CN102177178A

CN102177178A - 抗il-12/il-23抗体

Info

Publication number: CN102177178A
Application number: CN2009801402860A
Authority: CN
Inventors: A·W·克拉克; A·G·多伊尔; P·A·詹宁森; L·D·普尔东; B·瓦伊; A·J·波
Original assignee: Cephalon Australia Pty Ltd
Current assignee: Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
Priority date: 2008-08-14
Filing date: 2009-08-14
Publication date: 2011-09-07
Anticipated expiration: 2029-08-14
Also published as: EP2326668A4; KR101781965B1; JP5623401B2; MA32629B1; MY153074A; NZ590816A; KR20160116056A; KR20110043761A; EP2326668A1; IL210903A; EP2326668B1; TW201010725A; ZA201100711B; AR073060A1; CN102177178B; CA2733642A1; EA201170323A1; IL210903A0; US20110262445A1; JP2011530298A

Abstract

本发明提供了包含抗原结合结构域的抗体，该抗原结合结构域结合人IL-12和人IL-23。抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的人IL-12p40，并且抗体抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合和人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

Description

抗IL-12/IL-23抗体

申请数据

本申请与2008年8月14日提交的澳大利亚专利申请号2008904178和2008年8月14日提交的美国专利申请号61/089028相关并要求这两个申请的优先权，将这些申请各自的全部内容通过参考引入本文。

技术领域

本发明涉及结合人IL-12和IL-23的抗体。

背景技术

本说明书中作者参考的出版物的书目详细内容在描述结束时按字母顺序归总。

本说明书中对任何现有技术的参考不是并且不应当被认为是承认或任何形式的暗示该现有技术形成任何国家中公知常识的一部分。

白细胞介素-12(也称为细胞毒性淋巴细胞成熟因子或自然杀伤细胞刺激因子)是75-kDa的异二聚体蛋白。其由p35亚基构成，所述亚基由一束类似I类细胞因子的四个α螺旋组成。P35中C-端至C63的11个氨基酸称为二硫键环，因为该区域含有许多接触p40(IL-12的另一个亚基)的残基，包括p40中与C177的链间二硫键。p40亚基折叠类似其他I类受体(如，生长激素受体(GHR))的细胞外结构域。

p40亚基具有标为D1、D2和D3的三个结构域。每个结构域是β折叠结构，D2结构域含有C177链间二硫键。D2上还存在N-连接的糖基化位点(GlcNAc-GlcNAc-甘露糖，其中GlcNAc是N-乙酰葡糖胺)(Yoon等人，2000 Embo J 19 3530-41)。

白细胞介素-23是最近(2000年)通过搜索序列数据库发现的，该数据库具有白细胞介素-6螺旋细胞因子家族成员的计算衍生图谱。该搜索引起称为IL-23p19(p19)的新细胞因子亚基的发现。该亚基与IL-12p40共表达，引起称为白细胞介素-23(IL-23)的异二聚体蛋白的分泌。认为IL-23p19类似IL-12p35，因为其含有四个螺旋束(Oppmann等人，2000，Immunity 13 715-25)。

IL-12对其靶细胞类型的特异性作用是通过IL-12R复合物来介导的，该复合物由IL-12Rβ1(Chua等人，1994 J Immunol 153 128-36)和IL-12Rβ2(Presky等人，1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93 14002-7)构成。IL-23对其靶细胞类型的特异性作用是通过IL-23R复合物来介导的，该复合物由IL-12Rβ1和IL-23R构成(Parham等人，2002 J Immunol 168 5699-708)。

通过共同的p40亚基来介导IL-12Rβ1与IL-12和IL-23的结合。这使用竞争试验得到了证明，在该实验中p40亚基的同二聚体(p80)与IL-12竞争与IL-12Rβ1的结合。然而，p80对IL-12与IL-12Rβ2的结合不起作用(Presky等人，1996 Ann N Y Acad Sci 795 390-3)。

接着是IL-12的p35亚基或异二聚体接触面负责结合IL-12Rβ2，由此给予了IL-12对IL-12R复合物的选择性(Trinchieri等人，2003 Immunity 19 641-4)。同样，IL-23的p19或异二聚体接触面负责结合IL-23R，由此给予了IL-23对IL-23R复合物的选择性。

已经阐明了IL-12R和IL-23R复合物的信号传导。IL-12R激活Janus激酶(JAK)-这是信号传导的转录途径的信号传导子和激活子(STAT)。IL-12的实际细胞效应主要是由于STAT4激活引起的(Kaplan等人1996 Nature 382 174-7)。在IL-12Rβ2上存在STAT4结合位点，表明该受体对于信号传导是至关重要的(Yao等人，1999Arch Biochem Biophys 368 147-55)。在IL-12Rβ2的表达与TH1细胞对IL-12应答的相互关系中也证明了这一情况(Rogge等人，1997 J Exp Med 185 825-31)。IL-23R激活与IL-23R相似的复合物，如JAK-STAT途径。通过IL-23与IL-23R的结合，STAT3得到比STAT4更明显的诱导，并且其他所得到的结合DNA的STAT转录因子复合物是不同的(Parham、Chirica等人2002 J Immunol 168 5699-708)。

IL-12和IL-23的生物效应彼此不同。IL-12是由激活的炎性细胞(单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、小胶质细胞、树突细胞)分泌的。主要研究了IL-12对淋巴细胞的效应，尽管它也影响其他类型的细胞。在炎症过程中，IL-12诱导NK细胞和T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)。然后IL-12可能与IFN-γ联合，诱导T细胞分化成T_H1细胞。这种应答刺激了细胞免疫系统并最大化了巨噬细胞对病原体的杀灭效应和CD8+T细胞的增殖(Trinchieri 2003 Nat Rev Immunol 3 133-46)。IL-2的过度产生与提高的促炎症反应活性和自体免疫典型的组织损伤相关(Leonard等人，1997 Crit Rev Immunol 17 545-53)。失调的IL-12产生涉及以下疾病：牛皮癣(Yawalkar等人，1998 J Invest Dermatol 111 1053-7；de Rie 1999 Dermatology 199101；Shaker等人，2006 Clin Biochem 39 119-25)、克隆氏病(Neurath等人，1995J Exp Med 182 1281-90；Simpson等人，1998 J Exp Med 187 1225-34；Camoglio等人，2002 Eur J Immunol 32 261-9)、多发性硬化(Fassbender等人，1998 Neurology51 753-8；Laman等人，1998 J Neuroimmunol 86 30-45)、类风湿性关节炎(Kim等人，2000 Clin Exp Immunol 119 175-81；Leung等人，2000 J Immunol 1646495-502)，此外还有其他的自体免疫疾病。IL-12在这些疾病中的作用尚不清楚，但认为可能涉及T_H1应答的过度极化(Gordon等人，2005 Curr Opin Gastroenterol 21431-7)。

IL-23通过激活的人巨噬细胞以及树突细胞来分泌(Verreck等人，2004 ProcNatl Acad Sci U S A 101 4560-5)。IL-23主要作用于记忆T-细胞，并且认为通过IL-17A和IL-17F的调节来促进自体免疫疾病，如通过鼠脾细胞对IL-23应答而分泌IL-17的能力所证明的。在人存在IL-23/IL-17途径，并且已经显示出IL-23是IL-21、IL-22、IFN-γ、TNF-α和IL-17的同等良好诱导剂，这些全部是促炎症反应细胞因子。在体外，IL-6和TGF-β1促进天然T-细胞沿着新发现的T-细胞途径往下(T_H17)(Zhou等人，2007 Nat Immunol 8 967-74)。这些细胞进一步通过IL-21的分泌以自分泌的方式得到驱动。最后，认为IL-23和/或IL-1β在这种T_H17应答中维持了细胞(对于综述，参见Dong 2008 Nat Rev Immunol 8337-48)。还感兴趣的是转录因子RORγt，已经显示出其在T_H17应答中得到上调(Chen等人，2007Arthritis Rheum 56 2936-46)。

由于IL-12和IL-23都含有共同的亚基，因此难以将疾病状态仅仅归因于一种白细胞介素或另一种的过度产生。然而，研究表明IL-23失调涉及以下疾病：牛皮癣(Lee等人，2004 J Exp Med 199 125-30；Torti等人，2007 J Am Acad Dermatol 571059-68)、克隆氏病(Neurath 2007 Nat Med 13 26-8)和多发性硬化(Cua等人，2003 Nature 421 744-8)，此外还有其他自体免疫疾病。

IL-12p40可以作为单体(IL-12p40)或作为同二聚体(IL-12p80)得到分泌，IL-12p80是通过二硫键连接在一起的两个p40亚基(Gillessen等人，1995 Eur J Immunol 25 200-6)。与IL-12相比，在鼠休克模型中，这些p40物质超过50倍地得到分泌(Gillessen等人，1995 Eur J Immunol 25 200-6)，在人外周血单核细胞(PBMC)中，超过10-20倍(D′Andrea等人，1992 J Exp Med 176 1387-98)。IL-12p80可以以高于IL-12p40 20倍地在体外对抗IL-12的活性(Gillessen，Carvajal等人，1995 Eur J Immunol 25 200-6)。已经显示重组IL-12p80结合IL-12β1(Wang等人，1999 Eur J Immunol 29 2007-13)。

认为IL-12p40/p80是IL-12/23受体复合物的拮抗剂，因为重组鼠IL-12p80(rmIL-12p80)显示出在体内和体外与IL-12/23竞争对IL-12Rβ1的结合(Mattner等人，1993 Eur J Immunol 23 2202-8；Gillessen，Carvajal等人，1995 Eur J Immunol25 200-6；Gately等人，1996 Ann N Y Acad Sci 795 1-12)。同二聚体也显示出防止鼠模型中IL-12介导的休克(Mattner等人，1997 Infect Immun 65 4734-7)。在IL-23介导的免疫功能的研究中，IL-12p40通过竞争性地结合IL-12Rβ1破坏了IL-23诱导的细胞因子产生(Shimozato等人，2006 Immunology 117 22-8)。最近，IL-12p40或IL-12p80涉及其他生物学作用。最早确定的IL-12p80活性之一是作为巨噬细胞的化学引诱剂。IL-12Rβ1缺陷型巨噬细胞而不是IL-12Rβ2或IL-12p35缺陷型巨噬细胞，降低了对rmIL-12p80的化学引诱性应答，表明IL-12Rβ1可以在IL-12Rβ2的不存在下介导对IL-12p80的应答，并且IL-12p80的活性与IL-12无关(Russell等人，2003 J Immunol 171 6866-74)。IL-12p80还可以作为树突细胞(DC)迁移的诱导剂。IL-12p40缺陷型DC不能对分枝杆菌应答而从肺迁移至淋巴结。同时失去IL-12p35和IL-23p19没有影响分支杆菌激活的DC对趋化因子应答而迁移以及驱动T-细胞扩增的能力的事实强调了IL-12p40这种独特的作用(Khader等人，2006J Exp Med 203 1805-15)。IL-12p40和IL-12p80还显示出介导肺部的炎症应答并且显示出通过CD8⁺T细胞诱导IFN-γ产生(Cooper等人，2007 Trends Immunol 2833-8)。

由于IL-12和IL-23涉及各种病症，已经设计了几种治疗策略来抑制IL-12和/或IL-23活性。一些最早描述的抗体是由用IL-12免疫的小鼠杂交瘤分泌的鼠单克隆抗体(Strober等人，PCT公开号WO 97/15327；Gately等人，WO99/37682A2，Neurath，Fuss等人，1995 J Exp Med 182 1281-90)。由于将鼠免疫球蛋白给予人引起的问题，使用这些鼠抗体来治疗人受到限制。这些问题包括产生抗鼠免疫球蛋白的自体抗体，由此除去其在血清中的存在并使得没有任何治疗效果。随着将鼠序列仅限于抗体可变区的嵌合抗体的出现，这种称为人抗鼠抗体(HAMA)的效应得到了部分克服(Junghans等人，1990 Cancer Res 50 1495-502；Brown等人，1991 Proc Natl Acad Sci U S A 88 2663-7)。已经描述了嵌合抗体结合IL-12(Perritt等人，PCT公开号WO 02/097048A2)。甚至更多的人-样抗体是“人源化抗体”，其含有供体鼠抗体的互补决定区，但具有源自人受体抗体的可变框架(framework)区(Jones等人，1986 Nature 321 522-5，Winter U.S.Pat.No.5,225,539，Queen等人，U.S.Pat.No.5,693,761)。Lacy等人在WO07/005608中描述了这些抗IL-12和IL-23的“人源化”抗体。最近，已经描述了源自展示文库的完全人抗体，该展示文库源自人来源(Winter等人，美国专利号7,306,907；MacCafferty等人，美国专利号5,969,108)或具有人免疫球蛋白转基因的小鼠(Tomizuka等人，美国专利号7,041,870；Kucherlapati等人，美国专利号5,939,598)。Salfeld等人(美国专利号6,914,128)描述了抗IL-12的完全人抗体。

基于与IL-12、IL-23、IL-12p40和IL-12p80的相互作用，可以预见五大类抗体(图1)。第一类抗体是与存在于IL-12和IL-23中的IL-12p40，以及与IL-12p40单体和IL-12p80同二聚体特异性相互作用的那些抗体(图1.1)。第二类抗体是与IL-12p35特异性相互作用的那些抗体(通过Devergne等人，2001 Am J Pathol 1591763-76中的抗体G161-566来举例说明；图1.2)。第三类抗体是与IL-12，而不与IL-23、IL-12p35和IL-12p40特异性相互作用的那些抗体(通过D′Andrea，Rengaraju等人，1992 J Exp Med 176 1387-98中的抗体20C2来举例说明；图1.3)。第四类抗体是与IL-23p19特异性相互作用的那些抗体(通过Presta等人的WO2007/027714来举例说明；图1.4)。第五类抗体是与IL-23p40，而不与IL-12p40特异性相互作用的那些抗体，开发了IL-23上暴露的但通过IL-12中的IL-12p35亚基遮蔽的IL-12p40亚基上的序列(通过Benson等人，美国专利号7,247,711来举例说明；图1.5)。本发明描述了新形式的与IL-12p40、IL-12p80、IL-12和IL-23特异性相互作用的第一类抗体(图1.1)。

了解了一些关于方法的信息，通过所述方法这第一类抗体抑制IL-12/23受体-配体复合物并因此发挥其拮抗效应。Giles-Komar等人(WO2006/069036)描述了对IL-12p40的氨基酸残基1-88特异的抗-IL-12p40抗体。该抗体进一步的特征在于特异性地抑制IL-12和IL-23与IL-12Rβ1的相互作用(Papp等人，2008 Lancet 3711675-84)。同样，在文献中已经描述了另一种抗体抑制IL-12/23与IL-12 Rβ1的相互作用(Ding等人，2008 Curr Opin Investig Drugs 9 515-22)。本发明描述了通过新的作用机理抑制IL-12/23受体-配体复合物的抗体(图2.3)。这些新的作用机理包括IL-12/IL-12Rβ2相互作用和IL-23/IL-23R相互作用的选择性中和。它们不同于之前所述的抗体(参见上文)，因为它们不中和IL-12/23与IL-12Rβ1的结合。这些抗体也是新的，因为它们不抑制IL-12p40/p80结合IL-12Rβ1，因此不抑制IL-12p40/p80在宿主防御中的作用，由此潜在地提高了这些抗体相对于其他IL-12/23抗体的安全性特征。这些具有新作用机制的抗体可以引起与IL-12/23相关疾病治疗的改进，但具有降低的安全性问题。此外，这些抗体具有提高的功效，因为它们不抑制IL-12和IL-23、IL-12p40或IL-12p80的天然拮抗剂。这将使得抗体和IL-12p40或IL-12p80都作为拮抗剂发挥作用，由此提高抑制的水平，超过了单独给予抗体的水平。

发明内容

本发明提供了一种抗体，其包含结合人IL-12和人IL-23的抗原结合结构域，其中该抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的人IL-12p40，并且其中该抗体抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合以及人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

本发明进一步提供了治疗或降低细胞、组织、器官、动物或患者中至少一种IL-12和/或IL-23疾病的症状的方法，包括使用本发明的抗体或其特定的部分或变体。

本发明的抗体还可以用于检测或测定样品中IL-12、IL-23、IL-12p40或IL-12p80的存在。该方法包括将抗体加入样品中，测定抗体与样品中存在的IL-12、IL-23、IL-12p40或IL-12p80的结合。

为了可以更全面地理解本发明的性质，现在将参考以下的附图和实施例来描述其各种形式。

附图说明

图1：不同类别的抗IL-12/23抗体。图1.1)结合IL-12、IL-23、IL-12p40和IL-12p80的p40亚基的抗体；图1.2)结合IL-12的p35亚基的抗体；图1.3)结合作为异二聚体的IL-12的p35和p40亚基的抗体；图1.4)结合IL-23的p19亚基的抗体；图1.5)结合IL-23、IL-12p40和IL-12p80中存在的而不在IL-12中存在的p40的抗体。

图2：IL-12/23受体相互作用。IL-12结合IL-12Rβ1和IL-12Rβ2。IL-23结合IL-12Rβ1和IL-23R。IL-12p40结合IL-12Rβ1。IL-12p80结合IL-12Rβ1。图2.1)IL-12和IL-23的亚基。图2.2)抑制IL-12与IL-12Rβ2结合的抗体。图2.3)抑制IL-12与IL-12Rβ2结合和IL-23与IL-23R结合的抗体。

图3：如通过ELISA测定的，PMA204和抗体1以剂量依赖性方式结合IL-12(A)、IL-23(B)、IL-12p40(C)和IL-12p80(D)。

图4：PMA204和抗体1中和IL-12与IL-12Rβ2的结合(A)和IL-23与IL-23R的结合(B)。

图5：PMA204和抗体1不抑制IL-12与IL-12Rβ1的结合(A)和IL-12p80与IL-12Rβ1的结合(B)。

图6：PMA204和抗体1不抑制IL-12p40与IL-12Rβ1的结合(A)和IL-23与IL-12Rβ1的结合(B)。

图7：抗体1不抑制IL-p40(A)、IL-12(B)、IL-23(C)与IL-12Rβ1稳定转染的Jurkat细胞系的结合。阳性对照抗体202.1以剂量依赖性方式抑制了IL-12p40、IL-12和IL-23与该细胞系的结合。

图8：抗体1结合与IL-12Rβ1稳定转染的Jurkat细胞系结合的IL-p40(A)、IL-12(B)和IL-23(C)，形成复合物。阳性对照抗体202.1不能够形成这样的复合物。

图9：显示了各种抗体与IL-12和IL-23结合的ELISA数据。

图10：抗体1、3、4、7和比较抗体的SDS-PAGE凝胶，证明了不同的条带模式。

图11：展示了抑制IL-12诱导的NK-92细胞IFN-γ释放的PMA204、抗体1、抗体50、抗体68和抗体80。

图12：显示了各种抗体与IL-12和IL-23结合的ELISA数据。

图13：显示了各种抗体与IL-12和IL-23结合的ELISA数据。

图14：抗体80和抗体136展示了对IL-23诱导的鼠脾细胞IL-17分泌的抑制。

图15：显示了各种抗体与IL-12和IL-23结合的ELISA数据。

图16：显示了各种抗体与IL-12和IL-23结合的ELISA数据。

图17：抗体80和抗体136展示了对IL-12诱导的人PBMC IFN-γ释放的抑制。

图18：显示了各种抗体与IL-12和IL-23结合的ELISA数据。

图19：显示了各种抗体与IL-12和IL-23结合的ELISA数据。

图20：显示了各种抗体与IL-12和IL-23结合的ELISA数据。

图21：证明了抗体136和PMA204竞争与IL-12(A)和IL-23(B)结合的竞争SPR实验。

图22：证明了抗体136和PMA202不竞争与IL-12(A)和IL-23(B)结合的竞争SPR实验。

图23：证明了PMA204和抗体202.1不竞争与IL-12或IL-23结合以及抗体136竞争与IL-12和IL-23结合的竞争ELISA实验。

图24：与抗体202.1相比，抗体80和抗体136中和IL-12与IL-12Rβ2的结合(A)以及IL-23与IL-23R的结合(B)，这证明了在测试抗体的最高浓度下没有抑制。

图25：PMA204和抗体1不中和IL-12与IL-12Rβ1的结合(A)以及IL-23与IL-12Rβ1的结合(B)。抗体202.1展示出IL-12结合IL-12Rβ1(A)和IL-23结合IL-12Rβ1(B)的剂量依赖性抑制。

图26：各种人源化和亲和力成熟的抗体抑制了IL-23诱导的鼠脾细胞的IL-17释放。显示了两组亲和力成熟的人源化前导抗体(lead antibody)，基于抗体80的那些人源化前导抗体(A)和基于抗体136的那些人源化前导抗体(B)。

图27：IL-23皮内给药于小鼠6天后，它们产生了类似牛皮癣的皮肤炎症。A)同种型对照的给予没有防止皮肤炎症，然而，抗体80和抗体136降低了该模型中的炎症，如通过较低的临床分数所证实的。B)在组织学水平，在IL-23皮内给药超过6天后产生了表皮增厚。用抗体80和抗体136治疗改善了这种表皮增厚，但用同种型对照抗体治疗没有改善。

图28：各种人源化和亲和力成熟抗体抑制了嵌合IL-12诱导的鼠脾细胞的IFN-γ释放。显示了两组亲和力成熟的人源化前导抗体，基于抗体80的那些人源化前导抗体(A)和基于抗体136的那些人源化前导抗体(B)。

图29：给予嵌合IL-12重复注射的小鼠具有升高的IFN-γ血清水平。用抗体80或抗体136治疗时，相对于用同种型对照抗体的治疗，血清IFN-γ的水平降低。

图30：(A)抗体80能够在三明治ELISA中检测重组IL-23。(B)抗体80能够在三明治ELISA中检测由SAC刺激的PBMC产生的天然产生的IL-23。

图31：通过ELISA，抗体80强烈地结合IL-23WT蛋白，但与IL-23突变体D265A和R266A的结合降低。

具体实施方式

本发明产生了一组抗IL-12的抗体。在筛选这些抗体中，令人惊讶地发现了一个特别亚组的结合人IL-12和IL-23并抑制IL-12与IL-12Rβ2的结合以及IL-23与IL-23R的结合，但不抑制IL-12或IL-23或IL-12p40或IL-12p80与IL-12Rβ1的结合的抗体。因此，能够以先前不可完成的方式来改变IL-12和IL-23的活性。

因此，本发明提供了一种抗体，其包含结合人IL-12和人IL-23的抗原结合结构域，其中该抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的人IL-12p40，并且其中该抗体抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合以及人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

在优选的具体实施方案中，抗体与包含具有PMA204的序列(SEQ ID NO.6)的重链可变区的抗体和/或包含具有PMA204序列(SEQ ID NO.7)的轻链可变区的抗体竞争与人IL-12和/或人IL-23的结合。

如本文所用的，“竞争”意思是测试抗体与PMA204以相同的浓度使用时，将PMA204与IL-12、IL-23或IL-12p40的结合降低了至少10％(通过ELISA测试)。

本发明提供了一种抗体及其变体，其结合存在于IL-12和IL-23中的IL-12p40，IL-12p40具有SEQ ID No.1所示的序列，并在以下给出：

IWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQS SEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQK EPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYE NYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSE

在优选的具体实施方案中，由该抗体结合的表位在序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO：65)内。特别地，该抗体在Asp265上结合人IL-12p40(SEQ ID No.1)。

在另一个方面中，本发明提供了一种抗体，其包含结合人IL-23(SEQ ID NO：66)的抗原结合结构域，其中该抗体结合人IL-23(SEQ ID NO：66)的水平高于该抗体结合突变体IL-23 D265A(SEQ ID NO：75)的水平。

该抗体还结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的人IL-12p40并抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合以及人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

本发明提供了可以用于通过选择性地中和IL-12与IL-12Rβ2的结合以及IL-23与IL-23R的结合，治疗至少一种IL-12和/或一种IL-23相关病症的抗体。

本发明提供了一种抗体，其包含3个选自以下的重链CDR序列：

CDRHC1 DYYX₁H，其中

X₁＝M或L；

CDRHC2 WIDPENGDTEX₂APKFQG，其中

X₂＝Y、H或S；

CDRHC3 X₃KELRYFDV，其中

X₃＝C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P或V。

本发明提供了一种抗体，其包含3个选自以下的轻链CDR序列：

CDRLC1 RAX₄X₅SISINLH，其中

X₄＝S或P；

X₅＝Q或R；

CDRLC2 FAX₆QSX₇S，其中

X₆＝S或R；

X₇＝I或T；

CDRLC3 QQSNSX₈PLT，其中

X₈＝W或F。

本发明提供了一种抗体，其包含3个选自以下的重链CDR序列：

CDRHC1 DYYX₁H，其中

X₁＝M或L；

CDRHC2 WIDPENGDTEX₂APKFQG，其中

X₂＝Y、H或S；

CDRHC3 X₃KELRYFDV，其中

X₃＝C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P或V。

和3个选自以下的轻链CDR序列：

CDRLC1 RAX₄X₅SISINLH，其中

X₄＝S或P；

X₅＝Q或R；

CDRLC2 FAX₆QSX₇S，其中

X₆＝S或R；

X₇＝I或T；

CDRLC3 QQSNSX₈PLT，其中

X₈＝W或F。

本发明提供了一种抗体，其由免疫球蛋白重链可变区组成，该免疫球蛋白重链可变区由以下序列之一组成：

SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：118，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：134，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：141和SEQ ID NO：167。

本发明提供了一种抗体，其由免疫球蛋白轻链可变区组成，该免疫球蛋白轻链可变区由以下序列之一组成：

SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：170，SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：172，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：174，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：175，SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：177，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：178，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：179和SEQ ID NO：192。

本发明提供了一种抗体，其进一步包含人重链受体框架。特别地，是其中所述受体框架包含选自SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：204或SEQ ID NO：207的氨基酸序列的抗体。

本发明提供了一种抗体，其进一步包含人轻链受体框架。特别地，是其中所述受体框架包含选自SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：215的氨基酸序列的抗体。

本发明提供了一种抗体，其包含两个免疫球蛋白可变区，其中所述两个免疫球蛋白可变区选自：

本发明提供了一种抗体，其中所述人受体框架在关键残基处包含至少一个框架区氨基酸置换，所述关键残基选自邻近CDR的残基、糖基化位点残基、罕见的残基、能够与人IL-12的p40亚基相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范的残基、重链可变区和轻链可变区之间接触的残基；Veriner区内的残基和Chothia-限定的VH结构域CDR1与Kabat-限定的第一重链框架之间重叠区域中的残基。在进一步的方面中，所述人受体框架包含至少一个框架区氨基酸置换，其中框架的氨基酸序列与所述人受体框架的序列为至少65％相同，并包含至少70个与所述人受体框架相同的氨基酸残基。

本发明提供了一种抗体，其是共有的人VH结构域。此外，本发明提供了一种抗体，其是共有的人VL结构域。

本发明提供了一种抗体，其中所述人受体框架包含至少一个框架区氨基酸置换，其中框架的氨基酸序列与所述人受体框架的序列为至少65％相同，并包含至少70个与所述人受体框架相同的氨基酸残基。

本发明描述了一种抗体，其中该抗体含有选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE或IgA的人或非人灵长类动物的重链免疫球蛋白恒定区。

本发明描述了一种抗体，其中该抗体含有选自κ(kappa)或λ(lambda)的人或非人灵长类动物的轻链免疫球蛋白恒定区。

本发明还提供了生产本发明抗体的方法，该方法包括：

(i)用人IL-12p40或人IL-12p40的片段来免疫动物，以获得第一组抗体；

(ii)从第一组结合人IL-12和人IL-23的抗体中进行选择，以形成第二组抗体；和

(iii)从第二组抗体中进行选择，所述抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的p40并且抑制人IL-12与人IL-12β2的结合以及人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

该方法在步骤(ii)还可以包括选择还结合具有序列VQVQGKSKREKKDRV FTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO.65)的肽的抗体。

本发明还提供了另一种生产本发明抗体的方法，该方法包括：

(i)用具有序列VQVQGKSKREKKDRV FTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO.65)的肽来免疫动物，以获得第一组抗体；

(iii)从第二组抗体中进行选择，所述抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的p40并且抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合以及人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

本发明还提供了另外一种生产本发明抗体的方法，该方法包括：

(i)获得人抗体展示文库，以形成第一组抗体；

(iii)从第二组抗体中进行选择，所述抗体结合作为单体(人IL-12p40)和/或作为同二聚体(人IL-12p80)存在的p40并且抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合以及人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明的VH结构域。优选该核酸分子具有选自以下的序列：

本发明提供了一种核酸分子，其编码本发明的VL结构域。优选该核酸分子具有选自以下的序列：

本发明还提供了治疗受试者疾病的方法，其包括将本发明的抗体给药于受试者，其中疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、骨质丢失、气道超敏反应、慢性阻塞性肺病、脱髓鞘病症、牛皮癣、多发性硬化、皮肤超敏反应、急性和慢性移植排斥、同种异体移植排斥、移植物抗宿主病、系统性硬化、系统性红斑狼疮、自体免疫炎性肠病、泌尿系炎性病症、心血管疾病、血管炎、周期性发热、葡萄糖代谢障碍、肺病、癌症、牙周炎、肝基质角膜炎、过敏症、炎性疼痛、脊柱关节病、败血症、脓毒性或内毒素性休克、脑膜炎、外科创伤、自体免疫血液病、阿尔茨海默病、肉状瘤病、硬化、肝炎(包括自体免疫肝炎)、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、甲状腺炎、动脉粥样硬化、脱发、威尔逊氏病(Wilson’s disease)、肾小球性肾炎和血脂异常。

