TWI501776B - 抗ｉｌ－１２／ｉｌ－２３抗體 - Google Patents

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Description

抗IL-12/IL-23抗體
申請資料
本申請案與2008年8月14日申請之澳洲專利申請案第2008904178號及2008年8月14日申請之美國專利申請案第61/089028號相關且主張此等申請案之優先權，此等申請案中每一者之全部內容皆以引用的方式併入本文中。
本發明係關於與人類IL-12及IL-23結合之抗體。
本說明書中由作者所提及之出版物之書目細節係按字母順序集中於說明書之結尾處。
本說明書中對任何先前技術之提及均非且亦不應被視作承認或以任何形式暗示此先前技術形成任何國家之公知常識之一部分。
介白素-12(亦稱作細胞毒性淋巴細胞成熟因子或天然殺手細胞刺激因子)為75-kDa異二聚蛋白質。其係由類似於I類細胞介素之p35亞單位組成，該p35亞單位包含四α螺旋束。p35中之11個胺基酸的C-末端至C63被稱作二硫鍵環，這係因為此區含有許多與p40(IL-12之另一個亞單位)接觸之殘基，包括與p40中之C177形成之鏈間二硫鍵。p40亞單位如同其他I類受體(諸如生長激素受體(GHR))之細胞外域一般摺疊。
p40亞單位具有三個標記為D1、D2及D3之結構域。各結構域均為β-摺疊結構，其中D2結構域含有C177鏈間二硫鍵。D2上亦存在N-連接糖基化位點(GlcNAc-GlcNAc-甘露糖，其中GlcNAc為N-乙醯葡萄胺糖)(Yoon等人，2000 Embo J 19 3530-41)。
新近(2000年)，已藉由根據通過計算推導出之介白素-6螺旋細胞介素家族成員之特徵搜索序列資料庫而發現介白素-23。此搜索使得發現新穎細胞介素亞單位，該亞單位被稱為IL-23p19(p19)。此亞單位與IL-12p40共同表現，導致分泌被稱作介白素-23(IL-23)之異二聚蛋白質。吾人認為IL-23p19與IL-12p35相似，因為其含有四螺旋束(Oppmann等人，2000 Immunity 13 715-25)。
IL-12對其靶細胞類型之特異性作用係由IL-12R複合物介導，該複合物由IL-12Rβ1(Chua等人，1994 J Immunol 153 128-36)及IL-12Rβ2(Presky等人，1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 14002-7)組成。IL-23對其靶細胞類型之特異性作用係由IL-23R複合物介導，該複合物係由IL-12Rβ1及IL-23R組成(Parham等人，2002 J Immunol 168 5699-708)。
IL-12Rβ1與IL-12及IL-23之結合係經由共同p40亞單位介導。此係使用競爭實驗來證實，在競爭實驗中，p40亞單位之同元二聚體(p80)與IL-12競爭結合IL-12Rβ1。然而，p80對IL-12與IL-12Rβ2之結合並無影響(Presky等人，1996 Ann N Y Acad Sci 795 390-3)。
由此可見，IL-12之p35亞單位或異二聚界面負責與IL-12Rβ2結合，從而賦予IL-12對IL-12R複合物之選擇性(Trinchieri等人，2003 Immunity 19 641-4)。同樣，IL-23之p19或異二聚界面負責與IL-23R結合，從而賦予IL-23對IL-23R複合物之選擇性。
IL-12R及IL-23R複合物之信號傳導已經得到闡明。IL-12R活化Janus激酶(Janus kinase，JAK)-信號轉導子及轉錄活化因子(STAT)信號轉導路徑。IL-12之實際細胞效應主要歸因於STAT4活化(Kaplan等人，1996 Nature 382 174-7)。IL-12Rβ2上存在STAT4結合位點，指示此受體對於信號傳導較為重要(Yao等人，1999 Arch Biochem Biophys 368 147-55)。此亦由IL-12Rβ2表現與TH 1細胞對IL-12之反應性的相關性證實(Rogge等人，1997 J Exp Med 185 825-31)。IL-23R活化與IL-12R類似之複合物，諸如JAK-STAT路徑。與STAT4相比，STAT3更顯著地由IL-23與IL-23R之結合所誘導且其他所產生之DNA-結合STAT轉錄因子複合物係不同的(Parham，Chirica等人，2002 J Immunol 168 5699-708)。
IL-12及IL-23之生物效應互不相同。IL-12係由活化炎性細胞(單核細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、小神經膠質細胞、樹狀細胞)分泌。對於IL-12而言，主要研究其對淋巴細胞之作用，儘管其亦影響其他細胞類型。在炎性反應期間，IL-12誘導NK細胞及T細胞產生干擾素-γ(IFN-γ)。接著，IL-12(可能與IFN-γ組合)誘導T細胞分化成TH 1細胞。此反應刺激細胞免疫系統且使巨噬細胞對病原體之殺死作用及CD8+T細胞之增殖達到最大限度(Trinchieri 2003 Nat Rev Immunol 3 133-46)。IL-12的過度產生與自體免疫性之促炎活性升高及典型組織損傷有關(Leonard等人，1997 Crit Rev Immunol 17 545-53)。失調之IL-12產生已涉及下列疾病：牛皮癬(Yawalkar等人，1998 J Invest Dermatol 111 1053-7；de Rie 1999 Dermatology 199 101；Shaker等人，2006 Clin Biochem 39 119-25)、克羅恩氏病(Crohn's Disease)(Neurath等人，1995 J Exp Med 182 1281-90；Simpson等人，1998 J Exp Med 187 1225-34；Camoglio等人，2002 Eur J Immunol 32 261-9)、多發性硬化(Fassbender等人，1998 Neurology 51 753-8；Laman等人，1998 J Neuroimmunol 86 30-45)、類風濕性關節炎(Kim等人，2000 Clin Exp Immunol 119 175-81；Leung等人，2000 J Immunol 164 6495-502)連同其他自體免疫疾病。IL-12在此等疾病中之作用尚不清楚，然而，吾人認為可能涉及TH 1反應之過度極化(overpolarisation)(Gordon等人，2005 Curr Opin Gastroenterol 21 431-7)。
IL-23係由活化人類巨噬細胞以及樹狀細胞分泌(Verreck等人，2004 Proc Natl Acad Sci U S A 101 4560-5)。IL-23主要作用於記憶T-細胞且如鼠類脾細胞回應IL-23而分泌IL-17之能力所證實，已假定其經由調節IL-17A及IL-17F來促進自體免疫疾病。在人類中，存在IL-23/IL-17路徑，且IL-23已展示為與IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α以及IL-17(所有促炎性細胞介素)同樣良好之誘導物。試管內，IL-6及TGF-β1促進稚T-細胞(T-cell)進入新近發現之T-細胞路徑(TH 17)(Zhou等人，2007 Nat Immunol 8 967-74)。經由分泌IL-21而以自分泌方式進一步驅動此等細胞。最後，吾人認為IL-23及/或IL-1β在此TH 17反應中維持細胞(關於評述，參見Dong 2008 Nat Rev Immunol 8 337-48)。轉錄因子RORγt亦相關，其已展示為在TH 17反應中經上調(Chen等人，2007 Arthritis Rheum 56 2936-46)。
因為IL-12及IL-23含有共同亞單位，所以難以將疾病病況單獨歸因於一種介白素或另一者之過度產生。然而，研究指示IL-23失調已涉及下列疾病：牛皮癬(Lee等人，2004 J Exp Med 199 125-30；Torti等人，2007 J Am Acad Dermatol 571059-68)、克羅恩氏病(Neurath 2007 Nat Med 13 26-8)及多發性硬化(Cua等人，2003 Nature 421 744-8)連同其他自體免疫疾病。
IL-12p40可以單體(IL-12p40)或同元二聚體(IL-12p80)形式分泌，該同元二聚體為兩個經由二硫鍵結合在一起之p40亞單位(Gillessen等人，1995 Eur J Immunol 25 200-6)。在鼠類休克模型中，此等p40物質以相較於IL-1250倍過量之量分泌(Gillessen，Carvajal等人，1995 Eur J Immunol 25 200-6)且在人類周邊血單核細胞(PBMC)中以10-20倍過量之量分泌(D'Andrea等人，1992 J Exp Med 176 1387-98)。IL-12p80在試管內可拮抗IL-12活性，其作用為IL-12p40之作用的20倍(Gillessen，Carvajal等人，1995 Eur J Immunol 25 200-6)。已展示重組IL-12p80與IL-12β1結合(Wang等人，1999 Eur J Immunol 29 2007-13)。
因為已展示重組鼠類IL-12p80(rmIL-12p80)在活體內及試管內與IL-12/23競爭結合IL-12Rβ1，所以將IL-12p40/p80視作IL-12/23受體複合物之拮抗劑(Mattner等人，1993 Eur J Immunol 23 2202-8；Gillessen，Carvajal等人，1995 Eur J Immunol 25 200-6；Gately等人，1996 Ann N Y Acad Sci 795 1-12)。在鼠類模型中，亦已展示該同元二聚體防止IL-12介導之休克(Mattner等人，1997 Infect Immun 65 4734-7)。在對IL-23介導之免疫功能之研究中，IL-12p40藉由競爭性結合IL-12Rβ1而削弱IL-23誘導之細胞介素產生(Shimozato等人，2006 Immunology 117 22-8)。新近，IL-12p40或IL-12p80已涉及其他生物作用。IL-12p80之一種最早明確之活性為作為巨噬細胞之化學引誘劑。IL-12Rβ1缺乏性巨噬細胞(而非IL-12Rβ2或IL-12p35缺乏性巨噬細胞)對rmIL-12p80之化學引誘反應降低，指示IL-12Rβ1可在不存在IL-12Rβ2的情況下介導對IL-12p80之反應且IL-12p80活性與IL-12無關(Russell等人，2003 J Immunol 171 6866-74)。IL-12p80亦可充當樹狀細胞(DC)遷移之誘導物。IL-12p40缺乏性DC不能回應分枝桿菌(mycobacteria)而自肺遷移至淋巴結。以下事實突出IL-12p40之此獨特作用：喪失IL-12p35及IL-23p19不會影響分枝桿菌活化之DC回應趨化因子而遷移及驅使T-細胞擴增之能力(Khader等人，2006 J Exp Med 203 1805-15)。亦已展示IL-12p40及IL-12p80在肺中介導炎性反應且已展示其藉由CD8+ T細胞誘導IFN-γ產生(Cooper等人，2007 Trends Immunol 28 33-8)。
由於IL-12及IL-23已涉及多種病症，已設計多種治療策略來抑制IL-12及/或IL-23活性。一些最早描述之抗體為鼠類單株抗體，其係由用IL-12免疫之小鼠的融合瘤分泌(Strober等人，PCT公開案第WO 97/15327號；Gately等人，WO99/37682 A2；Neurath,Fuss等人，1995 J Exp Med 182 1281-90)。歸因於對人類投予小鼠免疫球蛋白所引起之問題，限制使用此等鼠類抗體來治療人類。該等問題包括產生針對小鼠免疫球蛋白之自體抗體，從而消除其在血清中之存在且使任何治療效應皆無效。此稱作人類抗小鼠抗體(HAMA)之作用隨著僅將鼠類序列限制於該抗體之可變區的嵌合抗體之出現而部分地得到克服(Junghans等人，1990 Cancer Res 50 1495-502；Brown等人，1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88 2663-7)。已描述嵌合抗體與IL-12結合(Perritt等人，PCT公開案第WO 02/097048A2號)。甚至更多的類人類抗體為「人類化抗體」，其含有供體鼠類抗體之互補決定區且具有源自人類接受體抗體之可變構架區(Jones等人，1986 Nature 321 522-5；Winter,美國專利第5,225,539號；Queen等人，美國專利第5,693,761號)。Lacy等人在WO 07/005608中描述該等針對IL-12及IL-23之「人類化」抗體。最近，已描述自來源於人類來源(Winter等人，美國專利第7,306,907號；MacCafferty等人，美國專利第5,969,108號)或具有人類免疫球蛋白轉殖基因之小鼠(Tomizuka等人，美國專利第7,041,870號；Kucherlapati等人，美國專利第5,939,598號)的呈現文庫所獲得之完全人類抗體。Salfeld等人(美國專利第6,9141,28號)描述針對IL-12之完全人類抗體。
可基於與IL-12、IL-23、IL-12p40及IL-12p80之相互作用預測5種廣泛類別之抗體(圖1)。第一類抗體為特異性地與IL-12及IL-23中所存在之IL-12p40以及IL-12p40單體及IL-12p80同元二聚體相互作用之抗體(圖1.1)。第二類抗體為特異性地與IL-12p35相互作用之抗體(如由Devergne等人，2001 Am J Pathol 159 1763-76中之抗體G161-566所例示；圖1.2)。第三類抗體為特異性地與IL-12而非IL-23、IL-12p35及IL-12p40相互作用之抗體(如由D'Andrea,Rengaraju等人，1992 J Exp Med 176 1387-98中之抗體20C2所例示；圖1.3)。第四類抗體為特異性地與IL-23p19相互作用之抗體(如由Presta等人，WO 2007/027714所例示；圖1.4)。第五類抗體為特異性地與IL-23p40而非IL-12p40相互作用之抗體，其利用在IL-23上暴露但在IL-12中由IL-12p35亞單位遮蓋之IL-12p40亞單位上之序列(如由Benson等人，美國專利第7,247,711號所例示；圖1.5)。本發明描述第一類抗體之新穎形式，其特異性地與IL-12p40、IL-12p80、IL-12及IL-23相互作用(圖1.1)。
已知一些關於使此第一類抗體抑制IL-12/23受體-配位體複合物且從而發揮其拮抗作用之方法的資訊。Giles-Komar等人(WO 2006/069036)描述特異性針對IL-12p40之胺基酸殘基1-88的抗IL-12p40抗體。此抗體之進一步特徵在於特異性抑制IL-12及IL-23與IL-12Rβ1之相互作用(Papp等人，2008 Lancet 371 1675-84)。同樣，文獻中將另一抗體描述為抑制IL-12/23與IL-12Rβ1之相互作用(Ding等人，2008 Curr Opin Investig Drugs 9 515-22)。本發明描述經由新穎作用機制抑制IL-12/23受體-配位體複合物之抗體(圖2.3)。此等新穎作用機制包括選擇性中和IL-12/IL-12Rβ2相互作用及IL-23/IL-23R相互作用。其不同於先前所述之抗體(參見上文)，因為其並不中和IL-12/23與IL-12Rβ1之結合。此等抗體亦為新穎的，因為其並不抑制IL-12p40/p80與IL-12Rβ1之結合且因此並不抑制IL-12p40/80在宿主防禦中發揮作用，從而相對於其他IL-12/23抗體潛在地增加此等抗體之安全性特徵。該等具有新穎作用機制之抗體可使得與IL-12/23相關之疾病之治療得到改善且減少安全性顧慮。另外，此等抗體可能具有改良之療效，因為其並不抑制IL-12及IL-23之天然拮抗劑IL-12p40或IL-12p80。此允許該抗體及IL-12p40或IL-12p80充當拮抗劑，從而使抑制水平增至高於單獨投予該抗體之抑制水平。
本發明提供一種抗體，其包含與人類IL-12及人類IL-23結合之抗原結合域，其中該抗體與以單體形式(人類IL-12p40)及以同元二聚體形式(人類IL-12p80)存在之人類IL-12p40結合且其中該抗體抑制人類IL-12與人類IL-12Rβ2之結合及人類IL-23與人類IL-23R之結合，但不抑制人類IL-12或人類IL-23或人類IL-12p40或人類IL-12p80與人類IL-12Rβ1的結合。
本發明進一步提供一種治療或減輕細胞、組織、器官、動物或患者中至少一種IL-12及/或IL-23疾病之症狀的方法，其包含使用本發明之抗體或其特定部分或變異體。
本發明之抗體亦可用於偵測或量測樣本中IL-12、IL-23、IL-12p40或IL-12p80之存在。該方法包括將該抗體添加至樣本中及量測該抗體與樣本中存在之IL-12、IL-23、IL-12p40或IL-12p80的結合。
為能更充分地瞭解本發明之性質，現將參考下列圖式及實施例來描述其各種形式。
本發明之發明者提出一組針對IL-12之抗體。在篩選此等抗體時，驚人地發現特定抗體子集與人類IL-12及IL-23結合且抑制IL-12與IL-12Rβ2之結合及IL-23與IL-23R之結合，但並不抑制IL-12或IL-23或IL-12p40或IL-12p80與IL-12Rβ1的結合。從而能夠以先前無法達成之方式來改變IL-12及IL-23之活性。
因此，本發明提供一種抗體，其包含與人類IL-12及人類IL-23結合之抗原結合域，其中該抗體與以單體形式(人類IL-12p40)及以同元二聚體形式(人類IL-12p80)存在之人類IL-12p40結合且其中該抗體抑制人類IL-12與人類IL-12Rβ2之結合及人類IL-23與人類IL-23R之結合，但不抑制人類IL-12或人類IL-23或人類IL-12p40或人類IL-12p80與人類IL-12Rβ1的結合。
在一較佳具體實例中，該抗體與包含具有PMA204序列(SEQ ID NO. 6)之重鏈可變區的抗體及/或包含具有PMA204序列(SEQ ID NO. 7)之輕鏈可變區的抗體競爭結合人類IL-12及/或人類IL-23。
如本文中所用，「競爭」意謂當以與PMA204相同之濃度使用時，如由ELISA所測試，測試抗體使PMA204與IL-12、IL-23或IL-12p40之結合降低至少10%。
本發明提供一種與IL-12及IL-23中存在之IL-12p40結合之抗體或其變異體，該IL-12p40具有如SEQ ID No 1所列且下文給出之序列：
在一較佳具體實例中，由該抗體結合之抗原決定基係處於序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO:65)中。特定而言，該抗體與人類IL-12p40(SEQ ID No. 1)在Asp 265處結合。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體，其包含與人類IL-23(SEQ ID NO:66)結合之抗原結合域，其中該抗體與人類IL-23(SEQ ID NO:66)結合之水平係大於該抗體與突變體IL-23 D265A(SEQ ID NO:75)結合之水平。
此抗體亦可與以單體形式(人類IL-12p40)及以同元二聚體形式(人類IL-12p80)存在之人類IL-12p40結合且抑制人類IL-12與人類IL-12Rβ2之結合及人類IL-23與人類IL-23R之結合，但不抑制人類IL-12或人類IL-23或人類IL-12p40或人類IL-12p80與人類IL-12Rβ1的結合。
本發明提供可藉由選擇性中和IL-12與IL-12Rβ2之結合及IL-23與IL-23R之結合而用於治療至少一種IL-12及/或一種IL-23相關病狀之抗體。
本發明提供一種抗體，其包含3個選自以下者之重鏈CDR序列：CDRHC1　DYYX1 H，其中：X1 =M或L；CDRHC2　WIDPENGDTEX2 APKFQG，其中：X2 =Y、H或S；CDRHC3　X3 KELRYFDV，其中：X3 =C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P或V。
本發明提供一種抗體，其包含3個選自以下者之輕鏈CDR序列：CDRLC1　RAX4 X5 SISINLH，其中：X4 =S或P；X5 =Q或R；CDRLC2　FAX6 QSX7 S，其中：X6 =S或R；X7 =I或T；CDRLC3　QQSNSX8 PLT，其中：X8 =W或F。
本發明提供一種抗體，其包含3個選自以下者之重鏈CDR序列：CDRHC1　DYYX1 H，其中：X1 =M或L；CDRHC2　WIDPENGDTEX2 APKFQG，其中：X2 =Y、H或S；CDRHC3　X3 KELRYFDV，其中：X3 =C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P或V；及3個選自以下者之輕鏈CDR序列：CDRLC1　RAX4 X5 SISINLH，其中：X4 =S或P；X5 =Q或R；CDRLC2　FAX6 QSX7 S，其中：X6 =S或R；X7 =I或T；CDRLC3　QQSNSX8 PLT，其中：X8 =W或F。
本發明提供一種抗體，其包含由一種以下序列組成之免疫球蛋白重鏈可變區：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:141及SEQ ID NO:167。
本發明提供一種抗體，其包含由一種以下序列組成之免疫球蛋白輕鏈可變區：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:179及SEQ ID NO:192。
本發明提供一種另外包含人類重鏈接受體構架之抗體。特定而言，提供一種抗體，其中該接受體構架包含選自由SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:204及SEQ ID NO:207所組成之群組的胺基酸序列。
本發明提供一種另外包含人類輕鏈接受體構架之抗體。特定而言，提供一種抗體，其中該接受體構架包含選自由SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:212及SEQ ID NO:215所組成之群組的胺基酸序列。
本發明提供一種包含兩個免疫球蛋白可變區之抗體，其中該兩個免疫球蛋白可變區係選自以下者所組成之群組：
本發明提供一種抗體，其中該人類接受體構架在關鍵殘基處包含至少一個構架區胺基酸取代，該關鍵殘基係選自由以下殘基所組成之群組：與CDR相鄰之殘基、糖基化位點殘基、稀有殘基(rare residue)、能與人類IL-12之p40亞單位相互作用之殘基、能與CDR相互作用之殘基、典型殘基(canonical residue)、介於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、微調區(Vernier zone)中之殘基及在Chothia定義之VH域CDR1與Kabat定義之第一重鏈構架之間重疊的區域中之殘基。在另一態樣中，該人類接受體構架包含至少一個構架區胺基酸取代，其中構架之胺基酸序列與該人類接受體構架之序列至少65%一致且包含至少70個與該人類接受體構架一致之胺基酸殘基。
本發明提供一種抗體，其為一致人類VH域。另外，本發明提供一種抗體，其為一致人類VL域。
本發明提供一種抗體，其中該人類接受體構架包含至少一個構架區胺基酸取代，其中構架之胺基酸序列與該人類接受體構架之序列至少65%一致且包含至少70個與該人類接受體構架一致之胺基酸殘基。
本發明描述一種抗體，其中該抗體含有選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE及IgA所組成之群組的人類或非人類靈長類動物重鏈免疫球蛋白恆定區。
本發明描述一種抗體，其中該抗體含有選自由κ或λ所組成之群組的人類或非人類靈長類動物輕鏈免疫球蛋白恆定區。
本發明亦提供一種產生本發明之抗體的方法，該方法包含：
(i)用人類IL-12p40或人類IL-12p40之片段使動物免疫以獲得第一組抗體；
(ii)自第一組選擇與人類IL-12及人類IL-23結合之抗體以形成第二組抗體；及
(iii)自第二組選擇與以單體形式(人類IL-12p40)及以同元二聚體形式(人類IL-12p80)存在之p40結合且抑制人類IL-12與人類IL-12Rβ2之結合及人類IL-23與人類IL-23R之結合但不抑制人類IL-12或人類IL-23或人類IL-12p40或人類IL-12p80與人類IL-12Rβ1的結合之抗體。
此方法亦可包含在步驟(ii)中選擇亦與具有序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO. 65)之肽結合的抗體。
本發明亦提供另一種產生本發明之抗體的方法，該方法包含：
(i)用具有序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO. 65)之肽使動物免疫以獲得第一組抗體；
(ii)自第一組選擇與人類IL-12及人類IL-23結合之抗體以形成第二組抗體；及
(iii)自第二組選擇與以單體形式(人類IL-12p40)及以同元二聚體形式(人類IL-12p80)存在之p40結合且抑制人類IL-12與人類IL-12Rβ2之結合及人類IL-23與人類IL-23R之結合但不抑制人類IL-12或人類IL-23或人類IL-12p40或人類IL-12p80與人類IL-12Rβ1的結合之抗體。
本發明亦提供另一種產生本發明之抗體的方法，該方法包含：
(i)獲得人類抗體呈現文庫以形成第一組抗體；
(ii)自第一組選擇與人類IL-12及人類IL-23結合之抗體以形成第二組抗體；及
(iii)自第二組選擇與以單體形式(人類IL-12p40)及/或以同元二聚體形式(人類IL-12p80)存在之p40結合且抑制人類IL-12與人類IL-12Rβ2之結合及人類IL-23與人類IL-23R之結合，但不抑制人類IL-12或人類IL-23或人類IL-12p40或人類IL-12p80與人類IL-12Rβ1的結合之抗體。
本發明提供編碼本發明之VH域的核酸分子。該核酸分子較佳地具有選自以下者之序列：
本發明提供編碼本發明之VL域的核酸分子。該核酸分子較佳地具有選自以下者之序列：
本發明亦提供一種治療個體疾病之方法，其包含對該個體投予本發明之抗體，其中該疾病係選自由以下者所組成之群組：類風濕性關節炎、骨關節炎、反應性關節炎、牛皮癬性關節炎、骨質流失、氣管過敏、慢性阻塞性肺病、髓鞘脫失病症、牛皮癬、多發性硬化、皮膚過敏、急性及慢性移植排斥、同種異體移植排斥、移植物抗宿主疾病、全身性硬化、全身性紅斑狼瘡、自體免疫發炎性腸病、泌尿發炎性病症、心血管疾病、血管炎、週期性發熱、葡萄 糖代謝病症、肺病、癌症、牙周炎、皰疹性基質角膜炎(herpetic stromal keratitis)、過敏症、發炎性疼痛、脊椎關節病、敗血症、敗血性或內毒素休克、腦膜炎、手術創傷、自體免疫血液學病症、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、類肉瘤病、肝硬化、肝炎(包括自體免疫肝炎)、原發性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、甲狀腺炎、動脈粥樣硬化、禿髮、威爾遜氏病(Wilson's disease)、絲球體腎炎及異常血脂症。
本發明進一步在方法或組合物中提供至少一種抗體、其特定部分或變異體，其在以治療有效量投予時調節細胞、組織、器官、動物或患者中之至少一種IL-12及/或IL-23疾病、治療或減輕其症狀，及/或如此項技術中所知及/或如本文中所述為多種不同情況所需，諸如(但不限於)在相關疾病或治療情況之前、之後或期間需要該至少一種抗體、其特定部分或變異體。
