TW202144425A - 特異性抗原結合分子，其製備方法及醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
特異性抗原結合分子，其製備方法及醫藥用途。具體地，涉及抗BCMA抗體、結合BCMA和CD3的雙特異抗原結合分子及其用途。進一步地，本發明涉及包含該抗BCMA抗體CDR區的嵌合抗體、人源化抗體，以及結合BCMA和CD3的雙特異抗原結合分子及其醫藥組成物，以及其作為抗癌藥物和治療自體免疫疾病的用途。尤其地，本發明涉及一種結合BCMA和CD3的雙特異抗原結合分子，及其在製備用於治療BCMA介導的疾病或病症藥物中的用途。
Description
本申請要求2020年04月17日提交的專利申請202010307360.1和2021年01月28日提交的專利申請202110119870.0的優先權。
本發明涉及生物醫藥領域，具體地，本發明涉及抗BCMA抗體、其抗原結合片段、結合BCMA和CD3的雙特異抗原結合分子，其製備方法，及其醫藥用途。
B細胞是淋巴細胞，其在體液免疫和特異性識別抗原的抗體的產生中發揮重要的作用。B細胞的三種亞類是初始B細胞、記憶B細胞和漿細胞。
VDJ重組的過程，DNA發生重組以產生抗體可變結構域的組合陣列，藉由不同譜系的B細胞編碼的可變結構域進一步改變，導致多達109種獨特B細胞譜系，產生具有特異性的抗體。
多種疾病涉及B細胞。B細胞的惡性轉化導致癌症，包括淋巴瘤(如多發性骨髓瘤和霍奇金氏淋巴瘤)。自體免疫性疾病也會涉及到B細
胞，包括系統性紅斑性狼瘡(SLE)和IgA腎病。涉及B細胞的癌症和自體免疫性疾病被認為B細胞功能異常，因此控制這類疾病的可能策略是使用靶向病理性B細胞的抗體。
BCMA(CD269或TNFRSF17)是TNF受體超家族的成員，其是對配體BAFF(B細胞啟動因子)和APRIL(增殖誘導配體)的非糖基化的內在膜受體。BCMA和它的相應配體可以調節體液免疫、B細胞發育和穩態。在脾臟、淋巴結、胸腺、腎上腺和肝臟檢測到BCMA，扁桃體記憶B細胞和生髮中心B細胞也表現BCMA。多種B細胞系的分析表明，成熟後BCMA的表現水準增加。BCMA在B細胞淋巴瘤和多發性骨髓瘤中高度表現。
當前針對BCMA的療法主要分為三大類：嵌合抗原受體T細胞療法(CAR-T)、雙特異性抗體(BsAb)以及抗體偶聯藥物(ADC)。其中GSK的ADC藥物Blenrep已於2020年8月獲美國FDA批准，成為首個獲批用於抗BCMA的免疫相關藥，但其治療存在視力損傷的不良反應，以及後期失效等缺點，使得雙特異性抗體策略成為該靶點的另一個熱門研發方向。其中，安進的雙抗AMG-420優先進入臨床後期。該抗體採用BiTE設計，穿透性好，但分子量小且半衰期短，降低了患者的依從性。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其包含：
抗體重鏈可變區，該抗體重鏈可變區包含至少1個選自以下序列所示的HCDR：
SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9；和
抗體輕鏈可變區，該抗體輕鏈可變區包含至少1個選自以下序列所述的LCDR：SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含：SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
在本發明一個具體實施方案中，提供了一種抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
i)
該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；以及
該輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3，
或ii)
該重鏈可變區包含：SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；以及
該輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3，
或iii)
該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；
該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3，
或iv)
該重鏈可變區包含：SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；以及
該輕鏈可變區包含：SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段為鼠源抗體或其抗原結合片段。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段為嵌合抗體或其抗原結合片段。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段為人抗體或其抗原結合片段。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段為人源化抗體或其抗原結合片段。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重鏈恆定區或其變體。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2、IgG4的重鏈恆定區或其變體。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1的重鏈恆定區。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1的重鏈恆定區變體。
在本發明一個具體實施方案中，其中，該人IgG1重鏈恆定區變體具有與野生IgG1重鏈恆定區相比降低的ADCC毒性。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：31的重鏈恆定區，或如SEQ ID NO：42所示的重鏈恆定區變體，或如SEQ ID NO：33所示的重鏈恆定區變體，或如SEQ ID NO：34所示的重鏈恆定區變體。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：31的重鏈恆定區或如SEQ ID NO：42所示的重鏈恆定區變體。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：42所示的重鏈恆定區變體。
在本發明一些實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人抗體κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其變體。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含源自人抗體κ鏈的輕鏈恆定區。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：32所示的輕鏈恆定區。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的重鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13；和/或，
該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含選自以下序列所示的輕鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。
在本發明一個具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段含有如下序列所示的重鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：43；和/或，
該抗BCMA抗體或其抗原結合片段含有如下序列所示的輕鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22。
在本發明一個更具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其包含：
SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：12所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：15所示的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區；或，
SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區。
在本發明一個更具體實施方案中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其包含：
SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈；或，
SEQ ID NO：18所示的重鏈和SEQ ID NO：21所示的輕鏈；或，