本发明进一步提供了一种方法或组合物中的至少一种抗体、其特定的部分或变体，以治疗有效量给药时，其用于调节、用于治疗或减轻细胞、组织、器官、动物或患者中的至少一种IL-12和/或IL-23疾病的症状，和/或按照许多不同病症的需要，如但不限于，相关疾病或治疗条件之前、之后或之中，如本领域已知的和/或本文所述的。

本发明进一步提供了一种方法或组合物中的至少一种抗体、其特定的部分或变体，以治疗有效量给药时，其用于调节、用于治疗或减轻免疫、神经和相关病症的症状，所述病症如，但不限于，关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎、幼年慢性关节炎、脓毒性关节炎、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、牛皮癣关节炎、反应性关节炎、脊柱关节病、系统性红斑狼疮、克隆氏病、溃疡性结肠炎、炎性肠病、胰岛素依赖性糖尿病、甲状腺炎、哮喘、过敏症、牛皮癣、皮炎硬皮病、移植物抗宿主病、器官移植排斥、与器官移植相关的急性或慢性免疫病、肉状瘤病、动脉粥样硬化、弥漫性血管内凝血、川崎病(Kawasaki′s disease)、甲状腺机能亢进(Grave′s disease)、肾病综合症、慢性疲劳综合症、韦格内氏肉芽肿症(Wegener′s granulomatosis)、过敏性紫癜、显微镜下肾脏血管炎、慢性活动性肝炎、葡萄膜炎、脓毒性休克、毒性休克综合症、脓毒综合症、恶病质、传染病、寄生虫病、获得性免疫缺陷综合症、急性横贯性脊髓炎、亨廷顿氏病、帕金森氏病、阿尔茨海默病、中风、原发性胆汁性肝硬化、溶血性贫血、恶性肿瘤、心力衰竭、心肌梗塞、爱迪生氏病(Addison′s disease)、散发性I型多腺缺陷和II型多腺缺陷、施密特氏综合征(Schmidt′s syndrome)、成人(急性)呼吸窘迫综合症、脱发、斑秃、血清反应阴性关节病、关节病、赖特尔氏病(Reiter′s disease，)、牛皮癣关节病、溃疡性结肠炎关节病、肠源性滑膜炎(enteropathic synovitis)、衣原体、耶尔森氏菌和沙门氏菌相关的关节病、脊柱关节病、动脉粥样硬化病/动脉硬化、异位性过敏症、自体免疫大疱病、寻常天疱疮、落叶型天疱疮、类天疱疮、线性IgA病、自体免疫溶血性贫血、Coombs阳性溶血性贫血、获得性恶性贫血、幼年性恶性贫血、肌痛性脑炎/Royal Free病、慢性皮肤粘膜念珠菌病、巨细胞性动脉炎、原发性硬化性肝炎、隐发性自体免疫肝炎、获得性免疫缺陷病综合症、获得性免疫缺陷相关疾病、乙肝、丙肝、普通变异性免疫缺陷(普通变异性低丙种球蛋白血症)、扩张性心肌病、女性不孕症、卵巢衰竭、卵巢早衰、纤维化肺病、原因不明性纤维性肺泡炎、炎症后间质性肺病、间质性肺炎、结缔组织病相关的间质性肺病、混合性结缔组织病相关的肺病、系统性硬化相关的间质性肺病、类风湿性关节炎相关的间质性肺病、系统性红斑狼疮相关的肺病、皮肌炎/多肌炎相关的肺病、斯耶格伦氏综合征(Sjogren′s disease)相关的肺病、强直性脊柱炎相关的肺病、脉管炎弥散性肺病(vasculitic diffuse lung disease)、含铁血黄素沉着相关的肺病、药物诱发的间质性肺病、纤维症、放射纤维症、闭塞性细支气管炎、慢性嗜酸细胞性肺炎、淋巴细胞浸润性肺病、感染后间质性肺病、痛风性关节炎、自体免疫肝炎、1型自体免疫肝炎(典型的自体免疫或狼疮状肝炎)、2-型自体免疫肝炎(抗-LKM抗体肝炎)、自体免疫介导的低血糖、伴随黑色棘皮症的B型胰岛素抵抗、甲状旁腺机能减退、与器官移植相关的急性免疫疾病、与器官移植相关的慢性免疫疾病、骨关节炎、原发性硬化性胆管炎、1型牛皮癣、2型牛皮癣、特发性白细胞减少症、自体免疫嗜中性白血球减少症、肾病NOS、肾小球肾炎、显微镜下肾脏血管炎、莱姆病、盘状红斑狼疮、特发性男性不育症或NOS(male infertility idiopathic or NOS)、精子自体免疫性、多发性硬化(所有亚型)、交感性眼炎、结缔组织病继发的肺动脉高血压、古德帕斯丘综合症(Goodpasture′s syndrome)、结节性多动脉炎的肺部呈现、急性风湿热、类风湿性脊椎炎、Still氏病、系统性硬化、Sjorgren氏综合症、多发性大动脉炎病/动脉炎、自体免疫血小板减少症、特发性血小板减少症、自体免疫甲状腺病、甲状腺机能亢进、甲状腺肿的自体免疫甲状腺机能减退(Hashimot氏病)、萎缩性自体免疫甲状腺机能减退、原发性粘液性水肿、晶状体源性葡萄膜炎(phacogenic uveitis)、原发性血管炎、白癜风急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精诱发的肝损伤、胆汁郁积(choleosatatis)、特质性肝病、药物诱发的肝炎、非酒精性脂肪性肝炎、过敏症和哮喘、B组链球菌(GBS)感染、精神障碍(例如，抑郁和精神分裂症)、T_H2型和T_H1型介导的疾病、急性和慢性疼痛(不同形式的疼痛)和癌症(如肺癌、乳腺癌、胃癌、膀胱癌、结肠癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌和直肠癌)和造血系统恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)、无β-脂蛋白血症、手足发绀、急性和慢性寄生虫性或传染性过程、急性白血病、急性淋巴性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、急性或慢性细菌感染、急性胰腺炎、急性肾衰竭、腺癌、空气异位搏动(aerial ectopic beats)、AIDS痴呆复合症、酒精诱发的肝炎、过敏性结膜炎、过敏性接触性皮炎、过敏性鼻炎、同种异体移植排斥、α-1-抗胰蛋白酶缺乏、肌萎缩性侧索硬化症、贫血、心绞痛、前角细胞退化、抗cd3治疗、抗磷脂综合症、抗受体超敏反应、主动脉和外周动脉瘤、主动脉壁夹层形成、动脉高血压、动脉硬化、动静脉瘘、运动失调、心房纤维性颤动(持续的或突发性的)、心房扑动、房室传导阻滞、B细胞淋巴瘤、骨移植排斥、骨髓移植(BMT)排斥、束支性传导阻滞、伯基特氏(Burkitt′s)淋巴瘤、烧伤、心律失常、心脏顿抑综合症(cardiac stun syndrome)、心脏肿瘤、心肌病、心肺分流术炎性反应、软骨移植排斥、小脑皮质退化、小脑障碍、紊乱性或多病灶性房性心动过速、化疗相关的失调、慢性髓细胞白血病(CML)、慢性醇中毒、慢性炎症病状、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性水杨酸盐中毒、结直肠癌、充血性心力衰竭、结膜炎、接触性皮炎、肺原性心脏病、冠心病、克雅二氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、培养阴性脓毒症、囊肿性纤维化、细胞因子治疗相关的失调、拳击员痴呆、脱髓鞘疾病、登革出血热、皮炎、皮肤病症、糖尿病、糖尿病(diabetes mellitus)、糖尿病性动脉硬化病、弥漫性路易体病、扩张型充血性心肌病、基底神经节失调、中年唐氏综合症、由阻断CNS多巴胺受体的药物诱发的药物诱发性运动障碍、药物敏感性、湿疹、脑脊髓炎、心内膜炎、内分泌病、会厌炎、EB病毒感染、红斑性肢痛病、椎体束外和小脑障碍、家族性噬血细胞淋巴组织细胞增生症、胎儿胸腺移植排斥、弗立特里希氏运动失调(Friedreich′s ataxia)、功能性外周动脉障碍、真菌性脓毒症、气性坏疽、胃溃疡、肾小球肾炎、任何器官或组织的移植排斥、革兰氏阴性脓毒症、革兰氏阳性脓毒症、由于胞内生物体引起的肉芽肿、毛细胞白血病、蛋白球色素退变综合征(Hallerrorden-Spatz disease)、桥本甲状腺炎、枯草热、心脏移植排斥、血色素沉着症、血液透析、溶血性尿毒症综合症/血栓溶解性血小板减少性紫癜、出血、肝炎(甲肝)、希氏束心律失常(His bundle arrythmias)、EVQ感染/HIV神经病、霍奇金病(Hodgkin′s disease)、运动过度性运动障碍、超敏反应、超敏性肺炎、高血压、运动功能减退性运动障碍、下丘脑-垂体-肾上腺轴评价、特发性爱迪生氏病、特发性肺纤维化、抗体介导的细胞毒性、虚弱、婴儿脊髓性肌萎缩、主动脉炎症、甲型流感、电离辐射暴露、虹膜睫状体炎/葡萄膜炎/视神经炎、缺血-再灌注损伤、缺血性中风、幼年型类风湿性关节炎、青少年脊髓性肌萎缩、卡波济氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、肾移植排斥、军团杆菌病(legionella)、利什曼病、麻风病、皮质脊髓系统的损伤、脂肪水肿、肝移植排斥、淋巴水肿、疟疾、恶性淋巴瘤、恶性组织细胞增多病、恶性黑素瘤、脑膜炎、脑膜炎球菌血症、代谢/特发性、偏头痛、线粒体多系统失调、混合性结缔组织病、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、多系统退化(Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager和Machado-Joseph)、重症肌无力、鸟型细胞内的分枝杆菌(mycobacterium avium intracellulare)、结核分枝杆菌、骨髓增生异常综合症、心肌梗塞、心肌缺血性失调、鼻咽癌、新生儿慢性肺病、肾炎、肾病、神经退化病、I型神经性肌肉萎缩、中性白细胞减少性发热、非霍奇金淋巴瘤、腹主动脉及其分支的阻塞、阻塞性动脉病症、okt3治疗、睾丸炎/附睾炎(epidydimitis)、睾丸炎/输精管切除术翻转程序(vasectomy reversal procedures)、脏器肿大、骨质疏松症、胰腺移植排斥、胰腺癌、瘤外综合症/恶性肿瘤的血钙过多(hypercalcemia of malignancy)、甲状旁腺移植排斥、盆腔炎、常年性鼻炎、心包疾病、外周性动脉硬化病、外周性血管疾病、腹膜炎、恶性贫血、卡氏肺囊虫肺炎、肺炎、POEMS综合症(多发性神经病、脏器肿大、内分泌病、单克隆丙种球蛋白病和皮肤变化综合症)、灌注后综合症、泵后综合症、MI后心切开术综合症、先兆子痫、进行性核上性麻痹、原发性肺动脉高血压、放射疗法、雷诺氏现象和疾病、雷诺氏病、雷弗素姆(氏)病(Refsum′s disease)、规律性窄QRS心动过速、肾血管性高血压、再灌注损伤、限制性心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易体型老年痴呆、血清反应阴性关节病、休克、镰状细胞贪血、皮肤同种异体移植排斥、皮肤变化综合症、小肠移植排斥、实体肿瘤、特异性心律失常、脊髓性运动失调、脊髓小脑变性、链球菌肌炎、小脑结构损伤、亚急性硬化性全脑炎、晕厥、心血管系统的梅毒、全身性过敏反应、全身性炎症应答综合症、全身性发作的幼年型类风湿性关节炎、T-细胞或FAB ALL、毛细管扩张、血栓闭塞性脉管炎、血小板减少、毒性、移植、创伤/出血、M型超敏反应、IV型超敏反应、不稳定型心绞痛、尿毒症、尿脓毒病、荨麻疹、瓣膜性心脏病、静脉曲张、脉管炎、静脉病、静脉血栓形成、心室纤颤、病毒和真菌感染、致命的脑炎/无菌性脑膜炎、致命相关的嗜血细胞综合症、韦-柯二氏综合征(Wernicke-Korsakoff syndrome)、威尔逊氏病(Wilson′s disease)、任何器官或组织的异种移植排斥。

本发明的范围包括亲和力已经成熟的抗IL-12/IL-23抗体。

各种用于抗体亲和力成熟的方法是本领域已知的。这些中的许多是基于通过诱变接着选择和/或筛选提高的亲和力来产生变体蛋白质组或文库的一般策略。诱变通常是在DNA水平进行的，例如，通过易错PCR(error prone PCR，Thie 2009)，通过基因改组(shuffling)(Kolkman 2001)，通过使用诱变化学物质或辐射，通过使用具有易错复制系统的“突变基因”株(Greener 1996)或通过利用天然亲和力成熟系统的体细胞高突变方法(Peled 2008)。诱变还可以在RNA水平进行，例如，通过使用Qβ复制酶(Kopsidas 2006)。可以筛选改良的变体蛋白质的基于文库的方法可以基于各种展示技术，如噬菌体、酵母、核糖体、细菌或哺乳动物细胞，并且是本领域熟知的(Benhar 2007)。可以通过更直接/可预测的方法来实现亲和力成熟，例如，通过由来自3D蛋白质建模的发现指导的定点诱变或基因合成(参见，例如，Queen 1989；或美国专利号6,180,370或5,225,539)。

因此，本发明提供了生产结合人IL-12p40的抗原结合结构域的方法，该方法包括

a.通过在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH结构域的氨基酸序列中添加、删除、置换或插入一个或多个氨基酸来提供是亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，其中亲本VH结构域HCDR1、HCDR2和HCDR3是一组以上限定的CDR，并任选将由此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域结合，以提供一个或多个VH/VL组合；和

b.测试所述为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域或一个或多个VH/VL组合，来鉴定人IL-12p40的抗体抗原结合结构域。

优选亲本VH结构域具有SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：118，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：134，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：167中所示的VH结构域氨基酸序列。

通过CDR诱变可以提供是亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域。

在该方法中，通过在包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的亲本VL结构域的氨基酸序列中添加、删除、置换或插入一个或多个氨基酸来提供一个或多个VL结构域，产生了一个或多个是亲本VL结构域的氨基酸序列变体的VL结构域，其中亲本VL结构域LCDR1、LCDR2和LCDR3是以上限定的VL组的CDR。

优选亲本VL结构域具有SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：170，SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：172，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：174，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：175，SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：177，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：178，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：192中所示的VL结构域氨基酸序列。

通过CDR诱变可以提供是亲本VL结构域的氨基酸序列变体的VL结构域。

可以提供抗体抗原-结合结构域，作为IgG、scFv或Fab抗体分子的成分。

本发明还提供了生产结合人IL-12p40的抗原结合结构域的方法，该方法包括：

a.提供编码VH结构域的起始核酸或各自编码VH结构域的核酸的起始库(starting repertoire)，其中VH结构域选自SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：114，SEQ ID NO：142，SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：87，SEQ ID NO：115，SEQ ID NO：143，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：88，SEQ ID NO：116，SEQ ID NO：144，SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：90，SEQ ID NO：117，SEQ ID NO：145，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：91，SEQ ID NO：118，SEQ ID NO：146，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：92，SEQ ID NO：119，SEQ ID NO：147，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：93，SEQ ID NO：120，SEQ ID NO：148，SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：94，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：149，SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：95，SEQ ID NO：124，SEQ ID NO：150，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：96，SEQ ID NO：125，SEQ ID NO：151，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：97，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：152，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：99，SEQ ID NO：127，SEQ ID NO：153，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：100，SEQ ID NO：128，SEQ ID NO：154，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：101，SEQ ID NO：129，SEQ ID NO：155，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：102，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：156，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：103，SEQ ID NO：131，SEQ ID NO：157，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：104，SEQ ID NO：132，SEQ ID NO：158，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：105，SEQ ID NO：133，SEQ ID NO：159，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：106，SEQ ID NO：134，SEQ ID NO：160，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：107，SEQ ID NO：135，SEQ ID NO：161，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：108，SEQ ID NO：136，SEQ ID NO：162，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：109，SEQ ID NO：137，SEQ ID NO：163，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：110，SEQ ID NO：138，SEQ ID NO：164，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：111，SEQ ID NO：139，SEQ ID NO：165，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：112，SEQ ID NO：140，SEQ ID NO：166，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：113，SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：167；

b.将所述起始核酸或起始库与一个或多个编码氨基酸序列突变或通过氨基酸序列突变产生的供体核酸结合，使得所述一个或多个供体核酸插入起始核酸或起始库的VH结构域中，以提供编码VH结构域的核酸产物库；表达所述产物库的核酸，以产生产物VH结构域；

c.任选将所述产物VH结构域与一个或多个VL结构域结合；

d.选择人IL-12p40的抗原结合结构域，

e.回收所述抗原结合结构域或编码其的核酸，其中，

抗原结合结构域包含产物VH结构域和任选的VL结构域。

a.提供编码VL结构域的起始核酸或各自编码VL结构域的核酸的起始库，其中VL结构域选自SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：169，SEQ ID NO：181，SEQ ID NO：193，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：170，SEQ ID NO：182，SEQ ID NO：194，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：171，SEQ ID NO：183，SEQ ID NO：195，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：172，SEQ ID NO：184，SEQ ID NO：196，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：173，SEQ ID NO：185，SEQ ID NO：197，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：174，SEQ ID NO：186，SEQ ID NO：198，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：175，SEQ ID NO：187，SEQ ID NO：199，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：176，SEQ ID NO：188，SEQ ID NO：200，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：177，SEQ ID NO：189，SEQ ID NO：201，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：178，SEQ ID NO：190，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：192；

b.将所述起始核酸或起始库与一个或多个编码氨基酸序列突变或通过氨基酸序列突变产生的供体核酸结合，使得所述一个或多个供体核酸插入起始核酸或起始库的VL结构域中，以提供编码VL结构域的核酸产物库；表达所述产物库的核酸，以产生产物VL结构域；

c.任选将所述产物VL结构域与一个或多个VH结构域结合；

d.选择人IL-12p40的抗原结合结构域，

e.回收所述抗原结合结构域或编码其的核酸，其中抗原结合结构域包含产物VH结构域和任选的VL结构域。

在这些方法中，可以通过所述HCDR1和/或HCDR2和/或HCDR3的突变来产生供体核酸。还可以通过核酸的随机突变来提供供体核酸。

本发明的抗体可以选自各种本领域熟知的抗体分子。在某些具体实施方案中，抗体选自免疫球蛋白分子、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、CDR移植的抗体、人源化抗体、合成人源化(synhumanised)抗体、灵长类化抗体、结构域抗体、骆驼衍生的抗体片段、Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、scFv、二硫化物连接的Fv、双功能抗体、多价抗体、双重特异性抗体、双特异性抗体、免疫球蛋白恒定区结合结构域和其中已经移植了抗原结合结构域的蛋白质支架(如Qiu等人，2007 Nat Biotechnol 25921-9中举例说明的)及其变体。本发明还延伸至抗体组合物、编码抗体的核酸和互补核酸、载体、宿主细胞、组合物、制剂、设备、转基因动物、转基因植物及其制备和使用方法，如所述的，和与本领域中已知的结合，在本文能够使用的。

本发明提供了分离的核酸分子，其包含，与编码特异性抗体的多核苷酸或其变体互补或杂交，包含至少一个特定的序列、结构域、其部分或变体。本发明提供了包含所述抗体衍生的核酸分子的重组载体，含有该核酸和/或重组载体的宿主细胞，以及制备和/或使用该抗体、核酸、载体和/或宿主细胞的方法。

本发明还提供了至少一种组合物，其包含(a)分离的抗体、编码其特定部分或变体的核酸和/或本文所述的抗体；和(b)合适的载体或稀释剂。根据已知的方法，载体或稀释剂可以任选是药学上可接受的。组合物可以任选进一步包含至少一种其他化合物、蛋白质或组合物。

本发明还提供了至少一种用于在宿主细胞中表达抗体或其变体的方法，包括在抗体或其变体以可回收量表达的条件下培养本文所述和/本领域已知的宿主细胞。

本发明提供了至少一种编码抗体的核酸，包含在严谨条件下与编码抗体的核酸杂交的核酸，或与编码抗体的核酸具有至少95％同一性的核酸。本发明进一步提供了由该核酸编码的分离的抗体。本发明进一步提供了包含该核酸的抗体载体，其中载体任选进一步包含至少一个选自以下的启动子：晚期或早期SV40启动子、CMV启动子、HSVtk启动子、pgk启动子、人免疫球蛋白启动子和EF-1α启动子。这样的载体可以任选进一步包含至少一个选自以下的选择基因或其部分：氨甲蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、绿色荧光蛋白(GFP)、新霉素(G418)或谷氨酰胺合成酶(GS)中的至少一种。本发明进一步包括含有该分离的核酸的哺乳动物宿主细胞，任选地，其中所述宿主是选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、HwpG2、PerCP、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤或淋巴瘤细胞，或其任何衍生物、永生化细胞或转化细胞中的至少一种。

本发明还提供了至少一种用于生产至少一种抗体组合物的方法，该组合物包含至少一种抗体和载体或稀释剂，任选地，另外其中所述载体或稀释剂是药学上可接受的，和/或进一步包含至少一种选自TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、IL-23剂、IL-12剂、矿物质、营养物、甲状腺剂、维生素、钙相关的激素、抗腹泻剂、止咳药、止吐药、抗溃疡药、轻泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素、非格司亭、沙格司亭、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药、雌激素受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹药、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β-激动剂、吸入的类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸钠、肾上腺素或类似物、链道酶α、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的化合物或蛋白质。

本发明还提供了至少一种用于治疗细胞、组织、器官或动物中的IL-12/23病症的方法，包括将免疫相关-或感染相关-病症调节有效量的至少一种抗体接触或给药于所述细胞、组织、器官或动物，任选地，其中所述动物是灵长类，任选猴子或人。该方法可以进一步任选地包括其中所述有效量为约0.001-100mg/kg所述细胞、组织、器官或动物。该方法可以进一步包括其中所述接触或所述给药是通过至少一种选自以下的方式进行：静脉内、肌内、推注(bolus)、腹膜内、皮下、呼吸、吸入、局部、鼻、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、真皮下和经皮。该方法可以进一步包括在所述接触或给药之前、同时或之后给予至少一种组合物，该组合物包含治疗有效量的至少一种选自以下的化合物或蛋白质：TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、IL-23剂、IL-12剂、矿物质、营养物、甲状腺剂、维生素、钙相关的激素、抗腹泻剂、止咳药、止吐药、抗溃疡药、轻泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素、非格司亭、沙格司亭、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药、雌激素受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹药、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β-激动剂、吸入的类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸纳、肾上腺素或类似物、链道酶α、细胞因子或细胞因子拮抗剂中的至少一种。

本发明还包括至少一种制剂，该制剂包含至少一种抗体和至少一种配制剂，所述配制剂选自无菌水、无菌缓冲水或至少一种在含水稀释剂中的防腐剂，所述防腐剂选自苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯化甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸烷基酯(alkylparaben)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠和硫柳汞，或其混合物，任选，其中蛋白质的浓度为约0.1mg/ml至约100mg/ml，进一步包含至少一种等渗剂或至少一种生理上可接受的缓冲剂。

本发明还提供了至少一种为人药物用途而制造的商品，包括包装材料和包含溶液或冻干形式的至少一种本发明抗体的容器，任选，进一步其中所述容器是具有用于多次使用给药的塞子的玻璃或塑料容器，任选，进一步其中所述容器是透明塑料包装，能够被刺穿和用于静脉内、肌内、推注、腹膜内、皮下、局部、呼吸、吸入、鼻、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、真皮下或经皮给药；所述容器是静脉内、肌内、推注、腹膜内、皮下、呼吸、吸入、鼻、阴道、局部、直肠、口腔、舌下、鼻内、真皮下或经皮递送装置或系统的一个组成部分；所述容器是用于静脉内、肌内、推注、腹膜内、皮下、呼吸、吸入、局部、鼻、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、真皮下或经皮递送的注射器或笔式注射器装置或系统的一个组成部分。

本发明还提供了至少一种用于生产至少一种本发明抗体的方法，包括提供能够以可回收量表达所述人抗体的宿主细胞、转基因动物、转基因植物或植物细胞，任选，进一步其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、植物细胞或酵母细胞；所述转基因动物是哺乳动物；所述转基因哺乳动物选自山羊、牛、绵羊、马或非人灵长类。

本发明进一步提供了至少一种用于治疗至少一种IL-12/23介导的失调的方法，包括以下的至少一个步骤：(a)将有效量的包含至少一种结合蛋白的组合物或药物组合物给药于需要这样的调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者；和(b)进一步在以上所述(a)给药之前、同时和/或之后给予选自以下的至少一种：免疫相关的治疗剂、TNF拮抗剂、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、神经剂、矿物质、营养物、甲状腺剂、维生素、钙相关的激素、抗腹泻剂、止咳药、止吐药、抗溃疡药、轻泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素、非格司亭、沙格司亭、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂、生长激素、激素替代药、雌激素受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹药、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β-激动剂、吸入的类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸纳、肾上腺素或类似物、链道酶α、细胞因子或细胞因子拮抗剂。

IL-12p40存在于蛋白质IL-12和IL-23中，并且作为IL-12p40单体和IL-12p80同二聚体存在。本发明描述了结合IL-12、IL-23、IL-12p40、IL-12p80并将可能结合新发现的含有IL-12p40亚基的蛋白质的抗体。该抗体特异性地结合IL-12p40，但不结合IL-12p35或IL-23p19。本发明进一步提供了这些抗体的组合物、制剂、方法、装置和用途，包括治疗用途。

在一个具体实施方案中，抗体能够中和IL-12与IL-12Rβ2的结合，认为这是在p40/p35界面处结合IL-12。在另一个具体实施方案中，抗体能够抑制IL-23与IL-23R的结合，认为这可能是通过p19/p40界面处的相互作用介导的。在进一步的具体实施方案中，抗体能够抑制IL-12与IL-12Rβ2的结合和IL-23与IL-23R的结合。通过在接近于与p35或p19的界面处的位置结合IL-12p40，抗体抑制了相关受体与IL-12和/或IL-23的结合。

本发明描述了结合IL-12p40/80但不中和IL-12p40或IL-12p80与IL-12Rβ1的结合的抗体。在该抗体的存在下，通过IL-12p40/80亚基，仍然可以完成IL-12或IL-23系统的调节，因为这些蛋白质仍能自由结合IL-12Rβ1。以下作用方法的优点在于其使得IL-12和IL-23系统(IL-12p40/p80)的天然调节剂继续与也作为IL-12和IL-23拮抗剂的抗体竞争。因此，通过这种作用方法建立了双重拮抗剂系统，引起抗体用作治疗剂时功效更大。在使用不抑制IL-12p40/80生物功能的抗体中还有潜在的安全性特征的提高。除了用作拮抗剂和调节IL-12/IL-23途径，最近已经表明了IL-12p40/80具有不同的作用。抗体没有阻止IL-12p40/80作为巨噬细胞的化学引诱剂和作为应答病原体挑战的DC迁移的诱导剂。这将引起抗体作为治疗剂给药时安全性特征的提高。

下文中涉及的所有科学引证、专利和专利申请和制造商的技术说明书以其整体通过参考并入本文。

在整个说明书中，除非文中需要另外指出，否则单词“comprise”或其变形，如“comprises”或“comprising”，将理解为表示包括所述要素或整体或要素或整体的组，但不排除任何其他要素或整体或要素或整体的组。

应该理解的是除非另外指出，否则本发明不限于特定的制剂成分、制造方法、剂量方案等，因为这些可以改变。

必须注意，如本说明书中所用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物，除非文中另外明确指出。因此，例如，提及“a”包括单个以及两个或更多；提及“an”包括单个以及两个或更多；提及“the”包括单个以及两个或更多，等等。

本文所用的术语“多肽”指的是氨基酸的任何聚合链。术语“肽”和“蛋白质”可以与术语多肽互换使用，并且也指的是氨基酸的聚合链。术语“多肽”包括天然的或人造的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。

术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是由于其起源或衍生的来源不与在其天然状态中伴随其的天然结合成分结合的蛋白质或多肽；其基本上没有来自相同物种的其他蛋白质；通过来自不同物种的细胞表达；或不在自然界中出现。因此，化学上合成的或在不同于其天然来源的细胞的细胞系统中合成的多肽将是从其天然结合成分中“分离的”。还可以通过分离，使用本领域熟知的蛋白质纯化技术，使蛋白质基本上无天然结合成分。本文所用的术语“回收”，指的是通过分离(例如，使用本领域熟知的蛋白质纯化技术)使化学物质(如，多肽)基本上无天然结合成分的过程。

本文所用的术语“人IL-12”(在本文缩写为hIL-12或IL-12)包括主要由抗原递呈细胞(如，单核细胞、巨噬细胞和树突细胞)分泌的人细胞因子。术语包括包含35kD亚基(p35)和40kD亚基(p40)的异二聚体蛋白，这两个亚基都是由二硫桥连接在一起。异二聚体蛋白称为“p70蛋白”。术语人IL-12旨在包括重组人IL-12(rhIL-12)，其可以通过标准重组表达方法来制备。IL-12属于最新成员为IL-35的白细胞介素家族，其共享IL-12p35亚基(Niedbala等人，2007 Eur J Immunol 373021-9)。IL-35的最近发现表明很可能存在尚未发现的更多形式的IL-12p40和IL-12p35。可以逻辑地假定本发明所述的抗体将结合所有新发现的含有IL-12p40形式的蛋白质。

