JP5623401B2 - 抗il−12/il−23抗体 - Google Patents
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Description
本出願は、これらの出願の各々の内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、2008年8月14日に出願されたオーストラリア特許出願第2008904178号、および2008年8月14日に出願された米国特許出願第61/089028号による優先権と関連し、これを主張するものである。
本発明は、ヒトIL-12およびIL-23に結合する抗体に関する。
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
に与えられる配列を有する抗体またはその変異体を提供する。
CDRHC1: DYYX1H
[式中、X1=MまたはL];
CDRHC2: WIDPENGDTEX2APKFQG
[式中、X2=Y、H、またはS];
CDRHC3: X3KELRYFDV
[式中、X3=C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P、またはV]
から選択される3つの重鎖CDR配列を含む抗体を提供する。
CDRLC1: RAX4X5SISINLH
[式中、X4=SまたはP;
X5=QまたはR];
CDRLC2: FAX6QSX7S
[式中、X6=SまたはR;
X7=IまたはT];
CDRLC3: QQSNSX8PLT
[式中、X8=WまたはF]
から選択される3つの軽鎖CDR配列を含む抗体を提供する。
CDRHC1: DYYX1H
[式中、X1=MまたはL];
CDRHC2: WIDPENGDTEX2APKFQG
[式中、X2=Y、H、またはS];
CDRHC3: X3KELRYFDV
[式中、X3=C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P、またはV]
から選択される3つの重鎖CDR配列と;
CDRLC1: RAX4X5SISINLH
[式中、X4=SまたはP;
X5=QまたはR];
CDRLC2: FAX6QSX7S
[式中、X6=SまたはR;
X7=IまたはT];
CDRLC3: QQSNSX8PLT
[式中、X8=WまたはF]
から選択される3つの軽鎖CDR配列と
を含む抗体を提供する。
配列番号6、配列番号62、配列番号114、配列番号142、配列番号28、配列番号87、配列番号115、配列番号143、配列番号29、配列番号88、配列番号116、配列番号144、配列番号30、配列番号90、配列番号117、配列番号145、配列番号31、配列番号91、配列番号118、配列番号146、配列番号33、配列番号92、配列番号119、配列番号147、配列番号34、配列番号93、配列番号120、配列番号148、配列番号35、配列番号94、配列番号122、配列番号149、配列番号36、配列番号95、配列番号124、配列番号150、配列番号38、配列番号96、配列番号125、配列番号151、配列番号39、配列番号97、配列番号126、配列番号152、配列番号40、配列番号99、配列番号127、配列番号153、配列番号41、配列番号100、配列番号128、配列番号154、配列番号42、配列番号101、配列番号129、配列番号155、配列番号43、配列番号102、配列番号130、配列番号156、配列番号44、配列番号103、配列番号131、配列番号157、配列番号45、配列番号104、配列番号132、配列番号158、配列番号53、配列番号105、配列番号133、配列番号159、配列番号54、配列番号106、配列番号134、配列番号160、配列番号55、配列番号107、配列番号135、配列番号161、配列番号56、配列番号108、配列番号136、配列番号162、配列番号57、配列番号109、配列番号137、配列番号163、配列番号58、配列番号110、配列番号138、配列番号164、配列番号59、配列番号111、配列番号139、配列番号165、配列番号60、配列番号112、配列番号140、配列番号166、配列番号61、配列番号113、配列番号141および配列番号167
のうちの1つからなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
配列番号7、配列番号169、配列番号181、配列番号193、配列番号32、配列番号170、配列番号182、配列番号194、配列番号37、配列番号171、配列番号183、配列番号195、配列番号42、配列番号172、配列番号184、配列番号196、配列番号46、配列番号173、配列番号185、配列番号197、配列番号47、配列番号174、配列番号186、配列番号198、配列番号48、配列番号175、配列番号187、配列番号199、配列番号49、配列番号176、配列番号188、配列番号200、配列番号50、配列番号177、配列番号189、配列番号201、配列番号51、配列番号178、配列番号190、配列番号52、配列番号179および配列番号192
のうちの1つからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
配列番号6&配列番号7 配列番号115&配列番号190
配列番号6&配列番号169 配列番号115&配列番号192
配列番号28&配列番号179 配列番号115&配列番号193
配列番号29&配列番号179 配列番号115&配列番号194
配列番号30&配列番号179 配列番号115&配列番号195
配列番号31&配列番号32 配列番号115&配列番号196
配列番号33&配列番号179 配列番号115&配列番号197
配列番号34&配列番号51 配列番号115&配列番号198
配列番号34&配列番号47 配列番号115&配列番号199
配列番号35&配列番号179 配列番号115&配列番号200
配列番号36&配列番号37 配列番号115&配列番号201
配列番号38&配列番号179 配列番号116&配列番号173
配列番号38&配列番号51 配列番号116&配列番号174
配列番号38&配列番号32 配列番号116&配列番号175
配列番号38&配列番号47 配列番号116&配列番号176
配列番号38&配列番号52 配列番号116&配列番号177
配列番号39&配列番号179 配列番号117&配列番号173
配列番号40&配列番号179 配列番号117&配列番号174
配列番号41&配列番号42 配列番号117&配列番号175
配列番号43&配列番号179 配列番号117&配列番号176
配列番号44&配列番号179 配列番号117&配列番号177
配列番号44&配列番号51 配列番号118&配列番号178
配列番号44&配列番号32 配列番号118&配列番号179
配列番号44&配列番号47 配列番号119&配列番号178
配列番号44&配列番号52 配列番号119&配列番号179
配列番号45&配列番号179 配列番号119&配列番号51
配列番号45&配列番号179 配列番号119&配列番号189
配列番号53&配列番号41 配列番号119&配列番号46
配列番号54&配列番号179 配列番号119&配列番号47
配列番号55&配列番号179 配列番号119&配列番号48
配列番号56&配列番号179 配列番号119&配列番号49
配列番号57&配列番号179 配列番号119&配列番号50
配列番号58&配列番号42 配列番号119&配列番号51
配列番号59&配列番号179 配列番号119&配列番号52
配列番号60&配列番号179 配列番号120&配列番号178
配列番号61&配列番号42 配列番号120&配列番号179
配列番号62&配列番号42 配列番号122&配列番号176
配列番号87&配列番号7 配列番号124&配列番号176
配列番号88&配列番号7 配列番号125&配列番号176
配列番号90&配列番号7 配列番号126&配列番号176
配列番号91&配列番号7 配列番号127&配列番号176
配列番号92&配列番号7 配列番号128&配列番号176
配列番号93&配列番号7 配列番号129&配列番号176
配列番号94&配列番号7 配列番号130&配列番号176
配列番号95&配列番号7 配列番号131&配列番号176
配列番号96&配列番号7 配列番号132&配列番号176
配列番号97&配列番号7 配列番号133&配列番号176
配列番号99&配列番号7 配列番号134&配列番号176
配列番号100&配列番号7 配列番号135&配列番号176
配列番号101&配列番号7 配列番号136&配列番号176
配列番号102&配列番号7 配列番号137&配列番号176
配列番号103&配列番号7 配列番号138&配列番号176
配列番号104&配列番号7 配列番号139&配列番号176
配列番号105&配列番号7 配列番号140&配列番号176
配列番号106&配列番号171 配列番号141&配列番号176
配列番号106&配列番号172 配列番号142&配列番号176
配列番号107&配列番号171 配列番号143&配列番号176
配列番号107&配列番号172 配列番号144&配列番号176
配列番号108&配列番号171 配列番号145&配列番号176
配列番号108&配列番号172 配列番号146&配列番号176
配列番号109&配列番号170 配列番号147&配列番号176
配列番号110&配列番号171 配列番号148&配列番号176
配列番号111&配列番号172 配列番号149&配列番号176
配列番号112&配列番号169 配列番号150&配列番号176
配列番号113&配列番号173 配列番号151&配列番号176
配列番号113&配列番号174 配列番号152&配列番号176
配列番号113&配列番号175 配列番号153&配列番号189
配列番号113&配列番号176 配列番号154&配列番号189
配列番号113&配列番号177 配列番号155&配列番号189
配列番号113&配列番号176 配列番号156&配列番号189
配列番号114&配列番号173 配列番号157&配列番号189
配列番号114&配列番号174 配列番号158&配列番号189
配列番号114&配列番号175 配列番号159&配列番号189
配列番号114&配列番号176 配列番号160&配列番号189
配列番号114&配列番号177 配列番号161&配列番号189
配列番号115&配列番号173 配列番号161&配列番号179
配列番号115&配列番号174 配列番号162&配列番号189
配列番号115&配列番号175 配列番号162&配列番号179
配列番号115&配列番号176 配列番号163&配列番号189
配列番号115&配列番号177 配列番号163&配列番号179
配列番号115&配列番号181 配列番号164&配列番号189
配列番号115&配列番号182 配列番号164&配列番号179
配列番号115&配列番号183 配列番号165&配列番号189
配列番号115&配列番号184 配列番号165&配列番号179
配列番号115&配列番号185 配列番号166&配列番号189
配列番号115&配列番号186 配列番号166&配列番号179
配列番号115&配列番号187 配列番号167&配列番号189
配列番号115&配列番号188 配列番号167&配列番号179
配列番号115&配列番号189 配列番号168&配列番号189
からなる群から選択される2つの免疫グロブリン可変領域を含む抗体を提供する。
(i)ヒトIL-12p40またはヒトIL-12p40の断片により動物を免疫化して、第1の抗体パネルを得るステップと;
(ii)該第1のパネルから、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第2の抗体パネルを形成するステップと;
(iii)該第2のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
を含む方法も提供する。
(i)配列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)を有するペプチドにより動物を免疫化して、第1の抗体パネルを得るステップと;
(ii)該第1のパネルから、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第2の抗体パネルを形成するステップと;
(iii)該第2のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
を含む方法も提供する。
(i)ヒト抗体ディスプレイライブラリーを得て、第1の抗体パネルを形成するステップと;
