JP2011530298A - 抗ｉｌ−１２／ｉｌ−２３抗体 - Google Patents

抗ｉｌ−１２／ｉｌ−２３抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗原結合ドメインを含む抗体を提供する。該抗体は、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するヒトIL-12p40に結合し、また、該抗体は、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない。

Description

出願データ
本出願は、これらの出願の各々の内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、2008年8月14日に出願されたオーストラリア特許出願第2008904178号、および2008年8月14日に出願された米国特許出願第61/089028号による優先権と関連し、これを主張するものである。
分野
本発明は、ヒトIL-12およびIL-23に結合する抗体に関する。
本明細書において著者により言及される刊行物の書誌的詳細は、本記載の末尾にアルファベット順に集約する。
本明細書における先行技術に対する言及は、この先行技術が、いかなる国においてであれ、共通の一般的知識の一部を形成することの承認、または任意の形態による示唆ではなく、また、そのようなものとして理解されるべきではない。
インターロイキン12(また、細胞傷害性リンパ球成熟因子またはナチュラルキラー細胞刺激因子としても知られる)は、75kDaのヘテロ二量体タンパク質である。それは、クラスIサイトカインに類似する4本のアルファヘリックスによるバンドルを含む、p35サブユニットからなる。p35内のC63に対してC末端側にある11のアミノ酸は、この領域が、p40におけるC177との鎖間ジスルフィド結合を包含する、IL-12の他のサブユニットであるp40に接触する多数の残基を含有するので、ジスルフィド結合ループと呼ばれる。p40サブユニットは、成長ホルモン受容体(GHR)など、他のクラスI受容体の細胞外ドメインと同様に折り畳まれる。
p40サブユニットは、D1、D2、およびD3と称する3つのドメインを有する。各ドメインはβシート構造であり、D2ドメインが、C177の鎖間ジスルフィド結合を含有する。D2上にはまた、N結合グリコシル化部位(GlcNAcがN-アセチルグルコサミンであるGlcNAc-GlcNAc-マンノース)も存在する(Yoonら、2000年、Embo J 19、3530〜41頁)。
インターロイキン23は、インターロイキン6ヘリカルサイトカインファミリーのメンバーについてコンピュータにより導出されたプロファイルにより配列データベースを検索することにより、より近年になって(2000年)発見された。この検索により、新規のサイトカインサブユニットが発見され、IL-23p19(p19)と名付けられた。このサブユニットは、IL-12p40と共発現し、インターロイキン23(IL-23)と称するヘテロ二量体タンパク質の分泌をもたらす。IL-23p19は、それが4本のヘリックスバンドルを含有する点で、IL-12p35に類似すると考えられている(Oppmannら、2000年、Immunity 13、715〜25頁)。
その標的細胞型に対するIL-12の特異的な効果は、IL-12Rβ1(Chuaら、1994年、J Immunol 153、128〜36頁)およびIL-12Rβ2(Preskyら、1996年、Proc Natl Acad Sci U S A 93、14002〜7頁)からなるIL-12R複合体を介する。その標的細胞型に対するIL-23の特異的な効果は、IL-12Rβ1およびIL-23RからなるIL-23R複合体(Parhamら、2002年、J Immunol 168、5699〜708頁)を介する。
IL-12およびIL-23に結合するIL-12Rβ1は、共通のp40サブユニットを介する。これは、p40サブユニットのホモ二量体(p80)を、IL-12Rβ1に対する結合についてIL-12と競合させる競合実験を用いて裏付けられた。しかし、p80は、IL-12Rβ2に対するIL-12の結合には効果を及ぼさなかった(Preskyら、1996年、Ann N Y Acad Sci 795、390〜3頁)。
したがって、IL-12のp35サブユニットまたはヘテロ二量体インターフェースが、IL-12Rβ2に対する結合の一因となり、これにより、IL-12R複合体に、IL-12に対する選択性が付与される(Trinchieriら、2003年、Immunity 19、641〜4頁)。同様に、IL-23のp19またはヘテロ二量体インターフェースが、IL-23Rに対する結合の一因となり、これにより、IL-23R複合体に、IL-23に対する選択性が付与される。
IL-12R複合体およびIL-23R複合体のシグナル伝達は解明されている。IL-12Rは、シグナル伝達のJAK(ヤヌスキナーゼ)-STAT(シグナル伝達性転写活性化因子)経路を活性化する。IL-12による実際の細胞効果は、主にSTAT4の活性化に起因する(Kaplanら、1996年、Nature 382、174〜7頁)。IL-12Rβ2上にSTAT4の結合部位が存在することは、この受容体が、シグナル伝達にとって極めて重要であることを示す(Yaoら、1999年、Arch Biochem Biophys 368、147〜55頁)。これはまた、IL-12に対するTH1細胞の反応性と、IL-12Rβ2の発現との相関においても示されている(Roggeら、1997年、J Exp Med 185、825〜31頁)。IL-23Rは、JAK-STAT経路など、IL-12Rと同様の複合体を活性化する。STAT3は、IL-23Rに対するIL-23の結合により、STAT4より顕著に誘導されるが、結果としてもたらされる、DNAに結合する他のSTAT転写因子複合体はこれと異なる(Parham、Chiricaら、2002年、J Immunol 168、5699〜708頁)。
IL-12およびIL-23の生物学的効果は、互いに異なる。IL-12は、活性化した炎症細胞(単球、マクロファージ、好中球、小膠細胞、樹状細胞)により分泌される。IL-12は主に、リンパ球に対するその効果について研究されているが、また、他の種類の細胞にも影響を及ぼす。炎症反応において、IL-12は、NK細胞およびT細胞を誘導して、インターフェロンγ(IFN-γ)を生成させる。次いで、IL-12は、おそらくはIFN-γとの組合せにより、TH1細胞へのT細胞の分化を誘導する。この反応により、細胞性免疫系が刺激され、病原体に対するマクロファージの殺滅効果、およびCD8+T細胞の増殖が最大化される(Trinchieri、2003年、Nat Rev Immunol 3、133〜46頁)。IL-12の過剰生成は、自己免疫性に典型的な炎症促進活性の上昇、および組織損傷と相関している(Leonardら、1997年、Crit Rev Immunol 17、545〜53頁)。IL-12生成の調節異常は、他の自己免疫性疾患にもまして以下の疾患: 乾癬(Yawalkarら、1998年、J Invest Dermatol 111、1053〜7頁; de Rie、1999年、Dermatology 199、101頁; Shakerら、2006年、Clin Biochem 39、119〜25頁)、クローン病(Neurathら、1995年、J Exp Med 182、1281〜90頁; Simpsonら、1998年、J Exp Med 187、1225〜34頁; Camoglioら、2002年、Eur J Immunol 32、261〜9頁)、多発性硬化症(Fassbenderら、1998年、Neurology 51、753〜8頁; Lamanら、1998年、J Neuroimmunol 86、30〜45頁)、関節リウマチ(Kimら、2000年、Clin Exp Immunol 119、175〜81頁; Leungら、2000年、J Immunol 164、6495〜502頁)に関与している。これらの疾患におけるIL-12の役割は明確ではないが、TH1反応の過剰偏向が関与しうると考えられている(Gordonら、2005年、Curr Opin Gastroenterol 21、431〜7頁)。
IL-23は、活性化したヒトマクロファージならびに樹状細胞により分泌される(Verreckら、2004年、Proc Natl Acad Sci U S A 101、4560〜5頁)。IL-23は主に、メモリーT細胞に作用し、IL-23に応答してマウス脾臓細胞がIL-17を分泌しうることに示される通り、IL-17AおよびIL-17Fの調節を介して自己免疫疾患を促進すると推定されている。ヒトにおいてはIL-23/IL-17経路が存在し、IL-23は、IL-17と共にすべてが炎症促進性サイトカインである、IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-αに対しても同様に高度の誘導因子であることが示されている。in vitroにおけるIL-6およびTGF-β1は、新たに発見されたT細胞経路(TH17経路)の下流において、ナイーブT細胞の活性化を促進する(Zhouら、2007年、Nat Immunol 8、967〜74頁)。これらの細胞は、IL-21の分泌を介して、自己分泌様式でさらに駆動される。最後に、IL-23および/またはIL-1βは、このTH 17反応における細胞を維持すると考えられている(総説として、Dong、2008年、Nat Rev Immunol 8、337〜48頁を参照されたい)。TH17反応において上方調節されることが示されている転写因子であるRORγtもまた関心の対象である(Chenら、2007年、Arthritis Rheum 56、2936〜46頁)。
IL-12およびIL-23の両方が共通のサブユニットを含有するので、疾患状態を一方または他方のインターロイキンの過剰生成だけに帰することは困難であった。しかし、研究は、IL-23の調節異常は、他の自己免疫性疾患にもまして以下の疾患: 乾癬(Leeら、2004年、J Exp Med 199、125〜30頁; Tortiら、2007年、J Am Acad Dermatol 57、1059〜68頁)、クローン病(Neurath、2007年、Nat Med 13、26〜8頁)、多発性硬化症(Cuaら、2003年、Nature 421、744〜8頁)に関連づけられていることを示す。
IL-12p40は、単量体(IL-12p40)、またはジスルフィド結合により一体に保持される2つのp40サブユニットであるホモ二量体(IL-12 p80)として分泌されうる(Gillessenら、1995年、Eur J Immunol 25、200〜6頁)。これらのp40分子種は、マウスショックモデルではIL-12と比較して50倍に過剰分泌され(Gillessen、Carvajalら、1995年、Eur J Immunol 25、200〜6頁)、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)中では10〜20倍に過剰分泌される(D'Andreaら、1992年、J Exp Med 176、1387〜98頁)。IL-12p80は、in vitroにおいて、IL-12p40より20倍高度にIL-12活性をアンタゴナイズしうる(Gillessen、Carvajalら、1995年、Eur J Immunol 25、200〜6頁)。組換えIL-12p80は、IL-12Rβ1に結合することが示されている(Wangら、1999年、Eur J Immunol 29、2007〜13頁)。
in vivoおよびin vitroにおいて、マウス組換えIL-12p80(rmIL-12p80)は、IL-12Rβ1に対するIL-12/23の結合と競合することが示されているので、IL-12p40/p80は、IL-12/23受容体複合体のアンタゴニストと考えられている(Mattnerら、1993年、Eur J Immunol 23、2202〜8頁; Gillessen、Carvajalら、1995年、Eur J Immunol 25、200〜6頁; Gatelyら、1996年、Ann N Y Acad Sci 795、1〜12頁)。該ホモ二量体はまた、マウスモデルにおいて、IL-12を介するショックを防止することも示されている(Mattnerら、1997年、Infect Immun 65、4734〜7頁)。IL-23を介する免疫学的機能を精査したところ、IL-12p40は、IL-12Rβ1に対する競合的結合により、IL-23により誘導されるサイトカイン生成を阻害した(Shimozatoら、2006年、Immunology 117、22〜8頁)。IL-12p40またはIL-12p80が、他の生物学的役割にも関連づけられたのは、より近年のことである。IL-12p80の最も早く確立された活性の1つは、マクロファージの化学遊走物質としての活性である。IL-12Rβ1を欠損するマクロファージは、rmIL-12p80に対する化学遊走反応を低下させたが、IL-12Rβ2またはIL-12p35を欠損するマクロファージはこれを低下させなかった。これにより、IL-12Rβ1は、IL-12Rβ2の不在下においてIL-12p80に対する反応を媒介することが可能であり、IL-12p80活性は、IL-12に依存しないことが示された(Russellら、2003年、J Immunol 171、6866〜74頁)。IL-12p80はまた、樹状細胞(DC)遊走の誘導因子としても作用しうる。IL-12p40を欠損するDCは、マイコバクテリアに応答して肺からリンパ節へと遊走することが不可能である。IL-12p35およびIL-23p19が共に喪失されても、ケモカインに応答して遊走すると共に、T細胞の増殖も駆動するという、マイクバクテリアにより活性化されたDCの能力に影響が及ばなかったことにより、IL-12p40に固有のこの役割が浮き彫りになる(Khaderら、2006年、J Exp Med 203、1805〜15頁)。IL-12p40およびIL-12p80はまた、肺における炎症反応を媒介することも示されており、また、CD8+T細胞によるIFN-γの生成を誘導することも示されている(Cooperら、2007年、Trends Immunol 28、33〜8頁)。
IL-12およびIL-23は、各種の障害に関与しているので、IL-12および/またはIL-23の活性を阻害する複数の治療戦略がデザインされている。最も早い時期に記載された抗体の一部は、IL-12により免疫化されたマウスのハイブリドーマにより分泌される、マウスモノクローナル抗体であった(Stroberら、PCT公開第WO97/15327号; Gatelyら、WO99/37682A2; Neurath、Fussら、1995年、J Exp Med 182、1281〜90頁)。ヒトの治療に対するこれらのマウス抗体の使用は、ヒトに対するマウス免疫グロブリンの投与から生じる問題のために制約されている。このような問題には、マウス免疫グロブリンに対する自己抗体の生成、これによる、血清中におけるその存在の除去、および治療効果の無化が含まれる。ヒト抗マウス抗体(HAMA)として知られるこの効果は、マウス配列をその可変領域だけに限定するキメラ抗体の出現により、部分的には克服された(Junghansら、1990年、Cancer Res 50、1495〜502頁; Brownら、1991年、Proc Natl Acad Sci U S A 88、2663〜7頁)。IL-12に結合するキメラ抗体については説明されている(Perrittら、PCT公開第WO02/097048A2号)。マウスドナー抗体の相補性決定領域を含有するが、ヒトアクセプター抗体に由来する可変フレームワーク領域も有する、さらによりヒト様の抗体が、「ヒト化」抗体である(Jonesら、1986年、Nature 321、522〜5頁; Winter、米国特許第5,225,539号; Queenら、米国特許第5,693,761号)。IL-12およびIL-23に対するこのような「ヒト化」抗体は、Lacyら、WO07/005608により説明されている。近年では、ヒト供給源に由来するディスプレイライブラリー(Winterら、米国特許第7,306,907号; MacCaffertyら、米国特許第5,969,108号)、またはヒト免疫グロブリントランス遺伝子を有するマウス(Tomizukaら、米国特許第7,041,870号; Kucherlapatiら、米国特許第5,939,598号)に由来する完全ヒト抗体について説明されている。Salfeldら(米国特許第6,9141,28号)は、IL-12に対する完全ヒト抗体について説明している。
IL-12、IL-23、IL-12p40、およびIL-12p80との相互作用に基づくなら、抗体を5つのクラスに大別することが期待されうるであろう(図1)。第1クラスの抗体は、IL-12p40単量体およびIL-12p80ホモ二量体と並んで、IL-12中およびIL-23中に存在するIL-12p40と特異的に相互作用する抗体である(図1.1)。第2クラスの抗体は、IL-12p35と特異的に相互作用する抗体(Devergneら、2001年、Am J Pathol 159、1763〜76頁における抗体G161-566により例示される; 図1.2)である。第3クラスの抗体は、IL-12とは特異的に相互作用するが、IL-23、IL-12p35、およびIL-12p40とは特異的に相互作用しない抗体(D'Andrea、Rengarajuら、1992年、J Exp Med 176、1387〜98頁における抗体20C2により例示される; 図1.3)である。第4クラスの抗体は、IL-23p19と特異的に相互作用する抗体(Prestaら、WO2007/027714により例示される; 図1.4)である。第5クラスの抗体は、IL-23上においては露出されるが、IL-12においてはIL-12p35サブユニットにより遮蔽される、IL-12p40サブユニット上における配列を利用して、IL-23p40とは特異的に相互作用するが、IL-12p40とは特異的に相互作用しない抗体(Bensonら、米国特許第7,247,711号により例示される; 図1.5)である。本発明は、IL-12p40、IL-12p80、IL-12、およびIL-23と特異的に相互作用する第1クラスの抗体(図1.1)の新規の形態に関する。
オーストラリア特許出願第2008904178号 米国特許出願第61/089028号 Stroberら、PCT公開第WO97/15327号 Gatelyら、WO99/37682A2 Perrittら、PCT公開第WO02/097048A2号 Winter、米国特許第5,225,539号 Queenら、米国特許第5,693,761号 Lacyら、WO07/005608 Winterら、米国特許第7,306,907号 MacCaffertyら、米国特許第5,969,108号 Tomizukaら、米国特許第7,041,870号 Kucherlapatiら、米国特許第5,939,598号 Salfeldら、米国特許第6,9141,28号 Prestaら、WO2007/027714 Bensonら、米国特許第7,247,711号 Giles-Komarら、WO2006/069036 米国特許第6,180,370号 Winterら、PCT公開第WO90/05144A1号 Koprowskiら、米国特許第4,172,124号 EP368,684 PCT/GB91/01134 PCT/GB92/01755 PCT/GB92/002240 PCT/GB92/00883 PCT/GB93/00605 米国特許出願第08/350260号 PCT/GB94/01422 PCT/GB94/02662 PCT/GB97/01835 WO90/14443 WO90/14424 WO90/14430 PCT/US594/1234 WO92/18619 WO96/07754 WO96/13583 WO97/08320 WO95/16027 WO88/06630 WO90/3809 米国特許第4,704,692号 PCT/US91/02989 WO89/06283 EP371998 EP550400 EP229046 PCT/US91/07149 米国特許第5,723,323号 米国特許第5,763,192号 米国特許第5,814,476号 米国特許第5,817,483号 米国特許第5,824,514号 米国特許第5,976,862号 WO86/05803 EP590689 米国特許第5,627,052号 米国特許第5,807,715号 米国特許第4,816,567号 米国特許第4,816,397号 特許公開第EP0983303A1号 特許公開第WO2000/34317号 特許公開第WO98/52976号 米国特許第5,585,089号 米国特許第5,693,762号 米国特許第5,859,205号 EP239400 PCT公開第WO91/09967号 米国特許第5,530,101号 EP592106 EP519596 米国特許第5,565,332号 国際特許公開第WO2004/006955号 国際特許公開第WO2001/27160号 米国特許第4,444,887号 米国特許第4,716,111号 PCT公開第WO98/46645号 PCT公開第WO98/50433号 PCT公開第WO98/24893号 PCT公開第WO98/16654号 PCT公開第WO96/34096号 PCT公開第WO96/33735号 PCT公開第WO91/10741号 PCT公開第WO92/01047号 欧州特許第0598877号 米国特許第5,413,923号 米国特許第5,625,126号 米国特許第5,633,425号 米国特許第5,569,825号 米国特許第5,661,016号 米国特許第5,545,806号 米国特許第5,814,318号 米国特許第5,885,793号 米国特許第5,916,771号 米国特許第6,075,181号 米国特許第6,114,598号 PCT WO93/06213 WO93/08829 米国特許第6,277,375号 米国特許第6,821,505号 米国特許第7,083,784号 米国特許第7,217,797号 WO2000/42072 米国特許出願第20090142340号 米国特許出願第20090068175号 米国特許出願第20090092599号 米国特許第6,602,684号 米国特許第7,326,681号 米国特許第7,388,081号 WO2008/006554 米国特許第4,676,980号 WO91/00360 WO92/00373 EP03089 Lonbergら、米国特許第5,770,428号 Lonbergら、米国特許第5,625,825号 Lonbergら、米国特許第5,789,650号 Lonbergら、WO98/24884 Lonbergら、WO97/13852 Lonbergら、WO94/25585 Kucherlapateら、EP0463151B1 Kucherlapateら、EP0710719A1 Suraniら、米国特許第5,545,807号 Bruggemannら、WO90/04036 Bruggemannら、EP0438474B1 Lonbergら、EP0814259A2 Lonbergら、GB2272440A PCT特許公開第WO91/17271号 PCT特許公開第WO91/18980号 PCT特許公開第WO91/19818号 PCT特許公開第WO93/08278号 PCT特許公開第WO92/05258号 PCT特許公開第WO92/14843号 PCT特許公開第WO96/19256号 米国特許第5,658,754号 米国特許第5,643,768号 米国特許第4,939,666号 米国特許第4,946,778号 米国特許第5,260,203号 米国特許第5,455,030号 米国特許第5,518,889号 米国特許第5,534,621号 米国特許第5,656,730号 米国特許第5,763,733号 米国特許第5,767,260号 米国特許第5,856,456号 米国特許第5,223,409号 米国特許第5,403,484号 米国特許第5,571,698号 米国特許第5,837,500号 米国特許第5,427,908号 米国特許第5,580,717号 米国特許第5,750,373号 米国特許第5,618,920号 米国特許第5,595,898号 米国特許第5,576,195号 米国特許第5,698,435号 米国特許第5,693,493号 米国特許第5,698,417号 米国特許第5,827,690号 米国特許第5,849,992号 米国特許第4,873,316号 米国特許第5,994,616号 米国特許第5,565,362号 米国特許第5,304,489号 Mullisら、米国特許第4,683,195号 Mullisら、米国特許第4,683,202号(1987) Mullisら、米国特許第4,800,159号 Mullisら、米国特許第4,965,188号 Taborら、米国特許第4,795,699号 Taborら、米国特許第4,921,794号 Innis、米国特許第5,142,033号 Wilsonら、米国特許第5,122,464号 Innis、米国特許第5,091,310号 Gyllenstenら、米国特許第5,066,584号 Gelfandら、米国特許第4,889,818号 Silverら、米国特許第4,994,370号 Biswas、米国特許第4,766,067号 Ringold、米国特許第4,656,134号 Malekら、米国特許第5,130,238号 米国特許第4,399,216号 米国特許第4,634,665号 米国特許第4,956,288号 米国特許第5,149,636号 米国特許第5,179,017号 米国特許第5,770,359号 米国特許第5,827,739号 米国特許第5,580,734号 米国特許第5,641,670号 米国特許第5,733,746号 米国特許第5,733,761号 米国特許第5,168,062号 米国特許第5,385,839号 米国特許第5,266,491号 Thompsonら、WO92/16221 Feldmannら、国際公開第WO92/07076号 米国特許第3,773,919号 米国特許第5,770,222号 米国特許出願第2003/039649 米国特許出願第10/194975 米国特許第6881557
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この第1クラスの抗体がIL-12/23受容体-リガンド複合体を阻害し、これにより、それらのアンタゴニスト性効果を及ぼす作用機構については、ある程度の情報が知られている。Giles-Komarら(WO2006/069036)は、IL-12p40のアミノ酸残基1〜88に特異的な抗IL-12p40抗体について説明している。この抗体は、IL-12Rβ1との、IL-12およびIL-23の相互作用を特異的に阻害するものとしてさらに特徴づけられた(Pappら、2008年、Lancet 371、1675〜84頁)。同様に、文献では、別の抗体が、IL-12Rβ1とのIL-12/23の相互作用を阻害するものとして説明されている(Dingら、2008年、Curr Opin Investig Drugs 9、515〜22頁)。本発明は、新規の作用機構(図2.3)を介して、IL-12/23受容体-リガンド複合体を阻害する抗体に関する。これらの新規の作用機構は、IL-12/IL-12Rβ2間相互作用、およびIL-23/IL-23R間相互作用に対する選択的な中和を伴う。これらは、IL-12Rβ1に対するIL-12/23の結合は中和しない点で、すでに説明されている(上記を参照されたい)抗体とは異なる。これらの抗体はまた、IL-12Rβ1に対するIL-12p40/p80の結合を阻害せず、したがって、宿主防御においてIL-12p40/80が果たす役割を阻害せず、これにより、他のIL-12/23抗体と比べた、これらの抗体の安全性プロファイルが潜在的に改善される点でも新規である。新規の作用機構を有するこのような抗体によれば、IL-12/23と関連する疾患の治療において改善がもたらされる一方、安全性の懸念は軽減されうるであろう。加えて、これらの抗体は、IL-12およびIL-23の天然のアンタゴニストであるIL-12p40またはIL-12p80を阻害しないので、これらにより、有効性の改善も可能となったであろう。これは、抗体、およびIL-12p40またはIL-12p80の両方がアンタゴニストとして機能することを可能とし、これにより、抗体を単独で投与する場合の阻害レベルを上回って阻害レベルを上昇させることが可能となるであろう。
本発明は、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗原結合ドメインを含む抗体であって、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するヒトIL-12p40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を提供する。
本発明は、細胞、組織、内臓、動物、または患者における、少なくとも1つのIL-12および/またはIL-23疾患の症状を治療または軽減する方法であって、本発明の抗体またはその特定の部分もしくは変異体の使用を含む方法をさらに提供する。
本発明の抗体はまた、試料中におけるIL-12、IL-23、IL-12p40、またはIL-12p80の存在を検出または測定するのにも用いることができる。該方法は、該抗体を該試料に添加し、該試料中に存在するIL-12、IL-23、IL-12p40、またはIL-12p80に対する該抗体の結合を測定するステップを伴う。
本発明の性格をより完全に理解しうるように、ここで、以下の図面および実施例を参照しながら、その各種の形態について説明する。
様々なクラスの抗IL-12/23抗体。図1.1）IL-12、IL-23、IL-12p40およびIL-12p80のp40サブユニットに結合する抗体; 図1.2）IL-12のp35サブユニットに結合する抗体; 図1.3）ヘテロ二量体としてIL-12のp35およびp40サブユニットに結合する抗体; 図1.4）IL-23のp19サブユニットに結合する抗体; 図1.5）IL-23、IL-12p40およびIL-12p80に存在するp40には結合するがIL-12に存在するp40には結合しない抗体。 IL-12/23受容体相互作用。IL-12はIL-12Rβ1およびIL-12Rβ2に結合する。IL-23はIL-12Rβ1およびIL-23Rに結合する。IL-12p40はIL-12Rβ1に結合する。IL-12p80はIL-12Rβ1に結合する。図２．１）IL-12およびIL-23のサブユニット。図２．２）IL-12のIL-12Rβ2への結合を阻害する抗体。図２．３）IL-12のIL-12Rβ2への結合とIL-23のIL-23Rへの結合を阻害する抗体。 PMA204および抗体1は、ELISAにより測定した場合、用量依存の形でIL-12(A)、IL-23(B)、IL-12p40(C)およびIL-12p80(D)に結合する。 PMA204および抗体1は、IL-12のIL-12Rβ2への結合(A)とIL-23のIL-23Rへの結合(B)を中和する。 PMA204および抗体1は、IL-12のIL-12Rβ1への結合(A)とIL-12p80のIL-12Rβ1への結合(B)を阻害しない。 PMA204および抗体1は、IL-12p40のIL-12Rβ1への結合(A)とIL-23のIL-12Rβ1への結合(B)を阻害しない。 抗体1は、IL-12Rβ1が安定的にトランスフェクトされたされたJurkat細胞系統へのIL-12p40(A)、IL-12(B)、IL-23(C)の結合を阻害しない。陽性対照抗体202.1は、この細胞系統に対するIL-12p40、IL-12およびIL-23の結合を用量依存の形で阻害する。 抗体1は、IL-12Rβ1が安定的にトランスフェクトされたJurkat細胞系統に結合しているIL-12p40(A)、IL-12(B)およびIL-23(C)に結合して、複合体を形成する。陽性対照抗体202.1はそのような複合体を形成することができなかった。 様々な抗体のIL-12およびIL-23への結合を示しているELISAデータ。 異なるバンドパターンを示している、抗体1、3、4、7およびコンパレータ抗体のSDS-PAGEゲル。 NK-92細胞によるIL-12誘発IFN-γ放出の抑制を示しているPMA204、抗体1、抗体50、抗体68および抗体80。 様々な抗体のIL-12およびIL-23への結合を示しているELISAデータ。 様々な抗体のIL-12およびIL-23への結合を示しているELISAデータ。 抗体80および抗体136は、マウス脾細胞によるIL-23誘発IL-17分泌の抑制を示している。 様々な抗体のIL-12およびIL-23への結合を示しているELISAデータ。 様々な抗体のIL-12およびIL-23への結合を示しているELISAデータ。 抗体80および抗体136は、ヒトPBMCによるIL-12誘発IFN-γ放出の抑制を示している。 様々な抗体のIL-12およびIL-23への結合を示しているELISAデータ。 様々な抗体のIL-12およびIL-23への結合を示しているELISAデータ。 様々な抗体のIL-12およびIL-23への結合を示しているELISAデータ。 抗体136とPMA204は、IL-12(A)およびIL-23(B)への結合において競合することを示している競合SPR実験。 抗体136とPMA202は、IL-12(A)およびIL-23(B)への結合において競合しないことを示している競合SPR実験。 PMA204と抗体202.1は、IL-12またはIL-23への結合において競合しないことを示している競合ELISA実験。PMA204と抗体136は、IL-12およびIL-23への結合において競合する。 抗体80および抗体136は、試験された抗体の最高濃度で抑制を全く示さない抗体202.1と比べると、IL-12Rβ2に対するIL-12の結合(A)およびIL-23Rに対するIL-23の結合(B)を中和する。 PMA204と抗体1は、IL-12Rβ1に対するIL-12の結合(A)およびIL-12Rβ1に対するIL-23の結合(B)を中和しない。抗体202.1は、IL-12Rβ1に対するIL-12の結合(A)およびIL-12Rβ1に対するIL-23の結合(B)の用量依存阻害を示した。 様々なヒト化および親和性成熟抗体は、マウス脾細胞からのIL-23誘発IL-17放出を抑制した。親和性成熟ヒト化リード抗体の2種のグループ、すなわち抗体80に基づく抗体(A)と抗体136に基づく抗体(B)が示されている。 マウスへのIL-23皮内投与の6日後、マウスは乾癬に類似する皮膚炎症を発症する。A)アイソタイプ対照の投与は皮膚炎症を防止しなかったが、抗体80と抗体136は、より低い臨床スコアーにより証明されるようにこのモデルにおいて炎症を減少させた。B)組織学的レベルでは、6日間にわたるIL-23内皮投与後に表皮肥厚が生じる。抗体80と抗体136を用いた処置は、この表皮肥厚を寛解したが、アイソタイプ対照抗体を用いた処置では寛解しなかった。 様々なヒト化および親和性成熟抗体は、マウス脾細胞からのキメラIL-12誘発IFN-γ放出を抑制した。親和性成熟ヒト化リード抗体の2種のグループ、すなわち抗体80に基づく抗体(A)と抗体136に基づく抗体(B)が示されている。 キメラIL-12の反復注射を受けたマウスは、IFN-γの血清レベルを上昇させた。抗体80または抗体136を用いて処置すると、血清IFN-γのレベルは、アイソタイプ対照抗体を用いた処置と比べると減少した。 (A)抗体80は、サンドイッチELISAにおいて組換えIL-23を検出することができる。(B)抗体80は、サンドイッチELISAにおいて、SAC刺激PBMCにより産生される天然産生IL-23を検出することができる。 抗体80はIL-23WTタンパク質に強力に結合したが、ELISAによるIL-23突然変異体D265AとR266Aへの結合を減少させた。
本発明者らは、IL-12に対する抗体パネルを作製した。これらの抗体をスクリーニングするうちに、抗体の特定のサブセットが、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合し、IL-12Rβ2に対するIL-12の結合、およびIL-23Rに対するIL-23の結合は阻害するが、IL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しないことが判明したのは驚くべきことであった。したがって、IL-12およびIL-23の活性を、いまだかつて達成可能となったことのない形で改変することができた。
したがって、本発明は、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗原結合ドメインを含む抗体であって、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するヒトIL-12p40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を提供する。
好ましい実施形態では、該抗体は、ヒトIL-12および/またはヒトIL-23に対する結合について、PMA204の配列を有する重鎖可変領域(配列番号6)を含む抗体、および/またはPMA204の配列を有する軽鎖可変領域(配列番号7)を含む抗体と競合する。
本明細書で用いられる「競合する」とは、ELISAにより試験する場合、PMA204と同じ濃度で用いると、被験抗体が、IL-12、IL-23、またはIL-12p40に対するPMA204の結合を、少なくとも10%低下させることを意味する。
本発明は、IL-12およびIL-23中に存在するIL-12p40に結合し、配列番号1として列挙され、以下:
IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS
に与えられる配列を有する抗体またはその変異体を提供する。
好ましい実施形態では、抗体が結合するエピトープは、配列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)内に存在する。特に、抗体は、Asp 265においてヒトIL-12p40(配列番号1)に結合する。
別の態様では、本発明は、ヒトIL-23(配列番号66)に結合する抗原結合ドメインを含み、ヒトIL-23(配列番号66)に対するその結合レベルが、突然変異体であるIL-23 D265A(配列番号75)に対するその結合レベルを上回る抗体を提供する。
この抗体はまた、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するヒトIL-12p40にも結合することが可能であり、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない。
本発明は、IL-12Rβ2に対するIL-12の結合、およびIL-23Rに対するIL-23の結合を選択的に中和することにより、少なくとも1つのIL-12および/またはIL-23関連状態を治療するのに用いうる抗体を提供する。
本発明は、
CDRHC1: DYYX1H
[式中、X1=MまたはL];
CDRHC2: WIDPENGDTEX2APKFQG
[式中、X2=Y、H、またはS];
CDRHC3: X3KELRYFDV
[式中、X3=C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P、またはV]
から選択される3つの重鎖CDR配列を含む抗体を提供する。
本発明は、
CDRLC1: RAX4X5SISINLH
[式中、X4=SまたはP;
X5=QまたはR];
CDRLC2: FAX6QSX7S
[式中、X6=SまたはR;
X7=IまたはT];
CDRLC3: QQSNSX8PLT
[式中、X8=WまたはF]
から選択される3つの軽鎖CDR配列を含む抗体を提供する。
本発明は、
CDRHC1: DYYX1H
[式中、X1=MまたはL];
CDRHC2: WIDPENGDTEX2APKFQG
[式中、X2=Y、H、またはS];
CDRHC3: X3KELRYFDV
[式中、X3=C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P、またはV]
から選択される3つの重鎖CDR配列と;
CDRLC1: RAX4X5SISINLH
[式中、X4=SまたはP;
X5=QまたはR];
CDRLC2: FAX6QSX7S
[式中、X6=SまたはR;
X7=IまたはT];
CDRLC3: QQSNSX8PLT
[式中、X8=WまたはF]
から選択される3つの軽鎖CDR配列と
を含む抗体を提供する。
本発明は、以下の配列:
配列番号6、配列番号62、配列番号114、配列番号142、配列番号28、配列番号87、配列番号115、配列番号143、配列番号29、配列番号88、配列番号116、配列番号144、配列番号30、配列番号90、配列番号117、配列番号145、配列番号31、配列番号91、配列番号118、配列番号146、配列番号33、配列番号92、配列番号119、配列番号147、配列番号34、配列番号93、配列番号120、配列番号148、配列番号35、配列番号94、配列番号122、配列番号149、配列番号36、配列番号95、配列番号124、配列番号150、配列番号38、配列番号96、配列番号125、配列番号151、配列番号39、配列番号97、配列番号126、配列番号152、配列番号40、配列番号99、配列番号127、配列番号153、配列番号41、配列番号100、配列番号128、配列番号154、配列番号42、配列番号101、配列番号129、配列番号155、配列番号43、配列番号102、配列番号130、配列番号156、配列番号44、配列番号103、配列番号131、配列番号157、配列番号45、配列番号104、配列番号132、配列番号158、配列番号53、配列番号105、配列番号133、配列番号159、配列番号54、配列番号106、配列番号134、配列番号160、配列番号55、配列番号107、配列番号135、配列番号161、配列番号56、配列番号108、配列番号136、配列番号162、配列番号57、配列番号109、配列番号137、配列番号163、配列番号58、配列番号110、配列番号138、配列番号164、配列番号59、配列番号111、配列番号139、配列番号165、配列番号60、配列番号112、配列番号140、配列番号166、配列番号61、配列番号113、配列番号141および配列番号167
のうちの1つからなる免疫グロブリン重鎖可変領域を含む抗体を提供する。
本発明は、以下の配列:
配列番号7、配列番号169、配列番号181、配列番号193、配列番号32、配列番号170、配列番号182、配列番号194、配列番号37、配列番号171、配列番号183、配列番号195、配列番号42、配列番号172、配列番号184、配列番号196、配列番号46、配列番号173、配列番号185、配列番号197、配列番号47、配列番号174、配列番号186、配列番号198、配列番号48、配列番号175、配列番号187、配列番号199、配列番号49、配列番号176、配列番号188、配列番号200、配列番号50、配列番号177、配列番号189、配列番号201、配列番号51、配列番号178、配列番号190、配列番号52、配列番号179および配列番号192
のうちの1つからなる免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む抗体を提供する。
本発明は、ヒト重鎖アクセプターフレームワークをさらに含む抗体を提供する。特に、前記アクセプターフレームワークが、配列番号202、配列番号205、配列番号208、配列番号203、配列番号206、配列番号209、配列番号204、および配列番号207からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体を提供する。
本発明は、ヒト軽鎖アクセプターフレームワークをさらに含む抗体を提供する。特に、前記アクセプターフレームワークが、配列番号210、配列番号213、配列番号216、配列番号211、配列番号214、配列番号212、および配列番号215からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体を提供する。
本発明は、
配列番号6&配列番号7 配列番号115&配列番号190
配列番号6&配列番号169 配列番号115&配列番号192
配列番号28&配列番号179 配列番号115&配列番号193
配列番号29&配列番号179 配列番号115&配列番号194
配列番号30&配列番号179 配列番号115&配列番号195
配列番号31&配列番号32 配列番号115&配列番号196
配列番号33&配列番号179 配列番号115&配列番号197
配列番号34&配列番号51 配列番号115&配列番号198
配列番号34&配列番号47 配列番号115&配列番号199
配列番号35&配列番号179 配列番号115&配列番号200
配列番号36&配列番号37 配列番号115&配列番号201
配列番号38&配列番号179 配列番号116&配列番号173
配列番号38&配列番号51 配列番号116&配列番号174
配列番号38&配列番号32 配列番号116&配列番号175
配列番号38&配列番号47 配列番号116&配列番号176
配列番号38&配列番号52 配列番号116&配列番号177
配列番号39&配列番号179 配列番号117&配列番号173
配列番号40&配列番号179 配列番号117&配列番号174
配列番号41&配列番号42 配列番号117&配列番号175
配列番号43&配列番号179 配列番号117&配列番号176
配列番号44&配列番号179 配列番号117&配列番号177
配列番号44&配列番号51 配列番号118&配列番号178
配列番号44&配列番号32 配列番号118&配列番号179
配列番号44&配列番号47 配列番号119&配列番号178
配列番号44&配列番号52 配列番号119&配列番号179
配列番号45&配列番号179 配列番号119&配列番号51
配列番号45&配列番号179 配列番号119&配列番号189
配列番号53&配列番号41 配列番号119&配列番号46
配列番号54&配列番号179 配列番号119&配列番号47
配列番号55&配列番号179 配列番号119&配列番号48
配列番号56&配列番号179 配列番号119&配列番号49
配列番号57&配列番号179 配列番号119&配列番号50
配列番号58&配列番号42 配列番号119&配列番号51
配列番号59&配列番号179 配列番号119&配列番号52
配列番号60&配列番号179 配列番号120&配列番号178
配列番号61&配列番号42 配列番号120&配列番号179
配列番号62&配列番号42 配列番号122&配列番号176
配列番号87&配列番号7 配列番号124&配列番号176
配列番号88&配列番号7 配列番号125&配列番号176
配列番号90&配列番号7 配列番号126&配列番号176
配列番号91&配列番号7 配列番号127&配列番号176
配列番号92&配列番号7 配列番号128&配列番号176
配列番号93&配列番号7 配列番号129&配列番号176
配列番号94&配列番号7 配列番号130&配列番号176
配列番号95&配列番号7 配列番号131&配列番号176
配列番号96&配列番号7 配列番号132&配列番号176
配列番号97&配列番号7 配列番号133&配列番号176
配列番号99&配列番号7 配列番号134&配列番号176
配列番号100&配列番号7 配列番号135&配列番号176
配列番号101&配列番号7 配列番号136&配列番号176
配列番号102&配列番号7 配列番号137&配列番号176
配列番号103&配列番号7 配列番号138&配列番号176