本文所用的术语“人IL-23”(在此缩写为hIL-23或IL-23)包括属于五种这样的异二聚体细胞因子家族的异二聚体人细胞因子，该家族包括IL-12和IL-27(Trichieri等人，2003 Immunity 19 641-4)。术语包括由亚基p19和p40组成的异二聚体蛋白，这两个亚基都由二硫桥接连接在一起。术语人IL-23旨在包括重组人IL-23(rh IL-23)，其可以通过标准重组表达方法来制备。

本文所用的术语“IL-12/23”总地表示人IL-12和IL-23。

本文所用的术语“IL-12p40”与“IL-23p40”相同，也简单地称为“p40”和“p40亚基”，包括人细胞因子IL-12的40kD亚基(p40)和人细胞因子IL-23的40kD亚基。

本文所用的术语“IL-12p80”，也简单地称为“p80”，包括通过二硫键连接在一起形成二聚体蛋白质的人细胞因子IL-12的2个单体40kD亚基(p40)。

本文所用的术语“IL-12p35”，也简单地称为“p35”，包括人细胞因子IL-12(p70)和IL-35的35kD亚基。

本文所用的术语“IL-23p19”，也简单地称为“p19”，包括人细胞因子IL-23的19kD亚基。

IL-12R复合物由两个亚基组成，这两个亚基称为IL-12受体β1，在此用作IL-12Rβ1，和IL-12受体β2，在此用作IL-12Rβ2，两者都是IL-12的高亲和力结合和信号传导需要的。这种IL-12R最初在PHA激活的淋巴母细胞和IL-2激活的NK细胞上得到鉴定(Chizzonite等人，1992，J Immunol 148 3117-24；Chua等人，1994，J Immunol 153 128-36)。显示出IL-12Rβ2负责通过引导细胞下降到T_H-1途径(IFN-γ分泌)的Tyk2/JAK2和STAT4途径的信号传导(Presky等人，1996 ProcNatl Acad Sci U S A 93 14002-7；Watford等人，2004 Immunol Rev 202 139-56)。已经表明IL-12Rβ1参与通过磷酸化Tyk2和STAT3的信号传导(Zou等人，1997 J Biol Chem 272 6073-7)。

IL-23R复合物由两个亚基组成，IL-12Rβ1，其存在于IL-12R复合物中，和IL-23受体，在此用作IL-23R。通过IL-23的IL-23R衔接引起JAK2自体磷酸化和IL-23R的磷酸化。这引起STAT3以及STAT1、STAT4和STAT5的定位和磷酸化(Parham等人，2002 J Immunol 168 5699-708)。

本文所用的“生物活性”指的是细胞因子的所有固有的生物特性。IL-12的生物特性包括但不限于结合IL-12Rβ1和/或IL-12Rβ2；IFN-γ分泌的诱导和抗原特异性1型T辅助(T_H1)淋巴细胞和2型T辅助(T_H2)淋巴细胞之间的平衡的调节。IL-23的生物特性包括但不限于结合IL-12Rβ1和/或IL-23R，诱导IFN-γ产生，诱导IL-17产生，诱导IL-21产生，诱导IL-22产生，T_H17细胞分化和激活树突细胞的抗原递呈功能，以及选择性地诱导记忆T细胞的增殖。

提及抗体、蛋白质或肽与第二种化学物质的相互作用时，本文所用的术语“特异性的结合”或“特异性地结合”，意思是相互作用取决于化学物质上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构，而通常并不是蛋白质。如果抗体对于表位“A”是特异性的，在含有标记的“A”和抗体的反应中，含有表位A(或游离的未标记的A)的分子的存在将降低结合抗体的标记的A的含量。

本文所用的术语“抗体”宽泛地指由四个多肽链(两个重(H)链和两个轻(L)链)，或其任何保留了Ig分子的必需表位结合特征的功能性片段、突变体、变体或衍生物组成的任何免疫球蛋白(Ig)分子。这样的突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。以下讨论了其非限制性具体实施方案。

在全长的抗体中，每个重链由重链可变区(在此缩写为HCVR或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变区，称为互补决定区(CDR)，散布于更保守的区域中，这些更保守的区域称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以下列顺序从氨基端至羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型的(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别的(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的。

本文所用的术语“抗原结合结构域”或“抗原结合部分”指的是抗体或蛋白质的保留了特异性结合抗原(例如，IL-12)能力的一个或多个片段。已经表明抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来进行。这样的抗体具体实施方案还可以是双特异性的、双重特异性的或多特异性的形式；特异性地结合两个或更多不同的抗原。包括在术语抗体的“抗原-结合部分”内的结合片段的实例包括(i)Fab片段，其是由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward等人，1989 Nature 341 544-6，Winter等人，PCT公开WO 90/05144A1，通过参考并入本文)，其包含单个可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但可以使用重组方法，通过能够使其制成单个蛋白质链的合成连接子，将它们连接，其中VL和VH区对形成单价分子(称为单链Fv(scFv))；(参见，例如，Bird等人，1988 Science242 423-6；Huston等人，1988 Proc Natl Acad Sci U S A 85 5879-83)。这样的单链抗体也旨在包括在术语抗体的“抗原-结合部分”内。还包括其他形式的单链抗体，如双功能抗体。双功能抗体是二价的双特异性抗体，其中在单个多肽链上表达VH和VL结构域，但使用太短的连接子以致相同链上的两个结构域之间不能配对，由此迫使结构域与另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger，P.等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，1994，Structure 2：1121-1123)。这样的抗体结合部分是本领域已知的(Kontermann和Dubel编辑，Antibody Engineering 2001 Springer-Verlag.New York.790 pp.，ISBN 3-540-41354-5)。

本文所用的术语“抗体构建体”指的是包含本发明的一个或多个抗原结合部分的多肽，该抗原结合部分连接连接子多肽或免疫球蛋白恒定区结构域。连接子多肽包含两个或更多通过肽键连接的氨基酸残基并用于连接一个或更多抗原结合部分。这样的连接子多肽是本领域中熟知的(参见，例如，Holliger等人，1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 6444-8)。

免疫球蛋白恒定结构域指的是重链或轻链恒定结构域。人IgG重链和轻链恒定结构域氨基酸序列是本领域已知的，以下显示了实例。

人重链IgG1恒定结构域(或其衍生物，如NCBI登录号P01857)

ASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人轻链κ恒定结构域(如NCBI登录号P01834)

TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

人轻链λ恒定结构域(如NCBI登录号P01842)

QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

再进一步，抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一个或多个其他蛋白质或肽的共价或非共价连接形成的较大的免疫粘附分子的一部分。这样的免疫粘附分子的实例包括使用抗生蛋白链菌素核心区来制备四聚体的scFv分子(Kipriyanov等人，1995 Hum Antibodies Hybridomas 6 93-101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C-端多组氨酸标签来制备二价和生物素化的scFv(Kipriyanov等人，1994 Mol Immunol 31 1047-58)。可以使用常规的技术，如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体，从完整的抗体制备抗体部分，如Fab和F(ab’)2片段。此外，可以使用本文所述的标准重组DNA技术来获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。

本文所用的“分离的抗体”旨在表示基本上无其他具有不同抗原特异性的抗体的抗体(例如，分离的特异性结合hIL-2的抗体基本上无特异性结合hIL-2以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合hIL-2的分离抗体可以具有与其他抗原(如来自其他物种的IL-12分子)的交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上无其他细胞材料和/或化学物质。

本文所用的术语“人抗体”，旨在包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸氨基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如，在CDR中，特别是在CDR3中。然而，本文所用术语“人抗体”不旨在包括其中源自另一种哺乳动物物种(如，小鼠)的种系的CDR序列已经移植在人框架序列上的抗体。

本文所用的术语“重组人抗体”，旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如使用转染至宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体(Hoogenboom 1997 Trends Biotechnol 15 62-70；Azzazy等人，2002 Clin Biochem 35 425-45；Gavilondo等人，2000 Biotechniques 29 128-32，134-6，138 passim Hoogenboom等人，2000 Immunol Today 21 371-8)，从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见，例如，Taylor等人，1992 Nucleic Acids Res 20 6287-95，Little等人2000 Immunol Today 21364-70)，或通过涉及人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些具体实施方案中，这样的重组人抗体受到体外诱变(或，使用对于人Ig序列为转基因的动物时，是体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是虽然源自人种系VH和VL序列并与人种系VH和VL序列相关，可以不天然存在于体内人抗体种系库内的序列。

术语“嵌合抗体”指的是包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列和来自另一个物种的恒定区序列的抗体，如具有连接人恒定区的鼠重链和轻链可变区的抗体。

术语“CDR移植的抗体”指的是包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但其中VH和/或VL的一个或多个CDR区的序列被另一个物种的CDR序列替代的抗体，如具有鼠重链和轻链可变区的抗体，其中一个或多个鼠CDR(例如，CDR3)被人CDR序列替代。

术语“人源化抗体”指的是包含来自非人物种(例如，小鼠)的重链和轻链可变区序列但其中VH和/或VL序列的至少一部分已经变得更“象人”的抗体，即，与人种系可变序列更相似。一种类型的人源化抗体是CDR移植的抗体，其中将人CDR序列引入非人VH和VL序列中来替代相应的非人CDR序列。

术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文可以互换使用。这些术语是本领域公认的，指的是将相对于抗体的重链和轻链可变区或其抗原结合部分中的其他氨基酸残基更可变(即超可变)的氨基酸残基编号的系统(Kabat等人，1971 Ann N Y Acad Sci 190 382-93和Kabat，E.A.等人，(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，美国卫生与人类服务部，NIH出版号91-3242)。对于重链可变区，对于CDR1，超变区从氨基酸位置31至35，对于CDR2，从氨基酸位置50至65，对于CDR3，从氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，对于CDR1，超变区从氨基酸位置24至34，对于CDR2，从氨基酸位置50至56，对于CDR3，从氨基酸位置89至97。

本文所用的术语“受体”和“受体抗体”指的是提供或编码一个或多个框架区的至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或100％的氨基酸序列的抗体或核酸序列。在一些具体实施方案中，术语“受体”指的是提供或编码恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在另一个具体实施方案中，术语“受体”指的是提供或编码一个或多个框架区和恒定区的抗体氨基酸或核酸序列。在特定的具体实施方案中，术语“受体”指的是提供或编码一个或多个框架区的至少80％，优选至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或100％的氨基酸序列的人抗体氨基酸或核酸序列。根据这个具体实施方案，受体可以含有至少1个，至少2个，至少3个，至少4个，至少5个或至少10个不在人抗体的一个或多个特定位置出现的氨基酸残基。受体框架区和/或受体恒定区可以，例如，源自或获自种系抗体基因、成熟抗体基因、功能性抗体(例如，本领域熟知的抗体，研发中的抗体或可商业获得的抗体)。本文所用的术语“CDR”指的是抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链各自的可变区中存在三个CDR，对于每个可变区，将其指定为CDR1、CDR2和CDR3。本文所用的术语“CDR组”指的是在能够结合抗原的单个可变区中出现的一组三个CDR。根据不同的系统，对这些CDR的精确边界进行了不同的限定。由Kabat描述的系统(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991))不仅提供了适用于任何抗体可变区的明确残基编号系统，而且还提供了限定三个CDR的精确残基边界。三个CDR可以称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia等人，1987 J Mol Biol 196901-17和Chothia等人，1989 Nature 342 877-83)发现Kabat CDR内的某些亚部分采用了近乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的差异。这些亚部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”各自表示轻链和重链区。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。还有其他的CDR边界限定可以不严格按照以上系统之一，但无论如何与Kabat CDR重叠，尽管根据特定的残基或残基组或甚至整个CDR不明显影响抗原结合的预测或实验发现，它们可能缩短或延长。本文所用的方法可以利用根据这些系统中的任一种定义的CDR，尽管优选的具体实施方案使用了Kabat或Chothia定义的CDR。

本文所用的术语“规范的”残基指的是CDR或框架中限定特定的规范CDR结构的残基，所述结构为Chothia等人定义的结构(Chothia和Lesk 1987 J Mol Biol 196901-17；Chothia等人，1992 J Mol Biol 227 799-817)，并且通过参考并入本文。根据Chothia等人，许多抗体的CDR的关键部分具有近乎相同的肽骨架构象，尽管在氨基酸序列水平上存在很大差异。每个规范的结构主要明确规定了用于形成环的氨基酸残基连续片段的一组肽骨架扭转角。

本文所用的术语“供体”和“供体抗体”指的是提供一个或多个CDR的抗体。在优选的具体实施方案中，供体抗体是来自不同于获得或衍生框架区的抗体的物种的抗体。在人源化抗体的范围中，术语“供体抗体”指的是提供一个或多个CDR的非人抗体。本文所用的术语“框架”或“框架序列”指的是可变区减去CDR剩余的序列。因为可以通过不同的系统来确定CDR序列的精确限定，框架区序列的意思得到相应的不同解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3以及重链的CDR-H1、-H2和-H3)还将轻链和重链上的框架区在每个链上分成四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，CDR3位于FR3和FR4之间。没有将特定亚区明确规定为FR1、FR2、FR3或FR4，通过其他指出的框架区，代表单个天然产生的免疫球蛋白链可变区内的合并FR。如本文所用的，FR代表四个亚区之一，而FRs代表组成框架区的四个亚区中的两个或多个。

本文所用的术语“种系抗体基因”或“基因片段”指的是由尚未经过成熟过程的非淋巴细胞编码的免疫球蛋白序列，所述成熟过程引起用于特定免疫球蛋白表达的遗传重排和突变(参见，例如，Shapiro等人，2002 Crit Rev Immunol 22 183-200；Marchalonis等人，2001 Adv Exp Med Biol 484 13-30)。由本发明的各种具体实施方案提供的优点之一源于以下的认识：种系抗体基因比成熟抗体基因更可能保存物种个体特征性的必需氨基酸序列结构，因此在该物种中用于治疗时，不太可能被识别为来自外来来源。

如本文所用的，术语“关键”残基指的是对抗体(特别是人源化抗体)的结合特异性和/或亲和力具有更多影响的可变区内的某些残基。关键残基包括，但不限于，以下的一个或多个：邻接CDR的残基、可能的糖基化位点(可以是N-或O-糖基化位点)、罕见残基、能够与抗原相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范的残基、重链可变区和轻链可变区之间的接触残基、Vernier区内的残基以及Chothia定义的VH结构域CDR1与Kabat定义的第一个重链框架之间重叠的区域中的残基。

如本文所用的，术语“人源化抗体”是免疫特异性结合目标抗原的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段，并且其包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)。如本文所用的，CDR范围中的术语“基本上”指的是具有与非人抗体CDR的氨基酸序列至少80％，优选至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的CDR。人源化抗体包括基本上全部的至少一个，通常两个可变结构域(Fab，Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白(即，供体抗体)的那些，并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。优选，人源化抗体还包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分。在一些具体实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链的可变结构域。抗体还可以包括重链的C_H1铰链、C_H2、C_H3和C_H4区。在一些具体实施方案中，人源化抗体仅含有人源化轻链。在一些具体实施方案中，人源化抗体仅含有人源化重链。在特定的具体实施方案中，人源化抗体仅含有轻链的人源化可变区和/或人源化重链。

人源化抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任何同种型，包括但不限于，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自一个以上类别或同种型的序列，并且可以使用本领域熟知的技术选择特定的恒定结构域来优化所需的效应物功能。

人源化抗体的框架和CDR区不需要精确地对应于亲本序列，例如，可以通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或删除来使供体抗体CDR或共有框架突变，使得在该位点的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在优选的具体实施方案中，这样的突变将不是大范围的。通常，至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些。如本文所用的，术语“共有框架”指的是共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用的，术语“共有免疫球蛋白序列”指的是从相关免疫球蛋白序列家族中最高频率出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见，例如，Winnaker，From Genes to Clones，Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国，1987)。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置被家族中在该位置最高频率出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸以相等频率出现，在共有序列中可以包括任一个。如本文所用的，“Vernier”区指的是可以调节CDR结构和微调与抗原的适合度的框架残基的子集，如Foote等人在1992 J Mol Biol 224 487-99中所述的。Vernier区残基形成CDR下面的层，并可以影响CDR的结构和抗体的亲和力。

如本文所用的，术语“中和”指的是抗体特异性结合细胞因子时，细胞因子的生物活性的中和。优选，中和抗体是其与IL-12和/或IL-23的结合引起IL-12和/或IL-23的生物活性抑制的中和抗体。优选，中和抗体结合IL-12和/或IL-23并将IL-12和/或IL-23的生物活性降低至少约50％，60％，80％，85％或更多。如本文所用的，术语“抑制”指的是抗体特异性结合细胞因子时，细胞因子的生物活性的降低。可以通过测量本领域熟知的IL-12和/或IL-23生物活性的一个或多个指示物来评估中和抗体对IL-12和/或IL-23的生物活性的抑制。例如，体外IL-12 PHA分析中人植物血凝素blast增殖的抑制或人IL-12受体结合分析中受体结合的抑制(参见实施例)。

术语“活性”包括如抗体对抗原的结合特异性/亲和力的活性，例如，结合IL-12抗原的抗-IL-12抗体和/或抗体的中和潜能，例如，其与IL-12的结合抑制了hIL-12的生物活性的抗-IL-12抗体，例如，人IL-12受体结合分析或体外IL-12 PHA分析中PHA blast增殖的抑制或受体结合的抑制。

术语“表位”包括能够特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何多肽决定簇。在某些具体实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些具体实施方案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。表位是由抗体结合的抗原区域。在某些具体实施方案中，抗体优选识别蛋白质和/或大分子复杂混合物中其目标抗原时，据说抗体特异性结合抗原。

本发明还提供了抑制抗原递呈细胞(APC)中的IL-12/23活性的抗体，所述抗原递呈细胞如但不限于，巨噬细胞、小神经胶质细胞、系膜吞噬细胞、滑液A细胞、干细胞前体、朗格汉斯细胞、枯否氏细胞(Kupffer cells)、树突细胞、B细胞等。这样的APC可以存在于不同的组织中，例如但不限于，皮肤、表皮、肝脏、脾脏、脑、脊髓、胸腺、骨髓、关节滑液、肾脏、血液等。还可以将这些APC限于血脑屏障之外或之内。

本发明提供了分离的、重组和/或合成的抗体，其特定的部分或变体，以及包含编码至少一种抗体的至少一种多核苷酸的组合物和编码核酸分子。本发明的这些抗体、其特定的部分或变体包含特定的全长抗体序列、其结构域、片段和特定的变体，以及制备和使用所述核酸和抗体、其特定的部分或变体的方法，包括治疗组合物、方法和设备。

可以用于本发明的抗体任选通过它们在延长的时间段内治疗患者的能力(症状有良好至极好的缓解以及低毒性)来鉴定。低致免疫性和/或高亲和力，以及其他合适的特性，有助于所获得的治疗结果。本文将“低致免疫性”定义为在约75％以下或优选地约50％以下的治疗患者中产生显著HAHA、HACA或HAMA应答，和/或在治疗的患者中产生低滴度(使用双重抗原酶免疫分析测量，为约300以下，优选地约100以下；Elliott等人，1994 Lancet 344 1125-7)。

本发明的分离的核酸可以用于至少一种抗体、其片段或特定的变体的生产，其可以用于细胞、组织、器官或动物中(包括哺乳动物和人)，来调节、治疗、缓解、帮助防止至少一种IL-12和/或IL-23病症的发作，或减轻至少一种IL-12和/或IL-23病症的症状。

这样的方法可以包括将有效量的包含至少一种抗体或特定的部分或变体的组合物或药物组合物给予需要这些症状、作用或机制的调节、治疗、缓解、防止或减轻的细胞、组织、器官、动物或患者。有效量可以包括每单次或多次给药约0.001至500mg/kg的含量，或每单次或多次给药获得0.01-5000μg/ml血清浓度的血清浓度的含量，或其中的任何有效范围或数值，使用已知的方法来进行和测定，如本文所述的或相关领域已知的。

IL-12p40亚基特异性的抗体可以针对合适的致免疫抗原来产生，如分离的IL-12p40、IL-12或IL-23蛋白或其部分(包括合成的分子，如合成的肽)。可以使用任何合适的技术来进行致免疫抗原的制备和单克隆抗体的生产。各种方法已经得到了描述(参见，例如，Kohler等人，1975 Nature 256 495-7和Kohler等人，1976Eur J Immunol 6 511-9；Galfre等人，1977 Nature 266 550-2；Koprowski等人，美国专利号4,172,124；Harlow，E.和D.Lane，1988，Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols In Molecular Biology，第2卷(例如，增补27，Summer′94)，Ausubel，F.M.等人编辑，John Wiley&Sons：New York，N.Y.，第11章，(1991-2003))，通过参考将每一篇完全并入本文。通常，通过将合适的永生化细胞系(例如，骨髓瘤细胞系，如但不限于，Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、＞243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2 SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH 3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A等，或杂骨髓瘤，其融合产物，或源自其的任何细胞或融合细胞，或任何其他本领域已知的合适细胞系，参见，例如，www.atcc.org、www.lifetech.com等，通过参考将每一个全部并入本文)与抗体产生细胞(如，但不限于，分离的或克隆的脾细胞，或表达重链或轻链恒定、可变、框架或CDR序列的任何其他细胞，所述序列作为内源性或异源性核酸，作为重组或内源性的病毒、细菌、藻类、原核生物、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼、哺乳动物、啮齿动物、马、羊、山羊、绵羊、灵长类、真核生物、基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单链、双链或三链、杂交的核酸等，或其任意组合)融合来产生杂交瘤。参见，例如，Ausubel(上文)和Colligan，Immunology(上文)第2章，通过参考将每一篇全部并入本文。

抗体产生细胞可以获自已经用目标抗原免疫的人或其他合适动物的外周血，或优选，脾或淋巴结。任何其他合适的宿主细胞也可以用于表达编码本发明的抗体、其特定的片段或变体的异源或内源核酸。使用选择性培养条件或其他合适的已知方法可以分离融合细胞(杂交瘤)或重组细胞，并通过有限稀释或细胞分选或其他已知方法来克隆。可以通过合适的分析(例如ELISA)来选择产生具有所需特异性抗体的细胞。

可以使用产生或分离所需特异性抗体的其他合适方法，包括但不限于，从肽或蛋白质文库(例如，但不限于，噬菌体、核糖体、寡核苷酸、RNA、cDNA等，展示文库；例如，获自Cambridge Antibody Technologies，Cambridgeshire，UK；MorphoSys，Martinsreid/Planegg，DE；Biovation，Aberdeen，Scotland，UK；Biolnvent，Lund，Sweden；Dyax Corp.，Enzon，Affymax/Biosite；Xoma，Berkeley，Calif.；Ixsys。参见，例如，EP 368,684，PCT/GB91/01134；PCT/GB92/01755；PCT/GB92/002240；PCT/GB92/00883；PCT/GB93/00605；美国系列号08/350260(1994年5月12日)；PCT/GB94/01422；PCT/GB94/02662；PCT/GB97/01835(CAT/MRC)；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；PCT/US594/1234；WO92/18619；WO96/07754(Scripps)；WO96/13583，WO97/08320(MorphoSys)；WO95/16027(BioInvent)；WO88/06630；WO90/3809(Dyax)；美国专利号4,704,692(Enzon)；PCT/US91/02989(Affymax)；WO89/06283；EP 371 998；EP 550 400(Xoma)；EP 229 046；PCT/US91/07149(Ixsys)，或随机产生的肽或蛋白质，美国专利号5,723,323，5,763,192，5,814,476，5,817,483，5,824,514，5,976,862，WO86/05803，EP 590 689(Ixsys，现在为Applied Molecular Evolution(AME)，通过参考每一个全部并入本文))选择重组抗体的方法，或依赖于能够产生人抗体库的转基因动物(例如，SCID小鼠，Nguyen等人，1997 Microbiol Immunol 41 901-7；Sandhu等人，1996 Crit Rev Biotechnol 16 95-118，通过参考以及相关专利和申请将每一篇全部并入本文)的免疫的方法，如本领域已知的和/或本文所述的。这样的技术，包括，但不限于，核糖体展示(Hanes等人，1997 Proc Natl Acad Sci U S A 944937-42；Hanes等人，1998 Proc Natl Acad Sci U S A 95 14130-5)；单细胞抗体产生技术(例如，选择的淋巴细胞抗体方法(“SLAM”)，美国专利号5,627,052，Wen等人，1987 Eur J Immunol 17 887-92；Babcook等人，1996 Proc Natl Acad Sci U S A93 7843-8)；凝胶微滴和流式细胞术(Powell等人，1990 Biotechnology(N Y)8333-7)；一细胞系统，Cambridge，Mass.；(Gray等人，1995 J Immunol Methods 182155-63；Kenney等人，1995 Biotechnology(N Y)13 787-90)；B-细胞选择(Steenbakkers等人，1994 Mol Biol Rep 19 125-34；Jonak等人，Progress Biotech，第5卷，In Vitro Immunization in Hybridoma Technology，Borrebaeck编辑，Elsevier Science Publishers B.V.，Amsterdam，Netherlands(1988))，通过参考将其每一篇全部并入本文)。

对于抗体在人的体内使用，优选可以使用嵌合、人源化或人的抗体。嵌合抗体是其中抗体的不同部分源自不同动物物种的分子，如具有源自鼠单克隆抗体的可变区和人免疫球蛋白恒定区的抗体。生产嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison(1985)；Oi(1986)；Gillies(1989)；美国专利号5,807,715；4,816,567和4,816,397。

包括在本发明范围内，并且在本发明方法的实践中有用的是去免疫(de-immunized)的抗体，其具有使用例如专利公开号EP0983303A1，WO2000/34317和WO98/52976中所述的方法产生的序列变化。

包括在本发明范围中的另一种方法是“镶饰法(veneering)”，以便使鼠或其他非人单克隆抗体固有的致免疫应答和过敏应答最小化，并由此提高所给予抗体的功效和安全性。术语“镶饰的抗体”指的是例如来自鼠重链或轻链可变区的框架区残基由人框架区残基的选择性替代，以提供包含抗原结合位点的异种分子，其保留了基本上全部的天然框架区折叠结构。镶饰技术是基于抗原结合位点的配体-结合特征主要由抗原-结合表面内重链和轻链CDR组的结构和相对排列来决定的理解(Davies(1990))。因此，只在其中小心地维持了CDR结构、其彼此间的相互作用及其与V区结构域的剩余部分的相互作用的人源化抗体中保存了抗原-结合特异性。通过使用镶饰技术，免疫系统容易遇到的外部(例如，溶剂易接近的)框架区残基被人残基选择性地替代，以提供包含弱致免疫的或基本上无致免疫的镶饰表面的杂交分子。

本发明的范围还延伸至人源化抗-IL-12/IL-23抗体。“人源化”是含有源自非人免疫球蛋白序列的最小序列的抗-IL-12/IL-23抗体的预期形式。对于大部分，人源化抗体是其中来自受体的超变区(也称为互补决定区或CDR)的残基被来自具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类)的超变区的残基(供体抗体)替代的人免疫球蛋白(受体抗体)。

本发明范围内并且适用于本发明方法中的人源化抗体，例如，可以具有与非人源化抗体(如，例如，本文所述的PMA204单克隆抗体)呈现的那些相似的结合特征。

可以基本上按照Winter和同事的方法(Jones(1986)；Riechmann(1988)；Verhoeyen(1988))，通过将啮齿动物或突变啮齿动物CDR或CDR序列替换为相应的人抗体序列，来进行人源化。还可以参见美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。

可以使用本领域已知的各种技术来将抗体人源化，包括例如CDR移植(EP239400；PCT公开WO91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101和5,585,089)，镶饰或重修表面(EP 592106；EP 519596；Padlan(1991)；Studnicka(1994)；Roguska(1994)和链改组(chain shuffling)(美国专利号5,565,332))。

在一些情况中，人免疫球蛋白的一个或多个可变区的框架区内的残基被相应的非人残基替代(参见，例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；美国专利号5,693,761；5,693,762和6,180,370，还可以参见，例如，Riechmann(1988))。

“超人源化”是其中将给予抗原特异性的CDR(“供体”)移植至已知待表达的人种系框架序列(“受体”)的人源化方法，人CDR在结构上与“供体”CDR相同或相似(Tan 2002，还可以参见国际公开号WO 2004/006955)。通过使用由人基因组V基因序列编码的框架，而不是可以包括体细胞突变的序列，该方法对于降低致免疫性具有提高的潜能。通过强调供体和受体CDR之间的结构同源性，该方法对于亲和力保持也具有提高的潜能。

此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或在供体抗体中未发现的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体性能(例如，以获得所需的亲和力)。通常，人源化抗体将包括基本上全部的至少一个，通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部的超变区对应于非人免疫球蛋白的那些超变区，以及全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白序列的那些框架区。

人源化抗体还任选包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。对于更多的详细内容，参见Jones(1986)；Riechmann(1988)和Presta(1992)。因此，这样的“人源化”抗体可以包括其中大幅小于完整的人可变结构域已经被相应的来自非人物种的序列置换的抗体。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能一些框架残基被来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基置换的人抗体。参见，例如，美国专利号5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。还可以参见美国专利号6,180,370和国际公开号WO 2001/27160，其中公开了对预定抗原具有提高的亲和力的人源化抗体和用于生产该人源化抗体的技术。

可以通过本领域已知的各种方法来制得人抗体，这些方法包括以上所述使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。还可以参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和PCT公开WO 98/46645，WO 98/50433，WO 98/24893，WO 98/16654，WO 96/34096，WO 96/33735和WO 91/10741。

可以使用称为“指导选择”的技术来产生识别所选表位的完全人抗体。在该方法中，所选的非人单克隆抗体，例如，小鼠抗体，用于指导识别相同表位的完全人抗体的选择(Jespers(1988))。