SEQ ID NO：19所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；或，
SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；或，
SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該重鏈可變區包含SEQ ID NO：35所示的HCDR1、SEQ ID NO：36所示的HCDR2和SEQ ID NO：37所示的HCDR3；
該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：38所示的LCDR1、SEQ ID NO：39所示的LCDR2和SEQ ID NO：40所示的LCDR3。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種抗CD3抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種抗CD3抗體的抗原結合片段，其是scFv。在具體的實施方案中，scFv如SEQ ID NO：41所示。
根據本發明的一些實施方案，提供了一種結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含：
特異性結合BCMA的第一結合區；和
特異性結合CD3的第二結合區。
在一些具體實施方案中，該第一結合區選自如前所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段。
在一些具體實施方案中，該第二結合區選自抗CD3抗體或其抗原結合片段。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重鏈恆定區或其變體。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1的重鏈恆定區。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1的重鏈恆定區變體，該人IgG1重鏈恆定區變體具有與人IgG1重鏈恆定區相比降低的ADCC毒性。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：31所示的重鏈恆定區。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：42所示的重鏈恆定區變體。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人抗體κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其變體，較佳為人抗體κ鏈的輕鏈恆定區，最佳為如SEQ ID NO：32所示的輕鏈恆定區。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：17或如SEQ ID NO：43所示的重鏈和如SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含如SEQ ID NO：43所示的重鏈和如SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中：
該抗CD3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區包含SEQ ID NO：35所示的HCDR1、SEQ ID NO：36所示的HCDR2和SEQ ID NO：37所示的HCDR3；
該抗CD3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：38所示的LCDR1、SEQ ID NO：39所示的LCDR2和SEQ ID NO：40所示的LCDR3。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗CD3抗體或其抗原結合片段含有SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第二結合區包含的重鏈可變區和輕鏈可變區藉由肽接頭連接。
該連接第二結合區的重鏈可變區和輕鏈可變區的肽接頭選自(GGGGS)n，n選自1-5的整數，較佳地，n為3。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第二結合區包含如SEQ ID NO：41所示的序列。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第二結合區的重鏈可變區的N端連接於第一結合區的輕鏈恆定區的C端。
在一些實施方案中，該第二結合區的重鏈可變區的N端藉由肽接頭連接於第一結合區的輕鏈恆定區的C端，該肽接頭選自(GGGGS)n，n選自1-5的整數，較佳地，n為3。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含特異性結合BCMA的第一結合區和特異性結合CD3的第二結合區，其中：
該第一結合區包含重鏈可變區和輕鏈可變區，
第一結合區的重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；
該第一結合區的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3，以及
該第二結合區包含重鏈可變區和輕鏈可變區，
第二結合區的重鏈可變區包含SEQ ID NO：35所示的HCDR1、SEQ ID NO：36所示的HCDR2和SEQ ID NO：37所示的HCDR3；
第二結合區的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：38所示的LCDR1、SEQ ID NO：39所示的LCDR2和SEQ ID NO：40所示的LCDR3。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中：
第一結合區包含SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區，以及
第二結合區包含SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中：
第一結合區包含如SEQ ID NO：17或如SEQ ID NO：43所示的重鏈和如SEQ ID NO：20所示的輕鏈，以及
第二結合區包含SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO；25所示的輕鏈可變區。
在本發明較佳的實施方案中，根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，第一結合區包含如SEQ ID NO：43所示的重鏈和如SEQ ID NO：20所示的輕鏈，以及第二結合區包含SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，第二結合區包含的重鏈可變區和輕鏈可變區藉由肽接頭連接，該連接第二結合區的重鏈可變區和輕鏈可變區的肽接頭選自(GGGGS)n，n選自1-5的整數(1、2、3、4、5)，較佳地，n為3。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，第二結合區的重鏈可變區的N端連接於第一結合區的輕鏈恆定區的C端；
較佳地，該第二結合區的重鏈可變區的N端藉由肽接頭連接於第一結合區的輕鏈恆定區的C端。
根據本發明的結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一結合區包含至少一個抗BCMA抗體的Fab片段，該第二結合區包含至少一個抗CD3抗體的scFv片段。
根據本發明的結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一結合區包含兩個抗BCMA抗體的Fab片段，該第二結合區包含兩個抗CD3抗體的scFv片段。
根據本發明的結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一結合區選自上述包含輕鏈和重鏈的抗BCMA抗體，該第二結合區包含兩個上述抗CD3抗體或其抗原結合片段的scFv片段。
根據本發明的結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該scFv片段的N端連接於Fab片段或連接於抗BCMA抗體的輕鏈恆定區C端；較佳地，該scFv片段的N端藉由肽接頭連接於Fab片段或連接於抗BCMA抗體的輕鏈恆定區C端。
根據本發明的結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一結合區選自包含輕鏈和重鏈的抗BCMA抗體，該第二結合區包含兩個抗CD3抗體的scFv片段。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該scFv片段的N端藉由肽接頭連接於Fab片段或抗BCMA抗體的輕鏈恆定區C端，該肽接頭選自(GGGGS)n，n選自1-5的整數，較佳地，n為3。
