CN104870015B - IL-1β的结合成员 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗IL‑1β结合成员，特别是高度稳定且可溶的单价高效价IL‑1β结合抗体片段。这些结合成员可用于治疗炎症性疾病和其他疾病，以及用于诊断。还提供的是相关的核酸、载体、细胞和组合物。

Description

IL-1β的结合成员
描述
本发明涉及人源化的抗IL-1β抗体，特别是单价、高效价抗IL-1β抗体片段。本发明还涉及编码这些抗体的核酸、载体、含有这些序列的宿主细胞、包括所述抗体或核酸的药物组合物和诊断组合物及其应用。
发明背景
白细胞介素-1β(IL-1β)是由活化的巨噬细胞作为前体产生的促炎性细胞因子。经蛋白水解切割，通过其活性形式结合至IL-1 I型受体(IL-1R1)而启动信号转导，所述IL-1I型受体(IL-1R1)继而与跨膜IL-1受体辅助蛋白(IL-1RAP)结合在一起。所形成的复合体有信号转导的能力。作为炎症反应中的关键介体，该细胞因子影响许多细胞活性，如细胞增殖、分化和凋亡。因此，IL-1β被认为是众多药物的重要标靶。
本领域内存在对具有高治疗效力的抗人IL-1β抗体的需求。为了在治疗上成功，重要的是，这些抗体显示期望的生物物理学和生物化学特性。例如，由于靶IL-1β是高效的白细胞介素，其在很低的浓度时就有效，因而需要被全面阻断，故这种抗体需要是高度有效的且高度稳定和可溶的。
发明简述
在第一方面，本发明提供了针对IL-1β的单价抗体片段，其具有低于50皮摩尔(pM)的效价，所述效价通过对于抑制人IL-1β的生物学效应的半最大抑制浓度IC50而确定。
具有pM级效价值的单价抗体片段，无论是否是人源化的，都是特别的且不能常规获得。此外，与非人源化的亲本抗体相比，经人源化后抗体对标靶的亲和力通常受损。因而对于人源化抗体的挑战，是使亲和力参数接近或等于亲本抗体。这对于仅包括一条可变轻链和重链的单价抗体片段而言尤其如此，因而与显示两条轻链和重链的双价抗体相比，结合至标靶没有那么强。
此外，当将全长抗体转化为更小的片段时，其效价通常会降低。这不仅仅是由于伴随的化合价变化(例如，抗体片段可能仅是单价的，而全长免疫球蛋白是双价或多价的)，还可能是由空间原因导致的。
有效的抗体由于其允许给予患者较低的药物量，由此降低治疗的总成本而特别有用。此外，提供了更完全地中和疾病分子标靶的可行性。
此外，当施用最高效价的抗体时，可以预期在动物模型以及人类治疗中不同的施用途径。例如，对于外用药物，虽然递送可能由于上皮层的屏障功能而受限制，但是治疗的效力由透过该生理屏障的高效价的有限数量的药物分子来弥补。
通常，与更有效的药物相比，为了实现类似的药效作用，需要给予大量不太有效的药物，其转化成更高的静脉内或皮下施用量。这种更高的施用量对于在动物或人中使用是不利的，原因有两个：一是用大量的药物治疗患者不切实际，二是因为每单位质量的抗体非常昂贵。
因此，使用更少量的抗体进行治疗转化为更低的药物生产成本。特别是抗体片段适合于利用如细菌或酵母培养系统生产时，与通常用于生产全长免疫球蛋白如IgG的哺乳动物表达系统相比，其成本相对较低。将给予更少量的药物结合成本更低的制造工艺，打开了每名患者更具成本效益的药物的可能性。因此，更多的患者可以受益于这些药物。
稳定性和可溶性参数是提供可行药物的其他重要参数。抗体药物越稳定可溶，给药的体积越小且保质期越长。本文所提供的抗体是高度稳定且可溶的，即它们长时间且还以高浓度保持为单体的。
一方面，提供了抗体，特别是以上的单价抗体片段，其包括
(a)分别如SEQ ID Nos.:1、2和3所示或其变体的可变重链(VH)互补性决定区(CDR)序列CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3中的至少一种；和/或
(b)分别如SEQ ID Nos.:4、5和6所示或其变体的可变轻链(VL)CDR序列CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3中的至少一种。
在另一实施方案中，所述抗体，特别是所述的单价抗体片段，其包括
(a)分别如SEQ ID Nos.:155、156和157所示或其变体的可变重链(VH)互补性决定区(CDR)序列CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3中的至少一种；和/或
(b)可变轻链(VL)CDR序列CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3中的至少一种
(i)分别如SEQ ID Nos.:158、159和160所示或其变体，或
(ii)分别如SEQ ID Nos.:161、162和163所示或其变体。
在一些实施方案中，所述抗体包括
(a)与选自SEQ ID No.:7和SEQ ID No.:146中的序列具有至少85％一致性的VH；和/或
(b)与选自SEQ ID No.:8、SEQ ID No.:136和SEQ ID No.:145中的序列具有至少85％一致性的VL。
抗体可包括接头序列，其为SEQ ID No.:9或衍生自SEQ ID No.:9。在一些实施方案中，这种抗体是与选自SEQ ID No.:10、SEQ ID No.:73和SEQ ID No.:82中的序列具有至少85％序列一致性的抗体片段。
一方面，本发明提供了结合至IL-1β且与本文所述的抗体竞争结合的结合成员。所述结合成员可以是单价或多价的。优选的多价结合成员是二价的。多价结合成员可以是双特异性的。
一方面，本发明提供了编码本文所公开的抗体或结合成员的分离的核酸序列。
一方面，提供了包括所述核酸序列的载体。
一方面，本发明提供了包括上述核酸序列或上述载体的宿主细胞。
一方面，包括上述抗体、上述结合成员、上述核酸序列、上述载体或上述宿主细胞，以及进一步合适的载剂(carrier)、稀释剂或赋形剂的组合物。组合物优选为包括药学可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物。该药物组合物优选为适合于外用、皮肤内、经皮、静脉内、皮下、肌肉内、肠胃外、舌下、颊部、口服、鼻、鼻内、直肠、局部或眼部给予的形式。
进一步提供的是治疗IL-1β介导的疾病的方法，其包括给予有需要的受试者上述药物组合物。
还提供的是用于以下应用的上述抗体、上述结合成员、上述核酸序列、上述载体或本文公开的宿主细胞：
(i)治疗IL-1β介导的疾病；
(ii)诊断；
(iii)美容；和/或
(iv)检测目的。
在又一方面，本发明提供了生产本文所述的抗体或结合成员的方法，其包括(i)分别培养上述宿主细胞，以及回收和纯化抗体片段或所述结合成员的步骤；或者(ii)利用无细胞系统。此外或可选择地，所述方法可包括至少一个化学蛋白质合成的步骤。
附图简述
图1示出确定DLX2323与重组人(rh)IL-1β以不同浓度结合的ELISA结果。标绘的是以ng/ml给出的scFv浓度在波长450nm处的吸光度差异。方形：DLX2323；圆形：对照。
图2是描述DLX2323结合至天然人IL-1β与结合至rhIL-1β相比的结果图。天然人IL-1β源自活化的THP-1细胞上清液。标绘的是以ng/ml给出的IL-1β浓度在波长450nm处的吸光度差异。方形：rIL-1β；圆形：天然IL-1β。
图3示出在人成纤维细胞测试的两个独立实验中针对中和rhIL-1β比较DLX2323与几种可商购的IL-1β抑制剂。图3A示出DLX2323与MAB201的结果。Y-轴指示从人成纤维细胞中以pg/ml释放的IL-6；x-轴指示抗体浓度(pM)。方形：DLX2323；圆形：对照MAB201。图3B总结了DLX2323、rhIL-1受体拮抗剂(ra)和卡那单抗(canakinumab)的数据。Y-轴指示从人成纤维细胞中以pg/ml释放的IL-6；x-轴指示抗体或rhIL-1ra浓度(pM)。方形：DLX2323；圆形：卡那单抗；三角形：rhIL-1ra。
图4示出DLX2323在人IL-1β诱导的小鼠炎症模型中的体内效力。用人IL-1β和a)5mg/ml的DLX2323；b)15mg/ml的DLX2323；c)卡那单抗；d)对照scFv；或d)PBS处理之后，在血清中定量IL-6(pg/ml)。
图5示出如本文所用的CDR-H1定义。箭头指示根据Kabat定义(上面)或如本文使用(下面)的CDR-H1残基。
图6示出ELISA分析结果，其中表达于大肠杆菌细胞中的DLX2323变体的透明细胞裂解物结合至包被的rhIL-1β。标绘的是所示出的scFv蛋白样品在波长450nm处观测到的吸收差异。所分析的是在测试缓冲液中按系数1:2(灰色柱)或1:10(黑色柱)的样品稀释液。
发明详述
为了更容易理解本发明，首先定义了一些术语。除非在本说明书内另外限定，本文使用的全部技术和科学术语具有其本领域公认的含义。尽管在实施或验证本发明时可以使用相似或相当于本文所述的方法和材料，以下还是描述了合适的方法和材料。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利及其他参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书，包括定义为准。材料、方法和实例仅仅是为了阐明而非限制。
在本发明的范围内，术语“抗体”是指全长免疫球蛋白及其片段。这些全长免疫球蛋白可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、镶嵌(veneered)抗体或人抗体。