还可以使用转基因动物来产生人抗体，该转基因动物不能够表达功能性内源免疫球蛋白，但可以表达人免疫球蛋白基因。例如，可以随机地或通过同源重组将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除了人重链和轻链基因以外，可以将人可变区、恒定区和多样区引入小鼠胚胎干细胞中。

对于生产人抗体的这种技术的概述，参见Lonberg和Huszer(1995)。对于生产人抗体和人单克隆抗体的这种技术以及生产这些抗体的规程的详细讨论，参见，例如，PCT公开WO 98/24893；WO 92/01047；WO 96/34096；WO 96/33735；欧洲专利号0598877；美国专利号5,413,923；5,625,126；5,633,425；5,569,825；5,661,016；5,545,806；5,814,318；5,885,793；5,916,771；5,939,598；6,075,181和6,114,598。

用于制备人源化抗体的轻和重的人可变结构域的选择可以用于降低抗原性。根据所谓的“最佳适配”方法，对已知的人可变结构域序列的整个文库筛选啮齿动物抗体的可变结构域序列。然后将最接近于啮齿动物的人序列接受为人源化抗体的人框架(FR)(Chothia和Lesk 1987 J Mol Biol 196 901-17；Sims等人，1993 JImmunol 151 2296-308，通过参考将其每一篇全部并入本文)。另一种方法使用源自轻链或重链特定亚组的所有人抗体共有序列的特定框架。相同的框架可以用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，1992 Proc Natl Acad Sci U S A 89 4285-9；Presta等人，1993 J Immunol 151 2623-32，通过参考将其每一篇全部并入本文)。

还可以以保持对抗原的高亲和力和其他有利的生物特性任选地将抗体人源化。为了实现该目标，根据优选的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型一般是可得的并且是本领域技术人员熟知的。可以获得说明和展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。对这些展示的检查使得可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从共有的和输入的序列中选择并组合FR残基，以便获得所需的抗体特征，如提高的对目标抗原的亲和力。通常，CDR残基直接地并且最显著地参与影响抗原结合。

可以通过杂交瘤方法制得人抗体，特别是人单克隆抗体。例如，Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)；和Boerner等人，J.Immunol.147：86(1991)已经描述了用于人单克隆抗体生产的人骨髓瘤和小鼠-人杂骨髓瘤细胞系，通过参考将其每一篇全部并入本文。

或者，除了以上提出的，噬菌体展示技术可以用于在体外从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因库中生产人抗体和抗体片段。根据该技术的一个非限制性实例，将抗体V结构域基因在框内(in-frame)克隆至丝状噬菌体(如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上作为功能性抗体片段展示。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体的功能特性的选择还引起编码呈现那些特性的抗体的基因的选择。因此，噬菌体模拟了B-细胞的一些特性。可以以各种形式来进行噬菌体展示；对于综述，参见，Johnson1993 Current Opinions in Structural Biology 3 564-571，通过参考将其每一个全部并入本文。

几个V-基因片段的来源可以用于噬菌体展示。Clackson等人(Clackdon等人，1991 Nature 352 624-8)从源自免疫小鼠脾的V基因的小随机组合文库中分离了不同阵列的抗-噁唑酮抗体。基本上按照Marks等人，1991 J Mol Biol 222 581-97或Griffiths等人，1993 Embo J 12 725-34所述的技术，可以构建来自未免疫人供体的V基因库并可以分离不同阵列抗原(包括自体抗原)的抗体，通过参考将其每一篇全部并入本文。

在天然免疫应答中，抗体基因高速累积突变(体细胞超突变)。引入的一些变化将给予较高的亲和力，并且在随后的抗原攻击过程中优选复制和分化展示高亲和力表面免疫球蛋白的B细胞。可以通过使用称为“链改组”的技术来模拟这种天然过程(Marks等人，1992 Biotechnology(N Y)10 779-83)。在这种方法中，可以通过用获自未免疫供体的V结构域基因的天然产生变体库(库)顺序替代重链和轻链V区基因来提高通过噬菌体展示获得的“初级”人抗体的亲和力。这种技术使得可以产生具有nM范围亲和力的抗体和抗体片段。

Waterhouse等人已经描述了制备非常大的噬菌体抗体库的策略(Waterhouse等人，1993 Nucleic Acids Res 21 2265-6)。基因改组还可以用于从啮齿动物抗体产生人抗体，其中人抗体具有与起始啮齿动物抗体相似的亲和力和特异性。根据也称为“表位印刻”的这种方法，用人V结构域基因库替代通过噬菌体展示技术获得的啮齿动物抗体的重链或轻链V结构域基因，形成啮齿动物-人嵌合体。使用抗原选择引起能够恢复功能性抗原-结合位点的人可变结构域的分离，即，表位控制(印刻)伴侣的选择。重复该过程以替代剩余的啮齿动物V结构域时，获得了人抗体(参见，PCT WO93/06213)。与通过CDR移植的啮齿动物抗体的传统人源化不同，该技术提供了完全人抗体，其没有啮齿动物来源的框架或CDR残基。

还可以使用双特异性抗体，这些抗体是单克隆的，优选人或人源化的抗体，其对于至少两种不同抗原具有结合特异性。在本发明的情况中，结合特异性之一是对至少一种IL-12和/或IL-23蛋白；另一种是对任何其他抗原。例如，特异性结合IL-12/23蛋白和至少一种神经营养因子，或两种不同类型的IL-12/23多肽的双特异性抗体在本发明的范围内。

制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。在传统上，双特异性抗体的重组生产是基于两个免疫球蛋白重链-轻链对的共同表达，其中两个重链具有不同的特异性(Milstein等人，1983 Nature 305 537-40)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(细胞杂交瘤)产生了10个不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一个具有正确的双特异性结构。通常通过亲和力色谱步骤进行的正确分子的纯化是相当麻烦的，并且产物产量低。相似的方法公开于WO93/08829中和Traunecker等，1991 Embo J 10 3655-9中，通过参考全部并入本文。

根据不同的和更优选的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合体优选具有免疫球蛋白重链恒定结构域，包含铰链的至少一部分，第二个重链恒定区(C_H2)和第三个重链恒定区(C_H3)。优选具有第一个重链恒定区(C_H1)，含有轻链结合需要的位点，存在于至少一个融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体(如果需要，以及免疫球蛋白轻链)的DNA插入单独的表达载体中，并且共同转染至合适的宿主生物体中。当构建中使用的不等比例的三个多肽链提供最佳产量时，这在调节具体实施方案中的三个多肽片段的彼此比例中提供了很大的灵活性。然而，至少两个多肽链以等比例生产引起高产量时或比例没有特别意义时，可以将两个或全部三个多肽链的编码序列插入一个表达载体中。在该方法的优选具体实施方案中，双特异性抗体由一条臂中具有第一种结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一条臂中杂交的免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二种结合特异性)组成。这种不对称的结构有助于从不需要的免疫球蛋白链组合中分离出所需的双特异性化合物，因为仅有一半的双特异性分子中存在免疫球蛋白轻链提供了一种容易的分离方式。对于产生双特异性抗体的更多详细内容，参见，例如，Suresh等人，1986 Methods Enzymol 121 210-28。

抗体是双功能分子，来自重链和轻链的N-端可变片段以特定的方式连接在一起，以产生对抗原表面上的特定表位具有亲和力的三维结构。恒定区片段负责延长的血清半衰期和抗体的效应物功能，并且涉及补体结合、吞噬作用的刺激、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和引发粒细胞颗粒释放。可以预见抗-IL-12/23抗体将能够执行效应物功能，如ADCC或CDC(补体指导的细胞毒性)。这是由于以下的发现引起的：IL-12可以以膜结合形式存在(Quinones等人，2000 J Exp Med 192507-16)，抗体可以与其结合并征募效应物细胞。或者，本发明抗体可以结合与细胞表面结合的IL-12或IL-23，并因此形成能够将效应物细胞募集至目标细胞表面的复合物(Vogel等人，1996 Int Immunol 8 1955-62)。

因此，接着是可以通过调节功能性特征来提高抗体的治疗效用，这些功能性特征如抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性、血清半衰期、生物分布以及与Fc受体的结合。可以通过蛋白质工程化、糖工程化或化学方法来实现这种调节。根据治疗应用和需要的效应物活性所需水平，提高或降低这些活性中的任一种将是有利的。对于Fc增强的现有方法的综述，参见Carter 2006 Nat Rev Immunol 6343-57；Presta 2006 Adv Drug Deliv Rev 58 640-56。这样的增强可以包括抗体的Fc部分的突变，以确定对Fc受体具有提高的亲和力的突变体(Shields等人，2001 J Biol Chem 276 6591-604；Lazar等人，2006 Proc Natl Acad Sci U S A 103 4005-10)，和通过在具有工程化糖基化特征的细胞中的抗体表达定制多糖结构(Yamane-Ohnuki等人，2004 Biotechnol Bioeng 87 614-22；Li等人，2006 Nat Biotechnol 24 210-5；Schuster等人，2007 Biotechnol J 2 700-8)。

用于调节抗体血清半衰期和生物分布的许多方法是基于改变抗体与新生Fc受体(FcRn)之间的相互作用和维持高血清抗体浓度，所述新生Fc受体是在保护IgG免受分解代谢中具有关键作用的受体。Dall’Acqua等人(2002)描述了IgG1的Fc区中提高与FcRn的结合亲和力，由此提高了血清半衰期的置换，并进一步证明了M252Y/S254T/T256E的三个置换提高的生物利用率和ACDD活性的调节(Dall’Acqua 2006)。还可以参见美国专利号6,277,375；6,821,505；和7,083,784。Hinton等人(2004，2005)描述了位置250和428处的恒定结构域氨基酸置换，这给予了提高的体内半衰期。还可以参见美国专利号7,217,797。Petkova等人(2006)描述了位置307、380和434处的恒定结构域氨基酸置换，这给予了提高的体内半衰期。还可以参见Shields等人(2001)和WO2000/42072。美国专利申请号20090142340；20090068175和20090092599中描述了恒定结构域氨基酸置换的其他实例，这些置换调节了与Fc受体的结合，以及随后通过这些受体介导的功能，包括FcRn结合和血清半衰期。

已知连接抗体分子的聚糖能影响抗体与Fc受体和聚糖受体的相互作用，并由此影响抗体活性，包括血清半衰期(Kaneko Y等人，2006；Jones AJ等人，2007；Kanda Y等人，2007)。因此，调节所需抗体活性的某些糖型可以给予治疗优势。产生工程化糖型的方法是本领域已知的，并且包括但不限于美国专利号6,602,684；7,326,681；7,388,081和WO2008/006554中所述的那些。

通过加入聚乙二醇(PEG)延长半衰期已经广泛用于延长蛋白质的血清半衰期，例如，如Fishburn(2008)所述的。

复共轭对配合物(Heteroconjugate)抗体也在本发明的范围内。复共轭对配合物抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已经提出这样的抗体将免疫系统细胞靶向不需要的细胞(美国专利号4,676,980)，和用于治疗HIV感染(WO91/00360；WO92/00373；和EP 03089)。可以使用任何方便的交联方法来制得复共轭对配合物抗体。合适的交联剂是本领域熟知的，并且连同许多交联技术，公开于美国专利号4,676,980中。

在优选的具体实施方案中，通过细胞系、混合细胞系、永生化细胞或永生化细胞的克隆群来产生至少一种本发明的抗体或其特定的部分或变体。可以使用合适的方法，例如，人抗体产生细胞和杂骨髓瘤的融合或通过EB病毒感染激活的人B细胞的永生化，来产生永生化的结合产生细胞(Gustafsson等人，1991 Hum Antibodies Hybridomas 2 26-32；Zanella等人，1992 J Immunol Methods 156 205-15；Niedbala等人，1998 Hybridoma 17 299-304)。优选，如本文所述的和/或本领域已知的，通过能够产生人抗体库的转基因动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类等)的免疫来产生人抗人IL-12/23蛋白、片段、特定的部分或变体。可以从这些动物中分离出产生人抗体的细胞，并使用合适的方法(如本所述的方法)将其永生化。

可以通过已知的方法来产生可以产生结合人抗原的人抗体库的转基因鼠(例如，但不限于，授权与Lonberg等人的美国专利号5,770,428，5,569,825，5,545,806，5,625,126，5,625,825，5,633,425，5,661,016和5,789,650；Jakobovits等人的WO98/50433，Jakobovits等人的WO 98/24893，Lonberg等人的WO 98/24884，Lonberg等人的WO 97/13852，Lonberg等人的WO 94/25585，Kucherlapate等人的WO96/34096，Kucherlapate等人的EP 0463 151 B1，Kucherlapate等人的EP 0710 719A1，Surani等人的美国专利号5,545,807，Bruggemann等人的WO 90/04036，Bruggemann等人的EP 0438 474 B1，Lonberg等人的EP 0814 259 A2，Lonberg等人的GB 2 272 440A，Taylor，Carmack等人，1992 Nucleic Acids Res 20 6287-95；Tuaillon等人，1993 Proc Natl Acad Sci U S A 90 3720-4；Green等人，1994 Nat Genet7 13-21；Lonberg等人，1994 Nature 368 856-9；Taylor等人，1994 Int Immunol 6579-91；Lonberg等人，1995 Int Rev Immunol 13 65-93；Fishwild等人，1996 Nat Biotechnol 14 845-51；Mendez等人，1997 Nat Genet 15 146-56，通过参考将其每篇全部并入本文)。通常，这些小鼠包含至少一个转基因，该转基因包含来自至少一个功能上重排的或可以进行功能重排的人免疫球蛋白基因座的DNA。这些小鼠中内源性免疫球蛋白基因座可以被破坏或删除，以消除动物产生由内源性基因编码的抗体的能力。

本文所用的术语“功能上重排的”指的是来自经历了V(D)J重排，由此产生编码免疫球蛋白链(例如，重链，轻链)的免疫球蛋白基因的免疫球蛋白基因座的DNA片段，或其任何片段。可以使用合适的方法直接或间接鉴定功能上重排的免疫球蛋白基因，这些方法如例如，核苷酸测序、杂交(例如，Southern印迹、Northern印迹)(使用可以与基因片段之间的编码连接点退火的探针)或免疫球蛋白基因的酶扩增(例如，聚合酶链式反应)(使用可以与基因片段之间的编码连接点退火的引物)。还可以使用合适的方法来测定细胞是产生包含特定可变区的抗体还是包含特定序列的可变区(例如，至少一个CDR序列)。在一个具体实施方案中，可以从抗体产生细胞(例如，杂交瘤或重组细胞或其他合适的来源)中分离出mRNA并用于产生编码抗体或其特定部分或变体的cDNA。可以将cDNA克隆并测序，或可以使用与目标可变区的一部分(例如，CDR，编码连接点)特异性退火的第一个引物和与非可变区序列(例如，C_H1，V_H)特异性退火的第二个引物进行扩增(例如，通过聚合酶链式反应或其他已知和合适的方法)，

可以使用肽展示文库方便地实现筛选抗体、其特定的部分或变体，用于特异性结合相似的蛋白质或片段。这种方法涉及为具有所需功能或结构的单个成员而筛选大的肽集合。肽展示文库的抗体筛选是本领域熟知的。展示的肽序列可以为3至5000或更多个氨基酸的长度，常常为5-100个氨基酸长，并且常常为约8至25个氨基酸长。除了产生肽文库的直接化学合成方法以外，还描述了几个重组DNA方法。一种类型涉及在噬菌体或细胞表面上展示肽序列。每个噬菌体或细胞含有编码特定展示肽序列的核苷酸序列。这些方法描述于PCT专利公开号WO91/17271，WO91/18980，WO91/19818和WO93/08278中。用于产生肽文库的其他系统具有体外化学合成和重组方法两者的特征。参见，PCT专利公开号WO92/05258，WO 92/14843和WO 96/19256。还可以参见美国专利号5,658,754和5,643,768。肽展示文库、载体和筛选试剂盒是商业上可获得的，从如Invitrogen(Carlsbad，Calif.)和Cambridge Antibody Technologies(Cambridgeshire，UK)这些供应商。参见，例如，归属于Enzon的美国专利号4,704,692，4,939,666，4,946,778，5,260,203，5,455,030，5,518,889，5,534,621，5,656,730，5,763,733，5,767,260，5,856,456；归属于Dyax的美国专利号5,223,409，5,403,484，5,571,698，5,837,500，归属于Affymax的美国专利号5,427,908，5,580,717；归属于Cambridge Anitibody Technologies的美国专利号5,885,793；归属于Genentech美国专利号5,750,373，归属于Xoma的美国专利号5,618,920，5,595,898，5,576,195，5,698,435，5,693,493，5,698,417，Colligan(上文)；Ausubel(上文)或Sambrook(上文)，通过参考将以上每篇专利和公开物完全并入本文。

还可以通过给在其奶中产生这些抗体、其特定的部分或变体的转基因动物或哺乳动物(如，山羊，牛，马，绵羊等)提供编码至少一种抗体、其特定的部分或变体的核酸来制备本发明的抗体、其特定的部分和变体。可以使用已知方法来提供这样的动物。参见，例如，但不限于，美国专利号5,827,690；5,849,992；4,873,316；5,849,992；5,994,616；5,565,362；5,304,489，通过参考将其每一篇全部并入本文。

另外，可以使用编码至少一种抗体或特定的部分或变体的核酸以提供在植物部分或从其培养的细胞中产生这些抗体、其特定的部分或变体的转基因植物和培养的植物细胞(例如，但不限于，烟草、玉米和苔藓植物)来制备本发明的抗体、其特定的部分和变体。作为非限制性实例，表达重组蛋白质的转基因烟草叶已经成功用于提供大量的重组蛋白质，例如，使用诱导型启动子。参见，例如，Cramer等人，1999 Curr Top Microbiol Immunol 240 95-118以及其中引用的参考文献。此外，转基因玉米已经用于以商业生产水平来表达哺乳动物蛋白质，具有相当于其他重组系统中产生的或从天然来源纯化的那些生物活性。参见，例如，Hood等人，1999 Adv Exp Med Biol 464 127-47以及其中引用的参考文献。还从转基因植物种子包括烟草种子和马铃薯块茎大量生产了抗体。参见，例如，Conrad等人，1998 PlantMol Biol 38 101-9以及其中引用的参考文献。还通过这些遗传上改进的苔藓原生质体瞬时表达和分泌了抗体，所述抗体显示出未改变的抗原结合亲和力，并且在广泛的测试中，显示出达40倍提高的ADCC(Schuster，Jost等人，2007 Biotechnol J2 700-8)。因此，还可以根据已知的方法，使用转基因植物生产本发明的抗体、其特定的部分和变体。还可以参见，例如，Whitelam等人，1994 Biochem Soc Trans 22940-4；Ma等人，1995 Trends Biotechnol 13 522-7；Ma等人，1995 Plant Physiol 109341-6以及其中引用的参考文献。通过参考将以上每一篇参考文献全部并入本文。本发明的抗体可以以宽范围的亲和力(K_D)结合人IL-12/23。在优选的具体实施方案中，至少一种本发明的抗体可以以高亲和力任选结合人IL-12/23。例如，抗体可以以等于或低于约10^-9M的KD结合人IL-12/23蛋白，更优选，具有等于或低于约0.1-9.9(或其中任何的范围或值)×10^-10M，10^-11，10^-12，10^-13的K_D，或其中任何的范围或值。可以使用任何合适的方法来实验测定抗体对抗原的亲和力或亲合力(avidity)(参见，例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions”，In Fundamental Immunology，Paul，W.E.编辑，Raven Press：NewYork，N.Y.(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company：New York，N.Y.(1992)；以及其中所述的方法)。如果在不同的条件下测量(例如，盐浓度，pH)，测得的特定抗体与其结合伴侣的亲和力可能会不同。因此，优选使用抗体和结合伴侣的标准化溶液和标准化缓冲剂，如本文所述的缓冲剂，来进行亲和力和其他抗原结合参数(例如，K_D，K_a，K_d)的测量。

本发明的分离的核酸分子可以包括含有开放阅读框(ORF)的核酸分子，任选具有一个或多个内含子，例如，但不限于，至少一个重链或轻链各自至少一个CDR(如CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一个特定部分；包含抗体、或其特定部分或变体的编码序列的核酸分子；和如下的核酸分子：其包含基本上不同于以上所述的那些核苷酸序列，但其由于遗传密码的简并，仍然编码本文所述的和/或本领域已知的至少一种抗体。当然，遗传密码是本领域熟知的。因此，产生这样编码本发明的特异抗体、其特定部分或变体的简并核酸变体是本领域技术人员的常规手段。参见，例如，Ausubel等人(上文)并且将这样的核酸变体包括在本发明中。

如本文所示的，包含编码抗体或特定部分或变体的核酸的本发明的核酸分子可以包括，但不限于，自身编码抗体片段的氨基酸序列的那些；整个抗体或其部分的编码序列；抗体、片段或部分以及其他序列的编码序列，如至少一个信号前导(signal leader)或融合肽的编码序列，含有或不含前述其他编码序列，如至少一个内含子，以及其他非编码序列，包括但不限于，非编码5’和3’序列，如在转录、mRNA加工(包括剪接和多腺苷酸化信号(例如，核糖体结合和mRNA的稳定性))中起作用的转录、未转录的序列；编码其他氨基酸的其他编码序列，如提供其他功能的那些。因此，编码抗体或特定部分或变体的序列可以与标记序列融合，所述标记序列如编码有助于纯化包含抗体片段或部分的融合抗体或特定部分或变体的肽的序列。

本发明提供了在选择性杂交条件下与编码本发明抗体的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，该具体实施方案的多核苷酸可以用于分离、检测和/或定量包含这些多核苷酸的核酸。例如，本发明的多核苷酸可以用于鉴定、分离或扩增保藏文库中的部分或全长克隆。在一些具体实施方案中，多核苷酸是从人或哺乳动物核酸文库分离的基因组或cDNA序列，或否则是与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补的基因组或cDNA序列。

优选，cDNA文库包含至少80％的全长序列，优选至少85％或90％的全长序列，更优选至少95％的全长序列。可以将cDNA文库标准化，来提高罕见序列的呈现。通常，但不限于，对于相对于互补序列具有降低序列同一性的序列，使用低或中等严谨杂交条件。对于同一性较高的序列，任选使用中等和高严谨条件。低严谨条件可以进行具有约70％序列同一性的序列的选择性杂交，并可以用于鉴定直系同源序列或旁系同源序列。

任选，本发明的多核苷酸将编码由本文所述的多核苷酸编码的抗体或特定部分或变体的至少一部分。本发明的多核苷酸包括可以用于与编码本发明的抗体或特定部分或变体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见，例如，Ausubel(上文)；Colligan(上文)，通过参考将每一篇全部并入本文。

可以使用本领域熟知的(a)重组方法，(b)合成技术和(c)纯化技术或其组合来制得本发明的分离的核酸。

核酸可以方便地包含除了本发明的多核苷酸以外的序列。例如，可以将包含一个或多个限制性核酸内切酶位点的多克隆位点插入核酸中，以帮助多核苷酸的分离。此外，可以将可翻译序列插入，以帮助分离本发明的翻译的多核苷酸。例如，六组氨酸标记序列提供方便的方法来纯化本发明的蛋白质。除了编码序列外，本发明的核酸任选是用于本发明多核苷酸的克隆和/或表达的载体、接头或连接子。

可以将其他的序列加入这些克隆和/或表达序列中，以优化它们在克隆和/或表达中的功能，帮助多核苷酸的分离或促进多核苷酸引入细胞中。克隆载体、表达载体、接头和连接子的使用是本领域熟知的。(参见，例如，Ausubel(上文)；或Sambrook(上文))。

可以使用任何数量的本领域技术人员已知的克隆方法，从生物来源获得本发明的分离的核酸组合物，如RNA、cDNA、基因组DNA或其任意组合。在一些具体实施方案中，将在严谨条件下与本发明的多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离以及cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员熟知的。(参见，例如，Ausubel(上文)；或Sambrook(上文))。

可以使用基于本发明多核苷酸序列(如本文所述的那些)的探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可以用于与基因组DNA或cDNA杂交，以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员将认识到在分析中可以使用各种严谨程度的杂交；并且杂交或洗涤介质可以是严谨的。随着用于杂交的条件变得更严谨，用于发生双链形成的探针和目标物之间的互补程度必须更高。可以通过温度、离子强度、pH和部分变性溶剂(例如，甲酰胺)存在中的一个或多个来控制严谨的程度。例如，通过改变反应溶液的极性来方便地改变杂交的严谨性，例如，通过控制0％至50％范围内的甲酰胺浓度来改变反应溶液的极性。可检测结合所需的互补性(序列同一性)程度将根据杂交介质和/或洗涤介质的严谨性而不同。互补性程度将任选为100％，或90-100％，或其中任何的范围或值。然而，应当理解探针和引物中较小的序列变化可以通过降低杂交和/或洗涤介质的严谨性来补偿。

RNA或DNA的扩增方法是本领域熟知的，并且可以基于本文提供的教导和指导，根据本发明来使用，而不需要过度的实验。已知的DNA或RNA扩增方法包括，但不限于，聚合酶链式反应(PCR)和相关的扩增方法(参见，例如，Mullis等人的美国专利号4,683,195，4,683,202，4,800,159，4,965,188；Tabor等人的美国专利号4,795,699和4,921,794；Innis等人的美国专利号5,142,033；Wilson等人的美国专利号5,122,464；Innis等人的美国专利号5,091,310；Gyllensten等人的美国专利号5,066,584；Gelfand等人的美国专利号4,889,818；Silver等人的美国专利号4,994,370；Biswas的美国专利号4,766,067；Ringold的美国专利号4,656,134)和使用作为模板的目标序列的反义RNA的RNA介导的扩增，用于双链DNA合成(Malek等人的美国专利号5,130,238，商标名为NASBA)，通过参考将这些参考文献的全部内容并入本文。(参见，例如，Ausubel(上文)；或Sambrook(上文))。

例如，PCR技术可以用于扩增本发明的多核苷酸序列和直接来自基因组DNA或cDNA文库的相关基因。PCR和其他体外扩增方法也是有用的，例如，用于克隆编码待表达蛋白质的核酸序列，制备用作探针的核酸，这些探针用于检测样品中所需mRNA的存在、用于核酸测序或用于其他目的。通过体外扩增方法足以指导技术人员的技术实例可以在以下的参考文献中找到：Berger，上文，Sambrook，上文和Ausubel，上文，以及Mullis等人，美国专利号4,683,202(1987)；和Innis等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications，编辑，Academic Press Inc.，San Diego，Calif.(1990)。商业可获得的用于基因组PCR扩增的试剂盒是本领域已知的。参见，例如，Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可以用于提高长PCR产物的产量。

还可以通过已知方法的直接化学合成来制备本发明的分离的核酸(参见，例如，Ausubel等人，上文)。化学合成通常产生单链寡核苷酸，其可以通过与互补序列的杂交，或通过使用单链作为模板以DNA聚合酶进行聚合，转化成双链DNA。本领域技术人员将认识到尽管DNA的化学合成限于约100或更多碱基的序列，但通过较短序列的连接可以获得更长的序列。

本发明进一步提供了含有本发明核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列，例如，编码本发明的抗体或特定部分或变体的cDNA或基因组序列，可以用于构建重组表达盒，该表达盒可以引入至少一个所需的宿主细胞中。重组表达盒通常含有可操作地连接转录起始调控序列的本发明的多核苷酸，所述转录起始调控序列将指导多核苷酸在预期的宿主细胞中转录。可以使用异源和非异源(即，内源)启动子来指导本发明核酸的表达。

在一些具体实施方案中，可以在本发明非异源形式的多核苷酸的合适位置中(上游、下游或内含子中)引入用作启动子、增强子或其他元件的分离的核酸，以上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如，可以通过突变、删除和/或置换在体内或体外改变内源性启动子。

本发明还涉及包括本发明分离的核酸分子的载体、用重组载体遗传工程化的宿主细胞和通过重组技术生产至少一种抗体或特定部分或变体，所述重组技术是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人(上文)；Ausubel等人(上文)，通过参考将每篇全部并入本文。可以任选将多核苷酸连接含有选择标记的载体，用于在宿主中繁殖。通常，将质粒载体引入沉淀物中，如磷酸钙沉淀物，或与带电脂质的复合物中。如果载体是病毒，可以使用合适的包装细胞系在体外将其包装，然后转导至宿主细胞中。

DNA插入物应当可操作地与合适的启动子连接。表达构建体将进一步含有用于转录起始、终止的位点，并且在转录区中，含有用于翻译的核糖体结合位点。通过构建体表达的成熟转录本的编码部分优选将包括适当位于待翻译的mRNA末端的开始和终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)上的翻译起始，UAA和UAG优选用于哺乳动物或真核细胞的表达。

表达载体优选但任选包括至少一个选择标记。这样的标记包括，例如，但不限于，对于真核细胞培养，氨甲喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利号4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636和5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464；5,770,359和5,827,739)抗性，对于在大肠杆菌(E.coli)和其他细菌或原核生物中的培养，四环素或氨苄青霉素抗性基因(通过参考将以上专利全部并入本文)。用于上述宿主细胞的合适的培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员是显而易见的。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知方法来实现将载体构建体引入宿主细胞中。这样的方法在本领域中有描述，如Sambrook，上文，第1-4和16-18章；Ausubel，上文，第1、9、13、15、16章。

可以以改进的形式，如融合蛋白，来表达本发明的至少一种抗体、特定部分或变体，并且不仅可以包括分泌信号，而且还包括其他异源的功能区。例如，可以将其他氨基酸，特别是带电的氨基酸区域，添加至抗体、特定部分或变体的N-端，以提高纯化过程或随后的操作和存储过程中在宿主细胞中的稳定性和持久性。此外，可以将肽部分(moiety)添加至本发明的抗体、特定部分或变体中，以促进纯化。在抗体或其至少一个片段的最终制备之前，可以除去这样的区域。这些方法在许多标准实验手册中有描述，如Sambrook，上文，第17.29-17.42和18.1-18.74章；Ausubel，上文，第16，17和18章。本领域普通技术人员可以得知许多表达系统，可用于编码本发明蛋白质的核酸的表达。