本發明進一步在方法或組合物中提供至少一種抗體、其特定部分或變異體，其在以治療有效量投予時調節下列疾病，治療或減輕下列疾病之症狀：免疫、神經及相關病症，諸如(但不限於)關節炎、骨關節炎、類風濕性關節炎、青少年慢性關節炎、膿毒性關節炎、萊姆關節炎(Lyme arthritis)、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發炎性腸病、胰島素依賴型糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾病、牛皮癬、皮炎、硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官移植排 斥、與器官移植相關之急性或慢性免疫疾病、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、散播性血管內凝血、川崎氏病(Kawasaki's disease)、格雷氏病(Grave's disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉牙腫病(Wegener's granulomatosis)、亨偌-絲奇恩賴紫癜(Henoch-Schoenlein purpurea)、顯微鏡下腎血管炎(microscopic vasculitis of the kidneys)、慢性活動性肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克症候群、敗血症症候群、惡病質、傳染病、寄生蟲病、後天免疫缺失症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病(Huntington's chorea)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、阿茲海默氏症、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性疾病、心臟衰竭、心肌梗塞、艾迪森氏病(Addison's disease)、偶發性I型多腺體缺乏及II型多腺體缺乏、施密特氏症候群(Schmidt's syndrome)、成人(急性)呼吸窘迫症候群、禿髮、斑禿、血清反應陰性之關節病、關節病、萊特爾氏病(Reiter's disease)、牛皮癬性關節病、潰瘍性結腸性關節病、腸病性滑膜炎、披衣菌(chlamydia)、耶氏桿菌(yersinia)及沙門氏菌(salmonella)相關性關節病、脊椎關節病、動脈粥樣化疾病/動脈硬化、特異體質過敏、自體免疫大皰病、尋常天疱瘡、落葉狀天疱瘡、類天疱瘡、線性IgA疾病、自體免疫溶血性貧血、庫姆氏陽性溶血性貧血(Coombs positive haemolytic anaemia)、後天惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛性腦炎/皇家自由疾病(Royal Free Disease)、慢性黏膜與皮膚性念珠菌病、巨細胞性動脈 炎、原發性硬化性肝炎、原因不明性自體免疫肝炎、後天免疫缺失病症候群、後天免疫缺失相關疾病、B型肝炎、C型肝炎、常見變異型免疫缺失(常見變異型低γ球蛋白血症)、擴張型心肌病、女性不孕症、卵巢功能衰竭、卵巢早衰、纖維變性肺病、原因不明性纖維性肺泡炎、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結締組織病相關性間質性肺病、混合結締組織病相關性肺病、全身性硬化相關性間質性肺病、類風濕性關節炎相關性間質性肺病、全身性紅斑狼瘡相關性肺病、皮肌炎/多發性肌炎相關性肺病、休格倫氏病相關性肺病(Sjogren's disease associated lung disease)、強直性脊椎炎相關性肺病、血管炎擴散性肺病、含鐵血黃素沈積症相關性肺病(haemosiderosis associated lung disease)、藥物誘發性間質性肺病、纖維化、放射性纖維化、阻塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血球肺炎、淋巴球浸潤性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關節炎、自體免疫肝炎、1型自體免疫肝炎(經典自體免疫或類狼瘡性肝炎)、2型自體免疫肝炎(抗LKM抗體肝炎)、自體免疫介導之低血糖症、伴有黑色棘皮症之B型胰島素抵抗、副甲狀腺低能症、與器官移植相關之急性免疫疾病、與器官移植相關之慢性免疫疾病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、1型牛皮癬、2型牛皮癬、特發性白血球減少病、自體免疫嗜中性白血球減少症、NOS型腎病、絲球體腎炎、顯微鏡下腎血管炎、萊姆病(Lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性或NOS型男性不育症、精子自體免疫、多發性硬化(所有亞型)、交感性眼炎、結締組織病繼發性肺循環血壓過高、古德帕斯徹氏症候群(Goodpasture's syndrome)、結節性多動脈炎之肺部表現、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、斯蒂爾氏病(Still's disease)、全身性硬化、休格倫氏症候群(Sjorgren's syndrome)、高安氏病(Takayasu's disease)/動脈炎、自體免疫血小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫甲狀腺病、甲狀腺機能亢進症、甲狀腺腫性自體免疫甲狀腺低能症(橋本氏病(Hashimoto's disease))、萎縮性自體免疫甲狀腺低能症、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis)、原發性血管炎、白斑病、急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發性肝損傷、膽汁鬱滯、特異體質肝病、藥物誘發性肝炎、非酒精性脂肝炎、過敏及哮喘、B群鏈球菌(group B streptococci，GBS)感染、精神障礙(例如抑鬱症及精神分裂症)、TH 2型及TH 1型介導之疾病、急性及慢性疼痛(不同疼痛形式)及癌症(諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌，及造血組織惡性疾病(白血病及淋巴瘤))、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病(ALL)、急性骨髓白血病(AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰腺炎、急性腎衰竭、腺癌、空氣異位搏動、AIDS癡呆綜合症、酒精誘發性肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、肌萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、抗磷脂症候群、抗受體過敏反應、主動脈瘤及周邊動脈瘤、主動脈夾層(aortic dissection)、動脈高壓、動脈硬化、動靜脈瘺、運動失調、心房微顫(持續性或陣發性)、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥反應、束支阻滯(bundle branch block)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、燒傷、心律不整、心臟頓抑症候群(cardiac stun syndrome)、心臟腫瘤、心肌病、心肺繞道發炎反應(cardiopulmonary bypass inflammation response)、軟骨移植排斥、小腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多病灶性心房跳動過速、化學療法相關病症、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎性病變、慢性淋巴球性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水楊酸鹽中毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮炎、肺原性心臟病(cor pulmonale)、冠狀動脈疾病、克-亞二氏症(Creutzfeldt-Jakob disease)、培養物陰性敗血症、囊腫纖維化、細胞介素療法相關病症、拳擊員癡呆(Dementia pugilistica)、髓鞘脫失疾病、出血性登革熱(dengue hemorrhagic fever)、皮炎、皮膚病狀、糖尿病(diabete/diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化疾病、泛發性路易體疾病(Diffuse Lewy body disease)、擴張型充血性心肌病、基底神經節病症、中年唐氏症候群(Down's Syndrome in middle age)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發之藥物誘發性運動障礙、藥物過敏、濕疹、腦脊髓炎、心內膜炎、內分泌病、會厭炎、埃-巴二氏病毒感染(epstein-barr virus infection)、肢端紅痛症、錐體外及小腦病症、家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(familial hematophagocytic lymphohistiocytosis)、胎兒胸腺植入物排斥反應、弗裏德賴希氏運動失調(Friedreich's ataxia)、功能性周邊動脈病症、真菌性敗血症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球腎炎、任何器官或組織之移植排斥、革蘭氏陰性敗血症、革蘭氏陽性敗血症、由細胞內生物所致之肉芽腫、毛細胞白血病、髓素異常表像(Hallerrorden-Spatz disease)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、枯草熱、心臟移植排斥、血色病、血液透析、溶血性尿毒癥症候群/血栓溶解性血小板減少性紫癜症、出血、肝炎(A)、希氏束心律不整(His bundle arrythmias)、EQV感染/HIV神經病、霍奇金氏病(Hodgkin's disease)、過動性運動障礙、過敏反應、過敏性肺炎、高血壓、運動不足運動障礙、下丘腦-垂體-腎上腺軸評價、特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細胞毒性、無力、嬰兒脊髓性肌萎縮、主動脈發炎、A型流行性感冒、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺血-再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節炎、青少年脊髓性肌萎縮、卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)、腎移植排斥、退伍軍人桿菌(legionella)、利什曼體病(leishmaniasis)、麻風病、皮質脊髓系統病變、脂性水腫、肝移植排斥、淋巴水腫、瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多症、惡性黑色素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝性/特發性疾病、偏頭痛、粒線體多系統病症、混合結締組織病、單株γ球蛋白病、多發性骨髓瘤、多系統退化(曼切、代哲因-托馬斯、史德爾格及馬查多-約瑟夫(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager and Machado-Joseph))、重症肌無力、禽細胞內分枝桿菌(mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis)、骨髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經退化性疾病、I型神經原性肌萎縮、嗜中性白血球減少性發熱、非霍奇金氏淋巴瘤、腹主動脈及其分支閉塞、閉塞性動脈病症、okt3療法、睾丸炎/附睾炎、睾丸炎/輸精管複通術(vasectomy reversal procedure)、內臟增大(organomegaly)、骨質疏鬆症、胰腺移植排斥、胰腺癌、惡性疾病之副腫瘤症候群/高鈣血症、副甲狀腺移植排斥、骨盆發炎性疾病、常年性鼻炎、心包病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周邊血管病症、腹膜炎、惡性貧血、肺胞囊蟲肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群(多發性神經病、內臟增大、內分泌病、單株γ球蛋白病及皮膚變化症候群)、灌注後症候群、泵後症候群(post pump syndrome)、MI心切開術後症候群、子癇前期、進行性核上麻痹、原發性肺循環血壓過高、放射療法、雷諾氏現象及疾病(Raynaud's phenomenon and disease)、雷諾氏病、雷夫蘇姆氏病(Refsum's disease)、規則窄QRS心跳過速、腎血管高血壓、再灌注損傷、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年性癡呆、血清反應陰性之關節病、休克、鐮狀細胞貧血、皮膚同種異體移植排斥、皮膚變化症候群、小腸移植排斥、實體腫瘤、特殊心律不整、脊髓性運動失調、脊髓小腦退化、鏈球菌性肌炎、小腦結構病變、亞急性硬化性全腦炎、暈厥、心血管系統梅毒、全身性過敏症、全身性發炎反應症候群、全身性發作青少年類風濕性關節炎、T-細胞或FAB ALL、毛細血管擴張、血栓閉塞性脈管炎、血小板減少症、毒性、移植、創傷/出血、M型過敏反應、IV型過敏、不穩定型心絞痛、尿毒癥、尿膿毒病、蕁麻疹、心臟瓣膜疾病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈栓塞、心室纖維性顫動、病毒及真菌感染、病毒性腦炎(vital encephalitis)/無菌性腦膜炎、病毒相關性噬血細胞症候群(vital-associated hemaphagocytic syndrome)、韋尼克-科爾薩科夫症候群(Wernicke-Korsakoff)、威爾遜氏病、任何器官或組織之異種移植排斥。
本發明之範圍內包括已親和力成熟之抗IL-12/IL-23抗體。
此項技術中已知多種使抗體親和力成熟之方法。此等方法中之多種方法係基於藉由突變誘發產生變異蛋白組或文庫，繼而針對改良之親和力進行選擇及/或篩選的一般策略。突變誘發通常在DNA層面下，例如藉由易錯PCR(Thie 2009)、藉由基因改組(Kolkman 2001)、藉由使用誘變化學品或照射、藉由使用具有易錯複製機器之「突變」株(Greener 1996)或藉由利用天然親合力成熟機器之體細胞超突變方法(Peled 2008)來進行。突變誘發亦可在RNA層面下，例如藉由使用Qβ複製酶來進行(Kopsidas 2006)。允許篩選改良之變異蛋白的基於文庫之方法可基於各種呈現技術(諸如噬菌體、酵母、核糖體、細菌或哺乳動物細胞)且在此項技術中為熟知的(Benhar 2007)。親和力成熟可藉由更具針對性/預測性之方法(例如藉由定點突變誘發，或由來自3D蛋白質模型化之研究結果所指導之基因合成)來達成(參見例如Queen 1989；或美國專利第6,180,370號或第5,225,539號)。
因此，本發明提供一種產生與人類IL-12p40結合之抗原結合域的方法，該方法包含：
a.藉由在親本VH域之胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個胺基酸來提供為親本VH域之胺基酸序列變異體的VH域，該親本VH域包含HCDR1、HCDR2及HCDR3，其中親本VH域HCDR1、HCDR2及HCDR3為上文所定義之CDR組；且視情況將如此所提供之VH域與一或多個VL域組合以提供一或多個VH/VL組合；及
b.測試該為親本VH域之胺基酸序列變異體的VH域或VH/VL組合以鑑認針對人類IL-12p40之抗體抗原結合域。
親本VH域較佳具有以下所示之VH域胺基酸序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:141或SEQ ID NO:167。
為親本VH域之胺基酸序列變異體的VH域可由CDR突變誘發來提供。
在此方法中，藉由在親本VL域之胺基酸序列中添加、缺失、取代或插入一或多個胺基酸來提供一或多個VL域，該親本VL域包含LCDR1、LCDR2及LCDR3，其中親本VL域LCDR1、LCDR2及LCDR3為VL的如上文所定義之CDR組；從而產生一或多個VL域，其中每一者均為親本VL域之胺基酸序列變異體。
親本VL域較佳具有以下所示之VL域胺基酸序列：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:179或SEQ ID NO:192。
為親本VL域之胺基酸序列變異體的VL域可由CDR突變誘發來提供。
抗體抗原結合域可以IgG、scFv或Fab抗體分子之組份形式提供。
本發明亦提供一種產生與人類IL-12p40結合之抗原結合域的方法，該方法包含：
a.　提供編碼VH域之起始核酸或各編碼VH域之核酸之起始譜系，其中該VH域係選自由以下者所組成之群組：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:114、SEQ ID NO:142、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:120、SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:126、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:128、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:130、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:112、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:141及SEQ ID NO:167；
b.　將該起始核酸或起始譜系與編碼該胺基酸序列或藉由突變該胺基酸序列而產生之一或多種供體核酸組合，從而將該或該等供體核酸插入起始核酸或起始譜系中之VH域中，以提供編碼VH域之核酸之產物譜系；表現該產物譜系之核酸以產生產物VH域；
c.　視情況將該等產物VH域與一或多個VL域組合；
d.　選擇針對人類IL-12p40之抗原結合域；
e.　回收該抗原結合域或編碼該抗原結合域之核酸，其中該抗原結合域包含產物VH域且視情況包含VL域。
本發明亦提供一種產生與人類IL-12p40結合之抗原結合域的方法，該方法包含：
a.　提供編碼VL域之起始核酸或各編碼VL域之核酸之起始譜系，其中該VL域係選自由以下者所組成之群組：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:169、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:170、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:194、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:195、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:197、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:199、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:188、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:201、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:179及SEQ ID NO:192；
b.　將該起始核酸或起始譜系與編碼該胺基酸序列或藉由突變該胺基酸序列而產生之一或多種供體核酸組合，從而將該或該等供體核酸插入起始核酸或起始譜系中之VL域中，以提供編碼VL域之核酸之產物譜系；表現該產物譜系之核酸以產生產物VL域；
c.　視情況將該等產物VL域與一或多個VH域組合；
d.　選擇針對人類IL-12p40之抗原結合域；
e.　回收該抗原結合域或編碼該抗原結合域之核酸，其中該抗原結合域包含產物VH域且視情況包含VL域。
在此等方法中，可藉由使該HCDRI及/或HCDR2及/或HCDR3突變而產生供體核酸。亦可藉由隨機突變核酸來提供供體核酸。
本發明之抗體可選自此項技術中所熟知之多種抗體分子。在某些具體實例中，抗體係選自由以下者所組成之群組：免疫球蛋白分子、單株抗體(mAb)、嵌合抗體、CDR移植抗體、人類化抗體、共人類化(synhumanised)抗體、靈長類化抗體(primatised antibody)、域抗體、源於駱駝科動物之抗體片段(camelid derived antibody fragment)、Fab、Fab'、F(ab')2 、Fv、scFv、二硫鍵連接之Fv、雙功能抗體(diabody)、多價抗體、雙重特異性抗體、雙特異性抗體、免疫球蛋白恆定區結合域及已移植有抗原結合域之蛋白質骨架(如Qiu等人，2007 Nat Biotechnol 25 921-9中所例示)及其變異體。本發明亦擴展至如本文中所述及所能達成並與此項技術中所知相結合之抗體組合物、編碼抗體之核酸及互補核酸、載體、宿主細胞、組合物、調配物、裝置、轉殖基因動物、轉殖基因植物及其製備及使用方法。
本發明提供包含編碼特異性抗體或其變異體之多核苷酸、與該多核苷酸互補或與該多核苷酸雜交之經分離核酸分子，其包含至少一個特定序列、其結構域、部分或變異體。本發明提供包含源自該抗體之核酸分子的重組載體、含有該等核酸及/或重組載體之宿主細胞以及製備及/或使用該等抗體核酸、載體及/或宿主細胞之方法。
本發明亦提供至少一種組合物，其包含(a)如本文中所述之編碼經分離抗體、其特定部分或變異體之核酸及/或抗體；及(b)合適載劑或稀釋劑。根據已知方法，該載劑或稀釋劑可視情況為醫藥學上可接受的。該組合物可視情況進一步包含至少一種其他化合物、蛋白質或組合物。
本發明亦提供至少一種使抗體或其變異體在宿主細胞中表現之方法，其包含如本文中所述及/或如此項技術中已知在使抗體或其變異體以可回收量表現之條件下培養宿主細胞。
本發明提供至少一種編碼抗體之核酸，其包含在嚴格條件下與編碼抗體之核酸雜交或與編碼抗體之核酸具有至少95%一致性的核酸。本發明進一步提供由該核酸編碼之經分離抗體。本發明進一步提供一種包含此類核酸之抗體載體，其中該載體視情況進一步包含至少一種選自由以下者所組成之群組的啟動子：晚期或早期SV40啟動子、CMV啟動子、HSV tk啟動子、pgk啟動子、人類免疫球蛋白啟動子及EF-1a啟動子。此類載體可視情況進一步包含至少一種選自甲胺喋呤(MTX)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、綠色螢光蛋白(GFP)、新黴素(neomycin，G418)或麩醯胺酸合成酶(GS)中之至少一者的選擇基因或其部分。本發明進一步包含包含此類經分離核酸之哺乳動物宿主細胞，視情況，其中該宿主為至少一種選自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HwpG2、PerCP、653、SP2/0、293、海拉(HeLa)、骨髓瘤或淋巴瘤細胞或其任何衍生物、不朽化或轉型細胞之細胞。
本發明亦提供至少一種產生至少一種抗體組合物之方法，該組合物包含至少一種抗體及載劑或稀釋劑，視情況，進一步在該組合物中該載劑或稀釋劑為醫藥學上可接受的，及/或該組合物進一步包含至少一種選自以下者之化合物或蛋白質：TNF拮抗劑、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、IL-23藥劑、IL-12藥劑、礦物質、營養劑、甲狀腺藥劑、維生素、鈣相關激素、止瀉劑、鎮咳劑、止吐藥、抗潰瘍劑、輕瀉劑、抗凝劑、紅血球生成素、非格司亭(filgrastim)、沙格司亭(sargramostim)、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、雌激素受體調節劑、擴瞳劑、睫狀肌麻痹劑、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗躁狂劑、精神抑制劑、抗焦慮劑、安眠劑、擬交感神經藥、興奮劑、多奈哌齊(donepezil)、他可林(tacrine)、哮喘藥物、β促效劑、吸入型類固醇、白三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色甘酸(cromolyn)、腎上腺素或類似物、α去氧核糖核酸酶(dornase alpha)、細胞介素及細胞介素拮抗劑。
本發明亦提供至少一種治療細胞、組織、器官或動物中之IL-12/23病狀之方法，其包含使免疫相關或感染相關病狀調節有效量之至少一種抗體與該細胞、組織、器官或動物接觸，或對該細胞、組織、器官或動物投予免疫相關或感染相關病狀調節有效量之至少一種抗體，視情況，其中該動物為靈長類動物，視情況為猴或人類。該方法可進一步視情況包括該有效量為每公斤該等細胞、組織、器官或動物約0.001-100mg之情況。此類方法可進一步包括該接觸或該投藥係藉由至少一種選自靜脈內、肌肉內、快速注射(bolus)、腹膜內、皮下、經呼吸、吸入、局部、經鼻、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻內、真皮下及經皮之模式來進行的情況。此類方法可進一步包含在該接觸或投藥之前、同時或之後投予至少一種包含治療有效量之至少一種化合物或蛋白質的組合物，該至少一種化合物或蛋白質係選自以下至少一者：TNF拮抗劑、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、IL-23藥劑及IL-12藥劑、礦物質、營養劑、甲狀腺藥劑、維生素、鈣相關激素、止瀉劑、鎮咳劑、止吐藥、抗潰瘍劑、輕瀉劑、抗凝劑、紅血球生成素、非格司亭、沙格司亭、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、雌激素受體調節劑、擴瞳劑、睫狀肌麻痹劑、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗躁狂劑、精神抑制藥、抗焦慮劑、安眠劑、擬交感神經藥、興奮劑、多奈哌齊、他可林、哮喘藥物、β促效劑、吸入型類固醇、白三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色甘酸、腎上腺素或類似物、α去氧核糖核酸酶、細胞介素及細胞介素拮抗劑。
本發明亦包括至少一種調配物，其包含至少一種抗體及至少一種選自無菌水、無菌緩衝水之調配劑或於水性稀釋劑中之至少一種選自由以下者所組成之群組的防腐劑：苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸烷酯、氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)、去水乙酸鈉及硫柳汞(thimerosal)或其混合物，視情況，其中蛋白質濃度為約0.1mg/ml至約100mg/ml，該調配物進一步包含至少一種等滲劑或至少一種生理學上可接受之緩衝劑。
本發明亦提供至少一種供人類醫藥使用之製品，其包含包裝材料及包含至少一種本發明抗體之溶液或凍乾形式的容器，視情況，另外其中該容器為具有塞子以供多用途投藥之玻璃或塑膠容器，視情況，另外其中該容器為能夠被刺穿且用於靜脈內、肌肉內、快速注射、腹膜內、皮下、局部、經呼吸、吸入、經鼻、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻內、真皮下或經皮投藥之發泡包裝；該容器為靜脈內、肌肉內、快速注射、腹膜內、皮下、經呼吸、吸入、經鼻、經陰道、局部、經直腸、經頰、舌下、鼻內、真皮下或經皮傳遞裝置或系統之組件；該容器為用於靜脈內、肌肉內、快速注射、腹膜內、皮下、經呼吸、吸入、局部、經鼻、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻內、真皮下或經皮傳遞之注射器或筆式注射器裝置或系統之組件。
本發明亦提供至少一種產生至少一種本發明抗體之方法，其包含提供能夠以可回收量表現該人類抗體之宿主細胞、轉殖基因動物、轉殖基因植物或植物細胞，視情況，另外其中該宿主細胞為哺乳動物細胞、植物細胞或酵母細胞；該轉殖基因動物為哺乳動物；該轉殖基因哺乳動物係選自山羊、母牛、綿羊、馬及非人類靈長類動物。
本發明進一步提供至少一種治療至少一種IL-12/23介導之病症之方法，其包含以下至少一者：(a)對需要該調節、治療或療法之細胞、組織、器官、動物或患者投予有效量之包含至少一種結合蛋白的組合物或醫藥組合物；及(b)進一步在上述(a)中之該投藥之前、同時及/或之後投予至少一種選自以下者之物質：免疫相關治療劑、TNF拮抗劑、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、神經藥劑、礦物質、營養劑、甲狀腺藥劑、維生素、鈣相關激素、止瀉劑、鎮咳劑、止吐藥、抗潰瘍劑、輕瀉劑、抗凝劑、紅血球生成素、非格司亭、沙格司亭、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、雌激素受體調節劑、擴瞳劑、睫狀肌麻痹劑、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗躁狂劑、精神抑制藥、抗焦慮劑、安眠劑、擬交感神經藥、興奮劑、多奈哌齊、他可林、哮喘藥物、β促效劑、吸入型類固醇、白三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色甘酸、腎上腺素或類似物、α去氧核糖核酸酶、細胞介素及細胞介素拮抗劑。
IL-12p40存在於蛋白質IL-12及IL-23中且以IL-12p40單體及IL-12p80同元二聚體形式存在。本發明描述與IL-12、IL-23、IL-12p40、IL-12p80結合且將可能與任何新發現之含有IL-12p40亞單位之蛋白質結合之抗體。該抗體特異性地與IL-12p40而非IL-12p35或IL-23p19結合。本發明進一步提供該等抗體之組合物、調配物、方法、裝置及用途(包括治療用途)。
在一具體實例中，該抗體能夠中和IL-12與IL-12Rβ2之結合，據信該IL-12Rβ2與IL-12在p40/p35界面處結合。在另一具體實例中，該抗體能夠抑制IL-23與IL-23R之結合，據信該結合可能經由p19/p40界面處之相互作用來介導。在另一具體實例中，該抗體能夠抑制IL-12與IL-12Rβ2之結合及IL-23與IL-23R之結合。藉由在鄰近於IL-12p40與p35或p19之界面的位置處與IL-12p40結合，該抗體抑制相關受體與IL-12及/或IL-23之結合。
本發明描述與IL-12p40/80結合但不中和IL-12p40或IL-12p80與IL-12Rβ1之結合的抗體。對IL-12或IL-23系統之調節仍可在該抗體存在下經由IL-12p40/80來完成，因為此等蛋白質仍能夠自由結合IL-12Rβ1。下列作用方法之優勢在於其允許IL-12及IL-23系統之天然調節劑(IL-12p40/p80)繼續與亦用作IL-12及IL-23之拮抗劑的抗體競爭。因此，經由此作用方法可能建立雙重拮抗劑系統，從而使得該抗體在用作治療劑時具有較高療效。在使用不抑制IL-12p40/80生物功能之抗體時，亦存在潛在的安全性概況改良。最近，已展示IL-12p40/80具有除用作拮抗劑及調節IL-12/IL-23路徑之外的不同作用。該抗體不會阻止IL-12p40/80用作巨噬細胞之化學引誘劑及用作回應病原體激發之DC遷移的誘導物。當投予抗體作為治療劑時，此可能使得該抗體之安全性概況得到改良。
下文所提及之所有科學引文、專利、專利申請案及製造商之技術說明書均係以全文引用之方式併入本文中。
貫穿此說明書，應瞭解除非上下文另外要求，否則「包含」一詞表示包括所述要素或整數或者要素或整數之群組，而非排除任何其他要素或整數或者要素或整數之群組。
應瞭解，除非另外指示，否則本發明不限於特定調配物組份、製造方法、給藥方案或其類似因素，因而其可變化。
須注意，如本說明書中所用，除非上下文另外明確規定，否則單數形式「一」及「該」包括複數個態樣。因此，舉例而言，對「一」之提及包括單個以及兩個或超過兩個；對「該」之提及包括單個以及兩個或超過兩個，諸如此類。
如本文中所用，術語「多肽」係指胺基酸之任何聚合鏈。術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦指胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋天然或人工蛋白質、蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單體或聚合多肽。
術語「經分離蛋白」或「經分離多肽」為以下蛋白質或多肽，其由於起源或衍生來源而不與其天然狀態下所伴隨之天然締合組份締合；實質上不含來自同一物種之其他蛋白質；由來自不同物種之細胞表現；或在自然界中不存在。因此，以化學方式合成或在不同於天然起源細胞之細胞系統中所合成之多肽將與其天然締合組份「分離」。亦可使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術，藉由分離使蛋白質實質上不含天然締合組份。如本文中所用之術語「回收」係指(例如)使用此項技術中熟知之蛋白質純化技術，藉由分離使化學物質(諸如多肽)實質上不含天然締合組份之過程。
如本文中所用，術語「人類IL-12」(本文中縮寫為hIL-12或IL-12)包括主要由諸如單核細胞、巨噬細胞及樹狀細胞之抗原呈現細胞所分泌之人類細胞介素。該術語包括包含35kD亞單位(p35)及40kD亞單位(p40)之異二聚蛋白質，此兩個亞單位由二硫橋連接在一起。該異二聚蛋白質係稱作「p70蛋白」。術語人類IL-12意欲包括重組人類IL-12(rhIL-12)，其可藉由標準重組表現方法來製備。IL-12屬於介白素家族，其中最新成員為IL-35，該IL-35共有IL-12p35亞單位(Niedbala等人，2007 Eur J Immunol 37 3021-9)。IL-35之新近發現指示可能存在仍待發現之更多形式之IL-12p40及IL-12p35。假定本發明中所述之抗體將與所有新發現之含有IL-12p40形式之蛋白質結合係合理的。
如本文中所用，術語「人類IL-23」(本文中縮寫為hIL-23或IL-23)包括屬於具有5種該等異二聚細胞介素(包括IL-12及IL-27)之家族的異二聚人類細胞介素(Trinchieri等人，2003 Immunity 19 641-4)。該術語包括包含亞單位p19及p40之異二聚蛋白質，此兩個亞單位由二硫橋連接在一起。術語人類IL-23意欲包括重組人類IL-23(rhIL-23)，其可藉由標準重組表現方法來製備。
如本文中所用，術語「IL-12/23」共同地係指人類IL-12及IL-23。
如本文中所用，術語「IL-12p40」等同於「IL-23p40」且亦簡稱作「p40」及「p40亞單位」，其包括人類細胞介素IL-12之40 kD亞單位(p40)及人類細胞介素IL-23之40 kD亞單位。
如本文中所用，術語「IL-12p80」(亦簡稱作「p80」)包括人類細胞介素IL-12之兩個單體40 kD亞單位(p40)，該兩個亞單位由二硫鍵連接在一起以形成二聚體蛋白。