“抗体片段”包括全长免疫球蛋白的一部分，其保留了所述免疫球蛋白的靶向特异性。许多但并非所有的抗体片段至少部分缺少全长免疫球蛋白的恒定区(Fc区)。在一些实施方案中，抗体片段通过全长免疫球蛋白的降解而产生。抗体片段还可以是包括部分免疫球蛋白或免疫球蛋白链的合成或重组构建体(参见，例如HOILIGER.P.andHudson.J.Engineered antibody fragments and the rise of single domains.NatureBiotechnology 2005.vol.23.no.9.p.1126-1136)。抗体片段的实例并不限于包括：scFv、Fab、Fv、Fab'、F(ab')2片段、dAb、VHH、纳米抗体(nanobodies)、V(NAR)或最小识别单位。
“单链可变片段”、或“单链抗体”、或“scFv”是抗体片段的一种类型。scFv是包括由接头连接的免疫球蛋白VH和VL的融合蛋白。因而它们没有存在于全长免疫球蛋白中的恒定区Fc，但是保留了原始免疫球蛋白的特异性。
本文使用的“结合成员”是指全长免疫球蛋白、抗体片段、非抗体支架和/或其他结合化合物。这些结合成员可以是单价或多价的，即具有一个或多个抗原结合位点。单价结合抗原的非限制性实例包括：scFv、Fab片段、dAb、VHH、DARPin、Affilin和纳米抗体。多价结合成员可具有两个、三个、四个或更多抗原结合位点，由此可识别一个或多个不同抗原。全长免疫球蛋白、F(ab')2片段、bis-scFv和双体抗体(diabodies)是多价结合成员的非限制性实例；在所述示例性多价结合成员中，存在两个结合位点，即结合成员是双价的。
在一实施方案中，多价结合成员是双特异性的，即，结合成员针对两个不同的标靶或同一靶分子上的两个不同靶位点。双特异性抗体综述于，例如MUILER.D.andKontermann.R.E.Bispecific antibodies.DLIBEL.S.Weinheim编:Wiley-VCH.2007.ISBN3527314539.p.345-378。在另一实施方案中，多价结合成员包括多于两个，例如分别对三个或四个不同抗原的三个或四个不同的结合位点。这些结合成员是多价且多特异性的，特别是分别为三或四特异性的。
“非抗体支架”是抗原结合多肽，其描述于，例如FIELDER.M.and Skerra.A.Non-antibody scaffolds.DLIBEL.S.Weinheim编:Wiley-VCH.2007.ISBN 3527314539.p.467-500；或GILBRETH.R.N.和Koide.S.Structural insights for engineering bindingproteins based on nonantibody scaffolds.Current Opinion in Structural Biology2012.vol.22.p.413-420。非限制性实例包括：亲和体(affibodies)、Affilin分子、AdNectin、Anticalin、DARPins、Knottin、Kunitz型结构域、Avimer、四连接素(Tetranectin)、以及反体(trans-body)。
“结合化合物”是与标靶结合的化学或生物分子，其不属于以上所定义的全长免疫球蛋白、抗体片段和非抗体支架的类别。结合化合物的实例非限制性地包括：大环内酯类(GUNDLURU.M.K.et al.Design.synthesis and initial biological evaluation of anovel pladienolide analog scaffold.Medchemcomm.2011.vol.2.p.904-908；PATERSON.I.et al.Total synthesis and biological evaluation of a series ofmacrocyclic hybrids and analogies of the antimitotic natural productsdictyostatin.discodermolide and taxol.Chem Asian J.2011.vol.6.p.459-473；MORITA.H.et al.Synthesis of unnatural alkaloid scaffolds by exploiting plantpolyketide synthase.PNAS 2011.vol.108.p.13504-13509)，分子印迹聚合物(HOSHINO.Y.et al.Recognition.neutralization and clearance of target peptidesin the blood stream of living mice by molecular imprinted polymernanoparticles:a plastic antibody.Journal of the American ChemicalSociety.2010.vol.19.p.664-6645)，适体(STREHLITZ.B.,et al.Aptamers forpharmaceuticals and their application in environmentalanalytics.Bioanalytical reviews 2012.vol.4.p.1-30；YE.M.et al.GeneratingAptamers by CeIL-SELEX for Applications in Molecular Medicine.InternationalJournal of Molecular Sciences 2012.vol.13.p.3341-3353)，镜像异构体(Spiegelmers)(参见，例如MAASCH.C.et al.Polyethylenimine-Polyplexes ofSpiegelmer NOX-A50 directed against intraceILular high mobility group proteinA1(HMGA1)reduce tumor growth in vivo.JBC 2010.vol.285.p.40012-40018)，或者肽类(环形或线性；参见，例如GOULD.A.et al.Cyclotides.a novel ultrastable polypeptidescaffold for drug discovery.Curr Pharm Des.2011.vol.17.p.4294-4307)。
“IC50”或“半最大抑制浓度”是拮抗药物效力的度量，定量地描述了化合物抑制生物或生化功能的效力。该度量值表明需要多少化合物来抑制某种生物或生化过程的50％。虽然没有直接指示亲和力，但是两种值是相关的，并可通过Cheng-Prusoff方程来确定(CHENG Y.and Prusoff W.H.Relationship between the inhibition constant(Ki)andthe concentration of inhibitor which causes 50per cent inhibition(150)of anenzymatic reaction.Biochemical Pharmacology1973.vol.22.p.3099-3108；RAMMES.G.et al.Identification of a domain which affects kinetics andantagonistic potency of clozapine at 5-HT3receptors.PLOS one 2009,vol.4.p.1-14；ZHEN.J.et al.Concentration of receptor and ligand revisited in a modifiedreceptor binding protocol for high-affinity radioligands:[3H]spiperonebinding to D2 and D3 dopamine receptors.Journal of Neuroscience Methods2010.vol.188.p.32-38)。
本文使用的术语“IL-1β特异性结合”描述了，相比不包括抗IL-1β结合成员与之结合的IL-1β表位的结构上不同的抗原，具有与IL-1β结合的更高亲和力的结合成员。特异性结合通过低于1微摩尔的离解平衡常数(KD)来体现。该常数可以利用，例如Attana仪器的石英晶体微天平(QCM)法，或BIACORE仪器的表面等离子共振(SPR)技术来测定。
本文使用的“IL-1β”，是指描述于，例如DinareILo C.A.(Treating inflammationby blocking interleukin-1in a broad spectrum of diseases.Nature reviews2012.vol.11.p.633-652)中的分子。本文使用的“hIL-1β”是指人重组IL-1β。“rIL-1β”是指重组IL-1β。重组IL-1β可以有或没有氨基末端蛋氨酸残基，这取决于其制备方法。“rhIL-1β”是指重组人IL-1β。rhIL-1β可获自，例如Peprotech,USA，商品目录号200-01B。IL-1β还可以通过分离人或非人来源的样品获得。
“人源化”抗体是指包括非人亲本抗体或其变体的一个或多个，通常是全部6个CDR区的抗体，其框架为，如(i)人框架，可能包括非人亲本抗体的一个或多个框架残基，或(ii)来自非人抗体的框架，其被修饰为与天然生成的人框架相似度增加。人源化抗体的方法是本领域已知的，参见，例如LEGER.O.and Saldanha.J.Antibody Drug Discovery.WOOD.C.编，London:Imperial CoILege Press.2011.ISBN1848166281.p.1-23。