或者，通过在含有编码本发明抗体、特定部分或变体的内源DNA的宿主细胞中打开(通过操纵)，可以在宿主细胞中表达本发明的核酸。这样的方法是本领域熟知的，例如，如美国专利号5,580,734，5,641,670，5,733,746和5,733,761，通过参考全部并入本文。

用于抗体、其特定部分或变体生产的说明性细胞培养物是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常是单层细胞的形式，尽管也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域已经研发了许多能够表达完整糖基化蛋白质的合适宿主细胞系，并且包括COS-1(例如，ATCC CRL 1650)、COS-7(例如，ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如，ATCC CRL-10)、CHO(例如，ATCC CRL 1610)和BSC-1(例如，ATCC CRL-26)细胞系、COS-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、海拉细胞等，其可以例如从美国典型培养物中心，Manassas，Va容易地获得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，如骨髓瘤和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞是P3X63Ag8.653细胞(ATCC登录号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登录号CRL-1581)。在特别优选的具体实施方案中，重组细胞是P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。

用于这些细胞的表达载体包括一个或多个以下的表达控制序列，如但不限于，复制起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子，CMV启动子；美国专利号5,168,062；5,385,839)，HSV tk启动子，pgk启动子(磷酸甘油酸激酶)启动子，EF-1α启动子(美国专利号5,266,491)，至少一个人免疫球蛋白启动子；增强子，和/或加工信息位点，如核糖体结合位点，RNA剪接位点，聚腺苷酸化位点(例如，SV40大TAg polyA添加位点)和转录终止子序列。参见，例如，Ausubel等人，上文；Sambrook等人，上文。用于生产本发明的核酸或蛋白质的其他细胞是已知的和/或可获得的，例如，来自美国典型培养物中心的细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或其他已知或商业来源。

使用真核宿主细胞时，通常将聚腺苷酸化或转录终止子序列整合至载体中。终止子序列的一个实例是来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。还可以包括用于精确剪接转录本的序列。剪接序列的实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，1983 J Virol 45 773-81)。此外，如本领域已知的，可以将控制宿主细胞中复制的基因序列整合至载体中。

可以通过熟知的方法，包括但不限于，蛋白A纯化、磷酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和力色谱、羟磷灰石色谱和凝集素色谱，从重组细胞培养物中回收和纯化抗体、特定部分或变体。高性能液相色谱(“HPLC”)也可以用于纯化。参见，例如，Colligan，Current Protocols in Immunology或Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，N.Y.，(1997-2003)，例如，第1、4、6、8、9、10章，通过参考将每一篇全部并入本文。

本发明的抗体、其特定部分或变体包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从真核宿主生产的产物，真核宿主包括，例如，酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产方法中所用的宿主，可以将本发明的抗体、特定部分或变体糖基化，或可以非糖基化，优选糖基化。这些方法描述于许多标准实验室手册中，如Sambrook，上文，17.37-17.42部分；Ausubel，上文，第10、12、13、16、18和20章，Colligan，Protein Science，上文，第12-14章，通过参考全部并入本文。

本发明的分离的抗体包括通过本发明任一个多核苷酸(如本文更充分讨论的)编码的抗体或特定部分或变体，或任何分离的或制备的抗体、其特定部分或变体。

优选，抗体或抗原结合片段结合人IL-12/23蛋白，并因此基本上中和了所述蛋白质的生物活性。抗体、其特定部分或变体，部分或优选基本上中和了至少一个IL-12/23蛋白的至少一种生物活性，并由此抑制通过IL-12与至少一个IL-12受体的结合，或IL-23与至少一个IL-23受体结合或通过其他IL-12或IL-23依赖性或介导的机制介导的活性。如本文所用的，术语“中和抗体”指的是可以将人IL-12p40蛋白或片段相关的依赖性活性抑制约20-120％的抗体，优选抑制至少约60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％或更高，这取决于分析。优选通过至少一种合适的抗体或蛋白质分析来评估抗体或特定部分或变体抑制人IL-12/23相关的依赖性活性的能力，所述分析如本文所述和/或本领域已知的。本发明的抗体、特定部分或变体可以是任何种类的(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同种型，并可以包括κ或λ轻链。在一个具体实施方案中，抗体或特定部分或变体包含IgG重链或限定的片段，例如，同种型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的至少一种。如本文所述的和/或本领域已知的，可以通过使用包含至少一个人轻链(例如，IgG、IgA和IgM；例如，γ1、γ2、γ3、γ4)转基因的转基因小鼠或其他转基因非人哺乳动物来制备这种类型的抗体。在另一个具体实施方案中，抗体、其特定部分或变体包含IgG1重链和IgG1轻链。

至少一种本发明的抗体、特定部分或变体结合IL-12p40蛋白、片段、部分或其任意组合特异性的至少一个特定表位。作为非限制性实例，抗体、特定部分或变体特异性地结合至少一个包含IL-12p40亚基的完整氨基酸序列的至少1-3个氨基酸的表位。所述至少一个特定的表位可以包括IL-12p40的至少一个氨基酸的任意组合，如，但不限于，SEQ ID NO：1(人IL-12p40亚基，306个氨基酸)的1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80、80-90、90-100、100-110、110-120、120-130、130-140、140-150、150-160、160-170、170-180、180-190、190-200、200-210、210-220、220-230、230-240、240-250、250-260、260-270、280-290、290-300、300-306、1-7、14-21、29-52、56-73、83-93、96-105、156-175、194-204、208-246、254-273、279-281或289-300的至少一个的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸。这些预测的表位在IL-12、IL-23、IL-12p40单体和IL-12p80同二聚体上可以获得。

抗体可以包含至少一个具有限定氨基酸序列的重链或轻链可变区。例如，在优选的具体实施方案中，抗体包含至少一个重链可变区和/或至少一个轻链可变区中的至少一个。如本领域已知和/或本文所述的，可以使用合适的方法，如噬菌体展示(Katsube等人，1998 Int J Mol Med 1 863-8)或使用转基因动物的方法，来制备结合人IL-12/23蛋白和/或片段并包含限定的重链或轻链可变区的人抗体。例如，可以用人IL-12和/或IL-23蛋白、其受体和/或片段免疫转基因小鼠，以引发抗体的产生，该转基因小鼠包含功能上重排的人免疫球蛋白重链转基因和包含可以进行功能性重排的人免疫球蛋白轻链基因座的DNA的转基因。如果需要，如本文所述的和/或本领域已知的，可以分离抗体产生细胞，并可以制备杂交瘤或其他永生化的抗体产生细胞。或者，可以在合适的宿主细胞中使用编码核酸或其部分表达抗体、特定部分或变体。

本发明还涉及包含与本文所述氨基酸序列基本上相同序列中的氨基酸的抗体、抗原结合片段、免疫球蛋白链和CDR。优选，包含这些链或CDR的这些抗体或抗原结合片段和抗体可以以高亲和力(例如，低于或等于约10^-9M的K_D)结合人IL-12/23蛋白和/或片段。与本文所述的序列基本上相同的氨基酸序列包括含有保守性氨基酸置换以及氨基酸删除和/或插入的序列。保守性氨基酸置换指的是第一个氨基酸被第二个具有与第一个氨基酸相似的化学和/或物理特性(例如，电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的氨基酸替代。保守性置换包括以下组内的一个氨基酸被另一个氨基酸的替代：赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H)；天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)；天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E；丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G)；F、W和Y；C、S和T。

如本文具体说明的，本发明的抗体或特定部分或变体可以包括一个或多个来自天然突变或人为操纵的氨基酸置换、删除或添加。当然，技术人员将根据许多因素来考虑氨基酸置换的数量，包括以上所述的那些因素。一般而言，如本文具体说明的，对于任何给定的结合多肽，氨基酸置换、插入或删除的数量将不超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个，如1-30个，或其中任何的范围或值。

可以通过本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描(alanine-scanning)诱变(例如，Ausubel，上文，第8，15章；Cunninghan等人，1989，Science 244 1081-5)，来鉴定对于功能必需的本发明的抗体、特定部分或变体中的氨基酸。后一种方法在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所得到突变分子的生物活性，如，但不限于，至少一种IL-12/23中和活性。还可以通过结构分析，如结晶、核磁共振或光亲和标记，来鉴定对于抗体、特定部分或变体结合关键的位点(de Vos等人，1992 Science 255 306-12；Smith等人，1992 J Mol Biol 224 899-904)。

在另一个方面中，本发明涉及抗体和抗原结合片段，如本文所述的，可以通过有机部分的共价连接对其进行修饰。这样的修饰可以产生具有提高的药物代谢动力学特性的抗体或抗原结合片段(例如，提高的体内血清半衰期)。有机部分可以是直链或支链亲水性聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定的具体实施方案中，亲水性聚合基团可以具有约800至约120,000道尔顿的分子量，并可以是聚烷撑二醇(polyalkane glycol)(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸或脂肪酸酯基团可以包含约八至约四十个碳原子。

本发明修饰的抗体和抗原结合片段可以包含一个或多个与抗体、特定部分或变体直接或间接共价键合的有机部分。与本发明的抗体或抗原结合片段键合的每个有机部分可以独立地是亲水性聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用的，术语“脂肪酸”包括单羧酸和二羧酸。本文所用的术语“亲水性聚合基团”指的是在水中比在辛烷中更可溶的有机聚合物。例如，聚赖氨酸在水中比在辛烷中更可溶。因此，本发明包括通过共价连接聚赖氨酸修饰的抗体。适于修饰本发明抗体的亲水性聚合物可以是直链或支链的，并包括，例如，聚烷撑二醇(例如，PEG、单甲氧基聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如，葡聚糖、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(例如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚链烷氧化物(例如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选，修饰本发明抗体的亲水性聚合物作为单独的分子实体具有约800至约150,000道尔顿的分子量。例如，可以使用PEG₅₀₀₀和PEG₂₀₀₀，其中下标是以道尔顿计的聚合物的平均分子量。

亲水性聚合基团可以被一至约六个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。可以通过使用合适的方法来制备被脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水性聚合物。例如，包含胺基的聚合物可以结合脂肪酸或脂肪酸酯的羧酸酯，脂肪酸或脂肪酸酯上激活的羧酸酯(例如，用N，N-羰基二咪唑激活的)可以结合聚合物上的羟基。

适用于修饰本发明抗体的脂肪酸和脂肪酸酯可以是饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单位。适用于修饰本发明抗体的脂肪酸包括，例如，n-十二烷酸(C₁₂，月桂酸)、n-十四烷酸(C₁₄，肉豆蔻酸)、n-十八烷酸(C₁₈，硬脂酸)、n-二十烷酸(C₂₀，花生酸)、n-二十二烷酸(C₂₂，山嵛酸)、n-三十烷酸(C₃₀)、n-四十烷酸(C₄₀)、顺-Δ9-十八烷酸(C₁₈，油酸)、全顺-Δ5，8，11，14-二十碳四烯酸(C₂₀，花生四烯酸)、辛二酸、四癸二酸、十八烷二酸、二十二碳烷酸等。合适的脂肪酸酯包括含有直链或支链低级烷基的二羧酸的单酯。低级烷基可以包含一至约十二个，优选一至约六个碳原子。

可以使用合适的方法，如通过与一种或多种修饰剂反应，来制备修饰的抗体和抗原结合片段。本文所用的术语“修饰剂”指的是含有激活基团的合适有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“激活基团”是在合适的条件下，可以与第二个化学基团反应，由此在修饰剂和第二个化学基团之间形成共价键的化学部分或官能团。例如，胺反应性激活基团包括亲电子基团，如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤素(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的激活基团包括，例如，马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。可以将醛官能团结合含有胺或酰肼的分子，叠氮化物基团可以与三价磷基团反应而形成氨基磷酸酯或磷酰亚胺连接。将激活基团引入分子的合适方法是本领域已知的(参见，例如，Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，Calif.(1996))。激活基团可以与有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)直接键合，或通过连接子部分，例如，二价C₁-C₁₂基团键合，其中一个或多个碳原子可以用杂原子替代，如氧、氮或硫。合适的连接子部分包括，例如，四甘醇、-(CH₂)₃-、-NH-(CH₂)₆-NH-、-(CH₂)₂-NH-和-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH-NH-。例如，可以通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的存在下，将单-Boc-烷基二胺(例如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-己二胺)与脂肪酸反应，以在游离胺和脂肪酸羧酸酯之间形成酰胺键，从而产生包含连接子部分的修饰剂。可以通过用三氟乙酸(TFA)处理从产物中除去Boc保护基团，以暴露可以与所述的另一个羧酸酯结合或可以与马来酐反应的伯胺，并将所得到的产物环化来产生激活的脂肪酸的马来酰亚胺衍生物。(参见，例如，Thompson等人，WO92/16221，通过参考将其全部教导并入本文)。

可以通过将抗体或抗原结合片段与修饰剂反应来产生本发明的修饰抗体。例如，可以通过使用胺反应性修饰剂，例如，PEG的NHS酯，以非位点特异性的方式，将有机部分与抗体键合。还可以通过还原抗体或抗原结合片段的二硫键(例如，链内二硫键)来制备修饰的抗体或抗原结合片段。然后可以将还原的抗体或抗原结合片段与硫醇反应性修饰剂反应，以产生本发明的修饰抗体。可以使用合适的方法，如反向蛋白质水解(Fisch等人，1992 Bioconjug Chem 3 147-53；Werlen等人，1994 Bioconjug Chem 5 411-7；Capellas等人，1997 Biotechnol Bioeng 56456-63；Kumaran等人，1997 Protein Sci 6 2233-41，以及Hermanson，G.T.，Bioconjugate Techniques，Academic Press：San Diego，Calif.(1996)中所述的方法)，来制备包含与本发明的抗体、特定部分或变体的特定位点键合的有机部分的修饰抗体和抗原结合片段。

本发明的抗体组合物可以任选进一步包含有效量的至少一种化合物或蛋白质，其选自抗感染药、心血管(CV)系统药、中枢神经系统(CNS)药、自主神经系统(ANS)药、呼吸道药、胃肠(GI)道药、激素药、用于流体或电解质平衡的药、血液学药、抗肿瘤药、免疫调节药、眼药、耳或鼻药、局部药、营养药等中的至少一种。这些药是本领域熟知的，包括每一种本文提出的制剂、适应症、剂量和给药(参见，例如，Nursing 2001 Handbook of Drugs，第21版，Springhouse Corp.，Springhouse，Pa.，2001；Health Professional′s Drug Guide 2001，编辑Shannon，Wilson，Stang，Prentice-Hall，Inc，Upper Saddle River，N.J.；Pharmcotherapy Handbook，Wells等人，编辑，Appleton&Lange，Stamford，Conn.，通过参考将每一篇全部并入本文)。

本发明的抗体、特定部分或变体组合物可以进一步含有任何合适的助剂中的至少一种，如但不限于，稀释剂、粘合剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。优选药学上可接受的助剂。制备这些无菌溶液的非限制性实例和方法是本领域熟知的，如但不限于，Gennaro编辑，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.(Easton，Pa.)1990。可以如本领域熟知的或本文所述的，常规地选择适于给药方式、抗体组合物的溶解性和/或稳定性的药学上可接受的载体。

用于本组合物中的药物赋形剂和添加剂包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、双糖、三糖、四糖和寡糖；衍生的糖，如多羟糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独或组合存在，单独或组合构成1-99.99重量或体积％。示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白，如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲能力中起作用的代表性氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬酰苯丙氨酸甲酯等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。

适用于本发明的碳水化合物赋形剂包括，例如，单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；双糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；和多羟糖醇，如甘露糖醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(山梨醇)、肌醇等。用于本发明的优选碳水化合物赋形剂是甘露糖醇、海藻糖和蜜三糖。

抗体组合物还可以包括缓冲剂或pH调节剂；通常，缓冲剂是从有机酸或碱制得的盐。代表性的缓冲剂包括有机酸盐，如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、醋酸或邻苯二甲酸的盐；Tris，三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，或磷酸盐缓冲剂。用于本发明组合物的优选缓冲剂是有机酸盐，如柠檬酸盐。

此外，本发明的抗体、特定部分或变体组合物可以包括聚合赋形剂/添加剂，如聚乙烯吡咯烷酮、菲柯尔(聚合糖)、葡聚糖结合剂(例如，环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨酯，如“TWEEN

20”和“TWEEN

80”)、脂质(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。

适用于根据本发明的抗体组合物的这些和其他已知的药物赋形剂和/或添加剂是本领域已知的，例如，如“Remington：The Science&Practice of Pharmacy”，第19版，Williams&Williams，(1995)，和“Physician′s Desk Reference”，第52版，Medical Economics，Montvale，N.J.(1998)中所列的，通过参考将其公开内容全部并入本文。优选的载体或赋形剂材料是碳水化合物(例如，糖和多羟糖醇)和缓冲剂(例如，柠檬酸盐)或聚合剂。

本发明提供了稳定的制剂，其优选包含具有盐水或所选盐的磷酸盐缓冲剂，以及防腐溶液和含有防腐剂的制剂，以及适用于药物或兽医使用的多用途防腐制剂，在药学上可接受的制剂中包含至少一种抗体、特定部分或变体。防腐制剂在含水稀释剂中含有至少一种已知的防腐剂或任选选自至少一种苯酚、m-甲酚、p-甲酚、o-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞(phenylmercuric nitrite)、苯氧乙醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如，六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(alkylparaben)(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢醋酸钠和硫柳汞，或其混合物。如本领域已知的，可以使用任何合适的浓度或混合物，如0.001-5％，或其中任何范围或值，如但不限于0.001、0.003、0.005、0.009、0.01、0.02、0.03、0.05、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.3、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9，或其中任何范围或值。非限制性实例包括，无防腐剂，0.1-2％m-甲酚(例如，0.2、0.3、0.4、0.5、0.9、1.0％)、0.1-3％苯甲醇(例如，0.5、0.9、1.1、1.5、1.9、2.0、2.5％)、0.001-0.5％硫柳汞(例如，0.005、0.01)、0.001-2.0％苯酚(例如，0.05、0.25、0.28、0.5、0.9、1.0％)、0.0005-1.0％对羟基苯甲酸烷基酯(例如，0.00075、0.0009、0.001、0.002、0.005、0.0075、0.009、0.01、0.02、0.05、0.075、0.09、0.1、0.2、0.3、0.5、0.75、0.9、1.0％)等。

本发明的任一方法可以包括将含有至少一种抗体、特定部分或变体的组合物或药物组合物给药于需要这样的调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或患者。这样的方法可以任选进一步包括用于治疗这些免疫疾病的共同给药或联合治疗，其中所述至少一种抗体、其特定部分或变体的给药进一步包括在之前、同时和/或之后，给予至少一种选自以下的物质：至少一种多发性硬化治疗剂(包括但不限于，β干扰素1a和β干扰素1b(例如，Avonex^TM、Rebif^TM、Betaseon^TM)、醋酸格拉替雷(例如，Copaxone)、环磷酰胺、硫唑嘌呤、糖皮质激素、甲氨蝶呤、紫杉醇、2-氯脱氧腺苷、米托蒽醌、IL-10、TGBb、CD4、CD52、antegren、CD11、CD18、TNFα、IL-1、IL-2和/或CD4抗体或抗体受体融合体、干扰素α、免疫球蛋白、Lismide(RequinimaxTM)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、elprodil、吡非尼酮、口服髓磷脂，或作用于以下至少一种情况的一种或多种化合物：髓磷脂破坏的自体免疫抑制，免疫调节，T细胞的激活、增殖、迁移和/或抑制细胞功能，T细胞受体/肽/MHC-II相互作用的抑制，T细胞aenergy的诱导，自体反应性T细胞的删除，穿过血脑屏障的运输(trafficking)的减少，促炎症反应(T_H1)和免疫调节(T_H2)细胞因子平衡的改变，基质金属蛋白酶抑制剂的抑制，神经保护，神经胶质增生的降低，髓鞘重新形成的促进)、TNF拮抗剂(例如，但不限于TNF抗体或片段、可溶的TNF受体或其片段、融合蛋白或小分子TNF拮抗剂)、抗风湿剂、肌肉松弛剂、麻醉药、非类固醇抗炎药(NSAID)、止痛剂、麻醉剂、镇静剂、局部麻醉剂、神经肌肉阻断剂、抗微生物剂(例如，氨基糖苷、抗真菌剂、抗寄生物药、抗病毒剂、碳青霉烯、头孢菌素、氟喹诺酮、大环内酯、青霉素、磺酰胺、四环素、另一种抗微生物剂)、抗牛皮癣剂、皮质类固醇、合成代谢类固醇、IL-12/23剂、矿物质、营养物、甲状腺剂、维生素、钙相关的激素、抗腹泻剂、止咳药、止吐药、抗溃疡药、轻泻剂、抗凝血剂、促红细胞生成素(例如，红细胞生成素α)、非格司亭(例如，G-CSF、Neupogen

)、沙格司亭(GM-SCF，Leukine)、免疫剂、免疫球蛋白、免疫抑制剂(例如，巴利昔单抗、环孢霉素、达克珠单抗)、生长激素、激素替代药、雌激素受体调节剂、扩瞳药、睫状肌麻痹药、烷化剂、抗代谢物、有丝分裂抑制剂、放射性药、抗抑郁药、抗躁狂剂、抗精神病药、抗焦虑药、催眠药、拟交感神经药、兴奋剂、多奈哌齐、他克林、哮喘药、β激动剂、吸入的类固醇、白细胞三烯抑制剂、甲基黄嘌呤、色甘酸纳、肾上腺素或类似物、链道酶α(Pulmozyme

)细胞因子或细胞因子拮抗剂。合适的剂量是本领域熟知的。参见，例如，Wells等人编辑，Pharmacotherapy Handbook，第2版，Appleton和Lange，Stamford，Conn(2000)，PDR Pharmacopoeia，Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000，豪华版，Tarascon Publishing，Loma Linda，Calif.(2000)，通过参考将每一篇参考文献全部并入本文。

适用于本发明的组合物、联合治疗、共同给药、装置和/或方法的TNF拮抗剂(进一步包含本发明的至少一种抗体、其特定部分和变体)包括但不限于，抗TNF抗体，其抗原结合片段和特异性结合TNF的受体分子；防止和/或抑制TNF合成、TNF释放或其在目标细胞上作用的化合物，如沙立度胺、替尼达普、磷酸二酯酶抑制剂(例如，己酮可可碱和咯利普兰)、A2b腺苷受体激动剂和A2b腺苷受体增强剂；防止和/或抑制TNF受体信号传导的化合物，如有丝分裂素激活蛋白(MAP)激酶抑制剂；阻断和/或抑制膜TNF分裂的化合物，如金属蛋白酶抑制剂；阻断和/或抑制TNF活性的化合物，如血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(例如，卡托普利)；和阻断和/或抑制TNF产生和/或合成的化合物，如MAP激酶抑制剂。

如本文所用的，“肿瘤坏死因子抗体”、“TNF抗体”、“TNFα抗体”或片段等在体外、原位和/或优选在体内降低、阻断、抑制、消除或干扰TNFα活性。例如，本发明合适的TNF人抗体可以结合TNFα，并且包括抗TNF抗体，其抗原结合片段，和特异性结合TNFα的特定突变体或其结构域。合适的TNF抗体或片段还可以降低、阻断、消除、干扰、防止和/或抑制TNF RNA、DNA或蛋白质的合成，TNF释放，TNF受体信号传导，膜TNF分裂，TNF活性，TNF产生和/或合成。

用于本发明的优选TNF受体分子是以高亲和力结合TNFα的那些(参见，例如，Feldmann等人，国际公开号WO 92/07076；Loetscher等人，1990 Cell 61 351-9；Schall等人，1990 Cell 61 361-70，通过参考将这些参考文献全部并入本文)并任选地具有低致免疫性。特别地，55kDa(p55TNF-R)和75kDa(p75TNF-R)TNF细胞表面受体在本发明中是有用的。这些受体的截短形式，包含受体的胞外结构域(ECD)或其功能性部分(参见，例如，Corcoran等人，1994 Eur J Biochem 223831-40)，在本发明中也是有用的。包含ECD的TNF受体的截短形式在尿和血清中已经被检测为30kDa和40kDa TNFα抑制抗体(Engelmann等人，1990 J Biol Chem265 1531-6)。TNF受体多聚体分子和TNF免疫受体融合分子，及其衍生物和片段或部分，是在本发明的方法和组合物中有用的TNF受体分子的其他实例。可以用于本发明的TNF受体分子的特征在于其以良好至极好的症状缓解和低毒性在延长时间段中治疗患者的能力。低致免疫性和/或高亲和力，以及其他未确定的特性，有助于所获得的治疗结果。

通常，通过给予有效量或剂量的至少一种抗体组合物来实现病理情况的治疗，平均的总范围为至少约0.01至500毫克的至少一种抗体、特定部分或变体/公斤患者/剂，并且优选，至少约0.1至100毫克的抗体、特定部分或变体/公斤患者/单次或多次给药，这取决于组合物中所含抗体、特定部分或变体的特定活性。或者，有效的血清浓度可以包括0.1-5000μg/ml血清浓度/单次或多次给药。合适的剂量是开业医生已知的，并且当然将取决于特定的疾病状态、所给予组合物的特定活性和进行治疗的特定患者。在一些情况中，为了获得所需的治疗量，需要提供重复的给药，即，特别监控或计量剂量的重复单独给药，其中重复单独给药直至获得所需的日剂量或效果。优选的剂量可以任选包括0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和/或100mg/kg/给药，或其任何范围、值或部分，或获得0.1、0.5、0.9、1.0、1.1、1.2、1.5、1.9、2.0、2.5、2.9、3.0、3.5、3.9、4.0、4.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、20、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14.0、14.5、4.9、5.0、5.5、5.9、6.0、6.5、6.9、7.0、7.5、7.9、8.0、8.5、8.9、9.0、9.5、9.9、10、10.5、10.9、11、11.5、11.9、12、12.5、12.9、13.0、13.5、13.9、14、14.5、15、15.5、15.9、16、16.5、16.9、17、17.5、17.9、18、18.5、18.9、19、19.5、19.9、20、20.5、20.9、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、96、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500和/或5000μg/ml血清浓度/单次或多次给药的血清浓度，或其任何范围、值或部分。

或者，给药的剂量可以根据已知的因素来改变，如特定药剂的药物代谢动力学特征，给药方式和途径；接受者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度、伴随治疗的种类、治疗频率和所需效果。通常，活性成分的剂量可以为约0.1至100毫克/公斤体重。通常，0.1至50，并优选0.1至10毫克/公斤/给药或以有效获得所需结果的持续释放形式。

作为非限制性实例，可以作为本发明的至少一种抗体、特定部分或变体的一次性或周期性剂量来提供人或动物的治疗，0.1至100mg/kg，如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg/天，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或，替换地或另外地，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52周中的至少一周，或，替换地或另外地，在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20年中的至少一年，或其任意组合，使用单次灌输或重复剂量。

适用于内部给药的剂型(组合物)一般含有约0.1毫克至约500毫克的活性成分/单位或容器。在这些药物组合物中，活性成分通常以基于组合物的总重约0.5-99.999重量％的量存在。

对于非肠道给药，抗体、特定部分或变体可以配制成溶液、悬浮液、乳液或冻干粉，与药学上可接受的非肠道载体结合或分开提供。这些载体的实例是水、盐水、林格氏溶液、右旋葡萄糖溶液和1-10％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和非水性载体，如固定油。载体或冻干粉可以含有维持等渗性(例如，氯化钠、甘露糖醇)和化学稳定性(例如，缓冲剂和防腐剂)的添加剂。通过已知的或合适的技术将制剂灭菌。

在最近版本的Remington的药物科学，A.Osol(该领域中的标准参考文献)中描述了合适的药物载体。

有时希望将本发明的抗体在延长的时间段内递送至患者，例如，一周至一年时间段的单次给药。可以使用各种缓释、贮藏或植入剂型。例如，剂型可以含有在体液中具有低程度溶解性的化合物的药学上可接受的无毒盐，例如，(a)与多元酸的酸加成盐，多元酸如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、丹宁酸、扑酸(pamoic acid)、海藻酸、聚谷氨酸、萘单-或二-磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)与多价金属阳离子的盐或与例如由N，N’-二苯甲基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子的盐，所述多价金属阳离子如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等；或(c)(a)和(b)的组合，例如，丹宁酸锌盐。此外，本发明的化合物，或优选，相对不溶的盐，如刚才所述的那些，可以配制在凝胶中，例如，单硬脂酸铝凝胶，含有例如芝麻油，适于注射。特别优选的盐是锌盐、丹宁酸锌盐、扑酸盐等。另一种类型的用于注射的缓释贮藏制剂含有为封装于缓慢降解、无毒、无抗原聚合物中而分散的化合物或盐，所述聚合物如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物，例如，如美国专利号3,773,919中所述。化合物或优选相对不溶的盐，如以上所述的那些，也可以配制于胆固醇基质硅橡胶丸中，特别用于动物。其他缓释、贮藏或植入制剂，例如，气体或液体脂质体，是文献中已知的(美国专利号5,770,222和“Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems”，J.R.Robinson编辑，Marcel Dekker，Inc.，N.Y.，1978)。

已经概括地描述了本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，实施例以说明的方式提供，而不是限制性的。

本发明的实施例

这些实施例中对IL-12、IL-23、IL-12p40、IL-12p80、IL-12Rβ1、IL-12Rβ2和IL-23的所有提及，指的是人形式的蛋白质，除非另外指出。