(ii)該第1のパネルから、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第2の抗体パネルを形成するステップと;
(iii)該第2のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
を含む方法も提供する。
配列番号217 配列番号254 配列番号282 配列番号310
配列番号218 配列番号255 配列番号283 配列番号311
配列番号219 配列番号257 配列番号284 配列番号312
配列番号220 配列番号258 配列番号285 配列番号313
配列番号222 配列番号259 配列番号286 配列番号314
配列番号223 配列番号260 配列番号287 配列番号315
配列番号224 配列番号261 配列番号289 配列番号316
配列番号225 配列番号262 配列番号291 配列番号317
配列番号227 配列番号263 配列番号292 配列番号318
配列番号228 配列番号264 配列番号293 配列番号319
配列番号229 配列番号266 配列番号294 配列番号320
配列番号230 配列番号267 配列番号295 配列番号321
配列番号232 配列番号268 配列番号296 配列番号322
配列番号233 配列番号269 配列番号297 配列番号323
配列番号234 配列番号270 配列番号298 配列番号324
配列番号242 配列番号271 配列番号299 配列番号325
配列番号243 配列番号272 配列番号300 配列番号326
配列番号244 配列番号273 配列番号301 配列番号327
配列番号245 配列番号274 配列番号302 配列番号328
配列番号246 配列番号275 配列番号303 配列番号329
配列番号247 配列番号276 配列番号304 配列番号330
配列番号248 配列番号277 配列番号305 配列番号331
配列番号249 配列番号278 配列番号306 配列番号332
配列番号250 配列番号279 配列番号307 配列番号333
配列番号251 配列番号280 配列番号308 配列番号334
配列番号252 配列番号281 配列番号309 配列番号335
から選択される配列を有することが好ましい。
配列番号221 配列番号338 配列番号350 配列番号362
配列番号226 配列番号339 配列番号351 配列番号363
配列番号231 配列番号340 配列番号352 配列番号364
配列番号235 配列番号341 配列番号353 配列番号365
配列番号236 配列番号342 配列番号354 配列番号366
配列番号237 配列番号343 配列番号355 配列番号367
配列番号238 配列番号344 配列番号356 配列番号368
配列番号239 配列番号345 配列番号357 配列番号369
配列番号240 配列番号346 配列番号358 配列番号370
配列番号241 配列番号347 配列番号359
配列番号336 配列番号348 配列番号361
から選択される配列を有することが好ましい。
ァ1アンチトリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗cd3抗体療法、抗リン脂質症候群、抗受容体抗体過敏反応、大動脈瘤および末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化、動静脈瘻、運動失調、心房細動(持続性または発作性)、心房粗動、房室ブロック、B細胞リンパ腫、骨移植片拒絶、骨髄移植(BMT)拒絶、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心臓不整脈、心臓性失神症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶、小脳皮質変性症、小脳障害、多源性(chaoticまたはmultifocal)心房性頻脈、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性アルコール依存症、慢性炎症性病態、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、鬱血性心不全、結膜炎、接触皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツフェルト-ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、ボクサー認知症、脱髄疾患、出血性デング熱、皮膚炎、皮膚状態、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性動脈硬化性疾患、びまん性レビー小体病、拡張型鬱血性心筋症、大脳基底核障害、中年におけるダウン症候群、CNSドーパミン受容体を遮断する薬物により誘導される薬物誘導性運動障害、薬物過敏、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、喉頭蓋炎、エプスタイン-バーウイルス感染、肢端紅痛症、錐体外路障害および小脳障害、家族性血球貪食リンパ組織球症、胎児胸腺移植拒絶、フリードライヒ運動失調症、末梢動脈機能障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎(glomerular nephritis)、任意の臓器または組織の移植片拒絶、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物による肉芽腫、有毛細胞白血病、ハレルフォルデン-シュパッツ病、橋本甲状腺炎、花粉症、心臓移植拒絶、血色素沈着症、血液透析、溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、出血、肝炎(A)、His束不整脈、EQV感染/HIV神経障害、ホジキン病、運動亢進性運動障害、過敏反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下性運動障害、視床下部-下垂体-副腎皮質評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体媒介性細胞傷害作用、無力症、小児性脊髄性筋萎縮症、大動脈炎、A型インフルエンザ、イオン化放射線曝露、虹彩毛様体炎/ブ
ドウ膜炎/視神経炎、虚血-再灌流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋委縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、脂肪性浮腫、肝移植拒絶、リンパ浮腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性/特発性疾患、偏頭痛、多系統ミトコンドリア障害、混合性結合組織疾患、単クローン性ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症(メンツェル症候群、デジュリーヌ-トーマス症候群、シャイ-ドレーガー症候群、およびマカド-ジョセフ症候群)、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ症、結核、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、鼻咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経性I型筋委縮症、好中球減少性発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈およびその分枝の閉塞、閉塞性動脈障害、okt3療法、睾丸炎/副睾丸炎、睾丸炎/精管切除反転術、臓器肥大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶、膵臓癌、新生物随伴性症候群/悪性腫瘍による高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢性アテローム性動脈硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、致死性貧血、カリニ肺炎、肺炎、ポエムス症候群(多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、単クローン性ガンマグロブリン血症、および皮膚病変による症候群)、灌流後症候群、ポストポンプ症候群(post pump syndrome)、心筋梗塞後心臓切開術症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺性高血圧、放射線療法、レイノー現象およびレイノー病、レフサム病、QRS間隔が等しく狭い頻脈(regular narrow QRS tachycardia)、腎血管性高血圧、再灌流傷害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老年舞踏病、レビー小体型老年性認知症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚異種移植拒絶、皮膚病変症候群、小腸移植拒絶、充実性腫瘍、特異的不整脈(specific arrhythmias)、脊髄性運動失調、脊髄小脳変性、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造的病変、亜急性硬化性汎脳炎、失神、心血管系の梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身型若年性関節リウマチ、T細胞性ALLまたはFAB分類によるALL、
末梢血管拡張症、閉塞性血栓性血管炎、血小板減少症、毒性、移植、外傷/出血、M型過敏反応、IV型過敏、不安定狭心症、尿毒、尿路性敗血症、じん麻疹、心弁疾患、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス感染および真菌感染、ウイルス性脳炎/ウイルス性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ-コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意の臓器または組織の異種移植拒絶などであるがこれらに限定されない免疫性障害、神経性障害、および関連障害の症状を調節するか、治療するか、または軽減する方法または組成物中における少なくとも1つの抗体、その特定の部分または変異体をさらに提供する。
a. 親VHドメインのHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、上記で定義されたCDRのセットである、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む親VHドメインのアミノ酸配列中における1または複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、該親VHドメインのアミノ酸配列変異体であるVHドメインを提供し、また、場合によって、このようにして提供された該VHドメインを、1または複数のVLドメインと組み合わせて、1または複数のVH/VLの組合せを提供するステップと;
b. 該親VHドメインのアミノ酸配列変異体である前記VHドメイン、または該1もしくは複数のVH/VLの組合せを試験して、ヒトIL-12p40に対する抗体抗原結合ドメインを同定するステップと
を含む方法を提供する。
a. VHドメインをコードする出発核酸、または、各々が配列番号6、配列番号62、配列番号114、配列番号142、配列番号28、配列番号87、配列番号115、配列番号143、配列番号29、配列番号88、配列番号116、配列番号144、配列番号30、配列番号90、配列番号117、配列番号145、配列番号31、配列番号91、配列番号118、配列番号146、配列番号33、配列番号92、配列番号119、配列番号147、配列番号34、配列番号93、配列番号120、配列番号148、配列番号35、配列番号94、配列番号122、配列番号149、配列番号36、配列番号95、配列番号124、配列番号150、配列番号38、配列番号96、配列番号125、配列番号151、配列番号39、配列番号97、配列番号126、配列番号152、配列番号40、配列番号99、配列番号127、配列番号153、配列番号41、配列番号100、配列番号128、配列番号154、配列番号42、配列番号101、配列番号129、配列番号155、配列番号43、配列番号102、配列番号130、配列番号156、配列番号44、配列番号103、配列番号131、配列番号157、配列番号45、配列番号104、配列番号132、配列番号158、配列番号53、配列番号105、配列番号133、配列番号159、配列番号54、配列番号106、配列番号134、配列番号160、配列番号55、配列番号107、配列番号135、配列番号161、配列番号56、配列番号108、配列番号136、配列番号162、配列番号57、配列番号109、配列番号137、配列番号163、配列番号58、配列番号110、配列番号138、配列番号164、配列番号59、配列番号111、配列番号139、配列番号165、配列番号60、配列番号112、配列番号140、配列番号166、配列番号61、配列番号113、配列番号141および配列番号167からなる群から選択されるVHドメインをコードする出発核酸レパートリーを提供するステップと;