“框架”(FR)是指可变免疫球蛋白结构域可变轻链(VL)或可变重链(VH)的支架，其嵌入有各自的CDR。VL和/或VH框架通常包括在CDR区两侧的四个框架部分，FR1、FR2、FR3和FR4。因而，如本领域已知的，VL具有通式结构：(FR-L1)-(CDR-L1)-(FR-L2)-(CDR-L2)-(FR-L3)-(CDR-L3)-(FR-L4)，而VH具有通式结构：(FR-H1)-(CDR-H1)-(FR-H2)-(CDR-H2)-(FR-H3)-(CDR-H3)-(FR-H4)。
“CDR”是指抗体的高变区，其主要利于抗原结合。通常，抗原结合位点包括6个CDR，其嵌入至框架支架中。在此，VL的CDR被称为CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，而VH的CDR被称为CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3。这些可在KABAT.E.A.等(Sequences of Proteins ofImmunological Interest.第5版.U.S.DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES编.NIH出版.1991.p.91-3242)的描述中被确认。然而，本文使用的CDR-H1与Kabat定义的区别在于：其从第27位起始，在第36位之前终止(参见图5说明)。
如本文所使用，鉴别抗体的VH和VL中的氨基酸残基位点的编号体系，对应于由ONEGGER.A.和Pluckthun.A描述的“AHo”体系。免疫球蛋白可变结构域的另一编号模式是：An automatic modeILing and analysis tool.Journal of Molecular Biology2001.vol.309.p.657-670。该文献进一步提供了AHo与Kabat体系之间的转换表(KABAT.E.A..et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest.第5版.U.S.DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES编.NIH出版，1991.p.91-3242)。
“分离的”抗体或核酸是从其自然环境的至少一种组分中鉴别、分离和/或回收的抗体或核酸。
本文使用的术语“一致性”是指在两种蛋白或核酸之间的序列匹配。例如利用诸如EMBOSS Needle(成对比对；可获自www.ebi.ac.uk)的生物信息学工具，将待比较的蛋白或核酸序列进行比对以给出最大一致性。当待比较的序列中的同一位点被相同核酸碱基或氨基酸残基占居时，各自的分子在该位点是相同的。因此，“一致性百分比”是匹配位点的数目除以比较的位点数目再乘以100％的函数。例如，如果10个序列位点中有6个是相同的，则一致性是60％。两条蛋白序列之间的一致性百分比可以利用如Needleman-Wunsch算法来确定(NEEDLEMAN.S.B.and Wunsch.CD.A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequence of two proteins.Journal of MolecularBiology 1970.vol.48.p.443-453)，其利用BLOSUM62矩阵并入EMBOSS Needle中，10的“空位开放罚分”、5的“空位延伸罚分”，错的“终止空位罚分”，10的“终止空位开放罚分”，以及0.5的“终止空位延伸罚分”。不考虑任何化学和/或生物修饰，具有相同的一级氨基酸或核酸序列的两个分子是相同的。例如，根据该定义，具有相同的一级氨基酸序列但不同糖基化模式的两个抗体是相同的。对于核酸，例如，根据该定义，具有相同的序列不同连接元件的两个分子是相同的，所述连接元件如硫代磷酸盐代替磷酸盐。
“相似的”蛋白序列是那些(当比对时)共享相似的氨基酸残基，且通常(但非必须)在待比较的序列的同一位点处共享相同的氨基酸残基。相似的氨基酸残基根据侧链的化学特征归类成家族。所述家族在以下“保守氨基酸取代”中描述。序列之间的“相似性百分比”是在待比较的序列的同一序列位点处含有相同或相似残基的位点数目除以所比较的位点总数目再乘以100％。例如，如果10个序列位点中有6个具有相同的氨基酸残基，且10个位点有2个含有相似残基，则序列具有80％的相似性。两条序列之间的相似性可利用如EMBOSSNeedle来确定。
“变体”是指由于添加(包括插入)、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基或核酸碱基而与亲本序列不同，但保留了本文所公开亲本序列的至少一种期望活性的氨基酸或核酸序列。对于抗体，这种期望活性可包括特异性抗原结合。类似地，与亲本序列比较时，变体核酸序列可通过添加、缺失和/或取代一个或多个核酸碱基而被修饰，但其所编码的抗体保留了以上所述的期望活性。变体可以是天然存在的，如等位基因或剪接变体，或者可以是人工构建的。
本文使用的术语“保守修饰”是指与相应的参照在生理学、生物学、化学或功能上相似的修饰，如具有相似的大小、形状、电荷、化学特性，包括形成共价或氢键等的能力。这种保守修饰包括但不限于一个或多个核酸碱基和氨基酸取代、添加和缺失。
例如，保守氨基酸取代包括那些氨基酸残基被取代为具有相似侧链的氨基酸残基。例如，对于结合至抗原非必需的氨基酸残基可被取代为来自同一侧链家族的另一氨基酸残基，如丝氨酸可取代苏氨酸。氨基酸残基通常根据共同的相似侧链特征被划分为家族，如
1.非极性侧链(如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸)；
2.无电荷极性侧链(如，天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、色氨酸)；
3.碱性侧链(如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸)；
4.酸性侧链(如，天冬氨酸、谷氨酸)；
5.β-分支侧链(如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)；以及
6.芳香族侧链(如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
保守取代还可涉及使用非天然氨基酸。
非保守取代，即将一个家族的成员与另一家族的成员进行交换，可能会引起实质变化，如关于电荷、偶极矩、大小、亲水性、疏水性或结合成员的构象，这可引起结合活性的显著下降，特别是如果受影响的氨基酸对于结合至靶分子是必需的。非保守取代还可涉及使用非天然氨基酸。
可将保守和非保守修饰通过各种本领域内已知的标准技术引入至亲本结合成员，如组合化学，定点DNA诱变，PCR-介导的和/或盒诱变，肽/蛋白化学合成，特异性修饰亲本结合成员的反应基团的化学反应。变体可通过常规方法检测其化学、生物学、生物物理学和/或生化特性。
可在不同的严紧性条件下进行核酸杂交反应。“严紧性条件”是公知的且在本领域内已公开。一般，杂交反应期间，可使用基于SSC的缓冲液，其中SSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸盐的缓冲液，具有pH 7.0。增加缓冲液浓度和变性剂的存在增强了杂交步骤的严紧性。例如，高严紧性杂交条件可包括使用(i)50％(vol/vol)甲酰胺、5x SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1％焦磷酸钠、5x Denhardt's溶液、超声粉碎的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS以及10％硫酸葡聚糖，于42℃，于42℃在0.2x SSC和0.1％SDS中冲洗；(ii)50％(vol/vol)甲酰胺，具有0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖(FicoIL)/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.5)，具有750mM氯化钠、75mM柠檬酸钠，于42℃，或(iii)10％硫酸葡聚糖、2x SSC以及50％甲酰胺，于55℃，之后于55℃由含EDTA的0.1x SSC组成的高严紧性冲洗液。另外或可选择地，使用低离子强度和高温的冲洗液的一个、两个或更多冲洗步骤可被包括于杂交方案中，于50℃利用例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠。
本发明的不同方面在以下部分进一步详细描述。可理解的是，不同实施方案，优选和范围可任意组合。进一步地，根据具体实施方案，可不应用所选择的定义、实施方案或范围。
第一方面，本发明提供了结合IL-1β的单价抗体片段，其抑制人IL-1β的生物学效应，具有低于50pM的IC50。所述IC50优选低于约40pM，更优选低于约30、20、10、5、4、3、2或1pM。
优选地，所述单价抗体片段具有的分子量约50kDa或更低，如约45kDa、40kDa、35kDa或更低，优选约25kDa，如23、24、25、26、或27kDa。
一方面，本发明提供了抗体，其包括：
(a)分别如SEQ ID Nos.:1、2和3所示或其变体的VH CDR序列CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3中的至少一种；和/或
(b)分别如SEQ ID Nos.:4、5和6所示或其变体的VL CDR序列CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3中的至少一种。