如本文中所用，術語「IL-12p35」(亦簡稱作「p35」)包括人類細胞介素IL-12(p70)及IL-35之35 kD亞單位。
如本文中所用，術語「IL-23p19」(亦簡稱作「p19」)包括人類細胞介素IL-23之19 kD亞單位。
IL-12R複合物包含兩個稱作IL-12受體β1(在本文中用作IL-12Rβ1)及IL-12受體β2(在本文中用作IL-12Rβ2)之亞單位，該等亞單位皆為以高親和力結合IL-12及信號傳導所需。此IL-12R最初為PHA活化之淋巴母細胞及IL-2活化之NK細胞所特有(Chizzonite等人，1992 J Immunol 148 3117-24；Chua等人，1994 J Immunol 153 128-36)。展示IL-12Rβ2負責經由Tyk2/JAK2及STAT4路徑進行信號傳導，使得細胞進入TH 1路徑(IFN-γ分泌)(Presky等人，1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 14002-7；Watford等人，2004 Immunol Rev 202 139-56)。自此示IL-12Rβ1涉及藉由使Tyk2及STAT3磷酸化來進行信號傳導(Zou等人，1997 J Biol Chem 272 6073-7)。
IL-23R複合物包含兩個亞單位，即IL-12R複合物中存在之IL-12Rβ1及IL-23受體(在本文中用作IL-23R)。IL-23與IL-23R之結合引起JAK2自體磷酸化及IL-23R磷酸化。此引起STAT3以及STAT1、STAT4及STAT5之定位及磷酸化(Parham等人，2002 J Immunol 168 5699-708)。
如本文中所用，「生物活性」係指細胞介素之所有固有的生物特性。IL-12之生物特性包括(但不限於)與IL-12Rβ1及/或IL-12Rβ2結合；誘導IFN-γ分泌；及調節抗原特異性T輔助1型(TH 1)與2型(TH 2)淋巴細胞之間的平衡。IL-23之生物特性包括(但不限於)與IL-12Rβ1及/或IL-23R結合、誘導IFN-γ產生、誘導IL-17產生、誘導IL-21產生、誘導IL-22產生、TH 17細胞分化及活化樹狀細胞之抗原呈現功能及選擇性誘導記憶T細胞增殖。
如本文中所用，關於抗體、蛋白質或肽與第二化學物質之相互作用的術語「特異性結合」意謂該相互作用係視化學物質上特定結構(例如抗原決定子或抗原決定基)之存在而定；例如，抗體一般識別且結合特定蛋白結構而非蛋白。若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則含有抗原決定基A(或游離、未標記之A)之分子在含有經標記「A」及抗體之反應中的存在將降低與抗體結合之經標記A之量。
如本文中所用，術語「抗體」泛指任何包含四個多肽鏈(即兩個重(H)鏈及兩個輕(L)鏈)之免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留Ig分子之必需抗原決定基結合特徵之任何功能片段、突變體、變異體或衍生物。該等突變體、變異體或衍生抗體形式在此項技術中為已知的。下文論述其非限制性具體實例。
在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區(本文中縮寫為HCVR或VH)及重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個結構域，即CH1、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區(本文中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個結構域CL。VH及VL區可進一步再分為具有高度可變性之區域(稱作互補決定區(CDR))，其與稱作構架區(FR)之較為保守區域交替。各VH及VL包含3個CDR及4個FR，該等區域自胺基末端至羧基末端依以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可具有任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或亞類。
如本文中所用，術語抗體之「抗原結合域」或「抗原結合部分」係指抗體或蛋白質之一或多個保留與抗原(例如IL-12)特異性結合之能力的片段。已展示抗體之抗原結合功能可由全長抗體之片段來執行。該等抗體具體實例亦可為雙特異性、雙重特異性或多特異性形式；其與兩個或超過兩個不同抗原特異性結合。術語抗體之「抗原結合部分」中所涵蓋的結合片段之實例包括(i)Fab片段，一種由VL、VH、CL及CH1域組成之單價片段；(ii)F(ab')2片段，一種包含兩個經由絞鏈區之二硫橋連接之Fab片段的二價片段；(iii)由VH及CH1域組成之Fd片段；(iv)由抗體單臂之VL及VH域組成之Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341 544-6；Winter等人，PCT公開案WO 90/05144 A1，其以引用方式併入本文中)，其包含單個可變域；及(vi)經分離互補決定區(CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個結構域VL及VH係由單獨基因編碼，但其可使用重組方法經由能將其製成單一蛋白質鏈之合成連接子連結，在該單一蛋白質鏈中，VL及VH區配對形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv)；參見例如Bird等人，1988 Science 242 423-6；Huston等人，1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879-83)。術語抗體之「抗原結合部分」亦意欲涵蓋該等單鏈抗體。亦涵蓋單鏈抗體之其他形式，諸如雙功能抗體。雙功能抗體為二價雙特異性抗體，其中VH及VL域係在單一多肽鏈上表現，但使用過短連接子以致同一鏈上之兩個結構域之間無法配對，從而促使該等結構域與另一條鏈之互補結構域配對且形成兩個抗原結合位點(參見例如Holliger,P.等人，1993,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak,R. J.等人，1994,Structure 2:1121-1123)。該等抗體結合部分在此項技術中為已知的(Kontermann及Dubel編，Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag. New York,第790頁,ISBN 3-540-41354-5)。
如本文中所用，術語「抗體構築體」係指包含一或多個與連接多肽或免疫球蛋白恆定域連接之本發明之抗原結合部分的多肽。連接多肽包含兩個或超過兩個由肽鍵連接之胺基酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分。該等連接多肽在此項技術中為熟知的(參見例如Holliger等人，1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 6444-8)。
免疫球蛋白恆定域係指重鏈或輕鏈恆定域。人類IgG重鏈及輕鏈恆定域胺基酸序列在此項技術中為已知的且實例表示於下文中。
人類重鏈IgG1 恆定域(或其衍生物，如NCBI寄存編號：P01857)
人類輕鏈κ恆定域(如NCBI寄存編號：P01834)
人類輕鏈λ恆定域(如NCBI寄存編號：P01842)
更進一步，抗體或其抗原結合部分可能為由該抗體或抗體部分與一或多種其他蛋白質或肽共價或非共價締合所形成的較大免疫黏附分子之一部分。該等免疫黏附分子之實例包括使用抗生蛋白鏈菌素核心區來製備四聚scFv分子(Kipriyanov等人，1995 Hum Antibodies Hybridomas 6 93-101)及使用半胱胺酸殘基、標記肽及C末端聚組胺酸標籤來製備二價及結合生物素之scFv(Kipriyanov等人，1994 Mol Immunol 31 1047-58)。可使用習知技術(諸如分別用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化整個抗體)自整個抗體製備抗體部分，諸如Fab及F(ab')2片段。此外，如本文中所述，可使用標準重組DNA技術來獲得抗體、抗體部分及免疫黏附分子。
如本文中所用，「經分離抗體」意欲指實質上不含其他具有不同抗原特異性之抗體的抗體(例如，特異性結合hIL-12之經分離抗體實質上不含特異性結合除hIL-12以外之抗原的抗體)。然而，特異性結合hIL-12之經分離抗體可能對其他抗原(諸如來自其他物種之IL-12分子)具有交叉反應性。此外，經分離抗體可能實質上不含其他細胞物質及/或化學物質。
如本文中所用，術語「人類抗體」意欲包括具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區的抗體。本發明之人類抗體可在例如CDR且特定言之CDR3中包括並非由人類生殖系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基(例如，由試管內隨機或位點特異性突變誘發或由活體內體細胞突變所引入之突變)。然而，如本文中所用，術語「人類抗體」並不意欲包括已將源自另一哺乳動物物種(諸如小鼠)生殖系之CDR序列移植至人類構架序列上的抗體。
如本文中所用，術語「重組人類抗體」意欲包括所有藉由重組方式製備、表現、形成或分離之人類抗體，諸如使用轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體、自重組的組合人類抗體文庫分離之抗體(Hoogenboom,1997 Trends Biotechnol 15 62-70；Azzazy等人，2002 Clin Biochem 35 425-45；Gavilondo等人，2000 Biotechniques 29 128-32,134-6,138 passim；Hoogenboom等人，2000 Immunol Today 21 371-8)、自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因動物(例如小鼠)分離之抗體(參見例如Taylor等人，1992 Nucleic Acids Res 20 6287-95；Little等人，2000 Immunol Today 21 364-70)或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列上的任何其他方式製備、表現、形成或分離之抗體。該等重組人類抗體具有源自人類生殖系免疫球蛋白序列之可變區及恆定區。然而，在某些具體實例中，該等重組人類抗體經受試管內突變誘發(或當使用人類Ig序列之轉殖基因動物時，經受活體內體細胞突變誘發)且因此，重組抗體之VH及VL區之胺基酸序列為雖然源自人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL序列有關，但可能無法天然存在於活體內人類抗體生殖系譜系中之序列。
術語「嵌合抗體」係指包含來自一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列及來自另一物種之恆定區序列的抗體，諸如具有與人類恆定區相連之鼠類重鏈及輕鏈可變區的抗體。
術語「CDR移植抗體」係指包含來自一個物種之重鏈及輕鏈可變區序列，但VH及/或VL之一或多個CDR區之序列由另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有鼠類重鏈及輕鏈可變區且一或多個鼠類CDR(例如CDR3)已由人類CDR序列置換之抗體。
術語「人類化抗體」係指包含來自非人類物種(例如小鼠)之重鏈及輕鏈可變區序列、但VH及/或VL序列之至少一部分已變得更「類人類」(亦即與人類生殖系可變序列更相似)的抗體。一種類型之人類化抗體為CDR移植抗體，其中將人類CDR序列引入非人類VH及VL序列中以替代相應的非人類CDR序列。
術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在本文中可互換使用。此等在此項技術中公認之術語係指胺基酸殘基之編號系統，該等胺基酸殘基比抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區中的其他胺基酸殘基更可變(亦即高變)(Kabat等人，1971Ann N Y Acad Sci 190 382-93；及Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版號：91-3242)。對於重鏈可變區而言，CDR1之高變區處於胺基酸位置31至35之範圍內，CDR2之高變區處於胺基酸位置50至65之範圍內，且CDR3之高變區處於胺基酸位置95至102之範圍內。對於輕鏈可變區而言，CDR1之高變區處於胺基酸位置24至34之範圍內，CDR2之高變區處於胺基酸位置50至56之範圍內，且CDR3之高變區處於胺基酸位置89至97之範圍內。
如本文中所用，術語「接受體」及「接受體抗體」係指提供或編碼一或多個構架區之至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%之胺基酸序列的抗體或核酸序列。在一些具體實例中，術語「接受體」係指提供或編碼恆定區之抗體胺基酸或核酸序列。在另一具體實例中，術語「接受體」係指提供或編碼構架區及恆定區中之一或多者的抗體胺基酸或核酸序列。在一特定具體實例中，術語「接受體」係指提供或編碼一或多個構架區之至少80%、較佳地至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或100%之胺基酸序列的人類抗體胺基酸或核酸序列。根據此具體實例，接受體可含有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個或至少10個在人類抗體之一或多個特定位置處並不存在之胺基酸殘基。接受體構架區及/或接受體恆定區可(例如)自生殖系抗體基因、成熟抗體基因、功能抗體(例如，此項技術中熟知之抗體、正在開發中之抗體或市售抗體)衍生或獲得。如本文中所用，術語「CDR」係指抗體可變序列中之互補決定區。在重鏈及輕鏈之各可變區中存在3個CDR，針對各可變區將其命名為CDR1、CDR2及CDR3。如本文中所用，術語「CDR組」係指在單個可變區中存在的3個能夠結合抗原之CDR之群組。已根據不同系統對此等CDR之確切邊界進行不同界定。Kabat所述之系統(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)及(1991))不僅提供適用於任何抗體可變區之明確殘基編號系統，且亦提供界定3個CDR之確切殘基邊界。此等CDR可稱作Kabat CDR。Chothia及其合作者(Chothia等人，1987 J Mol Biol 196 901-17；及Chothia等人，1989 Nature 342 877-83)發現Kabat CDR中之某些亞部分儘管在胺基酸序列之層面上具有巨大差異，但採用幾乎相同之肽主鏈構形。此等亞部分係命名為L1、L2及L3或H1、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈及重鏈區。此等區可被稱作Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。其他CDR邊界界定可能並未嚴格依從一種上述系統，但仍將與Kabat CDR重疊，然而其可能會根據特定殘基或殘基群組或甚至整個CDR不會顯著影響抗原結合之預測或實驗結果而有所縮短或延長。本文中所用之方法可利用根據此等系統中之任一者所定義之CDR，但較佳具體實例使用Kabat或Chothia定義之CDR。
如本文中所用，術語「典型」殘基係指界定如Chothia等人(Chothia及Lesk 1987 J Mol Biol 196 901-17；Chothia等人，1992 J Mol Biol 227 799-817且其係以引用方式併入本文中)所定義之特定的典型CDR結構之CDR或構架中之殘基。根據Chothia等人，多種抗體之CDR之關鍵部分儘管在胺基酸序列的層面上具有巨大差異，但具有幾乎相同之肽主鏈構形。各典型結構主要指定形成環之胺基酸殘基之鄰近區段的肽主鏈扭轉角之集合。
如本文中所用，術語「供體」及「供體抗體」係指提供一或多個CDR之抗體。在一較佳具體實例中，供體抗體為來自與產生或衍生構架區之抗體不同之物種的抗體。在人類化抗體之情況下，術語「供體抗體」係指提供一或多個CDR之非人類抗體。如本文中所用，術語「構架」或「構架序列」係指可變區中除去CDR剩餘之序列。因為CDR序列之確切定義可由不同系統確定，故構架序列之意義亦具有相應不同之解釋。6個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3及重鏈之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈之構架區在各鏈上分成4個亞區(FR1、FR2、FR3及FR4)，其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於ER2與FR3之間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在未指定特定亞區為FR1、FR2、FR3或FR4之情況下，如他人所提及之構架區表示單個天然存在免疫球蛋白鏈之可變區中之組合FR。如本文中所用，FR表示四個亞區之一，且FRs表示構成構架區之4個亞區中之兩者或超過兩者。
如本文中所用，術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」係指由未經歷會引起基因重排及突變以使特定免疫球蛋白表現之成熟過程的非淋巴細胞編碼之免疫球蛋白序列。(參見例如Shapiro等人，2002 Crit Rev Immunol 22 183-200；Marchalonis等人，2001 Adv Exp Med Biol 484 13-30)。由本發明之各具體實例所提供之一種優勢源於以下認知，即與成熟抗體基因相比，生殖系抗體基因更有可能保留物種中個體之基本胺基酸序列結構特徵，因此當以治療方式用於該物種時，不太可能會將其識別為來自外來來源。
如本文中所用，術語「關鍵」殘基係指可變區中對抗體(特定言之，人類化抗體)之結合特異性及/或親和力具有較大影響之特定殘基。關鍵殘基包括(但不限於)以下一或多者：與CDR相鄰之殘基、潛在糖基化位點(可為N-糖基化位點或O-糖基化位點)、稀有殘基、能與抗原相互作用之殘基、能與CDR相互作用之殘基、典型殘基、介於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、微調區中之殘基及在Chothia定義之VH域CDR1與Kabat定義之第一重鏈構架之間重疊的區域中之殘基。
如本文中所用，術語「人類化抗體」為與相關抗原免疫特異性結合且包含實質上具有人類抗體之胺基酸序列的構架(FR)區及實質上具有非人類抗體之胺基酸序列的互補決定區(CDR)之抗體或其變異體、衍生物、類似物或片段。如本文中所用，術語「實質上」在CDR之情況下係指CDR具有與非人類抗體CDR之胺基酸序列至少80%、較佳至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。人類化抗體包含至少一個且典型兩個可變域中之實質上每一者(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中所有或實質上所有CDR區對應於非人類免疫球蛋白(亦即供體抗體)之CDR區且所有或實質上所有構架區為人類免疫球蛋白一致序列之構架區。較佳地，人類化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地，該免疫球蛋白為人類免疫球蛋白。在一些具體實例中，人類化抗體含有輕鏈以及至少重鏈可變域。抗體亦可能包括重鏈之CH 1區、鉸鏈區、CH 2區、CH 3區及CH 4區。在一些具體實例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些具體實例中，人類化抗體僅含有人類化重鏈。在特定具體實例中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈可變域及/或人類化重鏈。
人類化抗體可選自免疫球蛋白之任何類別(包括IgM、IgG、IgD、IgA及IgE)及任何同型(包括(但不限於)IgG1、IgG2、IgG3及IgG4)。人類化抗體可包含來自超過一種類別或同型之序列，且可使用此項技術中熟知之技術來選擇特定恆定域以使所需效應功能最佳化。
人類化抗體之構架區及CDR區無須精確對應於親本序列，例如可藉由至少一個胺基酸殘基之取代、插入及/或缺失而對供體抗體CDR或一致構架進行突變誘發，使得該位點之CDR或構架殘基並不與供體抗體或一致構架相對應。然而，在一較佳具體實例中，該等突變不會大量存在。通常，人類化抗體殘基之至少80%、較佳至少85%、更佳至少90%且最佳至少95%將與親本FR及CDR序列之殘基相對應。如本文中所用，術語「一致構架」係指一致免疫球蛋白序列中之構架區。如本文中所用，術語「一致免疫球蛋白序列」係指由相關免疫球蛋白序列之家族中最常出現之胺基酸(或核苷酸)形成之序列(參見例如Winnaker,From Genes to Clones,Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987)。在免疫球蛋白家族中，一致序列中之各位置係由該家族中最常出現於彼位置之胺基酸佔據。若兩種胺基酸同樣頻繁出現，則一致序列中可包括任一者。如本文中所用，「微調」區係指如Foote等人，1992 J Mol Biol 224 487-99所述，可調整CDR結構且微調與抗原之合適性的構架殘基之子集。微調區殘基形成CDR之下伏層且可能影響CDR結構及抗體親和力。
如本文中所用，術語「中和」係指當抗體特異性結合細胞介素時中和細胞介素之生物活性。較佳地，中和抗體為與IL-12及/或IL-23之結合引起對IL-12及/或IL-23生物活性之抑制的中和抗體。較佳地，中和抗體結合IL-12及/或IL-23且使IL-12及/或IL-23之生物活性降低至少約50%、60%、80%、85%或以上85%。如本文中所用，術語「抑制」係指當抗體特異性結合細胞介素時降低細胞介素之生物活性。可藉由量測此項技術中熟知之一或多種IL-12及/或IL-2生物活性指標來分析中和抗體對IL-12及/或IL-23生物活性之抑制作用。例如，在試管內IL-12 PHA檢定中抑制人類植物血球凝集素胚細胞增殖或在人類IL-12受體結合檢定中抑制受體結合(參見實施例)。
術語「活性」包括諸如以下活性：抗體針對抗原之結合特異性/親和力(例如，抗IL-12抗體與IL-12抗原結合)及/或抗體之中和效能(例如，抗IL-12抗體與IL-12之結合會抑制hIL-12之生物活性)，例如在人類IL-12受體結合檢定或試管內IL-12 PHA檢定中抑制PHA胚細胞增殖或抑制受體結合。
術語「抗原決定基」包括任何能夠與免疫球蛋白或T-細胞受體特異性結合之多肽決定子。在某些具體實例中，抗原決定基決定子包括分子之化學活性表面基團，諸如胺基酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基，且在某些具體實例中，其可能具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗原決定基為抗原中與抗體結合之區域。在某些具體實例中，當抗體在蛋白質及/或巨分子之複雜混合物中優先識別其靶抗原時，認為抗體與抗原特異性結合。
本發明亦提供一種抑制抗原呈現細胞(APC)中之IL-12/23活性之抗體，該等抗原呈現細胞諸如(但不限於)巨噬細胞、小神經膠質細胞、腎小球膜吞噬細胞、滑膜A細胞、幹細胞前驅體、蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)、庫弗細胞(Kupffer cell)、樹狀細胞、B細胞及其類似細胞。該等APC可存在於不同組織中，該等組織例如(但不限於)皮膚、表皮、肝、脾、腦、脊髓、胸腺、骨髓、關節滑液、腎、血液及其類似組織。該等APC亦可被限定於血腦障壁之外側或內側。
本發明提供經分離、重組及/或合成抗體、其特定部分或變異體以及包含至少一種編碼至少一種抗體之多核苷酸的組合物及編碼性核酸分子。本發明之該等抗體、其特定部分或變異體包含特定全長抗體序列、其結構域、片段及特定變異體及該等核酸及抗體、其特定部分或變異體之製備及使用方法(包括治療組合物、方法及裝置)。
可用於本發明中之抗體視情況具有下列特徵，即其能夠長期以良好至優異之症狀緩解作用及低毒性治療患者。低免疫原性及/或高親和力以及其他合適特性可能促成所達成之治療結果。「低免疫原性」在本文中係定義為在少於約75%或較佳少於約50%之所治療患者中引起顯著HAHA、HACA或HAMA反應，及/或在所治療之患者中引起低效價(用雙抗原酶免疫檢定量測，少於約300，較佳少於約100；Elliott等人，1994 Lancet 344 1125-7)。
本發明之經分離核酸可用於產生至少一種可用於細胞、組織、器官或動物(包括哺乳動物及人類)中以調節、治療、緩解至少一種IL-12及/或IL-23病狀、輔助預防至少一種IL-12及/或IL-23病狀之發生或減輕至少一種IL-12及/或IL-23病狀之症狀的抗體、其片段或特定變異體。
此類方法可包含對需要症狀、效應或機制之該調節、治療、緩解、預防或減輕之細胞、組織、器官、動物或患者投予有效量之包含至少一種抗體或其特定部分或變異體之組合物或醫藥組合物。如使用如本文中所述或相關技術中所知之已知方法所執行及測定，有效量可包含每單次或多次投藥約0.001mg/kg至500mg/kg之量，或每單次或多次投藥達成0.01-5000μg/ml血清濃度之血清濃度之量，或其中任何有效範圍或值。
對IL-12p40亞單位具有特異性之抗體可針對適當免疫原性抗原(諸如經分離IL-12p40、IL-12或IL-23蛋白質或其部分(包括合成分子，諸如合成肽))而產生。免疫原性抗原之製備及單株抗體之產生可使用任何合適技術來進行。已描述多種方法(參見例如Kohler等人，1975 Nature 256495-7及Kohler等人，1976 Eur J Immunol 6 511-9；Galfre等人，1977 Nature 266 550-2；Koprowski等人，美國專利第4,172,124號；Harlow,E.及D. Lane,1988,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory:Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols In Molecular Biology,第2卷(例如，第27期增刊,94年夏),Ausubel,F. M.等人編，John Wiley & Sons：紐約(New York),N.Y.,第11章,(1991-2003)；其各以全文引用之方式併入本文中)。一般而言，融合瘤係藉由使合適之不朽細胞系(例如骨髓瘤細胞系，諸如(但不限於)Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A或其類似細胞系；或雜交骨髓瘤(heteromyeloma)、其融合產物或自其獲得之任何細胞或融合細胞或如此項技術中所知之任何其他合適細胞系，參見例如www.atcc.org,www.lifetech.com.及其類似文獻，其各以全文引用之方式併入本文中)與產生抗體之細胞融合而產生，該等產生抗體之細胞諸如(但不限於)經分離或經選殖之脾細胞或任何其他表現重鏈或輕鏈恆定、可變、構架或CDR序列的細胞，該等序列為內源性或異源性核酸(如重組或內源性、病毒、細菌、藻類、原核生物、兩棲動物、昆蟲、爬行動物、魚、哺乳動物、齧齒動物、馬、綿羊(ovine)、山羊、羊(sheep)、靈長類動物、真核生物、基因組DNA、cDNA、rDNA、粒線體DNA或RNA、葉綠體DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA(單股、雙股或三股、雜交)及其類似序列或其任何組合)。參見例如Ausubel(同上)及Colligan,Immunology,同上，第2章，各以全文引用之方式併入本文中。
產生抗體之細胞可自已經相關抗原免疫之人類或其他合適動物之周邊血液或較佳脾或淋巴結獲得。亦可使用任何其他合適之宿主細胞來表現編碼本發明抗體、其特定片段或變異體之異源性或內源性核酸。融合細胞(融合瘤)或重組細胞可使用選擇性培養條件或其他合適之已知方法進行分離，且可藉由限制稀釋法或細胞分選或其他已知方法進行選殖。可由合適檢定(例如ELISA)來選擇產生具有所需特異性之抗體的細胞。
可使用其他產生或分離具有所需特異性之抗體的合適方法，包括(但不限於)自肽或蛋白質文庫(例如(但不限於)噬菌體、核糖體、寡核苷酸、RNA、cDNA或其類似物之呈現文庫；例如，如可自Cambridge Antibody Technologies,Cambridgeshire,UK；MorphoSys,Martinsreid/Planegg,DE；Biovation,Aberdeen,Scotland,UK；Biolnvent,Lund,Sweden；Dyax公司,Enzon,Affymax/Biosite；Xoma,Berkeley,Calif.；Ixsys獲得之文庫，參見例如EP 368,684、PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；U.S.第08/350260號(1994年5月12日)；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835；(CAT/MRC)；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；PCT/US594/1234；WO92/18619；WO96/07754(Scripps)；WO96/13583、WO97/08320(MorphoSys)；WO95/16027(BioInvent)；WO88/06630；WO90/3809(Dyax)；美國專利第4,704,692號(Enzon)；PCT/US91/02989(Affymax)；WO89/06283；EP 371 998；EP 550 400(Xoma)；EP 229 046；PCT/US91/07149(Ixsys))或隨機產生之肽或蛋白質(美國專利第5,723,323號、第5,763,192號、第5,814,476號、第5,817,483號、第5,824,514號、第5,976,862號、WO86/05803、EP 590 689(Ixsys，現為Applied Molecular Evolution(AME))，各以全文引用之方式併入本文中)選擇重組抗體之方法，或依賴於如此項技術中所知及/或如本文中所述能夠產生人類抗體譜系之轉殖基因動物(例如SCID小鼠，Nguyen等人，1997 Microbiol Immunol 41 901-7；Sandhu等人，1996 Crit Rev Biotechnol 1695-118(各以全文引用之方式併入本文中)以及相關專利及申請案)的免疫之方法。該等技術包括(但不限於)核糖體呈現(Hanes等人，1997 Proc Natl Acad Sci U S A 94 4937-42；Hanes等人，1998 Proc Natl Acad Sci U S A 95 14130-5)；單細胞抗體產生技術(例如，所選淋巴細胞抗體法(「SLAM」)，美國專利第5,627,052號；Wen等人，1987 Eur J Immunol 17 887-92；Babcook等人，1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 7843-8)；凝膠微滴及流動式細胞量測術(flow cytometry)(Powell等人，1990 Biotechnology(N Y)8333-7)；One Cell Systems,Cambridge,Mass.(Gray等人，1995 J Immunol Methods 182 155-63；Kenney等人，1995 Biotechnology(N Y)13 787-90)；B細胞選擇(Steenbakkers等人，1994 Mol Biol Rep 19 125-34；Jonak等人，Progress Biotech,第5卷，In Vitro Immunization in Hybridoma Technology,Borrebaeck編，Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam,Netherlands(1988)，其各以全文引用之方式併入本文中)。