配列番号104&配列番号7 配列番号139&配列番号176
配列番号105&配列番号7 配列番号140&配列番号176
配列番号106&配列番号171 配列番号141&配列番号176
配列番号106&配列番号172 配列番号142&配列番号176
配列番号107&配列番号171 配列番号143&配列番号176
配列番号107&配列番号172 配列番号144&配列番号176
配列番号108&配列番号171 配列番号145&配列番号176
配列番号108&配列番号172 配列番号146&配列番号176
配列番号109&配列番号170 配列番号147&配列番号176
配列番号110&配列番号171 配列番号148&配列番号176
配列番号111&配列番号172 配列番号149&配列番号176
配列番号112&配列番号169 配列番号150&配列番号176
配列番号113&配列番号173 配列番号151&配列番号176
配列番号113&配列番号174 配列番号152&配列番号176
配列番号113&配列番号175 配列番号153&配列番号189
配列番号113&配列番号176 配列番号154&配列番号189
配列番号113&配列番号177 配列番号155&配列番号189
配列番号113&配列番号176 配列番号156&配列番号189
配列番号114&配列番号173 配列番号157&配列番号189
配列番号114&配列番号174 配列番号158&配列番号189
配列番号114&配列番号175 配列番号159&配列番号189
配列番号114&配列番号176 配列番号160&配列番号189
配列番号114&配列番号177 配列番号161&配列番号189
配列番号115&配列番号173 配列番号161&配列番号179
配列番号115&配列番号174 配列番号162&配列番号189
配列番号115&配列番号175 配列番号162&配列番号179
配列番号115&配列番号176 配列番号163&配列番号189
配列番号115&配列番号177 配列番号163&配列番号179
配列番号115&配列番号181 配列番号164&配列番号189
配列番号115&配列番号182 配列番号164&配列番号179
配列番号115&配列番号183 配列番号165&配列番号189
配列番号115&配列番号184 配列番号165&配列番号179
配列番号115&配列番号185 配列番号166&配列番号189
配列番号115&配列番号186 配列番号166&配列番号179
配列番号115&配列番号187 配列番号167&配列番号189
配列番号115&配列番号188 配列番号167&配列番号179
配列番号115&配列番号189 配列番号168&配列番号189
からなる群から選択される2つの免疫グロブリン可変領域を含む抗体を提供する。
本発明は、前記ヒトアクセプターフレームワークが、CDRに隣接する残基、グリコシル化部位の残基、まれな残基、ヒトIL-12のp40サブユニットとの相互作用が可能な残基、CDRとの相互作用が可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基、およびChothiaによる定義のVHドメインのCDR1とKabatによる定義の第1の重鎖フレームワークとで重複する領域内の残基からなる群から選択される重要残基において、少なくとも1つのフレームワーク領域のアミノ酸置換を含む抗体を提供する。さらなる態様では、前記ヒトアクセプターフレームワークは、少なくとも1つのフレームワーク領域のアミノ酸置換を含み、該フレームワークのアミノ酸配列は、前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも65%同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも70のアミノ酸残基を含む。
本発明は、コンセンサスのヒトVHドメインである抗体を提供する。加えて、本発明は、コンセンサスのヒトVLドメインである抗体も提供する。
本発明は、前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも1つのフレームワーク領域のアミノ酸置換を含み、該フレームワークのアミノ酸配列が、前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも65%同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも70のアミノ酸残基を含む抗体を提供する。
本発明は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、およびIgAからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒト霊長動物の重鎖免疫グロブリン定常領域を含有する抗体に関する。
本発明は、カッパまたはラムダからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒト霊長動物の軽鎖免疫グロブリン定常領域を含有する抗体に関する。
本発明はまた、本発明の抗体を作製する方法であって、
(i)ヒトIL-12p40またはヒトIL-12p40の断片により動物を免疫化して、第1の抗体パネルを得るステップと;
(ii)該第1のパネルから、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第2の抗体パネルを形成するステップと;
(iii)該第2のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
を含む方法も提供する。
該方法はまた、ステップ(ii)において、配列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)を有するペプチドにもまた結合する抗体を選択するステップも含みうる。
本発明はまた、本発明の抗体を作製する別の方法であって、
(i)配列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)を有するペプチドにより動物を免疫化して、第1の抗体パネルを得るステップと;
(ii)該第1のパネルから、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第2の抗体パネルを形成するステップと;
(iii)該第2のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
を含む方法も提供する。
本発明はまた、本発明の抗体を作製するさらなる方法であって、
(i)ヒト抗体ディスプレイライブラリーを得て、第1の抗体パネルを形成するステップと;
(ii)該第1のパネルから、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第2の抗体パネルを形成するステップと;
(iii)該第2のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
を含む方法も提供する。
本発明は、本発明のVHドメインをコードする核酸分子を提供する。該核酸分子は、
配列番号217 配列番号254 配列番号282 配列番号310
配列番号218 配列番号255 配列番号283 配列番号311
配列番号219 配列番号257 配列番号284 配列番号312
配列番号220 配列番号258 配列番号285 配列番号313
配列番号222 配列番号259 配列番号286 配列番号314
配列番号223 配列番号260 配列番号287 配列番号315
配列番号224 配列番号261 配列番号289 配列番号316
配列番号225 配列番号262 配列番号291 配列番号317
配列番号227 配列番号263 配列番号292 配列番号318
配列番号228 配列番号264 配列番号293 配列番号319
配列番号229 配列番号266 配列番号294 配列番号320
配列番号230 配列番号267 配列番号295 配列番号321
配列番号232 配列番号268 配列番号296 配列番号322
配列番号233 配列番号269 配列番号297 配列番号323
配列番号234 配列番号270 配列番号298 配列番号324
配列番号242 配列番号271 配列番号299 配列番号325
配列番号243 配列番号272 配列番号300 配列番号326
配列番号244 配列番号273 配列番号301 配列番号327
配列番号245 配列番号274 配列番号302 配列番号328
配列番号246 配列番号275 配列番号303 配列番号329
配列番号247 配列番号276 配列番号304 配列番号330
配列番号248 配列番号277 配列番号305 配列番号331
配列番号249 配列番号278 配列番号306 配列番号332
配列番号250 配列番号279 配列番号307 配列番号333
配列番号251 配列番号280 配列番号308 配列番号334
配列番号252 配列番号281 配列番号309 配列番号335
から選択される配列を有することが好ましい。
本発明は、本発明のVLドメインをコードする核酸分子を提供する。該核酸分子は、
配列番号221 配列番号338 配列番号350 配列番号362
配列番号226 配列番号339 配列番号351 配列番号363
配列番号231 配列番号340 配列番号352 配列番号364
配列番号235 配列番号341 配列番号353 配列番号365
配列番号236 配列番号342 配列番号354 配列番号366
配列番号237 配列番号343 配列番号355 配列番号367
配列番号238 配列番号344 配列番号356 配列番号368
配列番号239 配列番号345 配列番号357 配列番号369
配列番号240 配列番号346 配列番号358 配列番号370
配列番号241 配列番号347 配列番号359
配列番号336 配列番号348 配列番号361
から選択される配列を有することが好ましい。
本発明はまた、対象における疾患を治療する方法であって、該対象に本発明の抗体を投与するステップを含み、該疾患が、関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、骨喪失、気道過敏症、慢性閉塞性肺疾患、脱髄障害、乾癬、多発性硬化症、皮膚過敏症、急性移植拒絶、慢性移植拒絶、同種移植片拒絶、移植片対宿主病、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性炎症性腸疾患、泌尿器系炎症性疾患、心血管疾患、血管炎、周期性発熱、グルコース代謝障害、肺疾患、癌、歯周炎、ヘルペス性間質性角膜炎、アレルギー、炎症性疼痛、脊椎関節症、敗血症、敗血症性ショックまたは内毒素性ショック、髄膜炎、外科手術による外傷、自己免疫性血液障害、アルツハイマー病、サルコイドーシス、肝硬変、肝炎(自己免疫性肝炎を含めた)、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、甲状腺炎、アテローム性動脈硬化、脱毛症、ウィルソン病、糸球体腎炎、および脂質異常症からなる群から選択される方法も提供する。
本発明は、治療有効量で投与された場合、細胞、組織、内臓、動物、もしくは患者において、かつ/または、当技術分野で知られ、かつ/もしくは本明細書で記載される、関連する疾患もしくは治療状態の前において、この後において、もしくはこの期間においてなどであるがこれに限定されない多くの異なる状況下における必要に応じて、少なくとも1つのIL-12疾患および/またはIL-23疾患の症状を調節するか、治療するか、または軽減する方法または組成物中における少なくとも1つの抗体、その特定の部分または変異体をさらに提供する。
本発明は、治療有効量で投与された場合、関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、若年性慢性関節炎、敗血症性関節炎、ライム病関節炎、乾癬性関節炎、反応性関節炎、脊髄関節炎、全身性エリテマトーデス、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、甲状腺炎、喘息、アレルギー性疾患、乾癬、皮膚炎、強皮症、移植片対宿主病、内臓移植拒絶、内臓移植と関連する急性または慢性の免疫疾患、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、播種性血管内凝固、川崎病、グレーブス病、ネフローゼ症候群、慢性疲労症候群、ウェゲナー肉芽腫症、ヘノッホ-シェーンライン紫斑、顕微鏡的腎血管炎、慢性活性肝炎、ブドウ膜炎、敗血症性ショック、毒性ショック、敗血症症候群、悪液質、感染性疾患、寄生虫症、後天性免疫不全症候群、急性横断性脊髄炎、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳卒中、原発性胆汁性肝硬変、溶血性貧血、悪性腫瘍、心不全、心筋梗塞、アジソン病、散発性多腺性欠損症I型および散発性多腺性欠損症II型、シュミット症候群、成人(急性)呼吸逼迫症候群、脱毛症、円形脱毛症、血清反応陰性関節症、関節症、ライター病、乾癬性関節症、潰瘍性大腸炎性関節症、腸疾患性滑膜炎、クラミジア属、エルシニア属、およびサルモネラ属に関連する関節症、脊椎関節症、アテローム性疾患/動脈硬化、アトピー性アレルギー、自己免疫性水胞性疾患、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、類天疱瘡、線状IgA病、自己免疫性溶血性貧血、クームス陽性溶血性貧血、後天性悪性貧血、若年性悪性貧血、筋痛性脳炎/ロイヤルフリー病、慢性粘膜皮膚カンジダ症、巨細胞性動脈炎、原発性硬化性肝炎、原因不明自己免疫性肝炎、後天性免疫不全疾患症候群、後天性免疫不全関連疾患、B型肝炎、C型肝炎、分類不能型免疫不全症(分類不能型低ガンマグロブリン血症)、拡張型心筋症、女性不妊症、卵巣不全症、若年性卵巣不全症、線維性肺疾患、特発性線維化性肺胞炎、炎症後間質性肺疾患、間質性肺炎、結合組織疾患に関連する間質性肺疾患、混合性結合組織疾患に関連する肺疾患、全身性硬化症に関連する間質性肺疾患、関節リウマチに関連する間質性肺疾患、全身性エリテマトーデスに関連する肺疾患、皮膚筋炎/多発性筋炎に関連する肺疾患、シェーグレン病に関連する肺疾患、強直性脊椎炎に関連する肺疾患、血管炎性びまん性肺疾患、ヘモジデリン沈着症に関連する肺疾患、薬物誘導性間質性肺疾患、線維症、放射線線維症、閉塞性細気管支炎、慢性好酸球性肺炎、リンパ球性浸潤性肺疾患、感染後間質性肺疾患、痛風性関節炎、自己免疫性肝炎、1型自己免疫性肝炎(古典的な自己免疫性肝炎またはルポイド肝炎)、2型自己免疫性肝炎(抗LKM抗体性肝炎)、自己免疫媒介型低脂血症、黒色表皮症を伴うB型インスリン抵抗症、副甲状腺機能低下症、臓器移植と関連する急性免疫疾患、臓器移植と関連する慢性免疫症、骨関節症、原発性硬化性胆管炎、1型乾癬、2型乾癬、特発性白血球減少症、自己免疫性好中球減少症、NOS性腎疾患、糸球体腎炎(glomerulonephritides)、顕微鏡的腎血管炎、ライム病、円板状エリテマトーデス、特発性男性不妊症またはNOS性男性不妊症、精子自己免疫、多発性硬化症(すべての亜型)、交感性眼炎、結合組織疾患二続発する肺性高血圧、グッドパスチャー症候群、結節性動脈炎の肺症状、急性リウマチ性発熱、リウマチ性脊椎炎、スティル病、全身性硬化症、シェーグレン症候群、高安病/高安動脈炎、自己免疫性血小板減少症、特発性血小板減少症、自己免疫性甲状腺疾患、甲状腺機能亢進症、甲状腺腫性自己免疫性甲状腺機能低下症(橋本病)、萎縮性自己免疫性甲状腺機能低下症、原発性粘液水腫、水晶体起因性ブドウ膜炎、原発性血管炎、白斑、急性肝疾患、慢性肝疾患、アルコール性肝硬変、アルコール誘導性肝傷害、胆汁鬱滞、特異性肝疾患、薬物誘導性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、アレルギーおよび喘息、B群連鎖球菌(GBS)感染症、精神疾患(例えば、鬱病および統合失調症)、TH2型媒介疾患およびTH1型媒介疾患、急性疼痛および慢性疼痛(疼痛の多様な形態)、ならびに肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、精巣癌、および直腸癌、および造血器悪性腫瘍(白血病およびリンパ腫)などの癌、無ベータリポタンパク質血症、肢端チアノーゼ、急性寄生過程および慢性寄生過程または急性感染過程および慢性感染過程、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、急性細菌感染または慢性細菌感染、急性膵臓炎、急性腎不全、腺癌、異所性心房拍、AIDS認知症候群、アルコール誘導性肝炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性接触皮膚炎、アレルギー性鼻炎、同種移植拒絶、アルフ
ァ1アンチトリプシン欠損症、筋萎縮性側索硬化症、貧血、狭心症、前角細胞変性、抗cd3抗体療法、抗リン脂質症候群、抗受容体抗体過敏反応、大動脈瘤および末梢動脈瘤、大動脈解離、動脈性高血圧、動脈硬化、動静脈瘻、運動失調、心房細動(持続性または発作性)、心房粗動、房室ブロック、B細胞リンパ腫、骨移植片拒絶、骨髄移植(BMT)拒絶、脚ブロック、バーキットリンパ腫、火傷、心臓不整脈、心臓性失神症候群、心臓腫瘍、心筋症、心肺バイパス炎症反応、軟骨移植拒絶、小脳皮質変性症、小脳障害、多源性(chaoticまたはmultifocal)心房性頻脈、化学療法関連障害、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性アルコール依存症、慢性炎症性病態、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、慢性サリチル酸中毒、結腸直腸癌、鬱血性心不全、結膜炎、接触皮膚炎、肺性心、冠動脈疾患、クロイツフェルト-ヤコブ病、培養陰性敗血症、嚢胞性線維症、サイトカイン療法関連障害、ボクサー認知症、脱髄疾患、出血性デング熱、皮膚炎、皮膚状態、糖尿病、真性糖尿病、糖尿病性動脈硬化性疾患、びまん性レビー小体病、拡張型鬱血性心筋症、大脳基底核障害、中年におけるダウン症候群、CNSドーパミン受容体を遮断する薬物により誘導される薬物誘導性運動障害、薬物過敏、湿疹、脳脊髄炎、心内膜炎、内分泌障害、喉頭蓋炎、エプスタイン-バーウイルス感染、肢端紅痛症、錐体外路障害および小脳障害、家族性血球貪食リンパ組織球症、胎児胸腺移植拒絶、フリードライヒ運動失調症、末梢動脈機能障害、真菌性敗血症、ガス壊疽、胃潰瘍、糸球体腎炎(glomerular nephritis)、任意の臓器または組織の移植片拒絶、グラム陰性敗血症、グラム陽性敗血症、細胞内生物による肉芽腫、有毛細胞白血病、ハレルフォルデン-シュパッツ病、橋本甲状腺炎、花粉症、心臓移植拒絶、血色素沈着症、血液透析、溶血性尿毒症症候群/血栓性血小板減少性紫斑病、出血、肝炎(A)、His束不整脈、EQV感染/HIV神経障害、ホジキン病、運動亢進性運動障害、過敏反応、過敏性肺炎、高血圧、運動低下性運動障害、視床下部-下垂体-副腎皮質評価、特発性アジソン病、特発性肺線維症、抗体媒介性細胞傷害作用、無力症、小児性脊髄性筋萎縮症、大動脈炎、A型インフルエンザ、イオン化放射線曝露、虹彩毛様体炎/ブ
ドウ膜炎/視神経炎、虚血-再灌流傷害、虚血性脳卒中、若年性関節リウマチ、若年性脊髄性筋委縮症、カポジ肉腫、腎移植拒絶、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、皮質脊髄系の病変、脂肪性浮腫、肝移植拒絶、リンパ浮腫、マラリア、悪性リンパ腫、悪性組織球増殖症、悪性黒色腫、髄膜炎、髄膜炎菌血症、代謝性/特発性疾患、偏頭痛、多系統ミトコンドリア障害、混合性結合組織疾患、単クローン性ガンマグロブリン血症、多発性骨髄腫、多系統変性症(メンツェル症候群、デジュリーヌ-トーマス症候群、シャイ-ドレーガー症候群、およびマカド-ジョセフ症候群)、重症筋無力症、マイコバクテリウム・アビウム・イントラセルラーレ症、結核、骨髄異形成症候群、心筋梗塞、心筋虚血障害、鼻咽頭癌、新生児慢性肺疾患、腎炎、ネフローゼ、神経変性疾患、神経性I型筋委縮症、好中球減少性発熱、非ホジキンリンパ腫、腹部大動脈およびその分枝の閉塞、閉塞性動脈障害、okt3療法、睾丸炎/副睾丸炎、睾丸炎/精管切除反転術、臓器肥大、骨粗鬆症、膵臓移植拒絶、膵臓癌、新生物随伴性症候群/悪性腫瘍による高カルシウム血症、副甲状腺移植拒絶、骨盤内炎症性疾患、通年性鼻炎、心膜疾患、末梢性アテローム性動脈硬化性疾患、末梢血管障害、腹膜炎、致死性貧血、カリニ肺炎、肺炎、ポエムス症候群(多発性神経障害、臓器肥大、内分泌障害、単クローン性ガンマグロブリン血症、および皮膚病変による症候群)、灌流後症候群、ポストポンプ症候群(post pump syndrome)、心筋梗塞後心臓切開術症候群、子癇前症、進行性核上性麻痺、原発性肺性高血圧、放射線療法、レイノー現象およびレイノー病、レフサム病、QRS間隔が等しく狭い頻脈(regular narrow QRS tachycardia)、腎血管性高血圧、再灌流傷害、拘束型心筋症、肉腫、強皮症、老年舞踏病、レビー小体型老年性認知症、血清反応陰性関節症、ショック、鎌状赤血球貧血、皮膚異種移植拒絶、皮膚病変症候群、小腸移植拒絶、充実性腫瘍、特異的不整脈(specific arrhythmias)、脊髄性運動失調、脊髄小脳変性、連鎖球菌性筋炎、小脳の構造的病変、亜急性硬化性汎脳炎、失神、心血管系の梅毒、全身性アナフィラキシー、全身性炎症反応症候群、全身型若年性関節リウマチ、T細胞性ALLまたはFAB分類によるALL、
末梢血管拡張症、閉塞性血栓性血管炎、血小板減少症、毒性、移植、外傷/出血、M型過敏反応、IV型過敏、不安定狭心症、尿毒、尿路性敗血症、じん麻疹、心弁疾患、静脈瘤、血管炎、静脈疾患、静脈血栓症、心室細動、ウイルス感染および真菌感染、ウイルス性脳炎/ウイルス性髄膜炎、ウイルス関連血球貪食症候群、ウェルニッケ-コルサコフ症候群、ウィルソン病、任意の臓器または組織の異種移植拒絶などであるがこれらに限定されない免疫性障害、神経性障害、および関連障害の症状を調節するか、治療するか、または軽減する方法または組成物中における少なくとも1つの抗体、その特定の部分または変異体をさらに提供する。
本発明の範囲内には、アフィニティー成熟させた抗IL-12/IL-23抗体が包含される。
当技術分野では、抗体のアフィニティー成熟について、多数の方法が知られている。これらのうちの多くは、突然変異誘発の後、アフィニティーの改善についての選択および/またはスクリーニングを行うことにより、変異体タンパク質のパネルまたはライブラリーを作製する一般的な戦略に基づく。突然変異誘発は、例えば、エラープローンPCR (Thie 2009)、遺伝子シャフリング(Kolkman 2001)、突然変異誘発性の化学物質または放射線照射の使用、エラープローン複製機構を伴う「突然変異体」株の使用(Greener 1996)、または天然のアフィニティー成熟機構を用いる体細胞超変異(Peled 2008)により、DNAレベルで実施されることが多い。突然変異誘発はまた、例えば、Qβレプリカーゼ(Kopsidas 2006)を用いることにより、RNAレベルでも実施することができる。変異体タンパク質の改善についてのスクリーニングを可能とするライブラリーベースの方法は、ファージ、酵母、リボソーム、細菌細胞、または哺乳動物細胞など、各種のディスプレイ法に基づくことが可能であり、当技術分野でよく知られている(Benhar 2007)。アフィニティー成熟は、例えば、部位指向突然変異誘発、または3Dタンパク質モデリングからの知見により誘導される遺伝子合成(例えば、Queen 1989; または米国特許第6,180,370号; もしくは同第5,225,539号を参照されたい)を介する、より指向的/予測的方法により達成することができる。
したがって、本発明は、ヒトIL-12p40に結合する抗原結合ドメインを作製する方法であって、
a. 親VHドメインのHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、上記で定義されたCDRのセットである、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む親VHドメインのアミノ酸配列中における1または複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、該親VHドメインのアミノ酸配列変異体であるVHドメインを提供し、また、場合によって、このようにして提供された該VHドメインを、1または複数のVLドメインと組み合わせて、1または複数のVH/VLの組合せを提供するステップと;
b. 該親VHドメインのアミノ酸配列変異体である前記VHドメイン、または該1もしくは複数のVH/VLの組合せを試験して、ヒトIL-12p40に対する抗体抗原結合ドメインを同定するステップと
を含む方法を提供する。
該親VHドメインは、配列番号6、配列番号62、配列番号114、配列番号142、配列番号28、配列番号87、配列番号115、配列番号143、配列番号29、配列番号88、配列番号116、配列番号144、配列番号30、配列番号90、配列番号117、配列番号145、配列番号31、配列番号91、配列番号118、配列番号146、配列番号33、配列番号92、配列番号119、配列番号147、配列番号34、配列番号93、配列番号120、配列番号148、配列番号35、配列番号94、配列番号122、配列番号149、配列番号36、配列番号95、配列番号124、配列番号150、配列番号38、配列番号96、配列番号125、配列番号151、配列番号39、配列番号97、配列番号126、配列番号152、配列番号40、配列番号99、配列番号127、配列番号153、配列番号41、配列番号100、配列番号128、配列番号154、配列番号42、配列番号101、配列番号129、配列番号155、配列番号43、配列番号102、配列番号130、配列番号156、配列番号44、配列番号103、配列番号131、配列番号157、配列番号45、配列番号104、配列番号132、配列番号158、配列番号53、配列番号105、配列番号133、配列番号159、配列番号54、配列番号106、配列番号134、配列番号160、配列番号55、配列番号107、配列番号135、配列番号161、配列番号56、配列番号108、配列番号136、配列番号162、配列番号57、配列番号109、配列番号137、配列番号163、配列番号58、配列番号110、配列番号138、配列番号164、配列番号59、配列番号111、配列番号139、配列番号165、配列番号60、配列番号112、配列番号140、配列番号166、配列番号61、配列番号113、配列番号141または配列番号167において示されるVHドメインアミノ酸配列を有することが好ましい。
該親VHドメインのアミノ酸配列変異体であるVHドメインは、CDRにおける突然変異誘発により提供することができる。
この方法では、親VLドメインのLCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、上記で定義されたCDRのVLセットである、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む親VLドメインのアミノ酸配列中における1または複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、1または複数のVLドメインが提供され、これにより、それらの各々が、該親VLドメインのアミノ酸配列変異体である、1または複数のVLドメインが作製される。
該親VLドメインは、配列番号7、配列番号169、配列番号181、配列番号193、配列番号32、配列番号170、配列番号182、配列番号194、配列番号37、配列番号171、配列番号183、配列番号195、配列番号42、配列番号172、配列番号184、配列番号196、配列番号46、配列番号173、配列番号185、配列番号197、配列番号47、配列番号174、配列番号186、配列番号198、配列番号48、配列番号175、配列番号187、配列番号199、配列番号49、配列番号176、配列番号188、配列番号200、配列番号50、配列番号177、配列番号189、配列番号201、配列番号51、配列番号178、配列番号190、配列番号52、配列番号179または配列番号192において示されるVLドメインアミノ酸配列を有することが好ましい。
該親VLドメインのアミノ酸配列変異体であるVLドメインは、CDRにおける突然変異誘発により提供することができる。
抗体抗原結合ドメインは、IgG抗体分子、scFv抗体分子、またはFab抗体分子のコンポーネントとして提供することができる。
本発明はまた、ヒトIL-12p40に結合する抗原結合ドメインを作製する方法であって、
a. VHドメインをコードする出発核酸、または、各々が配列番号6、配列番号62、配列番号114、配列番号142、配列番号28、配列番号87、配列番号115、配列番号143、配列番号29、配列番号88、配列番号116、配列番号144、配列番号30、配列番号90、配列番号117、配列番号145、配列番号31、配列番号91、配列番号118、配列番号146、配列番号33、配列番号92、配列番号119、配列番号147、配列番号34、配列番号93、配列番号120、配列番号148、配列番号35、配列番号94、配列番号122、配列番号149、配列番号36、配列番号95、配列番号124、配列番号150、配列番号38、配列番号96、配列番号125、配列番号151、配列番号39、配列番号97、配列番号126、配列番号152、配列番号40、配列番号99、配列番号127、配列番号153、配列番号41、配列番号100、配列番号128、配列番号154、配列番号42、配列番号101、配列番号129、配列番号155、配列番号43、配列番号102、配列番号130、配列番号156、配列番号44、配列番号103、配列番号131、配列番号157、配列番号45、配列番号104、配列番号132、配列番号158、配列番号53、配列番号105、配列番号133、配列番号159、配列番号54、配列番号106、配列番号134、配列番号160、配列番号55、配列番号107、配列番号135、配列番号161、配列番号56、配列番号108、配列番号136、配列番号162、配列番号57、配列番号109、配列番号137、配列番号163、配列番号58、配列番号110、配列番号138、配列番号164、配列番号59、配列番号111、配列番号139、配列番号165、配列番号60、配列番号112、配列番号140、配列番号166、配列番号61、配列番号113、配列番号141および配列番号167からなる群から選択されるVHドメインをコードする出発核酸レパートリーを提供するステップと;
b. それが該出発核酸または出発レパートリーにおけるVHドメイン内へと挿入され、VHドメインをコードする核酸産物レパートリーをもたらすように、アミノ酸配列の突然変異をコードするか、またはこれにより生成される1または複数のドナー核酸と、前記出発核酸または出発レパートリーを組み合わせ、該産物レパートリーの核酸を発現させて、産物であるVHドメインをもたらすステップと;
c. 場合によって、前記産物であるVHドメインを、1または複数のVLドメインと組み合わせるステップと;
d. ヒトIL-12p40に対する抗原結合ドメインを選択するステップと;
e. 産物であるVHドメイン、また場合によってVLドメインを含む前記抗原結合ドメイン、またはそれをコードする核酸を回収するステップと
を含む方法も提供する。
本発明はまた、ヒトIL-12p40に結合する抗原結合ドメインを作製する方法であって、
a. VLドメインをコードする出発核酸、または、各々が配列番号7、配列番号169、配列番号181、配列番号193、配列番号32、配列番号170、配列番号182、配列番号194、配列番号37、配列番号171、配列番号183、配列番号195、配列番号42、配列番号172、配列番号184、配列番号196、配列番号46、配列番号173、配列番号185、配列番号197、配列番号47、配列番号174、配列番号186、配列番号198、配列番号48、配列番号175、配列番号187、配列番号199、配列番号49、配列番号176、配列番号188、配列番号200、配列番号50、配列番号177、配列番号189、配列番号201、配列番号51、配列番号178、配列番号190、配列番号52、配列番号179および配列番号192からなる群から選択されるVLドメインをコードする出発核酸レパートリーを提供するステップと;
b. それが該出発核酸または出発レパートリーにおけるVLドメイン内へと挿入され、VLドメインをコードする核酸産物レパートリーをもたらすように、アミノ酸配列の突然変異をコードするか、またはこれにより生成される1または複数のドナー核酸と、前記出発核酸または出発レパートリーを組み合わせ、該産物レパートリーの核酸を発現させて、産物であるVLドメインをもたらすステップと;
c. 場合によって、前記産物であるVLドメインを、1または複数のVHドメインと組み合わせるステップと;
d. ヒトIL-12p40に対する抗原結合ドメインを選択するステップと;
e. 産物であるVLドメイン、また場合によってVHドメインを含む前記抗原結合ドメイン、またはそれをコードする核酸を回収するステップと
を含む方法も提供する。
これらの方法において、ドナー核酸は、前記HCDRIおよび/またはHCDR2および/またはHCDR3の突然変異により作製することができる。該ドナー核酸はまた、核酸のランダム突然変異により作製することもできる。
本発明の抗体は、当技術分野でよく知られている広範な抗体分子から選択することができる。特定の実施形態では、抗体は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体(mAb)、キメラ抗体、CDR移植抗体、ヒト化抗体、Synhumanised抗体、霊長動物化抗体、ドメイン抗体、ラクダ科動物由来抗体断片、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv、ジスルフィド結合により連結されたFv、ダイアボディ、多価抗体、二重特異性抗体(dual specific antibody)、二重特異性抗体(bispecific antibody)、免疫グロブリン定常領域結合ドメイン、および抗原結合ドメインが移植されたタンパク質足場(Qiuら、2007年、Nat Biotechnol 25、921〜9頁において例示される)、ならびにこれらの変異体からなる群から選択される。本発明はまた、当技術分野で知られているものと組み合わせて本明細書で説明され、また本明細書で可能とされる、抗体組成物、抗体をコードする核酸および相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、製剤、デバイス、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、ならびにこれらを作製および使用する方法にも拡張される。
本発明は、少なくとも1つの特定の配列、ドメイン、部分、またはこれらの変異体を含む、特定の抗体またはこれらの変異体をコードするポリヌクレオチドを含むか、これに相補的であるか、またはこれにハイブリダイズする単離核酸分子を提供する。本発明は、前記抗体に由来する核酸分子を含む組換えベクター、このような核酸および/または組換えベクターを含有する宿主細胞のほか、このような抗体核酸、ベクター、および/または宿主細胞を作製および/または使用する方法も提供する。
本発明はまた、(a)本明細書に記載の、単離抗体、その特定部分もしくは変異体をコードする核酸、および/または抗体と; (b)適切な担体または希釈剤とを含む、少なくとも1つの組成物も提供する。担体または希釈剤は、場合によって、既知の方法に従い、薬学的に許容されるものでありうる。組成物は、場合によって、少なくとも1つの他の化合物、タンパク質、または組成物をさらに含みうる。
本発明はまた、宿主細胞内において抗体またはそれらの変異体を発現させる少なくとも1つの方法であって、該抗体またはその変異体が回収可能な量で発現する条件下において、本明細書で説明され、かつ/または当技術分野で知られる宿主細胞を培養するステップを含む方法も提供する。
本発明は、少なくとも1つの抗体をコードする核酸であって、抗体をコードする核酸に厳密な条件下でハイブリダイズするか、またはこれに対して少なくとも95%の同一性を有する核酸を提供する。本発明は、このような核酸によりコードされる単離抗体をさらに提供する。本発明は、このような核酸を含む抗体ベクターであって、場合によって、後期SV40プロモーターまたは初期SV40プロモーター、CMVプロモーター、HSV tkプロモーター、pgkプロモーター、ヒト免疫グロブリンプロモーター、およびEF-1αプロモーターからなる群から選択される少なくとも1つのプロモーターをさらに含むベクターをさらに提供する。このようなベクターは、場合によって、メトトレキサート(MTX)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、緑色蛍光タンパク質(GFP)、ネオマイシン(G418)、またはグルタミンシンターゼ(GS)のうちの少なくとも1つから選択される、少なくとも1つの選択遺伝子またはその部分をさらに含みうる。本発明は、場合によって、このような単離核酸を含む哺乳動物細胞をさらに含み、前記宿主は、COS-1細胞、COS-7細胞、HEK293細胞、BHK21細胞、CHO細胞、BSC-1細胞、HwpG2細胞、PerCP細胞、653細胞、SP2/0細胞、293細胞、HeLa細胞、骨髄腫細胞、もしくはリンパ腫細胞、またはこれらの任意の派生細胞、不死化細胞、もしくは形質転換細胞から選択される少なくとも1つの宿主である。
本発明はまた、場合によって、少なくとも1つの抗体、および薬学的に許容される担体もしくは希釈剤をさらに含み、かつ/またはTNFアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋弛緩剤、催眠剤、非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断剤、抗菌剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、IL-23剤、IL-12剤、ミネラル、栄養剤、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉剤、鎮咳剤、制吐剤、抗潰瘍剤、下剤、抗凝血剤、エリスロポエチン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、免疫化剤、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、エストロゲン受容体調節剤、散瞳剤、毛様体筋麻痺剤、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬、抗うつ剤、抗躁剤、抗精神病剤、精神安定剤、睡眠剤、交感神経様作用剤、刺激剤、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼアルファ、サイトカイン、およびサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つの化合物もしくはタンパク質をさらに含む、少なくとも1つの抗体組成物を作製する少なくとも1つの方法も提供する。
本発明はまた、細胞、組織、内臓、または動物におけるIL-12/23状態を治療する少なくとも1つの方法であって、場合によって、免疫関連状態または感染関連状態を調節する、有効量の、少なくとも1つの抗体を、前記細胞、組織、内臓、または動物と接触させるか、またはこれに投与するステップを含み、前記動物が霊長動物、場合によって、サルまたはヒトである方法も提供する。該方法は、場合によって、前記有効量が、前記細胞、組織、内臓、または動物1kg当たり約0.001〜100mgである方法をさらに包含しうる。このような方法は、前記接触させるステップまたは前記投与するステップが、静脈内方式、筋肉内方式、ボーラス方式、腹腔内方式、皮下(subcutaneous)方式、呼吸器内方式、吸入方式、局所方式、経鼻方式、膣内方式、直腸内方式、口腔内方式、舌下方式、鼻腔内方式、皮下(subdermal)方式、および経皮方式から選択される少なくとも1つの方式を介する方法をさらに含みうる。このような方法は、前記接触させるステップまたは投与するステップの前において、これと同時に、またはこの後において、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋弛緩剤、催眠剤、非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断剤、抗菌剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、IL-23剤、IL-12剤、ミネラル、栄養剤、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉剤、鎮咳剤、制吐剤、抗潰瘍剤、下剤、抗凝血剤、エリスロポエチン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、免疫化剤、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、エストロゲン受容体調節剤、散瞳剤、毛様体筋麻痺剤、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬、抗うつ剤、抗躁剤、抗精神病剤、精神安定剤、睡眠剤、交感神経様作用剤、刺激剤、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼアルファ、サイトカイン、およびサイトカインアンタゴニストのうちの少なくとも1つから選択される、治療有効量の、少なくとも1つの化合物またはタンパク質を含む、少なくとも1つの組成物を投与するステップをさらに含みうる。
本発明はまた、場合によって、少なくとも1つの抗体、また、滅菌水、滅菌緩衝水、または水性希釈剤中におけるフェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、もしくはこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも1つの防腐剤から選択される少なくとも1つの調合剤を含み、該タンパク質濃度が、約0.1mg/ml〜約100mg/mlであり、少なくとも1つの等張剤または少なくとも1つの生理学的に許容される緩衝剤をさらに含む、少なくとも1つの製剤も包含する。
本発明はまた、ヒト医薬に用いられる少なくとも1つの製品であって、本発明の少なくとも1つの抗体の溶液形態または凍結乾燥形態を含む包装材料および容器を含み、場合によってさらに、前記容器が、複数回投与に用いる栓を有するガラス容器またはプラスチック容器であり、場合によってさらに、前記容器が、穿刺して、静脈内投与、筋肉内投与、ボーラス投与、腹腔内投与、皮下(subcutaneous)投与、局所投与、呼吸器内投与、吸入投与、経鼻投与、膣内投与、直腸投与、頬側投与、舌下投与、鼻腔内投与、皮下(subdermal)投与、または経皮投与に用いることが可能なブリスター包装であり; 前記容器が、静脈内送達デバイスもしくは送達系、筋肉内送達デバイスもしくは送達系、ボーラス送達デバイスもしくは送達系、腹腔内送達デバイスもしくは送達系、皮下(subcutaneous)送達デバイスもしくは送達系、呼吸器内送達デバイスもしくは送達系、吸入送達デバイスもしくは送達系、経鼻送達デバイスもしくは送達系、膣内送達デバイスもしくは送達系、局所送達デバイスもしくは送達系、直腸送達デバイスもしくは送達系、頬側送達デバイスもしくは送達系、舌下送達デバイスもしくは送達系、鼻腔内送達デバイスもしくは送達系、皮下(subdermal)送達デバイスもしくは送達系、または経皮送達デバイスもしくは送達系のコンポーネントであり; 前記容器が、静脈内送達、筋肉内送達、ボーラス送達、腹腔内送達、皮下(subcutaneous)送達、呼吸器内送達、吸入送達、経鼻送達、膣内送達、局所送達、直腸送達、頬側送達、舌下送達、鼻腔内送達、皮下(subdermal)送達、または経皮送達用の注射器またはペン型注射デバイスもしくはペン型注射システムのコンポーネントである製品も提供する。
本発明はまた、本発明の少なくとも1つの抗体を作製する少なくとも方法であって、前記ヒト抗体を回収可能な量で発現することが可能な宿主細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、または植物細胞を供給するステップを含み、場合によってさらに、前記宿主細胞が、哺乳動物細胞、植物細胞、または酵母細胞であり; 前記トランスジェニック動物が、哺乳動物であり; 前記トランスジェニック哺乳動物が、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ウマ、および非ヒト霊長動物から選択される方法も提供する。
本発明は、少なくとも1つのIL-12/23を介する障害を治療する少なくとも1つの方法であって、(a)このような調節、治療、または療法を必要とする細胞、組織、内臓、動物、または患者に、少なくとも1つの結合タンパク質を含む、有効量の組成物または医薬組成物を投与するステップ; ならびに(b)上記(a)における前記投与するステップの前において、これと同時に、および/またはこの後において、免疫関連治療薬、TNFアンタゴニスト、抗リウマチ剤、筋弛緩剤、催眠剤、非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断剤、抗菌剤、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、神経作用剤（neurological agent）、ミネラル、栄養剤、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉剤、鎮咳剤、制吐剤、抗潰瘍剤、下剤、抗凝血剤、エリスロポエチン、フィルグラスチム、サルグラモスチム、免疫化剤、免疫グロブリン、免疫抑制剤、成長ホルモン、ホルモン置換薬、エストロゲン受容体調節剤、散瞳剤、毛様体筋麻痺剤、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬、抗うつ剤、抗躁剤、抗精神病剤、精神安定剤、睡眠剤、交感神経様作用剤、刺激剤、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンまたは類似体、ドルナーゼアルファ、サイトカイン、およびサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つをさらに投与するステップのうちの少なくとも1つを含む方法をさらに提供する。
IL-12p40は、タンパク質であるIL-12およびIL-23中に存在し、単量体であるIL-12p40およびホモ二量体であるIL-12p80として存在する。本発明は、IL-12、IL-23、IL-12p40、IL-12p80に結合し、IL-12p40サブユニットを含有する、新規に発見される任意のタンパク質に結合する可能性が高い抗体に関する。該抗体は、IL-12p40に特異的に結合するが、IL-12p35またはIL-23p19には結合しない。本発明は、治療的使用を含め、このような抗体の組成物、製剤、このような抗体による方法、デバイス、また、このような抗体の使用をさらに提供する。