对于这些实施例中列出的每种抗体的相应蛋白质和DNA序列，参考表10。

实施例1

1.1杂交瘤的分离和嵌合抗体的产生

使用标准鼠杂交瘤产生技术和重组IL-12作为免疫原，获得了两个杂交瘤细胞系，PMA202和PMA204。如在ELISA中测试的，这些细胞系分泌结合IL-12p40(SEQ ID NO：1)、IL-12(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)和IL-23(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3)的抗体(PMA204-图3)。将抗体定为鼠IgG₁κ同种型。

从细胞系PMA202和PMA204中提取RNA后，并使用PCR技术，获得了鼠重链和轻链可变区的序列。这些序列如下，将CDR下划线并根据Kabat(Kabat等人，1971 Ann N Y Acad Sci 190 382-93和Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)来限定。注意根据Kabat编号系统将所有随后的编码抗体可变区的蛋白质序列编号。

PMA202鼠重链可变区(SEQ ID NO：4)

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNFKNEDTATYFCARSLSTMI TTTFAYWGQGTLVTVSS

PMA202鼠轻链可变区(SEQ ID NO：5)

SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYA SNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKR

PMA204鼠重链可变区(SEQ ID NO：6)

EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNACKEL RYFDVWGAGTTVTVSS

PMA204鼠轻链可变区(SEQ ID NO：7)

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQ SISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKR

使用PMA202蛋白序列作为模板，产生了新的优化核苷酸序列，其中将鼠重链可变区移植至人IgG₁结构域上(CH1、CH2和CH3)(SEQ ID NO：8)，并将轻链可变区移植至人κ恒定结构域上(SEQ ID NO：9)，如下所示。将该嵌合抗体命名为抗体202.1。

抗体202.1重链(SEQ ID NO：10)

QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTNYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNFKNEDTATYFCARSLSTMITTTFAYWGQGTLVTVSSASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗体202.1轻链(SEQ ID NO：11)

SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

使用PMA204蛋白序列作为模板，产生了新的优化核苷酸序列，其中将鼠重链可变区移植至人IgG₁结构域上(CH1、CH2和CH3)(SEQ ID NO：8)，并将轻链可变区移植至人κ恒定结构域上(SEQ ID NO：9)，如下所示。将该嵌合抗体命名为抗体1。

抗体1重链(SEQ ID NO：12)

EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNACKELRYFDVWGAGTTVTVSSASTKNPDVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

抗体1轻链(SEQ ID NO：13)

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQSISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSWPLTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

在HEK细胞系中瞬时产生了两种抗体，并且使用蛋白A色谱纯化。针对IL-12、IL-23、IL-12p40在ELISA(图3)和表面等离子共振(SPR)(表1)分析中测试了抗体1，并显示抗体1对IL-12/23的p40亚基是特异性的。所述结合特征与最初的小鼠抗体PMA204的相似(图3)。

表1：抗体1的SPR数据

分析物	k_a(1/Ms)	k_a(1/s)	K_D(pM)
				IL-12	1.36x10⁶	6.45x10^-5	47.7
IL-23	2.55x10⁶	1.14x10^-4	44.6
				IL-12p40	1.07x10⁶	7.12x10^-5	66.3

实施例2

2.1PMA204和抗体1的特异性

PMA204和抗体1以剂量依赖性方式同等充分地结合人IL-12、IL-23、IL-12p40和IL-12p80，如使用ELISA测定的(图3)。使用SPR，计算了抗体1的动力学数据，包括k_a(结合速率(on-rate))、k_d(解离速率(off-rate))和平衡解离常数(K_D)，并列于表1中。抗体1以相似的40-70pM的K_D值结合人IL-12、IL-23、IL-12p40(表1)。

2.2PMA204和抗体1中和IL-12与IL-12Rβ2的结合和IL-23与IL-23R的结合

使用受体中和分析，证明了PMA204和抗体1中和IL-12与IL-12Rβ2的胞外结构域(SEQ ID NO：15)的结合(图4A)和IL-23与IL-23R的胞外结构域(SEQ ID NO：16)的结合(图4B)。

2.3PMA204和抗体1不中和IL-12、IL-12p40、IL-12p80或IL-23与IL-12Rβ1的结合

PMA204和抗体1不中和IL-12和IL-12p80与IL-12Rβ1(SEQ ID NO：14)的结合(图5)。PMA204或抗体1不抑制IL-12p40和IL-23与IL-12Rβ1的结合。

2.4抗体1不抑制IL-12/23与IL-12Rβ1转染的细胞系的结合

产生了过表达IL-12Rβ1的稳定转染的Jurkat细胞系。该细胞系对IL-12Rβ2和IL-23R是阴性的，如通过流式细胞术所测定的。使用流式细胞术证实了IL-12p40、IL-12和IL-23与细胞系的结合。在用IL-12p40、IL-12或IL-23滴定抗体1和抗体202.1的实验中，抗体202.1展示了对细胞因子结合IL-12Rβ1 Jurkat细胞系的可滴定抑制(图7)。相反，抗体1不显著中和IL-12、IL-23或IL-12p40链单独与IL-12Rβ1 Jurkat细胞系的结合(图7)。IL-12和IL-23的平均荧光强度随着多达1μg/ml的增加的抗体1浓度而增强，反映出抗体-细胞因子-受体复合物的形成(图7)。

2.5抗体1与转染细胞系上结合IL-12Rβ1的IL-12、IL-23形成复合物

抗体1强烈结合转染细胞表面上的结合IL-12Rβ1的IL-12、IL-23或IL-12p40链(图8)。可以预见这种复合物可以在生物系统中出现并且以使得抗体的Fc区与Fc结合受体相互作用的方向来呈现抗体。这样的抗体可以存在于效应细胞上，并且诱导ADCC和CDC活性，由此呈现出对目标细胞的细胞毒性效应，抗体-细胞因子-受体复合物在该目标细胞上形成。相反，抗体202.1，显示出可以忽略的与细胞因子-受体复合物的结合。

实施例3

3.1抗体1的优化

3.1.1轻链中位置94的W

在抗体纯化过程中，色氨酸可能被氧化，形成氧化和未氧化的物质，这些物质在蛋白质的HPLC分析过程中引起问题，如Yang等人，2007 J Chromatogr A 1156174-82中所示的。为了避免这一问题，进行了轻链中位置94的Trp至Phe的保守性置换。通过基因合成产生了这一称为抗体3的抗体，表达并在ELISA中筛选(图9)。在SPR筛选中，该抗体比抗体1更快地与IL-12和IL-23分离(表2)。

表2：抗体1、3、4和7的SPR数据。

3.1.2重链位置34的M

已经显示出在抗体的纯化和存储过程中，Met可能被氧化。人抗体序列的BLAST搜索鉴定出Leu在该位置上是常见的。进行了M34L置换并且将构建体命名为抗体4。合成基因，表达，并使用SPR和ELISA筛选抗体(图9)。与抗体1相比，抗体4对于IL-12和IL-23的亲和力有少量损失(表2)。

3.1.3重链中位置95的半胱氨酸

在抗体1重链的位置95上观察到了有问题的残基。在CDR3开始处的该半胱氨酸可能被氧化，引起任何所得到的抗体产物的异质性。其还可以通过二硫键的形成形成复合物。因此，使用基因合成而在该位置中取代其他18个(除了最初的Cys和Trp)氨基酸中的每一个，并且瞬时表达抗体(抗体5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22)。对这些抗体进行了ELISA(图9)。一些抗体保留了对IL-12和IL-23的结合活性，其他的仅对一种细胞因子或另一种具有结合活性，而其他的最小程度地结合任一种细胞因子。对样品进行了SPR，并且从该数据，分析了构建体的解离速率。从该数据，具有C95N置换的抗体7展示出最接近于抗体1的亲和力(表2)。

出乎意料地，该置换强烈地提高了产品的均一性，如通过SDS-PAGE所示。抗体7展示出一种主要物质的大小模式，其与已知分子量的比较抗体所见到的相似(图10)。将这与展示出两种主要物质的抗体1相比(图10)。

然后将3个置换结合至单个抗体中，将其称为抗体50，其具有以下重链和轻链可变区：

抗体50VH结构域(SEQ ID NO：112)

EVQLQQSGADLVRSGASIKLSCTASGFNIKDYYLHWVKQRPEQGLEWIGW IDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNANKELRYF DVWGAGTTVTVSS

抗体50VL结构域(SEQ ID NO：169)

DIVLTQSPATLSVTPGDSVSLSCRASQSISINLHWYQQKSHESPRLLIKFASQS ISGIPSRFSGYGSGTDFTLSINSVETEDFGRYFCQQSNSFPLTFGAGTKLELKR

该抗体保留了对IL-12和IL-23的高亲和力，如通过ELISA、SPR和基于细胞中的分析测定的(图11)。

实施例4

4.1PMA204的超人源化

根据美国公开号US2003/039649(Foote)和PCT公开号WO04/006955(Foote)中教导的并通过Tan等人(2002)和通过Hwang等人(2005)进一步解释的方法，进行了PMA204的超人源化。

首先，根据美国专利申请系列号10/194975和美国专利号6,881,557中教导的并通过Tan等人(2002.J.Immunol.169(2)：1119-25)，通过Hwang等人(2005)和本申请中(参见上文)进一步解释的方法，测定了重链和轻链CDR的规范结构(以下列出的)。它们如下：

表3：PMA204的CDR的规范结构模式

CDR	规范结构
		重链CDR1	1
重链CDR2	2
		轻链CDR1	2
轻链CDR2	1
		轻链CDR3	1

选择具有与PMA204相似规范结构模式的人种系VH区序列(Hwang等人，2005)作为受体。这些是以下的种系序列(注意：所有种系序列取自IMGT数据库，Giudicelli，V.等人，Nucleic Acids Res.，33：D256-D261(2005)；注意到这些种系序列中的一些残基是超可变的，并且没有在序列中列出)：

IGHV1-f*01(SEQ ID NO：17)

EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTDYYMHWVQQAPGKGLEWMGLVDPEDGETIYAEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT

IGHV1-24*01(SEQ ID NO：18)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTLTELSMHWVRQAPGKGLEWMGGFDPEDGETIYAQKFQGRVTMTEDTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCAT

IGHV1-18*01(SEQ ID NO：19)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGNTNYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAR

所示的任一个种系序列(SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19)结合六个所示人种系JH序列中的任一个可以提供用于制备人源化重链的框架区。基于主要序列相似性，选择了以下的JH区序列：

JH3(SEQ ID NO：20)

AFDVWGQGTMVTVSS

选择具有与PMA204相似的规范结构模式的人种系VL区序列(Hwang等人，2005)作为受体序列。这些是以下的种系序列：

IGKV6D-21*01(SEQ ID NO：21)

EIVLTQSPDFQSVTPKEKVTITCRASQSIGSSLHWYQQKPDQSPKLLIKYASQSFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTINSLEAEDAATYYCHQSSSLP

IGKV3-15*01(SEQ ID NO：22)

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWP

IGKV3-11*01(SEQ ID NO：23)

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWP

所示的任一个种系序列(SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23)结合5个可能的Jκ序列中的任一个可以提供用于制备人源化轻链的框架区。基于主要序列相似性，选择了以下的Jκ区序列：

Jκ4(SEQ ID NO：24)

LTFGGGTKVEIKR

用来自PMA204的相应CDR替代受体的CDR。使用基因合成产生了基因，并且转染了不同组合的超人源化重链和轻链(抗体40、41、42、43、44、45、46、47、48)。所有这些表达的抗体都保留了对IL-12和IL-23的结合活性(图12)。

鉴定了PMA204的重链中的两个罕见氨基酸。位置93的Ala和位置94的Asn。将这些氨基酸作为回复突变引入重链超人源化变体中。使用基因合成产生了基因，并且转染了这些回复突变的超人源化重链和超人源化轻链的不同组合(抗体31、32、33、34、35、36、37、38、39)。一些表达的抗体保留了对IL-12和IL-23的结合活性，一些抗体只结合一种细胞因子或另一种，而其他抗体显示出与任一种抗体的最小结合(图12)。

从这些抗体组合，几个抗体在ELISA和SPR分析中展示出与其抗原持续而强烈的结合。三个抗体是选择的抗体37、39和44。基于抗体1的优化，将增强了抗体1的生物物理特性的3个点突变(轻链W94F、重链M34L和重链C95N)引入抗体37、39和44中。进行了混合优化变体重链和轻链的组合方法，产生了一组抗体(抗体76、77、78、79、80、81)。在ELISA中，这些抗体全部结合IL-12和IL-23(图13)。抗体80展示出与IL-12强烈的结合(如通过SPR所测定的)，并被选择用于使用基于NK92细胞分析(图11)和人PBMC IL-12诱导的IFN-γ分析(图17)和鼠脾细胞分析(图14)的进一步分析。构建体抗体80展示了NK-92分析中对IL-12诱导的IFN-γ分泌的强烈抑制和鼠脾细胞分析中对IL-23诱导的IL-17分泌的强烈抑制。

实施例5

5.1PMA204的人源化

还使用线性肽序列中与原始小鼠抗体的框架序列密切同源的人框架序列，将PMA204人源化。

使用PMA204的重链和轻链作为查询序列进行了PBD数据库(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)的BLAST搜寻。

与PMA204的重链可变区接近的人同源物是1RZ7HC可变区(SEQ ID NO：25)，如下所示：

在CDR区外的两个序列之间存在31个氨基酸差异。

PMA204的轻链可变区和1RZ7LC可变区(SEQ ID NO：26)之间的轻链同源性也是高的，如下所示：

在CDR区外的两个序列之间存在31个氨基酸差异。

使用3D建模软件(Accelrys，Modeller)，基于主要序列，使用在PBD数据库的BLAST搜寻过程中发现的10个最同源的抗体作为模板，建立了PMA204的重链和轻链的3D模型，并且其中每个模板抗体具有公开的高分辨率晶体结构。比对PMA204和1RZ7的模型，证明了两个抗体框架之间的合理适合度(RMSD重链＝1.53，RMSD轻链＝0.6)。因此，选择1RZ7作为受体框架，将来自PMA204的供体CDR移植至其中，产生CDR移植的抗体。

对PMA204模型的仔细观察鉴定了可能影响CDR移植抗体与抗原结合的关键框架残基。这些如下：

重链

ARG40-与另一个残基的氢键并稳定CDR环结构

GLU42-供体和受体之间比较的二级结构中的差异

LYS66-与3个不同残基的氢键并稳定CDR环结构

轻链

LYS49-与重链CDR3残基的H-键

TYR65-非保守性的罕见残基

ARG85-非保守性的罕见残基

将这些氨基酸中的每一个作为回复突变引入CDR移植的抗体中。基于抗体1的优化，将增强了抗体1的生物物理特性的3个点突变(轻链W94F、重链M34L、重链C95N)引入所有人源化变体中。

所有人源化变体的基因合成后，一起表达直的CDR移植抗体链和回复突变链的组合，产生一组人源化抗体(抗体51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、73、75)。对这些抗体进行了ELISA。所有抗体保留了对IL-12和IL-23的结合活性(图15，图16)。抗体68展现出对IL-23的强烈结合(如通过SPR所测定的)，并且被选择用于使用基于NK92细胞分析(图11)的进一步分析。抗体68展示了NK-92分析中对IL-12诱导的IFN-γ分泌的强烈抑制。

为了研究其他回复突变是否可以增强抗体的亲和力和效力，将抗体68的重链可变区与优化的嵌合抗体抗体50的重链可变区进行了比对。在抗体68不同于抗体50的每个位置上，将来自抗体50该位置的残基引入抗体68中。基因合成这些变体，与抗体68轻链配对，并表达(抗体92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125)。对所有重链和轻链抗体进行了ELISA。一些保留了对IL-12和IL-23的结合活性，其他的只对一种细胞因子或另一种保留了结合活性，而其他的不显示与任一种细胞因子的结合(图18)。

为了观察其他回复突变是否可以增强抗体的亲和力和效力，将抗体68的轻链可变区与优化的嵌合抗体50的轻链可变区进行了比对。在抗体68不同于抗体50的每个位置上，将来自抗体50该位置的残基引入抗体68中。基因合成这些变体，与抗体68重链配对，并表达(抗体126、127、128、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148)。对所有重链和轻链抗体进行了ELISA。一些保留了对IL-12和IL-23的结合活性，而其他的不显示与任一种细胞因子的结合(图19)。

基于抗体与IL-12和IL-23的强烈结合(在基于细胞的分析中筛选)，选择了抗体127、130、136、140、146和148。抗体136展示了对IL-12人PBMC IL-12诱导的IFN-γ分析的强烈抑制(图17)和鼠脾细胞分析中对IL-23诱导的IL-17分泌的强烈抑制(图14)。

实施例6

6.1抗体80的亲和力成熟

6.1.1用于核糖体展示的材料的制备

将抗体80重新格式化，用于作为scFv(scFv-80)(SEQ ID NO：27)的表达并且亚克隆至pEGX448表达载体中。表达带有FLAG标签的scFv，使得可以亲和力纯化。然后在大肠杆菌(E.coli)中表达scFv，并通过亲和力色谱和凝胶过滤来纯化。通过SDS-PAGE和免疫印迹证实了表达。scFv保留了对IL-12和IL-23的结合活性，具有与亲本IgG相似的动力学，如通过SPR证实的。

将scFv-80的编码序列亚克隆至pEGX412诱变/核糖体展示载体中，并使用Q-Beta复制酶将随机突变引入scFv序列中(Kopsidas等人，2007，BMC Biotechnology，7：18)。将所得到的编码突变scFv-80变体的DNA构建体的集合在T7RNA聚合酶反应中转录成单链mRNA，然后用于进行核糖体展示。

将IL-23的商业制剂生物素化，用于核糖体展示实验中。进行SPR实验来证实生物素化的IL-23充分结合抗生蛋白链菌素并且在结合亲和力的最小损失内保留了对scFv-80的结合。

6.1.2使用核糖体展示富集IL-23结合变体

使用体外表达系统翻译编码scFv-80变体的mRNA集合，并使用Kopsidas等人(2007)所述的核糖体展示规程来淘选所得到的scFv文库的IL-23结合剂。将系统的选择压力调节至偏向具有低解离常数(k_d)的结合剂。一旦单轮的核糖体展示过程完成，通过PCR扩增富集的scFv的编码序列，并且亚克隆至pEGX448表达载体中。将来自亚克隆的scFv集合的二十个随机克隆测序，以证实它们作为scFv-80变体的身份。将剩余的克隆进行针对IL-23的高通量筛选。

6.1.3通过核糖体展示回收的scFv-80变体的高通量筛选

将大约6500个从核糖体展示反应中回收的单个scFv表达并使用高通量SPR分析筛选对IL-23的结合。根据k_d将变体分级，并将最佳变体在核酸水平测序。该方法鉴定了22个新的scFv变体(表4)，每一个呈现出等于或优于亲本scFv-80的IL-23结合亲和力(基于k_d)。

表4：通过SPR筛选鉴定的独特scFv-80变体的序列总结

^*报道了相对于野生型scFv-80序列的所有突变。

^**这是对整个筛选实验(n＝110)建立的scFv-80的平均k_d。

^***可变区的CDR区中的突变

6.1.4独特scFv-80变体的全动力学鉴定

选择表4中呈现的多个scFv变体，用于结合动力学的完全鉴定，包括宽范围的突变特征和结合亲和力。对于每个scFv，进行了大规模的蛋白质表达。将表达的scFv作为单体蛋白质纯化，并通过SPR测试对IL-12和IL-23的结合(表5)。这些结果证实了通过核糖体展示和筛选分离的所有变体结合两个抗原，其中一些与亲本scFv-80相比，呈现出高达5倍的亲和力提高。

表5：所选scFv-80变体的全动力学鉴定

^**使用该分析形式，这些变体的k_d低于BIAcore T100的检测极限(LOD)。估算LOD为1×10^-5s^-1。

6.1.5scFv变体至IgG格式的转换

通过将V_H和V_L结构域亚克隆至单独的哺乳动物表达载体中(即，一个构建体用于抗体重链，一个用于抗体轻链)，将三个在SPR分析中显示出最高结合亲和力的scFv(AW-F2、CU-A6和CP-A6)重新格式化，用于IgG表达。通过添加人重链Fc区(SEQ ID NO：8)和恒定κ轻链区(SEQ ID NO：9)，将CU-A6转换成抗体183，CP-A6转换成抗体184，AW-F2转换成抗体207。通过将每个抗体的重链和轻链构建体共同转染至HEK 293E培养物中来表达IgG分子。通过亲和力色谱和凝胶排阻来纯化表达的IgG，并通过SPR测试所得到的单体分子对IL-12和IL-23的结合(表6)。所有三个IgG变体保留了对两种分析物的结合活性，与亲本野生型IgG相比，k_d有明显提高。基于此，合理地预期表4中所示的scFv变体可以转化成IgG格式并保留提高的对IL-12和IL-23的结合特征。

表6：重新格式化和表达为全长IgG后scFv变体的全动力学鉴定。

^*使用该分析形式，该变体的k_d低于SPR T100的检测极限(LOD)。估算LOD为1×10^-5s^-1。

6.1.6通过核糖体展示和筛选鉴定的突变的组合

通过组合上述的各种突变产生了一系列其他的scFv变体(表4)。基于a)在筛选运行中观察到的次数，b)与突变相关的scFv的亲和力，通过权重各种突变，衍生了这些scFv。使用定点诱变，将最高权重的组合(表7)添加至scFv-80。然后小规模地表达所有这些组合scFv，然后使用亲和力色谱和脱盐柱部分纯化。通过SPR，使用介质-通量分析规程和单一浓度的分析物，测试每个新的scFv对IL-12和IL-23的结合(表7)。数据显示所有这些变体保留了IL-12或IL-23的结合。在大部分情况中，新变体的解离速率至少等于亲本变体。两个突变组合(VH结构域中的T28A加上VL结构域中的S26P，VH结构域中的F29L加上VL结构域中的S26P)显示出与亲本变体相比提高的亲和力。因此，合理地预期携带表4中所列突变新组合的scFv可以结合IL-12和IL-23，具有等于或优于亲本突变体以及实际上等于或优于野生型scFv-80的亲和力。

表7：携带突变组合的scFv的单一浓度动力学分析

^*报道了相对于野生型scFv-80序列的所有突变。

^**在该分析形式中，该变体的k_d低于BIAcore T100的检测极限(LOD)。估算较低的LOD为约1×10^-5s^-1。

+突变组合引起k_d速率至少等于亲本变体。

++突变组合引起相对于亲本变体提高的k_d。

-突变显示降低的亲和力。

实施例7

7.1人源化抗体的进一步成熟

7.1.1将亲和力提高的突变引入抗体136中

基于抗体80的亲和力成熟，将重链可变区中提高对IL-12和IL-23亲和力的几个关键突变(Y59S、Y59H和F29L)引入抗体136中(抗体175、176、177、178、179、180、181、182)。表达这些并在ELISA中筛选(图20)。所有抗体显示对IL-12和IL-23的结合。

7.1.2抗体的其他组合

将在位置93含有置换(N93A)的抗体80重链的亲和力成熟变体与其相应的轻链配对(抗体199、200、201、202、203、204、205、206)(图20)。将该置换引入从而将位置93返回至人种系，其在该位置最通常含有Ala。还使用抗体136轻链表达了含有N93A置换的抗体80重链的亲和力成熟变体，以鉴定更高亲和力的变体(抗体190、191、192、193、194、195、196、197、198)(图20)。

7.2结合亲和力测定

使用SPR技术，测定了各种人源化抗体的k_a和k_d和K_D。这些亲和力列于表8中。在所有情况中，含有Y59S或Y59H置换的抗体，与抗体的框架无关，展示出对IL-12和IL-23的结合亲和力的提高。

表8：各种人源化抗体的SPR数据。

实施例8

8.1各种抗体的进一步鉴定

8.1.1竞争实验-SPR

使用SPR建立了竞争分析，以证实上述嵌合抗体和人源化抗体维持了与PMA204相同的结合特异性。在SPR实验中，在蛋白A包被的表面上捕获抗体136，引起应答单位(RU)增加，然后加载IL-12或IL-23(引起应答单位的再增加)。然后加载PMA204，但不结合表面IL-12或IL-23-抗体136复合物(图21)(应答单位没有增加)。这表明抗体136以防止PMA204结合的方式结合IL-12和IL-23并且两个抗体共享了IL-12和IL-23上的重叠表位。

在对照实验中，在蛋白A包被的表面上捕获抗体136，引起应答单位增加，并加载IL-12或IL-23(引起应答单位的再增加)。然后加载PMA202，并展示了应答单位的增加，表明与复合物的结合。PMA202和抗体1可以形成夹入IL-12或IL-23的复合物，因此表明它们在分子上的不同位置中结合IL-12或IL-23(图22)。

可以想像可以使用捕获抗体、IL-12或IL-23和竞争抗体的其他组合进行相似的竞争ELISA。

8.1.2竞争实验-ELISA

使用ELISA建立了竞争分析，以证实抗体136维持了与PMA204相同的结合特异性。将PMA204包被于ELISA平板上时，然后加入IL-12或IL-23，接着加入抗体136，没有检测到抗体136的结合(图23A)。这表明抗体136和PMA204竞争与IL-12或IL-23的结合。包被对照抗体PMA202并且加入抗体136和IL-12p40的预孵育的混合物时，检测到了抗体136的结合(图23B)。这表明抗体1和PMA202不竞争与IL-12的结合。将抗体202.1用作第一个实验的阳性结合对照(图23A)，和用作第二个实验的阴性对照(图23B)。

8.1.3受体中和分析

8.1.3.1抗体80和抗体136中和IL-12与IL-12Rβ2的结合和IL-23与IL-23R的结合

使用受体中和分析，证明抗体80和抗体136中和了IL-12与IL-12Rβ2的结合(图24A)和IL-23与IL-23R的结合(图24B)。对照抗体202.1不显示对IL-12与IL-12Rβ2结合或IL-23与IL-23R结合的抑制。

8.1.3.2抗体80和抗体136不中和IL-12或IL-23与IL-12Rβ1的结合

抗体80和抗体136不中和IL-12与IL-12Rβ1的结合(图25A)。IL-23与IL-12Rβ1的结合不受抗体80和抗体136的抑制(图25B)，而是复合物形成出现，如通过结合的IL-23的增加超过只是IL-23和单独受体的增加所证实的。对照抗体202.1抑制了IL-12和IL-23与IL-12Rβ1的结合。

实施例9

9.1通过皮内IL-23给药诱导的皮肤炎症的改善

观察到几个前导抗体能够抑制鼠脾细胞上IL-23诱导的IL-17释放后(图26)，进行了进一步的工作来设计动物模型，其中可以将人IL-23用作疾病的诱导剂。用IL-23后背皮内处理C57Bl/6J小鼠6天诱导了特征在于红斑和硬化的局部炎症应答，具有表皮增生、角化不全和局部炎症浸润的组织学证据。在开始细胞因子治疗前一天，以单次剂量测试抗体降低炎症应答的能力。从第5天开始，相对于同种型对照，接受抗体80和抗体136的两个组具有降低的临床评分，证明了抗体在该研究中的功效(图27A)。

尽管抗体136与同种型对照相比显示出朝向降低的表皮厚度的趋势，但只有抗体80引起表皮厚度的统计学显著降低(图27B)。这与临床评分很相关，其中尽管抗体136和抗体80都显著降低了由IL-23引起的红斑和硬化，但抗体80更有效。

实施例10

10.1由鼠脾细胞上嵌合IL-12诱导的IFN-γ的中和

发现了人IL-12与鼠脾细胞微弱地反应，诱导IFN-γ产生。然而，由人p40和鼠p35(SEQ ID NO：63)组成的嵌合分子能够以相似于对鼠IL-12看到的水平诱导来自鼠脾细胞的IFN-γ应答。然后将几种前导抗体(抗体号36、80、180、181、193、194、198)加入该分析中，目的在于抑制嵌合IL-12诱导鼠脾细胞上的IFN-γ应答。所有抗体在该分析中展示了中和(图28)。

10.2对正常同系繁殖的小鼠中嵌合IL-12(IL-12)应答的血清干扰素-γ(IFN-γ)的中和

用0.1mg/kg的嵌合IL-12(具有小鼠IL-12p35链的人IL-12p40链(SEQ ID NO：63))处理C57Bl/6J小鼠连续五天，诱导了强烈的血清IFN-γ应答，没有明显毒性。在5mg/kg剂量下，在细胞因子处理第一天使用单次剂量，或与细胞因子处理的同时，每隔一天三次剂量，测试抗体中和嵌合IL-12并因此消除IFNγ应答的能力。测试的两种抗体都显示出中和能力，并且5mg/kg的单次剂量的抗体80足以将血清IFN-γ降至基线可检测水平(图29)。

实施例11

11.1刺激PBMC产生IL-23：使用抗体80的诊断检测

抗IL-12和IL-23的人源化抗体可以用作诊断试剂，用于生物样品中IL-12和IL-23的检测。研发了ELISA来检测重组的人IL-23。在该分析中，将抗人p19抗体用作捕获抗体，将抗体80用作检测抗体。在该三明治ELISA形式中，抗体80能够检测重组的人IL-23(图30A)。

用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cowan 1(SAC)处理诱导了人外周血细胞(PBMC)分泌IL-23。在该三明治ELISA形式中，抗体80能够检测由SAC刺激的PBMC分泌的内源性天然人IL-23(图30B)。