對於將抗體活體內用於人類，可較佳使用嵌合、人類化或人類抗體。嵌合抗體為抗體之不同部分係源自不同動物物種的分子，諸如具有源自鼠類單株抗體之可變區及人類免疫球蛋白恆定區之抗體。產生嵌合抗體之方法在此項技術中為已知的。參見例如Morrison(1985)；Oi(1986)；Gillies(1989)；美國專利第5,807,715號；第4,816,567號；及第4,816,397號。
本發明範圍中包括具有使用(例如)專利公開案第EP 0983303A1號、第WO 2000/34317號及第WO 98/52976號中所述之方法所產生之序列變異的去免疫抗體，且該等抗體適用於實施本發明之方法。
「鑲飾(veneering)」為本發明範圍中所包括的另一種用於使小鼠或其他非人類單株抗體所固有之免疫原性及過敏性反應降至最低且因此增加所投予抗體之療效及安全性的方法。術語「經鑲飾抗體」係指用人類構架區殘基選擇性置換來自(例如)小鼠重鏈或輕鏈可變區之構架區殘基以提供保留實質上全部天然構架區摺疊結構之包含抗原結合位點的異種分子。鑲飾技術係基於以下理解，即抗原結合位點之配位體結合特徵主要由抗原結合表面中重鏈及輕鏈CDR組之結構及相對配置決定(Davies(1990))。因此，僅CDR結構、其彼此之相互作用及其與剩餘V區結構域之相互作用得到小心維持的人類化抗體可保留抗原結合特異性。使用鑲飾技術，選擇性地用人類殘基置換易於由免疫系統遇到之外部(例如溶劑可達)構架區殘基，以提供包含弱免疫原性或實質上無免疫原性之經鑲飾表面之雜合分子。
本發明之範圍亦擴展至人類化抗IL-12/IL-23抗體。「人類化」意指含有源自非人類免疫球蛋白序列之最小序列的抗IL-12/IL-23抗體形式。人類化抗體主要為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中受體高變區(亦稱作互補決定區或CDR)之殘基係由諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供體抗體)的具有所要特異性、親和力及/或容量之高變區殘基置換。
本發明範圍內的適用於本發明方法之人類化抗體可(例如)具有與非人類化抗體(諸如本文中所述之PMA204單株抗體)所表現之結合特徵相似之結合特徵。
人類化可基本上根據Winter及同事(Jones(1986)；Riechmann(1988)；Verhoeyen(1988))之方法藉由用齧齒動物或突變型齧齒動物CDR或CDR序列取代人類抗體之相應序列來進行。亦參見美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號及第5,859,205號。
可使用此項技術中已知之多種技術使抗體人類化，該等技術包括(例如)CDR移植(EP 239400；PCT公開案WO 91/09967；美國專利第5,225,539號；第5,530,101號及第5,585,089號)、鑲飾或表面重塑(resurfacing)(EP 592106；EP 519596；Padlan(1991)；Studnicka(1994)；Roguska(1994))及鏈改組(美國專利第5,565,332號)。
在一些情況下，人類免疫球蛋白之一或多個可變區之構架區中的殘基係由相應非人類殘基置換(參見例如Queen 等人，美國專利第5,585,089號；美國專利第5,693,761號；第5,693,762號；及第6,180,370號；亦參見例如Riechmann(1988))。
「超人類化(Superhumanization)」為一種人類化方法，其中將賦予抗原特異性之CDR(『供體』)移植至已知表現為具有與『供體』CDR結構相同或相似之人類CDR的人類生殖系構架序列(『接受體』)上(Tan 2002，亦參見國際公開案第WO 2004/006955號)。使用由人類基因組V基因序列所編碼之構架而非使用可包括體細胞突變之序列，此方法具有增強之降低免疫原性之潛力。藉由強調供體與接受體CDR之間的結構同源性，此方法亦具有增強之親和力保留潛力。
此外，人類化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中未發現之殘基。進行此等修飾以進一步改良抗體效能(例如，以獲得所需親和力)。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且典型兩個可變域中之實質上每一者，其中所有或實質上所有高變區對應於非人類免疫球蛋白之高變區，且所有或實質上所有構架區為人類免疫球蛋白序列之構架區。
人類化抗體亦將視情況包含免疫球蛋白恆定區(Fc)(典型地為人類免疫球蛋白恆定區)之至少一部分。進一步細節參見Jones(1986)；Riechmann(1988)；及Presta(1992)。因此，該等「人類化」抗體可包括實質上小於完整人類可變域之序列已由來自非人類物種之相應序列取代之抗體。實際上，人類化抗體典型地為一些CDR殘基及可能一些構架殘基由齧齒動物抗體之類似位點上之殘基取代的人類抗體。參見例如美國專利第5,225,539號、第5,585,089號、第5,693,761號、第5,693,762號、第5,859,205號。亦參見美國專利第6,180,370號及國際公開案第WO 2001/27160號，其中揭示人類化抗體及產生對預定抗原具有改良之親和力的人類化抗體之技術。
人類抗體可藉由此項技術中已知之多種方法來製備，該等方法包括使用源自人類免疫球蛋白序列之抗體文庫的上述噬菌體呈現方法。亦參見美國專利第4,444,887號及第4,716,111號及PCT公開案WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735及WO 91/10741。
識別所選抗原決定基之完全人類抗體可使用稱作「導向選擇(guided selection)」之技術產生。在此方法中，使用所選之非人類單株抗體(例如小鼠抗體)來引導對識別相同抗原決定基之完全人類抗體的選擇(Jespers(1988))。
亦可使用不能表現功能性內源性免疫球蛋白但可表現人類免疫球蛋白基因之轉殖基因動物產生人類抗體。例如，可隨機或藉由同源重組將人類重鏈及輕鏈免疫球蛋白基因複合物引入小鼠胚胎幹細胞中。或者，除人類重鏈及輕鏈基因之外，亦可將人類可變區、恆定區及多變區引入小鼠胚胎幹細胞中。
關於此產生人類抗體之技術的概述，參見Lonberg及Huszar(1995)。關於此產生人類抗體及人類單株抗體之技術及產生該等抗體之方案的詳細論述，參見例如PCT公開案WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；歐洲專利第0598877號；美國專利第5,413,923號；第5,625,126號；第5,633,425號；第5,569,825號；第5,661,016號；第5,545,806號；第5,814,318號；第5,885,793號；第5,916,771號；第5,939,598號；第6,075,181號；及第6,114,598號。
選擇用於產生人類化抗體之人類可變域(輕鏈及重鏈)可用於降低抗原性。根據所謂的「最佳匹配」方法，針對已知人類可變域序列之整個文庫篩選齧齒動物抗體之可變域序列。接著將最接近齧齒動物序列的人類序列視作人類化抗體之人類構架(FR)(Chothia及Lesk,1987 J Mol Biol 196 901-17；Sims等人，1993 J Immunol 151 2296-308，其各以全文引用之方式併入本文中)。另一種方法使用源自所有人類抗體之具有特定輕鏈或重鏈亞群之一致序列的特定構架。同一構架可用於若干種不同之人類化抗體(Carter 等人，1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89 4285-9；Presta等人，1993 J Immunol 151 2623-32，其各以全文引用之方式併入本文中)。
抗體亦可視情況在保留針對抗原之高親和力及其他有利生物特性之情況下經人類化。為達成此目標，根據一較佳方法，藉由使用親本及人類化序列之三維模型來分析親本序列及各種概念性人類化產物的方法來製備人類化抗體。三維免疫球蛋白模型通常可獲得且為熟習此項技術者所熟悉。可獲得說明且呈現所選擇之候選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。對此等呈現之檢驗允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列之功能中之可能作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白與其抗原結合之能力的殘基。以此方式，可自一致序列及輸入序列選擇FR殘基並將其組合，以便達成所需抗體特徵，諸如增加的對靶抗原之親和力。一般而言，CDR殘基直接地且在大多數情況下實質上涉及影響抗原結合。
人類抗體(特定言之，人類單株抗體)可藉由融合瘤方法製成。已描述用以產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞系(例如Kozbor,J. Immunol. 133:3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,第51-63頁(Marcel Dekker公司,New York,1987)；及Boerner等人，J. Immunol.147:86(1991)，其各以全文引用之方式併入本文中)。
或者，除上文所提供之技術以外，亦可使用噬菌體呈現技術以在試管內由來自未經免疫之供體的免疫球蛋白可變(V)域基因譜系產生人類抗體及抗體片段。根據此項技術之一非限制性實施例，將抗體V域基因同框選殖至絲狀噬菌體(諸如M13或fd)之主要或次要鞘蛋白基因中且以功能抗體片段形式呈現於噬菌體粒子之表面上。因為絲狀粒子含有噬菌體基因組之單股DNA複本，故基於抗體之功能性特性的選擇亦可實現對編碼展現彼等特性之抗體之基因的選擇。因此，噬菌體模擬B細胞之一些特性。噬菌體呈現可以多種形式進行；關於其評述，參見Johnson 1993 Current Opinions in Structural Biology 3 564-571，其各以全文引用之方式併入本文中。
V基因區段之若干來源可用於噬菌體呈現。Clackson等人(Clackson等人，1991 Nature 352 624-8)自來源於經免疫小鼠之脾的小型隨機組合V基因文庫分離出不同之抗噁唑酮抗體。基本上，可根據由Marks等人，1991 J Mol Biol 222 581-97或Griffiths等人，1993 Embo J 12 725-34(其各以全文引用之方式併入本文中)所述之技術來構築來自未經免疫之人類供體的V基因譜系且分離針對不同抗原(包括自體抗原)之抗體。
在天然免疫反應中，抗體基因累積高比率之突變(體細胞超突變)。所引入之一些變化將賦予較高親和力，且在後繼抗原攻毒期間優先複製且分化呈現高親和力表面免疫球蛋白之B細胞。可使用稱作「鏈改組」之技術來模擬此天然過程(Marks等人，1992 Biotechnology(N Y)10 779-83)。在此方法中，由噬菌體呈現獲得之「原始」人類抗體的親和力可藉由用獲自未經免疫之供體之V域基因的天然存在變異體(譜系)連續置換重鏈及輕鏈V區基因進行改良。此項技術允許產生親和力介於nM範圍內之抗體及抗體片段。
製備極大噬菌體抗體譜系之策略已由Waterhouse等人(Waterhouse等人，1993 Nucleic Acids Res 21 2265-6)描述。亦可使用基因改組自齧齒動物抗體獲得人類抗體，其中人類抗體具有與起始齧齒動物抗體相似之親和力及特異性。根據此方法(亦稱作「抗原決定基印記」)，由人類V域基因譜系置換由噬菌體呈現技術獲得之齧齒動物抗體之重鏈或輕鏈V域基因，從而形成齧齒動物-人類嵌合體。用抗原進行選擇可分離能夠復原功能性抗原結合位點之人類可變域，亦即抗原決定基決定(印記)搭配物的選擇。當重複該方法以置換剩餘之齧齒動物V域時，獲得人類抗體(參見PCT WO 93/06213)。與傳統上藉由CDR移植來使齧齒動物抗體人類化不同，此項技術提供不具有齧齒動物起源之構架或CDR殘基的完全人類抗體。
亦可使用雙特異性抗體，其為對至少兩種不同抗原具有結合特異性之單株(較佳人類或人類化)抗體。在當前狀況下，一種結合特異性係針對至少一種IL-12及/或IL-23蛋白質；另一者係針對任何其他抗原。例如，特異性結合IL-12/23蛋白質及至少一種神經營養因子或兩種不同類型之IL-12/23多肽之雙特異性抗體在本發明之範圍內。
製備雙特異性抗體之方法在此項技術中為已知的。傳統上，重組產生雙特異性抗體係基於2個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之共同表現，其中兩條重鏈具有不同特異性(Milstein等人，1983 Nature 305 537-40)。因為隨機組合免疫球蛋白重鏈及輕鏈，故此等融合瘤(四源雜交瘤(quadroma))產生10種不同抗體分子之潛在混合物，其中僅一者具有恰當之雙特異性結構。恰當分子之純化相當麻煩，通常藉由親和層析步驟來進行，且產物產率較低。類似程序係揭示於WO 93/08829及Traunecker等人，1991 Embo J 10 3655-9(其係以全文引用之方式併入本文中)中。
根據一種不同且較佳之方法，使具有所需結合特異性(抗體抗原結合位點)之抗體可變域與免疫球蛋白恆定域序列融合。較佳與免疫球蛋白重鏈恆定域融合，該恆定域包含鉸鏈區、第二重鏈恆定區(CH 2)及第三重鏈恆定區(CH 3)之至少一部分。較佳在至少一種融合體中存在第一重鏈恆定區(CH 1)，其含有輕鏈結合所必需之位點。將編碼免疫球蛋白重鏈融合體(且必要時，編碼免疫球蛋白輕鏈)之DNA插入單獨表現載體中且共同轉染至合適之宿主生物中。當構建中所用之不相等比率之3條多肽鏈提供最佳產率時，此操作為調整具體實例中3個多肽片段之相互比例提供較大靈活性。然而，當以相等比率產生至少兩條多肽鏈會產生高產率時或當該等比率不具特定意義時，有可能將兩條或全部三條多肽鏈之編碼序列插入一種表現載體中。在此方法之一較佳具體實例中，雙特異性抗體在一臂中包含具有第一結合特異性之雜交免疫球蛋白重鏈且另一臂中包含雜交免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結合特異性)。此不對稱結構有助於使所需雙特異性化合物與不合需要之免疫球蛋白鏈組合分離，這是因為免疫球蛋白輕鏈僅存在於一半雙特異性分子中提供一種簡易分離方式。關於產生雙特異性抗體之其他細節，參見例如Suresh等人，1986 Methods Enzymol 121 210-28。
抗體為雙功能性分子，來自重鏈及輕鏈之N末端可變區段以特定方式締合在一起以產生對抗原表面上之特定抗原決定基具有親和力之三維結構。恆定區區段負責血清半生期延長及抗體之效應功能，且與補體結合、吞噬作用刺激、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)及粒狀白血球顆粒釋放之引發相關。可預期抗IL-12/23抗體應能夠執行效應功能，如ADCC或CDC(補體導向性細胞毒性)。此係歸因於發現IL-12可以可結合抗體之膜結合形式(Quinones等人，2000 J Exp Med 192 507-16)存在且可募集效應細胞。或者，本發明抗體可與結合至細胞表面之IL-12或IL-23結合且從而形成能夠將效應細胞募集至靶細胞表面之複合物(Vogel等人，1996 Int Immunol 8 1955-62)。
因此可知，抗體之治療效用可藉由調節其功能特徵來增強，該等功能特徵諸如抗體依賴性細胞毒性、補體依賴性細胞毒性、血清半生期、生物分布及與Fc受體之結合。此調節可藉由蛋白質工程改造、糖工程改造(glycoengineering)或化學方法來達成。視治療應用及所需效應活性之所需水平而定，宜增加或降低此等活性中之任一者。關於對Fc增強之當前方法的評述，參見Carter 2006 Nat Rev Immunol 6 343-57；Presta 2006 Adv Drug Deliv Rev 58640-56。該等增強可包括使抗體之Fc部分突變以確定對Fc受體之親和力增加之突變體(Shields等人，2001 J Biol Chem 276 6591-604；Lazar等人，2006 Proc Natl Acad Sci U S A 103 4005-10)；及經由使抗體在具有經工程改造之糖基化特徵的細胞中表現來調整聚糖結構(Yamane-Ohnuki等人，2004 Biotechnol Bioeng 87 614-22；Li等人，2006 Nat Biotechnol 24 210-5；Schuster等人，2007 Biotechnol J 2 700-8)。
多種調節抗體血清半生期及生物分布之方法係基於改變抗體與新生兒Fc受體(FcRn)(一種在保護IgG免於代謝方面具有關鍵作用之受體)之間的相互作用及維持高血清抗體濃度。Dall' Acqua等人(2002)描述IgGl之Fc區中增強與FcRn之結合親和力，從而增加血清半生期之取代，且進一步表明在M252Y/S254T/T256E之三元取代的情況下，生物可用性增強且ADCC活性受到調節(Dall' Acqua 2006)。亦參見美國專利第6,277,375號、第6,821,505號及第7,083,784號。Hinton等人(2004,2005)已描述位置250及428之恆定域胺基酸取代，其賦予增加之活體內半生期。亦參見美國專利第7,217,797號。Petkova等人(2006)已描述位置307、380及434之恆定域胺基酸取代，其賦予增加之活體內半生期。亦參見Shields等人(2001)及WO 2000/42072。美國專利申請案第20090142340號、第20090068175號及第20090092599號描述調節與Fc受體之結合及由此等受體所介導之後繼功能(包括FcRn結合及血清半生期)的恆定域胺基酸取代之其他實例。
已知與抗體分子連接之聚糖影響抗體與Fc受體及聚糖受體之相互作用且從而影響抗體活性(包括血清半生期)(Kaneko Y等人，2006；Jones AJ等人，2007；Kanda Y等人，2007)。因此，某些調節所需抗體活性之糖型(glycoform)可賦予治療優勢。產生經基因改造之糖型的方法在此係技術中為已知的且包括(但不限於)美國專利第6,602,684號、第7,326,681號、第7,388,081號及WO 2008/006554中所述之方法。
如例如Fishburn(2008)中所評述，藉由添加聚乙二醇(PEG)使半生期延長已廣泛用於延長蛋白質之血清半生期。
異源結合抗體(Heteroconjugate antibody)亦在本發明之範圍內。異源結合抗體包含兩個共價接合之抗體。該等抗體(例如)意欲使免疫系統細胞靶向不合需要之細胞(美國專利第4,676,980號)且用於治療HIV感染(WO 91/00360、W0 92/00373及EP 03089)。異源結合抗體可使用任何合適之交聯方法來製備。合適交聯劑及多種交聯技術在此項技術中為熟知的且揭示於美國專利第4,676,980號中。
在一較佳具體實例中，由細胞系、混合細胞系、不朽化細胞或不朽化細胞之純系族群產生至少一種本發明抗體或特定部分或變異體。可使用合適方法來產生不朽化結合產生之細胞，例如，使產生人類抗體之細胞與雜交骨髓瘤融合或經由用EB病毒(Epstein Barr virus)感染使活化人類B細胞不朽化(Gustafsson等人，1991 Hum Antibodies Hybridomas 226-32；Zanella等人，1992 J Immunol Methods 156 205-15；Niedbala等人，1998 Hybridoma 17 299-304)。較佳地，藉由使如本文中所述及/或如此項技術中所知能夠產生人類抗體譜系之轉殖基因動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、非人類靈長類動物及其類似動物)免疫來產生人類抗人類IL-12/23蛋白質、片段、特定部分或變異體。可自該等動物分離產生人類抗體之細胞且使用合適方法(諸如本文中所述之方法)使其不朽化。
可產生與人類抗原結合之人類抗體譜系的轉殖基因小鼠可由已知方法產生(例如(但不限於)頒予Lonberg等人之美國專利第5,770,428,號、第5,569,825號、第5,545,806號、第5,625,126號、第5,625,825號、第5,633,425號、第5,661,016號及第5,789,650號；Jakobovits等人，WO 98/50433；Jakobovits等人，WO 98/24893；Lonberg等人，WO 98/24884；Lonberg等人，WO 97/13852；Lonberg等人，WO 94/25585；Kucherlapate等人，WO 96/34096；Kucherlapate等人，EP 0463 151 B1；Kucherlapate等人，EP 0710 719 A1；Surani等人，美國專利第5,545,807號；Bruggemann等人，WO 90/04036；Bruggemann等人，EP 0438 474 B1；Lonberg等人，EP 0814 259 A2；Lonberg等人，GB 2 272 440 A；Taylor,Carmack等人，1992 Nucleic Acids Res 20 6287-95；Tuaillon等人，1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3720-4；Green等人，1994 Nat Genet 7 13-21；Lonberg等人，1994 Nature 368 856-9；Taylor等人，1994 Int Immunol 6 579-91；Lonberg等人，1995 Int Rev Immunol 13 65-93；Fishwild等人，1996 Nat Biotechnol 14 845-51；Mendez等人，1997 Nat Genet 15 146-56，其各以全文引用之方式併入本文中)。一般而言，此等小鼠包含至少一種包含來自至少一個人類免疫球蛋白基因座之經功能性重排或可進行功能性重排之DNA的轉殖基因。該等小鼠中之內源性免疫球蛋白基因座可斷裂或缺失以消除動物產生由內源性基因所編碼之抗體的能力。
如本文中所用，術語「功能性重排」係指來自免疫球蛋白基因座之DNA區段已經歷V(D)J重組，從而產生編碼免疫球蛋白鏈(例如重鏈、輕鏈)之免疫球蛋白基因或其任何部分。可使用合適方法直接或間接鑑認經功能性重排之免疫球蛋白基因，該等方法諸如核苷酸定序、使用可黏接至基因區段之間的編碼接點(coding joint)之探針進行雜交(例如南方墨點法、北方墨點法)或用可黏接至基因區段之間的編碼接點之引子使免疫球蛋白基因酶促擴增(例如聚合酶鏈反應)。亦可使用合適方法來確定細胞產生包含特定可變區之抗體亦或包含特定序列(例如，至少一個CDR序列)之可變區。在一實施例中，可自產生抗體之細胞(例如融合瘤或重組細胞或其他合適來源)分離mRNA且用於產生編碼抗體或其特定部分或變異體之cDNA。可選殖cDNA且定序，或可使用特異性黏接至相關可變區部分(例如CDR，編碼接點)之第一引子及特異性黏接至非可變區序列(例如，CH 1、VH )之第二引子來擴增cDNA(例如，藉由聚合酶鏈反應或其他已知之合適方法)。
宜使用肽呈現文庫來達成與相似蛋白質或片段特異性結合之抗體、其特定部分或變異體之篩選。此方法包括針對具有所需功能或結構之個別成員對大型肽集合進行篩選。肽呈現文庫之抗體篩選在此項技術中為熟知的。所呈現之肽序列可為3至5000個或以上5000個胺基酸長，常為5-100個胺基酸長且經常為約8至25個胺基酸長。除產生肽文庫之直接化學合成法以外，亦已描述若干種重組DNA方法。一種類型包括在噬菌體或細胞表面上呈現肽序列。各噬菌體或細胞含有編碼特定呈現之肽序列的核苷酸序列。該等方法係描述於PCT專利公開案第WO 91/17271號、第WO 91/18980號、第WO 91/19818號及第WO 93/08278號中。其他產生肽文庫之系統具有試管內化學合成及重組方法之態樣。參見PCT專利公開案第WO 92/05258號、第WO 92/14843號及第WO 96/19256號。亦參見美國專利第5,658,754號及第5,643,768號。肽呈現文庫、載體及篩選套組可自如nvitrogen(Carlsbad,Calif.)及Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire,UK)之供應商購得。參見例如讓渡於Enzon之美國專利第4,704,692號、第4,939,666號、第4,946,778號、第5,260,203號、第5,455,030號、第5,518,889號、第5,534,621號、第5,656,730號、第5,763,733號、第5,767,260號、第5,856,456號；讓渡於Dyax之美國專利第5,223,409號、第5,403,484號、第5,571,698號、第5,837,500號；讓渡於Affymax之美國專利第5,427,908號、第5,580,717號；讓渡於Cambridge Anitibody Technologies之美國專利第5,885,793號；讓渡於Genentech之美國專利第5,750,373號；讓渡於Xoma之美國專利第5,618,920號、第5,595,898號、第5,576,195號、第5,698,435號、第5,693,493號、第5,698,417號；Colligan(同上)；Ausubel(同上)；Sambrook(同上)，上述專利及公開案各以全文引用之方式併入本文中。
本發明之抗體、其特定部分及變異體亦可藉由向轉殖基因動物或哺乳動物(諸如山羊、奶牛、馬、羊及其類似動物)提供編碼至少一種抗體、其特定部分或變異體之核酸以在其乳汁中產生該等抗體、其特定部分或變異體來製備。該等動物可使用已知方法來提供。參見例如(但不限於)美國專利第5,827,690號、第5,849,992號、第4,873,316號、第5,849,992號、第5,994,616號、第5,565,362號、第5,304,489號,其各以全文引用之方式併入本文中。
本發明之抗體、其特定部分及變異體可另外使用編碼至少一種抗體或特定部分或變異體之核酸來製備，以提供在植物部分或自其所培養之細胞中產生該等抗體、其特定部分或變異體的轉殖基因植物及所培養之植物細胞(例如(但不限於)煙草、玉米及苔蘚植物)。作為非限制性實例，(例如)使用誘導性啟動子，已成功使用表現重組蛋白質之轉殖基因煙草葉來提供大量重組蛋白質。參見例如Cramer等人，1999 Curr Top Microbiol Immunol 240 95-118及其中所引用之參考文獻。同樣，已使用轉殖基因玉米以商業化生產水平表現哺乳動物蛋白質，該等哺乳動物蛋白質之生物活性與其他重組系統中所產生或自天然來源純化之蛋白質相當。參見例如Hood等人，1999 Adv Exp Med Biol 464 127-47及其中所引用之參考文獻。亦已自包括煙草種子及馬鈴薯塊莖之轉殖基因植物種子大量產生抗體。參見例如Conrad等人，1998 Plant Mol Biol 38 101-9及其中所引用之參考文獻。抗體亦已由該等經基因修飾之苔蘚原生質體短暫表現及分泌且展示不變之抗原結合親和力且在大量測試中顯示出至高達40倍增強之ADCC(Schuster,Jost等人，2007 Biotechnol J 2 700-8)。因此，根據已知方法，亦可使用轉殖基因植物來產生本發明之抗體、其特定部分及變異體。亦參見例如Whitelam等人，1994 Biochem Soc Trans 22 940-4；Ma等人，1995 Trends Biotechnol 13 522-7；Ma等人，1995 Plant Physiol 109 341-6及其中所引用之參考文獻。上述參考文獻各以全文引用之方式併入本文中。
本發明之抗體可以各種親和力(KD )結合人類IL-12/23。在一較佳具體實例中，至少一種本發明抗體可視情況以高親和力結合人類IL-12/23。舉例而言，抗體可以等於或小於約10-9 M之KD ，或更佳以等於或小於約0.1-9.9(或其中任何範圍或值)×10-10 M、10-11 M、10-12 M、10-13 M或其中任何範圍或值之KD 結合人類IL-12/23蛋白質。抗體對抗原之親和力或結合性可使用任何合適方法以實驗方式測定。(參見例如Berzofsky等人，「Antibody-Antigen Interactions」,Fundamental Immunology,Paul,W. E.編，Raven Press:New York,N.Y.(1984)；Kuby,Janis Immunology,W. H. Freeman and Company:New York,N.Y.(1992)；及本文中所述之方法)。若在不同條件(例如，鹽濃度、pH值)下量測，則所量測之特定抗體與其結合搭配物之親和力可改變。因此，對親和力及其他抗原結合參數(例如KD 、Ka 、Kd )之量測較佳用標準化抗體及結合搭配物溶液及標準化緩衝液(諸如本文中所述之緩衝液)來進行。
本發明之經分離核酸分子可包括包含開放閱讀框架(ORF)(視情況具有一或多個內含子)之核酸分子，該等核酸分子分別編碼(例如(但不限於))至少一條重鏈或輕鏈之至少一個CDR(如CDR1、CDR2及/或CDR3)之至少一個特定部分；包含抗體、其特定部分或變異體之編碼序列的核酸分子；及包含實質上不同於上文所述之核苷酸序列但歸因於遺傳密碼簡併，故仍編碼至少一種如本文中所述及/或如此項技術中所知之抗體之核苷酸序列的核酸分子。當然，遺傳密碼在此項技術中為熟知的。因此，對於熟習此項技術者而言，常規產生該等編碼本發明之特異性抗體、其特定部分或變異體之簡併核酸變異體。參見例如Ausubel等人(同上)，且本發明包括該等核酸變異體。
如本文中所指示，本發明之包含編碼抗體或特定部分或變異體之核酸的核酸分子可包括(但不限於)單獨編碼抗體片段之胺基酸序列之核酸分子；整個抗體或其部分之編碼序列；抗體、片段或部分之編碼序列；以及具有或不具有上述額外編碼序列(諸如至少一個內含子)之額外序列(諸如至少一種信號前導或融合肽之編碼序列)，連同額外非編碼序列(包括(但不限於)非編碼5' 及3' 序列，諸如在轉錄、mRNA加工(包括剪接及聚腺苷酸化信號(例如核糖體結合及mRNA穩定))方面起作用之經轉錄、未經轉譯之序列)；編碼額外胺基酸(諸如提供額外功能性之胺基酸)的額外編碼序列。因此，可使編碼抗體或特定部分或變異體之序列與標記序列融合，該標記序列諸如有助於純化包含抗體片段或部分之融合抗體或特定部分或變異體之肽的編碼序列。
本發明提供經分離核酸，其在選擇性雜交條件下與編碼本發明抗體之多核苷酸雜交。因此，此具體實例之多核苷酸可用於分離、偵測及/或定量包含該等多核苷酸之核酸。例如，可使用本發明之多核苷酸來鑑認、分離或擴增寄存文庫中之部分或全長純系。在一些具體實例中，多核苷酸為所分離之基因組或cDNA序列或以其他方式與來自人類或哺乳動物核酸文庫之cDNA互補。
較佳地，cDNA文庫包含至少80%全長序列、較佳至少85%或90%全長序列且更佳至少95%全長序列。可校正cDNA文庫以增加稀有序列之表現。在相對於互補序列之序列一致性降低之序列的情況下，典型地使用但非排他地使用低等或中等嚴格度之雜交條件。對於具有較大一致性之序列而言，可視情況使用中等及高嚴格度之條件。低嚴格度條件允許選擇性雜交具有約70%序列一致性之序列且可用於鑑認直系同源(orthologous)或旁系同源(paralogous)序列。
本發明之多核苷酸將視情況編碼由本文中所述之多核苷酸編碼之抗體或特定部分或變異體的至少一部分。本發明之多核苷酸涵蓋可用於與編碼本發明之抗體或特定部分或變異體之多核苷酸選擇性雜交之核酸序列。參見例如Ausubel(同上)；Colligan(同上)，各以全文引用之方式併入本文中。