b. それが該出発核酸または出発レパートリーにおけるVHドメイン内へと挿入され、VHドメインをコードする核酸産物レパートリーをもたらすように、アミノ酸配列の突然変異をコードするか、またはこれにより生成される1または複数のドナー核酸と、前記出発核酸または出発レパートリーを組み合わせ、該産物レパートリーの核酸を発現させて、産物であるVHドメインをもたらすステップと;
c. 場合によって、前記産物であるVHドメインを、1または複数のVLドメインと組み合わせるステップと;
d. ヒトIL-12p40に対する抗原結合ドメインを選択するステップと;
e. 産物であるVHドメイン、また場合によってVLドメインを含む前記抗原結合ドメイン、またはそれをコードする核酸を回収するステップと
を含む方法も提供する。
a. VLドメインをコードする出発核酸、または、各々が配列番号7、配列番号169、配列番号181、配列番号193、配列番号32、配列番号170、配列番号182、配列番号194、配列番号37、配列番号171、配列番号183、配列番号195、配列番号42、配列番号172、配列番号184、配列番号196、配列番号46、配列番号173、配列番号185、配列番号197、配列番号47、配列番号174、配列番号186、配列番号198、配列番号48、配列番号175、配列番号187、配列番号199、配列番号49、配列番号176、配列番号188、配列番号200、配列番号50、配列番号177、配列番号189、配列番号201、配列番号51、配列番号178、配列番号190、配列番号52、配列番号179および配列番号192からなる群から選択されるVLドメインをコードする出発核酸レパートリーを提供するステップと;
b. それが該出発核酸または出発レパートリーにおけるVLドメイン内へと挿入され、VLドメインをコードする核酸産物レパートリーをもたらすように、アミノ酸配列の突然変異をコードするか、またはこれにより生成される1または複数のドナー核酸と、前記出発核酸または出発レパートリーを組み合わせ、該産物レパートリーの核酸を発現させて、産物であるVLドメインをもたらすステップと;
c. 場合によって、前記産物であるVLドメインを、1または複数のVHドメインと組み合わせるステップと;
d. ヒトIL-12p40に対する抗原結合ドメインを選択するステップと;
e. 産物であるVLドメイン、また場合によってVHドメインを含む前記抗原結合ドメイン、またはそれをコードする核酸を回収するステップと
を含む方法も提供する。
ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
これらの実施例におけるIL-12、IL-23、IL-12p40、IL-12p80、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2およびIL-23への言及はすべて、他の方法で述べられることがなければヒト型のタンパク質のことである。
1.1 ハイブリドーマの単離およびキメラ抗体の作製
標準マウスハイブリドーマ作製技術および抗原として組換えIL-12を使用して、2種のハイブリドーマ細胞系統、すなわちPMA202とPMA204が得られた。これらの細胞系統は、ELISAにおいて試験されると、IL-12p40(配列番号1)、IL-12(配列番号1および配列番号2)ならびにIL-23(配列番号1および配列番号3)に結合する抗体を分泌した(PMA204-図3)。前記抗体は、マウスIgG1カッパとしてアイソタイプされた。
PMA202マウス重鎖可変領域(配列番号4)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNFKNEDTATYFCARSLSTMITTTFAYWGQGTLVTVSS
PMA202マウス軽鎖可変領域(配列番号5)
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKR
PMA204マウス重鎖可変領域(配列番号6)
EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNACKELRYFDVWGAGTTVTVSS
PMA204マウス軽鎖可変領域(配列番号7)
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKR
抗体202.1重鎖(配列番号10)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNFKNEDTATYFCARSLSTMITTTFAYWGQGTLVTVSSASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗体202.1軽鎖(配列番号11)
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
抗体1重鎖(配列番号12)
EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNACKELRYFDVWGAGTTVTVSSASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗体1軽鎖(配列番号13)
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
2.1 PMA204および抗体1の特異性
PMA204および抗体1は、ELISAを使用して決定すると、ヒトIL-12、IL-23、IL-12p40およびIL-12p80に用量依存的な形で等しくよく結合した(図3)。SPRを使用して、ka(結合速度)、kd(解離速度)および平衡解離定数(KD)を含む抗体1の速度論的データが計算され、TABLE1(表1)に収載されている。抗体1は、40〜70pM間の類似のKD値でヒトIL-12、IL-23、IL-12p40に結合した(TABLE1(表1))。
受容体中和アッセイを使用して、PMA204および抗体1は、IL-12Rβ2の細胞外ドメイン(配列番号15)に対するIL-12の結合(図4A)およびIL-23Rの細胞外ドメイン(配列番号16)に対するIL-23の結合(図4B)を中和することが実証された。
PMA204および抗体1は、IL-12Rβ1(配列番号14)に対するIL-12およびIL-12p80の結合を中和しない(図5)。IL-12Rβ1に対するIL-12p40およびIL-23結合は、PMA204または抗体1により阻害されなかった(図6)。
IL-12Rβ1を過剰発現している安定的にトランスフェクトされたJurkat細胞系統が作製された。この細胞系統は、フローサイトメトリーにより決定されるように、IL-12Rβ2およびIL-23Rに対して陰性であった。細胞系統へのIL-12p40、IL-12およびIL-23の結合は、フローサイトメトリーを使用して確認された。抗体1および抗体202.1をIL-12p40、IL-12またはIL-23を用いて滴定する実験では、抗体202.1は、IL-12Rβ1 Jurkat細胞系統へのサイトカイン結合の滴定可能な阻害を実証した(図7)。これとは対照的に、抗体1はIL-12Rβ1 Jurkat細胞系統へのIL-12、IL-23またはIL-12p40鎖のいずれか単独の結合を感知できるほど中和することはなかった(図7)。IL-12とIL-23両方の平均蛍光強度は、抗体1濃度を1μg/mlまで増加するに従って増加し、抗体-サイトカイン-受容体複合体の形成を反映していた(図7)。
抗体1は、トランスフェクトされた細胞表面上のIL-12Rβ1に結合しているIL-12、IL-23またはIL-12p40鎖に強力に結合した(図8)。この複合体は生物系において発生して、抗体のFc領域がFc結合受容体と相互作用をすることを可能にするような方向に抗体を提示することができると想像することが可能であろう。そのような受容体は、エフェクター細胞上に存在して、ADCCおよびCDC活性を誘導し、それによって、抗体-サイトカイン-受容体複合体が形成される標的細胞に対して細胞障害性効果を示すことが可能であろう。これとは対照的に、抗体202.1は、サイトカイン-受容体複合体への無視できるほどの結合しか示さなかった。
3.1 抗体1の最適化
3.1.1 軽鎖における94位でのW
Yangら、2007年 J Chromatogr A 1156 174〜82頁により理解されたように、トリプトファンは抗体精製工程中に酸化されて、タンパク質のHPLC解析中に問題を引き起こす酸化および未酸化種を生じることがある。これを回避するために、軽鎖における94位でのTrpからPheへの同類置換が行われた。抗体3と命名されたこの抗体は遺伝子合成を介して作製され、発現されELISAにおいてスクリーニングされた(図9)。SPRスクリーンにおいて、この抗体は、抗体1よりも速くIL-12とIL-23から解離した(TABLE2(表2))。
Metは、抗体の精製および貯蔵中に酸化されることがあることが明らかにされている。ヒト抗体配列のブラスト検索により、Leuがこの位置では一般的であることが確認された。M34L置換が行われ、構築物は抗体4と命名された。その遺伝子が合成され、発現され、その抗体がSPRとELISAを使用してスクリーニングされた(図9)。抗体4は、抗体1と比べて、IL-12とIL-23の両方に対する親和性がわずかに失われていた(TABLE2(表2))。
抗体1の重鎖において95位で問題のある残基が観察された。CDR3の開始位置のこのシステインは酸化され、こうして得られるどんな抗体産物にも不均一性を引き起こすことが可能であった。このシステインは、ジスルフィド結合形成により複合体を形成することも可能であった。したがって、その他の18(例外は最初のCysおよびTrpである)アミノ酸はそれぞれ、遺伝子合成を使用してこの位置で置換され、抗体は過渡的に発現された(抗体5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22)。ELISAがこれらの抗体に対して実施された(図9)。抗体の一部はIL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持し、どちらか一方のサイトカインに対してのみ結合活性を保持する抗体もあり、他にどちらかのサイトカインに最小限結合する結合する抗体もあった。SPRは試料に対して実施され、このデータから構築物の解離速度が解析された。このデータから、C95N置換を有する抗体7は抗体1のC95N置換にもっとも近い親和性を示した(TABLE2(表2))。
抗体50 VHドメイン(配列番号112)
EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNANKELRYFDVWGAGTTVTVSS
抗体50 VLドメイン(配列番号169)
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSFPLTFGAGTKLELKR
4.1 PMA204のスーパーヒト化
米国特許出願第2003/039649号(Foote)およびPCT出願国際公開第04/006955号(Foote)において教唆され、Tanら、(2002)によりおよびHwangら、(2005)によりさらに説明される方法に従って、PMA204のスーパーヒト化は実施された。
IGHV1-f*01(配列番号17)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
IGHV1-24*01(配列番号18)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
IGHV1-18*01(配列番号19)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR
JH3(配列番号20)
AFDVWGQGTMVTVSS