根據本發明的一個具體實施方案，本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段為四鏈結構，包含2條相同的第一鏈和2條相同的第二鏈，其中：
第一鏈，從N端到C端包含第一結合區的重鏈可變區和第一結合區的重鏈恆定區；
第二鏈，從N端到C端包含第一結合區的輕鏈可變區、第一結合區的輕鏈恆定區和第一肽接頭，以及第二結合區的重鏈可變區、第二肽接頭和第二結合區的輕鏈可變區。
根據本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第二鏈中第二結合區的重鏈可變區和第二結合區的輕鏈可變區選自本發明抗CD3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區，第二肽接頭選自(GGGGS)n，n選自1-5的整數，較佳地，n為3。
根據本發明的結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一結合區包含一個抗BCMA抗體的Fab片段，該第二結合區包含一個抗CD3抗體的scFv片段。
根據本發明的一個具體實施方案，本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段包含：
第一多肽，從N端到C端包含第一結合區的重鏈可變區和第一結合區的重鏈恆定區；
第二多肽，從N端到C端包含第一結合區的輕鏈可變區和第一結合區的輕鏈恆定區；
第三多肽，從N端到C端包含第二結合區的重鏈可變區、第一肽接頭、第二結合區的輕鏈可變區、第二肽接頭和第一結合區的重鏈恆定區。
根據本發明的結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，第三多肽中的第二肽接頭選自(GGGGS)n，n選自1-5的整數，較佳地，n為2。
在一些實施方案中，當肽接頭(即第一肽接頭)連接第二結合區的重鏈可變區和第二結合區的輕鏈可變區時，n為3。
在一些實施方案中，當肽接頭(即第二肽接頭)連接第二結合區的輕鏈可變區和重鏈恆定區時，n為2。
根據本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一多肽的第一結合區的重鏈可變區選自本發明抗BCMA抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區。
根據本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第二多肽的第一結合區的輕鏈可變區選自本發明抗BCMA抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區。
根據本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第三多肽的第二結合區的重鏈可變區和第二結合區的輕鏈可變區分別選自本發明抗CD3抗體或其抗原結合片段的重鏈可變區和輕鏈可變區；第一肽接頭選自(GGGGS)n，n選自1-5的整數。
根據本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一多肽中重鏈恆定區包含源自人IgG的重鏈恆定區，第三多肽中重鏈恆定區包含源自人IgG的重鏈恆定區結構域，較佳地，該IgG的重鏈恆定區結構域包含(從N至C端)鉸鏈區、CH2、和CH3。其中，人IgG選自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體，較佳為IgG1。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一多肽和第三多肽的重鏈恆定區在鉸鏈區包含一個或多個半胱胺酸殘基，以形成二硫鍵。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一多肽和第三多肽的重鏈恆定區在鉸鏈區外進一步包含一個或多個半胱胺酸殘基，以形成二硫鍵。
在一些實施方案中，半胱胺酸殘基位於選自以下的位元點或組合：349、354或等同位點。
針對抗體胺基酸的編號，存在多種不同的編號規則。可以進行編號規則的比對，以便確定等同的殘基位置。Kabat編號規則是基於相同高變區的位置而開發的。Chothia編號規則(Al-Lazikani，1997)與Kabat的方案相同，但對第一個VH CDR進行了校正。IMGT(Lefranc，2003)和AHo(Honegger和Plückthun，2001)定義了抗體和T細胞受體(TCR)的可變結構域，因此可以比較二者的等同殘基位置。
Eu編號規則的建立基於Gerald M.Edelman等人所純化得到人IgG1(命名為Eu)，Gerald M.Edelman等人測定了IgG1的胺基酸序列並對其進行編號。現有技術中，眾多工具可用於確定或比對抗體的胺基酸編號，例如但不限於ANARCI、abYsis。
在本申請的上下文中，重鏈恆定區中胺基酸位元點遵守EU編號規則，位元點349或354是指在EU編號規則下的胺基酸位元點。技術人員能夠顯而易見地確定，在等同位點上的半胱胺酸殘基也預期能夠實現相同的功能(即，在第一多肽和第三多肽之間促進二硫鍵的形成)。例如，確定抗體胺基酸位元點的編號規則還包括：Kabat、Chothia、IMGT，技術人員可以確定不同編號規則中對應的等同位元點。再比如，技術人員藉由胺基酸序列的比對分析，可以確定這樣的等同位點。
在一個具體的實施方案中，該第一多肽和第三多肽的重鏈恆定區分別包含349C和354C。
在一個具體的實施方案中，根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一多肽的重鏈恆定區包含354C，第三多肽的重鏈恆定區包含349C。
在另一些實施方案中，根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一多肽和第三多肽重鏈恆定區分別包含杵和臼結構域，臼和杵結構域相互作用促進第一多肽和第三多肽的異二聚化。
在一個具體的實施方案中，重鏈恆定區包含杵結構域，較佳為包含366或等同位點的色胺酸殘基。
在一個具體的實施方案中，重鏈恆定區包含臼結構域，較佳為包含選自以下的胺基酸殘基：366或等同位點的S，368或等同位點的A，407或等同位點的V。如前所述，技術人員能夠確定這樣的等同位點。
在一個具體的實施方案中，根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一多肽重鏈恆定區包含杵結構域，第三多肽重鏈恆定區包含臼結構域。
該重鏈恆定區的突變，其胺基酸殘基位元點根據Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的EU索引進行編號。
根據本發明結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第一多肽重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：33所示的序列，第三多肽重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：34所示的序列。
在本發明較佳的實施方案中，本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段含有SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的序列。
根據本發明較佳的實施方案，本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段為四鏈結構，包含2條(較佳為相同的)第一鏈和2條(較佳為相同的)
第二鏈，該第一鏈包含如SEQ ID NO：26所示的序列；該第二鏈包含如SEQ ID NO：27所示的序列。
在本發明一個更具體實施方案中，本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段含有SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：20所示的序列。
根據本發明的一個具體實施方案，本發明的雙特異性抗體或其抗原結合片段為三鏈抗體，該第一多肽含有如SEQ ID NO：28所示的序列，第二多肽含有如SEQ ID NO：20所示的序列，第三多肽含有如SEQ ID NO：29所示的序列
在本發明還提供了一種多核苷酸，其編碼本發明的抗BCMA抗體或其抗原結合片段、結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供了一種表現載體，其含有本發明所述的多核苷酸。
本發明還提供了一種宿主細胞，其導入或含有本發明所述的表現載體。
在本發明較佳的方案中，該宿主細胞為細菌，較佳為大腸桿菌(E.coli)。
在本發明較佳的方案中，該宿主細胞為酵母菌，較佳為畢赤酵母(P.pastoris)。
在本發明較佳的方案中，該宿主細胞為哺乳動物細胞，較佳為CHO細胞或HEK293細胞。
另一方面，本發明提供了一種生產抗BCMA抗體或其抗原結合片段、結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段的方法，包括步驟：
培養如前所述的宿主細胞；
從培養物中分離抗體；以及
對該抗體進行純化。
本發明還提供了一種醫藥組成物，其含有：