该抗体可包括：
(a)分别如SEQ ID Nos.:155、156和157所示或其变体的VH CDR序列CDR-H1、CDR-H2或CDR-H3中的至少一种；和/或
(b)以下VL CDR序列CDR-L1、CDR-L2或CDR-L3中的至少一种：
(i)分别如SEQ ID Nos.:158、159和160所示或其变体，或
(ii)分别如SEQ ID Nos.:161、162和163所示或其变体。
优选地，所述抗体分别包括至少SEQ ID No.:3的CDR-H3和SEQ ID No.:6或SEQ IDNo.:157或其变体的CDR-L3。甚至更优选地，所述抗体包括以下的全部6种CDR：
(i)SEQ ID Nos.:1至6或其变体；
(ii)SEQ ID Nos.:155至160或其变体；或
(iii)SEQ ID Nos.:155至157和SEQ ID Nos.:161至163或其变体。
这些抗体对人IL-1β具有非常高的抑制性效价，具有的IC50低于50pM，更优选低于约40pM、30、20、10，甚至更优选低5pM，并且最优选约1pM及更低。
优选地，抗体对人IL-1β具有的抑制性效价，具有的IC50至少2pM，更优选至少1pM。
IC50，例如可利用基于细胞的效价测试来确定。在一实施方案中，以上的IC50值通过抑制IL-1β诱导的从人成纤维细胞释放IL-6来测定。这些测试是基于这样的观测：用IL-1β刺激的成纤维细胞释放IL-6。存在抑制IL-1β的抗体时，所释放的IL-6浓度降低。在优选实施方案中，使用正常的人真皮成纤维细胞(NHDF-Neo，如可获自Lonza WalkersviILe USA,商品目录号CC-2509)。用hIL-1β和目标抗体混合物孵育后，采集上清液并通过IL-6ELISA如R&D Systems Human IL-6DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,商品目录号DY206)检测。在一实施方案中，所述测试为如实施例3所述的IL-1β中和测试。优选地，IC50值是获自这些实验的至少三个独立重复的平均值。
本文所述的抗体可以是全长免疫球蛋白或抗体片段，如Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、Fv片段、纳米抗体、VHH或最小识别单位。
在优选实施方案中，抗体，特别是上述的单价抗体片段为scFv。VH和VL结构域可通过柔性接头在任意方向相连接，VL-接头-VH或VH-接头-VL。在优选的实施方案中，方向是VL-接头-VH，即轻链可变区位于多肽的N-端，重链可变区位于多肽的C-端。
优选地，抗体为人源化的。这些人源化抗体例如可在可变轻链中包括SEQ ID No.:18的FR-L1、SEQ ID No.:19的FR-L2、SEQ ID No.:20的FR-L3和/或SEQ ID No.:21的FR-L4或其变体。此外或可选择地，人源化抗体可包括SEQ ID No.:22、26或30的重链可变框架区FR-H1；SEQ ID No.:23、27或31的重链可变框架区FR-H2；SEQ ID No.:24、28或32的重链可变框架区FR-H3；和/或SEQ ID No.:25、29或33的重链可变框架区FR-H4。
因而，在优选的实施方案中，所述抗体分别包括SEQ ID No.:7或SEQ ID No.:146或者其变体的VH序列。这些变体与SEQ ID No.:7或SEQ ID No.:146具有至少85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％以及最优选100％的序列一致性。这些变体VH序列的实例包括但不限于：SEQ ID No.:121、SEQ ID No.:122、SEQ ID No.:124、SEQ ID No.:126、SEQ ID No.:128、SEQ ID No.:130、SEQ ID No.:132、SEQ ID No.:134、SEQ ID No.:142、SEQ ID No.:144、SEQ ID No.:146、SEQ ID No.:148、SEQ ID No.:150或SEQ ID No.:152。
此外或可选择地，本文公开的抗体包括分别选自SEQ ID No.:8、SEQ ID No.:136和SEQ ID No.:145或其变体的VL序列。这些变体与SEQ ID No.:8、SEQ ID No.:136或SEQID No.:145具有至少85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及最优选100％的序列一致性。这些变体VL序列的实例包括但不限于：SEQ ID No.:123、SEQ ID No.:125、SEQ ID No.:127、SEQ ID No.:129、SEQ ID No.:131、SEQ ID No.:133、SEQ ID No.:135、SEQ ID No.:136、SEQ ID No.:137、SEQ ID No.:139或SEQ ID No.:153。
在一实施方案中，所述抗体包括与SEQ ID No.:7或SEQ ID No.:146具有至少85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及最优选100％的序列相似性的VH序列。此外或可选择地，所述抗体包括与SEQ ID No.:8、SEQ ID No.:136或SEQ ID No.:145具有至少85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及最优选100％的序列相似性的VL序列。
在更优选的实施方案中，所述抗体包括如SEQ ID No.:7所示的VH和如SEQ IDNo.:8所示的VL。SEQ ID No.:7和SEQ ID No.:8的框架序列都来源于WO 03/097697A(ESBATech AG)中描述的人免疫球蛋白。其VH和VL框架序列已针对兔抗体的人源化和稳定进行了修饰，参见，如WO 2009/155726A(ESBATech，AN ALCON BIOMEDICAL RESEARCH UNITILC)；BORRAS.L.et al.Generic approach for the generation of stable humanizedsingle-chain Fv fragments from rabbit monoclonal antibodies.Journal ofBiological Chemistry 2010.vol.285.no.12.p.9054-9066。在一实施方案中，本文公开的抗体VL框架包括SEQ ID Nos.:18-21或其变体。此外或可选择地，抗体的VH框架分别包括SEQ ID Nos.:22-25、SEQ ID Nos.:26-29或SEQ ID Nos.:30-33或其变体。
在另一优选实施方案中，所述抗体包括如SEQ ID No.:146所示的VH和如SEQ IDNo.:8或SEQ ID No.:145所示的VL。
在另一优选实施方案中，所述抗体包括如SEQ ID No.:146所示的VH和如SEQ IDNo.:136所示的VL。
所述抗体，尤其是对于scFv而言，可包括接头序列。这些接头序列一般具有10至约25个氨基酸。通常，这些接头肽富含赋予柔性的甘氨酸，以及用于提高可溶性的丝氨酸和/或苏氨酸。在优选实施方案中，使用(GGGGS)4接头(SEQ ID No.:9)或其变体。还可以使用具有3-5个重复的所述基序的变体。其他合适的接头描述于，例如ALFTHAN、K.Properties ofa single-chain antibody containing different linker peptides.ProteinEngineering 1995.vol.8.no.7.p.725-731。
在某些实施方案中，可包括本文所提供的抗体的变体。例如，可取的是增强抗原结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、补体依赖性细胞毒性作用(CDC)，增加稳定性或可溶性，降低免疫原性和/或改变抗体的其他生物学、生化、生物物理学特性。在一些实施方案中，所述变体与亲本抗体相比未显示任何改进。
本文所提供的抗体变体可通过蛋白和/或化学工程或通过蛋白/肽合成来制备，所述蛋白和/或化学工程向编码抗体的核酸序列中引入合适的修饰。可对框架或CDR进行缺失、取代、添加和插入的任意组合，只要所产生的抗体具有期望的特性，其可利用合适的方法来筛选。特别感兴趣的是取代，优选如上所述的保守取代。优选的保守取代包括：
1.缬氨酸(V)取代丙氨酸(A)；
2.赖氨酸(K)取代精氨酸(R)；
3.谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)；
4.谷氨酸(E)取代天冬氨酸(D)；
5.丝氨酸(S)取代半胱氨酸(C)；
6.天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)；
7.丙氨酸(A)取代甘氨酸(G)；
8.精氨酸(R)或赖氨酸(K)取代组氨酸(H)；
9.亮氨酸(L)取代异亮氨酸(I)；
10.亮氨酸(L)取代蛋氨酸(M)；
11.酪氨酸(Y)取代苯丙氨酸(F)；
12.丙氨酸(A)取代脯氨酸(P)；
13.苏氨酸(T)取代丝氨酸(S)；
14.酪氨酸(Y)取代色氨酸(W)；
15.色氨酸(W)取代苯丙氨酸(F)；和/或
16.亮氨酸(L)取代缬氨酸(V)，以及反之亦然。
本文所述的抗体可包括一个或多个这样的保守取代，如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多。