本發明之經分離核酸可使用如此項技術中所熟知之(a)重組方法、(b)合成技術及(c)純化技術或其組合來製備。
核酸可適宜地包含除本發明之多核苷酸以外之序列。例如，可將包含一或多個核酸內切酶限制性位點之多選殖位點插入核酸中以輔助多核苷酸之分離。同樣，可插入可轉譯序列以輔助分離本發明之經轉譯多核苷酸。例如，六聚組胺酸標記序列提供適宜純化本發明之蛋白質的方式。除去編碼序列，本發明之核酸視情況為用於選殖及/或表現本發明之多核苷酸的載體、銜接子(adapter)或連接子。
可將額外序列添加至該等選殖及/或表現序列中以使其在選殖及/或表現中之功能最佳化、輔助多核苷酸之分離或改良細胞中之多核苷酸引入。選殖載體、表現載體、銜接子及連接子之使用在此項技術中為熟知的。(參見例如Ausubel(同上)；或Sambrook(同上))。
本發明之經分離核酸組合物(諸如RNA、cDNA、基因組DNA或其任何組合)可使用熟習此項技術者所知之多種選殖方法自生物來源獲得。在一些具體實例中，使用在嚴格條件下與本發明之多核苷酸選擇性雜交的寡核苷酸探針來鑑認cDNA或基因組DNA文庫中之所需序列。RNA之分離及cDNA及基因組文庫之構建為一般技術者所熟知(參見例如Ausubel(同上)或Sambrook(同上))。
可使用基於本發明之多核苷酸序列(諸如本文中所揭示之多核苷酸序列)的探針來篩選cDNA或基因組文庫。探針可用於與基因組DNA或cDNA序列雜交以分離相同或不同生物中之同源基因。熟習此項技術者應瞭解在檢定中可使用各種雜交嚴格度；且雜交或洗滌培養基可為嚴格的。因為雜交條件變得較嚴格，故探針與靶之間須存在較大之互補度以進行雙鏈體形成。嚴格度可由溫度、離子濃度、pH值及部分變性溶劑(諸如甲醯胺)之存在中之一或多者控制。例如，宜藉由經由(例如)在0%至50%範圍內操控甲醯胺濃度使反應物溶液之極性變化來改變雜交之嚴格度。可偵測結合所需之互補度(序列一致性)將根據雜交培養基及/或洗滌培養基之嚴格度而變化。互補度最佳為100%或90%-100%或其中任何範圍或值。然而，應瞭解可藉由降低雜交及/或洗滌培養基之嚴格度來補償探針及引子中之較小序列變化。
RNA或DNA之擴增方法在此項技術中為熟知的，且根據本發明，可在未進行不當實驗之情況下基於本文中所提供之教示及指導使用該等方法。DNA或RNA擴增之已知方法包括(但不限於)聚合酶鏈反應(PCR)及相關擴增方法(參見例如Mullis等人之美國專利第4,683,195號、第4,683,202號、第4,800,159號、第4,965,188號；Tabor等人之美國專利第4,795,699號及第4,921,794號；Innis之美國專利第5,142,033號；Wilson等人之美國專利第5,122,464號；Innis之美國專利第5,091,310號；Gyllensten等人之美國專利第5,066,584號；Gelfand等人之美國專利第4,889,818號；Silver等人之美國專利第4,994,370號；Biswas之美國專利第4,766,067號；Ringold之美國專利第4,656,134號)及使用靶序列之反義RNA作為雙股DNA合成之模板的RNA介導之擴增(Malek等人之美國專利第5,130,238號，商標名NASBA)，該等參考文獻之全部內容係以引用方式併入本文中。(參見例如Ausubel(同上)或Sambrook(同上))。
例如，可使用PCR技術直接自基因組DNA或cDNA文庫擴增本發明之多核苷酸序列及相關基因。PCR及其他試管內擴增方法亦可適用於(例如)選殖編碼待表現之蛋白質的核酸序列、製備用作探針以偵測所需mRNA於樣本中之存在的核酸、適用於核酸定序或適用於其他目的。足以經由試管內擴增方法來指導熟習此項技術者之技術之實例可見於Berger(同上)、Sambrook(同上)及Ausubel(同上)以及Mullis等人，美國專利第4,683,202號(1987)；及Innis等人編，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications,Academic Press公司,San Diego,Calif.(1990)中。基因組PCR擴增之市售套組在此項技術中為已知的。參見例如Advantage-GC基因組PCR套組(Clontech)。可使用T4基因32蛋白質(Boehringer Mannheim)來改良長PCR產物之產率。
本發明之經分離核酸亦可藉由根據已知方法進行直接化學合成來製備(參見，例如Ausubel等人(同上))。化學合成一般產生單股寡核苷酸，可使用該單股作為模板藉由與互補序列雜交或藉由用DNA聚合酶聚合而使其變為雙股DNA。熟習此項技術者應瞭解，雖然DNA之化學合成可限於約100個或以上100個鹼基之序列，但可藉由連接較短序列獲得較長序列。
本發明進一步提供包含本發明之核酸的重組表現卡匣。可使用本發明之編碼本發明之抗體或特定部分或變異體之核酸序列(例如cDNA或基因組序列)來構建可引入至少一種所需宿主細胞中之重組表現卡匣。重組表現卡匣典型地包含與將引導多核苷酸在預期宿主細胞中轉錄之轉錄起始調節序列可操作性連接的本發明之多核苷酸。可使用異源性及非異源性(亦即內源性)啟動子來引導本發明之核酸表現。
在一些具體實例中，可將用作啟動子、增強子或其他元件之經分離核酸引入本發明之多核苷酸之非異源性形式之合適位置(上游、下游或內含子中)以上調或下調本發明之多核苷酸的表現。例如，可在活體內或試管內藉由突變、缺失及/或取代來改變內源性啟動子。
本發明亦關於包括本發明之經分離核酸分子的載體、用重組載體進行基因工程改造之宿主細胞及藉由如此項技術中所熟知之重組技術產生至少一種抗體或特定部分或變異體。參見例如Sambrook等人(同上)；Ausubel等人(同上)，各以全文引用之方式併入本文中。多核苷酸可視情況與宿主中繁殖之含有可選擇標記之載體接合。一般而言，可將質體載體引入沈澱物(諸如磷酸鈣沈澱物)或具有帶電脂質之複合物中。若載體為病毒，則可在試管內使用適當的包裝細胞系包裝該載體且接著將其轉導至宿主細胞中。
DNA插入片段應與適當啟動子可操作性連接。表現構築體進一步含有用於轉錄起始、終止之位點及在轉錄區中含有用於轉譯之核糖體結合位點。由構築體表現之成熟轉錄物之編碼部分較佳會包括在開始位置之轉譯起始及適當定位於待轉譯mRNA的末端之終止密碼子(例如UAA、UGA或UAG)，其中UAA及UAG較佳用於哺乳動物或真核細胞表現。
表現載體較佳(但視情況)包括至少一種可選擇標記。該等標記包括例如(但不限於)甲胺喋呤(MTX)、二氫葉酸還原酶(DHFR，美國專利第4,399,216號、第4,634,665號、第4,656,134號、第4,956,288號、第5,149,636號及第5,179,017號)、安比西林(ampicillin)、新黴素(G418)、黴酚酸或對真核細胞培養物具有抗性之麩醯胺酸合成酶(GS，美國專利第5,122,464號、第5,770,359號及第5,827,739號)及用於在大腸桿菌(E. coli)及其他細菌或原核生物中培養之四環素或安比西林抗性基因(上述專利係以全文引用之方式併入本文中)。適用於上述宿主細胞之培養基及條件在此項技術中為已知的。熟習此項技術者顯而易見合適載體。宿主細胞中載體構築體之引入可由磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導之轉染、陽離子脂質介導之轉染、電穿孔、轉導、感染或其他已知方法達成。此項技術中描述該等方法，諸如Sambrook(同上),第1-4章及第16-18章；Ausubel(同上),第1、9、13、15、16章。
至少一種本發明抗體、特定部分或變異體可以經修飾形式(諸如融合蛋白)表現且不僅可包括分泌信號，亦可包括額外異源性功能區。例如，可將額外胺基酸(較佳帶電胺基酸)區域添加至抗體、特定部分或變異體之N末端以改良純化期間或後繼處理及儲存期間於宿主細胞中之穩定性及持久性。同樣，可將肽部分添加至本發明之抗體、特定部分或變異體中以促成純化。在最終製備抗體或其至少一個片段之前可移除該等區域。該等方法係描述於多種標準實驗室手冊中，諸如Sambrook(同上),第17.29-17.42章及第18.1-18.74章；Ausubel(同上),第16、17及18章。一般技術者可知曉多種可用於使編碼本發明蛋白質的核酸表現之表現系統。
或者，可藉由在含有編碼本發明之抗體、特定部分或變異體之內源性DNA的宿主細胞中開啟(藉由操縱)而在宿主細胞中表現本發明之核酸。例如，如美國專利第5,580,734號、第5,641,670號、第5,733,746號及第5,733,761號(以全文引用之方式併入本文中)中所述，該等方法在此項技術中為熟知的。
適用於產生抗體、其特定部分或變異體之說明性細胞培養物為哺乳動物細胞。哺乳動物細胞系統常呈單層細胞之形式，但亦可使用哺乳動物細胞懸浮液或生物反應器。此項技術中已開發多種能夠表現完整糖基化蛋白質之合適宿主細胞系，且該等細胞系包括COS-1(例如ATCC CRL 1650)、COS-7(例如ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如ATCC CRL-10)、CHO(例如ATCC CRL 1610)及BSC-1(例如ATCC CRL-26)細胞系、COS-7細胞、CHO細胞、hep G2細胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293細胞、海拉細胞及其類似細胞，其可易於自(例如)American Type Culture Collection,Manassas,Va得到。較佳宿主細胞包括淋巴起源之細胞，諸如骨髓瘤及淋巴瘤細胞。尤其較佳之宿主細胞為P3X63Ag8.653細胞(ATCC寄存編號CRL-1580)及SP2/0-Ag14細胞(ATCC寄存編號CRL-1851)。在一尤其較佳之具體實例中，重組細胞為P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14細胞。
此等細胞之表現載體可包括下列表現控制序列中之一或多者，諸如(但不限於)複製起點；啟動子(例如晚期或早期SV40啟動子、CMV啟動子；美國專利第5,168,062號、第5,385,839號)、HSV tk啟動子、pgk(磷酸甘油酸激酶)啟動子、EF-1α啟動子(美國專利第5,266,491號)、至少一種人類免疫球蛋白啟動子；增強子及/或處理資訊位點(諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、聚腺苷酸化位點(例如SV40大T Ag聚腺苷酸添加位點)及轉錄終止子序列。參見例如Ausubel等人(同上)；Sambrook等人(同上)。其他適用於產生本發明之核酸或蛋白質之細胞為已知的及/或可自(例如)美國菌種保存中心細胞系及融合瘤目錄(American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas，www.atcc.org)或其他已知或商業來源得到。
當使用真核宿主細胞時，典型地將聚腺苷酸化或轉錄終止子序列併入載體中。終止子序列之實例為來自牛生長激素基因之聚腺苷酸化序列。亦可包括精確剪接轉錄物之序列。剪接序列之實例為來自SV40之VP1內含子(Sprague等人，1983 J Virol 45 773-81)。另外，如此項技術中所知，可將控制宿主細胞中之複製之基因序列併入載體中。
抗體、特定部分或變異體可藉由熟知方法自重組細胞培養物中回收且純化，該等熟知方法包括(但不限於)蛋白質A純化、硫酸銨或乙醇沈澱、酸萃取、陰離子或陽離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水性相互作用層析、親和層析、羥磷灰石層析及凝集素層析。亦可使用高效液相層析(「HPLC」)進行純化。參見例如Colligan,Current Protocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science,John Wiley ＆ Sons,NY,N.Y.,(1997-2003)(例如第1、4、6、8、9、10章)，各以全文引用之方式併入本文中。
本發明之抗體、其特定部分或變異體包括天然純化產物、化學合成程序之產物及由重組技術自真核宿主(包括例如酵母、高等植物、昆蟲及哺乳動物細胞)所產生之產物。視重組產生程序中所用之宿主而定，本發明之抗體、特定部分或變異體可經糖基化或可未經糖基化，但較佳經糖基化。該等方法係描述於多種標準實驗室手冊中，諸如Sambrook(同上)，第17.37-17.42部分；Ausubel(同上),第10、12、13、16、18及20章；Colligan,Protein Science(同上),第12-14章，全部係以全文引用之方式併入本文中。
本發明之經分離抗體包含由如本文中較充分論述之本發明之任一種多核苷酸編碼之抗體或特定部分或變異體，或任何經分離或經製備之抗體、其特定部分或變異體。
較佳地，抗體或抗原結合片段結合人類IL-12/23蛋白質且從而實質上中和蛋白質之生物活性。抗體、其特定部分或變異體部分地或較佳實質上中和至少一種IL-12/23蛋白質之至少一種生物活性且從而抑制經由IL-12與至少一種IL-12受體之結合或IL-23與至少一種IL-23受體之結合或經由其他IL-12或IL-23依賴性或介導性機制所介導之活性。如本文中所用，術語「中和抗體」係指可使人類IL-12p40蛋白質或片段相關之依賴性活性降低約20%-120%，較佳降低至少約60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%或以上100%(視檢定而定)之抗體。較佳藉由如本文中所述及/或如此項技術中所知之至少一種合適抗體或蛋白質檢定來分析抗體或特定部分或變異體抑制人類IL-12/23相關之依賴性活性的能力。本發明之抗體、特定部分或變異體可具有任何類別(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同型且可包含κ或λ輕鏈。在一具體實例中，抗體或特定部分或變異體包含IgG重鏈或確定片段，例如，同型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中之至少一者。此類型抗體可如本文中所述及/或如此項技術中所知藉由使用包含至少1種人類輕鏈(例如IgG、IgA及IgM；例如γ1、γ2、γ3、γ4)轉殖基因之轉殖基因小鼠或其他轉殖基因非人類哺乳動物來製備。在另一具體實例中，抗體、其特定部分或變異體包含IgG1重鏈及IgG1輕鏈。
至少一種本發明抗體、特定部分或變異體與IL-12p40蛋白質、其片段、部分或任何組合之至少一種具有特異性之特定抗原決定基結合。作為非限制性實例，抗體、特定部分或變異體與至少一種包含整個IL-12p40亞單位的胺基酸序列中之至少1-3個胺基酸的抗原決定基特異性結合。至少一種特定抗原決定基可包含IL-12p40之至少1個胺基酸之任何組合，諸如(但不限於)SEQ ID NO:1(人類IL-12p40亞單位，306個胺基酸)之1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、280-290、290-300、300-306、1-7、14-21、29-52、56-73、83-93、96-105、156-175、194-204、208-246、254-273、279-281或289-300中之至少一者的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14個胺基酸。此等預測抗原決定基可存在於IL-12、IL-23、IL-12p40單體及IL-12p80同元二聚體上。
抗體可包含具有確定胺基酸序列之重鏈或輕鏈可變區中之至少一者。例如，在一較佳具體實例中，抗體包含至少一個重鏈可變區及/或至少一個輕鏈可變區中之至少一者。可使用合適方法來製備與人類IL-12/23蛋白質及/或片段結合且包含確定重鏈或輕鏈可變區之人類抗體，該等方法諸如噬菌體呈現(Katsube等人，1998 Int J Mol Med 1 863-8)或使用如此項技術中所知及/或如本文中所述的轉殖基因動物之方法。例如，可用人類IL-12及/或IL-23蛋白質、其受體及/或片段使包含經功能性重排之人類免疫球蛋白重鏈轉殖基因及包含可進行功能性重排之人類免疫球蛋白輕鏈基因座DNA之轉殖基因的轉殖基因小鼠免疫以產生抗體。必要時，可分離產生抗體之細胞且可如本文中所述及/或如此項技術中所知來製備融合瘤或其他不朽化產生抗體之細胞。或者，可使用編碼核酸或其部分在合適宿主細胞中表現抗體、特定部分或變異體。
本發明亦關於包含實質上與本文中所述之胺基酸序列相同之胺基酸序列的抗體、抗原結合片段、免疫球蛋白鏈及CDR。較佳地，該等抗體或抗原結合片段及包含該等鏈或CDR之抗體可以高親和力(例如，KD 小於或等於約10-9 M)結合人類IL-12/23蛋白質及/或片段。實質上與本文中所述之序列相同之胺基酸序列包括包含保守胺基酸取代以及胺基酸缺失及/或插入之序列。保守胺基酸取代係指第一胺基酸由具有與其相似之化學及/或物理特性(例如，電荷、結構、極性、疏水性/親水性)的第二胺基酸置換。保守取代包括下列群組中之一種胺基酸由另一胺基酸置換：離胺酸(K)、精胺酸(R)及組胺酸(H)；天冬胺酸(D)及麩胺酸(E)；天冬醯胺(N)、麩胺醯胺(Q)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、酪胺酸(Y)、K、R、H、D及E；丙胺酸(A)、纈胺酸(V)、白胺酸(L)、異白胺酸(I)、脯胺酸(P)、苯丙胺酸(F)、色胺酸(W)、甲硫胺酸(M)、半胱胺酸(C)及甘胺酸(G)；F、W及Y；C、S及T。
如本文中所說明，本發明之抗體或特定部分或變異體可包括由天然突變或人類操縱產生之一或多個胺基酸取代、缺失或添加。當然，熟習此項技術者可進行之胺基酸取代之數目視多種因素而定，包括上文所述之彼等因素。一般而言，如本文中所說明，對於任何既定之結合多肽而言，胺基酸取代、插入或缺失之數目應不超過40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1，諸如1-30或其中任何範圍或值。
本發明之抗體、特定部分或變異體中對於功能所必需之胺基酸可藉由此項技術中已知之方法來鑑認，該等方法諸如定點突變誘發或丙胺酸掃描突變誘發(例如Ausubel(同上),第8、15章；Cunningham等人，1989 Science 244 1081-5)。後一程序在分子中之每個殘基處引入單個丙胺酸突變。接著測試所得突變分子之生物活性，諸如(但不限於)至少一種IL-12/23中和活性。對於抗體、特定部分或變異體結合至關重要之位點亦可由結構分析(諸如結晶、核磁共振或光親和標記)來鑑認(de Vos等人，1992 Science 255 306-12；Smith等人，1992 J Mol Biol 224 899-904)。
在另一態樣中，本發明係關於藉由與有機部分共價連接而經修飾之如本文中所述之抗體及抗原結合片段。該等修改可產生藥物動力學特性有所改良(例如活體內血清半生期增加)之抗體或抗原結合片段。有機部分可為線性或支鏈親水性聚合基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。在一特定具體實例中，親水性聚合基團可具有約800至約120,000道爾頓(Dalton)之分子量且可為聚烷二醇(例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、胺基酸聚合物或聚乙烯吡咯啶酮，且脂肪酸或脂肪酸酯基團可包含約8至約40個碳原子。
本發明之經修飾抗體及抗原結合片段可包含一或多個直接或間接與抗體、特定部分或變異體共價鍵結之有機部分。與本發明之抗體或抗原結合片段鍵結之各有機部分可獨立地為親水性聚合基團、脂肪酸基團或脂肪酸酯基團。如本文中所用，術語「脂肪酸」包括單羧酸及二羧酸。如本文中所用，術語「親水性聚合基團」係指與在辛烷中相比，更可溶於水中之有機聚合物。例如，聚離胺酸在水中比在辛烷中更可溶。因此，本發明涵蓋藉由共價連接聚離胺酸而經修飾之抗體。適用於修飾本發明之抗體的親水性聚合物可為線性或支鏈聚合物且包括(例如)聚烷二醇(例如PEG、單甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG及其類似物)、碳水化合物(例如葡聚糖、纖維素、寡醣、多醣及其類似物)、親水性胺基酸之聚合物(例如聚離胺酸、聚精胺酸、聚天冬胺酸及其類似物)、聚烷氧化物(例如聚氧化乙烯、聚氧化丙烯及其類似物)及聚乙烯吡咯啶酮。較佳地，修飾本發明之抗體的親水性聚合物作為單獨分子實體具有約800至約150,000道爾頓之分子量。例如，可使用PEG5000 及PEG20,000 ，其中下標為聚合物以道爾頓計之平均分子量。
親水性聚合基團可經1至約6個烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基團取代。經脂肪酸或脂肪酸酯基團取代之親水性聚合物可使用合適方法來製備。例如，可使包含胺基之聚合物與脂肪酸或脂肪酸酯之羧酸酯基偶合且可使脂肪酸或脂肪酸酯上之活化羧酸酯基(例如，用N,N-羰基二咪唑活化)與聚合物上之羥基偶合。
適用於修飾本發明之抗體的脂肪酸及脂肪酸酯可為飽和的或可含有一或多個不飽和單元。適用於修飾本發明之抗體的脂肪酸包括例如正十二烷酸酯(C12 ，月桂酸酯)、正十四烷酸酯(C14 ，肉豆蔻酸酯)、正十八烷酸酯(C18 ，硬脂酸酯)、正二十烷酸酯(C20 ，花生酸酯)、正二十二烷酸酯(C22 ，萮樹酸酯)、正三十烷酸酯(C30 )、正四十烷酸酯(C40 )、順Δ9-十八烷酸酯(C18 、油酸酯)、所有順Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸酯(C20 、花生四烯酸酯)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸及其類似物。合適之脂肪酸酯包括包含直鏈或支鏈低碳烷基之二羧酸之單酯。低碳烷基可包含1至約12個，較佳1至約6個碳原子。
經修飾抗體及抗原結合片段可使用合適方法(諸如藉由與一或多種修飾劑反應)來製備。如本文中所用，術語「修飾劑」係指包含活化基團之合適有機基團(例如親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。「活化基團」為可在合適條件下與第二化學基團反應從而在修飾劑與第二化學基團之間形成共價鍵之化學部分或官能基。例如，胺反應性活化基團包括親電子基團，諸如甲苯磺酸酯基、甲磺酸酯基、鹵基(氯基、溴基、氟基、碘基)、N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS)及其類似物。可與硫醇反應之活化基團包括例如馬來醯亞胺、碘乙醯基、丙烯醯基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)及其類似物。醛官能基可與含胺或含醯肼之分子偶合，且疊氮基可與三價磷基反應以形成胺基磷酸酯或磷醯亞胺鍵。適用於將活化基團引入分子中之方法在此項技術中為已知的(參見例如Hermanson,G. T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,Calif.(1996))。活化基團可直接與有機基團(例如親水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)鍵結，或經由連接部分(例如二價C1 -C12 基團，其中一或多個碳原子可由雜原子(諸如氧、氮或硫)置換)與有機基團鍵結。合適連接部分包括(例如)四乙二醇、-(CH2 )3 -、-NH-(CH2 )6 -NH-、-(CH2 )2 -NH-及-CH2 -O-CH2 -CH2 -O-CH2 -CH2 -O-CH-NH-。包含連接部分之修飾劑可(例如)藉由使單-Boc-烷基二胺(例如單-Boc-乙二胺、單-Boc-二胺基己烷)與脂肪酸在1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)存在下反應形成介於自由胺與脂肪酸羧酸酯之間的醯胺鍵而產生。可藉由用三氟乙酸(TFA)處理而自產物移除Boc保護基以暴露可與所述之另一羧酸酯偶合或可與馬來酸酐反應之一級胺，且使所得產物環化以產生脂肪酸之活化馬來醯亞胺衍生物(參見例如Thompson等人，WO 92/16221，其全部教示係以引用方式併入本文中)。
本發明之經修飾抗體可藉由使抗體或抗原結合片段與修飾劑反應而產生。例如，可藉由使用胺反應性修飾劑(例如PEG之NHS酯)而使有機部分以非位點特異性方式與抗體鍵結。經修飾抗體或抗原結合片段亦可藉由還原抗體或抗原結合片段之二硫鍵(例如鏈內二硫鍵)來製備。接著可使經還原之抗體或抗原結合片段與硫醇反應性修飾劑反應以產生本發明之經修飾抗體。可使用合適方法來製備包含鍵結至本發明之抗體、特定部分或變異體之特異性位點之有機部分的經修飾抗體及抗原結合片段，該等方法諸如逆蛋白質水解(reverse proteolysis)(Fisch等人，1992 Bioconjug Chem 3 147-53；Werlen等人，1994 Bioconjug Chem 5 411-7；Capellas等人，1997 Biotechnol Bioeng 56 456-63；Kumaran等人，1997 Protein Sci 6 2233-41))，及Hermanson,G. T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,Calif.(1996)中所述之方法。
本發明之抗體組合物可視情況進一步包含有效量之至少一種選自以下至少一者的化合物或蛋白質：抗感染藥物、心血管(CV)系統藥物、中樞神經系統(CNS)藥物、自主神經系統(ANS)藥物、呼吸道藥物、胃腸(GI)道藥物、激素藥物、用於體液或電解質平衡之藥物、血液學藥物、抗腫瘤藥、免疫調節藥物、眼用藥物、耳用或鼻用藥物、局部藥物、營養藥物或其類似物。該等藥物(包括本文中所提供之各藥物的調配物、適應症、給藥及投藥)在此項技術中為熟知的(參見例如Nursing 2001 Handbook of Drugs,第21版,Springhouse公司,Springhouse,Pa.,2001；Health Professional's Drug Guide 2001,編，Shannon,Wilson,Stang,Prentice-Hall公司,Upper Saddle River,N.J.；Pharmcotherapy Handbook,Wells等人編，Appleton & Lange,Stamford,Conn.，各以全文引用之方式併入本文中)。
本發明之抗體、特定部分或變異體組合物可進一步包含任何合適助劑中之至少一者，該合適助劑諸如(但不限於)稀釋劑、黏合劑、穩定劑、緩衝劑、鹽、親脂性溶劑、防腐劑、佐劑或其類似物。醫藥學上可接受之助劑為較佳的。該等無菌溶液之非限制性實例及製備方法在此項技術中為熟知的，諸如(但不限於)Gennaro編，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing公司(Easton,Pa.)1990。可常規選擇如此項技術中所熟知或如本文中所述適用於抗體組合物之投藥模式、溶解性及/或穩定性的醫藥學上可接受之載劑。
適用於本發明組合物中之醫藥賦形劑及添加劑包括(但不限於)蛋白質、肽、胺基酸、脂質及碳水化合物(例如糖，包括單醣、二醣、三醣、四醣及寡醣；衍生化糖，諸如醛醇、醛糖酸、酯化糖及其類似物；及多醣或糖聚合物)，其可單獨或以組合形式存在，單獨或組合佔1重量%-99.99重量%或1體積%-99.99體積%。例示性蛋白質賦形劑包括血清白蛋白(諸如人血清白蛋白(HSA))、重組人白蛋白(rHA)、明膠、酪蛋白及其類似物。亦可對緩衝能力起作用之代表性胺基酸包括丙胺酸、甘胺酸、精胺酸、甜菜鹼、組胺酸、麩胺酸、天冬胺酸、半胱胺酸、離胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、甲硫胺酸、苯丙胺酸、阿斯巴甜糖及其類似物。一種較佳胺基酸為甘胺酸。
適用於本發明中之碳水化合物賦形劑包括(例如)單醣，諸如果糖、麥芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖及其類似物；二醣，諸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纖維二糖及其類似物；多醣，諸如棉子糖、松三糖、麥芽糊精、葡聚糖、澱粉及其類似物；及醛醇，諸如甘露糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(山梨醇)、肌醇及其類似物。用於本發明中之較佳碳水化合物賦形劑為甘露糖醇、海藻糖及棉子糖。
抗體組合物亦可包括緩衝劑或pH值調節劑；典型地，緩衝劑為自有機酸或鹼製備之鹽。代表性緩衝劑包括有機酸鹽，諸如檸檬酸、抗壞血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、丁二酸、乙酸或鄰苯二甲酸之鹽；Tris、緩血酸胺鹽酸鹽或磷酸鹽緩衝劑。用於本發明組合物中之較佳緩衝劑為有機酸鹽，諸如檸檬酸鹽。
另外，本發明之抗體、特定部分或變異體組合物可包括聚合賦形劑/添加劑，諸如聚乙烯吡咯啶酮、菲科爾(ficolls)(聚合糖)、葡萄糖結合劑(例如環糊精，諸如2-羥基丙基-β-環糊精)、聚乙二醇、調味劑、抗微生物劑、甜味劑、抗氧化劑、抗靜電劑、界面活性劑(例如聚山梨醇酯，諸如「TWEEN20」及「TWEEN80」)、脂質(例如磷脂、脂肪酸)、類固醇(例如膽固醇)及螯合劑(例如EDTA)。
例如，如「Remington:The Science ＆ Practice of Pharmacy」,第19版,Williams ＆ Williams,(1995)及「Physician's Desk Reference」,第52版,Medical Economics,Montvale,N.J.(1998)(其揭示內容係以全文引用之方式併入本文中)中所列，適用於本發明之抗體組合物中之此等及其他已知之醫藥賦形劑及/或添加劑在此項技術中為已知的。較佳載劑或賦形劑物質為碳水化合物(例如醣及醛醇)及緩衝劑(例如檸檬酸鹽)或聚合劑。
本發明提供較佳包含具有生理鹽水之磷酸鹽緩衝劑或所選鹽的穩定調配物以及含有防腐劑之防腐溶液及調配物以及適用於醫藥或獸醫用途之多用途防腐調配物，其包含醫藥學上可接受之調配物中之至少一種抗體、特定部分或變異體。防腐調配物含有於水性稀釋劑中之至少一種已知防腐劑或視情況選自由至少一種以下物質所組成之群組的防腐劑：苯酚、間甲酚、對甲酚、鄰甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亞硝酸苯汞、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化鎂(例如六水合物)、對羥基苯甲酸烷酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯及其類似物)、氯化苯甲烴銨、苄索氯銨、去水乙酸鈉及硫柳汞或其混合物。如此項技術中所知，可使用任何合適濃度或混合物，諸如0.001%-5%或其中任何範圍或值，諸如(但不限於)0.001%、0.003%、0.005%、0.009%、0.01%、0.02%、0.03%、0.05%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.1%、1.2%、1.3%、1.4%、1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%、2.5%、2.6%、2.7%、2.8%、2.9%、3.0%、3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%、3.8%、3.9%、4.0%、4.3%、4.5%、4.6%、4.7%、4.8%、4.9%或其中任何範圍或值。非限制性實施例包括無防腐劑、0.1%-2%間甲酚(例如0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.9%、1.0%)、0.1%-3%苯甲醇(例如0.5%、0.9%、1.1%、1.5%、1.9%、2.0%、2.5%)、0.001%-0.5%硫柳汞(例如0.005%、0.01%)、0.001%-2.0%苯酚(例如0.05%、0.25%、0.28%、0.5%、0.9%、1.0%)、0.0005%-1.0%對羥基苯甲酸烷酯(例如0.00075%、0.0009%、0.001%、0.002%、0.005%、0.0075%、0.009%、0.01%、0.02%、0.05%、0.075%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.75%、0.9%、1.0%)及其類似情形。