本發明所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段或結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段；以及
可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
另一方面，本發明提供了一種用途，包括本發明所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段、結合BCMA和CD3的雙特異性抗體或其抗原結合片段，或如前所述的醫藥組成物用於治療或預防BCMA介導的疾病或病症。
在本發明較佳的實施方案中，該疾病或病症為癌症；較佳為表現BCMA的癌症；更佳為淋巴瘤和骨髓瘤。
在本發明較佳的實施方案中，該疾病或病症為自體免疫疾病；較佳為紅斑性狼瘡、IgA腎病和風濕性關節炎。
本發明提供的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，能夠特異性結合BCMA抗原和表現BCMA的細胞，靶向性強。
本發明提供的雙特異性抗體能夠保持與各抗原(或表位)的親和力，體外和體內腫瘤抑制作用明顯，相較於AMG-420具有更好親和活性的同時，體內藥效延長，依從性更優。本發明的雙特異性抗體的各鏈能夠正確配對，易於表現，製備工藝簡單，性質穩定，具有良好的成藥性，臨床應用前景廣闊。
圖1：雙特異抗體的示意性模型，A：第一鏈；B：第二鏈。
圖2：雙特異抗體的示意性模型，C：第一多肽；D：第二多肽；E：第三多肽。
術語
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本檔中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
本發明所述的術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條重鏈和兩條輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中第每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恆定區，該輕鏈恆定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(V區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區(C區)。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變
區(VL)和重鏈可變區(VH)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2，和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的VL區和VH區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則和Kabat或ABM定義規則。
術語“BCMA”包括由細胞表現的BCMA的任何變體或同種型。本發明的抗體或其片段可與得自非人物種的BCMA交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人BCMA特異性的，可不與其他物種的BCMA交叉反應。BCMA或其任何變體或同種型可從天然表現它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。作為一個示例，抗BCMA抗體或其片段靶向具有糖基化修飾的人源BCMA。
“特異性結合BCMA”是指本發明的抗體或其片段識別並結合BCMA或其表位。
術語“CD3”包括由細胞表現的CD3的任何變體或同種型。本發明的抗體或其片段可與得自非人物種的CD3交叉反應。作為另一種選擇，該抗體也可以是人CD3特異性的，可不與其他物種的CD3交叉反應。CD3或其任何變體或同種型可從天然表現它們的細胞或組織中分離而得，或使用本領域通用以及本文所述的那些技術藉由重組技術產生。
“特異性結合CD3”是指本發明的抗體或其片段識別並結合CD3或其表位。
術語“重組人抗體”包括藉由重組方法製備、表現、創建或分離的人抗體，所涉及的技術和方法在本領域中是熟知的，諸如：
1.從人免疫球蛋白基因的轉基因、轉染色體動物(例如小鼠)或由其製備的融合瘤中分離的抗體；
2.從經轉化以表現抗體的宿主細胞如轉染瘤中分離的抗體；
3.從重組組合人抗體文庫中分離的抗體；以及
4.藉由將人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列等方法製備、表現、創建或分離的抗體。
此類重組人抗體包含可變區和恆定區，這些區域利用特定的由種系基因編碼的人種系免疫球蛋白序列，但也包括隨後諸如在抗體成熟過程中發生的重排和突變。
術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人BCMA或其表位的單株抗體。製備時用BCMA抗原或其片段注射試驗物件，然後分離表現具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源BCMA抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恆定區，和/或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區。
術語“人抗體”包括具有人種系免疫球蛋白序列的可變和恆定區的抗體。本發明的人抗體可包括不由人種系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(如藉由體外隨機或位點特異性誘變或藉由體內體細胞突變所引入的突變)。然而，術語“人抗體”不包括這樣的抗體，即其中已將衍生自另一種哺乳動物物種(諸如小鼠)種系的CDR序列移植到人骨架序列上(即“人源化抗體”)。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將非人物種的CDR序列移植到人的抗體可變區框架中產生的抗體。人源化抗體可以克服嵌合抗體由於攜帶大量異源蛋
白成分，從而誘導的免疫應答反應的缺點。為避免在免疫原性下降的同時引起活性的下降，可對該人抗體可變區可進行反向突變，以保持活性。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將第一物種抗體的可變區與第二物種抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕異源抗體誘發的免疫應答反應。作為一個示例，建立嵌合抗體，要選建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從小鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再依據需要選殖人抗體的恆定區基因，將小鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入人載體中，最後在真核工業系統或原核工業系統中表現嵌合抗體分子。人抗體的恆定區可選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其變體的重鏈恆定區，較佳為包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恆定區，或者使用胺基酸突變後增強ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1重鏈恆定區。
術語“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段及抗體類似物，其通常包括至少部分母體抗體(parental antibody)的抗原結合區或可變區(例如一個或多個CDR)。抗體片段保留母體抗體的至少某些結合特異性。通常，當基於莫耳來表示活性時，抗體片段保留至少10%的母體結合活性。較佳地，抗體片段保留至少20%、50%、70%、80%、90%、95%或100%或更多的母體抗體對靶標的結合親和力。抗原結合片段實例包括但不限於：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、線性抗體(linear antibody)、單鏈抗體、納米抗體、結構域抗體和多特異性抗體。工程改造的抗體變體綜述於Holliger和Hudson，2005，Nat.Biotechnol.23：1126-1136中。
“Fab片段”由一條輕鏈和一條重鏈的CH1及可變區組成。Fab分子的重鏈不能與另一個重鏈分子形成二硫鍵。
“Fc”區是含有CH2和CH3結構域的兩個重鏈片段。兩個重鏈片段由一個或多個二硫鍵保持在一起。
“Fab’片段”含有一條輕鏈和一條重鏈的一部分(其包含VH結構域、CH1結構域、以及CH1和CH2結構域之間區域)；可在兩個Fab’片段之間形成鏈間二硫鍵以形成F(ab’)2分子。