IGKV6D-21*01(配列番号21)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP
IGKV3-15*01(配列番号22)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWP
IGKV3-11*01(配列番号23)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
Jκ4(配列番号24)
LTFGGGTKVEIKR
5.1 PMA204のヒト化
元のマウス抗体のフレームワーク配列に密接に相同である直鎖状ペプチド配列中のヒトフレームワーク配列を使用してPMA204もヒト化された。
重鎖
ARG40-別の残基に水素結合しCDRループ構造を安定化させる
GLU42-ドナーとアクセプター間で比較される二次構造の相違
LYS66-3つの異なる残基に水素結合し、CDRループ構造を安定化させる
軽鎖
LYS49-重鎖CDR3残基に水素結合する
TYR65-非保存的なRARE残基
ARG85-非保存的なRARE残基
6.1 抗体80の親和性成熟
6.1.1 リボソームディスプレイのための材料の調製
抗体80は、scFv(scFv-80)(配列番号27)としての発現のために再フォーマットされ、pEGX448発現ベクターにサブクローニングされた。scFvは、親和性精製を可能にするようにFLAGタグと一緒に発現された。次に、scFvは大腸菌(E.coli)中で発現され、アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過により精製された。発現はSDS-PAGEおよび免疫ブロット法により確認された。scFvは、SPRにより確認されるように、親IgGと類似の速度式で、IL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持していた。
scFv-80変異体をコードするmRNAプールは、in vitro発現システムを使用して翻訳され、こうして得られたscFvライブラリーは、Kopsidasら、(2007)により記載されているリボソームディスプレイプロトコールを使用して、IL-23バインダーについてパンされた。このシステムの選択圧は、解離定数(kd)が低いバインダーに対するバイアスに合わせて調整された。リボソームディスプレイプロセスの1巡が終わると、濃縮されたscFvのコード配列はPCRにより増幅され、pEGX448発現ベクターにサブクローニングされた。scFv-80の変異体としてのその同一性を確認するために、サブクローニングされたscFvプール由来の20のランダムクローンは配列決定された。残りのクローンは、IL-23に対するハイスループットスクリーニングにかけられた。
リボソームディスプレイ反応から回収されたほぼ6500の個々のscFvは発現され、ハイスルーアウトSPRアッセイを使用してIL-23に対する結合についてスクリーニングされた。変異体はkdに従って並べられ、最良の変異体は核酸レベルで配列決定された。このプロセスにより22の新規scFv変異体が同定され(TABLE4(表4))、それぞれの変異体は親scFv-80と同等のまたはそれより良好なIL-23結合親和性(kdに基づいて)を示した。
広範囲の突然変異プロファイルおよび結合親和性を網羅する、結合速度論の完全な特徴付けのために、TABLE4(表4)に提示されているいくつかのscFv変異体が選択された。scFvごとに大規模タンパク質発現が実施された。発現されたscFvは単量体タンパク質として精製され、SPRによりIL-12およびIL-23に対する結合について試験された(TABLE5(表5))。これらの結果により、リボソームディスプレイおよびスクリーニングを介して単離された変異体はすべて両抗原に結合し、一部の変異体は親scFv-80と比べて最大5倍の親和性改善を示すことが確認された。
SPRアッセイにおいてもっとも高い結合親和性を示した3つのscFv(AW-F2、CU-A6およびCP-A6)は、VHとVLドメインを別々の哺乳動物発現ベクターにサブクローニングすることにより(すなわち、抗体重鎖に1つの構築物、軽鎖に1つの構築物)、IgG発現のために再フォーマットされた。ヒト重鎖Fc領域(配列番号8)および定常カッパ軽鎖領域(配列番号9)を付加することにより、CU-A6は抗体183に変換され、CP-A6は抗体184に変換され、AW-F2は抗体207に変換された。IgG分子は、抗体ごとに重鎖および軽鎖構築物をHEK 293E培養物に同時トランスフェクトすることにより発現された。発現されたIgGは、アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル排除により精製され、こうして得られた単量体分子はSPRによりIL-12およびIL-23結合について試験された(TABLE6(表6))。3つのIgG変異体はすべて両分析物に対して結合活性を保持しており、親野生型IgGと比べてkdが目に見えて改善されていた。これに基づけば、TABLE4(表4)に記載されているscFv変異体はIgGフォーマットに変換され、IL-12およびIL-23に対して改善された結合特徴を保持することが可能であると予想するのは理にかなっている。
上記の様々な突然変異体(TABLE4(表4))を組み合わせることにより一連の追加のscFv変異体が作製された。これらのscFvは、a)スクリーニングランにおいて観察される回数、b)突然変異体に会合しているscFvの親和性に基づいて様々な突然変異体に重み付けをすることにより派生した。もっとも高い重み付けをされた組合せ(TABLE7(表7))は、部位特異的突然変異誘発を使用してscFvに付加された。次にこれらの組合せscFvはすべて小規模に発現され、その後アフィニティークロマトグラフィーおよび脱塩カラムを使用して部分的に精製された。新規のscFvはそれぞれ、単一濃度の分析物を用いる中スループット解析プロトコールを使用してSPRによりIL-12およびIL-23に対する結合について試験された(TABLE7(表7))。データは、これらの変異体はすべてIL-12またはIL-23結合を保持することを示していた。大半の場合、新規変異体の解離速度は、親変異体に少なくとも等しかった。2つの突然変異組合せ(VHドメインのT28AとVLドメインのS26P、VHドメインのF29LとVLドメインのS26P)は、親変異体と比べて親和性の改善を示した。したがって、TABLE4(表4)に収載されている突然変異体の新規組合せを担っているscFvは、親突然変異体および実際、野生型scFv-80より良好ではないが等しい親和性でIL-12およびIL-23に結合することが可能であったと予想するのは理にかなっている。
7.1 ヒト化抗体の追加の成熟
7.1.1抗体136ヘの親和性改善突然変異の導入
抗体80の親和性成熟に基づいて、IL-12およびIL-23への親和性を増強する重鎖可変領域のいくつかの重要な突然変異(Y59S、Y59HおよびF29L)が抗体136に導入された(抗体175、176、177、178、179、180、181、182)。これらの抗体は発現されEILSAにおいてスクリーニングされた(図20)。抗体はすべてIL-12およびIL-23への結合を示した。
93位に置換体(N93A)を含有する抗体80重鎖の親和性成熟変異体が、その対応する軽鎖と対合された(抗体199、200、201、202、203、204、205、206)(図20)。この置換は、93位をこの位置にAlaを含有することがもっとも多いヒト生殖系列に戻すために導入された。N93A置換を含有する抗体80重鎖の親和性成熟変異体も、さらに高い親和性変異体を同定するために、抗体136軽鎖と一緒に発現された(抗体190、191、192、193、194、195、196、197、198)(図20)。
SPR技術を使用して、様々なヒト化抗体のkaとkdとKDが決定された。これらの親和性はTABLE8(表8)に収載されている。あらゆる場合に、Y59SまたはY59H置換を含有する抗体は、抗体のフレームワークとは無関係に、IL-12およびIL-23に対する結合親和性の改善を示した。
8.1 様々な抗体の追加の特徴付け
8.1.1 競合実験-SPR
上記のキメラおよびヒト化抗体がPMA204と同じ結合特異性を維持していることを立証するために、SPRを使用して競合アッセイが確立された。SPR実験では、抗体136はプロテインA被膜表面に捕獲されて応答単位(RU)は増加し、次にIL-12またはIL-23が充填された(応答単位はさらに増加した)。次に、PMA204が充填されたが、表面IL-12またはIL-23-抗体136複合体に結合しなかった(図21)(応答単位の増加はなかった)。これは、抗体136がPMA204結合を妨げるような形でIL-12およびIL-23に結合すること、ならびに前記2つの抗体がIL-12とIL-23上で重複するエピトープを共有していることを示している。
抗体136がPMA204と同じ結合特異性を維持していることを立証するために、ELISA方法論を使用して競合アッセイが確立された。PMA204がELISAプレート上に被膜され、次にIL-12またはIL-23が添加され、続いて抗体136が添加されても、抗体136の結合は検出することができなかった(図23A)。これは、抗体136とPMA204がIL-12またはIL-23への結合を競合することを示していた。対照抗体PMA202を被膜し、抗体136とIL-12p40のプレインキュベートされた混合物を添加すると、抗体136の結合を検出することができた(図23B)。これは、抗体1とPMA202がIL-12への結合を競合しないことを示していた。抗体202.1は第1の実験では陽性結合対照として(図23A)、第2の実験では陰性対照として(図23B)使用された。
8.1.3.1 抗体80および抗体136はIL-12Rβ2に対するIL-12結合およびIL-23Rに対するIL-23結合を中和する
受容体中和アッセイを使用して、抗体80および抗体136がIL-12Rβ2に対するIL-12の結合(図24A)およびIL-23Rに対するIL-23の結合(図24B)を中和することが実証された。対照抗体202.1は、IL-12Rβ2に対するIL-12結合またはIL-23Rに対するIL-23結合の阻害を全く示さなかった。
抗体80および抗体136は、IL-12Rβ1に対するIL-12の結合を中和しなかった(図25A)。IL-12Rβ1に対するIL-23結合は、抗体80および抗体136により阻害されず(図25B)、むしろIL-23のみおよび受容体単独の増加を上回る結合したIL-23の増加により証拠だてられるように、複合体形成が生じた。対照抗体202.1は、IL-12Rβ1に対するIL-12およびIL-23結合を阻害した。
9.1 皮内IL-23投与により誘発される皮膚炎症の寛解
リード抗体のいくつかが、マウス脾細胞上でのIL-17のIL-23誘発放出を抑制できる(図26)ことを観察した後、ヒトIL-23を疾患の誘発因子として使用することが可能である動物モデルを設計するためにさらに研究が実施された。IL-23を用いた6日間のC57B1/6Jマウスの背中への内皮的処置により、紅斑および硬結により特徴付けられ、表皮過形成、不全角化および局所性炎症性浸潤という組織学的証拠を有する局所性炎症応答が誘発された。抗体は、サイトカイン処置が始まる前日の単回投与で炎症性応答を減少させるその能力について試験された。抗体80および抗体136を受ける両群は、アイソタイプ対照と比べて、5日目から先は臨床スコアーが減少し、この実験における抗体の効力が実証された(図27A)。
10.1 マウス脾細胞上においてキメラIL-12により誘発されるIFN-γの中和
ヒトIL-12はマウス脾細胞と弱く反応してIFN-γ産生を誘発することが見出された。しかし、ヒトp40とマウスp35からなるキメラ分子(配列番号63)は、マウスIL-12で見られるレベルに類似するレベルでマウス脾細胞からIFN-γ応答を誘発することができた。次に、キメラIL-12がマウス脾細胞上でIFN-γ応答を誘発するのを抑制する目的で、いくつかのリード抗体(抗体番号: 36、80、180、181、193、194、198)がこのアッセイに追加された。前記抗体はすべてこのアッセイにおいて中和を示した(図28)。
連続5日間の0.1mg/kgキメラIL-12(ヒトIL-12p40鎖とマウスIL-12p35鎖(配列番号63))を用いたC57B1/6Jマウスの処置により、明白な毒性がまったくない強い血清IFN-γ応答が誘発された。抗体はキメラIL-12を中和する、したがってIFNγ応答を抑制するその能力について、サイトカイン処置の第1日目に単回投与でまたはサイトカイン処置と同時に1日おきに3回投与のいずれかで、5mg/kgの用量で試験された。試験された両抗体は中和能力を示し、5mg/kgでの抗体80の単回投与で血清IFN-γを基線検出可能レベルにまで減らすには十分であった(図29)。