非保守取代可引起更基本的变化，例如，关于多肽的电荷、偶极矩、大小、亲水性、疏水性或构象。在一实施方案中，抗体包括一个或更多这样的非保守取代，如两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多。
修饰可存在于CDR或框架序列中。例如，本文所提供的CDR可包括一种、两种、三种、四种、五种或甚至更多种的修饰。例如，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3序列总体来看与本文所提供的CDR，特别是(i)SEQ ID Nos.:4、5和6，或(ii)SEQ ID Nos.:161、162和163，至少75％，优选至少76％、77％、78％、79％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更优选99％一致。此外或可选择地，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3序列总体来看与本文所提供的CDR，特别是(i)SEQ ID Nos.:1、2和3，或(ii)SEQ ID Nos.:155、156和157，至少80％，优选至少81％、82％、83％、84％、95％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更优选99％一致。
在一实施方案中，CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3总体来看与本文所提供的CDR至少85％，优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更优选99％相似。此外或可选择地，CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3总体来看与本文所提供的CDR至少85％，优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或更优选99％相似。
因此，变体可包括，例如SEQ ID No.:4中的一个、两个、三个、四个或五个取代。更优选的是在SEQ ID No.:14中标记为X的位点处的取代。所述变体例如可包括：
(i)可变轻链AHo第32位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；
(ii)可变轻链AHo第33位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；和/或
(iii)可变轻链AHo第40位处的谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)。
此外或可选择地，变体包括SEQ ID No.:5中的一个、两个、三个、或四个取代。更优选的是在SEQ ID No.:15中标记为X的位点处的取代。这些变体例如可包括：
(i)可变轻链AHo第58位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；和/或
(ii)可变轻链AHo第69位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)。
此外或可选择地，变体包括SEQ ID No.:6中的一个、两个、三个、四个、五个或六个取代。更优选的是在SEQ ID No.:16中标记为X的位点处的取代。这些变体例如可包括：
(i)可变轻链AHo第109位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)；
(ii)可变轻链AHo第111位处的丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)；
(iii)可变轻链AHo第112位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；
(iv)可变轻链AHo第135位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；和/或
(v)可变轻链AHo第136位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)。
此外或可选择地，变体可包括SEQ ID No.:1或SEQ ID No.:155中的一个、两个、三个或四个取代。更优选的是在SEQ ID No.:11中标记为X的位点处的取代。这些变体例如可包括：
(i)可变重链AHo第33位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；和/或
(ii)可变重链AHo第39位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)。
此外或可选择地，变体可包括SEQ ID No.:2或SEQ ID No.:156中的一个、两个、三个、四个、五个或六个取代。更优选的是在SEQ ID No.:12中标记为X的位点处的取代。这些变体例如可包括：
(i)可变重链AHo第59位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、或酪氨酸(Y)；
(ii)可变重链AHo第60位处的天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)、或脯氨酸(P)；和/或
(iii)可变重链AHo第69位处的丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)。
此外或可选择地，变体可包括SEQ ID No.:3或SEQ ID No.:157中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个取代。更优选的是在SEQ ID No.:13中标记为X的位点处的取代。这些变体可包括，例如
(i)可变重链AHo第110位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；
(ii)可变重链AHo第111位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；
(iii)可变重链AHo第112位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、酪氨酸(Y)；
(iv)可变重链AHo第113位处的苯丙氨酸(F)、或异亮氨酸(I)；
(v)可变重链AHo第114位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)；
(vi)可变重链AHo第115位处的丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、或天冬酰胺(N)；
(vii)可变重链AHo第135位处的丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；
(viii)可变重链AHo第136位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；
(ix)可变重链AHo第137位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)；和/或
(x)可变重链AHo第138位处的丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)。
变体特别优选的类型是其中一个或多个整个CDR被取代的变体。通常，CDR-H3和CDR-L3最有助于抗原结合。例如，整个CDR-L1、CDR-L2、CDR-H1和/或CDR-H2可被天然或人工来源的不同CDR取代。在一些实施方案中，一个或多个CDR被丙氨酸盒取代。
在一实施方案中，本文所述的变体与选自SEQ ID No.:10、SEQ ID No.:73和SEQID No.:82的序列具有至少85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及最优选100％的序列一致性。
在一实施方案中，本文所述的变体与SEQ ID No.:10、SEQ ID No.:73和SEQ IDNo.:82具有至少85％，更优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，以及最优选100％的序列相似性。
此外或可选择地，抗体的VH包括增强可溶性的点突变。WO2009/155725(ESBATech,Novartis company)描述了已被证明增加抗体的总体可溶性的基序。残基被放置于位于抗体的可变区和恒定区界面处的位点，使抗体片段稳定，特别是使缺乏恒定区的scFv稳定。具体地，存在以下一个，优选全部三个残基：
(i)位于重链第12位氨基酸处(根据AHo编号)的丝氨酸(S)；
(ii)位于重链第103位氨基酸处(根据AHo编号)的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)；和/或
(iii)位于重链第144位氨基酸处(根据AHo编号)的丝氨酸(S)或苏氨酸(T)。
在优选的实施方案中，抗体在VH第12位处具有丝氨酸；VH第103位处具有丝氨酸；以及VH第144位处具有苏氨酸(全部都是AHo编号)。
因而，在一实施方案中，本文所公开的抗体包括SEQ ID Nos.:30-33或其变体的VH框架序列。
优选地，本文使用的变体抗体
(i)保留了特异性结合至IL-1β，特别是hIL-1β；