“Fv區”包含重鏈和輕鏈的可變區，但缺少恆定區。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”是由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL藉由一段連接肽連接而成的單鏈重組蛋白，它是具有完全抗原結合位點的最小抗體片段。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS(SEQ ID NO：23)胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個(包括1個、2個、3個或4個)重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc Natl Acad Sci USA.90：6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur J Immuno.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J Mol Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol Immunother.50：51-59.描述。
術語“結構域抗體片段”是僅含有重鏈可變區或輕鏈可變區鏈的具有免疫學功能的免疫球蛋白片段。在某些情況下，兩個或多個VH區與肽接頭共價連接以形成二價結構域抗體片段。二價結構域抗體片段的兩個VH區可靶向相同或不同抗原。
本發明的術語“與BCMA結合”，指能與人BCMA相互作用。
本發明的術語“抗原結合位點”指本發明抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
術語“表位”是指抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位點。表位可以由相鄰的胺基酸、或藉由蛋白質的三級折疊而並列的不相鄰的胺基酸形成。由相鄰的胺基酸形成的表位通常在暴露於變性溶劑後保持，而藉由三級折疊形成的表位通常在變性溶劑處理後喪失。表位通常以獨特的空間構象包括至少3-15個胺基酸。確定什麼表位由給定的抗體結合的方法在本領域中是熟知的，包括免疫印跡和免疫沉澱檢測分析等。確定表位的空間構象的方法包括本領域中的技術和本文所述的技術，例如X射線晶體分析法和二維核磁共振等。
本發明所用的術語“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用人BCMA作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原結合，並且其與預定抗原結合的親和力是其與預定抗原或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。術語“識別抗原的抗體”在本文中可以與術語“特異性結合的抗體”互換使用。
“雙特異性”抗體或“雙功能”抗體是具有兩個不同表位結合位點的雜交抗體。兩個表位可以來自同一抗原，或來自不同抗原。作為一個示例，兩個表位分別來自BCMA和CD3。雙特異性抗體可藉由已知的方法(包括但不限於融合瘤融合或連接Fab'片段)而產生。例如參見Songsivilai等人，Clin.Exp.Immunol.,79：315-321(1990)；Kostelny等人，J.Immunol.,148：1547-1553(1992)中公開的方法。
術語“交叉反應”是指本發明的抗體與來自不同物種的BCMA結合的能力。例如，結合人BCMA的本發明的抗體也可以結合另一物種的BCMA。交叉反應性是藉由在結合測定(例如SPR和ELISA)中檢測與純化抗
原的特異性反應性，或與生理表現BCMA的細胞的結合或功能性相互作用來測量。確定交叉反應性的方法包括如本文所述的標準結合測定，例如表面等離子體共振(SPR)分析，或流式細胞術。
術語“抑制”或“阻斷”可互換使用，並涵蓋部分和完全抑制/阻斷這兩者。配體的抑制/阻斷較佳地降低或改變無抑制或阻斷的情況下發生配體結合時出現活性的正常水準或類型。抑制和阻斷也旨在包括與抗BCMA抗體接觸時，與未與抗BCMA抗體接觸的配體相比，任何可測量的配體結合親和力降低。
術語“抑制生長”(例如涉及細胞)旨在包括細胞生長任何可測量的降低。
如此處所用，術語“EC50”或“半數最大有效濃度”是指在持續特定的暴露時間後，能夠誘導50%最大反應的分子的濃度(例如，本申請的抗體或其抗原結合片段)。用於確定EC50的方法是本領域公知的，例如可以用軟體GraphPad Prism繪製濃度-效應的擬合曲線，從而計算得出EC50。
本發明中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用，是指表現Fc受體的細胞藉由識別抗體的Fc段直接殺傷被抗體包被的靶細胞。可藉由對IgG上Fc段的修飾，增強或降低或消除抗體的ADCC效應功能。該修飾指在抗體的重鏈恆定區進行突變。
生產和純化抗體和抗原結合片段的方法在現有技術中熟知和能找到，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。如，小鼠可以用人BCMA或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用一般的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用一般方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人FR區。人
FR種系序列可以從ImMunoGeneTics(IMGT)資料庫得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001 ISBN012441351上獲得。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用一般方法製備和純化。相應抗體的cDNA序列可以選殖並重組至GS表現載體。重組的免疫球蛋白表現載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表現系統會導致抗體的糖基化，特別是在FC區的高度保守N端。藉由表現與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用一般技術純化、收集。抗體可用一般方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用一般方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
本發明的抗體指單株抗體。本發明所述的單株抗體(mAb)，指由單一的純株細胞株得到的抗體，該細胞株不限於真核的，原核的或噬菌體的純株細胞株。單株抗體或抗原結合片段可以用如融合瘤技術、重組技術、噬菌體展示技術、合成技術(如CDR-grafting)、或其它現有技術進行重組得到。
“施用”、“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組成物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“施用”、“給予”和“處理”可以指例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“施用”、“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組成物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，諸如包含本發明的任一種抗體，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個患者都有的目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
本文使用的表述“紅斑性狼瘡”是指其中免疫系統變得過度活躍並攻擊正常組織的慢性自體免疫性疾病。這種攻擊引發炎症。紅斑性狼瘡是“非器官特異”類型的自體免疫性疾病。
本文使用的表述“IgA腎病”以IgA沉積在腎小球膜細胞上為特徵。IgA腎病屬於由針對腎小球系膜細胞的免疫反應所引起的增生性腎炎。
本文使用的表述“類風濕性關節炎”是指，因免疫系統的異常而攻擊自體的關節或身體部分並引起炎症的自體免疫性疾病，表現出手、腳、腕、膝等各關節的疼痛及腫脹的症狀，還可能對肌肉、皮膚、肺、眼等器官造成異常的全身性的慢性炎症性疾病。
本文使用的表述“淋巴瘤”是指起源於淋巴造血系統的惡性腫瘤。淋巴瘤的分類按照2016 WHO Lymphoma Classification的標準進行。
本文使用的表述“骨髓瘤”(又稱漿細胞瘤)是起源於骨髓中漿細胞的惡性腫瘤。骨髓瘤的分類按照WHO(2013)Classification of Bone Tumors的標準進行。
“外源性”指根據背景在生物、細胞或人體外產生的物質。
“內源性”指根據背景在生物、細胞或人體內產生的物質。
“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同一性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同一性。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同一性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括初代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意圖指代不同的情況下，其由上下文清楚可見。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或其抗原結合片段，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