11.1 IL-23を産生するためのPBMCの刺激作用: 抗体80を用いた診断用検出
IL-12およびIL-23に対するヒト化抗体は、生体試料におけるIL-12およびIL-23の検出のための診断試薬として使用することが可能である。組換えヒトIL-23を検出するためのELISAが開発された。このアッセイでは、抗ヒトp19抗体は捕獲抗体として使用され、抗体80は検出抗体として使用された。抗体80は、このサンドイッチELISAフォーマットにおいて組換えヒトIL-23を検出することができた(図30A)。
12.1 H/D交換によるエピトープ地図作成
最初の実験では、IL-12p40上の水素は溶液中で重陽子に交換され、次にカラムに固定された抗体80に結合し、次にまだ抗体カラムに結合している間に、H2O中で再び逆交換され、エピトープは保護された。したがって、エピトープは重陽子で標識されている。第2の実験では、IL-12p40は抗体カラムに結合され、次に重陽子で標識され、次にまだカラムに結合している間にH2Oに逆交換された。各実験後、IL-12p40は低pHを使用してカラムから溶出されて激しく還元され、タンパク質を消化するペプシンカラム中を通された。次に、消化断片はLC:MS上に充填された。2つの実験間の重水素化のレベルの差異は、抗体に結合している際の交換の遅延の尺度となる。
VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)に対応するアミノ酸253と286の間であった。
H/D交換実験から得られた結果に基づいて、標的突然変異がIL-23の同定された領域に導入された。スクリーニングする必要のある突然変異の数をさらに絞り込むために、ヒトIL-12p40がマウスIL-12p40(Uni-Prot No: P43432; http://www.uniprot.org)と次の位置で整列された。
哺乳動物細胞における抗体の作製、単離、発現
ハイブリドーマ細胞系統の作製、発現および精製
5BALB/Cマウスは、フロイント完全アジュバンド中のヒトIL-12(Peprotech)で免疫され、それぞれが、続いて14、35および70日目にフロイント不完全アジュバンド中のヒトIL-12の追加免疫を受けた。74日目、マウス脾臓は回収され、マウス脾細胞が得られた。これらの細胞と骨髄腫細胞系統SP2/0 Ag-14間で融合が実施され、細胞は96ウェル組織培養プレートに沈着された。96ウェルプレートのウェルごとに上澄みに対して、抗IL-12、抗IL-12p40および抗IL-23 ELISA(下参照)が実施された。3つのELISAすべてについて陽性の結果であった上澄みは進められて、限界希釈によりクローニングされた。下流ELISAにおいて陽性の結果であったクローンは500mL規模まで培養され、抗体精製が実施された(下参照)。この方法から精製された抗体は1×PBSに対して透析され、濃度はBCA(登録商標)アッセイキット(Pierce(登録商標))を介して決定された。
製造元のプロトコールに従ってTRI試薬(Sigma-Aldrich(登録商標))を使用して、RNAはハイブリドーマ細胞から単離された。cDNAは、AccuScript(登録商標) High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Stratagene(登録商標))を使用して、10〜200ng RNAから合成され、次にこれを次のPCR反応において鋳型として使用した。それぞれ重鎖用および軽鎖用のNovagen Murine IgG Primer Set由来のプライマーを、cDNAおよびPfu II Mastermix(登録商標)(Stratagene(登録商標))と互いに混合させ、次に以下の条件に従ってThermocyler(Eppendorf Mastercycler(登録商標))に流し込んだ。
ハイブリドーマ細胞であるPMA202およびPMA204から、DNA塩基配列決定を介して決定されたVHドメインは、ヒト定常領域(ヒトIgG1重鎖CH1、ヒンジ、CH2&CH3ドメイン)と一緒に発現された。これは、アミノ酸配列をDNA配列に逆翻訳することにより達成され、DNA配列はGeneOptimizer技術を使用して哺乳動物細胞発現のために最適化され、合成オリゴヌクレオチド(GeneArt, Germany)を組み立てることにより新規に合成された。遺伝子合成に続いて、全配列はpTT5重鎖ベクターの複数のクローニング部位にサブクローニングされた(Durocherら、2002年 Nucleic Acids Res 30 E9)。ハイブリドーマ細胞であるPMA202およびPMA204から、DNA塩基配列決定を介して発見されたVLアミノ酸鎖は、その配列をpTT5軽鎖ベクターの複数のクローニング部位にサブクローニングすることによりヒトカッパ軽鎖定常領域と一緒に発現された。こうして得られるPMA202マウス-ヒトキメラ抗体は、抗体202.1と命名された。こうして得られるPMA204マウス-ヒトキメラ抗体は、抗体1と命名された。すべての抗体は、候補タンパク質配列をDNA配列に逆翻訳するこの方法論を使用して作製され、最適化されて、合成オリゴヌクレオチドを組み立てることにより新規に合成された。すべての抗体がヒト重鎖Fc領域およびヒト軽鎖カッパ定常領域を含有していた。次に抗体可変領域をコードする遺伝子はすべて、発現のためにpTT5ベクターにクローニングされた。
一過性に発現されるすべての抗体では、以下の方法が使用された。手短に言えば、HEK293E細胞は、完全細胞増殖培養液(1LのF17培養液(Invitrogen(商標))、9mLのPluronic F68(Invitrogen(商標))、2mMグルタミン含有20%(w/v) Tryptone NI(Organotechnie(登録商標))および50μl/100mL培養液でGeneticin(50 mg/mL、Invitrogen(商標)))で培養された。トランスフェクションの前日に、細胞は遠心分離により回収され、新たな培養液(Geneticinなし)に再懸濁された。次の日、重鎖および軽鎖DNAはFuGENE(登録商標)(Roche)トランスフェクション試薬と混合され、DNAトランスフェクション混合物は液滴で培養液に添加された。培養液は、Geneticinなしで、37℃、5%CO2および120rpmで一晩インキュベートされた。次の日、500mL培養液あたり250μlのGeneticinと一緒に12.5mLのTryptoneが添加された。培養液は37℃、5%CO2および120rpmでインキュベートされた。7日後、上澄みが遠心分離により回収され、精製に備えた。
上記トランスフェクション物由来の上澄みはHiTrap(登録商標)Protein Aカラム(5 mL、GE Healthcare)に充填される前にpH7.4に調整された。カラムは50mLの1×PBS(pH7.4)で洗浄された。溶出は、0.1Mクエン酸pH2.5を使用して実施された。溶出された抗体は、Zeba(登録商標) Desaltingカラム(Pierce(登録商標))を使用して1×PBS(pH7.4)に脱塩された。抗体の完全性は、SDS-PAGEおよびゲル濾過HPLCを使用して解析された。抗体の濃度はBCA(登録商標)アッセイキット(Pierce(登録商標))を使用して決定された。
抗IL-12/23 ELISA
IL-12(Peprotech)、IL-23(Ebioscience(商標))、IL-12p40(Ebioscience(商標))またはIL-12p80(Peprotech)は、炭酸コーティング緩衝液(35mM炭酸ナトリウム、15mM炭酸水素ナトリウムpH9.6)に1μg/mLまで希釈し、4℃で一晩96ウェルプレート(Nunc(商標)、Maxisorp(商標))上に被膜された。次にプレートは洗浄緩衝液(0.01M PBS pH7.2、0.05% Tween-20)で3回洗浄され、次に0.01M PBS pH7.2で3回洗浄された。次に、ウェルは、200μlの遮断緩衝液(0.01M PBS中1% w/v BSA pH7.2)を各ウェルに添加し、25℃で1時間プレートをインキュベートすることにより遮断された。抗体は、滴定曲線を作成するのに十分な抗体希釈液(1% w/v BSA、0.01M PBS中0.05% Tween-20 pH7.2)に希釈された。ウェルは25℃で1時間、抗体と一緒にインキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄された。抗体希釈液中1対2000のヤギ抗ヒト免疫グロブリンG(H+L)抗体HRPコンジュゲート(Zymed(登録商標))を使用して、結合している一次抗体を検出した。抗体希釈液中1対2000のヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体HRPコンジュゲート(Dako)を使用して、結合しているマウス抗体を検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前述の通りに洗浄された。TMB基質溶液(Zymed(登録商標))を各ウェルに添加し、色を現像させ、反応はウェルに1M HClを添加することにより終了させた。各ウェルの吸光度は450nmで決定された(ref.620nm)。
IL-12Rβ1/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))は、炭酸コーティング緩衝液中に1μg/mLまで希釈され、96ウェルプレートの各ウェルに添加され、4℃で一晩インキュベートされた。次にプレートは洗浄緩衝液で3回洗浄され、次に0.01M PBS pH7.2で3回洗浄された。次にウェルは、200μlの遮断緩衝液を各ウェルに添加し、25℃で1時間プレートをインキュベートすることにより遮断された。抗体は、滴定曲線を作成するのに十分な抗体希釈液に希釈された。IL-12(Peprotech)は抗体希釈液に300ng/mLまで希釈された。IL-12は深ウェル容器において2時間、抗体とプレインキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄され、ウェルは抗体/IL-12溶液と一緒に25℃で1時間インキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄され、抗体希釈液中0.5μg/mLで100μlのビオチン化抗ヒトIL-12抗体(Peprotech)を使用して25℃で1時間結合した抗体を検出した。プレートは前述の通りに洗浄された。抗体希釈液中1対1000で100μlのStreptavidin HRP(Zymed(登録商標))を使用して結合したビオチン化抗体を検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前述の通りに洗浄された。100μl TMB基質溶液(Zymed(登録商標))を各ウェルに添加し、5分間色を現像させた。100μlの1M HClを添加して発色現像反応を終了させ、吸光度は450nmで決定された(ref.620nm)。
このアッセイはIL-12/IL-12Rβ1中和アッセイについて上記の通りに実施されたが、以下の変更があった:
このアッセイはIL-12/IL-12Rβ1中和アッセイについて上記の通りに実施されたが、以下の変更があった: IL-12Rβ1/Fc ChimeraはIL-12Rβ2/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))で置き換えられ、1μg/mlの代わりに5μl/mlまで希釈された。プレートは洗浄緩衝液で3回洗浄されたが、追加のPBS洗浄はなかった。IL-12(Peprotech)はビオチン化IL-12(Peprotech)で置き換えられた。ウェルは抗体/IL-12溶液と一緒に25℃で2時間インキュベートされた。ビオチン化抗ヒトIL-12抗体はウェルに添加されなかった。100μlの1対1000 Streptavidin HRP(Zymed(登録商標))は100μlの1対5000 Streptavidin HRP(Sigma-Aldrich(登録商標))で置き換えられた。100μl TMB基質溶液(Zymed(登録商標))は100μl TMB基質溶液(Sigma-Aldrich(登録商標))で置き換えられた。