(ii)针对抑制人IL-1β的生物效应具有的效价(IC50)低于500pM，优选低于400pM、300pM、200pM、100pM、50pM，更优选低于25pM；
(iii)与食蟹猴IL-1β、恒河猴IL-1β和/或大鼠IL-1β交叉反应；和/或
(iv)与本文公开的抗体竞争结合至IL-1β，优选人IL-1β、食蟹猴IL-1β、恒河猴IL-1β和/或大鼠IL-1β，最优选hIL-1β。
在一实施方案中，所述变体包括选自以下的VL序列：SEQ ID No.:96、SEQ ID No.:97、SEQ ID No.:98、SEQ ID No.:99、SEQ ID No.:100、SEQ ID No.:101、SEQ ID No.:102、SEQ ID No.:103、SEQ ID No.:104、SEQ ID No.:105、SEQ ID No.:123、SEQ ID No.:125、SEQ ID No.:127、SEQ ID No.:129、SEQ ID No.:131、SEQ ID No.:133、SEQ ID No.:135、SEQ ID No.:136、SEQ ID No.:137、SEQ ID No.:139、SEQ ID No.:141、SEQ ID No.:143、SEQ ID No.:145、SEQ ID No.:147、SEQ ID No.:149、SEQ ID No.:151、以及SEQ ID No.:153。
此外或可选择地，所述变体包括选自以下的VH序列：SEQ ID No.:106、SEQ IDNo.:107、SEQ ID No.:108、SEQ ID No.:109、SEQ ID No.:110、SEQ ID No.:111、SEQ IDNo.:112、SEQ ID No.:113、SEQ ID No.:114、SEQ ID No.:115、SEQ ID No.:116、SEQ IDNo.:117、SEQ ID No.:118、SEQ ID No.:119、SEQ ID No.:120、SEQ ID No.:121、SEQ IDNo.:122、SEQ ID No.:124、SEQ ID No.:126、SEQ ID No.:128、SEQ ID No.:130、SEQ IDNo.:132、SEQ ID No.:134、SEQ ID No.:138、SEQ ID No.:140、SEQ ID No.:142、SEQ IDNo.:144、SEQ ID No.:146、SEQ ID No.:148、SEQ ID No.:150、SEQ ID No.:152。
变体还可通过轻链和重链的链改组来制备。单个轻链可与重链文库相组合来产生变体文库。在一实施方案中，所述轻链选自以上所述的VL序列，和/或所述重链文库包括以上所述的一个或多个VH序列。同样地，单个重链可与轻链文库相组合。优选地，所述单个重链选自以上所述的VH序列，和/或所述轻链文库包括以上所述的一个或多个VL序列。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:135的VL，和/或SEQ ID No.:7、SEQID No.:142、SEQ ID No.:146、SEQ ID No.:150或SEQ ID No.:152的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:67、SEQ ID No.:85、SEQ ID No.:86、SEQ ID No.:87或SEQ ID No.:88。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:136的VL，和/或SEQ ID No.:7、SEQID No.:142、SEQ ID No.:146、SEQ ID No.:150或SEQ ID No.:152的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:68、SEQ ID No.:81、SEQ ID No.:82、SEQ ID No.:83或SEQ ID No.:84。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:137的VL，和/或SEQ ID No.:7、SEQID No.:138、SEQ ID No.:142、SEQ ID No.:146、SEQ ID No.:150或SEQ ID No.:152的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:69、SEQ ID No.:92、SEQ ID No:.93、SEQ ID No.:94或SEQ ID No.:95。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:139的VL，和/或SEQ ID No.:140、SEQID No.:142、SEQ ID No.:146、SEQ ID No.:150或SEQ ID No.:152的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:70、SEQ ID No.:77、SEQ ID No.:78、SEQ ID No.:79或SEQ ID No.:80。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:141的VL，和/或SEQ ID No.:142的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:71。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:143的VL，和/或SEQ ID No.:144的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:72。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:145的VL，和/或SEQ ID No.:146的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:73。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:147的VL，和/或SEQ ID No.:148的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:74。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:149的VL，和/或SEQ ID No.:150的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:75。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:151的VL，和/或SEQ ID No.:152的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:76。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:8的VL，和/或SEQ ID No.:121或SEQID No.:122的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.:59或SEQ ID No.:60。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:153的VL，和/或SEQ ID No.:142、SEQID No.:146或SEQ ID No.:152的VH。优选地，所述变体包括SEQ ID No.89、SEQ ID No.:90或91。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:8的VL，和/或SEQ ID No.:121、SEQID No.:122、SEQ ID No.:142、SEQ ID No.:144、SEQ ID No.:146、SEQ ID No.:148、SEQ IDNo.:150或SEQ ID No.:152的VH。
在一实施方案中，所述变体包括SEQ ID No.:7的VH，和/或SEQ ID No.:135、SEQID No.:136、SEQ ID No.:137、SEQ ID No.:139或SEQ ID No.:153的VL。
在一实施方案中，所述变体包括选自SEQ ID No.:34至95和SEQ ID No.:154的序列。
结合成员可包括上述的任何VL和/或VH序列。具有单结构域形式的结合成员如纳米抗体或VHH，仅包括上述的VL或VH序列中的一种，优选VH序列。多价结合成员，特别是F(ab')2片段，bis-scFv或双体抗体，优选特异性结合成员，可包括一种或多种上述的VH序列，和/或一种或多种上述的VH序列。
本发明的抗体特别稳定。本文使用的术语“稳定性”是指在长时间孵育和/或升高温度下孵育之后，抗体的生物物理学特性在溶液中保持为单体的。不稳定的抗体易于二聚化或低聚化，甚至沉淀，从而减短保质期并变得更不适合于药学应用。
37℃下以1mg/ml的浓度于PBS(pH 7.2)中孵育1个月之后，本文提供的抗体，特别是上述单价抗体，至少75％，优选至少80％、85％，以及最优选93％保持为单体的。此外或可选择地，于室温下以1mg/ml的浓度于PBS(pH 7.2)中1个月之后，抗体至少90％，优选至少92％、94％、96％、98％，最优选100％保持为单体的。
单体的程度，可通过例如SEC-HPLC(尺寸排阻色谱-高效液相色谱)来测定。这种测试的合适的流动相为，例如pH 7.2的PBS。单体含量可通过蛋白层析期间测量UV280信号的峰积分来定量。合适的系统，例如由6.5软件控制的Dionex Summit HPLC，其允许随后的色谱图分析和峰定量。