具體實施方式
以下結合實施例用於進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照一般條件，如冷泉港的抗體技術實驗手冊、分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的一般試劑。
實施例1：抗原準備
編碼帶His標籤的人BCMA(BCMA-His)蛋白由SinoBiologics公司合成(Cat No.：10620-H08H)。
BCMA-His序列：
MLQMAGQCSQNEYFDSLLHACIPCQLRCSSNTPPLTCQRYCNASVTNSVKGTNAHHHHHHHHHHH SEQ ID NO：30。
實施例2：鼠融合瘤及抗體序列的獲得
用人抗原BCMA-His進行動物免疫，共5隻Balb/c和5隻A/J小鼠，雌性，10週齡，使用Sigma完全弗氏佐劑(CFA)和Sigma不完全弗氏佐劑(IFA)、免疫原和免疫佐劑以1：1的比例充分混合乳化，製成穩定“油包水”液體；注射劑量25μg/200μL/小鼠。
表1. 免疫方案
對免疫小鼠血清使用如實施例3所述的間接ELISA法評估血清效價及結合細胞表面抗原的能力，對照效價檢測情況(大於10萬倍稀釋度)進行細胞融合。選擇血清效價、親和力和FACS結合強的免疫小鼠進行一次終免疫後處死小鼠。取脾細胞和SP2/0骨髓瘤細胞融合後，獲得融合瘤；藉由間接ELISA篩選到目標融合瘤，並藉由有限稀釋法，將細胞株建立為單株細胞株。得到的陽性抗體株進一步使用間接ELISA進行篩選，從而選定結合重組蛋白的融合瘤。收集對數生長期融合瘤細胞，用Trizol(Invitrogen,15596-018)提取RNA並反轉錄(PrimeScriptTM Reverse Transcriptase，Takara #2680A)。
將反轉錄得到的cDNA採用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)進行PCR擴增後測序，最終得到鼠源抗體M1的序列。
鼠單抗M1的重鏈和輕鏈可變區序列如下：
M1 HCVR
M1 LCVR
表2. 鼠單抗M1的重鏈和輕鏈可變區CDR序列
實施例3：抗體的體外結合活性檢測方法
1.體外間接ELISA結合實驗：
用pH7.4的PBS將BCMA His蛋白(Sino Biological Inc.，cat# 10428-H08H)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。
用含3%BSA的PBST稀釋待測抗體；以1μM起始，按照10倍的梯度進行稀釋，而獲得10個濃度梯度；以100μl/孔加到酶標板中，放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入100μl/孔用含3%BSA的PBST稀釋的HRP標記的羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔終止液(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止反應；用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析資料。做濃度-信號值曲線，以分析結果。如下表所示：
表3. 鼠抗體對人BCMA抗原的親和力(EC50值)
2.體外細胞結合實驗：
收集高表現BCMA的細胞(過表現BCMA的HEK-293T細胞和表現BCMA的腫瘤細胞，NCI-H929骨髓瘤細胞系)；調節細胞密度後，將細胞分鋪於96孔U底板，每孔1×105至2×105個細胞。以1200g離心5min，去上清；添加100μl稀釋的抗體溶液或小鼠免疫血清，4℃度孵育60min；以1200g離心5min，去上清；PBS洗細胞2次後，添加螢光標記二抗(PE-GAM或PE-GAH)100μl每孔，4℃度孵育60min。以1200g離心5min，去上清。細胞用PBS洗2次後，重新懸浮於PBS；使用流式細胞計數儀檢測信號，並作濃度曲線，以分析結果。
表4. 鼠抗體對表現BCMA的細胞的親和力(EC50值)
實施例4：小鼠抗體的人源化
如本領域許多文獻公示的方法進行鼠源抗人BCMA單株抗體的人源化。簡言之，使用人恆定結構域替代親本(鼠源抗體)恆定結構域，根據鼠源抗體和人抗體的同源性選擇人種抗體序列。本發明將鼠源抗體M1進行人源化。
在所獲得的鼠源抗體VH/VL CDR典型結構的基礎上，將重、輕鏈可變區序列與人源抗體種系資料庫比較，獲得同源性高的人種系範本。
將鼠源抗體M1的CDR區移植到選擇的人源化範本上。然後，以鼠源抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對VL和VH的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化。序列如下：
表5. CDR2區突變
表6. CDR2區突變
經表現測試和回復突變數量的對比，選擇出人源化重鏈可變區HCVR的序列，序列如下：
HCVR1
HCVR2
HCVR3
選擇出人源化輕鏈可變區LCVR的序列，序列如下：
LCVR1
LCVR2
LCVR3
將設計的重鏈和輕鏈可變區序列分別與人抗體的重鏈恆定區和輕鏈恆定區序列連接。示例性地，與人IgG1重鏈恆定區(SEQ ID NO：31)、人IgG1重鏈恆定區變體(SEQ ID NO：42)和人抗體κ鏈恆定區序列(SEQ ID NO：32)連接。示例性得到重鏈和輕鏈序列如下：
Ab1 HC
Ab2 HC
Ab3 HC
Ab1-1 HC
Ab1-2 HC
Ab1 LC
Ab2 LC
Ab3 LC
Ab1-1 LC
Ab1-2 LC
示例性的恆定區序列如下所示：
人IgG1重鏈恆定區
人IgG1重鏈恆定區變體
人抗體κ鏈恆定區
表7. 重鏈、輕鏈、可變區的序列編號
根據以上各人源化抗體的輕鏈和重鏈的胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表現載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表現載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。收取細胞培養液，離心過濾後，上樣到抗體純化親和柱，經磷酸緩衝液洗柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，得到本發明的人源化抗體。
實施例5：體外結合親和力和動力學實驗
使用實施例3的體外間接ELISA結合實驗，測定各人源化抗體對人BCMA抗原的親和力(EC50)，如下表所示：
表8. 人源化抗體對人BCMA抗原的親和力(EC50)
使用實施例3的體外細胞結合實驗，測定各人源化抗體對NCI-H929腫瘤細胞的親和力(EC50)，如下表所示：
表9. 人源化抗體對NCI-H929腫瘤細胞的親和力(EC50)
實施例6：雙特異性抗體的構建
特異性結合CD3的抗原結合片段：將如下序列所示的CD3HCVR和CD3LCVR，藉由連接序列連接成單鏈片段；連接序列是本領域內公知的接頭，示例性的接頭可以是(GGGGS)n，n選自1、2、3、4或5。
CD3 HCVR
CD3 LCVR
CD3 scFv
抗CD3抗體或其抗原結合片段的CDR序列如下：
表10. CDR序列
將特異性結合BCMA的抗原結合片段(第一結合區)與特異性結合CD3的抗原結合片段(第二結合區)藉由不同的方式連接，獲得含有如下序列的雙特異性抗體：
Ab4抗體的構建如下(排列順序從N端到C端)(結構如圖1所示)：
第一鏈，第一結合區的重鏈可變區和重鏈恆定區；
第二鏈，第一結合區的輕鏈可變區、輕鏈恆定區和肽接頭，以及第二結合區的重鏈可變區、肽接頭和輕鏈可變區。
Ab5抗體的構建如下(排列順序從N端到C端)(結構如圖2所示)：
第一多肽，從N端到C端包含第一結合區的重鏈可變區和重鏈恆定區；
第二多肽，從N端到C端包含第一結合區的輕鏈可變區和輕鏈恆定區；
第三多肽，從N端到C端包含第二結合區的重鏈可變區、肽接頭、第二結合區的輕鏈可變區、肽接頭和重鏈恆定區。
以上構建體中，肽接頭為用於連接抗原結合結構域的肽接頭，示例性的接頭序列可以是(GGGGS)n，n選自1、2、3、4或5。
以上構建體中，重鏈恆定區可以選自人抗體重鏈恆定區(如人IgG1重鏈恆定區)或其變體(如降低ADCC活性的變體)。重鏈恆定區可以為相同序列的恆定區(或恆定區結構域)，也可以為包含杵(Knob)和臼(Hole)空間結構的恆定區(或恆定區結構域)，還可以在包含Knob和Hole恆定區(或恆定區結構域)序列的基礎上，進一步引入二硫鍵以促進二聚體的形成。
本發明示例性的雙特異性抗體包含的重鏈恆定區序列如下：
CHKnob
CHHole
構建得到的雙特異性抗體的序列如下：
Ab4-1
Ab4-2
Ab5-1
Ab5-3
Ab5-2
表11. 抗體及其重鏈、輕鏈、可變區的序列編號
