合进它已经引入其中的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这样的载体在本文被称为“表达载体”。
在本说明书中，“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养”可互换使用，且表示其中已经引入外源核酸的细胞，包括这种细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，其包括原代转化的细胞和由其来源的后代(不考虑传代数)。后代在核酸内容物方面可以与亲本细胞不完全相同，但是可以含有突变。针对最初转化的细胞筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变体后代被包括在本说明书中。
在本说明书中，“药物组合物”表示这样的制品：其呈使得包含在其中的活性成分的生物活性有效的形式，并且所述组合物不含有对所述制剂要施用的受试者有不可接受的毒性的额外组分。
在本说明书中，“药学上可接受的载体”表示药物组合物中除了活性成分之外的成分，其对受试者无毒。药学上可接受的载体包括、但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明。应当理解的是，本发明不限于这些实施例。
实施例1抗人白介素17A单克隆抗体QX002N的制备
从上海近岸科技有限公司采购人白介素17A，用于免疫兔子，运用B细胞克隆技术筛选出对人白介素17A有抑制活性的单克隆抗体。首先，用binding ELISA检测细胞上清，挑选出与hIL-17A结合的克隆；再用blocking ELISA进行检测，挑选出能抑制hIL-17A与其受体结合的克隆。以上免疫和筛选过程委托给商业化公司完成。
挑选出8个克隆进行重组表达，并测序。并对37#克隆进行人源化改造。利用NCBIIgBlast进行人IgG胚系序列(Germline)同源性比对，选择IgGHV4-59*01作为重链CDR移植模板，将37#克隆重链的CDR区(即CDR-H1(SEQ ID No:1)、CDR-H2(SEQ ID No:2)和CDR-H3(SEQ ID No:3))移植入IgGHV4-59*01的骨架区；选择IGKV1-12*01作为轻链CDR移植模板，将37#克隆轻链的CDR区(即CDR-L1(SEQ ID No:4)、CDR-L2(SEQ ID No:5)和CDR-L3(SEQ IDNo:6))移植入IGKV1-12*01的骨架区；对骨架区特定位点进行回复突变，获得本发明的单克隆抗体QX002N可变区。最终，人源化后的重链可变区序列如SEQ ID NO：7所示；人源化后的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
上述重链可变区和轻链可变区的基因序列分别由人工合成，分别插入到pUC57载体中。用HindIII和NheI双酶切重链可变区基因，以及重链表达质粒pHZDCH；用HindIII和BsiWI双酶切轻链可变区基因，以及轻链表达质粒pHZDCK；用T4DNA连接酶将酶切好的片段分别插入对应的表达质粒中，构建重链表达质粒pHZDCH-37VH-Hu5和轻链表达质粒pHZDCK-37VK-Hu2。通过核酸电泳检测质粒的双酶切结果如图1所示。根据图1的结果可以看出，双酶切抗体重链可变区和轻链可变区以及重链和轻链表达质粒的结果，其中，重链和轻链的质粒大小约10000bp，轻链可变区约420bp，重链可变区约441bp。
将序列正确的重链表达质粒和轻链表达质粒共转染ExpiCHO-S细胞。转染前一天，将ExpiCHO-S细胞稀释成3×106个细胞/ml进行转染前传代。转染当天，将细胞密度稀释成6×106个细胞/ml，125ml摇瓶装25ml细胞，等待转染。转染和表达过程如图2所示。
转染后第7天，收获培养上清，用ProteinA进行一步纯化。用SDS-PAGE电泳检测纯化的抗体，将其命名为QX002N，利用蛋白电泳检测该抗体的结果如图3所示。蛋白电泳用变性还原胶检测，如图3的结果显示出有两条带，两个条带的大小分别约50kDa和25kDa，与重链(49.3kDa)和轻链(23.2kDa)理论分子量一致。
实施例2平衡解离常数(KD)的测定
用BiacoreT200检测QX002N与hIL-17A的亲和力，所有过程都在25℃进行。在CM5芯片上化学偶联Protein A蛋白，通过捕获法固定适量的抗体，使得Rmax小于50RU，捕获流速是10μl/min。将抗原进行梯度稀释，仪器流速切换成30μl/min，按照浓度从低到高的顺序依次流过参比通道和固定抗体的通道，流过缓冲液作为阴性对照。每一个结合、解离完成后用pH1.5甘氨酸再生芯片。用仪器自带的软件按照1:1结合模型进行拟合，计算抗体的结合速率常数ka，解离速率常数kd以及平衡解离常数KD值。
除此之外，将QX002N与目前已经商业化的针对hIL-17A的抗体，即Ixekizumab(IXE)和Secukinumab(SEC)的亲和力进行比较，针对已知抗体的检测方法与对QX002N进行检测的方法相同，结果如下表所示。
其中Ixekizumab(IXE)和Secukinumab(SEC)两个抗体分别通过购买市售的药品获得。
样品名称 ka(106M-1S-1) kd(10-5S-1) KD(pM)
QX002N 3.35 2.36 7.07
Ixekizumab(IXE) 1.70 2.58 15.35
Secukinumab(SEC) 0.24 6.55 339.00
每个样品检测两次，计算平均值。
实施例3实施例1中制备的抗人白介素17A单克隆抗体对表达人白介素17A或其突变体的细胞的活性抑制作用
3.1确定hIL-17A突变体瞬转表达上清的稀释倍数
由于hIL-17A突变体在哺乳动物细胞表达系统中的产量较低，因此不进行纯化，直接用图2所述的瞬转表达上清做细胞活性抑制实验，但需要通过细胞活性实验确定瞬转表达上清的稀释倍数。