一実施形態では、抗体は、p40/p35間のインターフェースでIL-12に結合すると考えられるIL-12Rβ2に対して、IL-12を中和することが可能である。別の実施形態では、抗体は、p19/p40間のインターフェースにおける相互作用を介する可能性が高いと考えられる、IL-23Rに対するIL-23の結合を阻害することが可能である。さらなる実施形態では、抗体は、IL-12Rβ2に対するIL-12の結合、およびIL-23Rに対するIL-23の結合を阻害することが可能である。p35またはp19とのインターフェースに近接する位置でIL-12p40に結合することにより、抗体は、IL-12および/またはIL-23に対する関連受容体の結合を阻害している。
本発明は、IL-12p40/80の両方に結合するが、IL-12Rβ1に対するIL-12p40またはIL-12p80の結合は中和しない抗体に関する。抗体の存在下においてもやはり、IL-12Rβ1に対するこれらのタンパク質の結合が自由なので、やはり、IL-12p40/80サブユニットを介してIL-12系またはIL-23系の調節を達成することができる。以下の作用機構の利点は、これが、IL-12系およびIL-23系に対する天然の調節物質(IL-12p40/80)に、これもまたIL-12およびIL-23のアンタゴニストとして作用する抗体と共に競合し続けることを可能にすることである。したがって、この作用機構によれば、二重のアンタゴニスト系を確立することが可能であろうし、これにより、治療剤として用いる場合、抗体の有効性はより大きくなるであろう。IL-12p40/80の生物学的機能を阻害しない抗体を用いると、潜在的な安全性プロファイルもまた改善される。IL-12p40/80は近年、アンタゴニストとして用いられ、IL-12/IL-23経路を調節することに加え、多岐にわたる役割を果たすことが示されている。抗体は、IL-12p40/80が、マクロファージに対する化学遊走物質として、また、病原体の侵襲に応答するDCの遊走に対する誘導因子として作用することを阻止しない。これによれば、治療剤として投与された場合、抗体の安全性プロファイルは改善されうるであろう。
本明細書の以下で言及されるすべての科学的引用文献、特許、特許出願、および製造元による技術仕様は、それらの全体において、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書の全体において、文脈から別段に要請されない限り、「含む(comprise)」という語、または「含む(comprises)」もしくは「含む(comprising)」などの変化形は、言及される要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の包含を示唆するものであり、他の任意の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の除外を示唆するものではないことが理解される。
製剤成分、製造方法、投与レジメンなどは変化しうるので、別段に指示しない限り、本発明は、特定の製剤成分、製造方法、投与レジメンに限定されないことを理解されたい。
対象の明細書で用いられる単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その(the)」は、文脈から別段に指示されることが明らかでない限り、複数形の態様を包含する。したがって、例えば、「ある(a)」に対する言及は、単数形のほか2以上も包含し、「ある(an)」に対する言及は、単数形のほか2以上も包含し、「その(the)」に対する言及は、単数形のほか2以上も包含するなどである。
本明細書で用いられる「ポリペプチド」という用語は、任意のアミノ酸ポリマー鎖を指す。「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、ポリペプチドという用語と互換的に用いられ、これもまた、アミノ酸のポリマー鎖を指す。「ポリペプチド」という用語は、天然または人工のタンパク質、タンパク質断片、また、タンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体の場合もあり、多量体の場合もある。
「単離タンパク質」または「単離ポリペプチド」という用語は、その天然状態においては、その誘導の由来もしくは供給源のためにそれに付随する、天然における関連成分とは関連しないタンパク質もしくはポリペプチド; 同じ種に由来する他のタンパク質を実質的に含まないタンパク質またはポリペプチド; 異なる種に由来する細胞により発現されるタンパク質もしくはポリペプチド; または天然ではないタンパク質もしくはポリペプチドである。したがって、天然においてそれが由来する細胞とは異なる細胞系において化学合成または合成されるポリペプチドは、その天然における関連成分から「単離」される。タンパク質はまた、当技術分野でよく知られるタンパク質精製法を用いる単離により、天然における関連成分を実質的に含まないようにすることもできる。本明細書で用いられる「回収」という用語は、例えば、当技術分野でよく知られるタンパク質精製法を用いる単離により、ポリペプチドなどの化学種が、天然における関連成分を実質的に含まないようにする過程を指す。
本明細書で用いられる「ヒトIL-12」という用語(本明細書では、hIL-12またはIL-12と略記する)は、主に、単球、マクロファージ、および樹状細胞などの抗原提示細胞により分泌されるヒトサイトカインを包含する。該用語は、ジスルフィド架橋によりいずれもが一体に連結された、35kDのサブユニット(p35)および40kDのサブユニット(p40)を含むヘテロ二量体タンパク質を包含する。該ヘテロ二量体タンパク質を「p70タンパク質」と称する。ヒトIL-12という用語には、標準的な組換え発現法により調製しうる、組換えヒトIL-12(rhIL-12)が含まれることを意図する。IL-12は、最も新しいメンバーが、IL-12p35サブユニットを共有するIL-35である、インターロイキンファミリーに属する(Niedbalaら、2007年、Eur J Immunol 37、3021〜9頁)。近年におけるIL-35の発見は、IL-12p40およびIL-12p35のいずれについても、まだ発見されていないより多くの形態が存在する可能性が高いことを示す。本明細書に記載の抗体ならば、IL-12p40の形態を含有する、新たに発見されるすべてのタンパク質に結合するであろうと推定することは理にかなっている。
本明細書で用いられる「ヒトIL-23」という用語(本明細書では、hIL-23またはIL-23と略記する)は、IL-12およびIL-27を含めた、5つのこのようなヘテロ二量体サイトカインのファミリーに属する、ヘテロ二量体のヒトサイトカインを包含する(Trinchieriら、2003年、Immunity 19、641〜4頁)。該用語は、ジスルフィド架橋によりいずれもが一体に連結された、サブユニットp19およびp40を含むヘテロ二量体タンパク質を包含する。ヒトIL-23という用語には、標準的な組換え発現法により調製しうる、組換えヒトIL-23(rhIL-23)が含まれることを意図する。
本明細書で用いられる「IL-12/23」という用語は、ヒトIL-12およびIL-23を集合的に指す。
「IL-23p40」と同一であり、また、単に「p40」および「p40サブユニット」とも称する、本明細書で用いられる「IL-12p40」という用語は、ヒトサイトカインであるIL-12の40kDのサブユニット(p40)、およびヒトサイトカインであるIL-23の40kDのサブユニットを包含する。
また単に「p80」とも称する、本明細書で用いられる「IL-12p80」という用語は、ジスルフィド結合により一体に連結されて二量体タンパク質を形成する、ヒトサイトカインであるIL-12の40kDの単量体サブユニット(p40)2つを包含する。
また、単に「p35」とも称する、本明細書で用いられる「IL-12p35」という用語は、ヒトサイトカインであるIL-12(p70)およびIL-35の35kDのサブユニットを包含する。
また、単に「p19」とも称する、本明細書で用いられる「IL-23p19」という用語は、ヒトサイトカインであるIL-23の19kDのサブユニットを包含する。
IL-12R複合体は、本明細書ではIL-12Rβ1として用いられるIL-12受容体ベータ1、また、本明細書ではIL-12Rβ2として用いられるIL-12受容体ベータ2と称する2つのサブユニットからなり、これらのいずれもが、IL-12の高アフィニティー結合およびシグナル伝達に必要とされる。このIL-12Rは当初、PHAにより活性化されるリンパ芽球、およびIL-2により活性化されるNK細胞上において特徴づけられた(Chizzoniteら、1992年、J Immunol 148、3117〜24頁; Chuaら、1994年、J Immunol 153、128〜36頁)。IL-12Rβ2は、細胞をTH1経路(IFN-γを分泌する)へと導く、Tyk2/JAK2経路およびSTAT4経路を介するシグナル伝達をもたらすことが示されている(Preskyら、1996年、Proc Natl Acad Sci U S A 93、14002〜7頁; Watfordら、2004年、Immunol Rev 202、139〜56頁)。IL-12Rβ1は、以来、Tyk2およびSTAT3のリン酸化を介するシグナル伝達に関与することが示されている(Zouら、1997年、J Biol Chem 272、6073〜7頁)。
IL-23R複合体は、IL-12R複合体中に存在するIL-12Rβ1、また、本明細書ではIL-23Rとして用いられるIL-23受容体という2つのサブユニットからなる。IL-23によるIL-23Rに対する係合の結果、JAK2の自己リン酸化、およびIL-23Rのリン酸化がもたらされる。この結果、STAT3のほか、STAT1、STAT4、およびSTAT5の局在化およびリン酸化がもたらされる(Parhamら、2002年、J Immunol 168、5699〜708頁)。
本明細書で用いられる「生物学的活性」とは、サイトカインに固有のすべての生物学的特性を指す。IL-12の生物学的特性には、IL-12Rβ1および/またはIL-12Rβ2に対する結合; IFN-γ分泌の誘導; ならびに抗原特異的な1型ヘルパーTリンパ球(TH1)と、2型ヘルパーTリンパ球(TH2)との平衡の調節が含まれるが、これらに限定されない。IL-23の生物学的特性には、IL-12Rβ1および/またはIL-23Rに対する結合、IFN-γ生成の誘導、IL-17生成の誘導、IL-21生成の誘導、IL-22生成の誘導、TH17細胞の分化および樹状細胞の抗原提示機能の活性化、ならびにメモリーT細胞の増殖に対する選択的誘導が含まれるがこれらに限定されない。
第2の化学種との、抗体、タンパク質、またはペプチドの相互作用に関して本明細書で用いられる「特異的結合」または「特異的に結合する」という用語は、該相互作用が、該化学種上における特定の構造(例えば、抗原決定基またはエピトープ)の存在に依存する; 例えば、抗体がタンパク質一般ではなく、特定のタンパク質構造を認識し、これに結合することを意味する。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、標識した「A」および抗体を含有する反応において、エピトープAを含有する分子(または遊離の、標識されないA)が存在すれば、抗体に結合する標識したAの量が減少する。
本明細書で用いられる「抗体」という用語は、免疫グロブリン(Ig)分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持する、4本のポリペプチド鎖、2本の重(H)鎖および2本の軽(L)鎖、またはこれらの任意の機能的断片、突然変異体、変異体、もしくは誘導体を含む、任意のIg分子を広く指す。このような突然変異体、変異体、または誘導体の抗体フォーマットは、当技術分野で知られている。それらの非限定的な実施形態については、以下で論じる。
全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書では、HCVRまたはVHと略記する)および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、CH1、CH2、およびCH3という3つのドメインを含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書では、LCVRまたはVLと略記する)および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、CLという1つのドメインを含む。VH領域およびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と称する、より保存的な領域を散在させた、相補性決定領域(CDR)と称する、超可変領域へとさらに細分することができる。各VHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序: FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配列された3つのCDRおよび4つのFRを含む。免疫グロブリン分子は、任意の種類(IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、およびIgY)、任意のクラス(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)、または任意のサブクラスでありうる。
本明細書で用いられる、抗体の「抗原結合ドメイン」または「抗原結合部分」という用語は、抗原(例えば、IL-12)に特異的に結合する能力を保持する、抗体またはタンパク質の1または複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって果たされうることが示されている。このような抗体の実施形態はまた、2つ以上の異なる抗原に特異的に結合する、二重特異性(bispecific)、二重特異性(dual specific)、または多重特異性のフォーマットでもありうる。抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含される結合断片の例には、(i) VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる1価断片であるFab断片; (ii)ヒンジ領域においてジスルフィド架橋により連結される2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab')2断片; (iii) VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片; (iv)抗体の単一のアームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片; (v)単一の可変ドメインを含むdAb断片(参照により本明細書に組み込まれる、Wardら、1989年、Nature 341、544〜6頁; Winterら、PCT公開第WO90/05144A1号); ならびに(vi)単離相補性決定領域(CDR)が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメインであるVLおよびVHは個別の遺伝子によりコードされるが、それらを単一のタンパク質鎖として作製することを可能とする、合成リンカーを介する組換え法を用いてそれらを接合することができ、この場合、該VL領域およびVH領域は、対合して1価分子(単鎖Fv(scFv)として知られる)を形成する(例えば、Birdら、1988年、Science 242、423〜6頁; Hustonら、1988年、Proc Natl Acad Sci U S A 85、5879〜83頁を参照されたい)。このような単鎖抗体もまた、抗体の「抗原結合部分」という用語の中に包含することを意図する。ダイアボディなど、単鎖抗体の他の形態もまた包含される。ダイアボディは、VHドメインおよびVLドメインが単一のポリペプチド鎖上において発現するが、同じ鎖上における2つのドメイン間における対合が不可能なほどに短いリンカーを用い、これにより、該ドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、2つの抗原結合部位を創出する、二価の二重特異性抗体である(例えば、Holliger, P.ら、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90、6444〜6448頁; Poljak, R. J.ら、1994年、Structure 2、1121〜1123頁を参照されたい)。このような抗体の結合部分は、当技術分野で知られている(KontermannおよびDubel編、「Antibody Engineering」、2001年、ニューヨーク、Springer-Verlag社、790頁、ISBN 3-540-41354-5)。
本明細書で用いられる「抗体構築物」という用語は、リンカーポリペプチドまたは免疫グロブリン定常ドメインへと連結された、本発明の1または複数の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により接合される2つ以上のアミノ酸残基を含み、1または複数の抗原結合部分を連結するのに用いられる。このようなリンカーポリペプチドは、当技術分野でよく知られている(例えば、Holliger, P.ら、1993年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90、6444〜6448頁を参照されたい)。
免疫グロブリンの定常ドメインとは、重鎖または軽鎖の定常ドメインを指す。ヒトIgG重鎖定常ドメインおよびヒトIgG軽鎖定常ドメインのアミノ酸配列は当技術分野で知られており、以下に例を示す。
ヒト重鎖IgG1定常ドメイン(またはNCBI受託番号P01857など、その誘導体)
ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
ヒト軽鎖カッパ定常ドメイン(NCBI受託番号P01834など)
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
ヒト軽鎖ラムダ定常ドメイン(NCBI受託番号P01842など)
QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
さらにまた、抗体またはその抗原結合部分は、1または複数の他のタンパク質またはペプチドとの、抗体または抗体部分の共有結合または非共有結合により形成される、より大きな免疫接着分子の一部でもありうる。このような免疫接着分子の例には、4量体のscFv分子を作製するためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanovら、1995年、Hum Antibodies Hybridomas 6、93〜101頁)、および二価のビオチニル化scFvを作製するためのシステイン残基、マーカーペプチド、およびC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanovら、1994年、Mol Immunol 31、1047〜58頁)が含まれる。Fab断片およびF(ab')2断片などの抗体部分は、それぞれ、全抗体のパパイン消化またはペプシン消化など、従来の技法を用いて、全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分、および免疫接着分子は、本明細書に記載の標準的な組換えDNA法を用いて得ることもできる。
本明細書で用いられる「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体(例えば、hIL-12に特異的に結合する単離抗体は、hIL-12以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない)を指すことを意図する。しかし、hIL-12に特異的に結合する単離抗体は、他の種に由来するIL-12分子など、他の抗原に対する交差反応性を有する場合がある。しかし、単離抗体は、他の細胞物質および/または化学物質を実質的に含まないことが可能である。
本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する抗体を包含することを意図する。本発明のヒト抗体は、例えば、CDR、また特に、CDR3において、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、in vitroにおけるランダム突然変異誘発もしくは部位特異的突然変異誘発、またはin vivoにおける体細胞突然変異誘発により導入される突然変異)を包含しうる。しかし、本明細書で用いられる「ヒト抗体」という用語は、マウスなど、別の哺乳動物種の生殖細胞系列に由来するCDR配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植された抗体を包含することを意図しない。
本明細書で用いられる「組換えヒト抗体」という用語は、宿主細胞内へとトランスフェクトされた組換え発現ベクターを用いて発現する抗体、組換えの組合せによるヒト抗体ライブラリーから単離される抗体(Hoogenboom、1997年、Trends Biotechnol 15、62〜70頁; Azzazyら、2002年、Clin Biochem 35、425〜45頁; Gavilondoら、2000年、Biotechniques 29、128〜32、134〜6、138頁の各所; Hoogenboomら、2000年、Immunol Today 21、371〜8頁)、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離される抗体(例えば、Taylorら、1992年、Nucleic Acids Res 20、6287〜95頁; Littleら、2000年、Immunol Today 21、364〜70頁を参照されたい)、または、他のDNA配列に対するヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを伴う他の任意の手段により調製、発現、作製、もしくは単離される抗体など、組換え手段により調製、発現、作製、または単離されるすべてのヒト抗体を包含することを意図する。このような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する。しかし、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体をin vitroにおける突然変異誘発(または、ヒトIg配列についてトランスジェニックである動物を用いる場合は、in vivoにおける体細胞突然変異誘発)にかけ、このため、該組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のVH配列およびVL配列に由来してこれに類縁である一方、in vivoにおけるヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然では存在しえない配列である。
「キメラ抗体」という用語は、マウスの重鎖可変領域および軽鎖可変領域がヒト定常領域に連結された抗体など、1つの種に由来する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列と、別の種に由来する定常領域配列とを含む抗体を指す。
「CDR移植抗体」という用語は、マウスCDRのうちの1または複数(例えば、CDR3)が、ヒトCDR配列により置換されている、マウスの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する抗体など、1つの種に由来する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むが、VHおよび/またはVLのCDR領域のうちの1または複数の配列が、別の種のCDR配列により置換されている抗体を指す。
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種(例えば、マウス)に由来する重鎖可変領域配列および軽鎖可変領域配列を含むが、VH配列および/またはVL配列のうちの少なくとも一部を、より「ヒト様」であるように、すなわち、ヒト生殖細胞系列の可変配列により類似するように変化させた抗体を指す。ヒト化抗体の1つの種類は、ヒトCDR配列が、非ヒトVH配列およびVL配列内へと導入されて、対応する非ヒトCDR配列を置換する、CDR移植抗体である。
本明細書において、「Kabatによる番号付け」、「Kabatによる定義」、および「Kabatによる表示」という用語は、互換的に用いられる。当技術分野で認知されているこれらの用語は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、またはこれらの抗原結合部分において、他のアミノ酸残基より可変的(すなわち、超可変的)なアミノ酸残基を番号付けするシステム(Kabatら、1971年、Ann N Y Acad Sci 190、382〜93頁; およびKabat, E.A.ら(1991)、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、米国保健福祉省、NIH刊行物第91-3242号)を指す。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、CDR1が31位〜35位のアミノ酸位置、CDR2が50位〜65位のアミノ酸位置、CDR3が95位〜102位のアミノ酸位置の範囲にある。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、CDR1が24位〜34位のアミノ酸位置、CDR2が50位〜56位のアミノ酸位置、CDR3が89位〜97位のアミノ酸位置の範囲にある。
本明細書で用いられる「アクセプター」および「アクセプター抗体」という用語は、1または複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列のうちの少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%を与えるかまたはコードする抗体配列または核酸配列を指す。一部の実施形態では、「アクセプター」という用語は、定常領域(複数可)を与えるかまたはコードする抗体アミノ酸配列または核酸配列を指す。さらに別の実施形態では、「アクセプター」という用語は、1または複数のフレームワーク領域、および定常領域(複数可)を与えるかまたはコードする抗体アミノ酸配列または核酸配列を指す。特定の実施形態では、「アクセプター」という用語は、1または複数のフレームワーク領域のアミノ酸配列のうちの少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%を与えるかまたはコードする、ヒト抗体のアミノ酸配列または核酸配列を指す。この実施形態によれば、アクセプターは、ヒト抗体の1または複数の特定の位置においては発生しない少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、または少なくとも10のアミノ酸残基を含有しうる。アクセプターフレームワーク領域、および/またはアクセプター定常領域(複数可)は、例えば、生殖細胞系列の抗体遺伝子、成熟抗体遺伝子、機能性抗体(例えば、当技術分野でよく知られる抗体、開発中の抗体、または市販される抗体)に由来する場合もあり、これらから得られる場合もある。本明細書で用いられる「CDR」という用語は、抗体の可変配列内における相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域の各々には3つずつのCDRが存在し、これらは、可変領域の各々について、CDR1、CDR2、およびCDR3と名付けられている。本明細書で用いられる「CDRセット」という用語は、単一の可変領域内において発生する、抗原に結合することが可能な3つのCDRによる群を指す。これらのCDRの正確な境界は、システムごとに異なる形で定義されている。Kabatにより説明されるシステム(Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、メリーランド州、ベセスダ、米国国立衛生研究所(1987)および(1991))は、抗体の任意の可変領域に適用可能な、明確な残基番号付けシステムについて記載するだけでなく、3つのCDRを規定する正確な残基境界についても記載する。これらのCDRは、KabatによるCDRと称することができる。Chothiaら(Chothiaら、1987年、J Mol Biol 196、901〜17頁; およびChothiaら、1989年、Nature 342、877〜83頁)は、KabatによるCDR内における特定の部分が、アミノ酸配列のレベルでは極めて多様であるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格の立体構造を用いていることを見出した。これらの部分を、L1、L2、およびL3、またはH1、H2、およびH3(ここで、「L」および「H」とは、それぞれ、軽鎖領域および重鎖領域を示す)と名付けられた。これらの領域は、ChothiaによるCDRと称することができ、これらは、KabatによるCDRと重複する境界を有する。さらに他のCDR境界の定義は、上記のシステムのうちの1つに厳密に従わない場合もあり、特定の残基もしくは残基群、さらにまたは全CDRが、抗原結合にさほど影響を与えないという予測または実験による知見に照らし、短縮または延長される場合もあるが、にもかかわらず、KabatによるCDRとは重複する。本明細書で用いられる方法は、これらのシステムのうちのいずれによる定義のCDRも用いうるが、好ましい実施形態では、KabatまたはChothiaによる定義のCDRが用いられる。
本明細書で用いられる「カノニカル」残基という用語は、Chothiaら(参照により本明細書に組み込まれる、ChothiaおよびLesk、1987年、J Mol Biol 196、901〜17頁; Chothiaら、1992年、J Mol Biol 227、799〜817頁)による定義の特定のカノニカルCDR構造を規定するCDRまたはフレームワーク内の残基を指す。Chothiaらによれば、多くの抗体のCDRの最重要部分は、アミノ酸配列のレベルでは極めて多様であるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格の立体構造を有する。各カノニカル構造は、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントについて、ペプチド骨格のねじれ角のセットを主に特定する。
本明細書で用いられる「ドナー」および「ドナー抗体」という用語は、1または複数のCDRを与える抗体を指す。好ましい実施形態では、ドナー抗体は、フレームワーク領域がそこから得られるか、またはそこに由来する抗体とは異なる種に由来する抗体である。ヒト化抗体の文脈では、「ドナー抗体」という用語は、1または複数のCDRを与える非ヒト抗体を指す。本明細書で用いられる「フレームワーク」または「フレームワーク配列」という用語は、可変領域からCDRを差し引いた残りの配列を指す。CDRの正確な定義は、システムにより異なる形で定められうるので、フレームワーク配列の意味は、これに対応して異なる解釈に従う。6つのCDR(軽鎖のCDR-L1、CDR-L2、およびCDR-L3、ならびに重鎖のCDR-H1、CDR-H2、およびCDR-H3)はまた、軽鎖および重鎖上におけるフレームワーク領域を、各鎖上における4つの部分領域(FR1、FR2、FR3、およびFR4)へと分割し、この場合、CDR1は、FR1とFR2との間に位置し、CDR2はFR2とFR3との間に位置し、CDR3は、FR3とFR4との間に位置する。その他の研究者らにより参照されるフレームワーク領域は、FR1、FR2、FR3、またはFR4など、特定の部分領域を指定せずに、単一で天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内において組み合わされるFRを表わす。本明細書で用いられる、あるFRとは、フレームワーク領域を構成する4つの部分領域のうちの1つを表わし、複数のFRとは、同4つの部分領域のうちの2つ以上を表わす。
本明細書で用いられる「生殖細胞系列の抗体遺伝子」または「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの遺伝子再配列およびその発現に対する突然変異をもたらす成熟化過程を経ていない、リンパ球以外の細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す(例えば、Shapiroら、2002年、Crit Rev Immunol 22、183〜200頁; Marchalonisら、2001年、Adv Exp Med Biol 484、13〜30頁を参照されたい)。本発明の各種の実施形態により提供される利点の1つは、生殖細胞系列の抗体遺伝子が、成熟抗体遺伝子より、種における個体に特徴的な、本質的なアミノ酸配列の構造を保存している可能性が高く、したがって、その種において治療的に用いた場合、外来の供給源に由来すると認識される可能性が低いという認識から発する。
本明細書で用いられる「重要」残基とは、抗体、特に、ヒト化抗体の結合特異性、および/またはアフィニティーに対してより大きな影響を及ぼす、可変領域内における特定の残基を指す。重要残基には、以下: CDRに隣接する残基、グリコシル化部位の残基（NまたはOグリコシル化部位）、まれな残基、抗原との相互作用が可能な残基、CDRとの相互作用が可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基、およびChothiaによる定義のVHドメインのCDR1とKabatによる定義の第1の重鎖フレームワークとで重複する領域内の残基のうちの1または複数が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で用いられる「ヒト化抗体」という用語は、対象の抗原に免疫特異的に結合し、また、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列を有するフレームワーク(FR)領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)とを含む抗体、またはその変異体、誘導体、類似体、もしくは断片である。CDRとの関係において本明細書で用いられる「実質的に」という用語は、非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有するCDRを指す。ヒト化抗体は、その中のすべてまたは実質的にすべてのCDR領域が、非ヒト免疫グロブリン(すなわち、ドナー抗体)のCDR領域に対応し、また、その中のすべてまたは実質的にすべてのフレームワーク領域が、ヒト免疫グロブリンのコンセンサス配列のフレームワーク領域である、少なくとも1つであり、また典型的には2つの可変ドメイン(Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)の実質的にすべてを含む。好ましくは、ヒト化抗体はまた、ヒト免疫グロブリンの定常領域(Fc)であることが典型的な免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部も含む。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖、ならびに重鎖の少なくとも可変ドメインの両方を含有する。該抗体はまた、重鎖のCH1領域、ヒンジ領域、CH2領域、CH3領域、およびCH4領域も包含しうる。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化軽鎖だけを含有する。一部の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖だけを含有する。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメインおよび/またはヒト化重鎖だけを含有する。
ヒト化抗体は、IgM、IgG、IgD、IgA、およびIgEを含めた免疫グロブリンの任意のクラス、ならびに、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4が含まれるがこれらに限定されない任意のアイソタイプから選択されうる。ヒト化抗体は、複数のクラスまたはアイソタイプに由来する配列を含む場合があり、特定の定常ドメインは、当技術分野でよく知られる技法を用いて、所望のエフェクター機能を最適化するように選択することができる。
ヒト化抗体のフレームワーク領域およびCDR領域は、親配列に正確に対応する必要はない、例えば、ドナー抗体のCDRまたはコンセンサスのフレームワークは、その部位におけるCDR残基またはフレームワーク残基が、ドナー抗体またはコンセンサスフレームワークに対応しないように、少なくとも1つのアミノ酸残基の置換、挿入、および/または欠失により突然変異誘発させることができる。しかし、好ましい実施形態では、このような突然変異は、広範なものではない。通常、ヒト化抗体残基の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、また最も好ましくは少なくとも95%は、親FR配列および親CDR配列の残基に対応する。本明細書で用いられる「コンセンサスフレームワーク」という用語は、免疫グロブリンのコンセンサス配列内におけるフレームワーク領域を指す。本明細書で用いられる「免疫グロブリンのコンセンサス配列」という用語は、類縁の免疫グロブリン配列のファミリー内において発生することが最も多いアミノ酸(またはヌクレオチド)から形成される配列を指す(例えば、Winnaker、「From Genes to Clones」、ドイツ、ヴァインハイム、Verlagsgesellschaft社、1987年を参照されたい)。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置は、そのファミリー内のその位置で発生することが最も多いアミノ酸により占められている。2つのアミノ酸の発生が同程度に多い場合、そのいずれも該コンセンサス配列内に包含することができる。Footeら、1992年、J Mol Biol 224、487〜99頁により説明される通り、本明細書で用いられる「バーニア」ゾーンとは、CDR構造を調整し、抗原に対する適合性を微調整しうるフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニア残基は、CDRの根底層をなし、CDRの構造および抗体のアフィニティーに対して影響を及ぼしうる。
本明細書で用いられる「中和」という用語は、抗体がサイトカインに特異的に結合する場合における、該サイトカインの生物学的活性の中和を指す。中和抗体は、IL-12および/またはIL-23に対するその結合の結果、IL-12および/またはIL-23の生物学的活性の阻害がもたらされる中和抗体であることが好ましい。該中和抗体は、IL-12および/またはIL-23に結合し、IL-12および/またはIL-23の生物学的活性を、少なくとも50%、60%、80%、85%以上低下させることが好ましい。本明細書で用いられる「阻害」という用語は、抗体がサイトカインに特異的に結合する場合における、該サイトカインの生物学的活性の低下を指す。中和抗体によるIL-12および/またはIL-23の生物学的活性の阻害は、当技術分野においてよく知られる、IL-12および/またはIL-23の生物学的活性の1または複数の指標を測定することにより評価することができる。例えば、in vitroのIL-12 PHAアッセイにおけるヒトフィトヘマグルチニン芽細胞の増殖に対する阻害、またはヒトIL-12受容体結合アッセイにおける受容体の結合に対する阻害が評価される(実施例を参照されたい)。
「活性」という用語には、抗原に対する抗体、例えば、IL-12抗原に結合する抗IL-12抗体の結合特異性/アフィニティー、および/または抗体、例えば、IL-12に対するその結合が、hIL-12の生物学的活性を阻害(例えば、ヒトIL-12受容体結合アッセイまたはin vitroのIL-12 PHAアッセイにおける、PHA芽細胞の増殖に対する阻害または受容体の結合に対する阻害)する抗IL-12抗体の中和効力などの活性が含まれる。
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に対する特異的な結合が可能な任意のポリペプチド決定基を包含する。特定の実施形態では、エピトープ決定基には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなど、分子表面の化学的活性基が含まれ、また、特定の実施形態では、エピトープ決定基は、特定の3次元構造特徴、および/または特定の電荷特徴を有しうる。エピトープは、抗体が結合する抗原領域である。特定の実施形態では、タンパク質および/または高分子の複雑な混合物中において、抗体がその標的抗原を優先的に認識する場合に、その抗体は、その抗原に特異的に結合するという。
本発明はまた、マクロファージ、小膠細胞、メサンギウム食細胞、滑膜A細胞、幹細胞前駆細胞、ランヘルハンス細胞、クッパー細胞、樹状細胞、B細胞などであるがこれらに限定されない抗原提示細胞(APC)におけるIL-12/23活性を阻害する抗体も提供する。このようなAPCは、例えば、皮膚、表皮、肝臓、脾臓、脳、脊髄、胸腺、骨髄、関節滑膜液、腎臓、血液などであるがこれらに限定されない異なる組織内に存在しうる。このようなAPCはまた、血液脳関門の外側または内側に限定される場合もある。
本発明は、単離抗体、組換え抗体、および/または合成抗体、それらの特定部分または変異体のほか、少なくとも1つの抗体をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む組成物およびコード核酸分子を提供する。本発明のこのような抗体、それらの特定部分または変異体は、特定の全長抗体配列、それらのドメイン、断片、および特定の変異体、ならびに治療用の組成物、方法、およびデバイスを含めた、前記核酸および抗体、それらの特定部分または変異体を作製および使用する方法を含む。
本発明において用いうる抗体は、場合によって、良好〜極めて良好な症状の緩和、および低度の毒性により、長期間にわたり患者を治療する能力により特徴づけられる。低度の免疫原性および/または高度のアフィニティーのほか、他の適切な特性は、達成される治療結果に寄与しうる。本明細書において、「低度の免疫原性」とは、著明なHAHA反応、HACA反応、またはHAMA反応の発生が、治療を受けた患者の約75%未満、または好ましくは約50%未満においてのものであり、かつ/または治療を受けた患者における力価の発生が低度である(二重抗原酵素イムノアッセイによる測定で、約300未満、好ましくは約100未満である; Elliottら、1994年、Lancet 344、1125〜7頁)こととして定義される。
本発明の単離核酸は、それらを細胞、組織、内臓、または動物(哺乳動物およびヒトを含めた)において用いて、少なくとも1つのIL-12状態および/またはIL-23状態を調節するか、治療するか、緩和するか、その発生を防止する一助となるか、またはその症状を軽減しうる、少なくとも1つの抗体、その断片または特定の変異体を作製するのに用いることができる。
このような方法は、このような調節、治療、緩和、防止、または症状、影響、もしくは機構の軽減を必要とする細胞、組織、内臓、動物、または患者に、少なくとも1つの抗体、または特定部分もしくは変異体を含む、有効量の組成物または医薬組成物を投与するステップを含みうる。本明細書で記載されるか、または当技術分野で知られる通り、有効量は、単回もしくは複数回の投与当たり約0.001〜500mg/kgの量、または単回もしくは複数回の投与当たり0.01〜5000μg/mlの血清濃度を達成する量、または既知の方法を用いて実施および決定される、その間にある任意の有効範囲もしくは有効値を含みうる。
IL-12p40サブユニットに特異的な抗体は、単離されたIL-12p40タンパク質、IL-12タンパク質、もしくはIL-23タンパク質、またはその一部(合成ペプチドなどの合成分子を含めた)など、適切な免疫原性抗原に対して作製することができる。免疫原性抗原の調製およびモノクローナル抗体の作製は、任意の適切な技法を用いて実施することができる。各種の方法が説明されている(例えば、それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Kohlerら、1975年、Nature 256、495〜7頁; およびKohlerら、1976年、Eur J Immunol 6、511〜9頁; Galfreら、1977年、Nature 266、550〜2頁; Koprowskiら、米国特許第4,172,124号; Harlow, E.およびD. Lane、1988年、「Using Antibodies: A Laboratory Manual」、ニューヨーク州、コールドスプリングハーバー、Cold Spring Harbor Laboratory社;「Current Protocols In Molecular Biology」、第2巻(例えば、補遺27、1994年夏)、Ausubel, F. M.ら編、ニューヨーク州、ニューヨーク、John Wiley & Sons社、第11章(1991〜2003)を参照されたい)。一般に、ハイブリドーマは、適切な不死細胞株(例えば、Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2Aなどであるがこれらに限定されない骨髄腫細胞株、もしくは異種骨髄腫、それらの融合生成物、またはそれらに由来する任意の細胞もしくは融合細胞、あるいは、当技術分野で知られる他の任意の適切な細胞株; 例えば、それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、www.atcc.org, www.lifetech.comなどを参照されたい)を、これらに限定されない、単離もしくはクローニングされた脾臓細胞、あるいは、組換えもしくは内因性の、ウイルス、細菌、藻類、原核生物、両生動物、昆虫、爬虫類、魚類、哺乳動物、げっ歯動物、ウマ、ヒツジ(ovine)、ヤギ、ヒツジ(sheep)、霊長動物、真核生物のゲノムDNA、cDNA、rDNA、ミトコンドリアDNAもしくはミトコンドリアRNA、葉緑体DNAもしくは葉緑体RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、一本鎖核酸、二本鎖核酸、もしくは三本鎖核酸、ハイブリダイズした核酸など、またはこれらの任意の組合せとしての、内因性核酸もしくは異種核酸としての、重鎖または軽鎖の定常領域配列、可変領域配列、フレームワーク配列、またはCDR配列を発現する他の任意の抗体作製細胞と融合することにより作製する。例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ausubel、前出; およびColligan、「Immunology」、前出、第2章を参照されたい。