IL-23/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))は炭酸コーティング緩衝液に1μg/mLまで希釈され、96ウェルプレートの各ウェルに添加され、4℃で一晩インキュベートされた。次にプレートは洗浄緩衝液で3回洗浄され、次に0.01M PBS pH7.2を用いて3回洗浄された。次にウェルは、各ウェルに200μlの遮断緩衝液を添加しプレートを25℃で1時間インキュベートすることにより遮断された。抗体は、滴定曲線を作成するのに十分な抗体希釈液に希釈された。IL-23(Ebioscience(商標))は、抗体希釈液に300ng/mLまで希釈された。IL-23は抗体と一緒に深ウェル容器で2時間プレインキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄され、ウェルは抗体/IL-23溶液と一緒に25℃で1時間インキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄され、抗体希釈液中0.5μg/mLで100μlのビオチン化抗ヒトIL-12抗体(Peprotech)を使用して25℃で1時間結合した抗体を検出した。プレートは前述の通りに洗浄された。抗体希釈液中1対1000で100μlのStredtavidin HRP(Zymed(登録商標))を使用して結合したビオチン化抗体を検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前述の通りに洗浄された。100μl TMB基質溶液(Zymed(登録商標))を各ウェルに添加し、5分間色を現像させた。100μlの1M HClを添加して発色現像反応を終了させ、吸光度は450nmで決定された(ref.620nm)。
IL-12/23競合ELISA
PMA204またはPMA202は、炭酸コーティング緩衝液(35mM炭酸ナトリウム、15mM炭酸水素ナトリウムpH9.6)に1μg/mLまで希釈され、4℃で一晩96ウェルプレート(Nunc(商標)、Maxisorp(商標))上に被膜された。次にプレートは洗浄緩衝液(0.01M PBS pH7.2、0.05% Tween-20)を用いて3回洗浄され、次に0.01M PBS pH7.2を用いて3回洗浄された。次にウェルは、200μlの遮断緩衝液(0.01M PBS中1% w/v BSA pH7.2)を各ウェルに添加し、プレートを25℃で1時間インキュベートすることにより遮断された。IL-12(Peprotech)またはIL-12(Ebioscience(商標))は抗体希釈液(1% w/v BSA、0.01M PBS中0.05% Tween-20 pH7.2)に0.5μg/mlまで希釈され、100μlが各ウェルに添加され、続いて25℃で1時間インキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄された。競合抗体の段階半ログ希釈が実施され、100μlが各ウェルに添加された。最終タンパク質濃度は滴定曲線を作成するのに十分であった。プレートは25℃で1時間インキュベートされ、次に前述の通りに洗浄された。抗体希釈液中1対2000でヤギ抗ヒト免疫グロブリンG(Fc特異的)-HRPコンジュゲート(Sigma-Aldrich(登録商標))が使用されて、結合した競合抗体を検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前述の通りに洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-標識検出試薬では、酵素反応は、室温で100μl/ウェル テトラメチルベンジジン(Zymed(登録商標))基質を用いて暗所で起こされた。反応は100μlの1M HClを用いて停止され、光学密度は450nm(ref.620nm)で測定された。
プロテインA(Thermo)は、BIAcore 3000を使用してCM5センサーチップ上に固定された。次にHBS-P(GE Healthcare)中5μg/mLのキメラまたはヒト化抗体は、流速20μl/分で1分間注入された。次にIL-12またはIL-23は、HBS-P中5μg/mLで、流速20μl/分で1分間表面全体に注入された。次にマウス抗体は、HBS-P中5μg/mLで、流速20μl/分で1分間注入された。IL-12またはIL-23がHBS-Pで置き換えられた、およびマウス抗体がHSB-Pで置き換えられた対照も実施された。データはすべて、IL-12またはIL-23またはマウス抗体がプロテインA表面に対するバックグランド結合について試験された対照ランから引き算された。
IL-12Rβ1のアミノ酸配列はDNA配列に逆翻訳され、このDNA配列はGeneOptimizer技術を使用して哺乳動物細胞発現のために最適化され、合成オリゴヌクレオチド(GeneArt, Germany)を組み立てることにより新規に合成された。IL-12Rβ1をコードするDNA配列はpcDNADEST-40にサブクローニングされ、次にTop-10化学的にコンピテントな大腸菌(E. coli)細胞に形質転換された。プラスミドDNAはHiSpeed Plasmid Maxi Kit(QIAgen(登録商標))を使用して細胞培養物から回収され、ScaI(Promega(登録商標))を用いる制限酵素消化により直線化された。プラスミドはJurkat 6E細胞(ATCC)にトランスフェクトされ、表面発現はIL-12Rβ1(R&D Systems(登録商標))に対する抗受容体鎖抗体を用いて染色することにより決定された。
FLAGタッグをつけたIL-12またはHISタッグをつけたIL-23もしくはIL-12p40は、37℃で2時間の段階半ログ希釈により1000から0.01ng/mlの範囲の濃度で、IL-12Rβ1発現細胞(106/ml)と一緒に同時インキュベートされた。細胞へのサイトカインの結合は、フィコエリトリンコンジュゲートマウス抗6xHISタグ抗体(Abcam(登録商標))またはFITC-コンジュゲート抗FLAG(Sigma-Aldrich(登録商標))を用いて検出された。試料データはBeckman-Coulter Quanta(登録商標)上で得られた。
濃度250ng/mlのFLAGタッグをつけたIL-12またはHISタッグをつけたIL-23もしくはIL-12p40は、37℃で1時間の段階半ログ希釈により10から0.01μg/mlの範囲の濃度の抗体と一緒に同時インキュベートされ、次に上記のIL-12Rβ1発現細胞は106/mlで添加され、さらに1時間インキュベートされた。細胞はPBS/10%FBSで徹底的に洗浄され、細胞結合サイトカインはフィコエリトリンコンジュゲートマウス抗6xHISタグ抗体(Abcam(登録商標))またはFITC-コンジュゲート抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich(登録商標))を用いて検出された。試料データはBeckman-Coulter Quanta上で得られた。
FLAGタッグをつけたIL-12またはHISタッグをつけたIL-23もしくはIL-12p40は、濃度250ng/mlで上記のIL-12Rβ1発現細胞と同時インキュベートされた。2時間のインキュベーション後、抗体は段階半ログ希釈により10から0.01μg/mlの範囲の濃度で添加され、さらに1時間インキュベートされた。細胞はPBS/10%FBSで徹底的に洗浄され、細胞結合サイトカインに結合した抗体はFITCコンジュゲートウサギ抗ヒトIgG(Dako)を用いて検出された。試料データはBeckman-Coulter Quanta(登録商標)上で得られた。
方法
抗体80 VHおよびVLドメイン由来のscFv-80コード配列の組立て
一本鎖抗体断片(scFv-80)は、配列(Gly4Ser)3の15アミノ酸リンカーにより軽鎖の可変ドメイン(VL)に結合している重鎖の可変ドメイン(VH)を含むポリペプチドを設計することによって抗体80から導き出された(scFv-80、配列番号27)。VHおよびVL配列は、(それぞれ)ポリペプチドのNおよびC終端末端に置かれていた。次にアミノ酸配列はDNA配列に逆翻訳され、このDNA配列はGeneOptimizer技術を使用して哺乳動物発現のために最適化された。次に全遺伝子は合成オリゴヌクレオチド(GeneArt)を組み立てることにより新規に合成された。最終配列は、追加のサブクローニングを促進する5'NcoIおよび3'NotI部位も含んでいた。
上記のpEGX412-scFv80構築物を使用して、scFv-80の突然変異体による変異体をコードするRNAのプールを作製した。これを達成するため、プラスミドはSmaIを用いて直線化され、製造元の説明書通りにT7 RNAポリメラーゼキット(Promega(登録商標))を使用する一本鎖RNA(ssRNA)産生のための鋳型として直接使用された。こうして得られた一本鎖RNA分子は、Q-Betaレプリカーゼ(Epicentre(登録商標) Biotechnologies)を使用するエラープローン複製のための鋳型として使用された。これを達成するため、200ngのRNAは33mM Tris酢酸(pH7.8)、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジチオストレイートル(DTT)、5mM rATP、5mM rUTP、10mM rCTP、10mM rGTP、0.1U/μLのQ-BetaレプリカーゼおよびH2Oを混合させて、最終容量20μLとした。反応は45℃で約16時間インキュベートされた。
上記のscFvライブラリーはpEGX412ベクターから発現されて、scFv-リボソーム複合体を産生し、次にこの複合体は、Kopsidasら、(2007)により記載されているリボソームディスプレイプロトコールに従ってIL-23に対してパンされた。手短に言えば、scFv-リボソーム複合体(scFvコードssRNAも含む)は、氷上で24時間、最終濃度の1nMまでビオチン化IL-23と一緒にインキュベートされた。次に選択圧を加えて、パンニング実験を解離定数が低いIL-23バインダーが濃縮される方に偏らせた。これは、800倍過剰な非ビオチン化IL-23を添加し、パンニング反応をさらに5日間続けることにより達成された。パンニング期間の終了時にビオチン化IL-23に結合したままであったscFv-リボソーム複合体は、ストレプトアビジン被膜磁気ビーズを用いて回収された。次に前記ビーズは、0.05%Tween20および5mM MgCl2を含有するPBSを用いて3回洗浄され、5mM MgCl2を含有するPBSを用いて2回洗浄された。最後に、ssRNAは回収されたscFv-リボソーム複合体から溶出され、コードされたscFvプールは製造元の説明書通りにSuperscript III One-Step RT-PCR system(Invitrogen(商標))を用いてRT-PCRにより、しかし反応鋳型として8μLの回収されたRNAおよび下に収載されているscFv特異的オリゴヌクレオチドプリマーを用いて増幅された。これらのオリゴヌクレオチドも、サブクローニングを促進するために5'NcoIおよび3'NotI部位を加えられていたことに注意されたい。
フォワード: 5'-CCATGGCCCAGGTGCAGCTG-3'
リバース: 5'-GCGGCCGCTGTCGTACGC-3'
リボソームディスプレイ実験(上記)の終了時に増幅されたRT-PCR産物のプールは、pEGX448発現ベクターのNcoIおよびNotI部位にサブクローニングされ、One-Step Competent KRX大腸菌(Stratagene(登録商標))に形質転換され、固形培地上で増殖された。こうして得られた細菌コロニーは、96ウェルプレート中の200μL液体増殖培養液に個別に播種され、600nmでのOD(OD600nm)0.8まで増殖され、次に0.5mMイソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いてタンパク質発現を誘発された。200μL発現培養液は20℃で一晩インキュベートされ、次にこれを使用して、40μLの溶解緩衝液(2Mショ糖; 0.25M Tris pH7; 0.2M EDTA pH8)を添加しプレートを30分間900RPMで攪拌することにより、粗い細菌溶菌液を作製した。次に溶菌液は遠心分離により清澄にされ、10000分子量カットオフ濾過プレート(Millipore)を通過させた。この方法を使用して、下で詳細に述べられるハイスループットSPRプロトコールを使用してIL-23バインダーについてスクリーニングされるほぼ6500のscFv試料を調製した。