根據以上雙特異性抗體胺基酸序列合成cDNA片段，插入到pcDNA3.1表現載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表現載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。收取細胞培養液，離心過濾後上樣到抗體純化親和柱，經磷酸緩衝液洗柱、甘胺酸鹽酸緩衝液(pH2.7 0.1M Gly-HCl)沖提、1M Tris鹽酸pH 9.0中和、以及磷酸緩衝液透析，得到本發明的雙特異性抗體。製備得到的雙特異性抗體濃度與SEC純度如下：
表12. 雙特異性抗體的濃度與SEC純度
實施例7：體外結合親和力實驗
使用實施例3的體外間接ELISA結合實驗，測定雙特異性抗體對人BCMA抗原的親和力(EC50)，如下表13所示：
表13. 雙特異性抗體對人BCMA抗原的親和力(EC50)
用pH7.4的PBS將CD3D/CD3E異二聚體蛋白(Acrobiosystems，cat# CDD-H82W0)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔高親和力酶標板中，於4℃冰箱孵育過夜(16-20小時)。用PBST(pH7.4 PBS含0.05%Tween-20)洗板4次後，加入用PBST稀釋的3%牛血清白蛋白(BSA)封閉液150μl/孔，室溫孵育1小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次。用含3%BSA的PBST稀釋待測抗體；以1μM起始，按照10倍的梯度進行稀釋，而獲得10個濃度梯度；以100μl/孔加到酶標板中，放於室溫孵育1小時。孵育結束後用PBST洗板4次，加入
100μl/孔用含3%BSA的PBST稀釋的HRP標記的羊抗人二抗(Abcam，cat#ab97225)，室溫孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(Cell Signaling Technology，cat#7004S)，於室溫避光孵育1分鐘，加入100μl/孔終止液(Cell Signaling Technology，cat#7002S)終止反應，用酶標儀(BioTek，型號Synergy H1)在450nm處讀取吸收值，分析資料。做濃度信號值曲線，以分析結果，如下表所示：
表14. 雙特異性抗體對人CD3的親和力(EC50)
實施例8：雙特異性抗體介導的腫瘤細胞殺傷作用
雙特異性抗體的BCMA結合部分結合於表現BCMA的腫瘤細胞，CD3結合部分結合於效應T細胞表面的TCR受體，在雙特異性抗體引導下形成免疫突觸，T細胞藉由顆粒酶，穿孔素等一系列細胞因子將腫瘤細胞裂解殺死。
將凍存的PBMC於37℃水浴迅速融化，轉移細胞懸液至細胞完全培養基(90%RPMI-1640含有10%FBS，100U/100ug/mL青黴素/鏈黴素，2mM麩醯胺酸)，重新懸浮細胞，於室溫2000rpm/min離心5min，棄上清；加入新鮮完全培養基，重新懸浮細胞沉澱；計數，調整細胞密度至1.5x105/mL，利用EasySep Human T Cell Iso Kit試劑盒(Stemcell,cat#：17951)分離人總T細胞
群；於全透明96-孔U-型底板(Corning，Cat#：3799)中加入33.3μl T細胞懸液5x103細胞/孔。將NCI-H929-LUC(Cobioer貨號CBP30061L)懸浮於細胞完全培養基，計數；調整細胞密度至1.5x106/mL。加入33.3μl NCI-H929-LUC懸液5x104/孔於含有人總T細胞群實驗板內。將雙特異性抗體用完全培養基從最高濃度3000nM，5倍稀釋，9個濃度梯度。將各濃度的抗體懸液以33.3μl/孔加入實驗板中，並混勻細胞，於37℃，5% CO2培養箱內共孵育48小時後，將實驗板置於室溫平衡10分鐘；同時將分裝的ONE-GloTM Luciferase Assay(Promega，Cat#：E6120)檢測試劑以100μl/孔加入實驗板中孵育5分鐘，將細胞裂解液轉移至實驗板(Corning,Cat#：3610)中(180μl/孔)；利用酶標儀(Bio-Tek,Synergy H1)讀取信號值。
按照如下公式計算殺傷效率：
細胞殺傷效率%=(1-實驗組的信號值/對照組的信號值)×100%。
利用GraphPad Prism軟體，藉由殺傷效率值計算EC50值，如下表15所示：
表15. 雙特異性抗體介導T細胞對NCI-H929-LUC細胞的殺傷(EC50)
實施例9：雙特異性抗體介導的腫瘤殺傷
NCG小鼠是一種缺少T、B、NK免疫細胞的免疫缺陷小鼠。選取8-9週齡，體重為18-22g的NCG雌性小鼠。藉由腹腔注射，在每隻小鼠體內注入4x106人PBMC細胞。於第3天將1x107NCI-H929細胞注入小鼠背部皮下。待腫瘤體積生長至170mm3左右，將小鼠分為3組，每組8隻。藉由腹腔注射的方式按照20μg/kg體重的劑量每3天一次給予小鼠IgG1對照抗體或雙特異性抗體。14天後測量每隻小鼠的瘤體積並計算腫瘤抑制率TGI如下表。
抑瘤率TGI=100%-(第14天給藥組的腫瘤體積-第0天給藥組的腫瘤體積)/(第14天對照組的腫瘤體積-第0天對照組的腫瘤體積)×100%。
表16. 雙特異性抗體對腫瘤生長的抑制
選取8-9週齡，體重為18-22g的NCG雌性小鼠。藉由腹腔注射，在每隻小鼠體內注入5x106人PBMC細胞，同時將1x107RPMI-8226細胞注入小鼠背部皮下。待腫瘤體積生長至95mm3左右，將小鼠分為3組，每組8隻。藉由腹腔注射的方式按照20μg/kg體重的劑量每3天一次給予小鼠IgG1對照抗體或雙特異性抗體。21天後測量每隻小鼠的瘤體積並計算腫瘤抑制率TGI如下表。
抑瘤率TGI=100%-(第21天給藥組的腫瘤體積-第0天給藥組的腫瘤體積)/(第21天對照組的腫瘤體積-第0天對照組的腫瘤體積)×100%。
表17. 雙特異性抗體對腫瘤生長的抑制
實施例10：BCMA/CD3雙特異性抗體在細胞水準的親和力測試
本實施例的目的在於評價候選BCMA/CD3雙特異性抗體的BCMA結合部分對腫瘤細胞表面的BCMA抗原在親和水準方面的差異。
將處於對數生長期的NCI-H929(ATCC，ATCC® CRL-9068TM)細胞懸液以300g，離心5min；加入5ml 2%FBS緩衝液重新懸浮細胞，調整細胞密度為1x106細胞/ml。於100μL/孔均分至96孔V型底板，300g×5min，4℃離心，棄上清，於100μL/孔加入10個濃度梯度(2500nM至0.064nM，5倍稀釋梯度)稀釋的候選抗體溶液，4℃孵育1h；300g×5min，4℃離心，洗滌2次，於100μL/孔加入以5μL/106細胞比例稀釋好的山羊抗人IgG Fc，FITC標記二抗(abcam,cat：97224)溶液，4℃孵育1h；300g×5min，4℃離心，洗滌2次，加入70μl 2%FBS溶液重新懸浮細胞，於流式細胞儀(Bio-Rad，ZE5)檢測PE通道的平均螢光強度(MFI)，並作曲線分析抗體結合細胞的EC50濃度。
表18. 雙特異性抗體與細胞表面抗原的親和力
實施例11：BCMA/CD3雙特異性抗體介導的體外腫瘤細胞殺傷作用
效應細胞人總T細胞群的準備：將凍存的PBMC於37℃水浴迅速融化，轉移細胞懸液至細胞完全培養基(90%RPMI-1640含有10%FBS，100U/100μg/mL青黴素/鏈黴素，2mM L-麩醯胺酸)，重新懸浮細胞，於室溫400g/min離心5min；棄上清，加入新鮮完全培養基；重新懸浮細胞沉澱，計數，調整細胞密度至1x107/mL；利用EasySep Human T Cell Iso Kit(Stemcell,cat#：17951)按照操作說明分離人總T細胞群，細胞計數，調整細胞密度至1.2x106/mL。
製備靶細胞人RPMI-8226(ATCC，cat：CCL-155)懸液，調整細胞密度至1.2x105/mL；於全透明96-孔U-型底板(Corning，Cat#：3799)每孔分別各加入50μl兩種細胞懸浮液。將BCMA/CD3雙特異性抗體用完全培養基按照10倍稀釋，獲得9個濃度梯度(以300nM的最高濃度開始)；完全培養基作為陰性對照；加入抗體懸液50μl/孔，並混勻細胞，於37℃，5% CO2培養箱內共孵育48h後，將實驗板置於室溫平衡10min；以75μl/孔加入CellTiter-Glo®細胞活力檢測試劑(Promega，Cat#：G7573)，避光震盪裂解350rpm/min，
5min；將細胞裂解物轉移至白色底部透明實驗板(Corning,Cat#：3610)180μL/孔，210g/min離心1min，利用酶標儀(Bio-Tek,Synergy H1)讀取信號值。
按照以下公式計算殺傷效率：
細胞殺傷效率%=(1-實驗組的信號值/對照組的信號值)×100
利用GraphPad Prism軟體，針對劑量-效應抑制公式：
log(抑制劑)vs效應-變數斜率(四參數)
(log(inhibitor)vs.response--Variable slope(four parameters))
進行曲線擬合，得到IC50值。結果如下表所示。
表19. BCMA/CD3雙特異性抗體介導T細胞對RPMI-8226細胞的殺傷
<110> 上海翰森生物醫藥科技有限公司(SHANGHAI HANSOH BIOMEDICAL CO.,LTD) 江蘇豪森藥業集團有限公司(JIANGSU HANSOH PHARMACEUTICAL GROUP CO.,LTD.)