抗体作製細胞は、対象の抗原により免疫化されたヒトまたは他の適切な動物の末梢血、または、好ましくは、脾臓もしくはリンパ節から得ることができる。本発明の抗体、その特定の断片または変異体をコードする異種核酸または内因性核酸を発現させるのに適切な他の任意の宿主細胞もまた用いることができる。融合細胞(ハイブリドーマ)または組換え細胞は、選択的な培養条件または他の適切な既知の方法を用いて単離することができ、希釈率の制限もしくは細胞分類、または他の既知の方法によりクローニングすることができる。所望の特異性を有する抗体を作製する細胞は、適切なアッセイ(例えば、ELISA)により選択することができる。
当技術分野で知られ、かつ/または本明細書で記載される通り、ヒト抗体のレパートリーを作製することが可能な、ペプチドライブラリーまたはタンパク質ライブラリーから組換え抗体を選択する方法(例えば、バクテリオファージ、リボソーム、オリゴヌクレオチド、RNA、cDNAなどによるディスプレイライブラリーであるがこれらに限定されない; 例えば、英国、ケンブリッジシャー、Cambridge Antibody Technologies社; ドイツ、マルチンスリート/プラネック、MorphoSys社; 英国、スコットランド、アバディーン、Biovation社; スウェーデン、ルンド、Biolnvent社; Dyax社、Enzon社、Affymax/Biosite社; カリフォルニア州、バークレー、Xoma社; Ixsys社から市販されている; 例えば、EP368,684、PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; 米国特許出願第08/350260号(1994年5月12日); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835(CAT/MRC社); WO90/14443; WO90/14424; WO90/14430; PCT/US594/1234; WO92/18619; WO96/07754(Scripps社); WO96/13583、WO97/08320(MorphoSys社); WO95/16027(BioInvent社); WO88/06630; WO90/3809(Dyax社); 米国特許第4,704,692号(Enzon社); PCT/US91/02989(Affymax社); WO89/06283; EP371998; EP550400(Xoma社); EP229046; PCT/US91/07149(Ixsys社)を参照されたい); または確率的に作製したペプチドもしくはタンパク質から組換え抗体を選択する方法(各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第5,723,323号、同第5,763,192号、同第5,814,476号、同第5,817,483号、同第5,824,514号、同第5,976,862号、WO86/05803、EP590689(Ixsys社; 現在はApplied Molecular Evolution(AME)社)); または、トランスジェニック動物の免疫化に依拠する方法(例えば、SCIDマウス; Nguyenら、1997年、Microbiol Immunol 41、901〜7頁; Sandhuら、1996年、Crit Rev Biotechnol 16、95〜118頁のほか、関連の特許および出願を参照されたい)が含まれるがこれらに限定されない、必須の特異性を有する抗体を作製または単離するのに適切な他の方法を用いることができる。このような技法には、リボソームディスプレイ(Hanesら、1997年、Proc Natl Acad Sci U S A 94、4937〜42頁; Hanesら、1998年、Proc Natl Acad Sci U S A 95、14130〜5頁); 単一細胞による抗体作製法(例えば、選択リンパ球抗体(「SLAM」)法; 米国特許第5,627,052号; Wenら、1987年、Eur J Immunol 17、887〜92頁; Babcookら、1996年、Proc Natl Acad Sci U S A 93、7843〜8頁); ゲル微液滴およびフローサイトメトリー(Powellら、1990年、Biotechnology (N Y) 8、333〜7頁); マサチューセッツ州、ケンブリッジ、One Cell Systems社製のアッセイ(Grayら、1995年、J Immunol Methods 182、155〜63頁; Kenneyら、1995年、Biotechnology (N Y) 13、787〜90頁); B細胞選択(それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Steenbakkersら、1994年、Mol Biol Rep 19、125〜34頁; Jonakら、「Progress Biotech」、第5巻、「In Vitro Immunization in Hybridoma Technology」、Borrebaeck編、オランダ、アムステルダム、Elsevier Science Publishers B.V.社(1988))が含まれるがこれらに限定されない。
in vivoのヒトにおいて抗体を用いる場合、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を用いることが好ましい場合がある。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体に由来する可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを有する抗体など、抗体部分によって由来する動物種が異なる分子である。キメラ抗体を作製する方法は、当技術分野で知られている。例えば、Morrison(1985); Oi(1986); Gillies(1989); 米国特許第5,807,715号; 同第4,816,567号; および同第4,816,397号を参照されたい。
例えば、特許公開第EP0983303A1号、同第WO2000/34317号、および同第WO98/52976号において説明される方法を用いて作製される配列変異体を有する脱免疫化抗体は、本発明の範囲内に包含され、本発明の方法を実施するのに有用である。
マウスモノクローナル抗体または他の非ヒトモノクローナル抗体に内在する免疫原性反応およびアレルギー反応を最小化し、これにより、投与される抗体の有効性および安全性を増大させる目的で本発明の範囲内に包含させる別の手法は、「ベニア化」である。「ベニア化抗体」という用語は、天然フレームワーク領域の折り畳み構造の実質的にすべてを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供することを目的として、ヒトフレームワーク領域の残基により、例えば、マウスの重鎖可変領域または軽鎖可変領域に由来するフレームワーク領域の残基を選択的に置換することを指す。ベニア化法は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に、抗原結合表面内における重鎖CDRセットおよび軽鎖CDRセットの構造および相対的配置により決定されるという理解(Davies (1990))に基づく。したがって、ヒト化抗体において抗原結合特異性が保存されうるのは、CDR構造、それら互いとの相互作用、V領域の残りのドメインとのそれらの相互作用が注意深く保持される場合に限る。ベニア化法を用いることにより、免疫系が容易に遭遇する外部の(例えば、溶媒が到達しうる)フレームワーク領域の残基を、ヒト残基により選択的に置換して、免疫原性が弱いか、または実質的に非免疫原性であるベニア化表面を含むハイブリッド分子を提供する。
本発明の範囲はまた、ヒト化抗IL-12/IL-23抗体にも拡張される。「ヒト化」とは、非ヒト免疫グロブリン配列に由来する最小限の配列を含有する抗IL-12/IL-23抗体の意図される形態である。大半の場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域(また、相補性決定領域またはCDRとしても知られる)に由来する残基が、マウス、ラット、ウサギ、または所望の特異性、アフィニティー、および能力を有する非ヒト霊長動物などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域に由来する残基により置換されるヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。
本発明の範囲内にあり、本発明の方法において用いるのに適するヒト化抗体は、例えば、本明細書に記載のPMA204モノクローナル抗体などの非ヒト化抗体により示される結合特徴と、例えば、同等の結合特徴を有しうる。
ヒト化は、本質的に、Winterら(Jones (1986); Riechmann (1988); Verhoeyen (1988))の方法に従い、げっ歯動物または突然変異体げっ歯動物のCDRまたはCDR配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施することができる。また、米国特許第5,225,539号; 同第5,585,089号; 同第5,693,761号; 同第5,693,762号; および同第5,859,205号も参照されたい。
例えば、CDR移植(EP239400; PCT公開第WO91/09967号; 米国特許第5,225,539号; 同第5,530,101号; および同第5,585,089号)、ベニア化またはリサーフェシング(EP592106; EP519596; Padlan (1991); Studnicka (1994); Roguska (1994))、およびチェーンシャフリング(米国特許第5,565,332号)を含めた、当技術分野で知られる各種の技法を用いて、抗体をヒト化することができる。
一部の場合には、ヒト免疫グロブリンの1または複数の可変領域のフレームワーク領域内の残基が、対応する非ヒト動物の残基により置換される(例えば、Queenら、米国特許第5,585,089号; 米国特許第5,693,761号; 同第5,693,762号; および同第6,180,370号を参照されたい; また、例えば、Riechmann (1988)も参照されたい)。
「超ヒト化」とは、抗原特異性を付与するCDR(「ドナー」)を、「ドナー」CDRと構造的に同一であるかまたは類似のヒトCDRと共に発現することが知られる、ヒト生殖細胞系列のフレームワーク配列(「アクセプター」)に移植するヒト化法である(Tan 2002; また、国際特許公開第WO2004/006955号も参照されたい)。体細胞の突然変異を包含しうる配列ではなく、ヒトゲノムのV遺伝子配列によりコードされるフレームワークを用いることにより、この手法では、免疫原性を低下させる可能性が増強されている。ドナーCDRとアクセプターCDRとの構造的相同性を重視することにより、この手法ではまた、アフィニティー保持の可能性も増強されている。
さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体において見出されない残基も含みうる。これらの改変は、抗体の効能をさらに洗練させる(例えば、所望のアフィニティーを得る)目的で作製される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つであり、また、典型的には2つの可変ドメインのうちの実質的にすべてを含み、この場合、すべてまたは実質的にすべての超可変領域は、非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に対応し、すべてまたは実質的にすべてのフレームワーク領域は、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域に対応する。
ヒト化抗体はまた、場合によって、免疫グロブリンの定常領域(Fc)、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域のうちの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、Jones (1986); Riechmann (1988); およびPresta (1992)を参照されたい。したがって、このような「ヒト化」抗体には、完全ヒト可変ドメインより実質的に小さなドメインを、非ヒト種に由来する対応する配列により置換した抗体が含まれうる。実際、ヒト化抗体は、一部のCDR残基、またおそらくは一部のフレームワーク残基を、げっ歯動物抗体における類似部位に由来する残基により置換したヒト抗体であることが典型的である。例えば、米国特許第5,225,539号; 同第5,585,089号; 同第5,693,761号; 同第5,693,762号; 同第5,859,205号を参照されたい。ヒト化抗体、また、所定の抗原に対するアフィニティーが改善されたヒト化抗体を作製する技法が開示されている、米国特許第6,180,370号、および国際特許公開第WO2001/27160号もまた参照されたい。
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる、上記で説明したファージディスプレイ法を含め、当技術分野で知られる各種の方法により作製することができる。また、米国特許第4,444,887号および同第4,716,111号; およびPCT公開第WO98/46645号、同第WO98/50433号、同第WO98/24893号、同第WO98/16654号、同第WO96/34096号、同第WO96/33735号、および同第WO91/10741号も参照されたい。
「誘導選択」と称する技法を用いて、選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体を作製することができる。この手法では、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えば、マウス抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する(Jespers (1988))。
ヒト抗体はまた、機能性の内因性免疫グロブリンを発現することは可能でないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子は発現することが可能なトランスジェニック動物を用いて作製することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖の免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または相同組換えにより、マウス胚性幹細胞内へと導入することができる。代替的に、ヒト重鎖および軽鎖の遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域を、マウス胚性幹細胞内へと導入することもできる。
ヒト抗体を作製するこの技法の概要については、LonbergおよびHuszar (1995)を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を作製するこの技法、ならびにこのような抗体を作製するプロトコールに関する詳細な議論については、例えば、PCT公開第WO98/24893号; 同第WO92/01047号; 同第WO96/34096号; 同第WO96/33735号; 欧州特許第0598877号; 米国特許第5,413,923号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; 同第5,569,825号; 同第5,661,016号; 同第5,545,806号; 同第5,814,318号; 同第5,885,793号; 同第5,916,771号; 同第5,939,598号; 同第6,075,181号; および同第6,114,598号を参照されたい。
ヒト化抗体を作製するのに軽鎖および重鎖両方のヒト可変ドメインを選択することにより、抗原性を低下させることができる。いわゆる「ベストフィット」法により、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対して、げっ歯動物抗体の可変ドメイン配列をスクリーニングする。次いで、げっ歯動物の配列に最も近接するヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(FR)として受容する(それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、ChothiaおよびLesk、1987年、J Mol Biol 196、901〜17頁; Simsら、1993年、J Immunol 151、2296〜308頁)。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定の亜群によるすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークを、複数の異なるヒト化抗体に用いることができる(それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Carterら、1992年、Proc Natl Acad Sci U S A 89、4285〜9頁; Prestaら、1993年、J Immunol 151、2623〜32頁)。
抗体はまた、抗原に対する高度のアフィニティーおよび他の好ましい生物学的特性を保持しながら、場合によりヒト化することもできる。この目標を達成するのに好ましい方法により、親配列およびヒト化配列の3次元モデルを用いて、親配列および各種のヒト化概念産物を解析する過程により、ヒト化抗体を調製する。3次元の免疫グロブリンモデルは市販されており、当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な3次元立体構造を例示および表示するコンピュータプログラムが市販されている。これらの表示を検討することにより、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の可能な役割を解析する、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基を解析することが可能となる。このようにして、標的抗原(複数可)に対するアフィニティーが上昇するなど、所望の抗体特徴が達成されるように、コンセンサス配列およびインポート配列からFR残基を選択して組み合わせることができる。一般に、CDR残基は、抗原結合に対する影響に直接的に、また最も実質的に関与する。
ハイブリドーマ法により、ヒト抗体、特に、ヒトモノクローナル抗体を作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を作製するための、ヒト骨髄腫細胞株およびマウス-ヒト異種骨髄腫細胞株については、例えば、それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Kozbor, J.、Immunol. 133、3001頁(1984); Brodeurら、「Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications」、51〜63頁(ニューヨーク、Marcel Dekker社、1987年); およびBoernerら、J. Immunol. 147、86頁(1991)により説明されている。
代替的に、上記で示した技法に加え、ファージディスプレイ法も、免疫化されていないドナーに由来する免疫グロブリン可変(V)ドメインの遺伝子レパートリーから、in vitroにおいて、ヒト抗体およびヒト抗体断片を作製するのに用いることができる。この技法の1つの非限定的な例によれば、抗体のVドメイン遺伝子は、M13またはfdなど、線維状バクテリオファージの主要被覆タンパク質遺伝子または小被覆タンパク質遺伝子内へと、インフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面に機能的抗体断片としてディスプレイされる。線維状粒子は、ファージゲノムの一本鎖DNAコピーを含有するので、抗体の機能的特性に基づく選択はまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択も結果としてもたらす。したがって、該ファージは、B細胞の特性のうちの一部を模倣する。ファージディスプレイは、各種のフォーマットで実施することができ、それらの総説については、参照により全体として本明細書に組み込まれる、Johnson、1993年、Current Opinions in Structural Biology 3、564〜571頁を参照されたい。
ファージディスプレイには、V遺伝子セグメントの複数の供給源を用いることができる。Clacksonら(Clacksonら、1991年、Nature 352、624〜8頁)は、免疫化マウスの脾臓に由来するV遺伝子の小規模なランダムの組合せライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Marksら、1991年、J Mol Biol 222、581〜97頁; またはGriffithsら、1993年、Embo J 12、725〜34頁により説明される技法に本質的に従い、免疫化されていないヒトドナーに由来するV遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原の多様なアレイ(自己抗原を含めた)に対する抗体を単離することができる。
天然の免疫反応において、抗体遺伝子は、高頻度で突然変異を蓄積する(体細胞超変異)。導入される変化の一部により、より高度のアフィニティーが付与され、その後の抗原感作において、高アフィニティーの表面免疫グロブリンを提示するB細胞が優先的に複製および識別される。「チェーンシャフリング」(Marksら、1992年、Biotechnology (N Y) 10、779〜83頁)として知られる技法を用いることにより、この天然の過程を模倣することができる。この方法では、免疫化されていないドナーから得られるVドメイン遺伝子の天然の変異体レパートリー(レパートリー)で該重鎖および軽鎖のV領域遺伝子を逐次置換することにより、ファージディスプレイにより得られる「一次」ヒト抗体のアフィニティーを改善することができる。この技法により、nM範囲におけるアフィニティーを有する抗体および抗体断片の作製が可能となる。
Waterhouseら(Waterhouseら、1993年、Nucleic Acids Res 21、2265〜6頁)により、極めて大規模なファージ抗体レパートリーを作製する戦略が説明されている。げっ歯動物抗体からヒト抗体を派生させるには、遺伝子シャフリングもまた用いることができ、この場合、ヒト抗体は、出発げっ歯動物発抗体と同等のアフィニティーおよび特異性を有する。また、「エピトープインプリンティング」とも称するこの方法によれば、ファージディスプレイ法により得られる、げっ歯動物抗体の重鎖または軽鎖のVドメイン遺伝子が、ヒトVドメイン遺伝子のレパートリーにより置換され、げっ歯動物-ヒトキメラが創出される。抗原による選択の結果、機能性の抗原結合部位を保存することが可能なヒト可変ドメインが単離される、すなわち、エピトープにより、パートナーの選択が支配される(刷り込まれる)。残りのげっ歯動物Vドメインを置換する目的で過程を反復すると、ヒト抗体が得られる(PCT WO93/06213)。従来のCDR移植によるげっ歯動物抗体のヒト化と異なり、この技法は、げっ歯動物由来のフレームワーク残基またはCDR残基を有さない、完全なヒト抗体をもたらす。
少なくとも2つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナルの、好ましくはヒト抗体またはヒト化抗体である、二重特異性抗体もまた用いることができる。本発明の場合、結合特異性のうちの一方は、少なくとも1つのIL-12タンパク質および/またはIL-23タンパク質に対するものであり、他の一方は、他の任意の抗原に対するものである。例えば、IL-12/23タンパク質、および少なくとも1つの神経栄養因子、または2つの異なる種類のIL-12/23ポリペプチドに特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明の範囲内にある。
二重特異性抗体を作製する方法は、当技術分野で知られている。従来、組換えによる二重特異性抗体の作製は、2つの重鎖が異なる特異性を有する、2つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の共発現に基づいている(Milsteinら、1983年、Nature 305、537〜40頁)。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな並べ替えのために、これらのハイブリドーマ(クァドローマ)は、それらのうちの1つだけが適正な二重特異性構造を有する、10の異なる抗体分子の潜在的な混合物をもたらす。アフィニティークロマトグラフィー工程により通常なされる適正分子の精製はかなり煩瑣なものであり、また、産物収量も少ない。同様の手順は、参照により全体として本明細書に組み込まれる、WO93/08829; およびTrauneckerら、1991年、Embo J 10、3655〜9頁において説明されている。
異なる、また、より好ましい手法により、所望の結合特異性を伴う抗体可変ドメイン(抗体-抗原結合部位)を、免疫グロブリンの定常ドメイン配列へと融合させる。この融合は、ヒンジの少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域、第2の重鎖定常領域(CH2)、および第3の重鎖定常領域(CH3)を伴うことが好ましい。軽鎖の結合に必要な部位を含有する第1の重鎖定常領域(CH1)を、融合体の少なくとも1つにおいて存在させることが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合体、また、所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするDNAを、別個の発現ベクター内へと挿入し、適切な宿主生物内へと共トランスフェクトする。これにより、構築物中において等比率でない3つのポリペプチド鎖を用いて最適収量を得る実施形態では、3つのポリペプチド断片の相互比率を調整するのに大きな柔軟性が得られる。しかし、少なくとも2つのポリペプチド鎖を等比率で作製する結果として高収量が得られる場合、または該比率が特に重要でない場合、2つまたは3つすべてのポリペプチド鎖をコードする配列を、1つの発現ベクター内に挿入することが可能である。この手法の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにおける、第1の結合特異性を有するハイブリッドの免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにおける、（第２の結合特異性を提供する）ハイブリッドの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対とからなる。二重特異性分子の半分だけに免疫グロブリン軽鎖が存在するので、この非対称性構造により、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せから、所望の二重特異性化合物を分離することが容易となる。二重特異性抗体作製のさらなる詳細については、例えば、Suresh ら、1986年、Methods Enzymol 121、210〜28頁を参照されたい。
抗体は二重機能性分子であり、重鎖および軽鎖に由来するN末端可変セグメントが、特定の方式で共に会合して、抗原の表面上における特定のエピトープに対するアフィニティーを有する3次元構造を発生させる。定常領域セグメントは、抗体の血清半減期の延長、およびエフェクター機能の一因となり、補体の結合、食作用の刺激、抗体依存性細胞傷害作用(ADCC)、また、顆粒球による顆粒放出の誘発に関する。抗IL-12/23抗体ならば、ADCCまたはCDC(補体誘導性細胞傷害作用)などのエフェクター機能を果たすことが可能であると意図しうるであろう。これは、抗体がそれに結合し、エフェクター細胞を動員する、膜結合形態(Quinonesら、2000年、J Exp Med 192、507〜16頁)として、IL-12が存在しうるという発見による。代替的に、本発明の抗体ならば、細胞表面に結合したIL-12またはIL-23に結合し、また、これにより、エフェクター細胞を標的細胞表面へと動員することが可能な複合体を形成することも可能であろう(Vogelら、1996年、Int Immunol 8、1955〜62頁)。
したがって、抗体の治療的有用性は、抗体依存性細胞傷害作用、補体依存性細胞傷害作用、血清半減期、生体内分布、およびFc受容体に対する結合など、それらの機能的特徴を調節することにより増強することができる。この調節は、タンパク質操作、糖操作、または化学的方法により達成することができる。治療的適用、また、必要とされるエフェクター活性の所望のレベルに応じて、これらの活性のうちのいずれかを上昇または低下させることが有利でありえよう。Fcを増強する最新の方法に関する総説については、Carter、2006年、Nat Rev Immunol 6、343〜57頁; Presta、2006年、Adv Drug Deliv Rev 58、640〜56頁を参照されたい。このような増強には、抗体のFc部分の突然変異による、Fc受容体に対するアフィニティーを上昇させた突然変異体の決定(Shieldsら、2001年、J Biol Chem 276、6591〜604頁; Lazarら、2006年、Proc Natl Acad Sci U S A 103、4005〜10頁)、およびグリコシル化プロファイルを操作した細胞内における抗体の発現を介する、グリカン構造の調整(Yamane-Ohnukiら、2004年、Biotechnol Bioeng 87、614〜22頁; Liら、2006年、Nat Biotechnol 24、210〜5頁; Schusterら、2007年、Biotechnol J 2、700〜8頁)が含まれうるであろう。
抗体の血清半減期および生体内分布を調節する多くの方法は、抗体と、IgGを分解から保護する際に重要な役割を有する受容体である新生児Fc受容体(FcRn)との相互作用を修飾し、血清抗体濃度を高度に維持することに基づく。Dall'Acquaら(2002)は、Fc領域内において、FcRnに対する結合アフィニティーを増強するIgG1を置換し、これにより、血清半減期を延長することについて説明し、また、M252Y/S254T/T256Eの3重置換による、バイオアベイラビリティーの増強およびADCC活性の調節についてもさらに示している(Dall'Acqua 2006)。また、米国特許第6,277,375号; 同第6,821,505号; および同第7,083,784号も参照されたい。Hintonら(2004, 2005)は、in vivoにおける半減期の延長をもたらす、250位および428位における定常ドメインのアミノ酸置換について説明している。また、米国特許第7,217,797号も参照されたい。Petkovaら(2006)は、in vivoにおける半減期の延長をもたらす、307位、380位、および434位における定常ドメインのアミノ酸置換について説明している。また、Shieldsら(2001)およびWO2000/42072も参照されたい。Fc受容体に対する結合、また、FcRnの結合および血清半減期を含めた、これらの受容体を介する下流の機能を調節する定常ドメインにおけるアミノ酸置換の他の例は、米国特許出願第20090142340号; 同第20090068175号; および同第20090092599号において説明されている。
抗体分子にグリカンを連結すると、Fc受容体を有する抗体と、グリカン受容体との相互作用に影響が及び、これにより、血清半減期を含めた抗体活性に影響が及ぶことが知られている(Kaneko Yら、2006年; Jones AJら、2007年; Kanda Yら、2007年)。したがって、所望の抗体活性を調節する特定の糖形態は、治療的利点を付与しうる。糖形態の操作をもたらす方法は当技術分野で知られており、これらには米国特許第6,602,684号; 同第7,326,681号; 同第7,388,081号; およびWO2008/006554が含まれるがこれらに限定されない。
例えば、Fishburn (2008)により総説されている通り、ポリエチレングリコール(PEG)の添加による半減期の延長は、タンパク質の血清半減期を延長するのに広く用いられている。
ヘテロコンジュゲート抗体もまた、本発明の範囲内にある。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合した2つの抗体からなる。このような抗体は、例えば、有害な細胞を免疫系細胞の標的とするのに(米国特許第4,676,980号)、また、HIV感染を治療するのに提起されている(WO91/00360; WO92/00373; およびEP03089)。ヘテロコンジュゲート抗体は、簡便な架橋形成法を用いて作製することができる。適切な架橋形成剤は当技術分野で知られており、多くの架橋形成法と共に、米国特許第4,676,980号において開示されている。
好ましい実施形態では、本発明の少なくとも1つの抗体または特定部位もしくは変異体を、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、または不死化細胞のクローン集団により作製する。不死化した結合生成細胞は、適切な方法、例えば、ヒト抗体生成細胞と、異種骨髄腫との融合、またはエプスタイン-バーウイルスの感染を介する、活性化ヒトB細胞の不死化(Gustafssonら、1991年、Hum Antibodies Hybridomas 2、26〜32頁; Zanellaら、1992年、J Immunol Methods 156、205〜15頁; Niedbalaら、1998 Hybridoma 17、299〜304頁)を用いて作製することができる。本明細書で記載され、かつ/または当技術分野で知られる通り、ヒト抗ヒトIL-12/23抗体タンパク質、ヒト抗ヒトIL-12/23抗体断片、ヒト抗ヒトIL-12/23抗体の特定部分、またはヒト抗ヒトIL-12/23抗体の変異体は、ヒト抗体レパートリーを生成することが可能なトランスジェニック動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、非ヒト霊長動物など)の免疫化により作製される。ヒト抗体を生成する細胞は、このような動物から単離し、本明細書に記載の方法など、適切な方法を用いて不死化させることができる。
ヒト抗原に結合するヒト抗体レパートリーを生成しうるトランスジェニックマウスは、既知の方法(例えば、それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Lonbergらが取得した、米国特許第5,770,428号、同第5,569,825号、同第5,545,806号、同第5,625,126号、同第5,625,825号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、および同第5,789,650号; Jakobovitsら、WO98/50433; Jakobovitsら、WO98/24893; Lonbergら、WO98/24884; Lonbergら、WO97/13852; Lonbergら、WO94/25585; Kucherlapateら、WO96/34096; Kucherlapateら、EP0463151B1; Kucherlapateら、EP0710719A1; Suraniら、米国特許第5,545,807号; Bruggemannら、WO90/04036; Bruggemannら、EP0438474B1; Lonbergら、EP0814259A2; Lonbergら、GB2272440A; Taylor、Carmackら、1992年、Nucleic Acids Res 20、6287〜95頁; Tuaillonら、1993年、Proc Natl Acad Sci U S A 90、3720〜4頁; Greenら、1994年、Nat Genet 7、13〜21頁; Lonbergら、1994年、Nature 368、856〜9頁; Taylorら、1994年、Int Immunol 6、579〜91頁; Lonbergら、1995年、Int Rev Immunol 13、65〜93頁; Fishwildら、1996年、Nat Biotechnol 14、845〜51頁; Mendezら、1997年、Nat Genet 15、146〜56頁などであるがこれらに限定されない)により作製することができる。一般に、これらのマウスは、機能的に再配列されるか、または機能的な再配列を受ける可能性がある、少なくとも1つのヒト免疫グロブリン遺伝子座に由来するDNAを含む、少なくとも1つのトランス遺伝子を含む。このようなマウスにおける内因性免疫グロブリン遺伝子座を破壊するかまたは欠失させて、該動物が、内因性遺伝子によりコードされる抗体を生成する能力を消失させることができる。
本明細書で用いられる「機能的に再配列された」という用語は、V(D)J組換えを受け、これにより、免疫グロブリン鎖(例えば、重鎖、軽鎖)またその任意の部分をコードする免疫グロブリン遺伝子を生成する免疫グロブリン遺伝子座に由来するDNAセグメントを指す。機能的に再配列された免疫グロブリン遺伝子は、例えば、ヌクレオチドの配列決定、遺伝子セグメント間におけるコード接合部にアニールしうるプローブを用いるハイブリダイゼーション(例えば、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング)、または、遺伝子セグメント間におけるコード接合部にアニールしうるプライマーによる免疫グロブリン遺伝子の酵素的増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)などの適切な方法を用いて直接的または間接的に同定することができる。細胞が、特定の可変領域を含む抗体、または特定の配列(例えば、少なくとも1つのCDR配列)を含む可変領域を生成するかどうかもまた、適切な方法を用いて決定することができる。一例では、抗体生成細胞(例えば、ハイブリドーマもしくは組換え細胞、または他の適切な供給源)からmRNAを単離することができ、これを用いて、抗体またはその特定部分もしくは変異体をコードするcDNAを作製することができる。cDNAは、対象の可変領域の一部(例えば、CDR、コード接合部)に特異的にアニールする第1のプライマーと、可変領域以外の配列(例えば、CH1、VH)に特異的にアニールする第2のプライマーとを用いて、クローニングおよび配列決定することもでき、増幅する(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、または他の既知で適切な方法により)こともできる。
同様のタンパク質または断片に対する特異的な結合についての、抗体、それらの特定部分または変異体のスクリーニングは、ペプチドディスプレイライブラリーを用いて簡便に達成することができる。この方法は、所望の機能または構造を有する個々のメンバーについて、大規模なペプチドコレクションをスクリーニングするステップを伴う。ペプチドディスプレイライブラリーによる抗体スクリーニングは、当技術分野でよく知られている。提示されるペプチド配列は、3〜5000アミノ酸以上の長さ、しばしば5〜100アミノ酸の長さ、また、しばしば約8〜25アミノ酸の長さでありうる。ペプチドライブラリーを作製する直接的な化学合成法に加え、複数の組換えDNA法が説明されている。1つの種類は、バクテリオファージまたは細胞の表面上におけるペプチド配列の提示を伴う。各バクテリオファージまたは細胞は、提示される特定のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含有する。このような方法は、PCT特許公開第WO91/17271号、同第WO91/18980号、同第WO91/19818号、および同第WO93/08278号において説明されている。ペプチドライブラリーを作製する他のシステムは、in vitroにおける化学合成法と組換え法との両方の側面を有する。PCT特許公開第WO92/05258号、同第WO92/14843号、および同第WO96/19256号を参照されたい。また、米国特許第5,658,754号; および同第5,643,768号も参照されたい。ペプチドディスプレイライブラリーキット、ベクターキット、およびスクリーニングキットは、Invitrogen社(カリフォルニア州、カールスバード)、およびCambridge Antibody Technologies社(英国、ケンブリッジシャー)などの販売元から市販されている。例えば、Enzon社に譲渡された、米国特許第4,704,692号、同第4,939,666号、同第4,946,778号、同第5,260,203号、同第5,455,030号、同第5,518,889号、同第5,534,621号、同第5,656,730号、同第5,763,733号、同第5,767,260号、同第5,856,456号; Dyax社に譲渡された、米国特許第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,571,698号、同第5,837,500号; Affymax社に譲渡された、米国特許第5,427,908号、同第5,580,717号; Cambridge Anitibody Technologies社に譲渡された、米国特許第5,885,793号; Genentech社に譲渡された、米国特許第5,750,373号; Xoma社に譲渡された、米国特許第5,618,920号、同第5,595,898号、同第5,576,195号、同第5,698,435号、同第5,693,493号、同第5,698,417号; Colligan、前出; Ausubel、前出; またはSambrook、前出を参照されたい(上記の特許および刊行物の各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる)。
本発明の抗体、それらの特定部分および変異体はまた、少なくとも1つの抗体、それらの特定部分または変異体をコードする核酸を、このような抗体、それらの特定部分または変異体をそれらのミルク中において生成させる、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジなどのトランスジェニック動物またはトランスジェニック哺乳動物に施すことにより調製することもできる。このような動物は、既知の方法を用いて提供することができる。例えば、それらの各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第5,827,690号; 同第5,849,992号; 同第4,873,316号; 同第5,849,992号; 同第5,994,616号; 同第5,565,362号; 同第5,304,489号(などであるがこれらに限定されない)を参照されたい。
本発明の抗体、それらの特定部分および変異体はまた、少なくとも1つの抗体、それらの特定部分または変異体をコードする核酸を用いて、このような抗体、それらの特定部分または変異体を、植物部分またはそれらから培養される細胞中において生成させる、トランスジェニック植物および培養植物細胞(例えば、タバコ、トウモロコシ、およびコケ植物などであるがこれらに限定されない)に施すことによりさらに調製することもできる。非限定的な例として述べると、組換えタンパク質を発現するトランスジェニックのタバコの葉が、例えば、誘導性プロモーターを用いて、大量の組換えタンパク質をもたらすのに用いられて成功している。例えば、Cramerら、1999年、Curr Top Microbiol Immunol 240、95〜118頁、およびこの文献に引用された参考文献を参照されたい。また、トランスジェニックのトウモロコシが、他の組換え系において生成されるタンパク質、または天然の供給源から精製されるタンパク質と同等の生物学的活性を有する哺乳動物タンパク質を、市販生産レベルで発現させるのに用いられてもいる。例えば、Hoodら、1999年、Adv Exp Med Biol 464、127〜47頁、およびこの文献に引用された参考文献を参照されたい。抗体はまた、タバコの種およびバレイショの根を含めたトランスジェニック植物の種子からも大量に作製されている。例えば、Conradら、1998年、Plant Mol Biol 38、101〜9頁、およびこの文献に引用された参考文献を参照されたい。抗体はまた、このように遺伝子改変されたコケのプロトプラストにより一過性発現および分泌されて抗原結合アフィニティーが変化しないことを示し、また、精密試験では、ADCCの最大40倍の増強も示した(Schuster、Jostら、2007年、Biotechnol J 2、700〜8頁)。したがって、本発明の抗体、それらの特定部分および変異体はまた、既知の方法に従い、トランスジェニック植物を用いても作製することができる。例えば、Whitelamら、1994年、Biochem Soc Trans 22、940〜4頁; Maら、1995年、Trends Biotechnol 13、522〜7頁; Maら、1995年、Plant Physiol 109、341〜6頁、およびこれらの文献に引用された参考文献を参照されたい。上記の参考文献の各々は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる。本発明の抗体は、広い範囲にわたるアフィニティー(KD)により、ヒトIL-12/23に結合しうる。好ましい実施形態では、本発明の少なくとも1つの抗体は、場合によって、高度のアフィニティーによりヒトIL-12/23に結合しうる。例えば、約10-9M以下のKDにより、またはより好ましくは、約0.1〜9.9(またはこの間の任意の範囲または値)×10-10、10-11、10-12、10-13 Mまたはこの間の任意の範囲もしくは値以下のKDにより、ヒトIL-12/23タンパク質に結合しうる。抗原に対する抗体のアフィニティーまたはアビディティーは、任意の適切な方法を用いて実験的に決定することができる(例えば、Berzofskyら、「Antibody-Antigen Interactions」、「Fundamental Immunology」、Paul, W. E.編、ニューヨーク州、ニューヨーク、Raven Press社(1984); Kuby, Janis、「Immunology」、ニューヨーク州、ニューヨーク、W. H. Freeman and Company社(1992); また、本明細書に記載の方法を参照されたい)。特定の抗体について測定された、その結合パートナーとのアフィニティーは、異なる条件(例えば、塩濃度、pH)下で測定されると変化しうる。したがって、アフィニティーおよび他の抗原結合パラメータ(例えば、KD、Ka、Kd)の測定は、抗体および結合パートナーの標準化溶液、ならびに本明細書に記載の緩衝液など、標準化された緩衝液により実施することが好ましい。
本発明の単離核酸分子には、場合によって、例えば、少なくとも1つの重鎖または軽鎖それぞれの、CDR1、CDR2、および/またはCDR3など、少なくとも1つのCDRの少なくとも1つの特定部分であるがこれに限定されない、1または複数のイントロンを伴うオープンリーディングフレーム(ORF)を含む核酸分子; 抗体、それらの特定部分または変異体のコード配列を含む核酸分子; ならびに、上記のヌクレオチド配列とは実質的に異なるが、遺伝子コードの縮重により、本明細書で記載され、かつ/または当技術分野で知られる少なくとも1つの抗体をやはりコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が含まれうる。当然ながら、遺伝子コードは、当技術分野でよく知られている。したがって、当業者が、本発明の特定の抗体、それらの特定部分または変異体をコードする縮重核酸変異体を作製することは日常的であろう。例えば、Ausubelら、前出を参照されたい(また、このような核酸は、本発明に包含されている)。