本發明之任何方法可包含對需要該調節、治療或療法之細胞、組織、器官、動物或患者投予有效量之包含至少一種抗體、特定部分或變異體之組合物或醫藥組合物。此類方法可視情況進一步包含治療該等免疫疾病之共同投藥或組合療法，其中該至少一種抗體、其特定部分或變異體之投藥進一步包含在投予至少一種選自至少一種以下物質之物質之前、同時及/或之後投藥：多發性硬化治療劑(包括(但不限於)β-干擾素1a及β-干擾素1b(例如AvoneXTM 、RebifTM 、BetaseonTM )、乙酸格拉替雷(glutiramer acetate)(例如克帕松(Copaxone))、環磷醯胺、硫唑嘌呤(azathioprine)、糖皮質類固醇、甲胺喋呤、太平洋紫杉醇(Paclitaxel)、2-氯去氧腺苷、米托蒽醌(mitoxantrone)、IL-10、TGBb、CD4、CD52、安替庫恩(antegren)、CD11、CD18、TNFα、IL-1、IL-2及/或CD4抗體或抗體受體融合體、干擾素α、免疫球蛋白、立斯米德(Lismide)(RequinimaxTM )、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)、依利羅地(elprodil)、吡非尼酮(pirfenidone)或經口髓鞘或對以下至少一者中之一或多者起作用之化合物：自體免疫抑制髓鞘破壞、T-細胞之免疫調節、活化、增殖、遷移及/或抑制細胞功能；抑制T細胞受體/肽/MHC-II相互作用；誘導T細胞aenergy；自體反應性T細胞缺失；抑制通過血腦屏障；改變促炎性(TH 1)與免疫調節(TH 2)細胞介素之平衡；抑制基質金屬蛋白酶抑制劑；神經保護；減輕神經膠樣變性；促進髓鞘再形成)、TNF拮抗劑(例如(但不限於)TNF抗體或片段、可溶性TNF受體或片段、其融合蛋白或小分子TNF拮抗劑)、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻藥、非類固醇消炎藥(NSAID)、鎮痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑(例如胺基糖苷、抗真菌劑、抗寄生蟲藥、抗病毒藥、卡巴盤尼姆(carbapenem)、頭孢菌素(cephalosporin)、氟化喹諾酮、大環內酯、青黴素、磺醯胺、四環素、另一抗微生物劑)、抗牛皮癬劑、皮質類固醇、同化類固醇、IL-12/23藥劑、礦物質、營養劑、甲狀腺藥劑、維生素、鈣相關激素、止瀉劑、鎮咳劑、止吐藥、抗潰瘍劑、輕瀉劑、抗凝劑、紅血球生成素(例如依泊汀α(epoetinα)、非格司亭(例如G-CSF、Neupogen)、沙格司亭(GM-CSF、瘤肯(Leukine))、免疫劑、免疫球蛋白、免疫抑制劑(例如巴利昔單抗(basiliximab)、環孢素、達利珠單抗(daclizumab))、生長激素、激素替代藥物、雌激素受體調節劑、擴瞳劑、睫狀肌麻痹劑、烷化劑、抗代謝藥、有絲分裂抑制劑、放射性藥物、抗抑鬱劑、抗躁狂劑、精神抑制劑、抗焦慮劑、安眠劑、擬交感神經藥、興奮劑、多奈哌齊、他可林、哮喘藥物、β促效劑、吸入型類固醇、白三烯抑制劑、甲基黃嘌呤、色甘酸、腎上腺素或類似物、α去氧核糖核酸酶(Pulmozyme)、細胞介素及細胞介素拮抗劑。合適劑量在此項技術中為熟知的。參見例如Wells等人編，Pharmacotherapy Handbook,第2版,Appleton and Lange,Stamford,Conn.(2000)；PDR Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,Loma Linda,Calif.(2000)，該等參考文獻各以全文引用之方式併入本文中。
適用於本發明之組合物、組合療法、共同投藥、裝置及/或方法之TNF拮抗劑(進一步包含至少一種本發明抗體、其特定部分及變異體)包括(但不限於)抗TNF抗體、其抗原結合片段及與TNF特異性結合之受體分子；防止及/或抑制TNF合成、TNF釋放或其對靶細胞之作用的化合物，諸如撒利多胺(thalidomide)、替尼達普(tenidap)、磷酸二酯酶抑制劑(例如己酮可可鹼(pentoxifylline)及羅立普安(rolipram))、A2b腺苷受體促效劑及A2b腺苷受體增強劑；防止及/或抑制TNF受體信號傳導之化合物，諸如有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶抑制劑；阻斷及/或抑制膜TNF斷裂之化合物，諸如金屬蛋白酶抑制劑；阻斷及/或抑制TNF活性之化合物，諸如血管緊張素轉化酶(ACE)抑制劑(例如卡托普利(captopril))；及阻斷及/或抑制TNF產生及/或合成之化合物，諸如MAP激酶抑制劑。
如本文中所用，「腫瘤壞死因子抗體」、「TNF抗體」、「TNFα抗體」或片段及其類似物降低、阻斷、抑制、消除或干擾TNFα在試管內、原位及/或較佳在活體內之活性。例如，本發明之合適TNF人類抗體可結合TNFα且包括與TNFα特異性結合之抗TNF抗體、其抗原結合片段及其特定突變體或結構域。合適TNF抗體或片段亦可降低、阻斷、消除、干擾、阻止及/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白質合成、TNF釋放、TNF受體信號傳導、膜TNF斷裂、TNF活性、TNF產生及/或合成。
適用於本發明中之較佳TNF受體分子為以高親和力結合TNFα(參見例如Feldmann等人，國際公開案第WO 92/07076號；Loetscher等人，1990 Cell 61 351-9；Schall等人，1990 Cell 61 361-70，該等參考文獻係以全文引用之方式併入本文中)且視情況具有低免疫原性之TNF受體分子。詳言之，55kDa(p55 TNF-R)及75kDa(p75 TNF-R)TNF細胞表面受體適用於本發明中。此等受體之包含該等受體之細胞外域(ECD)或其功能部分之截短形式(參見例如Corcoran等人，1994 Eur J Biochem 223 831-40)亦適用於本發明中。已在尿及血清中偵測到呈30kDa及40kDa TNFα抑制抗體形式之包含ECD之TNF受體截短形式(Engelmann等人，1990 J Biol Chem 265 1531-6)。TNF受體多聚分子及TNF免疫受體融合分子及其衍生物及片段或部分為適用於本發明之方法及組合物中之TNF受體分子的其他實例。可用於本發明中之TNF受體分子的特徵在於其能夠長期以良好至優異之症狀緩解作用及低毒性治療患者。低免疫原性及/或高親和力以及其他不明確之特性可能促成所達成之治療結果。
典型地，對病理病狀之治療係藉由投予有效量或有效劑量之至少一種抗體組合物來達成，該有效量或有效劑量平均總共為每次給藥每公斤患者至少約0.01毫克至500毫克之至少一種抗體、特定部分或變異體之範圍，且較佳為每單次或多次投藥每公斤患者至少約0.1毫克至100毫克抗體、特定部分或變異體之範圍，視組合物中所含之抗體、特定部分或變異體之比活性而定。或者，有效血清濃度可包含每單次或多次投藥0.1μg/ml-5000μg/ml之血清濃度。合適劑量為醫學行醫者所知，且當然將視特定疾病病況、所投予之組合物的比活性及進行治療之特定患者而定。在一些情況下，為達成所需治療量，可需要提供反覆投藥，亦即，反覆個別投予特定經監測或計量之劑量，其中反覆個別投藥直至達成所需每日劑量或作用。較佳劑量可視情況包括每次投藥0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99及/或100mg/kg或其任何範圍、值或部分，或達成以下血清濃度：每單次或多次投藥0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500及/或5000μg/ml之血清濃度或其任何範圍、值或部分。
或者，所投予之劑量可視已知因素而變化，該等因素諸如特定藥劑之藥效學特徵及其投藥模式及途徑；接受者之年齡、健康狀況及體重；症狀之性質及程度、並行治療之種類、治療頻率及所需作用。通常，活性成份之劑量可為每公斤體重約0.1毫克至100毫克。通常，每次投藥或以持續釋放形式投予每公斤0.1毫克至50毫克且較佳0.1毫克至10毫克可有效獲得所需結果。
作為非限制性實例，可使用單次給藥、輸注或重複給藥以以下一次性或週期性劑量之至少一種本發明抗體、特定部分或變異體來提供對人類或動物之治療：每天、第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中之至少一天，或者或另外，第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52週中之至少一週，或者或另外，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年中之至少一年或其任何組合投與0.1至100mg/kg，諸如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg。
適用於體內投藥之劑型(組合物)一般含有每單位或容器約0.1毫克至約500毫克之活性成份。在此等醫藥組合物中，以組合物之總重量計，活性成份通常以約0.5重量%-99.999重量%之量存在。
對於非經腸投藥而言，可將抗體、特定部分或變異體調配成溶液、懸浮液、乳液或凍乾粉末形式，該等形式與醫藥學上可接受之非經腸媒劑組合提供或與醫藥學上可接受之非經腸媒劑單獨提供。該等媒劑之實例為水、生理鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、右旋糖溶液及1%-10%人血清白蛋白。亦可使用脂質體及非水性媒劑(諸如不揮發性油)。媒劑或凍乾粉末可含有維持等滲性(例如氯化鈉、甘露糖醇)及化學穩定性(例如緩衝劑及防腐劑)之添加劑。可藉由已知或合適技術對調配物進行殺菌。
合適醫藥載劑係描述於最新版之Remington's Pharmaceutical Sciences,A. Osol(此項領域中之標準參考書)中。
有時可需要長期(例如，歷時一週至一年之時期)由單次投藥對個體傳遞本發明抗體。可使用各種緩慢釋放、儲槽式或植入式劑型。例如，劑型可含有化合物之在體液中具有低溶解度的醫藥學上可接受之無毒鹽，例如(a)與多元酸之酸加成鹽，該多元酸諸如磷酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、單寧酸、雙羥萘酸、褐藻酸、聚麩胺酸、萘單或二磺酸、聚半乳糖醛酸及其類似物；(b)與多價金屬陽離子(諸如鋅、鈣、鉍、鋇、鎂、鋁、銅、鈷、鎳、鎘及其類似物)或與由(例如)N,N' -二苯甲基-乙二胺或乙二胺所形成之有機陽離子之鹽；或(c)(a)及(b)之組合，例如單寧酸鋅鹽。另外，本發明之化合物或較佳相對不溶性鹽(諸如剛才所述之鹽)可在凝膠(例如單硬脂酸鋁凝膠)及(例如)芝麻油中進行調配以適用於注射。尤其較佳之鹽為鋅鹽、單寧酸鋅鹽、雙羥萘酸鹽及其類似物。例如，如美國專利第3,773,919號中所述，另一類用於注射之緩慢釋放儲槽式調配物應含有經分散而囊封於緩慢降解、無毒、無抗原性聚合物(諸如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物)中之化合物或鹽。化合物或較佳相對不溶性鹽(諸如上文所述之鹽)亦可在膽固醇基質矽橡膠顆粒中進行調配以尤其用於動物。其他緩慢釋放、儲槽式或植入式調配物(例如氣體或液體脂質體)在文獻中係已知的(美國專利第5,770,222號及「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」,J. R. Robinson編，Marcel Dekker公司，N.Y.,1978)。
由於已大體描述本發明，參考下列實施例將更易於理解本發明，該等實施例係以說明之方式提供且不意欲具有限制性。
本發明之實施例
除非另外說明，否則此等實施例中所有對IL-12、IL-23、IL-12p40、IL-12p80、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2及IL-23之提及均係指人類蛋白質形式。
關於此等實施例中所列之各抗體之相應蛋白質及DNA序列，參考表10。
實施例1 1.1分離融合瘤且產生嵌合抗體
使用標準鼠類融合瘤產生技術且使用重組IL-12作為免疫原，獲得兩種融合瘤細胞系，即PMA202及PMA204。如ELISA中所測試(PMA204-圖3)，此等細胞系分泌與IL-12p40(SEQ ID NO:1)、IL-12(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2)及IL-23(SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:3)結合之抗體。該等抗體與鼠類IgG1 κ為同型。
自細胞系PMA202及PMA204提取RNA後，使用PCR技術，獲得鼠類重鏈及輕鏈可變區序列。此等序列如下，其中CDR加下劃線且根據Kabat(Kabat等人，1971 Ann N Y Acad Sci 190 382-93；及Kabat,E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S. Department of Health and Human Services,NIH出版號91-3242)來界定。應注意，所有編碼抗體可變區之後繼蛋白質序列均係根據Kabat編號系統來編號。
PMA202鼠類重鏈可變區(SEQ ID NO:4)
PMA202鼠類輕鏈可變區(SEQ ID NO:5)
PMA204鼠類重鏈可變區(SEQ ID NO:6)
PMA204鼠類輕鏈可變區(SEQ ID NO:7)
使用PMA202蛋白質序列作為模板，產生新的最佳化核苷酸序列，其中如下文所見將鼠類重鏈可變區移植於人類IgG1 域(CH1、CH2及CH3)(SEQ ID NO:8)上，且將輕鏈可變區移植於人類κ恆定域(SEQ ID NO:9)上。此嵌合抗體被稱作抗體202.1：抗體202.1重鏈(SEQ ID NO:10)
抗體202.1輕鏈(SEQ ID NO:11)
使用PMA204蛋白質序列作為模板，產生新的最佳化核苷酸序列，其中如下文所見將鼠類重鏈可變區移植於人類IgG1 域(CH1、CH2及CH3)(SEQ ID NO：8)上，且將輕鏈可變區移植於人類κ恆定域(SEQ ID NO：9)上。此嵌合抗體被稱作抗體1。
抗體1重鏈(SEQ ID NO：12)
抗體1輕鏈(SEQ ID NO：13)
此兩種抗體均係在HEK細胞系中短暫產生且使用蛋白質A層析進行純化。在ELISA(圖3)及表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)(表1)檢定中針對IL-12、IL-23、IL-12p40來測試抗體1，且該抗體展示對IL-12/23之p40亞單位具有特異性。該結合特徵與原始小鼠抗體PMA204之結合特徵相似(圖3)。
實施例2
2.1 PMA204及抗體1之特異性
如使用ELISA所測定，PMA204及抗體1同樣良好地以劑量依賴性方式與人類IL-12、IL-23、IL-12p40及IL-12p80結合(圖3)。使用SPR，計算抗體1之動力學數據，包括ka (結合速率)、kd (解離速率)及平衡解離常數(KD )且列於表1中。抗體1以介於40pM-70pM之間的相似KD 值與人類IL-12、IL-23、IL-12p40結合(表1)。
2.2 PMA204及抗體1中和IL-12與IL-12Rβ2之結合及IL-23與IL-23R之結合
使用受體中和檢定，證實PMA204及抗體1中和IL-12與IL-12Rβ2(SEQ ID NO:15)細胞外域之結合(圖4A)及IL-23與IL-23R(SEQ ID NO:16)細胞外域之結合(圖4B)。
2.3PMA204及抗體1不中和IL-12、IL-12p40、IL-12p80或IL-23與IL-12Rβ1之結合
PMA204及抗體1不中和IL-12及IL-12p80與IL-12Rβ1(SEQ ID NO:14)之結合(圖5)。PMA204或抗體1亦不抑制IL-12p40及IL-23與IL-12Rβ1之結合(圖6)。
2.4抗體1不抑制IL-12/23與以IL-12Rβ1轉染之細胞系之結合
產生過度表現IL-12Rβ1之經穩定轉染的Jurkat細胞系。如流動式細胞量測術所測定，此細胞系對於IL-12Rβ2及IL-23R呈陰性。使用流動式細胞量測術證實IL-12p40、IL-12及IL-23與該細胞系結合。在用IL-12p40、IL-12或IL-23滴定抗體1及抗體202.1之實驗中，抗體202.1展示對細胞介素與IL-12Rβ1 Jurkat細胞系的結合具有可滴定抑制作用(圖7)。相反，抗體1並未顯著中和IL-12、IL-23或單獨IL-12p40鏈與IL-12Rβ1 Jurkat細胞系之結合(圖7)。隨著抗體1濃度增加直至1μg/ml，IL-12及IL-23之平均螢光強度亦增加，這反映抗體-細胞介素-受體複合物形成(圖7)。
2.5抗體1與結合經轉染細胞系上之IL-12Rβ1的IL-12、IL-23形成複合物
抗體1與結合經轉染細胞表面上之IL-12Rβ1的IL-12、IL-23或IL-12p40鏈強烈結合。可以預見，此複合物可能出現於生物系統中且以允許抗體之Fc區與Fc結合受體相互作用之定向呈現抗體。該等受體可能存在於效應細胞上且誘導ADCC及CDC活性，從而對形成有抗體-細胞介素-受體複合物之靶細胞展現細胞毒性作用。相反，抗體202.1展示與細胞介素-受體複合物之結合可以忽略。
實施例3 3.1最佳化抗體1 3.1.1輕鏈中之位置94處之W
如由Yang等人，2007 J Chromatogr A 1156 174-82可見，色胺酸在抗體純化過程期間可能經氧化，從而產生在蛋白質之HPLC分析期間會引起問題之經氧化及未經氧化物質。為避免此問題，在輕鏈中之位置94處用Phe對Trp進行保守性取代。經由基因合成產生此稱作抗體3之抗體，使其表現且在ELISA中進行篩選(圖9)。在SPR篩選中，此抗體比抗體1更快地自IL-12及IL-23解離(表2)。
3.1.2重鏈之位置34處之M
已展示Met在抗體純化及儲存期間可能經氧化。對人類抗體序列之BLAST搜索鑑認出Leu常見於此位置處。進行M34L取代且將構築體稱作抗體4。合成基因，使其表現且使用SPR及ELISA篩選抗體(圖9)。與抗體1相比，抗體4對IL-12及IL-23之親和力存在少量損失(表2)。
3.1.3重鏈之位置95處之半胱胺酸
在抗體1之重鏈中的位置95處觀察到有問題之殘基。此處於CDR3起始位置之半胱胺酸可能經氧化，從而引起任何所得抗體產物之異質性。該殘基亦可能藉由形成二硫鍵而形成複合物。因此，使用基因合成在此位置處用其他18個(例外為原始Cys及Trp)胺基酸中之每一者進行取代，且使抗體短暫表現(抗體5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22)。對此等抗體進行ELISA(圖9)。一些抗體保留對IL-12及IL-23之結合活性，另一些抗體僅保留對一種細胞介素或另一者之結合活性，而其他抗體以最低程度與任一細胞介素結合。對樣本進行SPR且自此數據分析構築體之解離速率。根據此數據，具有C95N取代之抗體7呈現最接近抗體1之親和力的親和力(表2)。
出乎意料地，如由SDS-PAGE可見，此取代顯著改良產物之均質性。抗體7呈現具有一種主要物質之尺寸圖案，該尺寸圖案與對於具有已知分子量之比較抗體所觀察到之尺寸圖案相似(圖10)。與其相比，抗體1呈現兩種主要物質(圖10)。
接著將3種取代組合於單一抗體中，該抗體稱作抗體50，其具有下列重鏈及輕鏈可變區：抗體50VH域(SEQ ID NO:112)
抗體50VL域(SEQ ID NO:169)
如由ELISA、SPR及基於細胞之檢定所量測，此抗體保留對IL-12及IL-23之高親和力(圖11)。
實施例4 4.1PMA204之超人類化(Superhumanization)
根據美國公開案第US 2003/039649號(Foote)及PCT公開案第WO 04/006955號(Foote)中所教示之方法且如Tan等人(2002)及Hwang等人(2005)進一步解釋來進行PMA204之超人類化。
首先，根據美國專利申請案第10/194975號及美國專利第6,881,557號中所教示之方法且如Tan等人(2002. J.Immunol. 169(2):1119-25)、Hwang等人(2005)及本申請案(參見上文)中進一步解釋來確定重鏈及輕鏈CDR的典型結構。該等結構如下：
選擇與PMA204具有相似的典型結構模式之人類生殖系VH區序列(Hwang等人，2005)作為接受體。此等序列為下列生殖系序列(注意：所有生殖系序列皆取自IMGT資料庫，Giudicelli,V.等人，Nucleic Acids Res.,33:D256-D261(2005)；注意：此等生殖系序列中之一些殘基具有高變性且在序列中未列出)：IGHV1-f*01(SEQ ID NO:17)
IGHV1-24*01(SEQ ID NO:18)
IGHV1-18*01(SEQ ID NO:19)
所示生殖系序列(SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19)中之任一者與6個已知的人類生殖系JH序列中之任一者之組合可能提供用於形成人類化重鏈之構架區。
基於初始序列相似性選擇下列JH區序列：
JH3(SEQ ID NO:20)
選擇與PMA204具有相似的典型結構模式之人類生殖系VL區序列(Hwang等人，2005)作為接受體序列。此等序列為下列生殖系序列：IGKV6D-21*01(SEQ ID NO:21)
IGKV3-15*01(SEQ ID NO:22)
IGKV3-11*01(SEQ ID NO:23)
所示生殖系序列(SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23)中之任一者與5種可能的Jκ序列中之任一者之組合可能提供用於形成人類化輕鏈之構架區。基於初始序列相似性選擇下列Jκ區序列：
Jκ4(SEQ ID NO:24)
使接受體之CDR經來自PMA204之相應CDR置換。使用基因合成形成基因，且對超人類化重鏈及輕鏈之不同組合(抗體40、41、42、43、44、45、46、47、48)進行轉染。所有此等表現抗體均保留對IL-12及IL-23之結合活性(圖12)。
已鑑認出PMA204重鏈中之兩種稀有胺基酸。即，位置93處之Ala及位置94處之Asn。將此等胺基酸以回復突變形式引入重鏈超人類化變異體中。使用基因合成形成基因，且對此等經回復突變之超人類化重鏈及超人類化輕鏈之不同組合(抗體31、32、33、34、35、36、37、38、39)進行轉染。一些表現抗體保留對IL-12及IL-23之結合活性，一些抗體僅與一種細胞介素或另一者結合，而其他抗體則展示與任一細胞介素之最小結合(圖12)。
由此等抗體組合可見，若干抗體在ELISA及SPR檢定中呈現與其抗原之強而穩定的結合。選擇三種抗體，即抗體37、39及44。基於使抗體1最佳化，將3種增強抗體1之生物物理特性之點突變(輕鏈W94F、重鏈M34L、重鏈C95N)引入抗體37、39及44中。執行混合最佳化變異體之重鏈及輕鏈的組合方法，從而產生抗體組(抗體76、77、78、79、80、81)。在ELISA中，所有此等抗體皆與IL-12及IL-23結合(圖13)。如經由SPR所量測，抗體80呈現與IL-12之強結合，且選擇抗體80，使用基於NK92細胞之檢定(圖11)及人類PBMCIL-12誘導之IFN-γ檢定(圖17)及鼠類脾細胞檢定(圖14)進行進一步分析。構築抗體80在NK-92檢定中展示對IL-12誘導之IFN-γ分泌的強烈抑制，且在鼠類脾細胞檢定中展示對IL-23誘導之IL-17分泌的強烈抑制。
實施例5 5.1PMA204之人類化
亦使用就線性肽序列而言與原始小鼠抗體之構架序列密切同源之人類構架序列使PMA204人類化。
使用PMA204之重鏈及輕鏈作為查詢序列來進行PBD資料庫(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)之BLAST搜索。
PMA204之重鏈可變區的密切人類同源序列為如下所示之1RZ7HC可變區(SEQ ID NO:25)：
該兩個序列在CDR區外部有31個胺基酸不同。
如下所示之PMA204輕鏈可變區與1RZ7LC可變區(SEQ ID NO:26)之間的輕鏈同源性亦較高：
該兩個序列在CDR區外部有31個胺基酸不同。
使用3D模型化軟體(Accelrys,Modeller)，使用基於初始序列，對PBD資料庫進行BLAST搜索期間所發現之10種最同源抗體作為模板來構建PMA204重鏈及輕鏈之3D模型，且其中各模板抗體具有公開之高解析度晶體結構。比對PMA204與1RZ7之模型，表明該2種抗體之構架之間存在適當匹配(RMSD重鏈=1.53且RMSD輕鏈=0.6)。因此，選擇1RZ7作為接受體構架，將來自PMA204之供體CDR移植至其中，從而產生CDR移植抗體。
對PMA204之模型進行更密切檢查，鑑認出可能影響CDR移植抗體與抗原的結合之關鍵構架殘基。此等殘基如下：
重鏈
ARG40-氫與另一殘基鍵結且使CDR環結構穩定
GLU42-在供體與接受體之間進行比較，存在二級結構差異
LYS66-氫與3個不同殘基鍵結且使CDR環結構穩定輕鏈
LYS49-H與重鏈CDR3殘基鍵結
TYR65-非保守性稀有殘基
ARG85-非保守性稀有殘基
將此等胺基酸各以回復突變形式引入CDR移植抗體中。基於使抗體1最佳化，將3種增強抗體1之生物物理特性之點突變(輕鏈W94F、重鏈M34L、重鏈C95N)引入所有人類化變異體中。
在所有人類化變異體之基因合成後，使直鏈CDR移植抗體鏈及經回復突變之鏈的組合共同表現，從而產生人類化抗體組(抗體51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75)。對此等抗體進行ELISA。所有抗體均保留對IL-12及IL-23之結合活性(圖15、圖16)。如經由SPR所量測，抗體68呈現與IL-23之強結合，且選擇抗體68，使用基於NK92細胞之檢定進行進一步分析(圖11)。抗體68在NK-92檢定中展示對IL-12誘導之IFN-γ分泌的強烈抑制。
為研究其他回復突變是否能增強抗體之親和力及效能，比對抗體68之重鏈可變區與最佳化嵌合抗體(抗體50)之重鏈可變區。在抗體68不同於抗體50之各位置處，將抗體50中處於彼位置之殘基引入抗體68中。基因合成此等變異體，與抗體68輕鏈配對，且使其表現(抗體92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125)。對所有重鏈及輕鏈抗體進行ELISA。一些抗體保留對IL-12及IL-23之結合活性，另一些抗體僅保留對一種細胞介素或另一者之結合活性，而其他抗體未展示與任一細胞介素結合(圖18)。
為研究其他回復突變是否能增強抗體之親和力及效能，比對抗體68之輕鏈可變區與最佳化嵌合抗體50之輕鏈可變區。在抗體68不同於抗體50之各位置處，將抗體50中處於彼位置之殘基引入抗體68中。基因合成此等變異體，與抗體68重鏈配對且使其表現(抗體126、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148)。對所有重鏈及輕鏈抗體進行ELISA。一些抗體保留對IL-12及IL-23之結合活性，而其他抗體未展示與任一細胞介素結合(圖19)。
基於抗體127、130、136、140、146、147及148與IL-12及IL-23之強結合而選擇該等抗體，以在基於細胞之檢定中進行篩選。抗體136呈現對IL-12人類PBMC IL-12誘導之IFN-γ檢定的強烈抑制(圖17)且在鼠類脾細胞檢定中呈現對IL-23誘導之IL-17分泌的強烈抑制(圖14)。
實施例6 6.1抗體80之親和力成熟 6.1.1 　製備用於核糖體呈現之物質
改造抗體80以使其表現為scFv(scFv-80)(SEQ ID NO:27)，且將其次選殖至pEGX448表現載體中。用FLAG標籤使scFv表現以允許親和力純化。接著，使scFv在大腸桿菌中表現且藉由親和層析及凝膠過濾純化。藉由SDS-PAGE及免疫墨點法來證實表現。如SPR所證實，scFv在與親本IgG相似之動力學下保留針對IL-12及IL-23之結合活性。
將scFv-80之編碼序列次選殖至pEGX412突變誘發/核糖體呈現載體中且使用Q-β複製酶將隨機突變引入scFv序列中(Kopsidas等人，2007,BMC Biotechnology,7:18)。使所得編碼突變型scFv-80變異體之DNA構築體池在T7 RNA聚合酶反應中轉錄為單股mRNA，且接著用於進行核糖體呈現。
使市售IL-23製劑結合生物素以用於核糖體呈現實驗中。進行SPR實驗，以證實結合生物素之IL-23與抗生蛋白鏈菌素良好結合且保持在結合親和力之最小損失內與scFv-80結合。
6.1.2使用核糖體呈現來富集IL-23結合變異體
使用試管內表現系統來轉譯編碼scFv-80變異體之mRNA池且使用Kopsidas等人(2007)所述之核糖體呈現方案，在所得scFv文庫中淘選IL-23結合子。調節系統之選擇性壓力以偏向具有低解離常數(kd )之結合子。一旦完成單輪核糖體呈現過程，則藉由PCR來擴增所富集之scFv的編碼序列，且將其次選殖至pEGX448表現載體中。對來自經次選殖的scFv池之20個隨機純系進行定序以證實其身分為scFv-80之變異體。使剩餘純系經受針對IL-23之高通量篩選。
6.1.3對由核糖體呈現回收之scFv-80變異體進行高通量篩選
使自核糖體呈現反應回收之約6500個個別scFv表現，且使用高通量SPR檢定，針對與IL-23之結合進行篩選。根據kd 值對變異體分級且在核酸層面上對最佳變異體定序。此過程鑑認出22種新穎的scFv變異體(表4)，各變異體均展現等於或優於親本scFv-80之IL-23結合親和力(基於kd 值)。
6.1.4獨特scFV-80變異體之完全動力學特性描述
針對結合動力學之完全特性描述來選擇表4中所提供之多種scFV變異體，該完全特性描述涵蓋多種突變特徵及結合親和力。對各scFV進行大規模蛋白質表現。將所表現之scFV純化為單體蛋白質且藉由SPR測試其與IL-12及IL-23之結合(表5)。此等結果證實經由核糖體呈現及篩選所分離之所有變異體均與兩種抗原結合，其中一些變異體與親本scFV-80相比展現至高達5倍之親和力改良。
6.1.5將scFv變異體轉化為IgG形式
藉由將VH 及VL 域次選殖至單獨哺乳動物表現載體中(亦即，一個抗體重鏈構築體，一個輕鏈構築體)來改造在SPR檢定中展示最高結合親和力之3種scFv(AW-F2、CU-A6及CP-A6)，以用於IgG表現。藉由添加人類重鏈Fc區(SEQ ID NO:8)及輕鏈κ恆定區(SEQ ID NO:9)將CU-A6轉化為抗體183，將CP-A6轉化為抗體184且將AW-F2轉化為抗體207。藉由將各抗體之重鏈及輕鏈構築體共轉染至HEK 293E培養物中來表現IgG分子。藉由親和層析及凝膠排斥來純化所表現之IgG，且藉由SPR測試所得單體分子與IL-12及IL-23之結合(表6)。所有3種IgG變異體均在與親本野生型IgG相比kd 值存在顯著改良之情況下保留針對兩種分析物之結合活性。基於此結果，合理預期表4中所述之scFv變異體可能轉化為IgG形式且保留針對IL-12及IL-23之改良結合特徵。
6.1.6經由核糖體呈現及篩選所鑑認之突變的組合