实施例12

12.1通过H/D交换的表位作图

在第一个实验中，将IL-12p40上的氢与溶液中的氘交换，然后结合固定于柱上的抗体80，然后在H₂O中再交换回来，同时仍然结合抗体柱，引起表位被保护。因此，表位被氘标记。在第二个实验中，将IL-12p40结合抗体柱，然后用氘标记，然后交换回H₂O中，同时仍然结合柱子。每个实验后，使用骤然降低的低pH从柱子洗脱IL-12p40，并使其通过消化蛋白质的胃蛋白酶柱。然后将肽片段加载于LC:MS上。两个实验之间氘化水平的差异是结合抗体时交换阻滞的量度。

在该研究中，如SEQ ID NO：64中给出的来使用IL-12p40。显示出H/D交换率明显干扰的唯一区域在氨基酸253至286之间，这对应于序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO：65)，如表9中所示。

表9：在pH7和3℃下的开/关交换实验后，每个IL-12p40片段中氘化水平的百分比差异。高于10％的平均百分比差异对应于在交换反应过程中受到显著保护的区域。注意残基编号对应于SEQ ID NO：64中给出的IL-12p40。

12.2突变的IL-23与抗体80的结合的分析

基于来自H/D交换实验的结果，将靶向突变引入IL-23的鉴定区域中。为了进一步缩小需要筛选的突变的数目，在该位置将人IL-12p40与鼠IL-12p40进行比对(Uni-Prot No：P43432；http://www.uniprot.org)。

人p40 VQVQGKSKREK--------KDRVFTDKTSATVICRKNASISV

鼠p40 .RI.R.KEKM.ETEEGCNQ.GAFLVE...TE.Q.-.GGNVC

基于抗体80结合人IL-23但不结合鼠IL-23的观察，只选择两个物种之间不同的残基用于靶向突变。引入的突变概括于以下取自所列SEQ ID号的氨基酸253-297的比对中。

将每个突变体转染至HEK-293E细胞后，通过针对抗体80的SPR，筛选这些转染物的上清液。所有构建体显示出与抗体80相似的结合水平，除了突变体D265A和R266A。几个突变体的k_d明显低于IL-23野生型的，表明IL-12p40该区域中的残基负责IL-12p40与抗体80的相互作用。

在ELISA中进一步分析了D265A和R266A，其中将抗体80、抗体202.1或IL-12Rβ1和IL-23R包被在平板上，并且将整个平板的含有IL-23野生型(IL-23WT)、D265A和R266A的转染上清液进行了滴定。突变体D265A展示了与抗体80的背景水平结合(图31)，由此鉴定D265为抗体80结合的IL-12p40上的重要残基。D265A以与IL-23野生型相当的水平结合抗体202.1、IL-12Rβ1和IL-23R，表明其已经正确地折叠，并且能够功能性结合。突变体R266A展示出低水平的与IL-12Rβ1、IL-23R、抗体80和抗体202.1的结合，表明发生了突变蛋白质的错误-折叠(图31)。

表10：抗体编号和相应序列识别号的列表。除了抗体1，该表中所列的所有序列是抗体的可变区。该表中所列的所有可变区形成含有人重链IgG₁ Fc区(SEQ ID NO：8)和轻链κ恒定区(SEQ ID NO：9)的抗体的一部分。

抗体列表

方法：

在哺乳动物细胞中抗体的产生、分离和表达

杂交瘤细胞系的产生、表达和纯化

用完全弗氏佐剂中的人IL-12(Peprotech)免疫5只BALB/C小鼠，接着在第14、35和70天，用不完全弗氏佐剂中的人IL-12加强。在第74天，收集小鼠脾，并获得了小鼠脾细胞。在这些细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0 Ag-14之间进行了融合，并将细胞沉积在96-孔组织培养平板中。对96孔平板的每个孔的上清液进行了抗-IL-12、抗-IL-12p40和抗-IL-23 ELISA(参见下文)。对所有三个ELISA测试都是阳性的上清液继续进行，并通过有限稀释进行了克隆。将下游ELISA中测试为阳性的克隆培养至500mL规模，并且进行了抗体纯化(参见下文)。将从该方法纯化的抗体对1×PBS进行了透析并通过BCA

分析试剂盒(Pierce

)测定了浓度。

DNA测序

根据制造商的规程，使用TRI试剂(Sigma-Aldrich

)，从杂交瘤细胞分离RNA。使用AccuScript高保真第一链cDNA合成试剂盒(Stratagene

)，从10-200ng RNA合成cDNA，然后在以下的PCR反应中用作模板。将分别来自重链和轻链的Novagen鼠IgG引物组的引物与cDNA和Pfu II Mastermix(Stratagene)混合在一起，然后根据以下的条件，在热循环仪上(Eppendorf Mastercycler

)运行。

℃	时间	循环
			94	2分钟	1
94	30秒	30
			60	30秒	30
72	45秒	30
			94	5分钟	1

用DNA凝胶提取试剂盒(QIAgen

)将PCR产物凝胶纯化，加A标签[dATP和Taq聚合酶(Invitrogen^TM)，72℃，15分钟，将A突出物添加至PCR产物上]，连接至pGEM-T载体系统中(Promega

)并转化至TOP10感受态细胞中(Invitrogen^TM)。筛选克隆的500bp插入物。从阳性克隆分离出质粒(Miniprep，QIAgen

)并在常规测序设备上测序。然后将核苷酸序列翻译成一级氨基酸序列。

表达嵌合抗体的载体的构建

用人恒定区(人IgG1重链CH1、铰链、CH2和CH3结构域)表达VH结构域，该结构域是从杂交瘤细胞PMA202和PMA204通过DNA测序测定的。这通过将氨基酸序列回覆翻译成DNA序列来实现，使用GeneOptimizer技术将DNA序列优化，用于哺乳动物细胞表达，并且通过合成寡核苷酸的组装(GeneArt，德国)从头合成。基因合成后，将整个序列亚克隆至pTT5重链载体的多克隆位点中(Durocher等人，2000 Nucleic Acids Res 30 E9)。通过将序列亚克隆至pTT5轻链载体的多克隆位点，用人κ轻链恒定区表达通过从杂交瘤细胞PMA202和PMA204的DNA测序发现的VL氨基酸链。将所得到的PMA202鼠-人嵌合抗体指定为抗体202.1。将所得到的PMA204鼠-人嵌合抗体指定为抗体1。使用该方法产生了所有抗体，将候选蛋白质序列回覆翻译成DNA序列、优化并通过合成寡核苷酸的组装从头合成。所有抗体含有人重链Fc区和人轻链κ恒定区。然后将编码抗体可变区的所有基因克隆至用于表达的pTT5载体中。

通过瞬时转染的重组抗体的表达

为了瞬时表达所有抗体，使用了以下方法。简而言之，在完全细胞生长培养基(1L的F17培养基(Invitrogen^TM)，9mL的Pluronic F68(Invitrogen^TM)，含有20％(w/v)Tryptone NI(Organotechnie

)的2mM谷氨酰胺，含有50μl/100mL培养物的遗传霉素(50mg/mL，Invitrogen^TM))中培养HEK293E细胞。在转染前一天，通过离心收集细胞并重悬于新鲜培养基中(不含遗传霉素)。第二天，将重链和轻链DNA与FuGENE(Roche)转染试剂混合，并且将DNA转染混合物逐滴加入培养物中。将培养物在37℃、5％CO₂和120rpm，不含遗传霉素下，孵育过夜。第二天，将12.5mL胰蛋白胨和250μl遗传霉素/500mL培养物一起加入。将培养物在37℃、5％CO₂和120rpm下孵育。7天后，通过离心收集上清液，准备用于纯化。

通过亲和力色谱纯化抗体

在加载至HiTrap

蛋白A柱(5mL，GE Healthcare)之前，将源自以上转染物的上清液调节至pH7.4。用50mL 1×PBS(pH7.4)洗涤柱子。使用0.1M柠檬酸pH2.5进行洗脱。使用Zeba脱盐柱(Pierce

)将洗脱的抗体脱盐至1×PBS中(pH7.4)。使用SDS-PAGE和凝胶过滤HPLC分析了抗体的完整性。使用BCA分析试剂盒(Pierce

)测定了抗体的浓度。

抗-IL-12/23抗体的鉴定

抗-IL-12/23 ELISA

将IL-12(Peprotech)、IL-23(Ebioscience^TM)、IL-12p40(Ebioscience^TM)或IL-12p80(Peprotech)在碳酸盐包被缓冲剂中(35mM碳酸钠，15mM碳酸氢钠，pH9.6)稀释至1μg/mL，并包被在96孔平板(Nunc^TM，Maxisorp^TM)上，在4℃下过夜。然后用洗涤缓冲剂(0.01M PBS pH7.2，0.05％吐温20)将平板洗涤三次，然后用0.01M PBS pH7.2洗涤三次。然后通过将200μl封闭缓冲剂(0.01M PBSpH7.2中的1％w/v BSA)加入每个孔中并将平板在25℃下孵育1小时来封闭孔。将抗体在足以产生滴定曲线的抗体稀释液(0.01M PBS pH7.2中的1％w/v BSA，0.05％吐温20)中稀释。用抗体将孔在25℃下孵育1小时。然后按照之前所述的来洗涤平板。将抗体稀释液中1∶2000的山羊抗人免疫球蛋白G(H+L)抗体HRP缀合物(Zymed

)用于检测结合的一抗。将抗体稀释液中1∶2000的山羊抗鼠免疫球蛋白抗体HRP共轭物(Dako)用于检测结合的鼠抗体。在25℃下孵育1小时后，按照之前所述的，将平板再次洗涤。将TMB底物溶液(Zymed

)加入每个孔中，并使其产生颜色；通过将1M HCl加入每个孔中来终止反应。在450nm(ref.620nm)下测定每个孔的吸光度。

IL-12/IL-12Rβ1中和分析

将IL-12Rβ1/Fc嵌合体(R&D Systems

)在碳酸盐包被缓冲剂中稀释至1μg/mL，加入96孔平板的每个孔中，并在4℃下孵育过夜。然后用洗涤缓冲剂将平板洗涤三次，然后用0.01M PBS pH7.2洗涤三次。然后通过将200μl封闭缓冲剂加入每个孔中并将平板在25℃下孵育1小时来封闭孔。将抗体在足以产生滴定曲线的抗体稀释液中稀释。将IL-12(Peprotech)在抗体稀释液中稀释至300ng/mL。在深孔容器中用抗体将IL-12预孵育2小时。然后按照之前所述的洗涤平板，并用抗体/IL-12溶液将孔在25℃下孵育1小时。然后按照之前所述的洗涤平板，并将抗体稀释液中100μl 0.5μg/mL的生物素化抗人IL-12抗体(Peprotech)用于25℃下检测结合的抗体，持续1小时。按照之前所述的洗涤平板。将抗体稀释液中1∶1000的100μl抗生蛋白链菌素HRP(Zymed

)用于检测结合的生物素化的抗体。在25℃下孵育1小时后，按照之前所述的再次洗涤平板。将100μl TMB底物溶液(Zymed

)加入每个孔中，并使其产生颜色，持续5分钟。加入100μl 1M HCl来终止颜色产生反应，并在450nm(ref.620nm)处测定吸光度。

IL-12p80/IL-12Rβ1中和分析

按照以上对IL-12/IL-12Rβ1中和分析所述的进行了这一分析，但具有以下改变：

用IL-12p80(Peprotech)替代了IL-12。

IL-12/IL-12Rβ2中和分析

按照以上对IL-12/IL-12Rβ1中和分析所述的进行了这一分析，但具有以下改变：用IL-12Rβ2/Fc嵌合体(R&D Systems

)替代IL-12Rβ1/Fc嵌合体，并稀释至5μg/ml而不是1μg/ml。用洗涤缓冲剂将平板洗涤三次，没有额外的PBS洗涤。用生物素化IL-12(Peprotech)替代IL-12(Peprotech)。将带有抗体/IL-12溶液的孔在25℃下孵育2小时。不向孔中加入生物素化的抗人IL-12抗体。用100μl 1∶5000抗生蛋白链菌素HRP(Sigma-Aldrich

)替代100μl 1∶1000的抗生蛋白链菌素HRP(Zymed)。用100μl TMB底物溶液(Sigma-Aldrich

)替代100μl TMB底物溶液(Zymed

)。

IL-23/IL-23R中和试验

将IL-23/Fc嵌合体(R&D Systems

)在碳酸盐包被缓冲剂中稀释至1μg/mL，并加入96孔平板的每个孔中，并在4℃孵育过夜。然后用洗涤缓冲剂将平板洗涤三次，然后用0.01M PBS pH7.2洗涤三次。然后通过将200μl封闭缓冲剂加入每个孔中并将平板在25℃下孵育1小时来封闭孔。将抗体在足以产生滴定曲线的抗体稀释液中稀释。将IL-23(Ebioscience^TM)在抗体稀释液中稀释至300ng/mL。在深孔容器中用抗体将IL-23预孵育2小时。然后按照之前所述的洗涤平板，并用抗体/IL-23溶液将孔在25℃下孵育1小时。然后按照之前所述的洗涤平板，并将抗体稀释液中100μl 0.5μg/mL的生物素化抗人IL-12抗体(Peprotech)用于25℃下检测结合的抗体，持续1小时。按照之前所述的洗涤平板。将抗体稀释液中1∶1000的100μl抗生蛋白链菌素HRP(Zymed

按照以上对IL-23/IL-23R中和分析所述的还进行了这一分析，但具有以下改变：用内部产生的IL-23R-HIS替代IL-23/Fc嵌合体(R&D Systems)，所述IL-23R-HIS源自HEK-293E细胞并使用亲和力色谱纯化。用洗涤缓冲剂将平板洗涤三次，没有额外的PBS洗涤。用生物素化IL-23(Ebioscience^TM)替代IL-23(Ebioscience^TM)。在抗体稀释液中，将IL-23稀释至50ng/ml而不是300ng/ml。将带有抗体/IL-23溶液的孔在25℃下孵育2小时。不向孔中加入生物素化的抗人IL-12抗体。用100μl 1∶5000的抗生蛋白链菌素HRP(Sigma-Aldrich

)替代100μl1∶1000的抗生蛋白链菌素HRP(Zymed

)。用100μl TMB底物溶液(Sigma-Aldrich

)替代100μl TMB底物溶液(Zymed

)。使颜色产生15分钟而不是5分钟。

竞争结合实验

IL-12/23竞争ELISA

将PMA204或PMA202在碳酸盐包被缓冲剂中(35mM碳酸钠，15mM碳酸氢钠，pH9.6)稀释至1μg/mL，并包被在96孔平板(Nunc^TM，Maxisorp^TM)上，在4℃下过夜。然后用洗涤缓冲剂(0.01M PBS pH7.2，0.05％吐温20)将平板洗涤三次，然后用0.01M PBS pH7.2洗涤三次。然后通过将200μl封闭缓冲剂(0.01MPBS pH7.2中的1％w/v BSA)加入每个孔中并将平板在25℃下孵育1小时来封闭孔。将IL-12(Peprotech)或IL-12(Ebioscience^TM)在抗体稀释液(0.01M PBSpH7.2中的1％w/v BSA，0.05％吐温20)中稀释至0.5μg/ml，并将100μl加入每个孔中，接着在25℃下孵育1小时。然后按照之前所述的来洗涤平板。进行了竞争抗体的系列半对数稀释，并将100μl加入每个孔中。最终的蛋白质浓度足以产生滴定曲线。将平板在25℃下孵育1小时，然后按照之前所述的进行洗涤。将抗体稀释液中1∶2000的山羊抗人免疫球蛋白G(Fc特异性)-HRP共轭物(Sigma-Aldrich

)用于检测结合的竞争抗体。在25℃下孵育1小时后，按照之前所述的，将平板再次洗涤。对于马辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测试剂，在室温下使用100μl/孔的四甲基联苯胺(Zymed

)底物在黑暗中进行了酶反应。用100μl的1M HCl停止反应，并在450nm(ref.620nm)下测定光密度。

SPR竞争性分析

使用BIAcore 3000将蛋白A(Thermo)固定于CM5传感器芯片上。然后将HBS-P(GE Healthcare)中5μg/ml的嵌合或人源化的抗体以20μl/分钟的流速注入，持续1分钟。然后将HBS-P中5μg/mL的IL-12或IL-23以20μl/分钟的流速在表面上注入，持续1分钟。然后将HBS-P中5μg/mL的鼠抗体以20μl/分钟的流速注入，持续1分钟。还进行了对照，其中用HBS-P替代IL-12或IL-23，并且其中用HBS-P替代鼠抗体。从对照运行中减去所有数据，所述对照运行中测试了IL-12或IL-23或鼠抗体与蛋白A表面的背景结合。

表达IL-12Rβ1链的稳定转染细胞系的产生

将IL-12Rβ1的氨基酸序列回覆翻译成DNA序列，使用GeneOptimizer技术将该DNA序列优化，用于哺乳动物细胞表达，并通过合成的寡核苷酸的组装(GeneArt，德国)从头合成。将编码IL-12Rβ1的DNA序列亚克隆至pcDNADEST-40中，然后转化至Top-10化学感受态大肠杆菌细胞中。使用HiSpeedPlasmid Maxi试剂盒(QIAgen

)从细胞培养物中回收质粒DNA，并通过用ScaI(Promega

)的限制酶消化来线性化。将质粒转染至Jurkat 6E细胞(ATCC)中，并通过用IL-12Rβ1的抗受体链抗体(R&D System

)染色来测定表面表达。

结合表达IL-12Rβ1的细胞系的IL-12p40、IL-12和IL-23的检测

在37℃下用表达IL-12-Rβ1的细胞(10⁶/ml)共同孵育通过系列半对数稀释的浓度为1000至.01ng/ml的有FLAG标签的IL-12或有HIS标签的IL-23或IL-12p40，持续2小时。用藻红蛋白偶联的小鼠抗6xHIS标签的抗体(Abcam

)或FITC偶联的抗FLAG(Sigma-Aldrich

)检测细胞因子与细胞的结合。在Beckman-Coulter Quanta

上获取样品数据。

对IL-12p40、IL-12和IL-23结合表达IL-12Rβ1的细胞系的抑制的检测

在37℃下用通过系列半对数稀释的浓度范围为10至.01μg/ml的抗体共同孵育浓度为250ng/ml的有FLAG标签的IL-12或有HIS标签的IL-23或IL-12p40，持续一小时，然后加入10⁶/ml的如上所述表达IL-12Rβ1的细胞，并再孵育一小时。将细胞在PBS/10％FBS中彻底洗涤，并用藻红蛋白偶联的小鼠抗6xHIS标签抗体(Abcam

)或FITC偶联的抗FLAG抗体(Sigma-Aldrich

)检测结合细胞的细胞因子。在Beckman-Coulter Quanta上获取样品数据。

表达IL-12Rβ1的细胞表面上抗体-细胞因子复合物的检测

用如上所述表达IL-12Rβ1的细胞共同孵育浓度为250ng/ml的有FLAG标签的IL-12或有HIS标签的IL-23或IL-12p40。2小时孵育后，加入通过系列半对数稀释的浓度范围为10至.01μg/ml的抗体并再孵育一个小时。将细胞在PBS/10％FBS中彻底洗涤，并用FITC偶联的兔抗人IgG(Dako)检测结合细胞因子(所述细胞因子结合细胞)的抗体。在Beckman-Coulter Quanta

上获取样品数据。

亲和力成熟

方法

来自抗体80V_H和V_L结构域的scFv-80编码序列的组装

通过设计多肽，从抗体80产生单链抗体片段(scFv-80)(scFv-80，SEQ ID NO：27)，该多肽包含重链可变结构域(V_L)，其通过序列(Gly₄Ser)₃的15个氨基酸连接子连接轻链可变结构域(V_L)。在多肽的N和C末端(分别)确定V_H和V_L序列的方向。然后将氨基酸序列回覆翻译成DNA序列，使用GeneOptimer技术将该DNA序列优化，用于哺乳动物表达。然后通过合成寡核苷酸的组装(GeneArt)，从头合成完整的基因。最终的序列还包括5’NcoI和3’NotI位点，以促进进一步的亚克隆。

将编码scFv-80蛋白的重组基因亚克隆至pEGX412表达载体的NcoI和NotI位点中。对pEGX448进行设计，使得亚克隆至NcoI和NotI位点中的任何scFv在C-端自动融合了专有的“FLAG”亲和标签。

将scFv-80基因相似地亚克隆至pEGX412载体中，用于RNA产生、诱变和核糖体展示。该载体与Kopsidas等人(2007)所述的pEGX253质粒相同，除了pEGX412使用基因III蛋白序列，而不是pEGX253中所用的C_L序列，将scFv连接至核糖体。

RNA产生和诱变

将上述的pEGX412-scFv80构建体用于产生编码scFv-80突变变体的RNA的集合。为了实现这个目的，用SmaI将质粒线性化，并按照制造商的说明书，使用T7 RNA聚合酶试剂盒(Promega

)直接用作单链RNA(ssRNA)产生的模板。将所得到的单链RNA分子用作易错复制的模板，使用Q-Beta复制酶(Epicentre

Biotechnologies)。为了实现这个目的，将200ng RNA与33mM Tris-醋酸盐(pH7.8)、66mM醋酸钾、10mM醋酸镁、0.5mM二硫苏糖醇(DTT)、5mMrATP、5mM rUTP、10mM rCTP、10mM rGTP、0.1U/μL Q-Beta复制酶和H₂O混合，至最终20μL的体积。将反应在45℃下孵育～16小时。

Q-Beta复制酶反应产生了双链RNA(dsRNA)分子的文库，该双链RNA分子编码亲本scFv-80突变体的集合，每个突变体具有1-2个点突变。使用逆转录PCR(RT-PCR)，将dsRNA文库转化成DNA片段的集合。在形成用于最终T7 RNA聚合酶反应的模板之前，通过琼脂糖凝胶电泳和凝胶提取纯化RT-PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳测试上述所有反应的产物。

从scFv-80变体文库富集IL-23结合剂

按照Kopsidas等人(2007)所述的核糖体展示规程，从pEGX412载体表达上述scFv文库，以产生scFv-核糖体复合物，然后对IL-23进行淘选。简而言之，用生物素化的IL-23孵育scFv-核糖体复合物(其还包括编码scFv的ssRNA)至1nM的终浓度，在冰上持续24小时。然后加入选择压力，使淘选实验偏向具有低解离常数的IL-23结合剂的富集。这通过加入800倍过量的未生物素化IL-23并将淘选反应再持续5天来实现。用抗生蛋白链菌素包被的磁珠回收淘选阶段结束时仍然结合生物素化IL-23的scFv-核糖体复合物。然后用含有0.05％吐温20和5mM MgCl₂的PBS将珠子洗涤三次，并用含有5mM MgCl₂的PBS洗涤两次。最终，从回收的scFv-核糖体复合物中洗脱出ssRNA，并按照制造商的说明书，但使用8μL回收的RNA作为反应模板和以下所列的scFv特异性寡核苷酸引物，使用Superscript III一步RT-PCR系统(Invitrogen^TM)，通过RT-PCR来扩增编码的scFv集合。注意这些寡核苷酸还添加了5’NcoI和3’NotI位点，以促进亚克隆。

正向：5’-CCATGGCCCAGGTGCAGCTG-3’

反向：5’-GCGGCCGCTGTCGTACGC-3’

鉴定IL-23结合剂的高通量筛选规程

将(以上)核糖体展示实验结束时扩增的RT-PCR产物的集合亚克隆至pEGX448表达载体的NcoI和NotI位点中，转化至One-Step Competent KRX大肠杆菌中(Stratagene

)，并在固体培养基上生长。将所得到的细菌菌落单独接种于96-孔平板的200μL液体生长培养基中，将其生长至0.8的600nm OD(OD600^nm)，然后用0.5mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。在20℃下将200μL表达培养物孵育过夜，然后通过加入40μL裂解缓冲剂(2M蔗糖；0.25M TrispH7，0.2M EDTA pH8)并将平板在900RPM下搅动30分钟，用于产生粗制细菌裂解物。然后通过离心来澄清裂解物，并穿过10000分子量截留滤板(Millipore)。将该方法用于制备大约6500个scFv样品，使用以下所述的高通量SPR规程筛选所述样品的IL-23结合。

使用BIAcore A 100生物反应器(GE Healthcare)进行了高通量SPR筛选。在BIAcore A100生物反应器的四个流动池的每一个中，在点1和5(外部点)使用标准胺耦合化学，将大约10000RU的专有FLAG特异性捕获分子固定于CM5系列S传感器芯片上，将3000RU用于点2和4(内部点)。所用的运行缓冲剂是HBS-EP+(BIAcore)，并且所有相互作用在25℃下测量。将有FLAG标签的scFv的粗周质制剂(按照之前段落中所述制备)在运行缓冲剂中稀释两倍，然后以5μl/分钟流速捕获60秒。捕获了大约100RU(在外部点上)和50RU(在内部点上)有标签的scFv。2分钟稳定期后，将IL-23以30μl/分钟流速同时通过所有四个流动池的所有点，持续120秒，并监控解离200秒。将产生的传感图对每个流动池的未修饰的点3进行对照，并使用1∶1朗缪尔方程式进行适配，使用RI组至局部来说明不同配体密度，以产生k_a、k_d和KD值。

将来自SPR筛选过程的数据用于选择潜在的改进结合剂。将每个单独scFv的对IL-23的k_d与每个平板上包括的野生型scFv-80对照记录的值相比较。将具有比对照提高至少1.5倍(即，较低)k_d的任何scFv变体指定为潜在的改进结合剂。然后将这些变体中的每一个进行DNA序列分析，并将携带新氨基酸序列的任何scFv进行进一步的鉴定。

高度纯化的scFv的全动力学鉴定

将该规程用于直接从核糖体展示和筛选实验鉴定的scFv变体的全动力学鉴定。首先，将编码相关scFv的pEGX448构建体转化至HB2151大肠杆菌中。然后通过使500mL培养物生长至0.8的OD⁶⁰⁰，然后用0.5mM的IPTG诱导蛋白质表达，将重组scFv表达至细菌周质中。按照Minsky等人所述的(1986，Proc.Natl.Acad.Sci.，Vol.83，4180-4184)，通过离心收集细胞，并通过渗透休克提取周质组分。使用1mL的琼脂糖树脂柱从周质组分中纯化scFv，所述琼脂糖树脂偶联了特异性识别C-端FLAG标签的抗体。将亲和力纯化的蛋白质浓缩至200μL的终体积，并进行在PBS中平衡的Superdex 200柱(GE Healthcare)上的凝胶过滤色谱，并收集对应于单体scFv(～32kDa)的峰蛋白质组分，用于功能鉴定(参见下文)。

使用BIAcore T100生物反应器(GE Healthcare)，将纯化的scFv进行全动力学鉴定。在BIAcore T100生物传感器的流动池(FC)1和FC2(或替换地为FC3和FC4)中使用标准胺耦合化学，将大约10,000RU的专有FLAG特异性捕获分子固定于CM5系列S传感器芯片上。所用的运行缓冲剂是HBS-EP+(BIAcore)，并且在30℃或35℃下测量相互作用，以促进具有非常相似k_d值的scFv的区分。将峰纯化的有FLAG标签的scFv(按照之前段落中所述制备)在运行缓冲剂中稀释至10nM，并且以10μl/分钟的流速在FC2上捕获，以捕获50RU的scFv(通常60秒足以捕获该水平的有标签的scFv)。在合适的稳定期后，将目标物IL-12或IL-23在81nM至0.13nM(使用IL-12的五倍稀释)和81nM至1nM(使用IL-23的三倍稀释)的浓度范围下以60μl/分钟的流速通过FC1和FC2。结合的接触时间为180秒，并且对于最高的浓度，测量解离10分钟，对于系列中所有其他浓度，测量300秒。从FC1和只有缓冲剂的对照中减去来自FC2的传感图数据。使用1∶1朗缪尔方程式将曲线进行适配，以产生k_a、k_d和KD值。

通过核糖体展示和筛选鉴定的突变的组合

通过组合用核糖体展示和筛选发现的突变来产生其他scFv-80变体。重要的是注意到，由于一轮核糖体展示，没有出现这些突变组合，在所述核糖体展示中将诱变水平内在地设定为产生一个突变(平均)/scFv序列。而通过设计产生了这些组合。通过权重根据表11的每个单独的突变来选择组合。

表11：用于设计另外的scFv-80变体的突变权重策略。

突变^*	权重
		V_H：F29L	7
V_H：Y59S	3
		V_H：Y59H	3
V_H：T07A	3
		V_L：S63F	3
V_H：T28A	2
		V_H：T68S	1

V_H：Q43R	1
		V_L：I55T	1
V_L：S26P	1
		V_L：Q27R	1
V_L：S52R	1

^*报道了相对于野生型scFv-80序列的所有突变。

权重关键

^*其中使用纯化的、单体scFv蛋白测量k_d(参见表5)。

通过使用Quikchange Lightning试剂盒(Stratagene

)，根据制造商的说明书，用scFv-80作为模板的定点诱变产生了具有最高权重突变组合的编码scFv的核苷酸序列。以下列出了用于添加每个特定突变的诱变引物。全部范围的scFv列于表4X中，交叉参考氨基酸序列。

V_H突变Y59S

正义：5′-gaacggcgataccgagtccgcccccaa-3′

反义：5′-ttgggggcggactcggtatcgccgttc-3′

V_H突变Y59H

正义：5′-cggcgataccgagcacgcccccaagtt-3′

反义：5′-aacttgggggcgtgctcggtatcgccg-3′

V_H突变T28A

正义：5′-ggccagcggctacgccttcaccgacta-3′

反义：5′-tagtcggtgaaggcgtagccgctggcc-3′

V_H突变F29L

正义：5′-gccagcggctacaccctcaccgactactatc-3′

反义：5′-gatagtagtcggtgagggtgtagccgctggc-3′

V_L突变S26P

正义：5′-tgtcctgtagagccccccagagcatcagc-3′

反义：5′-gctgatgctctggggggctctacaggaca-3′

V_L突变S52R

正义：5′-gatctacttcgccagacagtccatcagcggc-3′

反义：5′-gccgctgatggactgtctggcgaagtagatc-3′

V_L突变Q27R

正义：5′-cctgtagagcctcccggagcatcagcatcaa-3′

反义：5′-ttgatgctgatgctccgggaggctctacagg-3′

注意到没有设计引物来添加重链突变Q43R或轻链突变I55T。相反，将其他突变直接引入在V_H和V_L分别已经携带R43和T55的构建体中(SEQ ID NO：230和SEQ ID NO：231)。