本明細書で示される通り、抗体または特定部分もしくは変異体をコードする核酸を含む本発明の核酸分子には、抗体断片自体のアミノ酸配列をコードする核酸分子; 全抗体またはその部分をコードする配列; 抗体、断片または部分をコードする配列のほか、少なくとも1つのシグナルリーダーのコード配列などのなどさらなる配列、またはスプライシングシグナルおよびポリアデニル化シグナルを含めた、転写、mRNAプロセシングにおける役割(例えば、リボソーム結合およびmRNAの安定性)を果たす、転写されてはいるが翻訳はされていない配列など、非コードの5'配列および3'配列が含まれるがこれらに限定されないさらなる非コード配列と共に、少なくとも1つのイントロンなど、前述のさらなるコード配列を伴うかもしくは伴わない融合ペプチド; さらなる機能性をもたらすアミノ酸など、さらなるアミノ酸をコードするさらなるコード配列が含まれうるがこれらに限定されない。したがって、抗体または特定部分もしくは変異体をコードする配列を、抗体の断片または部分を含む、融合された抗体または特定部分もしくは変異体の精製を容易とするペプチドをコードする配列などのマーカー配列に融合させることができる。
本発明は、選択的なハイブリダイゼーション条件下で、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離核酸を提供する。したがって、この実施形態のポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドを含む核酸の単離、検出、および/または定量化に用いることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドを用いて、寄託されたライブラリー内において、部分長または全長のクローンを同定、単離、または増幅することができる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ゲノム配列もしくは単離されたcDNA配列であるか、または他の形でヒトもしくは哺乳動物の核酸ライブラリーに由来するcDNAに相補的である。
cDNAライブラリーは、全長配列の少なくとも80%、好ましくは全長配列の少なくとも85%または90%、またより好ましくは全長配列の少なくとも95%を含む。cDNAライブラリーを標準化して、まれな配列の表示を増大させることができる。相補的配列と比べて配列同一性が低い配列に対しては、低度または中程度の厳密性を示すハイブリダイゼーション条件を用いることが典型的であるが、これに限定されない。より高い同一性を有する配列には、場合によって、中程度および高度の厳密性を示す条件を用いることもできる。低度の厳密性を示す条件は、約70%の配列同一性を有する配列の選択的なハイブリダイゼーションを可能とし、オルトログ配列またはパラログ配列を同定するのに用いることができる。
場合によって、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによりコードされる抗体または特定部分もしくは変異体の少なくとも一部をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、本発明の抗体または特定部分もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドに対する選択的なハイブリダイゼーションに用いうる核酸配列を包含する。例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Ausubelら、前出; Colligan、前出を参照されたい。
当技術分野でよく知られている通り、本発明の単離核酸は、(a)組換え法、(b)合成法、および(c)精製法、またはこれらの組合せにより作製することができる。
核酸は、本発明のポリヌクレオチドに加えて配列を含むと好都合な場合がある。例えば、1または複数のエンドヌクレアーゼ制限部位を含む多重クローニング部位を核酸内に挿入して、ポリヌクレオチド単離の一助とすることができる。また、翻訳可能配列を挿入して、翻訳された本発明のポリヌクレオチドを単離する一助とすることもできる。例えば、6連のヒスチジンマーカー配列は、本発明のタンパク質を精製するのに好都合な手段を提供する。コード配列を除く本発明の核酸は、場合によって、本発明のポリヌクレオチドをクローニングおよび/または発現するためのベクター、アダプター、またはリンカーである。
このようなクローニング配列および/または発現配列にさらなる配列を付加して、クローニングおよび/または発現におけるそれらの機能を最適化することもでき、ポリヌクレオチドの単離の一助とすることもでき、細胞内へのポリヌクレオチドの導入を改善することもできる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当技術分野でよく知られている(例えば、Ausubel、前出; またはSambrook、前出を参照されたい)。
RNA、cDNA、ゲノムDNA、またはこれらの任意の組合せなど、本発明の単離核酸組成物は、当業者に知られる任意の多数のクローニング法を用いて、生物学的供給源から得ることがでいる。一部の実施形態では、厳密な条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いて、cDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリー内における所望の配列を同定する。RNAの単離、ならびにcDNAライブラリーおよびゲノムライブラリーの構築は、当業者によく知られている(例えば、Ausubel、前出; またはSambrook、前出を参照されたい)。
cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーは、本明細書で開示される配列など、本発明のポリヌクレオチド配列に基づくプローブを用いてスクリーニングすることができる。プローブは、ゲノムDNA配列またはcDNA配列とハイブリダイズさせて、同じ生物または異なる生物における相同遺伝子を単離するのに用いることができる。当業者は、アッセイにおいて、様々な程度のハイブリダイゼーションの厳密性を用いることができ、また、厳密でありうるのがハイブリダイゼーションの場合もあり、洗浄媒体の場合もあることを理解するであろう。ハイブリダイゼーション条件がより厳密となるにつれて、プローブと標的との間の相補性の程度が高まり、二重鎖の形成が生じることになる。厳密性の程度は、温度、イオン強度、pH、およびホルムアミドなど、部分的な変性溶媒の存在のうちの1または複数により制御することができる。例えば、ハイブリダイゼーションの厳密性は、例えば、ホルムアミド濃度を0%〜50%の範囲内に操作して、反応溶液の極性を変化させることにより変化させることが好都合である。検出可能な結合に必要な相補性(配列同一性)の程度は、ハイブリダイゼーション媒体および/または洗浄媒体の厳密性に従って変化する。相補性の程度は、100%、もしくは90〜100%、またはその間の任意の範囲もしくは値であることが最適である。しかし、ハイブリダイゼーション媒体および/または洗浄媒体の厳密性を低下させることにより、プローブおよびプライマー内におけるわずかな配列のばらつきを相殺しうることを理解されたい。
RNAまたはDNAを増幅する方法は当技術分野でよく知られており、本明細書で示される教示および指針に基づき、不要な実験なしに、本発明に従い用いることができる。DNAまたはRNAの既知の増幅には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および関連の増幅過程(例えば、Mullisらに与えられた、米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、同第4,800,159号、同第4,965,188号; Taborらに与えられた、米国特許第4,795,699号および同第4,921,794号; Innisに与えられた、米国特許第5,142,033号; Wilsonらに与えられた、米国特許第5,122,464号; Innisに与えられた、米国特許第5,091,310号; Gyllenstenらに与えられた、米国特許第5,066,584号; Gelfandらに与えられた、米国特許第4,889,818号; Silverらに与えられた、米国特許第4,994,370号; Biswasに与えられた、米国特許第4,766,067号; Ringoldに与えられた、米国特許第4,656,134号を参照されたい)、また、二本鎖DNA合成の鋳型としての標的配列に対するアンチセンスRNAを用いる、RNAを介する増幅(Malekらに与えられた、米国特許第5,130,238号; NASBAの商標名を有する)が含まれるがこれらに限定されない(これらの参考文献の全内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる)(例えば、Ausubel、前出; またはSambrook、前出を参照されたい)。
例えば、PCR法を用いて、本発明のポリヌクレオチド、およびゲノムDNAライブラリーまたはcDNAライブラリーに直接的に由来する類縁遺伝子の配列を増幅することができる。PCRおよび他のin vitroにおける増幅法はまた、例えば、発現させるタンパク質をコードする核酸配列をコードする核酸配列のクローニング、試料中における所望のmRNAの存在の検出、核酸の配列決定、または他の目的のためのプローブとして用いる核酸の作製にも有用でありうる。当業者をin vitroにおける増幅法へと導くのに十分な技法の例は、Berger、前出; Sambrook、前出; およびAusubel、前出; のほか、Mullisら、米国特許第4,683,202号(1987); およびInnisら編、「PCR Protocols A Guide to Methods and Applications」、カリフォルニア州、サンディエゴ、Academic Press社(1990)において見出される。ゲノムPCR増幅用に市販されるキットは、当技術分野で知られている。例えば、Advantage(登録商標)-GC Genomic PCRキット(Clontech社製)を参照されたい。長鎖のPCR産物収量を増大させるには、T4遺伝子32タンパク質(Boehringer Mannheim社製)を用いることができる。
本発明の単離核酸はまた、既知の方法(例えば、Ausubelら、前出を参照されたい)を介する直接的な化学合成によっても調製することができる。化学合成は一般に、一本鎖オリゴヌクレオチドを生成するが、これは、相補的配列とのハイブリダイゼーションを介して、または一本鎖を鋳型として用いる、DNAポリメラーゼによる重合化を介して、二本鎖DNAへと転換することができる。当業者は、DNAの化学合成を、約100塩基以上の配列に限定しうる一方、より長い配列は、より短い配列のライゲーションによっても得られることを認めるであろう。
本発明は、本発明の核酸を含む組換え発現カセットをさらに提供する。本発明の核酸配列、例えば、本発明の抗体または特定部分もしくは変異体をコードするcDNA配列またはゲノム配列を用いて、少なくとも1つの所望の宿主細胞へと導入しうる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、意図する宿主細胞内におけるポリヌクレオチドの転写を方向づける転写開始調節配列に作動的に連結された、本発明のポリヌクレオチドを含むことが典型的である。異種プロモーターおよび非異種(すなわち、内因性)プロモーターのいずれを用いても、本発明の核酸発現を方向づけることができる。
一部の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドの発現を上方調節または下方調節するように、プロモーター、エンハンサー、または他のエレメントとして用いられる単離核酸を、本発明のポリヌクレオチドの非異種形態の適切な位置(上流、下流、またはイントロン内)に導入することができる。例えば、内因性プロモーターは、in vivoまたはin vitroにおいて、突然変異、欠失、および/または置換により変化させることができる。
当技術分野でよく知られている通り、本発明はまた、本発明の単離核酸分子を包含するベクター、組換えベクターにより遺伝子操作された宿主細胞、および組換え法による少なくとも1つの抗体または特定部分もしくは変異体の精製にも関する。例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Sambrookら、前出; Ausubelら、前出を参照されたい。ポリヌクレオチドは、場合によって、宿主内における増殖のための選択マーカーを含有するベクターに接合することもできる。一般に、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物内、または帯電脂質との複合体内にプラスミドベクターを導入する。ベクターがウイルスベクターである場合、in vitroにおいて、適切な封入用細胞株を用いてそれを封入し、次いで、これを宿主細胞内へと形質導入することができる。
DNA挿入物は、適切なプロモーターへと作動的に連結されるものとする。発現構築物は、転写開始部位、転写終結部位、また、転写された領域内においては、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含有する。該構築物により発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるmRNAの始点における翻訳開始コドン、および同mRNAの終点に適切な形で配置された終結コドン(例えば、UAA、UGA、またはUAG)を包含することが好ましく、哺乳動物細胞または真核細胞の発現には、UAAおよびUAGが好ましい。
発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを包含することが好ましいが、これは場合による。このようなマーカーには、例えば、真核細胞培養の場合は、メトトレキサート(MTX)耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR; 米国特許第4,399,216号; 同第4,634,665号; 同第4,656,134号; 同第4,956,288号; 同第5,149,636号; および同第5,179,017号)耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン(G418)耐性遺伝子、マイコフェノール酸耐性遺伝子、またはグルタミンシンターゼ(GS; 米国特許第5,122,464号; 同第5,770,359号; および同第5,827,739号)耐性遺伝子、また、大腸菌および他の細菌または原核生物内における培養には、テトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシリン耐性遺伝子が含まれるがこれらに限定されない(上記の特許は、参照により全体として本明細書に組み込まれる)。上記で説明された宿主細胞に適切な培地および条件培地は、当技術分野で知られている。適切なベクターは、当業者には容易に明らかであろう。宿主細胞内へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストランを介するトランスフェクション、カチオン脂質を介するトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、または他の既知の方法により実施することができる。このような方法は、Sambrook、前出、第1〜4および16〜18章; Ausubel、前出、第1、9、13、15、16章など、当技術分野で説明されている。
本発明の少なくとも1つの抗体、特定部分または変異体は、融合タンパク質などの改変形態で発現させることができ、分泌シグナルだけでなく、さらなる異種機能領域も包含させることができる。例えば、さらなるアミノ酸、特に、帯電アミノ酸の領域を、抗体、特定部分または変異体のN末端に付加して、精製時、またはその後の操作および保管時の宿主細胞内における安定性および存続を改善することができる。また、本発明の抗体、特定部分または変異体にペプチド部分を付加して、精製を容易にすることができる。このような領域は、抗体または少なくとも1つのその断片の最終的な調製前に除去することができる。このような方法は、Sambrook、前出、第17.29〜17.42および18.1〜18.74章; Ausubel、前出、第16、17、および18章など、標準的な実験マニュアルにおいて説明されている。当業者は、本発明のタンパク質をコードする核酸の発現に使用可能な多くの発現系について知ることができる。
代替的に、本発明の核酸は、本発明の抗体、特定部分または変異体をコードする内因性DNAを含有する宿主細胞内における発現をオンにすることにより(宿主細胞内における操作により)、宿主細胞内で発現させることができる。このような方法は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる、米国特許第5,580,734号、同第5,641,670号、同第5,733,746号、および同第5,733,761号で説明される通り、当技術分野で知られている。
抗体、それらの特定部分または変異体を作製するのに有用な細胞培養物の例は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の懸濁液またはバイオリアクターもまた用いうるが、哺乳動物細胞系は、細胞の単層形態であることが多い。当技術分野では、完全なグリコシル化タンパク質を発現することが可能な、多くの適切な宿主細胞株が開発されており、これらには、例えば、バージニア州、マナサス、American Type Culture Collectionから容易に入手可能な、COS-1(例えば、ATCC CRL 1650)細胞株、COS-7(例えば、ATCC CRL-1651)細胞株、HEK293細胞株、BHK21(例えば、ATCC CRL-10)細胞株、CHO(例えば、ATCC CRL 1610)細胞株、およびBSC-1(例えば、ATCC CRL-26)細胞株、COS-7細胞、CHO細胞、hep G2細胞、P3X63Ag8.653細胞、SP2/0-Ag14細胞、293細胞、HeLa細胞などが含まれる。好ましい宿主細胞には、骨髄腫細胞およびリンパ腫細胞など、リンパ球由来の細胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞は、P3X63Ag8.653細胞(ATCC受託番号CRL-1580)、およびSP2/0-Ag14細胞(ATCC受託番号CRL-1851)である。特に好ましい実施形態では、組換え細胞は、P3X63Ab8.653細胞またはSP2/0-Ag14細胞である。
これらの細胞の発現ベクターには、複製起点; プロモーター(例えば、後期SV40プロモーターまたは初期SV40プロモーター、CMVプロモーター; 米国特許第5,168,062号; 同第5,385,839号)、HSV tkプロモーター、pgk(ホスホグリセリン酸キナーゼ)プロモーター、EF-1アルファプロモーター(米国特許第5,266,491号)、少なくとも1つのヒト免疫グロブリンプロモーター); エンハンサー、ならびに/または、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位(例えば、SV40大型T抗原ポリA付加部位)、および転写終結配列などのプロセシング情報部位などであるがこれらに限定されない、以上の1または複数の発現制御配列が含まれうる。例えば、Ausubelら、前出; Sambrookら、前出を参照されたい。本発明の核酸またはタンパク質を作製するのに有用な他の細胞も知られており、かつ/あるいは、例えば、American Type Culture Collectionの細胞株およびハイブリドーマカタログ(www.atcc.org)、または他の既知の供給源もしくは販売元から入手可能である。
真核宿主細胞を用いる場合は、ベクター内にポリアデニル化配列または転写終結配列を組み込むことが典型的である。終結配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子に由来するポリアデニル化配列である。転写物を正確にスプライシングするための配列もまた包含されうる。スプライシング配列の例は、SV40に由来するVP1イントロンである(Spragueら、1983年、J Virol 45、773〜81頁)。加えて、当技術分野で知られる通り、ベクター内に、宿主細胞内における複製を制御する遺伝子配列を組み込むことができる。
抗体、特定部分または変異体は、プロテインA精製、硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィーまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーが含まれるがこれらに限定されないよく知られた方法により、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。精製には、高速液体クロマトグラフィー(「HPLC」)もまた用いることができる。例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Colligan、「Current Protocols in Immunology」、または「Current Protocols in Protein Science」、ニューヨーク州、ニューヨーク、John Wiley & Sons社(1997〜2003)、例えば、第1、4、6、8、9、10章を参照されたい。
本発明の抗体、特定部分または変異体には、精製された天然生成物、化学合成手順による生成物、また、例えば、酵母細胞、高等植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含めた真核生物宿主から、組換え法により生成される生成物が含まれる。組換え作製手順で用いられる宿主に応じて、本発明の抗体、特定部分または変異体は、グリコシル化することもでき、非グリコシル化することもできるが、グリコシル化が好ましい。このような方法は、すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれる、Sambrook、前出、第17.37〜17.42節; Ausubel、前出、第10、12、13、16、18、および20章; Colligan、「Protein Science」、前出、第12〜14章など、多くの標準的な実験マニュアルにおいて説明されている。
本発明の単離抗体は、本明細書においてより完全に論じられる、本発明のポリヌクレオチドのいずれか1つによりコードされる抗体、特定部分もしくは変異体、または単離もしくは調製される任意の抗体、それらの特定部分もしくは変異体を含む。
抗体または抗原結合断片は、ヒトIL-12/23タンパク質に結合し、これにより、該タンパク質の生物学的活性を実質的に中和することが好ましい。抗体、その特定部分または変異体は、少なくとも1つのIL-12/23タンパク質の少なくとも1つの生物学的活性を部分的または好ましくは実質的に中和し、これにより、少なくとも1つのIL-12受容体に対するIL-12の結合、もしくは少なくとも1つのIL-23受容体に対するIL-23の結合を介するか、またはIL-12もしくはIL-23に依存するかもしくはこれを介する他の機構を介する活性を阻害する。本明細書で用いられる「中和抗体」という用語は、ヒトIL-12p40タンパク質またはIL-12p40断片に関連-依存する活性を、約20〜120%、好ましくは、アッセイに応じて、少なくとも約60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%以上阻害しうる抗体を指す。本明細書に記載される通り、かつ/または当技術分野で知られている通り、抗体または特定部分もしくは変異体がヒトIL-12/23に関連-依存する活性を阻害する能力は、少なくとも1つの適切な抗体アッセイまたはタンパク質アッセイにより評価することが好ましい。本発明の抗体、特定部分または変異体は、任意のクラス(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD)またはアイソタイプでありえ、カッパ軽鎖またはラムダ軽鎖を含みうる。一実施形態では、抗体または特定部分もしくは変異体は、IgG重鎖または規定の断片、例えば、アイソタイプIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のうちの少なくとも1つを含む。この種の抗体は、本明細書で記載され、かつ/または当技術分野で知られている少なくとも1つのヒト軽鎖(例えば、IgG、IgA、およびIgM; 例えば、γ1、γ2、γ3、γ4)トランス遺伝子を含むトランスジェニックマウスまたは他のトランスジェニック非ヒト哺乳動物を用いることにより調製することができる。別の実施形態では、抗体、その特定部分または変異体は、IgG1重鎖およびIgG1軽鎖を含む。
本発明の少なくとも1つの抗体、特定部分または変異体は、IL-12p40タンパク質、IL-12p40断片、IL-12p40部分、またはこれらの任意の組合せに特異的な、少なくとも1つの特定のエピトープに結合する。非限定的な例として述べると、抗体、特定部分または変異体は、IL-12p40サブユニットの全アミノ酸配列のうちの少なくとも1〜3アミノ酸を含む、少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する。少なくとも1つの特定のエピトープは、配列番号1(ヒトIL-12p40サブユニット; 306アミノ酸)の1〜10、10〜20、20〜30、30〜40、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100、100〜110、110〜120、120〜130、130〜140、140〜150、150〜160、160〜170、170〜180、180〜190、190〜200、200〜210、210〜220、220〜230、230〜240、240〜250、250〜260、260〜270、280〜290、290〜300、300〜306、1〜7、14〜21、29〜52、56〜73、83〜93、96〜105、156〜175、194〜204、208〜246、254〜273、279〜281、または289〜300のうちの少なくとも1つによる、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14アミノ酸などであるがこれらに限定されない、IL-12p40の少なくとも1つのアミノ酸の任意の組合せを含みうる。これらの予測されるエピトープは、IL-12、IL-23、IL-12p40単量体上、およびIL-12p80ホモ二量体上において入手可能である。
抗体は、規定のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域または軽鎖可変領域のうちの少なくとも1つを含みうる。例えば、好ましい実施形態では、抗体は、少なくとも1つの重鎖可変領域および/または少なくとも1つの軽鎖可変領域のうちの少なくとも1つを含む。ヒトIL-12/23タンパク質および/またはヒトIL-12/23断片に結合し、また、規定の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むヒト抗体は、ファージディスプレイ(Katsubeら、1998年、Int J Mol Med 1、863〜8頁)、または、当技術分野で知られ、かつ/もしくは本明細書で記載されるトランスジェニック動物を用いる方法など、適切な方法を用いて調製することができる。例えば、機能的に再配置されたヒト免疫グロブリン重鎖トランス遺伝子と、機能的再配置を受ける可能性のあるヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に由来するDNAを含むトランス遺伝子とを含むトランスジェニックマウスを、ヒトIL-12および/もしくはIL-23タンパク質、それらの受容体、ならびに/または断片により免疫化し、抗体の生成を誘発することができる。所望の場合、本明細書に記載の通り、かつ/または当技術分野で知られている通り、抗体生成細胞を単離することができ、また、ハイブリドーマまたは他の不死化された抗体生成細胞を調製することができる。代替的に、抗体、特定部分または変異体は、適切な宿主細胞内において、コード核酸またはその一部を用いて発現させることもできる。
本発明はまた、本明細書に記載のアミノ酸配列と実質的に同じ配列中のアミノ酸を含む、抗体、抗原結合断片、免疫グロブリン鎖、およびCDRにも関する。好ましくは、このような抗体または抗原結合断片、およびこのような鎖またはCDRを含む抗体は、高度のアフィニティー(例えば、約10-9M以下のKD)でヒトIL-12/23タンパク質および/またはヒトIL-12/23断片に結合しうる。本明細書に記載の配列と実質的に同じアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換のほか、アミノ酸の欠失および/または挿入を含む配列を包含する。保存的アミノ酸置換とは、第1のアミノ酸の化学的特性および/または物理的特性(例えば、電荷、構造、極性、疎水性/親水性)と同様の化学的特性および/または物理的特性を有する第2のアミノ酸による、第1のアミノ酸の置換を指す。保存的置換は、以下の群: リシン(K)、アルギニン(R)、およびヒスチジン(H); アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E); アスパラギン(N)、グルタミン(Q)、セリン(S)、トレオニン(T)、チロシン(Y)、K、R、H、D、およびE; アラニン(A)、バリン(V)、ロイシン(L)、イソロイシン(I)、プロリン(P)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、メチオニン(M)、システイン(C)、およびグリシン(G); F、W、およびY; C、S、およびT内における別のアミノ酸による1つのアミノ酸の置換を包含する。
本発明の抗体または特定部分もしくは変異体は、本明細書で指定される天然の突然変異または人的操作に由来する1または複数のアミノ酸の置換、欠失、または付加を包含しうる。当然ながら、当業者が作製するアミノ酸置換の数は、上記で説明した因子を含めた多くの因子に依存する。一般的に述べると、所与の任意の結合ポリペプチドに対するアミノ酸の置換、挿入、または欠失の数は、本明細書で指定される通り、1〜30またはその間の範囲もしくは値など、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1を超えるものではない。
機能に不可欠である、本発明の抗体、特定部分または変異体内のアミノ酸は、部位指向突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘発など、当技術分野で知られる方法(例えば、Ausubel、前出、第8、15章; Cunninghamら、1989年、Science 244、1081〜5頁)により同定することができる。後者の手順では、分子中のすべての残基において、単一のアラニン突然変異を導入する。次いで、結果として得られる突然変異体分子を、少なくとも1つのIL-12/23中和活性などであるがこれらに限定されない生物学的活性について試験する。抗体、特定部分または変異体の結合に極めて重要な部位はまた、結晶化、核磁気共鳴、または光アフィニティーによる標識化(de Vosら、1992年、Science 255、306〜12頁; Smithら、1992年、J Mol Biol 224、899〜904頁)などの構造的解析によっても同定することができる。
別の態様では、本発明は、有機部分の共有結合により修飾される、本明細書に記載の抗体および抗原結合断片に関する。このような修飾により、薬物動態特性(例えば、in vivoにおける血清半減期)が改善された抗体または抗原結合断片を作製することができる。有機部分は、直鎖状または分枝鎖状の親水性ポリマー基の場合もあり、脂肪酸基の場合もあり、脂肪酸エステル基の場合もある。特定の実施形態では、親水性ポリマー基は、約800〜約120,000ドルトンの分子量を有することが可能であり、また、ポリアルカングリコール(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコール(PPG))、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、またはポリビニルピロリドンでありえ、また、脂肪酸基または脂肪酸エステル基は、約8〜40個の炭素原子を含みうる。
本発明の修飾された抗体および抗原結合断片は、抗体、特定部分または変異体に直接的または間接的に共有結合した1または複数の有機部分を含みうる。本発明の抗体または抗原結合断片に結合する各有機部分は、個別に、親水性ポリマー基の場合もあり、脂肪酸基の場合もあり、脂肪酸エステル基の場合もある。本明細書で用いられる「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。本明細書で用いられる「親水性ポリマー基」という用語は、オクタン中より水中において溶けやすい有機ポリマーを指す。例えば、ポリリシンは、オクタン中より水中において溶けやすい。したがって、ポリリシンの共有結合により修飾された抗体は、本発明により包含される。本発明の抗体を修飾するのに適する親水性ポリマーは、直鎖状の場合もあり、分枝鎖状の場合もあり、また、これらには、例えば、ポリアルカングリコール(例えば、PEG、モノメトキシ-ポリエチレングリコール(mPEG)、PPGなど)、炭水化物(例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など)、親水性アミノ酸のポリマー(例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など)、ポリ酸化アルカン(例えば、ポリ酸化エチレン、ポリ酸化プロピレンなど)、およびポリビニルピロリドンが含まれる。本発明の抗体を修飾する親水性ポリマーは、個別の分子的実体として、約800〜約150,000ドルトンの分子量を有することが好ましい。例えば、PEG5000およびPEG20,000(ここで、添え字は、ドルトン単位によるポリマーの平均分子量である)を用いることができる。
親水性ポリマー基は、1〜約6のアルキル基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基により置換することができる。脂肪酸基または脂肪酸エステル基により置換される親水性ポリマーは、適切な方法を用いることにより調製することができる。例えば、アミノ基を含むポリマーは、脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボン酸に結合させることができ、脂肪酸または脂肪酸エステル上で活性化されたカルボン酸(例えば、N,N-カルボニルジイミダゾールにより活性化された)は、ポリマー状のヒドロキシル基に結合させることができる。
本発明の抗体を修飾するのに適する脂肪酸および脂肪酸エステルは、飽和させる場合もあり、1または複数単位の不飽和を含有させる場合もある。本発明の抗体を修飾するのに適する脂肪酸には、例えば、n-ドデカン酸(C12、ラウリン酸)、n-テトラデカン酸(C14、ミリスチン酸)、n-オクタデカン酸(C18、ステアリン酸)、n-エイコサン酸(C20、アラキジン酸)、n-ドコサン酸(C22、ベヘン酸)、n-トリアコンタン酸(C30)、n-テトラコンタン酸(C40)、cis-Δ9-オクタデカン酸(C18、オレイン酸)、all cis-Δ5,8,11,14-エイコサテトラエン酸(C20、アラキドン酸)、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などが含まれる。適切な脂肪酸エステルには、直鎖状または分枝鎖状の低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルが含まれる。低級アルキル基は、1〜約12個、好ましくは1〜約6個の炭素原子を含みうる。
修飾抗体および修飾抗原結合断片は、1または複数の修飾剤との反応など、適切な方法を用いて調製することができる。本明細書で用いられる「修飾剤」という用語は、活性化基を含む適切な有機基(例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル)を指す。「活性化基」とは、適切な条件下で第2の化学基と反応し、これにより、修飾剤と第2の化学基との共有結合を形成しうる化学部分または官能基である。例えば、アミン反応性活性化基には、トシル酸、メシル酸、ハロ(クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード)、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル(NHS)などの求電子基が含まれる。チオールと反応しうる活性化基には、例えば、マレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、5-チオール-2-ニトロ安息香酸チオール(TNB-チオール)などが含まれる。アルデヒド官能基は、アミン含有分子またはヒドラジド含有分子に結合することが可能であり、アジド基は、3価のリン酸基と反応して、ホスホルアミデート結合またはホスホルイミド結合を形成しうる。活性化基を分子内へと導入するのに適する方法は、当技術分野で知られている(例えば、Hermanson, G. T.、「Bioconjugate Techniques」、カリフォルニア州、サンディエゴ、Academic Press社(1996)を参照されたい)。活性化基は、有機基(例えば、親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル)に直接結合させることもでき、リンカー部分、例えば、2価のC1〜C12基[式中、1または複数の炭素原子を、酸素、窒素、または硫黄などのヘテロ原子により置換することができる]を介して結合させることもできる。適切なリンカー部分には、例えば、テトラエチレン、グリコール、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2)2-NH-、および-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-が含まれる。リンカー部分を含む修飾剤は、例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)の存在下で、モノ-Boc-アルキルジアミン(例えば、モノ-Boc-エチレンジアミン、モノ-Boc-ジアミノヘキサン)を、脂肪酸と反応させ、遊離アミンと脂肪酸のカルボン酸との間でアミド結合を形成させることにより作製することができる。Boc保護基は、説明した通り、トリフルオロ酢酸(TFA)で処理して、別のカルボン酸に結合しうる第一級アミンに曝露することにより生成物から除去することもでき、これをマレイン酸無水物と反応させて、結果として得られる生成物を環化させて、脂肪酸の活性化マレイミド誘導体を生成させることもできる(例えば、その教示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、Thompsonら、WO92/16221を参照されたい)。
本発明の修飾抗体は、抗体または抗原結合断片を修飾剤と反応させることにより生成することができる。例えば、アミン反応性修飾剤、例えば、PEGのNHSエステルを用いることにより、部位特異的でない形で、有機部分を抗体に結合させることができる。修飾抗体または修飾抗原結合断片はまた、抗体または抗原結合断片のジスルフィド結合(例えば、鎖内のジスルフィド結合)を還元することによっても調製することができる。次いで、還元抗体または還元抗原結合断片を、チオール反応性修飾剤と反応させて、本発明の修飾抗体を生成させる。本発明の抗体、特定部分または変異体の特定の部位に結合する有機部分を含む修飾抗体および修飾抗原結合断片は、逆相タンパク質分解(Fischら、1992年、Bioconjug Chem 3、147〜53頁; Werlenら、1994年、Bioconjug Chem 5、411〜7頁; Capellasら、1997年、Biotechnol Bioeng 56、456〜63頁; Kumaranら、1997年、Protein Sci 6、2233〜41頁; また、Hermanson, G. T.、「Bioconjugate Techniques」、カリフォルニア州、サンディエゴ、Academic Press社(1996)に記載の方法)などの適切な方法を用いて作製することができる。
本発明の抗体組成物は、場合によって、抗感染症薬、心血管(CV)系薬、中枢神経系(CNS)薬、自律神経系(ANS)薬、気道薬、消化器(GI)管薬、ホルモン薬、体液平衡薬または電解質平衡薬、血液作用薬、抗新生物薬、免疫調節薬、眼科薬、耳鼻咽喉科薬、局所薬、栄養薬などのうちの少なくとも1つから選択される、有効量の、少なくとも1つの化合物またはタンパク質をさらに含みうる。このような薬物は、本明細書で示される各々の薬物についての製剤、適応、用量、および投与を含め、当技術分野でよく知られている(例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、「Nursing 2001 Handbook of Drugs」、第21版、ペンシルベニア州、スプリングハウス、Springhouse社、2001年;「Health Professional's Drug Guide 2001」、Shannon、Wilson、Stang編、ニュージャージー州、アッパーサドルリバー、Prentice-Hall社;「Pharmcotherapy Handbook」、Wellsら、コネチカット州、スタンフォード、Appleton & Lange社を参照されたい)。
本発明の抗体、特定部分または変異体による組成物は、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、凍結乾燥溶媒、防腐剤、アジュバントなどであるがこれらに限定されない、任意の適切な補助剤のうちの少なくとも1つをさらに含みうる。薬学的に許容される補助剤が好ましい。このような滅菌溶液の非限定的な例、およびこれらを調製する方法は、Gennaro編、「Remington's Pharmaceutical Sciences」、第18版、Mack Publishing社(ペンシルベニア州、イーストン)、1990年などであるがこれらに限定されない当技術分野でよく知られている。当技術分野でよく知られている通り、または本明細書に記載の通り、抗体組成物の投与方式、可溶性、および/または安定性に適する、薬学的に許容される担体は、日常的に選択することができる。
本組成物において有用な医薬賦形剤および医薬添加剤には、単剤で存在する場合もあり、組合せで存在する場合もあり、単独で含まれる場合もあり、重量または容量で1〜99.99%の組合せで含まれる場合もある、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖; アルジトール、アルドン酸、エステル化糖など、誘導体化糖; ならびに多糖または糖ポリマーを含めた糖)が含まれるがこれらに限定されない。例示的なタンパク質賦形剤には、ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒトアルブミン(rHA)などの血清アルブミン、ゼラチン、カゼインなどが含まれる。緩衝能においてもまた機能しうる代表的なアミノ酸には、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルタームなどが含まれる。好ましい1つのアミノ酸は、グリシンである。
本発明で用いるのに適する炭水化物賦形剤には、例えば、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D-マンノース、ソルボースなどの単糖; ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖; ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖; およびマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、ソルビトール(グルシトール)、ミオイノシトールなどのアルジトールが含まれる。本発明で用いるのに好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、およびラフィノースである。
抗体組成物はまた、緩衝剤またはpH調整剤もまた包含する場合があり、緩衝剤は、有機酸または有機塩基から調製される塩である。代表的な緩衝剤には、クエン酸塩、アスコルビン酸酸塩、グルコン酸酸塩、炭酸酸塩、酒石酸酸塩、コハク酸酸塩、酢酸酸塩、またはフタル酸塩などの有機酸塩; トリス緩衝剤、塩酸トロメタミン緩衝剤、またはリン酸緩衝剤が含まれる。本組成物において用いるのに好ましい緩衝剤は、クエン酸塩などの有機酸塩である。
加えて、本発明の抗体、特定部分または変異体による組成物は、ポリビニルピロリドン、フィコール(ポリマー糖)、デキストレート(例えば、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンなどのシクロデキストリン)、ポリエチレングリコール、芳香剤、抗菌剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤(例えば、「TWEEN(登録商標) 20」および「TWEEN(登録商標) 80」などのポリソルベート)、脂質(例えば、リン脂質、脂肪酸)、ステロイド(例えば、コレステロール)、およびキレート化剤(例えば、EDTA)などのポリマー賦形剤/添加剤も包含しうる。
本発明による抗体組成物において用いるのに適する、これらの、およびさらなる、既知の医薬賦形剤および/または医薬添加剤は、例えば、その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる、「Remington: The Science & Practice of Pharmacy」、第19版、Williams & Williams社(1995); および「Physician's Desk Reference」、第52版、ニュージャージー州、モントベール、Medical Economics社(1998)において列挙される通り、当技術分野において知られている。好ましい担体物質または賦形剤物質は、炭水化物(例えば、糖およびアルジトール)および緩衝剤(例えば、クエン酸)またはポリマー剤である。