藉由上述各種突變之組合形成一系列其他scFv變異體(表4)。基於a)在篩選操作中所觀察到之次數，b)與突變有關之scFv的親和力對各種突變進行加權，從而產生此等scFv。使用定點突變誘發將權重最高之組合(表7)添加至scFv-80中。接著，使所有此等組合scFv小規模表現且接著使用親和層析及脫鹽管柱使其部分純化。藉由SPR，使用中等通量分析方案在單一分析物濃度下測試各新穎scFv與IL-12及IL-23之結合(表7)。數據展示所有此等變異體皆保持與IL-12或IL-23結合。在大多數狀況下，新穎變異體之解離速率至少等於親本變異體。與親本變異體相比，2種突變組合(VH域中之T28A加上VL域中之S26P，VH域中之F29L加上VL域中之S26P)展示親和力改良。因此，可合理預期帶有表4中所列之新穎突變組合的scFv可以即使不優於亦等同於親本突變體及實際上野生型scFv-80之親和力與IL-12及IL-23結合。
實施例7 7.1使人類化抗體進一步成熟 7.1.1將改良親和力之突變引入抗體136中
基於使抗體80親和力成熟，將重鏈可變區中增強對IL-12及IL-23之親和力的若干關鍵突變(Y59S、Y59H及F29L)引入抗體136中(抗體175、176、177、178、179、180、181、182)。使此等抗體表現，且在ELISA中進行篩選(圖20)。所有抗體均展示與IL-12及IL-23結合。
7.1.2其他抗體組合
將位置93處含有取代(N93A)之抗體80重鏈的親和力成熟變異體與其相應輕鏈配對(抗體199、200、201、202、203、204、205、206)(圖20)。引入此取代以使位置93回復在此位置處最常含有Ala之人類生殖系。亦使含有N93A取代之抗體80重鏈的親和力成熟變異體與抗體136輕鏈一起表現以鑑認較高親和力變異體(抗體190、191、192、193、194、195、196、197、198)(圖20)。
7.2結合親和力量測
使用SPR技術，測定各種人類化抗體之ka 值及kd 值及KD 值。此等親和力列於表8中。在所有狀況下，含有Y59S或Y59H取代(與抗體構架無關)之抗體均呈現對IL-12及IL-23之結合親和力的改良。
實施例8 8.1各種抗體之進一步特性描述 8.1.1競爭實驗-SPR
使用SPR建立競爭檢定，以驗證上文所述之嵌合及人類化抗體維持與PMA204相同之結合特異性。在SPR實驗中，在蛋白質A塗覆之表面上捕捉抗體136，從而增加反應單位(RU)，且接著加載IL-12或IL-23(引起反應單位之再次增加)。接著加載PMA204，且使其不與表面IL-12或IL-23-抗體136複合物結合(圖21)(反應單位未增加)。這指示抗體136以阻止PMA204結合之方式與IL-12及IL-23結合且該兩種抗體共用IL-12及IL-23上之重疊抗原決定基。
在對照實驗中，在蛋白質A塗覆之表面上捕捉抗體136，從而增加反應單位，且加載IL-12或IL-23(引起反應單位之再次增加)。接著加載PMA202且展示反應單位增加，指示與複合物結合。PMA202及抗體1可形成夾有IL-12或IL-23之複合物，從而指示其與IL-12或IL-23在分子之不同位置結合(圖22)。
可預期，使用捕捉抗體、IL-12或IL-23及競爭抗體之其他組合可能進行類似的競爭ELISA。
8.1.2競爭實驗-ELISA
使用ELISA方法建立競爭檢定，以驗證抗體136維持與PMA204相同之結合特異性。當將PMA204塗覆於ELISA板上，接著添加IL-12或IL-23，繼而添加抗體136時，未偵測到抗體136之結合(圖23A)。此結果指示抗體136與PMA204競爭結合IL-12或IL-23。當塗覆對照抗體PMA202且添加抗體136及IL-12p40之預培育混合物時，可偵測到抗體136之結合(圖23B)。此結果指示抗體1不與PMA202競爭結合IL-12。抗體202.1係用作第一實驗之陽性結合對照(圖23A)及第二實驗之陰性對照(圖23B)。
8.1.3受體中和檢定 8.1.3.1　抗體80及抗體136中和IL-12與IL-12Rβ2之結合及IL-23與IL-23R之結合
使用受體中和檢定，證實抗體80及抗體136中和IL-12與IL-12Rβ2之結合(圖24A)及IL-23與IL-23R之結合(圖24B)。對照抗體202.1未呈現對IL-12與IL-12Rβ2之結合或IL-23與IL-23R之結合的抑制。
8.1.3.2　抗體80及抗體136不中和IL-12或IL-23與IL-12Rβ1之結合
抗體80及抗體136不中和IL-12與IL-12Rβ1之結合(圖25A)。IL-23與IL-12Rβ1之結合不受抗體80及抗體136抑制(圖25B)，而是如相較於僅單獨IL-23及受體之情況結合的IL-23有所增加所證實，形成複合物。對照抗體202.1抑制IL-12及IL-23與IL-12Rβ1之結合。
實施例9 9.1改善由皮內IL-23投藥所誘發之皮膚發炎
在觀察到若干前導抗體能夠抑制鼠類脾細胞上IL-23誘導之IL-17釋放(圖26)後，進行其他工作來設計人類IL-23可用作疾病之誘發物的動物模型。用IL-23皮內處理C57B1/6J小鼠之背部歷時6天，誘發特徵在於紅斑及硬結之局部發炎性反應，同時具有表皮增生、角化不全及局部發炎性浸潤之組織學跡象。測試抗體在開始細胞介素處理前一天以單次給藥減輕發炎性反應之能力。自第5天起，與同型對照組相比，接受抗體80及抗體136之兩個組的臨床得分均降低，表明抗體在此研究中之療效(圖27A)。
儘管與同型對照組相比，抗體136展示趨於降低表皮厚度之傾向，但僅抗體80引起表皮厚度之統計學顯著降低(圖27B)。此結果與臨床得分良好相關，其中儘管抗體136及抗體80均顯著減輕由IL-23引起之紅斑及硬結，但抗體80更有效。
實施例10 10.1　中和鼠類脾細胞上嵌合IL-12誘導之IFN-γ
發現人類IL-12對鼠類脾細胞具有較弱之誘導IFN-γ產生之反應性。然而，由人類p40及鼠類p35(SEQ ID NO:63)組成之嵌合分子能夠以與對於鼠類IL-12所觀察到之水平相似之水平誘導鼠類脾細胞之IFN-γ反應。出於抑制嵌合IL-12誘導鼠類脾細胞上之IFN-γ反應的目的，接著向此檢定中添加若干前導抗體(抗體編號：36、80、180、181、193、194、198)。所有抗體均在此檢定中展示中和作用(圖28)。
10.2　中和正常的近親交配小鼠中血清干擾素-γ(IFN-γ)對嵌合IL-12(IL-12)之反應
用0.1mg/kg嵌合IL-12(具有小鼠IL-12 p35鏈(SEQ ID NO:63)之人類IL-12p40鏈)處理C57B1/6J小鼠歷時連續5天，在無明顯毒性之情況下誘發強血清IFN-γ反應。測試抗體以5mg/kg之劑量在細胞介素處理第1天單次給藥或在細胞介素處理的同時隔天3次給藥之情況下中和嵌合IL-12且從而消除IFNγ反應之能力。所測試之兩種抗體均展示中和能力且以5mg/kg進行抗體80之單次給藥足以使血清IFN-γ降低至基線可偵測含量(圖29)。
實施例11 11.1　刺激PBMC產生IL-23：用抗體80進行診斷性偵測
針對IL-12及IL-23之人類化抗體可用作診斷試劑，以偵測生物樣本中之IL-12及IL-23。進行ELISA以偵測重組人類IL-23。在此檢定中，使用抗人類p19抗體作為捕捉抗體且使用抗體80作為偵測抗體。抗體80能夠在此夾心ELISA形式中偵測重組人類IL-23(圖30A)。
用金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowan 1(SAC)進行處理，從而誘導人類周邊血細胞(PBMC)分泌IL-23。抗體80能夠在此夾心ELISA形式中偵測由SAC刺激之PBMC所分泌之內源性天然人類IL-23(圖30B)。
實施例12 12.1　藉由H/D交換進行抗原決定基定位
在第一實驗中，在溶液中使IL-12p40上之氫與氘交換，接著與固定於管柱上之抗體80結合，且接著再交換回H2 O中同時仍與抗體管柱結合，從而使得抗原決定基受到保護。從而，用氘核標記抗原決定基。在第二實驗中，使IL-12p40與抗體管柱結合，接著用氘核標記且接著交換回H2 O中同時仍與管柱結合。各實驗後，使用遞減之低pH值自管柱溶離IL-12p40，且使IL-12p40通過消化蛋白質之胃蛋白酶管柱。接著，將胃蛋白酶片段加載於LC:MS上。兩個實驗之間的氘化程度差異為與抗體結合時交換延遲之量度。
在此研究中，使用如SEQ ID NO:64所給出之IL-12p40。如表9中所示，唯一對H/D交換速率展示顯著干擾之區域係介於胺基酸253至286之間，對應於序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO:65)。
表9：在pH 7及3℃下，結合/解離交換實驗後各IL-12p40區段之氘化程度差異百分比。大於10%之平均差異百分比對應於在交換反應期間受到顯著保護之區域。應注意，殘基編號對應於如SEQ ID NO:64所給出之IL-12p40。
12.2分析突變型IL-23與抗體80之結合
基於H/D交換實驗之結果，將目標突變引入IL-23中之所識別區域中。為進一步減少需要篩選之突變的數目，在此位置比對人類IL-12p40與鼠類IL-12p40(Uni-Prot編號：P43432；http://www.uniprot.org)。
基於觀察到抗體80與人類IL-23而非鼠類IL-23結合，僅選擇兩種物種不同之殘基來進行目標突變。所引入之突變係概述於取自所列的SEQ ID編號之胺基酸253-297之下列比對中。
將各突變體轉染至HEK-293E細胞中，隨後經由SPR針對抗體80來篩選來自此等轉染之上清液。除突變體D265A及R266A之外，所有構築體皆展示與抗體80相似之結合水平。若干突變體之kd 值顯著低於IL-23野生型之kd 值，指示IL-12p40在此區域中之殘基有助於IL-12p40與抗體80相互作用。
在ELISA中進一步分析D265A及R266A，其中將抗體 80、抗體202.1或IL-12Rβ1及IL-23R塗覆至板上且在該板上滴定含有IL-23野生型(IL-23WT)、D265A及R266A之轉染上清液。突變體D265A呈現以本底水平與抗體80結合(圖31)，因此將D265鑑認為IL-12p40上與抗體80結合之重要殘基。D265A以與IL-23野生型可相當之水平結合抗體202.1、IL-12Rβ1及IL-23R，指示其恰當摺疊且能夠進行功能性結合。突變體R266A呈現以低水平與IL-12Rβ1、IL-23R、抗體80及抗體202.1結合，指示該突變型蛋白質存在摺疊異常(圖31)。
抗體列表
方法： 在哺乳動物細胞中形成、分離、表現抗體 產生融合瘤細胞系，表現且純化
各用傳氏完全佐劑(Complete Freund's adjuvant)中之人類IL-12(Peprotech)使5隻BALB/C小鼠免疫，繼而在第14、35及70天用傳氏不完全佐劑中之人類IL-12加強(boost)。第74天，取小鼠脾臟且獲得小鼠脾細胞。使此等細胞與骨髓瘤細胞系SP2/0 Ag-14融合且將細胞存放於96孔組織培養板中。對於96孔板之各孔中之上清液進行抗IL-12、抗IL-12p40及抗IL-23 ELISA(參見下文)。採用對於所有三個ELISA皆測試呈陽性之上清液且藉由限制稀釋法選殖。將在下游ELISA中測試呈陽性之純系培養至500mL規模且進行抗體純化(參見下文)。用1×PBS透析由此方法所純化之抗體且經由BCA檢定套組(Pierce)測定濃度。
DNA定序
使用TRI試劑(Sigma-Aldrich)，根據製造商之方案自融合瘤細胞分離RNA。使用AccuScript高保真度第一股cDNA合成套組(Stratagene)自10ng-200ng RNA合成cDNA，接著在後繼PCR反應中用作模板。將分別用於重鏈及輕鏈之來自Novagen鼠類IgG引子組之引子與cDNA及Pfu II Mastermix(Stratagene)混合在一起，接著根據下列條件在溫度循環器(Thermocyler，Eppendorf Mastercycler)中操作：
PCR產物為凝膠，用DNA凝膠提取套組(QIAgen)純化，經A標記[在72℃下使用dATP及Taq聚合酶(InvitrogenTM )，歷時15分鐘，從而添加A懸垂物至PCR產物中]，將該產物與pGEM-T-載體系統(Promega)接合且轉型至TOP10感受態細胞(InvitrogenTM )中。針對500bp插入片段篩選純系。自陽性純系分離質體(Miniprep,QIAgen)且以習知定序設備定序。接著將核苷酸序列轉譯為第一胺基酸序列。
建構表現嵌合抗體之載體
使來自融合瘤細胞PMA202及PMA204並經由DNA定序確定之VH域與人類恆定區(人類IgG1重鏈CH1、鉸鏈域、CH2及CH3域)一起表現。此操作係藉由以下步驟達成：使胺基酸序列反轉譯為DNA序列，使用GeneOptimizer技術使該等DNA序列最佳化以用於哺乳動物細胞表現，且藉由組裝合成寡核苷酸(GeneArt,Germany)而重新進行合成。基因合成後，將整個序列次選殖至pTT5重鏈載體之多選殖位點中(Durocher等人，2002 Nucleic Acids Res 30 E9)。藉由將序列次選殖至pTT5輕鏈載體之多選殖位點中而使來自融合瘤細胞PMA202及PMA204並藉由DNA定序發現之VL胺基酸鏈與人類κ輕鏈恆定區一起表現。所得PMA202鼠類-人類嵌合抗體被稱作抗體202.1。所得PMA204鼠類-人類嵌合抗體被稱作抗體1。使用此方法產生所有抗體，其中將候選蛋白質序列反轉譯為DNA序列，最佳化且藉由組裝合成寡核苷酸而重新進行合成。所有抗體均含有人類重鏈Fc區及人類輕鏈κ恆定區。接著，將所有編碼抗體可變區之基因選殖至pTT5載體中以供表現。
經由短暫轉染使重組抗體表現
為使所有抗體均短暫表現，使用下列方法。簡言之，在完全細胞生長培養基(1 L F17培養基(InvitrogenTM )、9mL Pluronic F68(InvitrogenTM )、含有2mM麩胺醯胺之20%(w/v)胰化蛋白NI(Organotechnie)及每100mL培養物50μl遺傳黴素(Geneticin)(50mg/mL，InvitrogenTM ))中培養HEK293E細胞。在轉染前一天，藉由離心採集細胞且使細胞再懸浮於新鮮培養基(無遺傳黴素)中。第二天，使重鏈及輕鏈DNA與FuGENE(Roche)轉染試劑混合且逐滴添加DNA轉染混合物至培養物中。在無遺傳黴素之情況下，在37℃、5% CO2 及120rpm下培育培養物隔夜。第二天，每500mL培養物添加12.5mL胰化蛋白以及250μl遺傳黴素。在37℃、5%CO2 及120rpm下培育培養物。7天後，藉由離心取上清液，準備進行純化。
經由親和層析純化抗體
將源自上述轉染之上清液調節至pH 7.4，之後將其加載至HiTrap蛋白質A管柱(5mL，GE Healthcare)上。用50mL 1×PBS(pH 7.4)洗滌管柱。使用0.1M檸檬酸(pH 2.5)進行溶離。使用Zeba脫鹽管柱(Pierce)使所溶離之抗體脫鹽並進入1×PBS(pH 7.4)中。使用SDS-PAGE及凝膠過濾HPLC分析抗體之完整性。使用BCA檢定套組(Pierce)測定抗體濃度。
抗IL-12/23抗體之特性描述 抗IL-12/23 ELISA
在碳酸鹽塗覆緩衝液(35mM碳酸鈉、15mM碳酸氫鈉，pH 9.6)中稀釋IL-12(Peprotech)、IL-23(EbioscienceTM )、IL-12p40(EbioscienceTM )或IL-12p80(Peprotech)至1μg/mL，且在4℃下塗覆於96孔板(NuncTM ,MaxisorpTM )上隔夜。接著，用洗滌緩衝液(0.01M PBS(pH 7.2)、0.05% Tween-20)將板洗滌3次且接著用0.01M PBS(pH 7.2)洗滌3次。接著，藉由向各孔中添加200μl阻斷緩衝液(0.01M PBS(pH 7.2)中之1% w/v BSA)且在25℃下將板培育1小時來阻斷各孔。在抗體稀釋液(0.01M PBS(pH 7.2)中之1% w/v BSA、0.05% Tween-20)中稀釋抗體至足以產生滴定曲線。將各孔與抗體一起在25℃下培育1小時。接著如先前所述洗滌該板。使用以1:2000稀釋至抗體稀釋液中之山羊抗人類免疫球蛋白G(H+L)抗體HRP結合物(Zymed)來偵測所結合之第一抗體。使用以1:2000稀釋至抗體稀釋液中之山羊抗鼠類免疫球蛋白抗體HRP結合物(Dako)來偵測所結合之鼠類抗體。在25℃下培育1小時後，再如先前所述洗滌該板。添加TMB受質溶液(Zymed)至各孔中且使顏色顯現；藉由向各孔中添加1M HCl來終止反應。在450nm下(參照620nm)測定各孔之吸光度。
IL-12/IL-12Rβ1中和檢定
在碳酸鹽塗覆緩衝液中稀釋IL-12Rβ1/Fc嵌合體(R&D Systems)至1pg/mL且添加至96孔板之各孔中，且在4℃下培育隔夜。接著，用洗滌緩衝液將板洗滌3次且接著用0.01M PBS(pH 7.2)洗滌3次。接著，藉由向各孔中添加200μl阻斷緩衝液且在25℃下將板培育1小時來阻斷各孔。在抗體稀釋液中稀釋抗體至足以產生滴定曲線。在抗體稀釋液中稀釋IL-12(Peprotech)至300ng/mL。將IL-12與抗體一起在深孔容器中預培育2小時。接著，如先前所述洗滌該板，且將各孔與抗體/IL-12溶液一起在25℃下培育1小時。接著如先前所述洗滌該板且在25℃下，使用100μl於抗體稀釋液中之0.5μg/mL結合生物素之抗人類IL-12抗體(Peprotech)來偵測結合抗體歷時1小時。如先前所述洗滌該板。使用100μl於抗體稀釋液中(1:1000)之抗生蛋白鏈菌素HRP(Zymed)來偵測所結合之結合生物素抗體。在25℃下培育1小時後，再如先前所述洗滌該板。添加100μl TMB受質溶液(Zymed)至各孔中且使顏色顯現5分鐘。添加100μl之1M HCl來終止顯色反應且在450nm下(參照620nm)測定吸光度。
IL-12p80/IL-12Rβ1中和檢定
如上文關於IL-12/IL-12Rβ1中和檢定所述來進行此檢定，但其中具有下列變化：用IL-12p80(Peprotech)替代IL-12。
IL-12/IL-12Rβ2中和檢定
如上文關於IL-12/IL-12Rβ1中和檢定所述來進行此檢定，但其中具有下列變化：用IL-12Rβ2/Fc嵌合體(R&D Sytsems)替代IL-12Rβ1/Fc嵌合體，且稀釋至5μg/ml而非1μg/ml。用洗滌緩衝液將板洗滌3次而無額外PBS洗滌。用結合生物素之IL-12(Peprotech)替代IL-12(Peprotech)。將各孔與抗體/IL-12溶液一起在25℃下培育2小時。未向各孔中添加結合生物素之抗人類IL-12抗體。由100μl之1:5000抗生蛋白鏈菌素HRP(Sigma-Aldrich)替代100μl之1:1000抗生蛋白鏈菌素HRP(Zymed)。由100μl TMB受質溶液(Sigma-Aldrich)替代100μl TMB受質溶液(Zymed)。
IL-23/IL-23R中和檢定
在碳酸鹽塗覆緩衝液中稀釋IL-23/Fc嵌合體(R＆D Systems)至1μg/mL且添加至96孔板之各孔中，且在4℃下培育隔夜。接著，用洗滌緩衝液將板洗滌3次且接著用0.01M PBS(pH 7.2)洗滌3次。接著，藉由向各孔中添加200μl阻斷緩衝液且將板在25℃下培育1小時來阻斷各孔。在抗體稀釋液中稀釋抗體至足以產生滴定曲線。在抗體稀釋液中稀釋IL-23(EbioscienceTM )至300ng/mL。將IL-23與抗體一起在深孔容器中預培育2小時。接著，如先前所述洗滌該板且將各孔與抗體/IL-23溶液一起在25℃下培育1小時。接著如先前所述洗滌該板且在25℃下，使用100μl於抗體稀釋液中之0.5μg/mL結合生物素的抗人類IL-12抗體(Peprotech)來偵測結合抗體歷時1小時。如先前所述洗滌該板。使用100μl於抗體稀釋液中(1:1000)之抗生蛋白鏈菌素HRP(Zymed)來偵測所結合之結合生物素抗體。在25℃下培育1小時後，再如先前所述洗滌該板。添加100μl TMB受質溶液(Zymed)至各孔中且使顏色顯現5分鐘。添加100μl之1M HCl來終止顯色反應且在450nm下(參照620nm)測定吸光度。
亦如上文關於IL-23/IL-23R中和檢定所述來進行此檢定，但其中具有下列變化：用源自HEK-293E細胞且使用親和層析純化之內部產生的IL-23R-HIS替代IL-23/Fc嵌合體(R&D Systems)。用洗滌緩衝液將板洗滌3次而無額外PBS洗滌。用結合生物素之IL-23(EbioscienceTM )替代IL-23(EbioscienceTM )。在抗體稀釋液中稀釋IL-23至50ng/ml而非300ng/ml。將各孔與抗體/IL-23溶液一起在25℃下培育2小時。未向各孔中添加結合生物素之抗人類IL-12抗體。由100μl之1:5000抗生蛋白鏈菌素HRP(Sigma-Aldrich)替代100μl之1:1000抗生蛋白鏈菌素HRP(Zymed)。由100μl TMB受質溶液(Sigma-Aldrich)替代100μl TMB受質溶液(Zymed)。使顏色顯現15分鐘而非5分鐘。
競爭結合實驗 IL-12/23競爭ELISA
在碳酸鹽塗覆緩衝液(35mM碳酸鈉、15mM碳酸氫鈉，pH 9.6)中稀釋PMA204或PMA202至1μg/mL且在4℃下塗覆至96孔板(NuncTM ,MaxisorpTM )上隔夜。接著，用洗滌緩衝液(0.01M PBS(pH 7.2)、0.05% Tween-20)將板洗滌3次且接著用0.01M PBS(pH 7.2)洗滌3次。接著，藉由向各孔中添加200μl阻斷緩衝液(0.01M PBS(pH 7.2)中之1% w/v BSA)且在25℃下將板培育1小時來阻斷各孔。在抗體稀釋液(0.01M PBS(pH 7.2)中之1% w/v BSA、0.05% Tween-20)中稀釋IL-12(Peprotech)或IL-12(EbioscienceTM )至0.5μg/ml且添加100μl至各孔中，繼而在25℃下培育1小時。接著，如先前所述洗滌該板。對競爭抗體進行連續半對數稀釋且添加100μl至各孔中。最終蛋白質濃度足以產生滴定曲線。將板在25℃下培育1小時且接著如先前所述加以洗滌。使用以1:2000稀釋至抗體稀釋液中之山羊抗人類免疫球蛋白G(Fc特異性)-HRP結合物(Sigma-Aldrich)來偵測所結合之競爭抗體。在25℃下培育1小時後，再如先前所述洗滌該板。對於辣根過氧化酶(HRP)標記之偵測試劑而言，在室溫下用每孔100μl之四甲基聯苯胺(Zymed)受質使酶促反應在暗處顯色。用100μl之1M HCl停止反應且在450nm下(參照620nm)量測光密度。
SPR競爭檢定
使用BIAcore 3000將蛋白質A(Thermo)固定於CM5感應器晶片上。接著，以20μl/min之流速注射HBS-P(GE Healthcare)中之5μg/mL嵌合或人類化抗體歷時1分鐘。接著，以20μl/min之流速注射HBS-P中之5μg/mL IL-12或IL-23至表面上。接著，以20μl/min之流速注射HBS-P中之5μg/mL鼠類抗體。亦進行用HBS-P替代IL-12或IL-23之對照注射及用HBS-P替代鼠類抗體之對照注射。自所有數據中減去對照操作，在對照操作中測試IL-12或IL-23或鼠類抗體與蛋白質A表面之本底結合。
產生表現IL-12Rβ1鏈之經穩定轉染細胞系
將IL-12Rβ1之胺基酸序列反轉譯為DNA序列，使用GeneOptimizer技術使該等DNA序列最佳化以供哺乳動物細胞表現，且藉由組裝合成寡核苷酸(GeneArt,Germany)而重新進行合成。將編碼IL-12Rβ1之DNA序列次選殖至pcDNADEST-40中且接著轉型至Top-10化學感受態大腸桿菌細胞中。使用HiSpeed質體大量提取套組(HiSpeed Plasmid Maxi Kit)(QIAgen)自細胞培養物回收質體DNA，且藉由用ScaI(Promega)限制酶消化使質體DNA線性化。將質體轉染至Jurkat 6E細胞(ATCC)中且藉由用針對IL-12Rβ1之抗受體鏈抗體(R＆D Systems)染色來測定表面表現。
偵測IL-12p40、IL-12及IL-23與表現IL-12Rβ1之細胞系之結合
在37℃下，藉由連續半對數稀釋將濃度介於1000ng/ml至0.01ng/ml範圍內的經FLAG標記之IL-12或經HIS標記之IL-23或IL-12p40與表現IL-12-Rβ1之細胞(106 個/毫升)共同培育2小時。用藻紅素結合之小鼠抗6×HIS標籤抗體(Abcam)或FITC結合之抗FLAG(Sigma-Aldrich)偵測細胞介素與細胞之結合。在Beckman-Coulter Quanta上獲得樣本數據。
偵測對IL-12p40、IL-12及IL-23與表現IL-12Rβ1之細胞系的結合之抑制
在37℃下，將濃度為250mg/ml的經FLAG標記之IL-12或經HIS標記之IL-23或IL-12p40與藉由連續半對數稀釋而使得濃度介於10μg/ml至0.01μg/ml範圍內之抗體共同培育1小時，接著每毫升添加106 個如上文所述之表現IL-12Rβ1之細胞且再培育1小時。在PBS/10% FBS中充分洗滌細胞且用藻紅素結合之小鼠抗6×HIS標籤抗體(Abcam)或FITC結合之抗FLAG抗體(Sigma-Aldrich)偵測與細胞結合之細胞介素。在Beckman-Coulter Quanta上獲得樣本數據。
偵測表現IL-12Rβ1之細胞系表面上之抗體-細胞介素複合物
共同培育濃度為250ng/ml的經FLAG標記之IL-12或經HIS標記之IL-23或IL-12p40與如上文所述之表現IL-12Rβ1之細胞。培育2小時後，添加藉由連續半對數稀釋而使得濃度介於10μg/ml至0.01μg/ml範圍內之抗體且再培育1小時。用PBS/10% FBS充分洗滌細胞且用FITC結合之兔抗人類IgG(Dako)偵測結合與細胞結合之細胞介素的抗體。在Beckman-Coulter Quanta上獲得樣本數據。
親和力成熟 方法 由抗體80V H 及V L 域組裝scFv-80編碼序列
藉由設計包含由序列(Gly4 Ser)3 之15個胺基酸連接子接合之重鏈(VH )可變域及輕鏈(VL )可變域的多肽(scFv-80，SEQ ID NO:27)自抗體80獲得單鏈抗體片段(scFv-80)。VH 及VL 序列位於多肽之N末端及C末端(分別)。接著將胺基酸序列反轉譯為DNA序列，使用GeneOptimizer技術使該DNA序列最佳化以供哺乳動物表現。接著藉由組裝合成寡核苷酸(GeneArt)而重新合成整個基因。最終序列亦包括5'NcoI 及3'NotI 位點以有助於進一步次選殖。
將編碼scFv-80蛋白質之重組基因次選殖至pEGX448表現載體之NcoI 及NotI 位點中。設計pEGX448，使得任何次選殖至NcoI 及NotI 位點中之scFv自動融合C末端之專有『FLAG』親和標籤。
同樣將scFv-80基因次選殖至pEGX412載體中以用於RNA產生、突變誘發及核糖體呈現。除pEGX412使用基因III蛋白質序列而非pEGX253中所用之CL 序列來連接scFv與核糖體之外，此載體與Kopsidas等人(2007)所述之pEGX253質體相同。
RNA產生及突變誘發
使用上文所述之pEGX412-scFv80構築體來產生編碼scFv-80之突變型變異體的RNA池。為達成此目的，用SmaI 使質體線性化且直接用作模板以使用T7 RNA聚合酶套組(Promega)根據製造商之說明書產生單股RNA(ssRNA)。將所得單股RNA分子用作使用Q-β複製酶(EpicentreBiotechnologies)進行易錯複製之模板。為達成此目的，使200ng RNA與33mM Tris-乙酸鹽(pH 7.8)、66mM乙酸鉀、10mM乙酸鎂、0.5mM二硫蘇糖醇(DTT)、5mM rATP、5mM rUTP、10mM rCTP、10mM rGTP、0.1U/μL Q-β複製酶及H2 O混合至20μL最終體積。將反應物在45℃下培育約16小時。
Q-β複製酶反應產生編碼親本scFv-80之突變體池(每個突變體具有1-2個點突變)的雙股RNA(dsRNA)分子之文庫。使用逆轉錄酶PCR(RT-PCR)將dsRNA文庫轉化為DNA片段池。藉由瓊脂糖凝膠電泳及凝膠提取來純化RT-PCR產物，之後形成最終T7 RNA聚合酶反應之模板。藉由瓊脂糖凝膠電泳測試上文所述之所有反應之產物。
自scFv-80變異體之文庫富集IL-23結合子
由pEGX412載體表現上文所述之scFv文庫以產生scFv-核糖體複合物，接著根據Kopsidas等人(2007)所述之核糖體呈現方案針對IL-23對該等複合物進行淘選。簡言之，在冰上以結合生物素之IL-23培育scFv-核糖體複合物(亦包括編碼scFv之ssRNA)至1nM之最終濃度，歷時24小時。接著增加選擇性壓力以使淘選實驗偏向於富集具有低解離常數之IL-23結合子。此操作係藉由添加800倍過量之未結合生物素之IL-23且再繼續淘選反應達5天來達成。用抗生蛋白鏈菌素塗覆之磁性珠粒回收在淘選時期結束時保留與結合生物素之IL-23結合的ScFv-核糖體複合物。接著用含有0.05% Tween 20及5mM MgCl2 之PBS將珠粒洗滌3次且用含有5mM MgCl2 之PBS洗滌2次。最終，自所回收之scFv-核糖體複合物溶離ssRNA且藉由RT-PCR使用Superscript III單步驟RT-PCR系統(InvitrogenTM )根據製造商之說明書，且使用8μL所回收之RNA作為反應模板及下文所列之scFv特異性寡核苷酸引子來擴增所編碼之scFv池。應注意，此等寡核苷酸亦增添5'NcoI 及3'NotI 位點以有助於次選殖。
正向：5'-CCATGGCCCAGGTGCAGCTG-3'
反向：5'-GCGGCCGCTGTCGTACGC-3'
鑑認IL-23結合子之高通量篩選方案
將在核糖體呈現實驗(上文)結束時所擴增之RT-PCR產物池次選殖至pEGX448表現載體之NcoI 及NotI 位點中，轉型至單步驟感受態KRX大腸桿菌(Stratagene)中且在固體培養基上生長。將所得細菌群落個別地接種至96孔板中之200μL液體生長培養物中，使其生長直至600nm下之OD(OD600nm )為0.8且接著用0.5mM異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)誘導蛋白質表現。將200μL表現培養物在20℃下培育隔夜，且接著用於藉由添加40μL溶解緩衝液(2M蔗糖；0.25M Tris，pH 7；0.2M EDTA，pH 8)且以900RPM搖動該板30分鐘來產生粗細菌溶解產物。接著，藉由離心使溶解產物澄清且通過10 000分子量截斷過濾板(Millipore)。使用此方法來製備約6500個scFv樣本，針對IL-23結合使用下文詳述之高通量SPR方案篩選該等樣本。
使用BIAcore A100生物感應器(GE Healthcare)進行高通量SPR篩選。在BIAcore A100生物感應器之4個流量槽中之每一者中，在第1點及第5點(外部點)上，使用標準胺偶合化學將約10 000RU之專有FLAG特異性捕捉分子固定於CM5系列S感應器晶片上，且將3,000RU固定於第2點及第4點(內部點)上。所用之操作緩衝液為HBS-EP+(BIAcore)且在25℃下量測所有相互作用。在操作緩衝液中2倍稀釋經FLAG標記之scFv之粗周質製劑(如先前段落中所述來製備)，之後以5μl/min之流速捕捉60秒。捕捉到約100RU(外部點上)及50RU(內部點上)之經標記scFv。2分鐘穩定期後，使IL-23以30μl/min之流速同時通過所有4個流量槽之所有點，歷時120秒，且監測解離歷時200秒。參照針對各流量槽之未經修飾第3點所產生之感應器圖譜，且使用1:1朗繆方程(Langmuir equation)進行擬合以產生ka 、kd 及KD值(RI設定為局部的以說明變化之配位體密度)。
使用來自SPR篩選過程之數據以選擇潛在改良之結合子。將各個別scFv針對IL-23之kd 與對於各板上所包括之野生型scFv-80對照所記錄之值相比較。將kd 相較於對照具有至少1.5倍改良(亦即降低)之任何scFv變異體指定為潛在改良之結合子。接著對此等變異體中之每一者進行DNA序列分析且採用任何帶有新穎肽基酸序列之scFv以供進一步特性描述。
高度純化之scFv的完全動力學特性描述