このプロトコールは、リボソームディスプレイおよびスクリーニング実験から直接同定されたscFv変異体の完全な速度論的特徴付けのために使用された。先ず、関連するscFvをコードするpEGX448構築物がHB2151大腸菌に形質転換された。次に組換えscFvを、500mL培養物を0.8のOD600まで増殖させ、次に0.5mMのIPTGを用いてタンパク質発現を誘発することにより細菌性周辺質中に発現させた。細胞は遠心分離により回収され、周辺質画分はMinskyら、(1986年、Proc. Natl. Acad. Sci.、Vol. 83、4180〜4184)により記載されている通りに、浸透圧ショックにより抽出された。scFvは、C終端FLAGタグを特異的に認識する抗体にコンジュゲートされた1mLカラムのセファロース樹脂を使用して周辺質画分から精製された。アフィニティー精製されたタンパク質は最終容量200μLまで濃縮され、PBS中で平衡化されたSuperdex 200カラム(GE Healthcare)上でゲル濾過クロマトグラフィーにかけられ、単量体scFv(約32kDa)に相当するピークタンパク質画分は機能的特徴付けのために収集された(下参照)。
追加のscFv-80変異体は、リボソームディスプレイおよびスクリーニングを通じて発見された突然変異を組み合わせることにより導き出された。これらの突然変異組合せは、突然変異誘発レベルがscFv配列あたり1つの突然変異(平均で)を作り出すように内因的に設定されているリボソームディスプレイの1巡りの結果としては生じなかったことに注目するのは重要である。これらの組合せは、代わりに設計により導き出された。組合せは、TABLE11(表13)に従って個々の突然変異それぞれに重み付けをすることにより選択された。
VH突然変異 Y59S
センス: 5'-gaacggcgataccgagtccgcccccaa-3'
アンチセンス: 5'-ttgggggcggactcggtatcgccgttc-3'
VH突然変異 Y59H
センス: 5'-cggcgataccgagcacgcccccaagtt-3'
アンチセンス: 5'-aacttgggggcgtgctcggtatcgccg-3'
VH突然変異 T28A
センス: 5'-ggccagcggctacgccttcaccgacta-3'
アンチセンス: 5'-tagtcggtgaaggcgtagccgctggcc-3'
VH突然変異 F29L
センス: 5'-gccagcggctacaccctcaccgactactatc-3'
アンチセンス: 5'-gatagtagtcggtgagggtgtagccgctggc-3'
VL突然変異 S26P
センス: 5'-tgtcctgtagagccccccagagcatcagc-3'
アンチセンス: 5'-gctgatgctctggggggctctacaggaca-3'
VL突然変異 S52R
センス: 5'-gatctacttcgccagacagtccatcagcggc-3'
アンチセンス: 5'-gccgctgatggactgtctggcgaagtagatc-3'
VL突然変異 Q27R
センス: 5'-cctgtagagcctcccggagcatcagcatcaa-3'
アンチセンス: 5'-ttgatgctgatgctccgggaggctctacagg-3'
このプロトコールを使用して、突然変異組合せを担っているscFv-80変異体のIL-12およびIL-23結合を調べた。小規模HB2151大腸菌培養物を使用して、中スループットSPR解析のために部分的に精製されたscFvを作製した(下参照)。組換えscFvは周辺質中に発現され、次に抽出されて、上記の抗FLAG抗体-セファロースカラムを使用して精製された。次にscFv試料は、PD10脱塩カラム(GE Healthcare)を使用してPBS中に緩衝液交換され、最終容量の200μlまで濃縮された。この材料はそれ以上精製されずにSPR解析にかけられた。
SPR3000を使用して、プロテインAは、アミンカップリングを使用してCM5研究グレードセンサーチップのFC1およびFC2(または代わりにFC3およびFC4)上に固定され、ほぼ2000RUを与えた。FC1は実験全体を通してブランクとして使用された。実験はHBS-P緩衝液中で行われた(SPR)。流速20μl/分で、5μg/mLの抗体の20μlをFC2上に通した。IL-12、IL-23またはIL-12p40(Peprotech)は、66nMから2nMまでの範囲の濃度でFC1およびFC2の表面上に通された。表面の再生は、10mMグリシン、pH1.0を使用して実施された。FC2からのセンサーグラムデータは、FC1および緩衝液のみ対照から引き算された。曲線は、kd、kaおよびKD値を生み出す1対1のラングミュア方程式を使用してフィットされた。曲線はすべて、可能な場合には2.0未満のχ2を用いてフィットされた。
in vitroマウス脾細胞アッセイ
単細胞懸濁液は、破壊して100μmのシーブを通過させることによりマウス脾臓から得られた。赤血球細胞は、細胞懸濁液を遠心分離し9mlの減菌水に再懸濁させる水法により溶解された。次に1mlの10×PBSを直ちに添加しよく混ぜあわされた。細胞は洗浄され計数され、次に濃度107細胞/mlでRPMI(2mM l-グルタミン、100U/ml Pen/Strep、10%FBSを含む)中に再懸濁された。細胞は、96ウェル平底組織培養プレートに100μl中106細胞/ウェルで蒔かれた。コンカナバリンAおよびrhIL-23は、最終濃度がそれぞれ1μg/mlおよび25ng/mlまで添加された。試験抗体は試料全体で滴定された。典型的アッセイは試験抗体あたり3〜5生物学的複製物および1〜10μg/mlの開始試験抗体濃度を有していた。各アッセイプレートは、Con A+IL-23を有するが抗体のみおよびCon Aのみはない複製試料を含有していた。プレートは37℃、5%CO2で3日間インキュベートされ、次に上澄みはIL-17 ELISAのために収集された。IL-17は、製造元の説明書通りにIL-17 ELISAキット(R&D Systems(登録商標))を使用してアッセイされた。濃度は標準曲線法により決定された。
NK92細胞(ATCC、CRL-2407)は、RPMI1640、2mM L-グルタミン、100U Pen/Strep、10%FBS中で培養され、200U/mlのヒトIL-2(Peprotech Asia)および10ng/mlのヒトIL-15(Ebioscience(商標))を補充された。細胞は、アッセイに先立ってヒトIL-2およびヒトIL-15が欠乏状態にされた。抗体は、滴定曲線を作成するのに十分に培養液に希釈された。IL-12(Peprotech)はプレートに添加され、37℃、5%CO2で2時間インキュベートされた。細胞は回収されてウェルに添加され、200μl/ウェルの全容量中1×105細胞/mLの細胞濃度を与えた。培養物は37℃、5%CO2で24時間インキュベートされた。インキュベーションの終了時に上澄みが回収され、Duoset ELISAヒトIFN-γキット(R&D Systems(登録商標))を使用して、産生されたヒトIFN-γを検出した。
ヒトPBMCは、リンホプレップ分離を使用してヒト軟膜から収集され、培養液(50%DMEM、50%RPMI、0.045%D(+)グルコース、2mM L-グルタミン、5%ウシ胎児血清(FBS)、10mM HEPES)中1×107細胞/mLで培養された。PHA-P(Sigma-Aldrich(登録商標))が10μg/mLで添加され、37℃、5%CO2で3日間インキュベートされた。次にヒトIL-2(R&D Systems(登録商標))が50U/mLで添加された。培養物は37℃、5%CO2で1日間インキュベートされた。抗体は、96ウェルプレート全体にわたり10μg/mLから0.001μg/mLまでの範囲を含む滴定曲線を作成するのに十分に培養液に希釈された。1ng/mLのヒトIL-12(Peprotech)がプレートに添加され、37℃、5%CO2で2時間インキュベートされた。1ng/mLのhIL-2(R&D Systems(登録商標))が各ウェルに添加された。細胞は回収されてウェルに添加され、200μl/ウェルの全容量中2×105細胞/ウェルの細胞濃度を与えた。培養物は37℃、5%CO2で2日間インキュベートされた。インキュベーションの終了時に上澄みが回収され、Duoset ELISAヒトIFN-γキット(R&D Systems(登録商標))を使用して、産生されたヒトIFN-γを検出した。
試験的用量反応域検出および速度論的研究
オスC57B1/6Jマウスは、注射開始の2日前に背中の試験部位を脱毛され、次に背中の2箇所にPBSまたはrhIL-23のどちらかの内皮注射を総量で3または10μg/マウス/日まで毎日受けた。両治療計画は炎症のある程度の徴候を与えたが、10μg/日の用量は高レベルの紅斑を伴う強い応答を与えた。後の実験では、マウスは炎症応答の完全な速度論を決定するために10μgのrhIL-23/日を全部で10日間与えられた。応答は処置の3日目から検出可能になり、6〜7日目にピークに達し、その後消散し始めた。
オスC57B1/6Jマウスは、上記の通りに10μg/日のrhIL-23を用いて6日間処置された。サイトカイン注射の開始1日前に、マウスは、抗体80、抗体136またはアイソタイプ対照抗体の単回腹腔内注射を10mg/kgの用量で受けた。マウスは試験部位において紅斑および硬結を毎日スコアー化された。すべての処置および所見は盲検で実施された。実験の終了時、皮膚試料は各マウスから収集され、組織学的処理および標準プロトコールによるヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色のために固定された。
キメラIL-12
ヒトIL-12p40およびマウスIL-12p35を含有するキメラIL-12(配列番号63)が作製された。タンパク質は遺伝子配列に逆翻訳され、最適化され、合成されpTT5ベクターにサブクローニングされた。キメラIL-12はHEK-293E細胞に発現され、HISタグアフィニティー精製カラムを介して精製された。キメラIL-12に対するマウスT細胞の応答性はin vitroで試験された。マウス脾細胞(107/ml)は、2mM 1-グルタミンおよび10%ウシ胎児血清に加えてキメラ、組換えマウスまたは組換えヒトIL-12(0〜20ng/ml)を補充されたRPMI中で一晩培養された。上澄みが収集され、製造元の説明書通りにIFN-γELISAキット(R&D Systems(登録商標))を使用して、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)によりIFN-γについてアッセイされた。キメラIL-12は、一定範囲の濃度にわたりマウス脾細胞からIFN-γ分泌を誘発することができた。ヒトIL-12は、試験されたもっとも高濃度でを除いて不活性であった。
単細胞懸濁液は、破壊して100μmのシーブを通過させることによりマウス脾臓から得られた。赤血球細胞は、細胞懸濁液を遠心沈殿させ、9mlの無菌液に再懸濁させる水法により溶解され、1mlの10×PBSを直ちに添加してよく混ぜ合わせた。細胞は洗浄し計数して、次にRPMI+2mM 1-グルタミン+100U/ml pen/strep+10%FBS中に濃度5×106/mlで再懸濁させた。
オスC57B1/6Jマウスは、PBS、0.03mg/kgのマウスIL-12(IL-12)または0.03、0.1もしくは0.3mg/kgのキメラIL-12のいずれかを用いて腹腔内注射により5日間処置された。6日目、終末血液試料は血清作製のために収集された。血清中のIFN-γ濃度は、製造元の説明書通りに高感度IFN-γ ELISAキット(Ebioscience(商標))を使用して決定された。
オスC57B1/6Jマウスは、0.1mg/kgのキメラIL-12を用いて腹腔内注射により5日間処置された。前記マウスは、サイトカイン注射の1日目にキメラIL-12を投与する30分前に単一投与の抗体80もしくは抗体136のどちらかも5mg/kgで用いて、またはサイトカイン注射の1、3および5日目にキメラIL-12を投与する30分前に3用量の抗体80、抗体136もしくはアイソタイプ対照も用いて処置された。6日目に、終末血液試料は収集され、血清IFN-γは上記の通りに決定された。
ELISA現像
96ウェル平底ELISAプレート(Nunc Maxisorp)はPBS中0.5μg/mlのマウス抗ヒトIL-23p19(Ebioscience(商標))を4℃で一晩被膜された。プレートは洗浄され(洗浄はすべて3回実施される)、次にPBS/10%FBSを用いて1時間遮断された。プレートは洗浄され、次に組換えIL-23が半ログ希釈により1000から0.003ng/mlの範囲の濃度で添加された。プレートは室温で2時間インキュベートされた。プレートは洗浄され、次にサイトカインは抗体80を0.5μg/mlで用いて検出された。プレートは室温でさらに2時間インキュベートされ、洗浄され、次にマウス吸着抗ヒトIgG、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(Invitrogen(商標))が添加された。さらに30分のインキュベーション後、プレートは6回洗浄され、TMB基質が添加され(Sigma-Aldrich(登録商標))、色を5〜10分間現像させた。反応は1M HClを用いて停止させ、プレートは450nm吸光度で読み取られた。洗浄はすべて、Biotek(登録商標)ELx405プレート洗浄液を使用してPBS+0.1%Tweenで実施された。