具有突变组合的scFv的中通量动力学分析

将该规程用于研究携带突变组合的scFv-80变体的IL-12和IL-23结合。将小规模HB2151大肠杆菌培养物用于产生部分纯化的scFv，用于中通量SPR分析(参见下文)。如上所述，将重组scFv表达至周质中，然后提取并使用抗FLAG抗体琼脂糖柱纯化。然后使用PD10脱盐柱(GE Healthcare)将scFv样品缓冲交换至PBS中，并浓缩至200μL的终体积。将该材料不进一步纯化就进行SPR分析。

使用与高度纯化scFv的完全鉴定所用的相似方法(参见上文)分析了这些具有结合的重链和轻链突变的scFv，除了使用了IL-12或IL-23的81nM的单双参照浓度，并测量解离3000s。

IgG的表面等离子共振结合实验

使用SPR3000，使用胺耦合将蛋白A固定于CM5研究级传感器芯片的FC1和FC2上(或替换地为FC3和FC4)，产生了大约2000RU。在整个实验中，将FC1用作空白。在HBS-P缓冲剂(SPR)中运行实验。在20μl/分钟的流速下，将20μl的5μg/mL的抗体通过FC2。将IL-12、IL-23或IL-12p40(Peprotech)以66nM至2nM的浓度范围通过FC1和FC2的表面。使用10mM甘氨酸，pH1.0，进行了表面的再生。从FC1和只有对照的缓冲剂中减去来自FC2的传感图数据。使用1∶1朗缪尔方程式对曲线进行适配，以产生k_d、k_a和KD值。在可能的情况中，用2.0以下的χ²来适配所有的曲线。

体外功效研究

体外鼠脾细胞分析

通过破碎和通过100μm的筛网从小鼠脾脏获得单细胞悬浮液。通过水方法裂解红血细胞，其中将细胞悬浮液离心并重悬于9ml的无菌水中。然后立即加入1ml的10×PBS，并混合。将细胞洗涤并计数，然后以10⁷细胞/ml的浓度重悬于RPMI(含有2mM 1-谷氨酰胺、100U/ml Pen/Strep，10％FBS)中。将细胞以100μl中10⁶细胞/孔植板于96-孔平底组织培养平板中。加入伴刀豆球蛋白A和rhIL-23，分别至1μg/ml和25ng/ml的终浓度。在全部样品中滴定测试抗体。典型的分析具有3-5个生物重复/测试抗体，并且起始测试抗体浓度为1-10μg/ml。每个分析平板含有具有ConA+IL-23但无抗体和单独的ConA的重复样品。将平板在37℃，5％CO₂下孵育3天，然后收集上清液，用于IL-17 ELISA。按照制造商的说明书，使用IL-17 ELISA试剂盒(R&D Systems

)分析IL-17。通过标准曲线方法来测定浓度。

NK92 IFN-γ释放分析

将NK92细胞(ATCC，CRL-2407)在RPMI 1640、2mM L-谷氨酰胺、100UPen/Strep、10％FBS，并补充了200U/ml的人IL-2(Peprotech Asia)和10ng/ml的人IL-15(Ebioscience^TM)中培养。在分析前，使细胞缺乏人IL-2和人IL-15。将抗体在足以产生滴定曲线的培养基中稀释。将IL-12(Peprotech)加入平板中，并在37℃和5％CO₂下孵育2小时。收集细胞，并加入孔中，在200μl/孔的总体积中产生1×10⁵细胞/mL的细胞浓度。将培养物在37℃和5％CO₂下孵育24小时。在孵育结束时，收集上清液，并使用Duoset ELISA人IFN-γ试剂盒(R&D System

)来检测所产生的人IFN-γ。

人PBMC IL-12诱导的IFN-γ分析

使用lymphoprep分离从人血沉棕黄层收集人PBMC，并以1×10⁷细胞/mL在培养基(50％DMEM、50％RPMI、0.045％D(+)葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、5％胎牛血清(FBS)、10mM HEPES)中培养。加入10μg/mL的PHA-P(Sigma-Aldrich

)，并在37℃和5％CO₂下孵育3天。然后加入50U/mL的人IL-2(R&D System)。将培养物在37℃和5％CO₂下孵育1天。将抗体在足以产生滴定曲线的培养基中稀释，所述滴定曲线涵盖96孔平板中10μg/mL至0.001μg/mL的范围。将1ng/mL的人IL-12(Peprotech)加入平板中，并在37℃和5％CO₂下孵育2小时。将1ng/mL的hIL-2(R&D System

)加入每个孔中。收集细胞并加入孔中，在200μl/孔的总体积中产生2×10⁵细胞/mL的细胞浓度。将培养物在37℃和5％CO₂下孵育2天。在孵育结束时，收集上清液，并使用Duoset ELISA人IFN-γ试剂盒(R&D System)来检测所产生的人IFN-γ。

由皮内给予IL-23诱发的皮肤炎症的缓解

试验性范围确定和动力学研究

在开始注射前两天，将雄性C57Bl/6J小鼠的背部测试区域脱毛，然后在背上的两个位置每日给予皮内注射PBS或rhIL-23，至总的3或10μg/小鼠/天。两个方案产生了一些炎症的迹象，但10μg/天的剂量产生了强烈的应答，具有高水平的红斑。在之后的研究中，给予小鼠10μg的rhIL-23/天，共持续10天，以确定炎症应答的全部动力学。从处理的第三天，可检测到应答，在6-7天时出现峰值，然后开始消退。

体内抗体测试

如上所述，用10μg/天的rhIL-23处理雄性C57Bl/6J小鼠，持续6天。在开始细胞因子注射前一天，给予它们10mg/kg剂量的抗体80、抗体136或同种型对照抗体的单次腹膜内注射。每日对小鼠测试区的红斑和硬化进行评分。所有处理和观察都是随机进行的。在研究终止时，从每只小鼠收集皮肤样品，并固定，用于通过标准规程进行组织学处理以及苏木精和曙红(H&E)染色。

通过晒印出每只小鼠的皮肤切片的较低放大倍数图像的纸印本，来测定表皮厚度的值。使用三条垂直线，将每个图像上的皮肤切片分成四个象限。然后在用于描绘象限的三条线的交叉点测量表皮厚度，即，每个照片三次厚度测量。然后使用每个图像上的比例尺将以mm计的实际距离转化成微米。在测量点与被认为是非代表性表皮厚度的区域(如，毛囊或汗腺)交叉的情况中，将测量点的位置调整至皮肤的邻近切片。测量通过两名独立的观察者来随机进行。

正常同系繁殖小鼠中对嵌合IL-12(IL-12)应答的血清干扰素-γ(IFN-γ)的中和

嵌合IL-12

产生了含有人IL-12p40和鼠IL-12p35的嵌合IL-12(SEQ ID NO：63)。将蛋白质回覆翻译成基因序列，优化、合成并亚克隆至pTT5载体中。在HEK-293E细胞中表达了嵌合IL-12，并通过HIS标签亲和力纯化柱来纯化。在体外测试小鼠T细胞对嵌合IL-12的应答性。将小鼠脾细胞(10⁷/ml)在补充了2mM 1-谷氨酰胺和10％胎牛血清加嵌合的重组小鼠或重组人IL-12(0-20ng/ml)的RPMI中培养过夜。收集上清液，并按照制造商的说明书，使用IFN-γELISA试剂盒(R&Dsystem

)，通过酶联免疫吸附分析(ELISA)分析IFN-γ。嵌合IL-12能够在一个浓度范围内诱导IFN-γ从小鼠脾细胞中分泌出来。除了在最高的测试浓度下，人IL-12是无活性的。

通过鼠脾细胞释放的嵌合IL-12诱导的IFN-γ的抗体抑制

通过破碎并通过100μm筛网，从小鼠脾脏获得单细胞悬浮液。通过水方法裂解红血细胞，其中将细胞悬浮液离心并重悬于9ml的无菌水中，立即加入1ml的10×PBS，并混合。将细胞洗涤并计数，然后以5×10⁶/ml的浓度重悬于RPMI+2mM1-谷氨酰胺+100U/ml pen/strep+10％FBS中。

将细胞以100μl中5×10⁵细胞/孔植板于96孔平底组织培养平板中。加入伴刀豆球蛋白A和嵌合IL-12，分别至0.5μg/ml和20ng/ml的终浓度。在全部样品中滴定测试抗体。典型的分析具有3-5个生物重复/测试抗体，并且起始测试抗体浓度为1-10μg/ml。每个分析平板含有具有ConA+IL-12但无抗体和单独的ConA的重复样品。将平板在37℃，5％CO₂下孵育24小时，然后收集上清液，用于IFN-γELISA。按照制造商的说明书，使用IFN-γELISA试剂盒(R&D Systems

)分析IFN-γ。通过标准曲线方法来测定浓度。如果背景IFN-γ产生(如从仅有ConA的样品测定的)高，将从IL-12处理的样品值中减去该背景，来获得直接归因于IL-12的IFN-γ浓度。

试验性范围确定研究

用PBS、0.03mg/kg的小鼠IL-12(IL-12)，或0.03、0.1或0.3mg/kg的嵌合IL-12通过腹膜内注射来处理雄性C57Bl/6J小鼠，持续五天。在第六天时，收集末端血样，用于血清生产。按照制造商的说明书，使用高灵敏度IFN-γELISA试剂盒(Ebioscience^TM)，测定了血清中的IFN-γ浓度。

在PBS处理的对照小鼠中没有检测到IFN-γ，但在用小鼠或嵌合IL-12处理的所有组中检测到了。嵌合IL-12处理引起了强烈的血清IFN-γ的剂量依赖性诱导。选择0.1mg/kg作为理想的剂量来测量血清IFN-γ应答的变化。

体内抗体测试

通过腹膜内注射，用0.1mg/kg的嵌合IL-12处理雄性C57Bl/6J小鼠，持续五天。在细胞因子注射第1天，给予嵌合IL-12之前30分钟，还用单次剂量的5mg/kg的抗体80或抗体136处理了它们，或在细胞因子注射的第1、3和5天，给予嵌合IL-12之前30分钟，用三次剂量的抗体80、抗体136或同种型对照处理了它们。在第六天，如上所述，收集末端血样，并测定血清IFN-γ。

刺激PBMC产生IL-23：用抗体80的诊断检测

ELISA的进行

用PBS中的0.5μg/ml的小鼠抗人IL-23p19(Ebioscience^TM)将96孔平底ELISA平板(Nunc Maxisorp)在4℃下包被过夜。洗涤平板(所有洗涤进行三次)，然后用PBS/10％FBS封闭。洗涤平板，然后加入通过半对数稀释的浓度范围为1000至0.003ng/ml的重组IL-23。将平板在室温下培养2小时。洗涤平板，然后用0.5μg/ml的抗体80检测细胞因子。将平板在室温下再孵育2hr，洗涤，然后加入小鼠吸附的辣根过氧化物酶偶联的抗人IgG(Invitrogen^TM)。在再孵育30’后，将平板洗涤六次，加入TMB底物(Sigma-Aldrich

)，并且使颜色产生5-10分钟。用1M HCl停止反应，并在450nm吸光度下阅读平板。所有洗涤在PBS+0.1％吐温中进行，使用Biotek

ELx405平板洗涤器。

刺激人PBMC产生IL-23

通过在Lymphoprep梯度(Axis-shield

)上离心，从单个血沉棕黄层获得PBMC。将它们以10⁵/孔植板于96孔平底平板中。如下制备金黄色葡萄球菌Cowan1(SAC)(Sigma-Aldrich)：从10％w/v的储液，取出合适的体积，并离心来沉淀细胞。将这些在X-Vivo 15培养基(Biowhittaker^TM)中洗涤2次，然后以起始浓度重悬，用于滴定。将系列半对数稀释的浓度范围为1％w/v至0.0001％w/v的SAC加入PBMC中。将平板培养72hr，然后收集上清液，用于ELISA。如上所述，进行了用于检测IL-23的ELISA。

H/D交换实验

使用PBS中1mg/mL的IL-12p40。使用PBS中2.0mg/mL的抗体80。根据制造商的说明书，将抗体结合POROS AL树脂(Applied Biosystems)。将mab柱填充600μL抗体80-POROS AL树脂，并储存在4℃。

用87.5％D₂O中的PBS洗涤柱子。将5μL的1mg/mL IL-12p40与35μL100％D₂O中的冰冷PBS缓冲剂(pH7.0)混合。在注入抗体柱之前，将IL-12p40混合物孵育500、1500、5000s(在单独的运行中)。用200μl冷的PBS(用H₂O)洗涤柱子。使柱子在3℃下静置250、750或2500s(在单独的运行中)。将80μL冷的0.8％甲酸注入柱子中。将另外的40μL冷的0.8％甲酸用于从抗体柱中洗脱出抗原。收集这40μL样品，并向其中加入20μL冷的2M脲、1M TCEP，pH3.0。然后将55μL注入含有胃蛋白酶的柱子，将蛋白质消化成肽，通过rpHPLC来分离，在23分钟中使用13-40％的洗脱缓冲剂梯度(95％乙腈，5％水，0.0025％TFA)。通过MS1：特征和MS2：DDA模式的质谱来分析洗脱液。使用SEQUEST软件程序(Thermo)来鉴定亲本肽离子的序列。

与以上基本上相同地进行了抗体对IL-12p40的不同部分的交换率的影响，除了以下变化：用35μL H₂O中的冰冷PBS缓冲剂(pH7.0)稀释5μL的IL-12p40，然后注入已经用H₂O中的PBS制备的柱子。结合后，用100μL H₂O中的PBS洗涤柱子。通过将200μL 87.5％D₂O中的PBS(pH7.0)通过柱子，来启动交换开启(on-exchange)反应。将柱子在3℃下在单独的运行中孵育500、1500和5000s。

突变IL-23构建体的产生

合成编码在亚基和C-端FLAG标签之间含有连接子的野生型IL-23的基因。IL-23的X-射线晶体结构分析后(例如，3D85)，选择具有暴露侧链的氨基酸用于突变成ala残基。这使用野生型IL-23基因上的定点诱变来进行。将所有基因克隆至pTT5载体中。

突变IL-23构建体的转染

在含有遗传霉素(Invitrogen^TM)的F17培养基(Invitrogen^TM)中培养HEK293E细胞，并以1×10⁶细胞/ml转染，不含遗传霉素。对于每个构建体，建立5ml转染培养物。使用OptiMEMI(Invitrogen^TM)和Fugene

HD转染试剂(Roche)来转染7.5μg DNA。在转染后那天，将胰蛋白胨(BD

)和遗传霉素加入培养物中。使培养物生长6天，并收集上清液，过滤，用于分析。

ELISA筛选突变IL-23构建体

将IL 12Rβ1/Fc嵌合体(R&D System

)、IL-23/Fc嵌合体(R&D System)、抗体202.1和抗体80在碳酸盐包被缓冲剂中稀释至1μg/mL，并加入96孔平板的每个孔中，并在4℃下孵育过夜。然后用洗涤缓冲剂将平板洗涤三次。然后通过将200μl的封闭缓冲剂加入每个孔中来封闭孔，并将平板在25℃下孵育1小时。将上清液在足以产生滴定曲线的抗体稀释液中稀释，并将100μl加入孔中，然后在25℃下孵育1小时。然后按照之前所述的洗涤平板，并将100μl在抗体稀释液中1∶1000的单克隆抗FLAGM2-HRP(Sigma-Aldrich

)用于检测结合的细胞因子。在25℃下孵育1小时后，按照之前所述的，再次洗涤平板。将100μl TMB底物溶液(Sigma-Aldrich)加入每个孔中，然后使颜色产生5分钟。加入100μl1M HCl来终止颜色产生反应，并在450nm(ref.620nm)测定吸光度。

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美国专利号5,770,222

Claims

1.一种包含抗原结合结构域的抗体，该抗原结合结构域结合人IL-12和人IL-23，其中抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的人IL-12p40，并且其中抗体抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合和人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

2.如权利要求1中所述的抗体，其中抗体与包含具有SEQ ID NO：6序列的重链可变区的抗体竞争与人IL-12和/或人IL-23的结合。

3.如权利要求1中所述的抗体，其中抗体与包含具有SEQ ID NO：7序列的轻链可变区的抗体竞争与人IL-12和/或人IL-23的结合。

4.如权利要求1中所述的抗体，其中抗体结合具有序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO：65)的人IL-12p40的一部分。

5.如权利要求1中所述的抗体，其中抗体在Asp265上特异性地结合人IL-12p40(SEQ ID NO：1)。

6.一种包含抗原结合结构域的抗体，该抗原结合结构域结合人IL-23(SEQ ID NO：66)，其中抗体与人IL-23(SEQ ID NO：66)的结合水平高于抗体与突变IL-23D265A(SEQ ID NO：75)的结合水平。

7.如权利要求6中所述的抗体，其中抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的人IL-12p40，并且其中抗体抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合和人IL-23与人IL-23R的结合，但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1的结合。

8.一种抗体，其包含3个选自以下的重链CDR序列：

HCDR1 DYYX₁H，其中：

X₁＝M或L；

HCDR2 WIDPENGDTEX₂APKFQG，其中

X₂＝Y、H或S；

HCDR3 X₃KELRYFDV，其中

X₃＝C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P或V。

9.一种抗体，其包含3个选自以下的轻链CDR序列：

LCDR1 RAX₄X₅SISINLH，其中

X₄＝S或P；

X₅＝Q或R；

LCDR2 FAX₆QSX₇S，其中

X₆＝S或R；

X₇＝I或T；

LCDR3 QQSNSX₈PLT，其中

X₈＝W或F。

10.一种抗体，其包含3个选自以下的重链CDR序列：

HCDR1 DYYX₁H，其中

X₁＝M或L；

HCDR2 WIDPENGDTEX₂APKFQG，其中

X₂＝Y、H或S；

HCDR3 X₃KELRYFDV，其中

X₃＝C、A、N、D、E、Q、G、H、I、L、P或V，

和3个选自以下的轻链CDR序列：

LCDR1 RAX₄X₅SISINLH，其中

X₄＝S或P；

X₅＝Q或R；

LCDR2 FAX₆QSX₇S，其中

X₆＝S或R；

X₇＝I或T；

LCDR3 QQSNSX₈PLT，其中

X₈＝W或F。

11.如权利要求8或权利要求10中所述的抗体，其中抗体进一步包含选自SEQ ID NO：202、SEQ ID NO：205、SEQ ID NO：208、SEQ ID NO：203、SEQ ID NO：206、SEQ ID NO：209、SEQ ID NO：204或SEQ ID NO：207的人重链受体框架序列。

12.如权利要求9或权利要求10中所述的抗体，其中抗体进一步包含选自SEQ ID NO：210、SEQ ID NO：213、SEQ ID NO：216、SEQ ID NO：211、SEQ ID NO：214、SEQ ID NO：212或SEQ ID NO：215的人轻链受体框架序列。

13.如权利要求8或权利要求9中所述的抗体，其中抗体进一步包含抗体人受体框架，该框架在关键残基处包含至少一个框架区氨基酸置换，所述关键残基选自邻近CDR的残基、糖基化位点残基、罕见的残基、能够与人IL-12的p40亚基相互作用的残基、能够与CDR相互作用的残基、规范的残基、重链可变区和轻链可变区之间的接触残基；Veriner区内的残基和Chothia限定的VH结构域CDR1与Kabat限定的第一重链框架之间重叠区域中的残基。

14.如权利要求8或权利要求9中所述的抗体，其中抗体进一步包含抗体人受体框架，该框架包含至少一个框架区氨基酸置换，其中框架的氨基酸序列与所述人受体框架的序列为至少65％相同，并包含至少70个与所述人受体框架相同的氨基酸残基。

15.如权利要求8或权利要求10中所述的抗体，其中抗体包含选自以下的免疫球蛋白重可变区：SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：144、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：145、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：152、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：153、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：155、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：156、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：157、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：158、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：159、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：134、SEQ ID NO：160、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：163、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：164、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：165、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：166、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：141或SEQ ID NO：167。

16.如权利要求9或权利要求10中所述的抗体，其中抗体包含选自以下的免疫球蛋白轻可变区：SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：169、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：170、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：194、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：171、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：195、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：172、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：196、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：173、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：197、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：174、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：198、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：175、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：199、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：176、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：200、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：177、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：201、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：178、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：192。

17.如权利要求10中所述的抗体，其中抗体包含两个免疫球蛋白可变区，其中所述两个免疫球蛋白可变区选自：

18.如权利要求1至17任一项中所述的抗体，其中抗体包含选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE或IgA的人或非人灵长类重链免疫球蛋白恒定区。

19.如权利要求1至17任一项中所述的抗体，其中抗体包含选自κ或λ的人或非人灵长类轻链免疫球蛋白恒定区。

20.如权利要求1至19任一项中所述的抗体，其中通过有机部分的共价连接来修饰抗体。

21.如权利要求20中所述的抗体，其中有机部分是直链或支链亲水性聚合基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。

22.如权利要求1至19任一项中所述的抗体，其中将抗体修饰来调节选自抗体依赖性细胞毒性、补体依赖性细胞毒性、血清半衰期、生物分布和结合Fc受体的功能性特征。

23.如权利要求22中所述的抗体，其中通过蛋白质工程、糖工程或化学方法来进行修饰。

24.一种生产如权利要求1中所述的抗体的方法，该方法包括：

I.用人IL-12p40或人IL-12p40的片段来免疫动物，以获得第一组抗体；

II.从第一组结合人IL-12和人IL-23的抗体中进行选择，以形成第二组抗体；和

III.从第二组抗体中进行选择，所述抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的p40并且抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合和人IL-23与人IL-23R的结合但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1结合。

25.如权利要求24中所述的方法，其中该方法的步骤(II)进一步包括选择还结合具有序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO：65)的肽的抗体。

26.生产如权利要求1中所述的抗体的方法，该方法包括：

I.用具有序列VQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISV(SEQ ID NO.65)的肽免疫动物，以获得第一组抗体；

27.一种生产如权利要求1中所述的抗体的方法，该方法包括：

I.筛选人抗体展示文库来选择结合人IL-12和人IL-23的抗体，以形成第一组抗体；和

II.从第一组抗体中进行选择，所述抗体结合作为单体(人IL-12p40)和作为同二聚体(人IL-12p80)存在的p40并且抑制人IL-12与人IL-12Rβ2的结合和人IL-23与人IL-23R的结合但不抑制人IL-12或人IL-23或人IL-12p40或人IL-12p80与人IL-12Rβ1结合。

28.一种核酸分子，其中核酸编码如权利要求8、10、11、15或17任一项中所述的VH结构域。

29.如权利要求28中所述的核酸分子，其中核酸分子具有选自以下的序列：

30.一种核酸分子，其中核酸编码如权利要求9、10、12、16或17任一项中所述的VL结构域。

31.如权利要求30中所述的核酸分子，其中核酸具有选自以下的序列：

32.一种治疗受试者疾病的方法，包括将如权利要求1至23任一项中所述的抗体给予受试者，其中疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、骨质丢失、气道超敏反应、慢性阻塞性肺病、脱髓鞘病症、牛皮癣、多发性硬化、皮肤超敏反应、急性和慢性移植排斥、同种异体移植排斥、移植物抗宿主病、系统性硬化、系统性红斑狼疮、自体免疫炎性肠病、泌尿系炎性病症、心血管疾病、血管炎、周期性发热、葡萄糖代谢障碍、肺病、癌症、牙周炎、肝基质角膜炎、过敏症、炎性疼痛、脊柱关节病、败血症、脓毒性或内毒素性休克、脑膜炎、外科创伤、自体免疫血液病、阿尔茨海默病、肉状瘤病、硬化、肝炎(包括自体免疫肝炎)、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、甲状腺炎、动脉粥样硬化、脱发、威尔逊氏病、肾小球性肾炎或血脂异常。

33.如权利要求1至23任一项中所述的抗体在治疗疾病中的用途，其中疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、骨质丢失、气道超敏反应、慢性阻塞性肺病、脱髓鞘病症、牛皮癣、多发性硬化、皮肤超敏反应、急性和慢性移植排斥、同种异体移植排斥、移植物抗宿主病、系统性硬化、系统性红斑狼疮、自体免疫炎性肠病、泌尿系炎性病症、心血管疾病、血管炎、周期性发热、葡萄糖代谢障碍、肺病、癌症、牙周炎、肝基质角膜炎、过敏症、炎性疼痛、脊柱关节病、败血症、脓毒性或内毒素性休克、脑膜炎、外科创伤、自体免疫血液病、阿尔茨海默病、肉状瘤病、硬化、肝炎(包括自体免疫肝炎)、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、甲状腺炎、动脉粥样硬化、脱发、威尔逊氏病、肾小球性肾炎或血脂异常。

34.如权利要求1至23任一项中所述的抗体在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中疾病选自类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎、牛皮癣关节炎、骨质丢失、气道超敏反应、慢性阻塞性肺病、脱髓鞘病症、牛皮癣、多发性硬化、皮肤超敏反应、急性和慢性移植排斥、同种异体移植排斥、移植物抗宿主病、系统性硬化、系统性红斑狼疮、自体免疫炎性肠病、泌尿系炎性病症、心血管疾病、血管炎、周期性发热、葡萄糖代谢障碍、肺病、癌症、牙周炎、肝基质角膜炎、过敏症、炎性疼痛、脊柱关节病、败血症、脓毒性或内毒素性休克、脑膜炎、外科创伤、自体免疫血液病、阿尔茨海默病、肉状瘤病、硬化、肝炎(包括自体免疫肝炎)、原发性胆汁性肝硬化、葡萄膜炎、甲状腺炎、动脉粥样硬化、脱发、威尔逊氏病、肾小球性肾炎或血脂异常。

35.生产结合人IL-12p40的抗原结合结构域的方法，该方法包括：

I.通过在包含HCDR1、HCDR2和HCDR3的亲本VH结构域的氨基酸序列中添加、删除、置换或插入一个或多个氨基酸来提供是亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，其中亲本VH结构域HCDR1、HCDR2和HCDR3是根据权利要求8的一组CDR，并任选将由此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域结合，以提供一个或多个VH/VL组合；和

II.测试所述为亲本VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域或一个或多个VH/VL组合，来鉴定人IL-12p40的抗体抗原结合结构域。

36.根据权利要求35所述的方法，其中亲本VH结构域具有权利要求15中所示的VH结构域氨基酸序列。

37.根据权利要求35所述的方法，其中通过CDR诱变提供所述VH结构域，其是亲本VH结构域的氨基酸序列变体。

38.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，其中通过在包含LCDR1、LCDR2和LCDR3的亲本VL结构域的氨基酸序列中添加、删除、置换或插入一个或多个氨基酸来提供所述一个或多个VL结构域，产生了每个为亲本VL结构域的氨基酸序列变体的一个或多个VL结构域，其中亲本VL结构域LCDR1、LCDR2和LCDR3是根据权利要求9的VL组的CDR。

39.根据权利要求38所述的方法，其中亲本VL结构域具有权利要求16中所示的VL结构域氨基酸序列。

40.根据权利要求38所述的方法，其中通过CDR诱变提供所述VL结构域，其是亲本VL结构域的氨基酸序列变体。

41.根据权利要求35至40任一项所述的方法，进一步包括产生作为IgG、scFv或Fab抗体分子成分的抗体抗原结合结构域。

42.生产结合人IL-12p40的抗原结合结构域的方法，该方法包括：

I.提供编码VH结构域的起始核酸或各自编码VH结构域的核酸起始库，其中VH结构域选自权利要求15，

II.将所述起始核酸或起始库与一个或多个编码氨基酸序列突变或通过氨基酸序列突变产生的供体核酸结合，使得所述一个或多个供体核酸插入起始核酸或起始库的VH结构域中，以提供编码VH结构域的核酸产物库；表达所述产物库的核酸，以产生产物VH结构域；

III.任选将所述产物VH结构域与一个或多个VL结构域结合；

IV.选择人IL-12p40的抗原结合结构域，

V.回收所述抗原结合结构域或编码其的核酸，其中，

抗原结合结构域包含产物VH结构域和任选的VL结构域。

43.一种生产结合人IL-12p40的抗原结合结构域的方法，该方法包括：

I.提供编码VL结构域的起始核酸或各自编码VL结构域的核酸起始库，其中VL结构域选自权利要求16，

II.将所述起始核酸或起始库与一个或多个编码氨基酸序列突变或通过氨基酸序列突变产生的供体核酸结合，使得所述一个或多个供体核酸插入起始核酸或起始库的VL结构域中，以提供编码VL结构域的核酸产物库；表达所述产物库的核酸，以产生产物VL结构域；

III.任选将所述产物VL结构域与一个或多个VH结构域结合；

IV.选择人IL-12p40的抗原结合结构域，

V.回收所述抗原结合结构域或编码其的核酸，其中抗原结合结构域包含产物VH结构域和任选的VL结构域。

44.根据权利要求42或43所述的方法，其中通过所述HCDR1和/或HCDR2和/或HCDR3的突变来产生供体核酸。

45.根据权利要求42或43所述的方法，包括通过核酸的随机突变来提供供体核酸。