本文公开的抗体，特别是上述单价抗体片段在更高的浓度下也稳定，例如，于室温和/或4℃下以50mg/ml的浓度于PBS(pH 7.2)中孵育2周之后，其至少50％，优选至少55％、60％、65％、70％，以及最优选75％保持为单体的。
此外，本文提供的抗体，特别是上述单价抗体片段特别可溶，因而可被高度浓缩，不会因为形成团粒而沉淀。优选地，抗体可浓缩于pH 7.2的PBS中，至浓度超过20mg/ml而不沉淀，更优选在pH 7.2的PBS中其浓度为30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml，最优选为70mg/ml。
在更优选的实施方案中，通过差示扫描荧光分析(DSF)测定，所述抗体具有约60℃，优选65℃、70℃、71℃、72℃、73℃，以及最优选74℃的解链温度。该方法基于某些染料仅在疏水环境中发荧光的特性。例如，蛋白去折叠可由橙色染料结合至热变性的蛋白时荧光增强来检测(NIESEN F.H.et al.The use of differential scanningfluorimetry to detect ligand interactions that promote proteinstability.Nature Protocols 2007.vol.2.p.2212-2221)。蛋白的稳定性可通过热变性来分析。
所述抗体的理论等电点(pI)优选为5至10，优选7至9，最优选约8.3。理论pI可通过，例如利用ExPASy服务器上的ProtParam工具来计算(可获自http://web.expasy.org/protparam/；还参见GASTEIGER E.et al.Protein Identification and Analysis Toolson the ExPASy Server.(In)The Proteomics Protocols Handbook.WALKER J.M.编,Totowa:Humana Press Inc.2005.ISBN 9781588295934.p.571-607)。
所述抗体可与来自非人类的IL-1β交叉反应，例如但不限于，食蟹猴IL-1β、恒河猴IL-1β、大鼠IL-1β、鼠科动物IL-1β、犬IL-1β、猫科动物IL-1β、狨猴IL-1β、猪IL-1β和/或豚鼠IL-1β。优选地，所述抗体与食蟹猴IL-1β(如，重组产生的且可获自Sino BiologicalInc.,商品目录号90010-CNAE)、恒河猴IL-1β(如，重组产生的且可获自R&D Systems,商品目录号1318-RL/CF)和/或大鼠IL-1β(如，重组产生的且可获自Peprotech,商品目录号400-01B)交叉反应。
优选地，在体内和/或体外环境，用本文公开的抗体中和时，IL-1β没有残余活性，即抗体完全抑制了IL-1β的作用。本文使用的“无残余活性”是指，与相同浓度的非相关特异性的抗体或载体对照相比，在60ng/ml本文所述的抗体存在下，对应于通过10pg/ml的IL-1β诱导从人成纤维细胞中释放IL-6的效力测试信号低于2％，优选如实施例3所述的测试。
本发明还提供了与本文公开的抗体竞争结合至人IL-1β的结合成员。
如本文使用的术语“竞争”是指，结合成员之间为了结合至同一标靶而竞争。竞争可通过竞争性结合测试来测定，其中目标结合成员防止或抑制或减少本文公开的抗体特异性结合至共有的抗原(在此，为hIL-1β或其片段)。这些竞争性结合测试是本领域内已知的，且包括但不限于：固相直接或间接放射免疫法(RIA)和固相直接或间接酶免疫测定(EIA)。通常，这种测试包括利用纯化的抗原结合至固相表面，待检测的结合成员以及本文所述的参照抗体。竞争性抑制通过测定以下的量来测量：(i)在待检测的结合成员存在下，参照抗体结合至固相表面的量；或(ii)在参照抗体存在下，待检测的结合成员结合至固相表面的量。竞争结合成员可结合至：(i)与抗体的结合表位相同的表位，(ii)重叠的表位，或(iii)同一标靶分子上的不同表位但在空间上阻碍抗体与其标靶的结合。
通常，当存在过量的竞争结合成员时，将减少本文所述的抗体特异性结合至IL-1β至少40-45％、45-50％、50-55％、55-60％、60-65％、65-70％、70-75％、或75％或更多。优选地，抗体的结合减少至少80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、或97％或更多。
在一实施方案中，竞争结合成员结合至hIL-1β的亲和力KD为：至少约1pM、10pM、100pM、500pM、1nM、10nM。
在一实施方案中，结合成员为单价，如scFv或Fab片段。在另一实施方案中，结合成员为多价。这种多价分子可为双价(如全长免疫球蛋白或F(ab')2片段)或包括至少三个标靶结合位点。
多价结合成员可以是双特异性抗体，如双体抗体、单链双体抗体或串联的scFv(参见，如KONTERMANN.R.E.Methods in Molecular Biology.LO,B.Totowa编,N.J.:HumanaPress，2004.ISBN 1588290921.p.227-242)。所述双特异性抗体可较好地利用比上述用于scFv的那些更短的接头，即，仅具有SEQ ID NO:14的基本基序的一个至三个重复序列(参见，例如，HOILIGER P.,et al.Diabodies:smaIL bivalent and bispecific antibodyfragments.PNAS 1993,vol.90,no.14,p.6444-6448)。在另一实施方案中，所述多价结合成员为三链抗体(triabody)、微抗体(minibody)或四链抗体(tetrabody)。
本发明还提供了包括本文公开的抗体的T-bodies。T-bodies是免疫球蛋白T-细胞受体(clgTCRs)，其将抗体的抗原识别与T-细胞受体复合物的信号和效应物特性相组合。在这样的构建体中，所述抗体优选为抗体片段，如Fv、Fab、scFv或scFv-Fc，最优选为scFv。关于T-bodies的一般设计及其应用的进一步讨论，请参见，例如SCHIRRMANN,T.and Pecher,G.Handbook of Therapeutic Antibodies.,S.Weinheim编:Wiley-VCH.2009.ISBN 3527314539.p.533-561。
本发明还提供了针对IL-1β的初始(即未进行改造以提高亲和力或效价)结合成员，其具有标准化为每个结合成员的结合位点数目之后在某一分子量(g/mol)的单价效价(如，在基于细胞的测试中测定为亲和力(KD)或生物效价(IC50)，以mol/l为单位)，如通过以下等式所确定的：
如上所述，具有皮摩尔级效价值的单价抗体片段是特别的且为非常规获得的。效价通常与结合成员的大小相关：皮摩尔级的高效价可通过全长免疫球蛋白获得，而非常小的抗体片段如纳米抗体或最小识别单位，或小的非抗体支架如affilins通常显示较低的效价值，即纳摩尔级。表面上看，由本文所述的scFv提供的所述函数K存在最小值：结合成员越小，其单价效价或亲和力越大，每个分子的结合位点越多，K越小。例如，对于本文所述的scFv，K的下限等于约50ng/l，而K的上限等于约12'500ng/l；对于各自的全长免疫球蛋白，K的下限等于约150ng/l，K上限等于约37'500ng/l；对于具有分子量小于本文所述的scFv的其他结合成员，K值为K>500'000ng/l。在优选的实施方案中，K值为约50ng/l、100ng/l、200ng/l、500ng/l、750ng/l、1'000ng/l、1'250ng/l、1'500ng/l、1'750ng/l、2'000ng/l、2'250ng/l、或2'500ng/l。
核酸、载体、宿主细胞及其生产方法
本文所述的抗体由单个核酸或由两个或更多核酸编码，例如，分别编码至少一个可变区。已知抗体或其部分的序列，编码多肽序列的cDNA可通过本领域内所熟知的方法来产生，例如通过基因合成。这些cDNA可由标准克隆和诱变技术克隆至合适的载体如表达载体或克隆载体中。任选地，可变轻链由与抗体的可变重链分开的核酸编码。进一步地，其他序列如标签(如His-标签)、产生Fab或全长免疫球蛋白的恒定区、接头、第二结合特异性或另一功能性多肽(如产生融合构建体的酶)的编码序列或双特异性分子可包括于基因构建体中。
基于所选择的克隆策略，基因构建体可产生在N-端或C-端具有一个或多个其他残基的抗体。例如，如果其未被翻译后剪切，源自起始密码子的N-端蛋氨酸或额外的丙氨酸可存在于表达的多肽中。因而，应理解的是，本文公开的抗体包括公开的序列而非由公开的序列组成。
在一实施方案中，本发明提供的核酸序列包括至少300个核酸碱基，更优选至少350、400、450、或500个核酸碱基，并且与SEQ ID No.:17具有至少85％、更优选至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。在优选的实施方案中，所述核酸序列为SEQ ID No.:17。
此外或可选择地，本发明提供的核酸序列包括至少300个核酸碱基，更优选至少350、400、450、或500个核酸碱基，其与SEQ ID No.:17的核酸在高严紧性条件下杂交。
标准克隆、诱变和分子生物学技术的基本方法描述于，例如分子克隆，实验室手册(GREEN,M.and Sambrook,J.Molecular Cloning:a Laboratory Manual.第4版.ColdSpring Harbor Laboratory,2012.ISBN1936113422.)中。