<120> 特異性抗原結合分子，其製備方法及醫藥用途
<130> 721033CPCT
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<151> 2020-04-17
<150> 202110119870.0
<151> 2021-01-28
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<213> 智人(Homo sapiens)
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<223> CH-杵(Knob)
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<221> 結構域
<223> HC
<400> 43
Claims (27)
- 一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含：特異性結合BCMA的第一結合區、和特異性結合CD3的第二結合區；該第一結合區是抗BCMA抗體或其抗原結合片段，第二結合區是抗CD3抗體或其抗原結合片段；其中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3；或，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
- 如請求項1所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含：SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：12所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：15所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區。
- 如請求項2所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重鏈恆定區或其變體，較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1的重鏈恆定區，或者人IgG1的重鏈恆定區變體，其中，該人IgG1的重鏈恆定區變體與人IgG1重鏈恆定區相比具有降低的ADCC毒性，進一步佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：31所示重鏈恆定區，或如SEQ ID NO：42所示的重鏈恆定區變體，或如SEQ ID NO：33所示的重鏈恆定區變體，或如SEQ ID NO：34所示的重鏈恆定區變體；最佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：42所示的重鏈恆定區變體；任選地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人抗體κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其變體，較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人抗體κ鏈的輕鏈恆定區；更佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：32所示的輕鏈恆定區。
- 如請求項3所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段包含：SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：18所示的重鏈和SEQ ID NO：21所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：19所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
- 如請求項1至4中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該抗CD3抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該第二結合區的重鏈可變區包含SEQ ID NO：35所示的HCDR1、SEQ ID NO：36所示的HCDR2和SEQ ID NO：37所示的HCDR3；該第二結合區的輕鏈可變區包含SEQ ID NO：38所示的LCDR1、SEQ ID NO：39所示的LCDR2和SEQ ID NO：40所示的LCDR3；較佳地，該第二結合區包含如SEQ ID NO：24所示的重鏈可變區和如SEQ ID NO：25所示的輕鏈可變區；進一步佳地，該第二結合區的重鏈可變區和輕鏈可變區藉由肽接頭連接；最佳地，該第二結合區包含如SEQ ID NO：41所示的序列。
- 如請求項5所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，該第二結合區的重鏈可變區的N端連接於第一結合區的輕鏈恆定區的C端；較佳地，該第二結合區的重鏈可變區的N端藉由肽接頭連接於第一結合區的輕鏈恆定區的C端。
- 如請求項5所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含2條第一鏈和2條第二鏈，其中，該第一鏈，從N端到C端包含第一結合區的重鏈可變區和第一結合區的重鏈恆定區；該第二鏈，從N端到C端包含第一結合區的輕鏈可變區、第一結合區的輕鏈恆定區和第一肽接頭，以及第二結合區的重鏈可變區、第二肽接頭和第二結合區的輕鏈可變區；第一肽接頭和該第二肽接頭是相同的或不同的。
- 如請求項5所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其包含：第一多肽，從N端到C端包含第一結合區的重鏈可變區和重鏈恆定區；第二多肽，從N端到C端包含第一結合區的輕鏈可變區和第一結合區的輕鏈恆定區；第三多肽，從N端到C端包含第二結合區的重鏈可變區、第一肽接頭、第二結合區的輕鏈可變區、第二肽接頭和重鏈恆定區；第一肽接頭和該第二肽接頭是相同的或不同的。
- 如請求項8所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中，該第一多肽的重鏈恆定區包含人IgG的重鏈恆定區，該第三多肽的重鏈恆定區包含人IgG的重鏈恆定區結構域，較佳地，該人IgG的重鏈恆定區結構域從N端到C端包含：鉸鏈區、CH2、和CH3；任選地，該第一多肽和該第三多肽在鉸鏈區外進一步包含一個或多個半胱胺酸殘基，較佳地，該半胱胺酸殘基位於選自以下的位元點或組合：349、354或等同位點，進一步佳地，該第一多肽和該第三多肽藉由該半胱胺酸殘基形成一個或多個二硫橋；任選地，該第一多肽和該第三多肽的重鏈恆定區分別包含杵結構域和臼結構域，較佳地，該杵結構域和臼結構域形成異二聚體，進一步較佳地，該杵結構域在以下的位點包含色胺酸殘基：366或等同位元點，該臼結構域包含以下任一項或組合：位於366或等同位點的絲胺酸殘基、位於368或等同位點的丙胺酸殘基、位於407或等同位點的纈胺酸殘基；較佳地，該第一多肽的重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：33所示的序列，較佳地，該第三多肽的重鏈恆定區包含如SEQ ID NO：34所示的序列。
- 如請求項5至8中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其中該肽接頭選自(GGGGS)n，n選自1-5的整數；較佳地，n選自2或3；進一步佳地，當該肽接頭連接第二結合區的輕鏈可變區和重鏈恆定區時，n為2；當該肽接頭連接第二結合區的重鏈可變區和第二結合區的輕鏈可變區時，n為3；當該肽接頭連接第一結合區的輕鏈恆定區和第二結合區的重鏈可變區時，n為3。
- 如請求項7所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其含有SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27所示的序列；較佳地，包含兩條SEQ ID NO：26所示多肽和兩條SEQ ID NO：27所示多肽。
- 如請求項8所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，其含有SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：20所示的序列。
- 一種抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3，或，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：7所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3，或，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：9所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3，或，該重鏈可變區包含SEQ ID NO：3所示的HCDR1、SEQ ID NO：4所示的HCDR2和SEQ ID NO：5所示的HCDR3；該輕鏈可變區包含SEQ ID NO：6所示的LCDR1、SEQ ID NO：10所示的LCDR2和SEQ ID NO：8所示的LCDR3。
- 如請求項13所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其選自鼠源抗體或其抗原結合片段，嵌合抗體或其抗原結合片段，人抗體或其抗原結合片段或者人源化抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項14所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其進一步包含人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的重鏈恆定區或其變體；較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1、IgG2、IgG4的重鏈恆定區或其變體；更佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人IgG1的重鏈恆定區，或者人IgG1的重鏈恆定區變體，其中，該人IgG1的重鏈恆定區變體與野生IgG1重鏈恆定區相比具有降低的ADCC毒性；進一步較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：31所示重鏈恆定區，或如SEQ ID NO：42所示的重鏈恆定區變體。
- 如請求項14所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其進一步包含人抗體κ鏈、λ鏈的輕鏈恆定區或其變體；較佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含人抗體κ鏈的輕鏈恆定區；更佳地，該抗BCMA抗體或其抗原結合片段進一步包含如SEQ ID NO：32所示的輕鏈恆定區。
- 如請求項14所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其包含：選自以下序列所示的重鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%，75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈可變區：SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13；和/或，選自以下序列所示的輕鏈可變區，或與以下序列相比具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈可變區：SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16。
- 如請求項17所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其含有：選自如下序列所示的重鏈或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的重鏈：SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：43；和/或，選自如下序列所示的輕鏈，或與以下序列相比具有至少80%、85%、90%、95%或99%同一性的輕鏈：SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22。
- 如請求項17所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其包含：SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：14所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：12所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：15所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：11所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區；或，SEQ ID NO：13所示的重鏈可變區和SEQ ID NO：16所示的輕鏈可變區。
- 如請求項18所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段，其包含：SEQ ID NO：17所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：18所示的重鏈和SEQ ID NO：21所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：19所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：22所示的輕鏈；或，SEQ ID NO：43所示的重鏈和SEQ ID NO：20所示的輕鏈。
- 一種多核苷酸，其編碼：如請求項1至12中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，或如請求項13至20中任一項所述的抗BCMA體或其抗原結合片段。
- 一種表現載體，其含有如請求項21所述的多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其導入有或含有：如請求項22所述的表現載體，該宿主細胞選自細菌、酵母菌或哺乳動物細胞，較佳為大腸桿菌、畢赤酵母或CHO細胞或HEK293細胞。
- 一種生產抗BCMA抗體或其抗原結合片段、雙特異性抗體或其抗原結合片段的方法，包括步驟：培養如請求項23所述的宿主細胞；從培養物中分離該抗體或其抗原結合片段；以及純化該抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組成物，其含有：如請求項1至12中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段，或，如請求項13至20中任一項所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段；以及可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
- 一種如請求項1至12中任一項所述的雙特異性抗體或其抗原結合片段、或如請求項13至20中任一項所述的抗BCMA抗體或其抗原結合片段、或如請求項25所述的醫藥組成物在用於製備治療或預防BCMA介導的疾病或病症的藥物中的用途。
- 如請求項26所述的用途，其中，該BCMA介導的疾病或病症為癌症或自體免疫疾病，較佳地，該癌症為表現BCMA的癌症，更佳為淋巴瘤和骨髓瘤；較佳地，該自體免疫疾病選自紅斑性狼瘡、IgA腎病和風濕性關節炎。
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