本発明は、薬学的に許容される製剤中に、少なくとも1つの抗体、特定部分または変異体を含む、医薬使用または獣医薬使用に適する、好ましくは、生理食塩液または選択された塩を伴うリン酸緩衝液を含む安定的製剤、ならびに防腐剤を含有する防腐溶液および防腐製剤、ならびに複数回使用のための防腐製剤を提供する。防腐製剤は、水性希釈剤中に、少なくとも1つの既知の防腐剤、または場合によって、水性希釈剤中における少なくとも1つのフェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム(例えば、六水和物)、アルキルパラベン(メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンなど)、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、またはこれらの混合物からなる群から選択される防腐剤を含有する。0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、またはその間の任意の範囲もしくは値などであるがこれらに限定されない、0.001〜5%またはその間の任意の範囲もしくは値など、当技術分野で知られる任意の適切な濃度または混合物を用いることができる。非限定的な例には、防腐剤なし、0.1〜2%のm-クレゾール(例えば、0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0%)、0.1〜3%のベンジルアルコール(例えば、0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5%)、0.001〜0.5%のチメロサール(例えば、0.005、0.01%)、0.001〜2.0%のフェノール(例えば、0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0%)、0.0005〜1.0%のアルキルパラベン(複数可)(例えば、0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0%)などが含まれる。
本発明の任意の方法は、少なくとも1つの抗体、特定部分または変異体を含む有効量の組成物または医薬組成物を、このような調節、治療、または療法を必要とする細胞、組織、内臓、動物、または患者に投与するステップを含みうる。このような方法は、場合によって、このような免疫疾患を治療するための共投与または組合せ療法をさらに含む場合があり、この場合、前記少なくとも1つの抗体、その特定部分または変異体を投与するステップは、その前において、それと同時に、またはその後において、少なくとも1つの多発性硬化症治療剤(ベータインターフェロン1aおよびベータインターフェロン1b(例えば、Avonex(商標)、Rebif(商標)、Betaseon(商標))、酢酸グラチラマー(例えば、Copaxone)、シクロホスファミド、アザチオプリン、グルココルチコステロイド、メトトレキサート、パクリタキセル、2-クロロデオキシアデノシン、ミトキサントロン、IL-10、TGBb、CD4、CD52、アンテグレン、CD11、CD18、TNFアルファ、IL-1、IL-2、および/もしくはCD4に対する抗体もしくは抗体受容体の融合体、インターフェロンアルファ、免疫グロブリン、リスミド(Requinimax(商標))、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、エルプロジル、ピルフェニドン、経口ミエリン、またはミエリン破壊に関する自己免疫性の抑制、免疫調節、T細胞の活性化、増殖、遊走、および/もしくはサプレッサー細胞機能、T細胞受容体/ペプチド/MHC-II間相互作用の阻害、T細胞アネルギーの誘導、自己反応性T細胞の欠失、血液脳関門を越える輸送の低下、炎症促進性(TH1型)サイトカインおよび免疫調節性(TH2型)サイトカインの平衡の変化、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の阻害、神経保護、神経膠症、再有髄化の促進のうちの1もしくは複数に対して作用する化合物が含まれるがこれらに限定されない)、TNFアンタゴニスト(例えば、TNFに対する抗体もしくは断片、可溶性TNF受容体もしくはその断片、融合タンパク質、または低分子TNFアンタゴニストであるがこれらに限定されない)、抗リウマチ剤、筋弛緩剤、催眠剤、非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、鎮痛剤、麻酔剤、鎮静剤、局所麻酔剤、神経筋遮断剤、抗菌剤(例えば、アミノグリコシド、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、カルバペネム、セファロスポリン、フルオロキノロン、マクロリド、ペニシリン、スルホンアミド、テトラサイクリン、別の抗菌剤)、抗乾癬剤、コルチコステロイド、アナボリックステロイド、IL-23剤、IL-12剤、ミネラル、栄養剤、甲状腺剤、ビタミン、カルシウム関連ホルモン、止瀉剤、鎮咳剤、制吐剤、抗潰瘍剤、下剤、抗凝血剤、エリスロポエチン(例えば、エポエチンアルファ)、フィルグラスチム(例えば、G-CSF、Neupogen(登録商標))、サルグラモスチム(GM-CSF、Leukine)、免疫化剤、免疫グロブリン、免疫抑制剤(例えば、バシリキシマブ、シクロスポリン、ダクリズマブ)、成長ホルモン、ホルモン置換薬、エストロゲン受容体調節剤、散瞳剤、毛様体筋麻痺剤、アルキル化剤、抗代謝剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬、抗うつ剤、抗躁剤、抗精神病剤、精神安定剤、睡眠剤、交感神経様作用剤、刺激剤、ドネペジル、タクリン、喘息薬、ベータアゴニスト、吸入用ステロイド、ロイコトリエン阻害剤、メチルキサンチン、クロモリン、エピネフリンもしくは類似体、ドルナーゼアルファ(Pulmozyme (登録商標))、サイトカイン、またはサイトカインアンタゴニストから選択される少なくとも1つを投与するステップをさらに含む。適切な用量は当技術分野で知られれている。例えば、それらの参考文献の各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Wellsら編、「Pharmacotherapy Handbook」、第2版、コネチカット州、スタンフォード、Appleton and Lange社(2000);「PDR Pharmacopoeia」、「Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000」、デラックス版、カリフォルニア州、ロマリンダ、Tarascon Publishing社(2000)を参照されたい。
本発明の組成物、組合せ療法、共投与、デバイス、および/または方法(本発明の少なくとも1つの抗体、その特定部分および変異体をさらに含む)に適するTNFアンタゴニストには、抗TNF抗体、その抗原結合断片、およびTNFに特異的に結合する受容体分子; サリドマイド、テニダップ、ホスホジエステラーゼ阻害剤(例えば、ペントキシフィリンおよびロリプラム)、A2bアデノシン受容体アゴニスト、およびA2bアデノシン受容体増強剤など、TNFの合成、TNFの放出、または標的細胞に対するその作用を阻止および/または阻害する化合物; マイトジェン活性化タンパク質(MAP)キナーゼ阻害剤など、TNF受容体によるシグナル伝達を阻止および/または阻害する化合物; メタロプロテイナーゼ阻害剤など、膜におけるTNF切断を遮断および/または阻害する化合物; アンジオテンシン転換酵素(ACE)阻害剤(例えば、カプトプリル)など、TNF活性を遮断および/または阻害する化合物; ならびにMAPキナーゼ阻害剤など、TNFの生成および/または合成を遮断および/または阻害する化合物が含まれるがこれらに限定されない。
本明細書で用いられる「腫瘍壊死因子抗体」、「TNF抗体」、「TNFα抗体」、または断片などは、in vitro、in situ、および/または、好ましくはin vivoにおけるTNFα活性を低減、遮断、阻害、無効化するか、またはこれに干渉する。例えば、本発明に適するTNFヒト抗体は、TNFαに結合することが可能であり、これには、抗TNF抗体、それらの抗原結合断片、また、TNFαに特異的に結合するそれらの特定の変異体またはドメインが含まれる。適切なTNF抗体または断片はまた、TNF RNA、TNF DNA、またはTNFタンパク質の合成、TNFの放出、TNF受容体によるシグナル伝達、膜内TNFの切断、TNF活性、TNFの生成および/または合成も低減、遮断、無効化し、これらに干渉し、これらを阻止し、かつ/または阻害しうる。
本発明において有用な、好ましいTNF受容体分子は、高度のアフィニティーでTNFαに結合し(それらの参考文献が参照により全体として本明細書に組み込まれる、Feldmannら、国際公開第WO92/07076号; Loetscherら、1990年、Cell 61、351〜9頁; Schallら、1990年、Cell 61、361〜70頁を参照されたい)、また、場合によって低度の免疫原性を有するTNF受容体分子である。特に、55kDa(p55 TNF-R)および75kDa(p75 TNF-R)のTNF細胞表面受容体が、本発明では有用である。該受容体の細胞外ドメイン(ECD)またはそれらの機能性部分を含む、これらの受容体の切断形態(例えば、Corcoranら、1994年、Eur J Biochem 223、831〜40頁を参照されたい)もまた、本発明において有用である。ECDを含むTNF受容体の切断形態は、尿および血清中において、30kDaおよび40kDaのTNFα阻害抗体として検出されている(Engelmannら、1990年、J Biol Chem 265、1531〜6頁)。TNF受容体の多量体分子、およびTNF免疫受容体融合分子、ならびにそれらの誘導体および断片または部分が、本発明の方法および組成物において有用なTNF受容体分子のさらなる例である。本発明において用いうるTNF受容体分子は、長期間にわたり、症状に対する良好〜極めて良好な緩和および低度の毒性により患者を治療するそれらの能力により特徴づけられる。低度の免疫原性および/または高度のアフィニティーのほか、いまだ規定されていない他の特性が、達成される治療結果に寄与しうる。
病態の治療は、組成物中に含有される抗体、特定部分または変異体の比活性に応じて、総量の平均で、1回の投与当たり、患者キログラム当たり、少なくとも約0.01〜500ミリグラムの範囲の、少なくとも1つの抗体、特定部分または変異体、また好ましくは、単回または複数回の投与当たり、患者キログラム当たり、少なくとも約0.1〜100ミリグラムの範囲の、少なくとも1つの抗体、特定部分または変異体となる、有効量または有効用量の少なくとも1つの抗体組成物を投与することにより実施されることが典型的である。代替的に、有効血清濃度は、単回または複数回の投与当たり0.1〜5000μg/mlの血清濃度を含みうる。適切な用量は、医療従事者に知られており、当然ながら、特定の疾患状態、投与される組成物の比活性、および治療を受ける特定の患者に依存する。一部の場合において、所望の治療量を達成するには、反復投与、すなわち、モニタリングまたは計量された特定の用量による個別の反復投与(この場合、毎日の所望の用量または所望の効果が達成されるまで、個別の投与が反復される)を施すことが必要でありうる。単回もしくは複数回の投与当たり0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、および/または5000μg/mlの血清濃度、またはこれらの間の任意の範囲、値、もしくは画分を達成するのに好ましい用量には、場合によって、1回の投与当たり、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99および/もしくは100mg/kg、またはこれらの間の任意の範囲、値、もしくは画分が含まれうる。
代替的に、投与される用量は、特定の薬剤の薬力学的特徴、ならびにその投与方式および投与経路; 受容者の年齢、健康、および体重; 症状の性格および程度、併用治療の種類、治療頻度、ならびに所望の効果など、既知の因子に応じて変化しうる。通常、有効成分の用量は、体重1キログラム当たり約0.1〜100ミリグラムでありうる。所望の結果を得るには、通常、投与1回当たり、1キログラム当たり0.1〜50ミリグラム、また好ましくは、0.1〜10ミリグラム、または持続放出形態が有効である。
非限定的な例として述べると、ヒトまたは動物の治療は、第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40日のうちの少なくとも1日、または代替的にもしくは加えて、第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、または52週のうちの少なくとも1週間、または代替的にもしくは加えて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20年間のうちの少なくとも1年間において、1日当たり0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90、または100mg/kgなど、0.1〜100mg/kgである、少なくとも1つの抗体、特定部分または変異体の1回の用量または定期的な用量として施すことができる。
内用投与に適する剤形(組成物)は一般に、1単位または容器1個当たり約0.1ミリグラム〜約500ミリグラムの有効成分を含有する。これらの医薬組成物において、有効成分は通常、該組成物の総重量に基づく重量で、約0.5〜99.999%の量で存在する。
非経口投与の場合、抗体、特定部分または変異体は、溶液、懸濁液、エマルジョンとして、または、薬学的に許容される非経口媒体と共に、もしくはこれとは別に提供される凍結乾燥粉末として調合することができる。このような媒体の例は、水、生理食塩液、リンゲル液、デキストロース液、および1〜10%のヒト血清アルブミンである。リポソーム、また固定油などの非水性媒体もまた、用いることができる。媒体または凍結乾燥粉末は、等張性(例えば、塩化ナトリウム、マンニトール)、および化学的安定性(例えば、緩衝剤および防腐剤)を維持する添加剤を含有しうる。製剤は、既知であるかまたは適切な技法により滅菌することができる。
適切な医薬担体は、この分野における標準的な参考文献である「Remington's Pharmaceutical Sciences」、A. Osolの最新版において説明されている。
本発明の抗体を、長期間にわたり、例えば、単回投与から1週間〜1年間にわたり対象に送達することが望ましい場合がありうる。各種の徐放剤形、デポ剤形、または植え込み剤形を用いることができる。例えば、剤形は、体液中における可溶性が低度である化合物の薬学的に許容される非毒性塩、例えば、(a)リン酸、硫酸、クエン酸、酒石酸、タンニン酸、パモ酸、アルギニン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンモノスルホン酸またはナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などの多塩基酸による酸添加塩; (b)亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどの多価金属カチオン、または、例えば、N,N'-ジベンジル-エチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成される有機カチオンによる塩; あるいは(c)例えば、亜鉛のタンニン酸塩など、(a)および(b)の組合せを含有しうる。加えて、本発明の化合物、または好ましくは、いま説明した塩など、比較的不溶性の塩を、ゲル、例えば、注射に適する、例えば、ゴマ油を伴う、モノステアリン酸アルミニウムゲル中で調合することもできる。特に好ましい塩は、亜鉛塩、亜鉛のタンニン酸塩、パモ酸塩などである。注射用の徐放デポ製剤の別の種類は、例えば、米国特許第3,773,919号で説明されるポリ乳酸/ポリグリコール酸ポリマーなどの緩徐分解性、非毒性、非抗原性のポリマー内における封入用に分散させた化合物または塩を含有する。上記の化合物または塩などの化合物、または好ましくは、比較的不溶性の塩はまた、特に動物において用いる場合、コレステロールマトリックスによるシラスティックペレット中で調合することができる。さらなる徐放製剤、デポ製剤、または植え込み製剤、例えば、気体または液体のリポソームは、文献において知られている(米国特許第5,770,222号; および「Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems」、J. R. Robinson編、ニューヨーク州、Marcel Dekker社、1978年)。
本発明を一般的に説明してきたが、これは、例示を目的として示されるものであり、限定として意図されるものではない以下の実施例を参照することにより、より容易に理解される。
(実施例)
これらの実施例におけるIL-12、IL-23、IL-12p40、IL-12p80、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2およびIL-23への言及はすべて、他の方法で述べられることがなければヒト型のタンパク質のことである。
これらの実施例に収載されている抗体ごとの対応するタンパク質およびDNA配列についてはTABLE10(表10)を参照されたい。
(実施例1)
1.1 ハイブリドーマの単離およびキメラ抗体の作製
標準マウスハイブリドーマ作製技術および抗原として組換えIL-12を使用して、2種のハイブリドーマ細胞系統、すなわちPMA202とPMA204が得られた。これらの細胞系統は、ELISAにおいて試験されると、IL-12p40(配列番号1)、IL-12(配列番号1および配列番号2)ならびにIL-23(配列番号1および配列番号3)に結合する抗体を分泌した(PMA204-図3)。前記抗体は、マウスIgG1カッパとしてアイソタイプされた。
細胞系統PMA202およびPMA204からRNAを抽出後、PCR技術を使用して、マウス重鎖および軽鎖可変領域の配列が得られた。これらの配列は以下の通りであり、CDRは下線が施されKabat(Kabatら1971年、Ann N Y Acad Sci 190 382〜93ページとKabat, E.A.ら、(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版、米国保健福祉省NIH刊行物第91-3242号)に従って定義されている。抗体の可変領域をコードするそれに続くタンパク質配列はすべて、Kabat番号付けシステムに従って番号付けされていることに注意されたい。
PMA202マウス重鎖可変領域(配列番号4)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNFKNEDTATYFCARSLSTMITTTFAYWGQGTLVTVSS
PMA202マウス軽鎖可変領域(配列番号5)
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKR
PMA204マウス重鎖可変領域(配列番号6)
EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNACKELRYFDVWGAGTTVTVSS
PMA204マウス軽鎖可変領域(配列番号7)
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKR
PMA202タンパク質配列を鋳型として使用して、以下に見られるようにマウス重鎖可変領域がヒトIgG1ドメイン(CH1、CH2およびCH3)(配列番号8)に移植され軽鎖可変領域がヒトカッパ定常ドメイン(配列番号9)に移植された新規の最適化されたヌクレオチド配列が作製された。このキメラ抗体は抗体202.1と命名された:
抗体202.1重鎖(配列番号10)
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNFKNEDTATYFCARSLSTMITTTFAYWGQGTLVTVSSASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗体202.1軽鎖(配列番号11)
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
PMA204タンパク質配列を鋳型として使用して、以下に見られるようにマウス重鎖可変領域がヒトIgG1ドメイン(CH1、CH2およびCH3)(配列番号8)に移植され軽鎖可変領域がヒトカッパ定常ドメイン(配列番号9)に移植された新規の最適化されたヌクレオチド配列が作製された。このキメラ抗体は抗体1と命名された。
抗体1重鎖(配列番号12)
EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNACKELRYFDVWGAGTTVTVSSASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
抗体1軽鎖(配列番号13)
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
両抗体はHEK細胞系統において過渡的に産生され、プロテインAクロマトグラフィーを使用して精製された。抗体1は、IL-12、IL-23、IL-12p40に対してELISA(図3)および表面プラズモン共鳴(SPR)(TABLE1(表1))アッセイにおいて試験され、IL-12/23のp40サブユニットに特異的であることが明らかにされた。結合プロファイルは、元のマウス抗体PMA204の結合プロファイルに類似していた(図3)。
(実施例2)
2.1 PMA204および抗体1の特異性
PMA204および抗体1は、ELISAを使用して決定すると、ヒトIL-12、IL-23、IL-12p40およびIL-12p80に用量依存的な形で等しくよく結合した(図3)。SPRを使用して、ka(結合速度)、kd(解離速度)および平衡解離定数(KD)を含む抗体1の速度論的データが計算され、TABLE1(表1)に収載されている。抗体1は、40〜70pM間の類似のKD値でヒトIL-12、IL-23、IL-12p40に結合した(TABLE1(表1))。
2.2 PMA204および抗体1は、IL-12Rβ2に対するIL-12結合およびIL-23Rに対するIL-23結合を中和する
受容体中和アッセイを使用して、PMA204および抗体1は、IL-12Rβ2の細胞外ドメイン(配列番号15)に対するIL-12の結合(図4A)およびIL-23Rの細胞外ドメイン(配列番号16)に対するIL-23の結合(図4B)を中和することが実証された。
2.3 PMA204および抗体1は、IL-12Rβ1に対するIL-12、IL-12p40、IL-12p80またはIL-23結合を中和しない
PMA204および抗体1は、IL-12Rβ1(配列番号14)に対するIL-12およびIL-12p80の結合を中和しない(図5)。IL-12Rβ1に対するIL-12p40およびIL-23結合は、PMA204または抗体1により阻害されなかった(図6)。
2.4 抗体1は、IL-12Rβ1トランスフェクトされた細胞系統へのIL-12/23の結合を阻害しない
IL-12Rβ1を過剰発現している安定的にトランスフェクトされたJurkat細胞系統が作製された。この細胞系統は、フローサイトメトリーにより決定されるように、IL-12Rβ2およびIL-23Rに対して陰性であった。細胞系統へのIL-12p40、IL-12およびIL-23の結合は、フローサイトメトリーを使用して確認された。抗体1および抗体202.1をIL-12p40、IL-12またはIL-23を用いて滴定する実験では、抗体202.1は、IL-12Rβ1 Jurkat細胞系統へのサイトカイン結合の滴定可能な阻害を実証した(図7)。これとは対照的に、抗体1はIL-12Rβ1 Jurkat細胞系統へのIL-12、IL-23またはIL-12p40鎖のいずれか単独の結合を感知できるほど中和することはなかった(図7)。IL-12とIL-23両方の平均蛍光強度は、抗体1濃度を1μg/mlまで増加するに従って増加し、抗体-サイトカイン-受容体複合体の形成を反映していた(図7)。
2.5 抗体1はトランスフェクトされた細胞系統上のIL-12Rβ1に結合しているIL-12、IL-23と複合体を形成する
抗体1は、トランスフェクトされた細胞表面上のIL-12Rβ1に結合しているIL-12、IL-23またはIL-12p40鎖に強力に結合した(図8)。この複合体は生物系において発生して、抗体のFc領域がFc結合受容体と相互作用をすることを可能にするような方向に抗体を提示することができると想像することが可能であろう。そのような受容体は、エフェクター細胞上に存在して、ADCCおよびCDC活性を誘導し、それによって、抗体-サイトカイン-受容体複合体が形成される標的細胞に対して細胞障害性効果を示すことが可能であろう。これとは対照的に、抗体202.1は、サイトカイン-受容体複合体への無視できるほどの結合しか示さなかった。
(実施例3)
3.1 抗体1の最適化
3.1.1 軽鎖における94位でのW
Yangら、2007年 J Chromatogr A 1156 174〜82頁により理解されたように、トリプトファンは抗体精製工程中に酸化されて、タンパク質のHPLC解析中に問題を引き起こす酸化および未酸化種を生じることがある。これを回避するために、軽鎖における94位でのTrpからPheへの同類置換が行われた。抗体3と命名されたこの抗体は遺伝子合成を介して作製され、発現されELISAにおいてスクリーニングされた(図9)。SPRスクリーンにおいて、この抗体は、抗体1よりも速くIL-12とIL-23から解離した(TABLE2(表2))。
3.1.2 重鎖における34位でのM
Metは、抗体の精製および貯蔵中に酸化されることがあることが明らかにされている。ヒト抗体配列のブラスト検索により、Leuがこの位置では一般的であることが確認された。M34L置換が行われ、構築物は抗体4と命名された。その遺伝子が合成され、発現され、その抗体がSPRとELISAを使用してスクリーニングされた(図9)。抗体4は、抗体1と比べて、IL-12とIL-23の両方に対する親和性がわずかに失われていた(TABLE2(表2))。
3.1.3 重鎖における95位でのシステイン
抗体1の重鎖において95位で問題のある残基が観察された。CDR3の開始位置のこのシステインは酸化され、こうして得られるどんな抗体産物にも不均一性を引き起こすことが可能であった。このシステインは、ジスルフィド結合形成により複合体を形成することも可能であった。したがって、その他の18(例外は最初のCysおよびTrpである)アミノ酸はそれぞれ、遺伝子合成を使用してこの位置で置換され、抗体は過渡的に発現された(抗体5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22)。ELISAがこれらの抗体に対して実施された(図9)。抗体の一部はIL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持し、どちらか一方のサイトカインに対してのみ結合活性を保持する抗体もあり、他にどちらかのサイトカインに最小限結合する結合する抗体もあった。SPRは試料に対して実施され、このデータから構築物の解離速度が解析された。このデータから、C95N置換を有する抗体7は抗体1のC95N置換にもっとも近い親和性を示した(TABLE2(表2))。
意外なことに、この置換は、SDS-PAGEにより見られる産物の均一性を劇的に改善した。抗体7は、分子量が既知のコンパレータ抗体について見られるサイズパターンに類似している1つの大きな種を有するサイズパターンを示した(図10)。これは、2つの大きな種を示す抗体1に比べられた(図10)。
次に、3つの置換体を合体させて抗体50と呼ばれる単一の抗体にし、この抗体は以下の重鎖および軽鎖可変領域を有していた:
抗体50 VHドメイン(配列番号112)
EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNANKELRYFDVWGAGTTVTVSS
抗体50 VLドメイン(配列番号169)
DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSFPLTFGAGTKLELKR
この抗体は、ELISA、SPRによりおよび細胞ベースアッセイにおいて測定されるIL-12およびIL-23に対する高親和性を保持していた(図11)。
(実施例4)
4.1 PMA204のスーパーヒト化
米国特許出願第2003/039649号(Foote)およびPCT出願国際公開第04/006955号(Foote)において教唆され、Tanら、(2002)によりおよびHwangら、(2005)によりさらに説明される方法に従って、PMA204のスーパーヒト化は実施された。
先ず、米国特許出願第10/194975号および米国特許第6881557号において教唆され、Tanら(2002年、J.Immunol.169(2): 1119〜25頁)により、Hwangら(2005)により、および本出願(上記参照)においてさらに説明されている方法に従って、重鎖および軽鎖のCDRのカノニカル構造が決定された(下に収載されている)。カノニカル構造は以下の通りであった:
PMA204に類似するカノニカル構造パターンを有するヒト生殖系列VH領域配列(Hwangら、2005)がアクセプターとして選択された。これらの配列は以下の生殖系列配列であり(注: 生殖系列はすべてIMGTデータベース、Giudicelli, V.ら、Nucleic Acids Res.,33: D256〜D261(2005)から取られた; これらの生殖系列配列中の一部の残基は高頻度可変性であり、配列には収載されていないことに注意されたい):
IGHV1-f*01(配列番号17)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
IGHV1-24*01(配列番号18)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT
IGHV1-18*01(配列番号19)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR
6つの既知のヒト生殖系列JH配列のどれとでも組み合わせて示される生殖系列配列(配列番号17、配列番号18、配列番号19)のいずれも、ヒト化重鎖を作製するためにフレームワーク領域を提供することが可能であった。以下のJH領域配列は、主要配列類似性に基づいて選択された:
JH3(配列番号20)
AFDVWGQGTMVTVSS
PMA204に類似するカノニカル構造パターンを有するヒト生殖系列VL領域配列(Hwangら、2005)がアクセプター配列として選択された。これらの配列は以下の生殖系列配列であった:
IGKV6D-21*01(配列番号21)
EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP
IGKV3-15*01(配列番号22)
EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWP
IGKV3-11*01(配列番号23)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP
5つの考えられるJk配列どれとでも組み合わせて示されている生殖系列配列(配列番号21、配列番号22、配列番号23)のいずれも、ヒト化軽鎖を作製するためにフレームワーク領域を提供することが可能であった。以下のJκ領域配列は、主要配列類似性に基づいて選択された:
Jκ4(配列番号24)
LTFGGGTKVEIKR
アクセプターのCDRは、PMA204由来の対応するCDRで置き換えられた。その遺伝子は遺伝子合成を使用して作製され、スーパーヒト化重鎖および軽鎖の様々な組合せがトランスフェクトされた(抗体40、41、42、43、44、45、46、47、48)。これらの発現された抗体はすべて、IL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持していた(図12)。
PMA204の重鎖中の2つのまれなアミノ酸が同定された。すなわち、93位のAlaと94位のAsnであった。これらのアミノ酸は、重鎖スーパーヒト化変異体中へ逆突然変異として導入された。その遺伝子は遺伝子合成を使用して作製され、これらの逆突然変異スーパーヒト化重鎖とスーパーヒト化軽鎖の様々な組合せがトランスフェクトされた(抗体31、32、33、34、35、36、37、38、39)。発現された抗体の一部はIL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持しており、一部の抗体はどちらか一方のサイトカインにのみ結合し、他にどちらかのサイトカインへの最小限の結合を示す抗体もあった(図12)。
抗体のこれらの組合せから、ELISAおよびSPRアッセイにおいて、いくつかの抗体がその抗原への一貫した強力な結合を示した。3つの抗体、すなわち抗体37、39および44が選択された。抗体1の最適化に基づいて、抗体1の生物物理学的特性を増強する3点突然変異(軽鎖W94F、重鎖M34L、重鎖C95N)が抗体37、39および44に導入された。最適化された変異体の重鎖および軽鎖を混合する組合せアプローチが実施されて、抗体のパネル(抗体76、77、78、79、80、81)を作製した。これらの抗体のうち、すべてがELISAにおいてIL-12およびIL-23に結合した(図13)。抗体80は、SPRを介して測定されるとIL-12に対する強力な結合を示し、NK92細胞ベースアッセイ(図11)およびヒトPBMC IL-12誘発IFN-γアッセイ(図17)およびマウス脾細胞アッセイ(図14)を使用する追加の解析のために選択された。構築物抗体80はNK-92アッセイにおいてIL-12誘発IFN-γ分泌の、およびマウス脾細胞アッセイにおいてIL-23誘発IL-17分泌の強力な抑制を示した。
(実施例5)
5.1 PMA204のヒト化
元のマウス抗体のフレームワーク配列に密接に相同である直鎖状ペプチド配列中のヒトフレームワーク配列を使用してPMA204もヒト化された。
PBDデータベースのブラスト検索(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)は、PMA204の重鎖と軽鎖を問い合わせ配列として使用して実施された。
PMA204の重鎖可変領域に密接なヒト相同体は、下に示される1RZ7HC可変領域(配列番号25)であった:
CDR領域の外側の2つの配列間には31アミノ酸の相違が存在する。
下に示されるように、PMA204の軽鎖可変領域と1RZ7LC可変領域(配列番号26)間では軽鎖相同性も高かった:
CDR領域の外側の2つの配列間には31アミノ酸の相違が存在する。
3Dモデリングソフトウェア(Accelrys、Modeller)を使用して、PMA204の重鎖および軽鎖の3Dモデルが、主要な配列に基づいて、PBDデータベースのブラスト検索中に見出され、各鋳型抗体が公表された高解析度結晶構造を有する10のもっとも相同性の抗体を鋳型として使用して構築された。PMA204と1RZ7のモデルを整列させると、2つの抗体のフレームワーク間の妥当な一致(RMSD重鎖=1.53およびRMSD軽鎖=0.6)が示された。したがって、1RZ7が、PMA204由来のドナーCDRが移植されるアクセプターフレームワークとして選択され、CDR移植された抗体を作製した。
PMA204のモデルをさらに詳しく調べると、抗原へのCDR移植された抗体の結合に影響を与えることが可能な決定的に重要なフレームワーク残基が同定された。これらの残基は以下の通りであった:
重鎖
ARG40-別の残基に水素結合しCDRループ構造を安定化させる
GLU42-ドナーとアクセプター間で比較される二次構造の相違
LYS66-3つの異なる残基に水素結合し、CDRループ構造を安定化させる
軽鎖
LYS49-重鎖CDR3残基に水素結合する
TYR65-非保存的なRARE残基
ARG85-非保存的なRARE残基
これらのアミノ酸はそれぞれが、CDR移植された抗体に逆突然変異として導入された。抗体1の最適化に基づいて、抗体1の生物物理学的特性を増強する3点突然変異(軽鎖W94F、重鎖M34L、重鎖C95N)が、ヒト化変異体すべてに導入された。
ヒト化変異体すべての遺伝子合成後、直鎖状CDR移植された抗体鎖と逆突然変異された鎖の組合せがともに発現されて、ヒト化抗体のパネル(抗体51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75)を作製した。これらの抗体に対してELISAが実施された。その抗体はすべて、IL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持していた(図15、図16)。抗体68は、SPRを介して測定されるとIL-23に対する強力な結合を示し、NK92細胞ベースアッセイ(図11)を使用する追加の解析のために選択された。抗体68は、NK-92アッセイにおいてIL-12誘発IFN-γ分泌の強力な抑制を示した。
他の逆突然変異体が抗体の親和性と効力を増強することが可能かどうかを調査するため、抗体68の重鎖可変領域が、最適化されたキメラ抗体である抗体50の重鎖可変領域と整列された。抗体68が抗体50と異なる各位置で、抗体50由来のその位置の残基が抗体68に導入された。これらの変異体は遺伝子合成され、抗体68の軽鎖と対合され発現された(抗体92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125)。重鎖および軽鎖抗体すべてに対してEILSAが実施された。一部の抗体はIL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持しており、どちらか一方のサイトカインにのみ結合活性を保持している抗体もあり、他にどちらのサイトカインへも結合を示さない抗体もあった(図18)。
他の逆突然変異体が抗体の親和性と効力を増強することが可能かどうかを調査するため、抗体68の軽鎖可変領域が、最適化されたキメラ抗体である抗体50の軽鎖可変領域と整列された。抗体68が抗体50と異なる各位置で、抗体50由来のその位置の残基が抗体68に導入された。これらの変異体は遺伝子合成され、抗体68重鎖と対合され発現された(抗体126、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148)。重鎖および軽鎖抗体すべてに対してEILSAが実施された。一部の抗体はIL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持しており、他にどちらのサイトカインへも結合を示さない抗体もあった(図19)。
抗体127、130、136、140、146、147および148がIL-12およびIL-23へのその強力な結合に基づいて選択され、細胞ベースアッセイにおいてスクリーニングされた。抗体136は、ヒトPBMC IL-12誘発IFN-γアッセイ(図17)においてIL-12の、マウス脾細胞アッセイ(図14)においてIL-23誘発IL-17分泌の強力な抑制を示した。
(実施例6)
6.1 抗体80の親和性成熟
6.1.1 リボソームディスプレイのための材料の調製
抗体80は、scFv(scFv-80)(配列番号27)としての発現のために再フォーマットされ、pEGX448発現ベクターにサブクローニングされた。scFvは、親和性精製を可能にするようにFLAGタグと一緒に発現された。次に、scFvは大腸菌(E.coli)中で発現され、アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過により精製された。発現はSDS-PAGEおよび免疫ブロット法により確認された。scFvは、SPRにより確認されるように、親IgGと類似の速度式で、IL-12とIL-23の両方に対する結合活性を保持していた。
scFv-80のコード配列は、pEGX412突然変異誘発/リボソームディスプレイベクターにサブクローニングされ、ランダム変異体がQ-ベータレプリカーゼを使用してscFv配列に導入された(Kopsidasら、2007、BMC Biotechnology、7:18)。突然変異体scFv-80変異体をコードするDNA構築物のこうして得られたプールは、T7 RNAポリメラーゼ反応において一本鎖mRNAに転写され、次にこれを使用してリボソームディスプレイを行った。
市販製剤のIL-23が、リボソームディスプレイ実験において使用するためにビオチン化された。ビオチン化IL-23がストレプトアビジンに良好に結合し、結合活性の喪失を最小限に抑えてscFv-80に対する結合を保持することを確認するためにSPR実験が実施された。
6.1.2 リボソームディスプレイを使用するIL-23結合変異体の濃縮
scFv-80変異体をコードするmRNAプールは、in vitro発現システムを使用して翻訳され、こうして得られたscFvライブラリーは、Kopsidasら、(2007)により記載されているリボソームディスプレイプロトコールを使用して、IL-23バインダーについてパンされた。このシステムの選択圧は、解離定数(kd)が低いバインダーに対するバイアスに合わせて調整された。リボソームディスプレイプロセスの1巡が終わると、濃縮されたscFvのコード配列はPCRにより増幅され、pEGX448発現ベクターにサブクローニングされた。scFv-80の変異体としてのその同一性を確認するために、サブクローニングされたscFvプール由来の20のランダムクローンは配列決定された。残りのクローンは、IL-23に対するハイスループットスクリーニングにかけられた。
6.1.3 リボソームディスプレイにより回収されるscFv-80変異体のハイスループットスクリーニング
リボソームディスプレイ反応から回収されたほぼ6500の個々のscFvは発現され、ハイスルーアウトSPRアッセイを使用してIL-23に対する結合についてスクリーニングされた。変異体はkdに従って並べられ、最良の変異体は核酸レベルで配列決定された。このプロセスにより22の新規scFv変異体が同定され(TABLE4(表4))、それぞれの変異体は親scFv-80と同等のまたはそれより良好なIL-23結合親和性(kdに基づいて)を示した。
6.1.4 ユニークなscFv-80変異体の完全な速度論的特徴付け
広範囲の突然変異プロファイルおよび結合親和性を網羅する、結合速度論の完全な特徴付けのために、TABLE4(表4)に提示されているいくつかのscFv変異体が選択された。scFvごとに大規模タンパク質発現が実施された。発現されたscFvは単量体タンパク質として精製され、SPRによりIL-12およびIL-23に対する結合について試験された(TABLE5(表5))。これらの結果により、リボソームディスプレイおよびスクリーニングを介して単離された変異体はすべて両抗原に結合し、一部の変異体は親scFv-80と比べて最大5倍の親和性改善を示すことが確認された。
6.1.5 IgGフォーマットへのscFv変異体の変換
SPRアッセイにおいてもっとも高い結合親和性を示した3つのscFv(AW-F2、CU-A6およびCP-A6)は、VHとVLドメインを別々の哺乳動物発現ベクターにサブクローニングすることにより(すなわち、抗体重鎖に1つの構築物、軽鎖に1つの構築物)、IgG発現のために再フォーマットされた。ヒト重鎖Fc領域(配列番号8)および定常カッパ軽鎖領域(配列番号9)を付加することにより、CU-A6は抗体183に変換され、CP-A6は抗体184に変換され、AW-F2は抗体207に変換された。IgG分子は、抗体ごとに重鎖および軽鎖構築物をHEK 293E培養物に同時トランスフェクトすることにより発現された。発現されたIgGは、アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル排除により精製され、こうして得られた単量体分子はSPRによりIL-12およびIL-23結合について試験された(TABLE6(表6))。3つのIgG変異体はすべて両分析物に対して結合活性を保持しており、親野生型IgGと比べてkdが目に見えて改善されていた。これに基づけば、TABLE4(表4)に記載されているscFv変異体はIgGフォーマットに変換され、IL-12およびIL-23に対して改善された結合特徴を保持することが可能であると予想するのは理にかなっている。
6.1.6 リボソームディスプレイおよびスクリーニングにより同定される突然変異体の組合せ
上記の様々な突然変異体(TABLE4(表4))を組み合わせることにより一連の追加のscFv変異体が作製された。これらのscFvは、a)スクリーニングランにおいて観察される回数、b)突然変異体に会合しているscFvの親和性に基づいて様々な突然変異体に重み付けをすることにより派生した。もっとも高い重み付けをされた組合せ(TABLE7(表7))は、部位特異的突然変異誘発を使用してscFvに付加された。次にこれらの組合せscFvはすべて小規模に発現され、その後アフィニティークロマトグラフィーおよび脱塩カラムを使用して部分的に精製された。新規のscFvはそれぞれ、単一濃度の分析物を用いる中スループット解析プロトコールを使用してSPRによりIL-12およびIL-23に対する結合について試験された(TABLE7(表7))。データは、これらの変異体はすべてIL-12またはIL-23結合を保持することを示していた。大半の場合、新規変異体の解離速度は、親変異体に少なくとも等しかった。2つの突然変異組合せ(VHドメインのT28AとVLドメインのS26P、VHドメインのF29LとVLドメインのS26P)は、親変異体と比べて親和性の改善を示した。したがって、TABLE4(表4)に収載されている突然変異体の新規組合せを担っているscFvは、親突然変異体および実際、野生型scFv-80より良好ではないが等しい親和性でIL-12およびIL-23に結合することが可能であったと予想するのは理にかなっている。
(実施例7)
7.1 ヒト化抗体の追加の成熟
7.1.1抗体136ヘの親和性改善突然変異の導入
抗体80の親和性成熟に基づいて、IL-12およびIL-23への親和性を増強する重鎖可変領域のいくつかの重要な突然変異(Y59S、Y59HおよびF29L)が抗体136に導入された(抗体175、176、177、178、179、180、181、182)。これらの抗体は発現されEILSAにおいてスクリーニングされた(図20)。抗体はすべてIL-12およびIL-23への結合を示した。
7.1.2 抗体の他の組合せ
93位に置換体(N93A)を含有する抗体80重鎖の親和性成熟変異体が、その対応する軽鎖と対合された(抗体199、200、201、202、203、204、205、206)(図20)。この置換は、93位をこの位置にAlaを含有することがもっとも多いヒト生殖系列に戻すために導入された。N93A置換を含有する抗体80重鎖の親和性成熟変異体も、さらに高い親和性変異体を同定するために、抗体136軽鎖と一緒に発現された(抗体190、191、192、193、194、195、196、197、198)(図20)。
7.2 結合親和性測定
SPR技術を使用して、様々なヒト化抗体のkaとkdとKDが決定された。これらの親和性はTABLE8(表8)に収載されている。あらゆる場合に、Y59SまたはY59H置換を含有する抗体は、抗体のフレームワークとは無関係に、IL-12およびIL-23に対する結合親和性の改善を示した。
(実施例8)
8.1 様々な抗体の追加の特徴付け
8.1.1 競合実験-SPR