PBMCは、Lymphoprep勾配(Axis-shield(登録商標))上の遠心分離により単一軟膜から得られた。PBMCは96ウェル平底プレートに105/ウェルで蒔かれた。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cowan 1(SAC)(Sigma-Aldrich(登録商標))は以下の通りに調製された: 10% w/vの保存液から、適切な容量が取り除かれ、ペレット細胞にまで遠心分離された。これらの細胞はX-Vivo 15培養液(Biowhittaker(商標))で2回洗浄され、次に滴定のために開始濃度で再懸濁された。SACは、1% w/vから0.0001% w/v間の範囲濃度で段階半ログ希釈でPBMCに添加された。プレートは72時間インキュベートされ、次にELISAのために上澄みが収集された。IL-23の検出のためのELISAは上記の通りに実施された。
IL-12p40はPBS中1mg/mLで使用された。抗体80はPBS中2.0mg/mLで使用された。抗体は製造元の説明書に従ってPOROS AL樹脂(Applied Biosystems)に連結された。マブカラムに600μlの抗体80- POROS AL樹脂が充填され、4℃で貯蔵された。
サブユニットとC終端FLAGタグの間にリンカーを含有する野生型IL-23をコードする遺伝子が合成された。IL-23のX線結晶構造(例えば、3D85)の解析後、ala残基への突然変異のために側鎖が露出したアミノ酸が選択された。これは、野生型IL-23遺伝子への部位特異的突然変異誘発を使用して達成された。遺伝子はすべてpTT5ベクターにクローニングされた。
HEK293E細胞は、Geneticin(Invitrogen(商標))を含むF17培地(Invitrogen(商標))で培養され、Geneticinなしで1×106細胞/mlでトランスフェクトされた。5mlトランスフェクション培養液が構築物ごとに準備された。7.5μgのDNAが、OptiMEM(登録商標) I(Invitrogen(商標))およびFugene(登録商標) HDトランスフェクション試薬(Roche)を使用してトランスフェクトされた。Tryptone(BD(登録商標))およびGeneticinがトランスフェクションの翌日に培養液に添加された。培養液は6日間増殖され、上澄みは回収されて解析のために濾過された。
IL-12Rβ1/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))、IL-23/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))、抗体202.1および抗体80は炭酸コーティング緩衝液に1μg/mLまで希釈され、96ウェルプレートの各ウェルに添加され、4℃で一晩インキュベートされた。次にプレートは洗浄緩衝液を用いて3回洗浄された。次にウェルは、各ウェルに200μlの遮断緩衝液を添加しプレートを25℃で1時間インキュベートすることにより遮断された。上澄みは滴定曲線を作成するのに十分に抗体希釈液に希釈され、100μlがウェルに添加され、次に25℃で1時間インキュベートされた。次にプレートは前記の通りに洗浄され、抗体希釈液中1対1000のMonoclonal Anti-FLAG(登録商標)M2-HRP(Sigma-Aldrich(登録商標))の100μlを使用して、結合しているサイトカインを検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前記の通りに洗浄された。100μl TMB基質溶液(Sigma-Aldrich(登録商標))が各ウェルに添加され、5分間色を現像させた。100μlの1M HClを添加して色現像反応を停止させ、吸光度は450nm(ref.620nm)で決定された。
NCBI受託番号P01834
NCBI受託番号P01842
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ATCC CRL-1651
ATCC CRL-10
ATCC CRL 1610
ATCC CRL-26
ATCC受託番号CRL-1580
ATCC受託番号CRL-1851
Claims (25)
- ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗原結合ドメインを含み、以下の3つの重鎖CDR配列
HCDR1: DYYLH;
HCDR2: WIDPENGDTEX 2 APKFQG
[式中、X 2 =Y、H、またはS];
HCDR3:NKELRYFDV、および;
以下の3つの軽鎖CDR配列
LCDR1: RASQSISINLH;
LCDR2: FASQSIS;
LCDR3: QQSNSFPLT
を含む
抗体。 - 配列番号202、配列番号205、配列番号208、配列番号203、配列番号206、配列番号209、配列番号204、および配列番号207からなる群から選択される、ヒト重鎖アクセプターフレームワーク配列をさらに含む、請求項1に記載の抗体。
- 配列番号210、配列番号213、配列番号216、配列番号211、配列番号214、配列番号212、および配列番号215からなる群から選択される、ヒト軽鎖アクセプターフレームワーク配列をさらに含む、請求項1または請求項2に記載の抗体。
- CDRに隣接する残基、グリコシル化部位の残基、まれな残基、ヒトIL-12のp40サブユニットとの相互作用が可能な残基、CDRとの相互作用が可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基、およびChothiaによる定義のVHドメインのCDR1とKabatによる定義の第1の重鎖フレームワークとで重複する領域内の残基からなる群から選択される重要残基において、少なくとも1つのフレームワーク領域のアミノ酸置換を含む、抗体ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項1または請求項2に記載の抗体。
- 少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む抗体ヒトアクセプターフレームワークをさらに含み、前記フレームワークのアミノ酸配列が、前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも65%同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも70のアミノ酸残基を含む、請求項1または請求項2に記載の抗体。
- 配列番号115、配列番号119、配列番号158、配列番号159、配列番号162および配列番号112からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項1または請求項2に記載の抗体。
- 配列番号169、配列番号189および配列番号179からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項1または請求項2に記載の抗体。
- 配列番号119&配列番号179
配列番号112&配列番号169
配列番号158&配列番号189
配列番号159&配列番号189、および
配列番号162&配列番号189
からなる群から選択される2つの免疫グロブリン可変領域を含む、請求項1に記載の抗体。 - 単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するヒトIL-12p40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない、
請求項1から8のいずれか一項に記載の抗体。 - ヒトIL-12および/またはヒトIL-23に対する結合について、配列番号6の配列を有する重鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒトIL-12および/またはヒトIL-23に対する結合について、配列番号7の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項1から10のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)を有するヒトIL-12p40の部分に結合する、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗体。
- Asp 265においてヒトIL-12p40(配列番号1)に特異的に結合する、請求項1から12のいずれか一項に記載の抗体。
- ヒトIL-23(配列番号66)に対するその結合レベルが、突然変異体であるIL-23 D265A(配列番号75)に対するその結合レベルを上回る、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体。
- IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、およびIgAからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒト霊長動物重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の抗体。
- カッパまたはラムダからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒト霊長動物軽鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体。
- 有機部分の共有結合により修飾される、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗体。
- 有機部分が直鎖状もしくは分枝鎖状の親水性ポリマー基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基である、請求項17に記載の抗体。
- 抗体依存性細胞傷害作用、補体依存性細胞傷害作用、血清半減期、生体内分布、およびFc受容体に対する結合からなる群から選択される機能特徴を調節するように修飾される、請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体。
- 修飾が、タンパク質操作、糖操作、または化学的方法を介する、請求項19に記載の抗体。
- 請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体のVHドメインをコードする核酸分子。
- 配列番号279、配列番号282、配列番号286、配列番号325、配列番号326、配列番号329、配列番号338および配列番号358から選択される配列を有する、請求項21に記載の核酸分子。
- 請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体のVLドメインをコードする核酸分子。
- 配列番号338、配列番号348および配列番号358から選択される配列を有する、請求項23に記載の核酸分子。
- 関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、骨喪失、気道過敏症、慢性閉塞性肺疾患、脱髄障害、乾癬、多発性硬化症、皮膚過敏症、急性移植拒絶、慢性移植拒絶、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性炎症性腸疾患、泌尿器系炎症性疾患、心血管疾患、血管炎、周期性発熱、グルコース代謝障害、肺疾患、癌、歯周炎、ヘルペス性間質性角膜炎、アレルギー、炎症性疼痛、脊椎関節症、敗血症、敗血症性ショックまたは内毒素性ショック、髄膜炎、外科手術による外傷、自己免疫性血液障害、アルツハイマー病、サルコイドーシス、肝硬変、肝炎(自己免疫性肝炎を含めた)、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、甲状腺炎、アテローム性動脈硬化、脱毛症、ウィルソン病、糸球体腎炎、および脂質異常症からなる群から選択される疾患を治療するための薬物の調製における、請求項1から23のいずれか一項に記載の抗体の使用。
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