此方案係用於對直接自核糖體呈現及篩選實驗所鑑認之scFv變異體進行完全動力學特性描述。首先，將編碼相關scFv之pEGX448構築體轉型至HB2151大腸桿菌中。接著，藉由使500mL培養物生長直至OD600 為0.8，接著用0.5mM IPTG誘導蛋白質表現來使重組scFv表現於細菌周質中。藉由離心採集細胞，且藉由如Minsky等人(1986,Proc. Natl. Acad. Sci.,第83卷,4180-4184)所述之滲透猝震(osmotic shock)來提取周質部分。使用與特異性識別C末端FLAG標籤之抗體結合之1mL瓊脂糖樹脂管柱，自周質部分純化ScFv。將經親和純化之蛋白質濃縮至200μL之最終體積且在於PBS中達到平衡之Superdex 200管柱(GE Healthcare)上進行凝膠過濾層析，且收集對應於單體scFv(約32kDa)之峰值蛋白質溶離份以供進一步特性描述(參見下文)。
使用BIAcore T100生物感應器(GE Healthcare)對經純化之scFv進行完全動力學特性描述。使用標準胺偶合化學，在BIAcore T100生物感應器之流量槽(FC)1及FC2(或者FC3及FC4)中將約10,000RU之專有FLAG特異性捕捉分子固定於CM5系列S感應器晶片上。所用之操作緩衝液為HBS-EP+(BIAcore)且在30℃或35℃下量測相互作用以促進區分具有極相似kd 值之scFv。在操作緩衝液中稀釋峰值純化之經FLAG標記之scFv(如先前段落中所述來製備)至10nM，且在FC2上以10μl/min之流速進行捕捉以捕捉50RU之scFv(典型地，60秒足以捕捉此水平之經標記scFv)。合適穩定期後，使濃度介於81nM至0.13nM(對IL-12使用5倍稀釋)及81nM至1nM(對IL-23使用3倍稀釋)範圍內之靶IL-12或IL-23以60μl/min之流速通過FC1及FC2。結合之接觸時間為180秒且量測解離，對於最高濃度歷時10分鐘且對於系列中之所有其他濃度歷時300秒。自來自FC2之感應器圖譜數據減去來自FC1及僅緩衝液對照之數據。使用1:1朗繆方程擬合曲線以產生ka 、kd 及KD值。
組合經由核糖體呈現及篩選所鑑認之突變
藉由組合經由核糖體呈現及篩選所發現之突變來獲得其他scFv-80變異體。重要的是，注意到此等突變組合並未作為一輪核糖體呈現之結果出現，在一輪核糖體呈現中固有地設定突變誘發水平以形成每個scFv序列1個突變(平均)。代之以藉由設計產生此等組合。根據表11，藉由對各個別突變進行加權來選擇組合。
*報道相對於野生型scFv-80序列之所有突變。加權關鍵
藉由用scFv-80作為模板使用Quikchange Lightning套組(Stratagene)根據製造商之說明書進行定點突變誘發來產生編碼具有權重最高之突變組合之scFv的核苷酸序列。下文列出用於添加各特定突變之突變誘發引子。完全範圍之scFv係列於具有胺基酸序列的交叉對照之表4中。
VH 突變Y59S
意義：5'-gaacggcgataccgagtccgcccccaa-3'
反義：5'-ttgggggcggactcggtatcgccgttc-3'
VH 突變Y59H
意義：5'-cggcgataccgagcacgcccccaagtt-3'
反義：5'-aacttgggggcgtgctcggtatcgccg-3'
VH 突變T28A
意義：5'-ggccagcggctacgccttcaccgacta-3'
反義：5'-tagtcggtgaaggcgtagccgctggcc-3'
VH 突變F29L
意義：5'-gccagcggctacaccctcaccgactactatc-3'
反義：5'-gatagtagtcggtgagggtgtagccgctggc-3'
VL 突變S26P意義：5'-tgtcctgtagagccccccagagcatcagc-3'
反義：5'-gctgatgctctggggggctctacaggaca-3'
VL 突變S52R
意義：5'-gatctacttcgccagacagtccatcagcggc-3'
反義：5'-gccgctgatggactgtctggcgaagtagatc-3'
VL 突變Q27R
意義：5'-cctgtagagcctcccggagcatcagcatcaa-3'
反義：5'-ttgatgctgatgctccgggaggctctacagg-3'
應注意，未設計引子來添加重鏈突變Q43R或輕鏈突變I55T。取而代之，將其他突變直接引入VH 及VL (SEQ ID NO:230及SEQ ID NO:231)中已分別帶有R43及T55之構築體中。
對具有突變組合之scFv進行中等通量之動力學分析
此方案係用於研究帶有突變組合之scFV-80變異體與IL-12及IL-23之結合。使用小規模HB2151大腸桿菌培養物來產生部分純化之scFV以進行中等通量SPR分析(參見下文)。使重組scFV表現於周質中且接著提取，且如上文所述使用抗FLAG抗體-瓊脂糖管柱純化。接著，使用PD10脫鹽管柱(GE Healthcare)將scFv樣本用緩衝液交換至PBS中且濃縮至200μL之最終體積。在無進一步純化之情況下，對此物質進行SPR分析。
除使用81nM之單個雙參考濃度之IL-12或IL-23且量測解離歷時3000秒以外，使用與高度純化之scFv的完全特性描述所用之方法(參見上文)相似之方法來分析此等具有組合重鏈及輕鏈突變之scFv。
IgG之表面電漿共振結合實驗
使用SPR 3000，使用胺偶合將蛋白質A固定於CM5研究級感應器晶片之FC1及FC2(或FC3及FC4)上，得到約2000 RU。FC1在整個實驗期間用作空白。在HBS-P緩衝液中進行實驗(SPR)。使20μl之5μg/mL抗體以20μl/min之流速通過FC2。使濃度介於66nM至2nM範圍內之IL-12、IL-23或IL-12p40(Peprotech)通過FC1及FC2之表面。使用10mM甘胺酸(pH 1.0)進行表面再生。自來自FC2之感應器圖譜數據減去來自FC1及僅緩衝液對照之數據。使用1:1朗繆方程擬合曲線以產生kd 、ka 及KD值。所有曲線皆與可能小於2.0之χ2 擬合。
試管內功效研究 試管內鼠類脾細胞檢定
藉由破裂及通過100μm篩子自小鼠脾臟獲得單細胞懸浮液。藉由水浸法(water method)使紅血球溶解，其中將細胞懸浮液離心且再懸浮於9ml無菌水中。接著立即添加且混入1ml 10×PBS。洗滌細胞且計數，接著以107 個細胞/毫升之濃度再懸浮於RPMI(具有2mM L-麩胺醯胺、100U/ml之青黴素/鏈黴素、10% FBS)中。將細胞以106 個細胞/孔(100μl)塗於96孔平底組織培養板中。添加刀豆球蛋白A及rhIL-23直至最終濃度分別為1μg/ml及25ng/ml。在樣本上滴定測試抗體。典型檢定具有每個測試抗體3-5個生物重複樣本及1-10μg/ml之起始測試抗體濃度。各檢定板含有具有Con A+IL-23而非單獨抗體及Con A之重複樣本。在37℃、5% CO2 下將板培育3天，接著收集上清液以用於IL-17 ELISA。使用IL-17 ELISA套組(R＆D Systems)根據製造商之說明書來檢定IL-17。藉由標準曲線方法來測定濃度。
NK92 IFN-γ釋放檢定
在RPMI1640、2mM L-麩胺醯胺、100U青黴素/鏈黴素、10% FBS中培養NK92細胞(ATCC，CRL-2407)，且補充200U/ml之人類IL-2(Peprotech Asia)及10ng/ml之人類IL-15(EbioscienceTM )。在檢定前使細胞缺乏人類IL-2及人類IL-15。在培養基中稀釋抗體至足以產生滴定曲線。將IL-12(Peprotech)添加至板中且在37℃、5% CO2 下培育2小時。採集細胞且添加至各孔中以得到於200微升/孔之總體積中1×105 個細胞/毫升之細胞濃度。在37℃、5% CO2 下培育培養物24小時。在培育結束時取上清液，且使用Duoset ELISA人類IFN-γ套組(R&D Systems)來偵測所產生之人類IFN-γ。
人類PBMC IL-12誘導之IFN-γ檢定
使用lymphoprep分離液自人類白血球層採集人類PBMC且以1×107 個細胞/毫升在培養基(50% DMEM、50% RPMI、0.045% D(+)葡萄糖、2mM L-麩胺醯胺、5%胎牛血清(FBS)、10mM HEPES)中培養。添加10μg/mL之PHA-P(Sigma-Aldrich)且在37℃、5% CO2 下培育3天。接著添加50U/mL之人類IL-2(R&D Systems)。在37℃、5%CO2 下將培養物培育1天。在96孔板上之培養基中稀釋抗體至足以產生涵蓋10μg/mL至0.001μg/mL之範圍的滴定曲線。將1ng/mL之人類IL-12(Peprotech)添加至板中且在37℃、5% CO2 下培育2小時。添加1ng/mL之hIL-2(R&D Systems)至各孔中。採集細胞且添加至各孔中以得到於200微升/孔之總體積中2×105 個細胞/毫升之細胞濃度。在37℃、5% CO2 下將培養物培育2天。在培育結束時取上清液，且使用Duoset ELISA人類IFN-γ套組(R&D Systems)來偵測所產生之人類IFN-γ。
改善由皮內IL-23投藥所誘發之皮膚發炎 前期範圍確定及動力學研究
在開始注射前2天，對雄性C57B1/6J小鼠之背部測試區域進行脫毛，接著每天在背部之2個位置上給予PBS或rhIL-23之皮內注射，總共每天每隻小鼠3μg或10μg。兩種方案產生一些發炎適應症，但每天10μg之劑量產生具有高水平紅斑之強烈反應。在隨後研究中，每天給予小鼠10μg rhIL-23，歷時總共10天以確定發炎性反應之完全動力學。自處理第3天起，反應為可偵測的，在第6-7天達到峰值，接著開始消散。
活體內抗體測試
如上文所述，用每天10微克之rhIL-23處理雄性C57B1/6J小鼠，歷時6天。在開始細胞介素注射前一天，給予小鼠10mg/kg劑量之抗體80、抗體136或同型對照抗體之單次腹膜內注射。每天對小鼠測試區域中之紅斑及硬結計分。在不知情之情況下進行所有處理及觀察。在研究結束時，自各小鼠採集皮膚樣本且固定以根據標準方案進行組織學處理及蘇木精及伊紅(H&E)染色。
藉由複製各小鼠皮膚切片之較低功率影像之紙複本來測定表皮厚度值。藉由使用3條垂直線將各影像上之皮膚切片分成4個象限。接著在用於劃分象限之3條線之相交點處量測表皮厚度，亦即，每張照片3次厚度測量。接著使用各影像上之比例將以mm計之實際距離轉化為以微米計。在量測點橫穿被視為不表示表皮厚度之區域(諸如毛囊或汗腺)之彼等情況下，將量測點位置調整至相鄰皮膚切片。由兩名獨立觀察者在不知情之情況下進行量測。
中和正常近親交配小鼠中血清干擾素-γ(IFNγ)對嵌合IL-12(IL-12)之反應嵌合IL-12
產生含有人類IL-12p40及鼠類IL-12p35(SEQ ID NO:63)之嵌合IL-12。將蛋白質反轉譯為基因序列，最佳化，合成且次選殖至pTT5載體中。使嵌合IL-12在HEK-293E細胞中表現且經由HIS標籤親和純化管柱純化。在試管內測試小鼠T細胞對嵌合IL-12之反應性。在補充有2mML-麩胺醯胺及10%胎牛血清加上嵌合、重組小鼠或重組人類IL-12(0-20ng/ml)之RPMI中培養小鼠脾細胞(107 個/毫升)隔夜。收集上清液，且藉由酶聯免疫吸附檢定(ELISA)使用IFN-γ ELISA套組(R&D systems)根據製造商之說明書來檢定IFN-γ。嵌合IL-12能夠在各種濃度下誘導小鼠脾細胞分泌IFN-γ。除所測試之最高濃度之外，人類IL-12不具活性。
抗體抑制嵌合IL-12誘導鼠類脾細胞釋放IFN-γ
藉由破裂及通過100μm篩子自小鼠脾臟獲得單細胞懸浮液。藉由水浸法使紅血球溶解，其中將細胞懸浮液離心且再懸浮於9ml無菌水中，立即添加且混入1ml之10×PBS。洗滌細胞且計數，接著以5×106 個/毫升之濃度再懸浮於RPMI+2mM 1-麩胺醯胺+100U/ml之青黴素/鏈黴素+10% FBS中。
將細胞以5×105 個細胞/孔(100μl)塗於96孔平底組織培養板中。添加刀豆球蛋白A及嵌合IL-12直至最終濃度分別為0.5μg/ml及20ng/ml。在樣本上滴定測試抗體。典型檢定應具有每個測試抗體3-5個生物重複樣本及1-10μg/ml之起始測試抗體濃度。各檢定板應含有具有Con A+IL-12而非單獨抗體及ConA之重複樣本。在37℃、5%CO2 下將板培育24小時，接著收集上清液以用於IFN-γELISA。使用IFN-γ ELISA套組(R&D systems)根據製造商之說明書來檢定IFN-γ。藉由標準曲線方法測定濃度。若本底IFN-γ產生(如由僅ConA之樣本所測定)較高，則自經IL-12處理之樣本值減去此本底以使IFN-γ濃度直接歸於IL-12。
前期範圍確定研究
藉由腹膜內注射PBS、0.03mg/kg小鼠IL-12(IL-12)或0.03mg/kg、0.1mg/kg或0.3mg/kg之嵌合IL-12來處理雄性C57B1/6J小鼠，歷時5天。在第6天，採集末梢血液樣本以產生血清。使用高靈敏度IFN-γ ELISA套組(EbioscienceTM )根據製造商之說明書來測定血清中之IFN-γ濃度。
在經PBS處理之小鼠中未偵測到IFN-γ，但在所有經小鼠或嵌合IL-12處理之組中均偵測到IFN-γ。嵌合IL-12處理引起對血清IFN-γ之強劑量依賴性誘導。選擇0.1mg/kg作為量測血清IFN-γ反應變化之理想劑量。
活體內測試抗體
藉由腹膜內注射0.1mg/kg之嵌合IL-12來處理雄性C57B1/6J小鼠，歷時5天。在細胞介素注射之第1天，在用嵌合IL-12給藥前30分鐘，用5mg/kg之抗體80或抗體136之單次給藥處理小鼠，或在細胞介素注射之第1、3及5天，在用嵌合IL-12給藥前30分鐘，經抗體80、抗體136或同型對照之三次給藥處理小鼠。在第6天，採集末梢血液樣本，且如上文所述測定血清IFN-γ。
刺激PBMC產生IL-23：用抗體80進行診斷性偵測ELISA開發
在4℃下用PBS中之0.5μg/ml小鼠抗人類IL-23p19(EbioscienceTM )塗覆96孔平底ELISA板(Nunc Maxisorp)隔夜。洗滌板(所有洗滌皆進行3次)，接著用PBS/10% FBS阻斷1小時。洗滌板，接著添加藉由半對數稀釋而使得濃度介於1000ng/ml與0.003ng/ml之間的重組IL-23。將板在室溫下培育2小時。洗滌板，接著用0.5μg/ml之抗體80偵測細胞介素。再將板在室溫下培育2小時，洗滌，接著添加結合辣根過氧化酶之小鼠吸附性抗人類IgG(InvitrogenTM )。再培育30分鐘後，將板洗滌6次，添加TMB受質(Sigma-Aldrich)，且使顏色顯現5-10分鐘。用1M HCl停止反應且讀取板在450nm下之吸光度。使用BiotekELx405板式洗滌器在PBS+0.1% Tween中進行所有洗滌。
刺激人類PBMC產生IL-23
藉由經Lymphoprep梯度(Axis-shield)離心自單個白血球層獲得PBMC。將其以105 個/孔塗於96孔平底板中。如下製備金黃色葡萄球菌Cowan 1(SAC)(Sigma-Aldrich)：自10% w/v之儲備溶液移出合適體積且離心成細胞小球。將此等細胞小球在X-Vivo 15培養基(BiowhittakerTM )中洗滌2次，接著以用於滴定之起始濃度再懸浮。將以連續半對數稀釋而使得濃度介於1% w/v與0.0001% w/v之間的SAC添加至PBMC中。將板培育72小時，接著收集上清液以用於ELISA。如上文所述進行ELISA以偵測IL-23。
H/D交換實驗
使用PBS中之1mg/mL IL-12p40。使用PBS中之2.0mg/mL抗體80。根據製造商之說明書將抗體與POROS AL樹脂(Applied Biosystems)偶合。用600μL抗體80-POROS AL樹脂填充mab管柱且儲存於4℃下。
用87.5% D2 O中之PBS洗滌管柱。將5μL之1mg/mL IL-12p40與100% D2 O中之35μL冰冷卻之PBS緩衝液(pH 7.0)混合。將IL-12p40混合物培育500秒、1500秒、5000秒(以單獨操作)，之後注射至抗體管柱上。用200μL冷卻之PBS(具有H2 O)洗滌管柱。使管柱在3℃下靜置250秒、750秒或2500秒(以單獨操作)。將80μL冷卻之0.8%甲酸注射至管柱上。使用另外40μL冷卻之0.8%甲酸自抗體管柱溶離抗原。收集此40μL樣本且向其中添加20μL冷卻之2M脲、1M TCEP(pH 3.0)。接著將50μL注射至含有胃蛋白酶之管柱上以將蛋白質消化成肽，藉由rpHPLC使用13%-40%梯度之溶離緩衝液(95%乙腈、5%水、0.0025% TFA)經23分鐘分離該等肽。藉由質譜分析以MS1：輪廓及MS2:DDA模式分析溶離液。使用SEQUEST軟體程式(Thermo)來鑑認親本肽離子之序列。
基本上與上文所述相同地進行抗體對IL-12p40之不同部分之交換速率的影響，其中具有下列例外：用35μL於H2 O中之冰冷卻PBS緩衝液(pH 7.0)稀釋5μL IL-12p40，接著注射至已用H2 O中之PBS製備之管柱上。結合後，用100μL於H2 O中之PBS洗滌管柱。藉由使200μL於87.5% D2 O中之PBS(pH 7.0)通過管柱來起始結合-交換反應。在3℃下培育管柱，歷時500秒、1500秒及5000秒(以單獨操作)。
形成突變型IL-23構築體
合成編碼野生型IL-23之基因，該野生型IL-23含有亞單位之間的連接子及C末端FLAG標籤。分析IL-23(例如3D85)之X射線晶體結構後，選擇具有暴露側鏈之胺基酸突變為ala殘基。使用定點突變誘發對野生型IL-23基因進行此操作。將所有基因選殖至pTT5載體中。
轉染突變型IL-23構築體
在具有遺傳黴素(InvitrogenTM )之F17培養基(InvitrogenTM )中培養HEK293E細胞，且在無遺傳黴素之情況下以1×106 個細胞/毫升轉染。對於各構築體而言，產生5ml轉染培養物。使用OptiMEMI(InvitrogenTM )及FugeneHD轉染試劑(Roche)轉染7.5μg DNA。在轉染後第一天將胰化蛋白(BD)及遺傳黴素添加至培養物中。使培養物生長6天，且取上清液且過濾以供分析。
ELISA篩選突變型IL-23構築體
在碳酸鹽塗覆緩衝液中稀釋IL 12Rβ1/Fc嵌合體(R&DSystems)、IL-23/Fc嵌合體(R＆D Systems)、抗體202.1及抗體80至1μg/mL且添加至96孔板之各孔中，且在4℃下培育隔夜。接著用洗滌緩衝液將板洗滌3次。藉由向各孔中添加200μl阻斷緩衝液且將板在25℃下培育1小時來阻斷各孔。在抗體稀釋液中稀釋上清液至足以產生滴定曲線，且將100μl添加至各孔中，接著在25℃下培育1小時。接著如先前所述洗滌該板，且使用100μl於抗體稀釋液中(1:1000)之單株抗FLAGM2-HRP(Sigma-Aldrich)來偵測所結合之細胞介素。在25℃下培育1小時後，再如先前所述洗滌該板。將100μl TMB受質溶液(Sigma-Aldrich)添加至各孔中且使顏色顯現5分鐘。添加100μl之1M HCL來終止顯色反應且在450nm下(參照620nm)測定吸光度。
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圖1：不同類別之抗IL-12/23抗體。圖1.1)與IL-12、IL-23、IL-12p40及IL-12p80之p40亞單位結合之抗體；圖1.2)與IL-12之p35亞單位結合之抗體；圖1.3)與呈異元二聚體形式之IL-12的p35及p40亞單位結合之抗體；圖1.4)與IL-23之p19亞單位結合之抗體；圖1.5)與IL-23、IL-12p40及IL-12p80而非IL-12中存在之p40結合之抗體。
圖2:IL-12/23受體相互作用。IL-12與IL-12Rβ1及IL-12Rβ2結合。IL-23與IL-12Rβ1及IL-23R結合。IL-12p40與IL-12Rβ1結合。IL-12p80與IL-12Rβ1結合。圖2.1)IL-12及IL-23之亞單位。圖2.2)抑制IL-12與IL-12Rβ2之結合之抗體。圖2.3)抑制IL-12與IL-12Rβ2之結合及IL-23與IL-23R之結合的抗體。
圖3：如藉由ELISA所量測，PMA204及抗體1以劑量依賴方式與IL-12(A)、IL-23(B)、IL-12p40(C)及IL-12p80(D)結合。
圖4:PMA204及抗體1中和IL-12與IL-12Rβ2之結合(A)及IL-23與IL-23R之結合(B)。
圖5:PMA204及抗體1不抑制IL-12與IL-12Rβ1之結合(A)且不抑制IL-12p80與12Rβ1之結合(B)。
圖6:PMA204及抗體1不抑制IL-12p40與IL-12Rβ1之結合(A)且不抑制IL-23與IL-12Rβ1之結合(B)。
圖7：抗體1不抑制IL-12p40(A)、IL-12(B)、IL-23(C)與以IL-12Rβ1穩定轉染之Jurkat細胞系的結合。陽性對照抗體202.1以劑量依賴方式抑制IL-12p40、IL-12及IL-23與此細胞系之結合。
圖8：抗體1與結合至以IL-12Rβ1穩定轉染之Jurkat細胞系的IL-12p40(A)、IL-12(B)及IL-23(C)結合，從而形成複合物。陽性對照抗體202.1不能形成此類複合物。
圖9：展示各種抗體與IL-12及IL-23的結合之ELISA數據。
圖10：抗體1、3、4、7及比較抗體之SDS-PAGE凝膠，其表現不同條帶圖案。
圖11：PMA204、抗體1、抗體50、抗體68及抗體80展示對IL-12誘導NK-92細胞釋放IFN-γ之抑制。
圖12：展示各種抗體與IL-12及IL-23的結合之ELISA數據。
圖13：展示各種抗體與IL-12及IL-23的結合之ELISA數據。
圖14：抗體80及抗體136展示對IL-23誘導鼠類脾細胞分泌IL-17之抑制。
圖15：展示各種抗體與IL-12及IL-23的結合之ELISA數據。
圖16：展示各種抗體與IL-12及IL-23的結合之ELISA數據。
圖17：抗體80及抗體136展示對IL-12誘導人類PBMC釋放IFN-γ之抑制。
圖18：展示各種抗體與IL-12及IL-23的結合之ELISA數據。
圖19：展示各種抗體與IL-12及IL-23的結合之ELISA數據。
圖20：展示各種抗體與IL-12及IL-23的結合之ELISA數據。
圖21：證實抗體136與PMA204競爭結合IL-12(A)及IL-23(B)之競爭SPR實驗。
圖22：證實抗體136不與PMA202競爭結合IL-12(A)及IL-23(B)之競爭SPR實驗。
圖23：證實PMA204不與抗體202.1競爭結合IL-12或IL-23之競爭ELISA實驗。PMA204與抗體136競爭結合IL-12及IL-23。
圖24：抗體80及抗體136中和IL-12與IL-12Rβ2之結合(A)及IL-23與IL-23R之結合(B)，相較之下，抗體202.1在所測試抗體之最高濃度下不展示抑制作用。
圖25：PMA204及抗體1不中和IL-12與IL-12Rβ1之結合(A)及IL-23與IL-12Rβ1之結合(B)。抗體202.1呈現對IL-12與IL-12Rβ1之結合(A)及IL-23與IL-12Rβ1之結合(B)的劑量依賴性抑制。
圖26：各種人類化及親和力成熟抗體抑制IL-23誘導鼠類脾細胞釋放IL-17。所展示者為基於抗體80(A)及基於抗體136(B)之兩組親和力成熟人類化前導抗體(lead antibody)。
圖27：在對小鼠皮內投予IL-23歷時6天後，小鼠形成類似於牛皮癬之皮膚發炎。A)投予同型對照未防止皮膚發炎，然而，如較低臨床評分所證實，抗體80及抗體136在此模型中減輕發炎。B)在組織學層面上，在經6天皮內投予IL-23後出現表皮增厚。用抗體80及抗體136處理改善此表皮增厚，但用同型對照抗體處理則無此作用。
圖28：各種人類化及親和力成熟抗體抑制嵌合IL-12誘導鼠類脾細胞釋放IFN-γ。所展示者為基於抗體80(A)及基於抗體136(B)之兩組親和力成熟人類化前導抗體。
圖29：給予嵌合IL-12反覆注射之小鼠的IFN-γ血清含量升高。相對於用同型對照抗體處理而言，當用抗體80或抗體136處理時，血清IFN-γ含量降低。
圖30：(A)抗體80能夠在夾心ELISA中偵測重組IL-23。(B)抗體80能夠在夾心ELISA中偵測由SAC刺激之PBMC所產生之天然產生IL-23。
圖31：藉由ELISA發現，抗體80與IL-23WT蛋白強烈結合，但與IL-23突變體D265A及R266A之結合降低。

Claims (26)

  1. 一種抗體，其包含與人類IL-12及人類IL-23結合之抗原結合域，其中該抗體包含具有以下序列的重鏈CDR1、CDR2及CDR3：HCDR1 DYYX1 H，其中X1 =L；HCDR2 WIDPENGDTEX2 APKFQG，其中X2 =Y、H、或S；HCDR3 X3 KELRYFDV，其中X3 =N及具有以下序列的輕鏈CDR1、CDR2及CDR3：LCDR1 RAX4 X5 SISINLH，其中X4 =S，且X5 =Q；LCDR2 FAX6 QSX7 S，其中X6 =S，且X7 =I；LCDR3 QQSNSX8 PLT，其中X8 =F。
  2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體進一步包含選自由SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：204與SEQ ID NO：207所組成之群組的人類重鏈接受體構架序列。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體進一步包含選自由SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：212與SEQ ID NO：215所組成之群組的人類輕鏈接受體構架序列。
  4. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體進一步包含抗體人類接受體構架，該抗體人類接受體構架包含至少一個在關鍵殘基的構架區胺基酸取代，該關鍵殘基係選自由以下者所組成之群組：與CDR相鄰之殘基、糖基化位點殘基、稀有殘基、能與人類IL-12之p40亞單位相互作用之殘基、能與CDR相互作用之殘基、典型殘基(canonical residue)、介於重鏈可變區與輕鏈可變區之間的接觸殘基、微調區(Vernier zone)中之殘基及在Chothia定義之VH域CDR1與Kabat定義之第一重鏈構架之間重疊的區域中之殘基。
  5. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體進一步包含抗體人類接受體構架，該抗體人類接受體構架包含至少一個構架區胺基酸取代，其中該構架之胺基酸序列與該人類接受體構架之序列至少65%一致且包含至少70個與該人類接受體構架一致之胺基酸殘基。
  6. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體包含選自由以下者所組成之群組的免疫球蛋白重鏈可變區：SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：162與SEQ ID NO：112。
  7. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體包含選自由以下者所組成之群組的免疫球蛋白輕鏈可變區：SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：189與SEQ ID NO：179。
  8. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體包含兩個免疫球蛋白可變區，其中該兩個免疫球蛋白可變區係選自由以下者所組成之群組：SEQ ID NO：119 & SEQ ID NO：179 SEQ ID NO：112 & SEQ ID NO：169 SEQ ID NO：115 & SEQ ID NO：189 SEQ ID NO：158 & SEQ ID NO：189 SEQ ID NO：159 & SEQ ID NO：189 SEQ ID NO：162 & SEQ ID NO：189。
  9. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體與以單體形式(人類IL-12p40)及以同元二聚體形式(人類IL-12p80)存在之人類IL-12p40結合且其中該抗體抑制人類IL-12與人類IL-12Rβ2之結合及人類IL-23與人類IL-23R之結合，但不抑制人類IL-12或人類IL-23或人類IL-12p40或人類IL-12p80與人類IL-12Rβ1之結合。
  10. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體與包含具有SEQ ID NO：6序列之重鏈可變區的抗體競爭結合人類IL-12及/或人類IL-23。
  11. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體與包含具有SEQ ID NO：7序列之輕鏈可變區的抗體競爭結合人類IL-12及/或人類IL-23。
  12. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體與具有序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV (SEQ ID NO：65)之人類IL-12p40之部分結合。
  13. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體與人類IL-12p40(SEQ ID NO：1)在Asp 265處特異性結合。
  14. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體與人類IL-23(SEQ ID NO：66)結合之水平係大於該抗體與突變型IL-23 D265A(SEQ ID NO：75)結合之水平。
  15. 如申請專利範圍第14項之抗體，其中該抗體與以單體形式(人類IL-12p40)及以同元二聚體形式(人類IL-12p80)存在之人類IL-12p40結合且其中該抗體抑制人類IL-12與人類IL-12Rβ2之結合及人類IL-23與人類IL-23R之結合，但不抑制人類IL-12或人類IL-23或人類IL-12p40或人類IL-12p80與人類IL-12Rβ1之結合。
  16. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體包含選自由IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE及IgA所組成之群組的人類或非人類靈長類動物重鏈免疫球蛋白恆定區。
  17. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體包含選自由κ或λ所組成之群組的人類或非人類靈長類動物輕鏈免疫球蛋白恆定區。
  18. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體係藉由共價連接有機部分來進行修飾。
  19. 如申請專利範圍第18項之抗體，其中該有機部分為直鏈或支鏈親水性聚合基團、脂肪酸基團、或脂肪酸酯基團。
  20. 如申請專利範圍第1或2項之抗體，其中該抗體經修飾以調節選自由以下者所組成之群組的功能特徵：抗體依賴性細胞毒性、補體依賴性細胞毒性、血清半生期、生物分布及與Fc受體之結合。
  21. 如申請專利範圍第20項之抗體，其中該修飾係藉由蛋白質工程改造、糖工程改造(glycoengineering)或化學方法。
  22. 一種核酸分子，其中該核酸編碼如申請專利範圍第1至8項中任一項所定義之抗體之VH域。
  23. 如申請專利範圍第22項之核酸分子，其中該核酸具有選自SEQ ID NO：279、SEQ ID NO：282、SEQ ID NO：286、SEQ ID NO：325、SEQ ID NO：326、SEQ ID NO：329、SEQ ID NO：338與SEQ ID NO：358之序列。
  24. 一種核酸分子，其中該核酸編碼如申請專利範圍第1至8項中任一項所定義之抗體之VL域。
  25. 如申請專利範圍第24項之核酸分子，其中該核酸具有選自SEQ ID NO：338、SEQ ID NO：348與SEQ ID NO：358之序列。
  26. 一種如申請專利範圍第1至21項中任一項之抗體的用途，其係用於製備供治療皮膚發炎之醫藥品。
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