上記のキメラおよびヒト化抗体がPMA204と同じ結合特異性を維持していることを立証するために、SPRを使用して競合アッセイが確立された。SPR実験では、抗体136はプロテインA被膜表面に捕獲されて応答単位(RU)は増加し、次にIL-12またはIL-23が充填された(応答単位はさらに増加した)。次に、PMA204が充填されたが、表面IL-12またはIL-23-抗体136複合体に結合しなかった(図21)(応答単位の増加はなかった)。これは、抗体136がPMA204結合を妨げるような形でIL-12およびIL-23に結合すること、ならびに前記2つの抗体がIL-12とIL-23上で重複するエピトープを共有していることを示している。
対照実験では、抗体136はプロテインA被膜表面に捕獲されて応答単位が増加し、IL-12またはIL-23が充填された(応答単位はさらに増加した)。次に、PMA202が充填されて応答単位の増加を示し、複合体への結合を示していた。PMA202と抗体1はIL-12またはIL-23を挟む複合体を形成することができ、したがって、PMA202と抗体1が分子上の異なる位置でIL-12またはIL-23に結合することを示している(図22)。
捕獲抗体、IL-12またはIL-23および競合抗体の他の組合せを使用して類似の競合ELISAを実施することが可能であることを予測することができるであろう。
8.1.2 競合実験-ELISA
抗体136がPMA204と同じ結合特異性を維持していることを立証するために、ELISA方法論を使用して競合アッセイが確立された。PMA204がELISAプレート上に被膜され、次にIL-12またはIL-23が添加され、続いて抗体136が添加されても、抗体136の結合は検出することができなかった(図23A)。これは、抗体136とPMA204がIL-12またはIL-23への結合を競合することを示していた。対照抗体PMA202を被膜し、抗体136とIL-12p40のプレインキュベートされた混合物を添加すると、抗体136の結合を検出することができた(図23B)。これは、抗体1とPMA202がIL-12への結合を競合しないことを示していた。抗体202.1は第1の実験では陽性結合対照として(図23A)、第2の実験では陰性対照として(図23B)使用された。
8.1.3 受容体中和アッセイ
8.1.3.1 抗体80および抗体136はIL-12Rβ2に対するIL-12結合およびIL-23Rに対するIL-23結合を中和する
受容体中和アッセイを使用して、抗体80および抗体136がIL-12Rβ2に対するIL-12の結合(図24A)およびIL-23Rに対するIL-23の結合(図24B)を中和することが実証された。対照抗体202.1は、IL-12Rβ2に対するIL-12結合またはIL-23Rに対するIL-23結合の阻害を全く示さなかった。
8.1.3.2抗体80および抗体136は、IL-12Rβ1に対するIL-12またはIL-23結合を中和しない
抗体80および抗体136は、IL-12Rβ1に対するIL-12の結合を中和しなかった(図25A)。IL-12Rβ1に対するIL-23結合は、抗体80および抗体136により阻害されず(図25B)、むしろIL-23のみおよび受容体単独の増加を上回る結合したIL-23の増加により証拠だてられるように、複合体形成が生じた。対照抗体202.1は、IL-12Rβ1に対するIL-12およびIL-23結合を阻害した。
(実施例9)
9.1 皮内IL-23投与により誘発される皮膚炎症の寛解
リード抗体のいくつかが、マウス脾細胞上でのIL-17のIL-23誘発放出を抑制できる(図26)ことを観察した後、ヒトIL-23を疾患の誘発因子として使用することが可能である動物モデルを設計するためにさらに研究が実施された。IL-23を用いた6日間のC57B1/6Jマウスの背中への内皮的処置により、紅斑および硬結により特徴付けられ、表皮過形成、不全角化および局所性炎症性浸潤という組織学的証拠を有する局所性炎症応答が誘発された。抗体は、サイトカイン処置が始まる前日の単回投与で炎症性応答を減少させるその能力について試験された。抗体80および抗体136を受ける両群は、アイソタイプ対照と比べて、5日目から先は臨床スコアーが減少し、この実験における抗体の効力が実証された(図27A)。
抗体136は、アイソタイプ対照と比べて表皮厚が減少する傾向を示したが、抗体80だけは表皮厚に統計的に有意な減少を引き起こした(図27B)。この結果は、抗体136も抗体80もIL-23により引き起こされる紅斑および硬結を著しく軽減したが、抗体80のほうが効果的であった臨床スコアリングとよく相関している。
(実施例10)
10.1 マウス脾細胞上においてキメラIL-12により誘発されるIFN-γの中和
ヒトIL-12はマウス脾細胞と弱く反応してIFN-γ産生を誘発することが見出された。しかし、ヒトp40とマウスp35からなるキメラ分子(配列番号63)は、マウスIL-12で見られるレベルに類似するレベルでマウス脾細胞からIFN-γ応答を誘発することができた。次に、キメラIL-12がマウス脾細胞上でIFN-γ応答を誘発するのを抑制する目的で、いくつかのリード抗体(抗体番号: 36、80、180、181、193、194、198)がこのアッセイに追加された。前記抗体はすべてこのアッセイにおいて中和を示した(図28)。
10.2 正常近交系マウスにおけるキメラIL-12(IL-12)に対する血清インターフェロンγ(IFN-γ)応答の中和
連続5日間の0.1mg/kgキメラIL-12(ヒトIL-12p40鎖とマウスIL-12p35鎖(配列番号63))を用いたC57B1/6Jマウスの処置により、明白な毒性がまったくない強い血清IFN-γ応答が誘発された。抗体はキメラIL-12を中和する、したがってIFNγ応答を抑制するその能力について、サイトカイン処置の第1日目に単回投与でまたはサイトカイン処置と同時に1日おきに3回投与のいずれかで、5mg/kgの用量で試験された。試験された両抗体は中和能力を示し、5mg/kgでの抗体80の単回投与で血清IFN-γを基線検出可能レベルにまで減らすには十分であった(図29)。
(実施例11)
11.1 IL-23を産生するためのPBMCの刺激作用: 抗体80を用いた診断用検出
IL-12およびIL-23に対するヒト化抗体は、生体試料におけるIL-12およびIL-23の検出のための診断試薬として使用することが可能である。組換えヒトIL-23を検出するためのELISAが開発された。このアッセイでは、抗ヒトp19抗体は捕獲抗体として使用され、抗体80は検出抗体として使用された。抗体80は、このサンドイッチELISAフォーマットにおいて組換えヒトIL-23を検出することができた(図30A)。
黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cowan1(SAC)を用いた処置は、ヒト末梢血液細胞(PBMC)によるIL-23の分泌を誘発した。抗体80はこのサンドイッチELISAフォーマットにおいてSAC刺激PBMCにより分泌される内在性天然ヒトIL-23を検出することができた(図30B)。
(実施例12)
12.1 H/D交換によるエピトープ地図作成
最初の実験では、IL-12p40上の水素は溶液中で重陽子に交換され、次にカラムに固定された抗体80に結合し、次にまだ抗体カラムに結合している間に、H2O中で再び逆交換され、エピトープは保護された。したがって、エピトープは重陽子で標識されている。第2の実験では、IL-12p40は抗体カラムに結合され、次に重陽子で標識され、次にまだカラムに結合している間にH2Oに逆交換された。各実験後、IL-12p40は低pHを使用してカラムから溶出されて激しく還元され、タンパク質を消化するペプシンカラム中を通された。次に、消化断片はLC:MS上に充填された。2つの実験間の重水素化のレベルの差異は、抗体に結合している際の交換の遅延の尺度となる。
この実験では、配列番号64に与えられているIL-12p40が使用された。H/D交換速度の著しい摂動を示す唯一の領域は、TABLE9(表9)に示されている配列
VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)に対応するアミノ酸253と286の間であった。
12.2 抗体80への突然変異体IL-23の結合の解析。
H/D交換実験から得られた結果に基づいて、標的突然変異がIL-23の同定された領域に導入された。スクリーニングする必要のある突然変異の数をさらに絞り込むために、ヒトIL-12p40がマウスIL-12p40(Uni-Prot No: P43432; http://www.uniprot.org)と次の位置で整列された。
抗体80はヒトIL-23に結合するが、マウスIL-23には結合しないという知見に基づいて、2つの種間で異なる残基のみが標的突然変異のために選択された。導入された突然変異は、収載されている配列番号から取ったアミノ酸253〜297の以下の整列化に集約されている。
突然変異体のそれぞれをHEK-293E細胞にトランスフェクトした後、これらのトランスフェクション由来の上澄みは抗体80に対するSPRを介してスクリーニングされた。突然変異体D265AおよびR266Aを除いて、構築物はすべて抗体80に類似の結合のレベルを示した。突然変異体のうちのいくつかのkdは、IL-23野生型のkdよりも目につくほど低く、IL-12p40のこの領域の残基がIL-12p40と抗体80の相互作用の一因となることを示していた。
D265AおよびR266AはELISAにおいてさらに解析され、抗体80、抗体202.1またはIL-12Rβ1およびIL-23Rがプレート上に被膜され、IL-23野生型(IL-23WT)、D265AおよびR266Aを含有するトランスフェクション上澄みがプレート全体で滴定された。突然変異体D265Aは抗体80へのバックグランドレベルの結合を示し(図31)、したがって、抗体80が結合するIL-12p40上の重要な残基としてD265を同定した。D265Aは、IL-23野生型のレベルに匹敵するレベルで抗体202.1、IL-12Rβ1およびIL-23Rに結合し、D265Aが正しく折り畳まれており、機能的に結合できることを示していた。突然変異体R266Aは、IL-12Rβ1、IL-23R、抗体80および抗体202.1への低いレベルでの結合を示し、突然変異体タンパク質の誤った折り畳みが起きていたことを示していた(図31)。
方法
哺乳動物細胞における抗体の作製、単離、発現
ハイブリドーマ細胞系統の作製、発現および精製
5BALB/Cマウスは、フロイント完全アジュバンド中のヒトIL-12(Peprotech)で免疫され、それぞれが、続いて14、35および70日目にフロイント不完全アジュバンド中のヒトIL-12の追加免疫を受けた。74日目、マウス脾臓は回収され、マウス脾細胞が得られた。これらの細胞と骨髄腫細胞系統SP2/0 Ag-14間で融合が実施され、細胞は96ウェル組織培養プレートに沈着された。96ウェルプレートのウェルごとに上澄みに対して、抗IL-12、抗IL-12p40および抗IL-23 ELISA(下参照)が実施された。3つのELISAすべてについて陽性の結果であった上澄みは進められて、限界希釈によりクローニングされた。下流ELISAにおいて陽性の結果であったクローンは500mL規模まで培養され、抗体精製が実施された(下参照)。この方法から精製された抗体は1×PBSに対して透析され、濃度はBCA(登録商標)アッセイキット(Pierce(登録商標))を介して決定された。
DNA塩基配列決定
製造元のプロトコールに従ってTRI試薬(Sigma-Aldrich(登録商標))を使用して、RNAはハイブリドーマ細胞から単離された。cDNAは、AccuScript(登録商標) High Fidelity 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Stratagene(登録商標))を使用して、10〜200ng RNAから合成され、次にこれを次のPCR反応において鋳型として使用した。それぞれ重鎖用および軽鎖用のNovagen Murine IgG Primer Set由来のプライマーを、cDNAおよびPfu II Mastermix(登録商標)(Stratagene(登録商標))と互いに混合させ、次に以下の条件に従ってThermocyler(Eppendorf Mastercycler(登録商標))に流し込んだ。
PCR産物はDNA Gel Extraction Kit(QIAgen(登録商標))を用いてゲル精製され、Aタグを付けられ[dATPとTaq-polymerase(Invitrogen(商標))が72℃、15分間でAオーバーハングをPCR産物に付加する]、pGEM-T-Vector System(Promega(登録商標))にライゲーションされ、TOP10コンピテント細胞(Invitrogen(商標))に形質転換された。クローンは500bpインサートについてスクリーニングされた。陽性クローンから、プラスミドが単離され(Miniprep, QIAgen(登録商標))、従来の配列決定施設で塩基配列決定された。次にヌクレオチド配列は、一次アミノ酸配列に翻訳された。
キメラ抗体を発現するベクターの構築
ハイブリドーマ細胞であるPMA202およびPMA204から、DNA塩基配列決定を介して決定されたVHドメインは、ヒト定常領域(ヒトIgG1重鎖CH1、ヒンジ、CH2&CH3ドメイン)と一緒に発現された。これは、アミノ酸配列をDNA配列に逆翻訳することにより達成され、DNA配列はGeneOptimizer技術を使用して哺乳動物細胞発現のために最適化され、合成オリゴヌクレオチド(GeneArt, Germany)を組み立てることにより新規に合成された。遺伝子合成に続いて、全配列はpTT5重鎖ベクターの複数のクローニング部位にサブクローニングされた(Durocherら、2002年 Nucleic Acids Res 30 E9)。ハイブリドーマ細胞であるPMA202およびPMA204から、DNA塩基配列決定を介して発見されたVLアミノ酸鎖は、その配列をpTT5軽鎖ベクターの複数のクローニング部位にサブクローニングすることによりヒトカッパ軽鎖定常領域と一緒に発現された。こうして得られるPMA202マウス-ヒトキメラ抗体は、抗体202.1と命名された。こうして得られるPMA204マウス-ヒトキメラ抗体は、抗体1と命名された。すべての抗体は、候補タンパク質配列をDNA配列に逆翻訳するこの方法論を使用して作製され、最適化されて、合成オリゴヌクレオチドを組み立てることにより新規に合成された。すべての抗体がヒト重鎖Fc領域およびヒト軽鎖カッパ定常領域を含有していた。次に抗体可変領域をコードする遺伝子はすべて、発現のためにpTT5ベクターにクローニングされた。
一過性トランスフェクションを介する組換え抗体の発現
一過性に発現されるすべての抗体では、以下の方法が使用された。手短に言えば、HEK293E細胞は、完全細胞増殖培養液(1LのF17培養液(Invitrogen(商標))、9mLのPluronic F68(Invitrogen(商標))、2mMグルタミン含有20%(w/v) Tryptone NI(Organotechnie(登録商標))および50μl/100mL培養液でGeneticin(50 mg/mL、Invitrogen(商標)))で培養された。トランスフェクションの前日に、細胞は遠心分離により回収され、新たな培養液(Geneticinなし)に再懸濁された。次の日、重鎖および軽鎖DNAはFuGENE(登録商標)(Roche)トランスフェクション試薬と混合され、DNAトランスフェクション混合物は液滴で培養液に添加された。培養液は、Geneticinなしで、37℃、5%CO2および120rpmで一晩インキュベートされた。次の日、500mL培養液あたり250μlのGeneticinと一緒に12.5mLのTryptoneが添加された。培養液は37℃、5%CO2および120rpmでインキュベートされた。7日後、上澄みが遠心分離により回収され、精製に備えた。
アフィニティークロマトグラフィーを介する抗体の精製
上記トランスフェクション物由来の上澄みはHiTrap(登録商標)Protein Aカラム(5 mL、GE Healthcare)に充填される前にpH7.4に調整された。カラムは50mLの1×PBS(pH7.4)で洗浄された。溶出は、0.1Mクエン酸pH2.5を使用して実施された。溶出された抗体は、Zeba(登録商標) Desaltingカラム(Pierce(登録商標))を使用して1×PBS(pH7.4)に脱塩された。抗体の完全性は、SDS-PAGEおよびゲル濾過HPLCを使用して解析された。抗体の濃度はBCA(登録商標)アッセイキット(Pierce(登録商標))を使用して決定された。
抗IL-12/23抗体の特徴付け
抗IL-12/23 ELISA
IL-12(Peprotech)、IL-23(Ebioscience(商標))、IL-12p40(Ebioscience(商標))またはIL-12p80(Peprotech)は、炭酸コーティング緩衝液(35mM炭酸ナトリウム、15mM炭酸水素ナトリウムpH9.6)に1μg/mLまで希釈し、4℃で一晩96ウェルプレート(Nunc(商標)、Maxisorp(商標))上に被膜された。次にプレートは洗浄緩衝液(0.01M PBS pH7.2、0.05% Tween-20)で3回洗浄され、次に0.01M PBS pH7.2で3回洗浄された。次に、ウェルは、200μlの遮断緩衝液(0.01M PBS中1% w/v BSA pH7.2)を各ウェルに添加し、25℃で1時間プレートをインキュベートすることにより遮断された。抗体は、滴定曲線を作成するのに十分な抗体希釈液(1% w/v BSA、0.01M PBS中0.05% Tween-20 pH7.2)に希釈された。ウェルは25℃で1時間、抗体と一緒にインキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄された。抗体希釈液中1対2000のヤギ抗ヒト免疫グロブリンG(H+L)抗体HRPコンジュゲート(Zymed(登録商標))を使用して、結合している一次抗体を検出した。抗体希釈液中1対2000のヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体HRPコンジュゲート(Dako)を使用して、結合しているマウス抗体を検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前述の通りに洗浄された。TMB基質溶液(Zymed(登録商標))を各ウェルに添加し、色を現像させ、反応はウェルに1M HClを添加することにより終了させた。各ウェルの吸光度は450nmで決定された(ref.620nm)。
IL-12/IL-12Rβ1中和アッセイ
IL-12Rβ1/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))は、炭酸コーティング緩衝液中に1μg/mLまで希釈され、96ウェルプレートの各ウェルに添加され、4℃で一晩インキュベートされた。次にプレートは洗浄緩衝液で3回洗浄され、次に0.01M PBS pH7.2で3回洗浄された。次にウェルは、200μlの遮断緩衝液を各ウェルに添加し、25℃で1時間プレートをインキュベートすることにより遮断された。抗体は、滴定曲線を作成するのに十分な抗体希釈液に希釈された。IL-12(Peprotech)は抗体希釈液に300ng/mLまで希釈された。IL-12は深ウェル容器において2時間、抗体とプレインキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄され、ウェルは抗体/IL-12溶液と一緒に25℃で1時間インキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄され、抗体希釈液中0.5μg/mLで100μlのビオチン化抗ヒトIL-12抗体(Peprotech)を使用して25℃で1時間結合した抗体を検出した。プレートは前述の通りに洗浄された。抗体希釈液中1対1000で100μlのStreptavidin HRP(Zymed(登録商標))を使用して結合したビオチン化抗体を検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前述の通りに洗浄された。100μl TMB基質溶液(Zymed(登録商標))を各ウェルに添加し、5分間色を現像させた。100μlの1M HClを添加して発色現像反応を終了させ、吸光度は450nmで決定された(ref.620nm)。
IL-12p80/IL-12Rβ1中和アッセイ
このアッセイはIL-12/IL-12Rβ1中和アッセイについて上記の通りに実施されたが、以下の変更があった:
IL-12はIL-12p80(Peprotech)で置き換えられた。
IL-12/IL-12Rβ2中和アッセイ
このアッセイはIL-12/IL-12Rβ1中和アッセイについて上記の通りに実施されたが、以下の変更があった: IL-12Rβ1/Fc ChimeraはIL-12Rβ2/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))で置き換えられ、1μg/mlの代わりに5μl/mlまで希釈された。プレートは洗浄緩衝液で3回洗浄されたが、追加のPBS洗浄はなかった。IL-12(Peprotech)はビオチン化IL-12(Peprotech)で置き換えられた。ウェルは抗体/IL-12溶液と一緒に25℃で2時間インキュベートされた。ビオチン化抗ヒトIL-12抗体はウェルに添加されなかった。100μlの1対1000 Streptavidin HRP(Zymed(登録商標))は100μlの1対5000 Streptavidin HRP(Sigma-Aldrich(登録商標))で置き換えられた。100μl TMB基質溶液(Zymed(登録商標))は100μl TMB基質溶液(Sigma-Aldrich(登録商標))で置き換えられた。
IL-23/IL-23R中和アッセイ
IL-23/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))は炭酸コーティング緩衝液に1μg/mLまで希釈され、96ウェルプレートの各ウェルに添加され、4℃で一晩インキュベートされた。次にプレートは洗浄緩衝液で3回洗浄され、次に0.01M PBS pH7.2を用いて3回洗浄された。次にウェルは、各ウェルに200μlの遮断緩衝液を添加しプレートを25℃で1時間インキュベートすることにより遮断された。抗体は、滴定曲線を作成するのに十分な抗体希釈液に希釈された。IL-23(Ebioscience(商標))は、抗体希釈液に300ng/mLまで希釈された。IL-23は抗体と一緒に深ウェル容器で2時間プレインキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄され、ウェルは抗体/IL-23溶液と一緒に25℃で1時間インキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄され、抗体希釈液中0.5μg/mLで100μlのビオチン化抗ヒトIL-12抗体(Peprotech)を使用して25℃で1時間結合した抗体を検出した。プレートは前述の通りに洗浄された。抗体希釈液中1対1000で100μlのStredtavidin HRP(Zymed(登録商標))を使用して結合したビオチン化抗体を検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前述の通りに洗浄された。100μl TMB基質溶液(Zymed(登録商標))を各ウェルに添加し、5分間色を現像させた。100μlの1M HClを添加して発色現像反応を終了させ、吸光度は450nmで決定された(ref.620nm)。
このアッセイもIL-23/IL-23R中和アッセイについての上記の通りに実施されたが、以下の変更があった: IL-23/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))は、HEK-293E細胞由来の、アフィニティークロマトグラフィーを使用して精製された内部作製IL-23R-HISで置き換えられた。プレートは洗浄緩衝液で3回洗浄されたが、追加のPBS洗浄はなかった。IL-23(Ebioscience(商標))は、ビオチン化IL-23(Ebioscience(商標))で置き換えられた。IL-23は抗体希釈液に300ng/mlの代わりに50ng/mlまで希釈された。ウェルは抗体/IL-23溶液と一緒に25℃で2時間インキュベートされた。ビオチン化抗ヒトIL-12抗体はウェルに添加されなかった。100μlの1対1000 Streptavidin HRP(Zymed(登録商標))は、100μlの1対5000 Streptavidin HRP(Sigma-Aldrich(登録商標))で置き換えられた。100μl TMB基質溶液(Zymed(登録商標))は100μl TMB基質溶液(Sigma-Aldrich(登録商標))で置き換えられた。色は5分間の代わりに15分間現像させた。
競合結合実験
IL-12/23競合ELISA
PMA204またはPMA202は、炭酸コーティング緩衝液(35mM炭酸ナトリウム、15mM炭酸水素ナトリウムpH9.6)に1μg/mLまで希釈され、4℃で一晩96ウェルプレート(Nunc(商標)、Maxisorp(商標))上に被膜された。次にプレートは洗浄緩衝液(0.01M PBS pH7.2、0.05% Tween-20)を用いて3回洗浄され、次に0.01M PBS pH7.2を用いて3回洗浄された。次にウェルは、200μlの遮断緩衝液(0.01M PBS中1% w/v BSA pH7.2)を各ウェルに添加し、プレートを25℃で1時間インキュベートすることにより遮断された。IL-12(Peprotech)またはIL-12(Ebioscience(商標))は抗体希釈液(1% w/v BSA、0.01M PBS中0.05% Tween-20 pH7.2)に0.5μg/mlまで希釈され、100μlが各ウェルに添加され、続いて25℃で1時間インキュベートされた。次にプレートは前述の通りに洗浄された。競合抗体の段階半ログ希釈が実施され、100μlが各ウェルに添加された。最終タンパク質濃度は滴定曲線を作成するのに十分であった。プレートは25℃で1時間インキュベートされ、次に前述の通りに洗浄された。抗体希釈液中1対2000でヤギ抗ヒト免疫グロブリンG(Fc特異的)-HRPコンジュゲート(Sigma-Aldrich(登録商標))が使用されて、結合した競合抗体を検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前述の通りに洗浄された。西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)-標識検出試薬では、酵素反応は、室温で100μl/ウェル テトラメチルベンジジン(Zymed(登録商標))基質を用いて暗所で起こされた。反応は100μlの1M HClを用いて停止され、光学密度は450nm(ref.620nm)で測定された。
SPR競合アッセイ
プロテインA(Thermo)は、BIAcore 3000を使用してCM5センサーチップ上に固定された。次にHBS-P(GE Healthcare)中5μg/mLのキメラまたはヒト化抗体は、流速20μl/分で1分間注入された。次にIL-12またはIL-23は、HBS-P中5μg/mLで、流速20μl/分で1分間表面全体に注入された。次にマウス抗体は、HBS-P中5μg/mLで、流速20μl/分で1分間注入された。IL-12またはIL-23がHBS-Pで置き換えられた、およびマウス抗体がHSB-Pで置き換えられた対照も実施された。データはすべて、IL-12またはIL-23またはマウス抗体がプロテインA表面に対するバックグランド結合について試験された対照ランから引き算された。
IL-12Rβ1鎖を発現する安定的にトランスフェクトされた細胞系統の作製
IL-12Rβ1のアミノ酸配列はDNA配列に逆翻訳され、このDNA配列はGeneOptimizer技術を使用して哺乳動物細胞発現のために最適化され、合成オリゴヌクレオチド(GeneArt, Germany)を組み立てることにより新規に合成された。IL-12Rβ1をコードするDNA配列はpcDNADEST-40にサブクローニングされ、次にTop-10化学的にコンピテントな大腸菌(E. coli)細胞に形質転換された。プラスミドDNAはHiSpeed Plasmid Maxi Kit(QIAgen(登録商標))を使用して細胞培養物から回収され、ScaI(Promega(登録商標))を用いる制限酵素消化により直線化された。プラスミドはJurkat 6E細胞(ATCC)にトランスフェクトされ、表面発現はIL-12Rβ1(R&D Systems(登録商標))に対する抗受容体鎖抗体を用いて染色することにより決定された。
IL-12Rβ1発現細胞系統に対するIL-12p40、IL-12およびIL-23結合の検出
FLAGタッグをつけたIL-12またはHISタッグをつけたIL-23もしくはIL-12p40は、37℃で2時間の段階半ログ希釈により1000から0.01ng/mlの範囲の濃度で、IL-12Rβ1発現細胞(106/ml)と一緒に同時インキュベートされた。細胞へのサイトカインの結合は、フィコエリトリンコンジュゲートマウス抗6xHISタグ抗体(Abcam(登録商標))またはFITC-コンジュゲート抗FLAG(Sigma-Aldrich(登録商標))を用いて検出された。試料データはBeckman-Coulter Quanta(登録商標)上で得られた。
IL-12Rβ1発現細胞系統に対するIL-12p40、IL-12およびIL-23結合の阻害の検出
濃度250ng/mlのFLAGタッグをつけたIL-12またはHISタッグをつけたIL-23もしくはIL-12p40は、37℃で1時間の段階半ログ希釈により10から0.01μg/mlの範囲の濃度の抗体と一緒に同時インキュベートされ、次に上記のIL-12Rβ1発現細胞は106/mlで添加され、さらに1時間インキュベートされた。細胞はPBS/10%FBSで徹底的に洗浄され、細胞結合サイトカインはフィコエリトリンコンジュゲートマウス抗6xHISタグ抗体(Abcam(登録商標))またはFITC-コンジュゲート抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich(登録商標))を用いて検出された。試料データはBeckman-Coulter Quanta上で得られた。
IL-12Rβ1発現細胞系統の表面での抗体-サイトカイン複合体の検出
FLAGタッグをつけたIL-12またはHISタッグをつけたIL-23もしくはIL-12p40は、濃度250ng/mlで上記のIL-12Rβ1発現細胞と同時インキュベートされた。2時間のインキュベーション後、抗体は段階半ログ希釈により10から0.01μg/mlの範囲の濃度で添加され、さらに1時間インキュベートされた。細胞はPBS/10%FBSで徹底的に洗浄され、細胞結合サイトカインに結合した抗体はFITCコンジュゲートウサギ抗ヒトIgG(Dako)を用いて検出された。試料データはBeckman-Coulter Quanta(登録商標)上で得られた。
親和性成熟
方法
抗体80 VHおよびVLドメイン由来のscFv-80コード配列の組立て
一本鎖抗体断片(scFv-80)は、配列(Gly4Ser)3の15アミノ酸リンカーにより軽鎖の可変ドメイン(VL)に結合している重鎖の可変ドメイン(VH)を含むポリペプチドを設計することによって抗体80から導き出された(scFv-80、配列番号27)。VHおよびVL配列は、(それぞれ)ポリペプチドのNおよびC終端末端に置かれていた。次にアミノ酸配列はDNA配列に逆翻訳され、このDNA配列はGeneOptimizer技術を使用して哺乳動物発現のために最適化された。次に全遺伝子は合成オリゴヌクレオチド(GeneArt)を組み立てることにより新規に合成された。最終配列は、追加のサブクローニングを促進する5'NcoIおよび3'NotI部位も含んでいた。
scFv-80タンパク質をコードしている組換え遺伝子は、pEGX448発現ベクターのNcoIおよびNotI部位にサブクローニングされた。pEGX448は、NcoIおよびNotI部位にサブクローニングされたどんなscFvも、C終端で特許に守られた「FLAG」アフィニティータグと自動的に融合されるように設計されている。
scFv-80遺伝子は、RNA作製、突然変異誘発およびリボソームディスプレイのためにpEGX412ベクターに同様にサブクローニングされた。このベクターは、pEGX412が、pEGX253において使用されるCL配列の代わりに、遺伝子IIIタンパク質配列を使用してscFvをリボソームに連結することを除いて、Kopsidasら、(2007)により記載されているpEGX253プラスミドと同一であった。
RNA作製および突然変異誘発
上記のpEGX412-scFv80構築物を使用して、scFv-80の突然変異体による変異体をコードするRNAのプールを作製した。これを達成するため、プラスミドはSmaIを用いて直線化され、製造元の説明書通りにT7 RNAポリメラーゼキット(Promega(登録商標))を使用する一本鎖RNA(ssRNA)産生のための鋳型として直接使用された。こうして得られた一本鎖RNA分子は、Q-Betaレプリカーゼ(Epicentre(登録商標) Biotechnologies)を使用するエラープローン複製のための鋳型として使用された。これを達成するため、200ngのRNAは33mM Tris酢酸(pH7.8)、66mM酢酸カリウム、10mM酢酸マグネシウム、0.5mMジチオストレイートル(DTT)、5mM rATP、5mM rUTP、10mM rCTP、10mM rGTP、0.1U/μLのQ-BetaレプリカーゼおよびH2Oを混合させて、最終容量20μLとした。反応は45℃で約16時間インキュベートされた。
Q-Betaレプリカーゼ反応は、突然変異体あたり1〜2個の点突然変異のある親scFv-80の突然変異体のプールをコードする二本鎖RNA(dsRNA)分子のライブラリーを生成した。dsRNAライブラリーは、逆転写酵素PCR(RT-PCR)を使用してDNA断片のプールに変換された。RT-PCR産物は、最終T7 RNAポリメラーゼ反応のための鋳型を形成する前に、アガロースゲル電気泳動法およびゲル抽出により精製された。上記の反応すべての産物は、アガロースゲル電気泳動法により試験された。
scFv-80変異体のライブラリー由来のIL-23バインダーの濃縮
上記のscFvライブラリーはpEGX412ベクターから発現されて、scFv-リボソーム複合体を産生し、次にこの複合体は、Kopsidasら、(2007)により記載されているリボソームディスプレイプロトコールに従ってIL-23に対してパンされた。手短に言えば、scFv-リボソーム複合体(scFvコードssRNAも含む)は、氷上で24時間、最終濃度の1nMまでビオチン化IL-23と一緒にインキュベートされた。次に選択圧を加えて、パンニング実験を解離定数が低いIL-23バインダーが濃縮される方に偏らせた。これは、800倍過剰な非ビオチン化IL-23を添加し、パンニング反応をさらに5日間続けることにより達成された。パンニング期間の終了時にビオチン化IL-23に結合したままであったscFv-リボソーム複合体は、ストレプトアビジン被膜磁気ビーズを用いて回収された。次に前記ビーズは、0.05%Tween20および5mM MgCl2を含有するPBSを用いて3回洗浄され、5mM MgCl2を含有するPBSを用いて2回洗浄された。最後に、ssRNAは回収されたscFv-リボソーム複合体から溶出され、コードされたscFvプールは製造元の説明書通りにSuperscript III One-Step RT-PCR system(Invitrogen(商標))を用いてRT-PCRにより、しかし反応鋳型として8μLの回収されたRNAおよび下に収載されているscFv特異的オリゴヌクレオチドプリマーを用いて増幅された。これらのオリゴヌクレオチドも、サブクローニングを促進するために5'NcoIおよび3'NotI部位を加えられていたことに注意されたい。
フォワード: 5'-CCATGGCCCAGGTGCAGCTG-3'
リバース: 5'-GCGGCCGCTGTCGTACGC-3'
IL-23バインダーを同定するためのハイスループットスクリーニングプロトコール
リボソームディスプレイ実験(上記)の終了時に増幅されたRT-PCR産物のプールは、pEGX448発現ベクターのNcoIおよびNotI部位にサブクローニングされ、One-Step Competent KRX大腸菌(Stratagene(登録商標))に形質転換され、固形培地上で増殖された。こうして得られた細菌コロニーは、96ウェルプレート中の200μL液体増殖培養液に個別に播種され、600nmでのOD(OD600nm)0.8まで増殖され、次に0.5mMイソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を用いてタンパク質発現を誘発された。200μL発現培養液は20℃で一晩インキュベートされ、次にこれを使用して、40μLの溶解緩衝液(2Mショ糖; 0.25M Tris pH7; 0.2M EDTA pH8)を添加しプレートを30分間900RPMで攪拌することにより、粗い細菌溶菌液を作製した。次に溶菌液は遠心分離により清澄にされ、10000分子量カットオフ濾過プレート(Millipore)を通過させた。この方法を使用して、下で詳細に述べられるハイスループットSPRプロトコールを使用してIL-23バインダーについてスクリーニングされるほぼ6500のscFv試料を調製した。
ハイスループットSPRスクリーニングはBIAcore A100バイオセンサー(GE Healthcare)を使用して行われた。ほぼ10000RUの特許に守られたFLAG特異的捕獲分子は、BIAcore A100バイオセンサーの4フローセルごとにSpots 1 & 5(外部スポット)およびSpots 2 & 4(内部スポット)までの3000RU上で標準アミンカップリング化学法を使用して、CM5 Series S Sensorチップ上に固定された。使用された泳動緩衝液はHBS-EP+(BIAcore)であり、相互作用はすべて25℃で測定された。FLAGタグつきのscFvの粗い周辺質調製物(前段で記載されている通りに調製される)は、流速5μl/分で60秒間捕獲する前に、泳動緩衝液で2倍に希釈された。ほぼ100RU(外部スポット上で)および50RU(内部スポット上で)のタグつきscFvが捕獲された。2分の安定化期間に続いて、IL-23は、流速30μl/分で120秒間、4フローセルのすべてのスポット上を同時に通され、解離は200秒間モニターされた。作成されたセンサーグラムは各フローセルの無修飾スポット3に対して参照され、ka、kdおよびKD値を生み出す様々なリガンド密度を説明するためにRIがローカルに設定されている1対1のラングミュア方程式を使用してフィットされた。
SPRスクリーニングプロセスから得られるデータを使用して、潜在的な改善されたバインダーを選択した。個々のscFvそれぞれのKd対IL-23は、各プレート上に含まれる野生型scFv-80対照について記録された値と比較された。対照よりも少なくとも1.5倍改善された(すなわち、低い)KdのscFv変異体はどれでも潜在的な改善されたバインダーと命名された。次にこれらの変異体はそれぞれDNA配列解析にかけられ、新規のアミノ酸配列を担っているscFvはどれでもさらなる特徴付けのために先に進められた。
高度に精製されたscFvの完全な速度論的特徴付け
このプロトコールは、リボソームディスプレイおよびスクリーニング実験から直接同定されたscFv変異体の完全な速度論的特徴付けのために使用された。先ず、関連するscFvをコードするpEGX448構築物がHB2151大腸菌に形質転換された。次に組換えscFvを、500mL培養物を0.8のOD600まで増殖させ、次に0.5mMのIPTGを用いてタンパク質発現を誘発することにより細菌性周辺質中に発現させた。細胞は遠心分離により回収され、周辺質画分はMinskyら、(1986年、Proc. Natl. Acad. Sci.、Vol. 83、4180〜4184)により記載されている通りに、浸透圧ショックにより抽出された。scFvは、C終端FLAGタグを特異的に認識する抗体にコンジュゲートされた1mLカラムのセファロース樹脂を使用して周辺質画分から精製された。アフィニティー精製されたタンパク質は最終容量200μLまで濃縮され、PBS中で平衡化されたSuperdex 200カラム(GE Healthcare)上でゲル濾過クロマトグラフィーにかけられ、単量体scFv(約32kDa)に相当するピークタンパク質画分は機能的特徴付けのために収集された(下参照)。
精製されたscFvは、BIAcore T100バイオセンサー(GE Healthcare)を使用して完全速度論的特徴付けにかけられた。ほぼ10000RUの特許に守られたFLAG特異的捕獲分子は、BIAcore T100バイオセンサーのフローセル(FC)1およびFC2(または代わりにFC3およびFC4)において標準アミンカップリング化学法を使用して、CM5 Series S Sensorチップ上に固定された。使用された泳動緩衝液はHBS-EP+(BIAcore)であり、相互作用は、非常に類似するkd値を有するscFvの分化を促進するため30℃または35℃で測定された。ピーク精製されたFLAGタグつきのscFv(前段に記載されている通りに調製された)は、泳動緩衝液に10nMまで希釈され、50RUのscFvを捕獲するために流速10μl/分でFC2上で捕獲された(典型的には、60秒はこのレベルのタグつきのscFvを捕獲するには十分であった)。適切な安定化期間後、標的IL-12またはIL-23は、81nMから0.13nMまで(IL-12の5倍希釈液を使用して)および81nMから1nMまで(IL-23の3倍希釈液を使用して)の範囲の濃度で流速60μl/分でFC1およびFC2上を通された。会合のための接触時間は180秒で、解離は最高濃度で10分間、連続する他のすべての濃度で300秒間測定された。FC2からのセンサーグラムデータはFC1と緩衝液のみ対照から引き算された。曲線はka、kdおよびKD値を生みだすために1対1のラングミュア方程式を使用してフィットされた。
リボソームディスプレイおよびスクリーニングを通じて同定された突然変異の組合せ
追加のscFv-80変異体は、リボソームディスプレイおよびスクリーニングを通じて発見された突然変異を組み合わせることにより導き出された。これらの突然変異組合せは、突然変異誘発レベルがscFv配列あたり1つの突然変異(平均で)を作り出すように内因的に設定されているリボソームディスプレイの1巡りの結果としては生じなかったことに注目するのは重要である。これらの組合せは、代わりに設計により導き出された。組合せは、TABLE11(表13)に従って個々の突然変異それぞれに重み付けをすることにより選択された。
もっとも高い重み付けをされた突然変異の組合せを有するscFvをコードするヌクレオチド配列は、製造元の説明書に従ってQuikchange Lightningキット(Stratagene(登録商標))を使用して、鋳型としてscFv-80を用いる部位特異的突然変異誘発により作製された。各特異的突然変異を加えるのに使用される突然変異誘発プライマーは下に収載されている。全種類のscFvは、アミノ酸配列への相互参照付きのTABLE4Xに収載されている。
VH突然変異 Y59S
センス: 5'-gaacggcgataccgagtccgcccccaa-3'
アンチセンス: 5'-ttgggggcggactcggtatcgccgttc-3'
VH突然変異 Y59H
センス: 5'-cggcgataccgagcacgcccccaagtt-3'
アンチセンス: 5'-aacttgggggcgtgctcggtatcgccg-3'
VH突然変異 T28A
センス: 5'-ggccagcggctacgccttcaccgacta-3'
アンチセンス: 5'-tagtcggtgaaggcgtagccgctggcc-3'
VH突然変異 F29L
センス: 5'-gccagcggctacaccctcaccgactactatc-3'
アンチセンス: 5'-gatagtagtcggtgagggtgtagccgctggc-3'
VL突然変異 S26P
センス: 5'-tgtcctgtagagccccccagagcatcagc-3'
アンチセンス: 5'-gctgatgctctggggggctctacaggaca-3'
VL突然変異 S52R
センス: 5'-gatctacttcgccagacagtccatcagcggc-3'
アンチセンス: 5'-gccgctgatggactgtctggcgaagtagatc-3'
VL突然変異 Q27R
センス: 5'-cctgtagagcctcccggagcatcagcatcaa-3'
アンチセンス: 5'-ttgatgctgatgctccgggaggctctacagg-3'
重鎖突然変異Q43Rまたは軽鎖突然変異I55Tを加えるためのプライマーは設計されなかったことに注意されたい。実際、他の突然変異は、VHおよびVLにそれぞれR43およびT55をすでに担っている構築物に直接導入された(配列番号230および配列番号231)。
突然変異組合せを有するscFvの中スループット速度論的解析
このプロトコールを使用して、突然変異組合せを担っているscFv-80変異体のIL-12およびIL-23結合を調べた。小規模HB2151大腸菌培養物を使用して、中スループットSPR解析のために部分的に精製されたscFvを作製した(下参照)。組換えscFvは周辺質中に発現され、次に抽出されて、上記の抗FLAG抗体-セファロースカラムを使用して精製された。次にscFv試料は、PD10脱塩カラム(GE Healthcare)を使用してPBS中に緩衝液交換され、最終容量の200μlまで濃縮された。この材料はそれ以上精製されずにSPR解析にかけられた。
組み合わせられた重鎖と軽鎖突然変異を有するこれらのscFvは、IL-12またはIL-23のいずれかの81nMの単一の二重基準濃度が使用され解離は3000秒間測定されたことを除いて、高度に精製されたscFvの完全な特徴付け(上参照)のために使用された方法論に類似する方法論を使用して解析された。
IgG上の表面プラズモン共鳴結合実験
SPR3000を使用して、プロテインAは、アミンカップリングを使用してCM5研究グレードセンサーチップのFC1およびFC2(または代わりにFC3およびFC4)上に固定され、ほぼ2000RUを与えた。FC1は実験全体を通してブランクとして使用された。実験はHBS-P緩衝液中で行われた(SPR)。流速20μl/分で、5μg/mLの抗体の20μlをFC2上に通した。IL-12、IL-23またはIL-12p40(Peprotech)は、66nMから2nMまでの範囲の濃度でFC1およびFC2の表面上に通された。表面の再生は、10mMグリシン、pH1.0を使用して実施された。FC2からのセンサーグラムデータは、FC1および緩衝液のみ対照から引き算された。曲線は、kd、kaおよびKD値を生み出す1対1のラングミュア方程式を使用してフィットされた。曲線はすべて、可能な場合には2.0未満のχ2を用いてフィットされた。
in vitro効力実験
in vitroマウス脾細胞アッセイ
単細胞懸濁液は、破壊して100μmのシーブを通過させることによりマウス脾臓から得られた。赤血球細胞は、細胞懸濁液を遠心分離し9mlの減菌水に再懸濁させる水法により溶解された。次に1mlの10×PBSを直ちに添加しよく混ぜあわされた。細胞は洗浄され計数され、次に濃度107細胞/mlでRPMI(2mM l-グルタミン、100U/ml Pen/Strep、10%FBSを含む)中に再懸濁された。細胞は、96ウェル平底組織培養プレートに100μl中106細胞/ウェルで蒔かれた。コンカナバリンAおよびrhIL-23は、最終濃度がそれぞれ1μg/mlおよび25ng/mlまで添加された。試験抗体は試料全体で滴定された。典型的アッセイは試験抗体あたり3〜5生物学的複製物および1〜10μg/mlの開始試験抗体濃度を有していた。各アッセイプレートは、Con A+IL-23を有するが抗体のみおよびCon Aのみはない複製試料を含有していた。プレートは37℃、5%CO2で3日間インキュベートされ、次に上澄みはIL-17 ELISAのために収集された。IL-17は、製造元の説明書通りにIL-17 ELISAキット(R&D Systems(登録商標))を使用してアッセイされた。濃度は標準曲線法により決定された。