hIL-17A能诱导HEK-BlueTM IL-17Cells释放分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。检测不同浓度hIL-17A标品诱导释放的SEAP量，并作浓度曲线图。将SEAP释放量接近上平台期的标品浓度3ng/ml，选定为工作浓度。
梯度稀释不同hIL-17A突变体瞬转表达上清，检测不同稀释度hIL-17A突变体诱导释放的SEAP量，当特定稀释倍数的hIL-17A突变体与3ng/ml hIL-17A标品诱导释放SEAP量相似时，选定该稀释倍数，用于研究抗体与hIL-17A识别表位的细胞抑制实验。
3.2通过细胞活性抑制实验研究抗体与hIL-17A识别表位
将不同浓度梯度的抗体分别与预先稀释的hIL-17A突变体(N78A)瞬转表达上清和3ng/ml hIL-17A标品孵育2小时，2小时后将上述孵育物转移到铺有HEK-BlueTM IL17Cells的96孔细胞培养板中，24小时后检测细胞中SEAP的表达情况，运用SoftMax Pro模拟四参数曲线分析结果(见图4)。抗体能抑制IL-17A诱导的SEAP释放量。如果抗体不能或者不能完全抑制hIL-17A突变体诱导的SEAP释放，则表示抗体不能结合hIL-17A突变体，突变对应的位点是抗体表位；如果抗体能抑制hIL-17A突变体诱导的SEAP释放，则表示抗体能结合hIL-17A突变体，突变对应的位点不是抗体表位。
实验结果显示，人IL-17A的N78突变成A后，QX002N不能完全抑制SEAP释放。而且相同实验表明，QX002N不能抑制食蟹猴IL-17A诱导SEAP释放，但能抑制恒河猴IL-17A诱导SEAP释放。因此人IL-17A的N78是QX002N表位。
需要说明的是，图5示出了人、恒河猴和食蟹猴的IL-17A氨基酸序列比对结果，人和恒河猴IL-17A的78位是N，但食蟹猴IL-17A的78位是K。
针对SEC、IXE也采用上述同样的方法进行检测，实验结果表明SEC、IXE均能够结合hIL-17A突变体(N78A)、食蟹猴IL-17A。因此，QX002N与SEC、IXE的表位都不一样。
实施例4QX002N的体内活性研究
白介素17(Interleukin-17,IL-17)是一种促炎症性细胞因子，主要由活化的记忆性CD4+T淋巴细胞分泌。IL-17与受体结合后可以诱导释放炎症因子(TNF-α、IL-1、IL-6、G-CSF、GM-CSF)和趋化因子(CXCL1、CXCL2、IL-8、CCL2、CCL7)，介导炎性细胞的浸润及组织损伤；此外，IL-17还与其它炎症因子(如TNF-α，IL-6等)具有协同效应，放大其促炎效应,研究证实IL-17参与多种自身免疫性疾病(如银屑病、类风湿关节炎、类风湿性心脏病等)的发生。本研究发现QX002N可以抑制IL-17A诱导小鼠体内KC(Keratinocyte Chemoattractant，即角质细胞趋化因子，其与人体中趋化因子CXCL1相当)的产生，提示QX002N具有体内抑制IL-17A生物学活性的功能。
实验动物为C57BL/6雌性小鼠，6～8周龄。将小鼠随机分为12组并称重，每组6只小鼠。其中，2组小鼠经眼眶静脉丛注射200μl PBS，其余组小鼠经眼眶静脉丛注射200μl不同浓度的各组抗体药物溶液。在注射PBS或抗体药物1小时后，2组经眼眶静脉注射PBS的小鼠中1组经背部皮下注射200μl PBS，另1组及其余各组小鼠经背部皮下注射200μl IL-17A(15μg/ml)。每组小鼠在注射PBS或IL-17A 2h后经眼眶取血，全血室温静置2h，3000rpm，4℃离心10min，吸取上层血清。采用ELISA方法检测小鼠血清样本中的KC含量。需要说明的是，下述简要流程及图6中的“37-5”即为QX002N。
简要的实验流程如下：
实验结果如图6所示。可知，QX002N可以抑制IL-17A诱导小鼠体内KC的释放，并呈现出一定抗体浓度依赖性。这提示QX002N可以在体内有效的抑制IL-17A的功能，具备体内药效活性。进一步从图6中的数据可以看出，QX002N效果与目前已经批准上市的药物SEC和IXE的效果相当或稍优于SEC和IXE。
序列表
<110> 江苏荃信生物医药有限公司
<120> 抗人白介素17A单克隆抗体及其应用
<130> PB00089
<141> 2018-01-31
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Leu Phe Tyr Met Ser
1 5
<210> 2
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Ile His Glu Val Ala Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Thr Tyr Ser Ser Arg Tyr Pro Tyr Pro Asn Ile
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser
1 5
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gln Ser Tyr Asn Thr Ile Ser Thr Tyr Gly Leu Ala
1 5 10
<210> 7
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Leu Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile His Glu Val Ala Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Thr Tyr Ser Ser Arg Tyr Pro Tyr Pro Asn Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asn Thr Ile Ser Thr
85 90 95
Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 9
<211> 155
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly
20 25 30
Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn
35 40 45
Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser
50 55 60
Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu
65 70 75 80
Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His
85 90 95
Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser
100 105 110
Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His
115 120 125
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys
130 135 140
Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala
145 150 155
<210> 10
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser Leu Phe
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Thr Ile His Glu Val Ala Ser Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
50 55 60
Gly Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Glu Thr Tyr Ser Ser Arg Tyr Pro Tyr Pro Asn Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 11
<211> 217
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asn Ile Gly Gly Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asn Thr Ile Ser Thr
85 90 95
Tyr Gly Leu Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu
115 120 125
Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro
130 135 140
Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly
145 150 155 160
Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His
180 185 190
Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val
195 200 205
Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215

Claims (10)

1.一种分离的抗人白介素17A单克隆抗体，其包含三个重链互补决定区(CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)和三个轻链互补决定区(CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3)，其中：
(a)CDR-H1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
(b)CDR-H2的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(c)CDR-H3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
(d)CDR-L1的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
(e)CDR-L2的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；且
(f)CDR-L3的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；且，
所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其结合人白介素17A中包括第78位的天冬酰胺(N78)的抗原表位。
4.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体。
5.一种宿主细胞，其包含根据权利要求4所述的核酸。
6.一种生产单克隆抗体的方法，所述方法包括培养根据权利要求5所述的宿主细胞从而生产根据权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体。
7.一种药物组合物，其包含根据权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其用于治疗自身免疫性疾病。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、银屑病、克罗恩病、多发性硬化、银屑病性关节炎、斑块性银屑病和/或强直性脊柱炎。
10.根据权利要求1～3中任一项所述的单克隆抗体在制备用于治疗自身免疫性疾病的药物中的用途。
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