NK92 IFN-γ放出アッセイ
NK92細胞(ATCC、CRL-2407)は、RPMI1640、2mM L-グルタミン、100U Pen/Strep、10%FBS中で培養され、200U/mlのヒトIL-2(Peprotech Asia)および10ng/mlのヒトIL-15(Ebioscience(商標))を補充された。細胞は、アッセイに先立ってヒトIL-2およびヒトIL-15が欠乏状態にされた。抗体は、滴定曲線を作成するのに十分に培養液に希釈された。IL-12(Peprotech)はプレートに添加され、37℃、5%CO2で2時間インキュベートされた。細胞は回収されてウェルに添加され、200μl/ウェルの全容量中1×105細胞/mLの細胞濃度を与えた。培養物は37℃、5%CO2で24時間インキュベートされた。インキュベーションの終了時に上澄みが回収され、Duoset ELISAヒトIFN-γキット(R&D Systems(登録商標))を使用して、産生されたヒトIFN-γを検出した。
ヒトPBMC IL-12誘発IFN-γアッセイ
ヒトPBMCは、リンホプレップ分離を使用してヒト軟膜から収集され、培養液(50%DMEM、50%RPMI、0.045%D(+)グルコース、2mM L-グルタミン、5%ウシ胎児血清(FBS)、10mM HEPES)中1×107細胞/mLで培養された。PHA-P(Sigma-Aldrich(登録商標))が10μg/mLで添加され、37℃、5%CO2で3日間インキュベートされた。次にヒトIL-2(R&D Systems(登録商標))が50U/mLで添加された。培養物は37℃、5%CO2で1日間インキュベートされた。抗体は、96ウェルプレート全体にわたり10μg/mLから0.001μg/mLまでの範囲を含む滴定曲線を作成するのに十分に培養液に希釈された。1ng/mLのヒトIL-12(Peprotech)がプレートに添加され、37℃、5%CO2で2時間インキュベートされた。1ng/mLのhIL-2(R&D Systems(登録商標))が各ウェルに添加された。細胞は回収されてウェルに添加され、200μl/ウェルの全容量中2×105細胞/ウェルの細胞濃度を与えた。培養物は37℃、5%CO2で2日間インキュベートされた。インキュベーションの終了時に上澄みが回収され、Duoset ELISAヒトIFN-γキット(R&D Systems(登録商標))を使用して、産生されたヒトIFN-γを検出した。
内皮IL-23投与により誘発される皮膚炎症の寛解
試験的用量反応域検出および速度論的研究
オスC57B1/6Jマウスは、注射開始の2日前に背中の試験部位を脱毛され、次に背中の2箇所にPBSまたはrhIL-23のどちらかの内皮注射を総量で3または10μg/マウス/日まで毎日受けた。両治療計画は炎症のある程度の徴候を与えたが、10μg/日の用量は高レベルの紅斑を伴う強い応答を与えた。後の実験では、マウスは炎症応答の完全な速度論を決定するために10μgのrhIL-23/日を全部で10日間与えられた。応答は処置の3日目から検出可能になり、6〜7日目にピークに達し、その後消散し始めた。
in vivoでの抗体試験
オスC57B1/6Jマウスは、上記の通りに10μg/日のrhIL-23を用いて6日間処置された。サイトカイン注射の開始1日前に、マウスは、抗体80、抗体136またはアイソタイプ対照抗体の単回腹腔内注射を10mg/kgの用量で受けた。マウスは試験部位において紅斑および硬結を毎日スコアー化された。すべての処置および所見は盲検で実施された。実験の終了時、皮膚試料は各マウスから収集され、組織学的処理および標準プロトコールによるヘマトキシリンとエオシン(H&E)染色のために固定された。
表皮厚の値は、各マウス由来の皮膚切片の比較的弱拡大像を紙コピー紙に刷り上げることにより決定された。各像の皮膚切片は、3本の垂直線を使用することにより4象限に分割された。次に表皮厚は、象限を描くのに使用された3本の線の交点で測定され、すなわち写真あたり3つの厚測定値であった。次にmmで表される実際の距離は、各画像上の目盛を使用してミクロンに変換された。測定点が毛包または汗腺などの表皮厚を代表しないと見なされる部位を交差する場合には、測定点の位置は皮膚の隣接切片に調整された。測定は、2人の無関係な観察者により盲検で行われた。
正常な近交系マウスにおけるキメラIL-12(IL-12)に対する血清インターフェロン-γ(IFN-γ)の中和
キメラIL-12
ヒトIL-12p40およびマウスIL-12p35を含有するキメラIL-12(配列番号63)が作製された。タンパク質は遺伝子配列に逆翻訳され、最適化され、合成されpTT5ベクターにサブクローニングされた。キメラIL-12はHEK-293E細胞に発現され、HISタグアフィニティー精製カラムを介して精製された。キメラIL-12に対するマウスT細胞の応答性はin vitroで試験された。マウス脾細胞(107/ml)は、2mM 1-グルタミンおよび10%ウシ胎児血清に加えてキメラ、組換えマウスまたは組換えヒトIL-12(0〜20ng/ml)を補充されたRPMI中で一晩培養された。上澄みが収集され、製造元の説明書通りにIFN-γELISAキット(R&D Systems(登録商標))を使用して、酵素連結免疫吸着アッセイ(ELISA)によりIFN-γについてアッセイされた。キメラIL-12は、一定範囲の濃度にわたりマウス脾細胞からIFN-γ分泌を誘発することができた。ヒトIL-12は、試験されたもっとも高濃度でを除いて不活性であった。
マウス脾細胞によるキメラIL-12誘発IFN-γ放出の抗体抑制
単細胞懸濁液は、破壊して100μmのシーブを通過させることによりマウス脾臓から得られた。赤血球細胞は、細胞懸濁液を遠心沈殿させ、9mlの無菌液に再懸濁させる水法により溶解され、1mlの10×PBSを直ちに添加してよく混ぜ合わせた。細胞は洗浄し計数して、次にRPMI+2mM 1-グルタミン+100U/ml pen/strep+10%FBS中に濃度5×106/mlで再懸濁させた。
細胞は96ウェル平底組織培養プレート上に100μl中5×105細胞/ウェルで播種された。コンカナバリンAおよびキメラIL-12は、最終濃度がそれぞれ0.5μg/mlおよび20ng/mlまで添加された。試験抗体は試料全体で滴定された。典型的アッセイは試験抗体あたり3〜5生物学的複製物および1〜10μg/mlの開始試験抗体濃度を有することになる。各アッセイプレートは、Con A+IL-12を有するが抗体のみおよびCon Aのみはない複製試料を含有しているはずである。プレートは37℃、5%CO2で24時間インキュベートされ、次に上澄みはIFN-γ ELISAのために収集された。IFN-γは、製造元の説明書通りにIFN-γ ELISAキット(R&D Systems(登録商標))を使用してアッセイされた。濃度は標準曲線法により決定された。バックグランドIFN-γ産生(Con Aのみの試料から決定される)が高かった場合には、このバックグランドはIL-12処置試料値から引き算されて、直接IL-12に起因しうるIFN-γ濃度が得られた。
試験的用量反応域検出研究
オスC57B1/6Jマウスは、PBS、0.03mg/kgのマウスIL-12(IL-12)または0.03、0.1もしくは0.3mg/kgのキメラIL-12のいずれかを用いて腹腔内注射により5日間処置された。6日目、終末血液試料は血清作製のために収集された。血清中のIFN-γ濃度は、製造元の説明書通りに高感度IFN-γ ELISAキット(Ebioscience(商標))を使用して決定された。
IFN-γはPBS処置対照マウスでは検出されなかったが、マウスまたはキメラIL-12を用いて処置されたすべての群では検出された。キメラIL-12処置により、血清IFN-γの強力な用量依存性誘発が生じた。0.1mg/kgが、血清IFN-γ応答の変化を測定するのに理想的用量として選択された。
in vivoにおける抗体試験
オスC57B1/6Jマウスは、0.1mg/kgのキメラIL-12を用いて腹腔内注射により5日間処置された。前記マウスは、サイトカイン注射の1日目にキメラIL-12を投与する30分前に単一投与の抗体80もしくは抗体136のどちらかも5mg/kgで用いて、またはサイトカイン注射の1、3および5日目にキメラIL-12を投与する30分前に3用量の抗体80、抗体136もしくはアイソタイプ対照も用いて処置された。6日目に、終末血液試料は収集され、血清IFN-γは上記の通りに決定された。
IL-23を作製するためのPBMCの刺激: 抗体80を用いた診断用検出
ELISA現像
96ウェル平底ELISAプレート(Nunc Maxisorp)はPBS中0.5μg/mlのマウス抗ヒトIL-23p19(Ebioscience(商標))を4℃で一晩被膜された。プレートは洗浄され(洗浄はすべて3回実施される)、次にPBS/10%FBSを用いて1時間遮断された。プレートは洗浄され、次に組換えIL-23が半ログ希釈により1000から0.003ng/mlの範囲の濃度で添加された。プレートは室温で2時間インキュベートされた。プレートは洗浄され、次にサイトカインは抗体80を0.5μg/mlで用いて検出された。プレートは室温でさらに2時間インキュベートされ、洗浄され、次にマウス吸着抗ヒトIgG、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート(Invitrogen(商標))が添加された。さらに30分のインキュベーション後、プレートは6回洗浄され、TMB基質が添加され(Sigma-Aldrich(登録商標))、色を5〜10分間現像させた。反応は1M HClを用いて停止させ、プレートは450nm吸光度で読み取られた。洗浄はすべて、Biotek(登録商標)ELx405プレート洗浄液を使用してPBS+0.1%Tweenで実施された。
IL-23を作製するためのヒトPBMCの刺激
PBMCは、Lymphoprep勾配(Axis-shield(登録商標))上の遠心分離により単一軟膜から得られた。PBMCは96ウェル平底プレートに105/ウェルで蒔かれた。黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)Cowan 1(SAC)(Sigma-Aldrich(登録商標))は以下の通りに調製された: 10% w/vの保存液から、適切な容量が取り除かれ、ペレット細胞にまで遠心分離された。これらの細胞はX-Vivo 15培養液(Biowhittaker(商標))で2回洗浄され、次に滴定のために開始濃度で再懸濁された。SACは、1% w/vから0.0001% w/v間の範囲濃度で段階半ログ希釈でPBMCに添加された。プレートは72時間インキュベートされ、次にELISAのために上澄みが収集された。IL-23の検出のためのELISAは上記の通りに実施された。
H/D交換実験
IL-12p40はPBS中1mg/mLで使用された。抗体80はPBS中2.0mg/mLで使用された。抗体は製造元の説明書に従ってPOROS AL樹脂(Applied Biosystems)に連結された。マブカラムに600μlの抗体80- POROS AL樹脂が充填され、4℃で貯蔵された。
カラムは87.5% D2O中のPBSを用いて洗浄された。5μLの1mg/mL IL-12p40は、100%D2O中氷冷PBS緩衝液(pH 7.0)の35μLと混合された。IL-12p40混合物は、抗体カラムに注入される前に500、1500、5000秒間(別々のランで)インキュベートされた。カラムは200μLの冷却PBS(H2Oを用いて)で洗浄された。カラムは、3℃で250、750または2500秒間(別々のランで)静置させた。80μLの冷却0.8%ギ酸をカラムに注入した。さらに40μLの冷却0.8%ギ酸を使用して抗体カラムから抗原を溶出させた。この40μL試料が収集され、それに20μLの冷却2M尿素、1M TCEP、pH 3.0が添加された。次に55μLがペプシンを含有するカラムに注入されてタンパク質をペプチドに消化し、このペプチドは溶出緩衝液(95%アセトニトリル、5%水、0.0025% TFA)の13〜40%勾配を使用してrpHPLCにより23分にわたり分離された。溶出物は質量分析によりMS1:ProfileおよびMS2:DDAモードで解析された。SEQUESTソフトウェアプログラム(Thermo)を使用して、親ペプチドイオンの配列を同定した。
IL-12p40の異なる部分の交換速度に対する抗体の効果は、以下の例外を設けて基本的に上記と同じように実施された: 5μLのIL-12p40はH2O中氷冷PBS緩衝液(pH 7.0)の35μLを用いて溶出され、次にH2O中のPBSを用いて調製されたカラムに注入された。結合後、カラムはH2O中PBSの100μLを用いて洗浄された。オン交換反応は、カラム上に87.5%D2O中PBS、pH 7.0の200μLを通すことにより開始された。カラムは、別々のランで3℃、500、1500および5000秒間インキュベートされた。
突然変異体IL-23構築物の作製
サブユニットとC終端FLAGタグの間にリンカーを含有する野生型IL-23をコードする遺伝子が合成された。IL-23のX線結晶構造(例えば、3D85)の解析後、ala残基への突然変異のために側鎖が露出したアミノ酸が選択された。これは、野生型IL-23遺伝子への部位特異的突然変異誘発を使用して達成された。遺伝子はすべてpTT5ベクターにクローニングされた。
突然変異体IL-23構築物のトランスフェクション
HEK293E細胞は、Geneticin(Invitrogen(商標))を含むF17培地(Invitrogen(商標))で培養され、Geneticinなしで1×106細胞/mlでトランスフェクトされた。5mlトランスフェクション培養液が構築物ごとに準備された。7.5μgのDNAが、OptiMEM(登録商標) I(Invitrogen(商標))およびFugene(登録商標) HDトランスフェクション試薬(Roche)を使用してトランスフェクトされた。Tryptone(BD(登録商標))およびGeneticinがトランスフェクションの翌日に培養液に添加された。培養液は6日間増殖され、上澄みは回収されて解析のために濾過された。
ELISAスクリーニング突然変異体IL-23構築物
IL-12Rβ1/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))、IL-23/Fc Chimera(R&D Systems(登録商標))、抗体202.1および抗体80は炭酸コーティング緩衝液に1μg/mLまで希釈され、96ウェルプレートの各ウェルに添加され、4℃で一晩インキュベートされた。次にプレートは洗浄緩衝液を用いて3回洗浄された。次にウェルは、各ウェルに200μlの遮断緩衝液を添加しプレートを25℃で1時間インキュベートすることにより遮断された。上澄みは滴定曲線を作成するのに十分に抗体希釈液に希釈され、100μlがウェルに添加され、次に25℃で1時間インキュベートされた。次にプレートは前記の通りに洗浄され、抗体希釈液中1対1000のMonoclonal Anti-FLAG(登録商標)M2-HRP(Sigma-Aldrich(登録商標))の100μlを使用して、結合しているサイトカインを検出した。25℃で1時間のインキュベーション後、プレートは再び前記の通りに洗浄された。100μl TMB基質溶液(Sigma-Aldrich(登録商標))が各ウェルに添加され、5分間色を現像させた。100μlの1M HClを添加して色現像反応を停止させ、吸光度は450nm(ref.620nm)で決定された。
(参考文献)
NCBI受託番号P01857
NCBI受託番号P01834
NCBI受託番号P01842
ATCC CRL 1650
ATCC CRL-1651
ATCC CRL-10
ATCC CRL 1610
ATCC CRL-26
ATCC受託番号CRL-1580
ATCC受託番号CRL-1851

Claims (45)

  1. ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗原結合ドメインを含む抗体であって、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するヒトIL-12p40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体。
  2. ヒトIL-12および/またはヒトIL-23に対する結合について、配列番号6の配列を有する重鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項1に記載の抗体。
  3. ヒトIL-12および/またはヒトIL-23に対する結合について、配列番号7の配列を有する軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項1に記載の抗体。
  4. 配列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)を有するヒトIL-12p40の部分に結合する、請求項1に記載の抗体。
  5. Asp 265においてヒトIL-12p40(配列番号1)に特異的に結合する、請求項1に記載の抗体。
  6. ヒトIL-23(配列番号66)に結合する抗原結合ドメインを含み、ヒトIL-23(配列番号66)に対するその結合レベルが、突然変異体であるIL-23 D265A(配列番号75)に対するその結合レベルを上回る抗体。
  7. 単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するヒトIL-12p40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない、請求項6に記載の抗体。
  8. HCDR1: DYYX1H
    [式中、X1=MまたはL];
    HCDR2: WIDPENGDTEX2APKFQG
    [式中、X2=Y、H、またはS];
    HCDR3: X3KELRYFDV
    [式中、X3=C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P、またはV]
    から選択される3つの重鎖CDR配列を含む抗体。
  9. LCDR1: RAX4X5SISINLH
    [式中、X4=SまたはP;
    X5=QまたはR];
    LCDR2: FAX6QSX7S
    [式中、X6=SまたはR;
    X7=IまたはT];
    LCDR3: QQSNSX8PLT
    [式中、X8=WまたはF]
    から選択される3つの軽鎖CDR配列を含む抗体。
  10. HCDR1: DYYX1H
    [式中、X1=MまたはL];
    HCDR2: WIDPENGDTEX2APKFQG
    [式中、X2=Y、H、またはS];
    HCDR3: X3KELRYFDV
    [式中、X3=C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P、またはV]
    から選択される3つの重鎖CDR配列と;
    LCDR1: RAX4X5SISINLH
    [式中、X4=SまたはP;
    X5=QまたはR];
    LCDR2: FAX6QSX7S
    [式中、X6=SまたはR;
    X7=IまたはT];
    LCDR3: QQSNSX8PLT
    [式中、X8=WまたはF]
    から選択される3つの軽鎖CDR配列と
    を含む抗体。
  11. 配列番号202、配列番号205、配列番号208、配列番号203、配列番号206、配列番号209、配列番号204、および配列番号207からなる群から選択される、ヒト重鎖アクセプターフレームワーク配列をさらに含む、請求項8または請求項10に記載の抗体。
  12. 配列番号210、配列番号213、配列番号216、配列番号211、配列番号214、配列番号212、および配列番号215からなる群から選択される、ヒト軽鎖アクセプターフレームワーク配列をさらに含む、請求項9または請求項10に記載の抗体。
  13. CDRに隣接する残基、グリコシル化部位の残基、まれな残基、ヒトIL-12のp40サブユニットとの相互作用が可能な残基、CDRとの相互作用が可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基、およびChothiaによる定義のVHドメインのCDR1とKabatによる定義の第1の重鎖フレームワークとで重複する領域内の残基からなる群から選択される重要残基において、少なくとも1つのフレームワーク領域のアミノ酸置換を含む、抗体ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項8または請求項9に記載の抗体。
  14. 少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含む抗体ヒトアクセプターフレームワークをさらに含み、前記フレームワークのアミノ酸配列が、前記ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも65%同一であり、前記ヒトアクセプターフレームワークと同一の少なくとも70のアミノ酸残基を含む、請求項8または請求項9に記載の抗体。
  15. 配列番号6、配列番号62、配列番号114、配列番号142、配列番号28、配列番号87、配列番号115、配列番号143、配列番号29、配列番号88、配列番号116、配列番号144、配列番号30、配列番号90、配列番号117、配列番号145、配列番号31、配列番号91、配列番号118、配列番号146、配列番号33、配列番号92、配列番号119、配列番号147、配列番号34、配列番号93、配列番号120、配列番号148、配列番号35、配列番号94、配列番号122、配列番号149、配列番号36、配列番号95、配列番号124、配列番号150、配列番号38、配列番号96、配列番号125、配列番号151、配列番号39、配列番号97、配列番号126、配列番号152、配列番号40、配列番号99、配列番号127、配列番号153、配列番号41、配列番号100、配列番号128、配列番号154、配列番号42、配列番号101、配列番号129、配列番号155、配列番号43、配列番号102、配列番号130、配列番号156、配列番号44、配列番号103、配列番号131、配列番号157、配列番号45、配列番号104、配列番号132、配列番号158、配列番号53、配列番号105、配列番号133、配列番号159、配列番号54、配列番号106、配列番号134、配列番号160、配列番号55、配列番号107、配列番号135、配列番号161、配列番号56、配列番号108、配列番号136、配列番号162、配列番号57、配列番号109、配列番号137、配列番号163、配列番号58、配列番号110、配列番号138、配列番号164、配列番号59、配列番号111、配列番号139、配列番号165、配列番号60、配列番号112、配列番号140、配列番号166、配列番号61、配列番号113、配列番号141および配列番号167からなる群から選択される免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項8または請求項10に記載の抗体。
  16. 配列番号7、配列番号169、配列番号181、配列番号193、配列番号32、配列番号170、配列番号182、配列番号194、配列番号37、配列番号171、配列番号183、配列番号195、配列番号42、配列番号172、配列番号184、配列番号196、配列番号46、配列番号173、配列番号185、配列番号197、配列番号47、配列番号174、配列番号186、配列番号198、配列番号48、配列番号175、配列番号187、配列番号199、配列番号49、配列番号176、配列番号188、配列番号200、配列番号50、配列番号177、配列番号189、配列番号201、配列番号51、配列番号178、配列番号190、配列番号52、配列番号179および配列番号192からなる群から選択される免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む、請求項9または請求項10に記載の抗体。
  17. 配列番号6&配列番号7 配列番号115&配列番号190
    配列番号6&配列番号169 配列番号115&配列番号192
    配列番号28&配列番号179 配列番号115&配列番号193
    配列番号29&配列番号179 配列番号115&配列番号194
    配列番号30&配列番号179 配列番号115&配列番号195
    配列番号31&配列番号32 配列番号115&配列番号196
    配列番号33&配列番号179 配列番号115&配列番号197
    配列番号34&配列番号51 配列番号115&配列番号198
    配列番号34&配列番号47 配列番号115&配列番号199
    配列番号35&配列番号179 配列番号115&配列番号200
    配列番号36&配列番号37 配列番号115&配列番号201
    配列番号38&配列番号179 配列番号116&配列番号173
    配列番号38&配列番号51 配列番号116&配列番号174
    配列番号38&配列番号32 配列番号116&配列番号175
    配列番号38&配列番号47 配列番号116&配列番号176
    配列番号38&配列番号52 配列番号116&配列番号177
    配列番号39&配列番号179 配列番号117&配列番号173
    配列番号40&配列番号179 配列番号117&配列番号174
    配列番号41&配列番号42 配列番号117&配列番号175
    配列番号43&配列番号179 配列番号117&配列番号176
    配列番号44&配列番号179 配列番号117&配列番号177
    配列番号44&配列番号51 配列番号118&配列番号178
    配列番号44&配列番号32 配列番号118&配列番号179
    配列番号44&配列番号47 配列番号119&配列番号178
    配列番号44&配列番号52 配列番号119&配列番号179
    配列番号45&配列番号179 配列番号119&配列番号51
    配列番号45&配列番号179 配列番号119&配列番号189
    配列番号53&配列番号41 配列番号119&配列番号46
    配列番号54&配列番号179 配列番号119&配列番号47
    配列番号55&配列番号179 配列番号119&配列番号48
    配列番号56&配列番号179 配列番号119&配列番号49
    配列番号57&配列番号179 配列番号119&配列番号50
    配列番号58&配列番号42 配列番号119&配列番号51
    配列番号59&配列番号179 配列番号119&配列番号52
    配列番号60&配列番号179 配列番号120&配列番号178
    配列番号61&配列番号42 配列番号120&配列番号179
    配列番号62&配列番号42 配列番号122&配列番号176
    配列番号87&配列番号7 配列番号124&配列番号176
    配列番号88&配列番号7 配列番号125&配列番号176
    配列番号90&配列番号7 配列番号126&配列番号176
    配列番号91&配列番号7 配列番号127&配列番号176
    配列番号92&配列番号7 配列番号128&配列番号176
    配列番号93&配列番号7 配列番号129&配列番号176
    配列番号94&配列番号7 配列番号130&配列番号176
    配列番号95&配列番号7 配列番号131&配列番号176
    配列番号96&配列番号7 配列番号132&配列番号176
    配列番号97&配列番号7 配列番号133&配列番号176
    配列番号99&配列番号7 配列番号134&配列番号176
    配列番号100&配列番号7 配列番号135&配列番号176
    配列番号101&配列番号7 配列番号136&配列番号176
    配列番号102&配列番号7 配列番号137&配列番号176
    配列番号103&配列番号7 配列番号138&配列番号176
    配列番号104&配列番号7 配列番号139&配列番号176
    配列番号105&配列番号7 配列番号140&配列番号176
    配列番号106&配列番号171 配列番号141&配列番号176
    配列番号106&配列番号172 配列番号142&配列番号176
    配列番号107&配列番号171 配列番号143&配列番号176
    配列番号107&配列番号172 配列番号144&配列番号176
    配列番号108&配列番号171 配列番号145&配列番号176
    配列番号108&配列番号172 配列番号146&配列番号176
    配列番号109&配列番号170 配列番号147&配列番号176
    配列番号110&配列番号171 配列番号148&配列番号176
    配列番号111&配列番号172 配列番号149&配列番号176
    配列番号112&配列番号169 配列番号150&配列番号176
    配列番号113&配列番号173 配列番号151&配列番号176
    配列番号113&配列番号174 配列番号152&配列番号176
    配列番号113&配列番号175 配列番号153&配列番号189
    配列番号113&配列番号176 配列番号154&配列番号189
    配列番号113&配列番号177 配列番号155&配列番号189
    配列番号113&配列番号176 配列番号156&配列番号189
    配列番号114&配列番号173 配列番号157&配列番号189
    配列番号114&配列番号174 配列番号158&配列番号189
    配列番号114&配列番号175 配列番号159&配列番号189
    配列番号114&配列番号176 配列番号160&配列番号189
    配列番号114&配列番号177 配列番号161&配列番号189
    配列番号115&配列番号173 配列番号161&配列番号179
    配列番号115&配列番号174 配列番号162&配列番号189
    配列番号115&配列番号175 配列番号162&配列番号179
    配列番号115&配列番号176 配列番号163&配列番号189
    配列番号115&配列番号177 配列番号163&配列番号179
    配列番号115&配列番号181 配列番号164&配列番号189
    配列番号115&配列番号182 配列番号164&配列番号179
    配列番号115&配列番号183 配列番号165&配列番号189
    配列番号115&配列番号184 配列番号165&配列番号179
    配列番号115&配列番号185 配列番号166&配列番号189
    配列番号115&配列番号186 配列番号166&配列番号179
    配列番号115&配列番号187 配列番号167&配列番号189
    配列番号115&配列番号188 配列番号167&配列番号179
    配列番号115&配列番号189 配列番号168&配列番号189
    からなる群から選択される2つの免疫グロブリン可変領域を含む、請求項10に記載の抗体。
  18. IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、およびIgAからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒト霊長動物重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体。
  19. カッパまたはラムダからなる群から選択される、ヒトまたは非ヒト霊長動物軽鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の抗体。
  20. 有機部分の共有結合により修飾される、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗体。
  21. 有機部分が直鎖状もしくは分枝鎖状の親水性ポリマー基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基である、請求項20に記載の抗体。
  22. 抗体依存性細胞傷害作用、補体依存性細胞傷害作用、血清半減期、生体内分布、およびFc受容体に対する結合からなる群から選択される機能特徴を調節するように修飾される、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗体。
  23. 修飾が、タンパク質操作、糖操作、または化学的方法を介する、請求項22に記載の抗体。
  24. 請求項1に記載の抗体を作製する方法であって、
    I.ヒトIL-12p40またはヒトIL-12p40の断片により動物を免疫化して、第1の抗体パネルを得るステップと;
    II.前記第1のパネルから、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第2の抗体パネルを形成するステップと;
    III.前記第2のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
    を含む方法。
  25. ステップ(II)の方法が、配列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)を有するペプチドにもまた結合する抗体を選択するステップをさらに含む、請求項24に記載の方法。
  26. 請求項1に記載の抗体を作製する方法であって、
    I.配列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(配列番号65)を有するペプチドにより動物を免疫化して、第1の抗体パネルを得るステップと;
    II.前記第1のパネルから、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第2の抗体パネルを形成するステップと;
    III.前記第2のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
    を含む方法。
  27. 請求項1に記載の抗体を作製する方法であって、
    I.ヒト抗体ディスプレイライブラリーをスクリーニングし、ヒトIL-12およびヒトIL-23に結合する抗体を選択して、第1の抗体パネルを形成するステップと;
    II.前記第1のパネルから、単量体(ヒトIL-12p40)およびホモ二量体(ヒトIL-12p80)として存在するp40に結合し、ヒトIL-12Rβ2に対するヒトIL-12の結合、およびヒトIL-23Rに対するヒトIL-23の結合は阻害するが、ヒトIL-12Rβ1に対する、ヒトIL-12もしくはヒトIL-23、またはヒトIL-12p40もしくはヒトIL-12p80の結合は阻害しない抗体を選択するステップと
    を含む方法。
  28. 請求項8、10、11、15、または17のいずれか一項に記載のVHドメインをコードする核酸分子。
  29. 配列番号217 配列番号254 配列番号282 配列番号310
    配列番号218 配列番号255 配列番号283 配列番号311
    配列番号219 配列番号257 配列番号284 配列番号312
    配列番号220 配列番号258 配列番号285 配列番号313
    配列番号222 配列番号259 配列番号286 配列番号314
    配列番号223 配列番号260 配列番号287 配列番号315
    配列番号224 配列番号261 配列番号289 配列番号316
    配列番号225 配列番号262 配列番号291 配列番号317
    配列番号227 配列番号263 配列番号292 配列番号318
    配列番号228 配列番号264 配列番号293 配列番号319
    配列番号229 配列番号266 配列番号294 配列番号320
    配列番号230 配列番号267 配列番号295 配列番号321
    配列番号232 配列番号268 配列番号296 配列番号322
    配列番号233 配列番号269 配列番号297 配列番号323
    配列番号234 配列番号270 配列番号298 配列番号324
    配列番号242 配列番号271 配列番号299 配列番号325
    配列番号243 配列番号272 配列番号300 配列番号326
    配列番号244 配列番号273 配列番号301 配列番号327
    配列番号245 配列番号274 配列番号302 配列番号328
    配列番号246 配列番号275 配列番号303 配列番号329
    配列番号247 配列番号276 配列番号304 配列番号330
    配列番号248 配列番号277 配列番号305 配列番号331
    配列番号249 配列番号278 配列番号306 配列番号332
    配列番号250 配列番号279 配列番号307 配列番号333
    配列番号251 配列番号280 配列番号308 配列番号334
    配列番号252 配列番号281 配列番号309 配列番号335
    から選択される配列を有する、請求項28に記載の核酸分子。
  30. 請求項9、10、12、16、または17のいずれか一項に記載のVLドメインをコードする核酸分子。
  31. 配列番号221 配列番号338 配列番号350 配列番号362
    配列番号226 配列番号339 配列番号351 配列番号363
    配列番号231 配列番号340 配列番号352 配列番号364
    配列番号235 配列番号341 配列番号353 配列番号365
    配列番号236 配列番号342 配列番号354 配列番号366
    配列番号237 配列番号343 配列番号355 配列番号367
    配列番号238 配列番号344 配列番号356 配列番号368
    配列番号239 配列番号345 配列番号357 配列番号369
    配列番号240 配列番号346 配列番号358 配列番号370
    配列番号241 配列番号347 配列番号359
    配列番号336 配列番号348 配列番号361
    から選択される配列を有する、請求項30に記載の核酸分子。
  32. 対象における疾患を治療する方法であって、前記対象に請求項1から23のいずれか一項に記載の抗体を投与するステップを含み、前記疾患が、関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、骨喪失、気道過敏症、慢性閉塞性肺疾患、脱髄障害、乾癬、多発性硬化症、皮膚過敏症、急性移植拒絶、慢性移植拒絶、同種移植編拒絶、移植片対宿主病、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性炎症性腸疾患、泌尿器系炎症性疾患、心血管疾患、血管炎、周期性発熱、グルコース代謝障害、肺疾患、癌、歯周炎、ヘルペス性間質性角膜炎、アレルギー、炎症性疼痛、脊椎関節症、敗血症、敗血症性ショックまたは内毒素性ショック、髄膜炎、外科手術による外傷、自己免疫性血液障害、アルツハイマー病、サルコイドーシス、肝硬変、肝炎(自己免疫性肝炎を含めた)、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、甲状腺炎、アテローム性動脈硬化、脱毛症、ウィルソン病、糸球体腎炎、および脂質異常症からなる群から選択される方法。
  33. 関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、骨喪失、気道過敏症、慢性閉塞性肺疾患、脱髄障害、乾癬、多発性硬化症、皮膚過敏症、急性移植拒絶、慢性移植拒絶、同種移植編拒絶、移植片対宿主病、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性炎症性腸疾患、泌尿器系炎症性疾患、心血管疾患、血管炎、周期性発熱、グルコース代謝障害、肺疾患、癌、歯周炎、ヘルペス性間質性角膜炎、アレルギー、炎症性疼痛、脊椎関節症、敗血症、敗血症性ショックまたは内毒素性ショック、髄膜炎、外科手術による外傷、自己免疫性血液障害、アルツハイマー病、サルコイドーシス、肝硬変、肝炎(自己免疫性肝炎を含めた)、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、甲状腺炎、アテローム性動脈硬化、脱毛症、ウィルソン病、糸球体腎炎、および脂質異常症からなる群から選択される疾患の治療における、請求項1から23のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  34. 関節リウマチ、骨関節炎、反応性関節炎、乾癬性関節炎、骨喪失、気道過敏症、慢性閉塞性肺疾患、脱髄障害、乾癬、多発性硬化症、皮膚過敏症、急性移植拒絶、慢性移植拒絶、同種移植編拒絶、移植片対宿主病、全身性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性炎症性腸疾患、泌尿器系炎症性疾患、心血管疾患、血管炎、周期性発熱、グルコース代謝障害、肺疾患、癌、歯周炎、ヘルペス性間質性角膜炎、アレルギー、炎症性疼痛、脊椎関節症、敗血症、敗血症性ショックまたは内毒素性ショック、髄膜炎、外科手術による外傷、自己免疫性血液障害、アルツハイマー病、サルコイドーシス、肝硬変、肝炎(自己免疫性肝炎を含めた)、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎、甲状腺炎、アテローム性動脈硬化、脱毛症、ウィルソン病、糸球体腎炎、および脂質異常症からなる群から選択される疾患を治療するための薬物の調製における、請求項1から23のいずれか一項に記載の抗体の使用。
  35. ヒトIL-12p40に結合する抗原結合ドメインを作製する方法であって、
    I. 親VHドメインのHCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、請求項8に記載のCDRのセットである、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含む親VHドメインのアミノ酸配列中における1または複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、前記親VHドメインのアミノ酸配列変異体であるVHドメインを提供し、また、場合によって、このようにして提供された前記VHドメインを、1または複数のVLドメインと組み合わせて、1または複数のVH/VLの組合せを提供するステップと;
    II. 前記親VHドメインのアミノ酸配列変異体である前記VHドメイン、または前記1もしくは複数のVH/VLの組合せを試験して、ヒトIL-12p40に対する抗体の抗原結合ドメインを同定するステップと
    を含む方法。
  36. 親VHドメインが、請求項15に記載のVHドメインアミノ酸配列を有する、請求項35に記載の方法。
  37. 親VHドメインのアミノ酸配列変異体である前記VHドメインが、CDRにおける突然変異誘発により提供される、請求項35に記載の方法。
  38. 親VLドメインのLCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、請求項9に記載のCDRのVLセットである、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含む親VLドメインのアミノ酸配列中における1または複数のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入により、1または複数のVLドメインが提供され、これにより、それらの各々が、前記親VLドメインのアミノ酸配列変異体である、1または複数のVLドメインが作製される、請求項35または請求項36に記載の方法。
  39. 親VLドメインが、請求項16に記載のVLドメインアミノ酸配列を有する、請求項38に記載の方法。
  40. 親VLドメインのアミノ酸配列変異体である前記VLドメインが、CDRにおける突然変異誘発により提供される、請求項38に記載の方法。
  41. 抗体抗原結合ドメインを、IgG抗体分子、scFv抗体分子、またはFab抗体分子のコンポーネントとして作製するステップをさらに含む、請求項35から40のいずれか一項に記載の方法。
  42. ヒトIL-12p40に結合する抗原結合ドメインを作製する方法であって、
    I. VHドメインをコードする出発核酸、または、各々が請求項15に記載の群から選択されるVHドメインをコードする出発核酸レパートリーを提供するステップと;
    II. それが前記出発核酸または出発レパートリーにおけるVHドメイン内へと挿入され、VHドメインをコードする核酸産物レパートリーをもたらすように、アミノ酸配列の突然変異をコードするか、またはこれにより生成される1または複数のドナー核酸と、前記出発核酸または出発レパートリーを組み合わせ、前記産物レパートリーの核酸を発現させて、産物であるVHドメインをもたらすステップと;
    III. 場合によって、前記産物であるVHドメインを、1または複数のVLドメインと組み合わせるステップと;
    IV. ヒトIL-12p40に対する抗原結合ドメインを選択するステップと;
    V. 産物であるVHドメイン、また場合によってVLドメインを含む前記抗原結合ドメイン、またはそれをコードする核酸を回収するステップと
    を含む方法。
  43. ヒトIL-12p40に結合する抗原結合ドメインを作製する方法であって、
    I. VLドメインをコードする出発核酸、または、各々が請求項16に記載の群から選択されるVLドメインをコードする出発核酸レパートリーを提供するステップと;
    II. それが前記出発核酸または出発レパートリーにおけるVLドメイン内へと挿入され、VLドメインをコードする核酸産物レパートリーをもたらすように、アミノ酸配列の突然変異をコードするか、またはこれにより生成される1または複数のドナー核酸と、前記出発核酸または出発レパートリーを組み合わせて、前記産物レパートリーの核酸を発現させ、産物であるVLドメインをもたらすステップと;
    III. 場合によって、前記産物であるVLドメインを、1または複数のVHドメインと組み合わせるステップと;
    IV. ヒトIL-12p40に対する抗原結合ドメインを選択するステップと;
    V. 産物であるVLドメイン、また場合によってVHドメインを含む前記抗原結合ドメイン、またはそれをコードする核酸を回収するステップと
    を含む方法。
  44. ドナー核酸が、前記HCDRIおよび/またはHCDR2および/またはHCDR3の突然変異により作製される、請求項42または43に記載の方法。
  45. 核酸のランダム突然変異によりドナー核酸を提供するステップを含む、請求項42または43に記載の方法。
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