表达基因构建体的合适的宿主细胞可以为原核的或真核的。合适的原核宿主细胞为革兰氏阴性或革兰氏阳性的，且包括包括埃希氏菌属、欧文氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、假单胞菌属或芽孢杆菌属的物种。更优选的是大肠杆菌，特别是大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Life TechnologiesTM,商品目录号C6000-03)以及OrigamiTM2(DE3)(Novagen,商品目录号)。
如果期望翻译后修饰如糖基化或磷酸化，则优选真核宿主细胞。例如，真核微生物如常用的酿酒酵母或毕赤酵母菌株可用作宿主细胞。宿主细胞还可包括植物或动物细胞，特别是昆虫或哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞包括但不限于：中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人脾肾细胞(HEK)、人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或NS0骨髓瘤细胞。
可通过在合适的宿主细胞中表达来产生抗体。例如，通过标准技术如电穿孔或化学转化，可将上述的表达载体引入至宿主细胞。然后将转化的细胞在适合于重组蛋白表达的条件下培养，一般在适合的营养培养基中，任选地加以改良以便诱导启动子、选择转化体或扩增目标编码序列。将抗体从培养物中回收，任选利用本领域内的标准技术纯化。重组蛋白的收率可通过优化培养基和培养条件如温度或氧气供应来提高。在原核生物中，所述抗体可在外周胞质、细胞内包涵体的或被分泌至培养基中来产生。收集时，蛋白可利用本领域内已知的方法来纯化，如凝胶过滤、离子交换层析、反相层析、疏水性相互作用、混合模式层析和/或亲和层析。
在一实施方案中，所述抗体在无细胞系统中产生。这一般涉及体外转录之后体外翻译编码本文所述蛋白的核酸产物模板，如质粒DNA或PCR产物模板。例如，使用来自生长细胞的粗裂解物，提供必需的酶以及细胞蛋白合成机制。可外源提供必需的构建模块如氨基酸或核酸碱基以及能量递送分子和其他分子。无细胞表达系统可基于，例如裂解的兔网织红细胞(如兔网织红细胞裂解物系统,Promega,商品目录号L4540)、HeLa细胞(如一步法人体外翻译试剂盒,Thermo Scientific,商品目录号88881)、昆虫细胞(如EasyXpress昆虫试剂盒II,Qiagen,商品目录号32561)、麦胚(如麦胚提取物,Promega,商品目录号L4380)、或大肠杆菌细胞(如体外蛋白合成试剂盒,NEB,商品目录号E6800S)。同样地，为了改进二硫键生成而优化的无细胞抗体表达系统可用于生产。可商购的试剂盒包括昆虫细胞裂解物(如EasyXpress二硫化物昆虫试剂盒,Qiagen,商品目录号32582)或大肠杆菌细胞裂解物(如EasyXpress二硫化物大肠杆菌试剂盒,Qiagen,商品目录号32572)。无细胞蛋白合成例如具有以下优势：快速、实现高产物收率、允许容易地改变反应条件，形成较低程度的副产物甚至无副产物。无细胞蛋白合成可包括无法在纯生物或化工生产系统中进行的生物学和/或化学步骤。例如，可将非天然或化学修饰的氨基酸并入蛋白的期望位点。已在无细胞系统中成功地产生ScFv-毒素融合蛋白(NICHOILS,P.J.,etal.Characterization of single-chain antibody(sFv)-toxin fusion proteinsproduced in vitro in rabbit reticulocyte lysate.Journal of BiologicalChemistry 1993,vol.268,pp.5302-5308)。因而，在一实施方案中，提供的生产本文所述的抗体、以上的结合成员或以上的T-body的方法，包括以下步骤：(a)提供无细胞系统；(b)提供编码本文所述的抗体、上述结合成员或上述T-body的核酸产物模板；(c)允许所述核酸产物模板转录和翻译；(d)回收；以及任选地，(e)分别纯化所述抗体、所述结合成员或所述T-body。
此外或可选择地，产生本文所述抗体的方法包括至少一步化学合成。例如，所述方法可完全为化学的。在另一实施方案中，上述基于细胞的或无细胞生产系统包括至少一步这种化学合成。
在优选的实施方案中，本文所述的抗体在基于细胞的系统中产生，利用表达载体在大肠杆菌中进行细胞内表达。表达时多肽在细胞内作为包涵体产生，该包涵体与其他细胞颗粒中分离，之后溶于变性剂如盐酸胍(GndHCI)中，并通过本领域技术人员所熟知的复性程序重折叠。
可理解的是，上述的核酸、载体、宿主细胞和生产方法还适用于本文所述的结合成员(在其为蛋白的范围内)和/或T-bodies。
化学和/或生物学修饰
一方面，本发明的抗体为化学和/或生物学修饰的。这种修饰可包括但不限于：糖基化、聚乙二醇化、羟乙基淀粉化(HESylation)、白蛋白融合技术、PAS化(PASylation)、用染料和/或放射性同位素标记、用酶和/或毒素偶联、磷酸化、羟基化和/或硫酸化。同样地，以上所述的任何结合成员、核酸序列、载体和/或宿主细胞可相应地进行修饰。
可进行化学和/或生物学修饰来优化蛋白的药效动力学或水溶性或降低其副作用。例如，可应用聚乙二醇化、PAS化和/或羟乙基淀粉化来延缓肾清除，从而增加抗体的血浆半衰期。此外或可选择地，修饰可给蛋白如毒素添加不同的功能，以更有效地与癌细胞斗争，或用于诊断目的的检测分子。
糖基化是指将糖类附着于蛋白的过程。在生物系统中，该过程以共同翻译和/或翻译后修饰的形式在细胞内酶促进行。蛋白，此处的抗体，还可被化学糖基化。糖基化一般但不限于的是：(i)N-连接至天冬酰胺或精氨酸侧链的氮原子；(ii)O-连接至丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸侧链的羟基氧原子；(iii)包括将木糖、海藻糖、甘露糖和N-乙酰葡糖胺附着至磷-丝氨酸；或(iv)以C-甘露糖基化的形式，其中将甘露糖添加至特定识别序列中存在的色氨酸残基。糖基化模式可通过，例如选择合适的细胞系、培养基、蛋白质工程制造的模式以及加工策略来控制(HOSSLER,P.Optimal and consistent proteinglycosylation in mammalian ceIL culture.Glycobiology 2009.vol.19.no.9,p.936-949)。
控制或改变糖基化模式的蛋白质工程包括缺失和/或添加一个或多个糖基化位点。糖基化位点的形成可通过在抗体的氨基酸序列中引入相应的酶识别序列，或者通过添加或取代一个或多个上述列举的氨基酸残基来方便地完成。
可期望的是将抗体聚乙二醇化。聚乙二醇化可改变蛋白的药效动力学和药代动力学特性。将适当分子量的聚乙二醇(PEG)共价附着于蛋白骨架(参见，例如PASUT,G.andVeronese,F.State of the art in PEGylation:the great versatility achievedafter forty years of research.Journal of ControILed Release 2012,vol.161.no.2.p.461-472)。聚乙二醇化可通过将聚乙二醇化蛋白屏蔽于免疫系统外而额外地降低免疫原性，和/或通过例如增加抗体的体内稳定性，保护其免于蛋白水解，延长其半衰期以及通过改变其生物分布来改变其药代动力学。
类似的效果可通过PEG模拟物如HES化(HESylating)或PAS化抗体来实现。HES化(HESylation)利用羟乙基淀粉("HES")衍生物，而PAS化期间抗体开始与构象无序的由脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸组成的多肽序列相连接。所述PEG模拟物及相关的化合物描述于例如BINDER,U.and Skerra,A.Half-Life Extension of Therapeutic Proteins viaGenetic Fusion to Recombinant PEG Mimetics,in Therapeutic Proteins:Strategiesto Modulate Their Plasma Half-Lives.KONTERMANN,R.,Weinheim编,Germany:Wiley-VCH,2012.ISBN:9783527328499.p.63-81。
所述抗体可包括表位，特别是补救(salvage)受体结合表位。这种补救受体结合表位一般是指IgG分子的Fc区的表位(如IgG1、IgG2、IgG3,或IgG4)，并且具有增加分子体内半衰期的效果。
此外或可选择地，所述抗体用第二部分进行标记或与第二部分偶联，所述第二部分归因于除标靶结合外的辅助功能。所述第二部分可具有例如额外的免疫学效应因子功能，在药物寻靶中起作用或在检测中有用。第二部分可例如利用本领域内已知的方法化学连接或基因融合至抗体。
可用作第二部分的分子包括但不限于：放射性核素，又被称为放射性同位素(如35S、32P、14C、18F、125I)；脱辅酶；酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶或血管生成素)；辅助因子；肽(如HIS-标签)；蛋白质(包括凝集素)；糖类(包括甘露糖-6-磷酸标签)；荧光素(包括异硫氰酸荧光素(FITC)；藻红蛋白；绿色/蓝色/红色及其他荧光蛋白；别藻蓝蛋白(APC))；发色团；维生素(包括生物素)；螯合剂；抗代谢物(如甲氨蝶呤)、脂质体；毒素，包括细胞毒性药物如紫杉醇、短杆菌肽D或秋水仙碱；或放射性毒素。
标记的抗体对于体外和体内检测或诊断目的尤其有用。例如，用合适的放射性同位素、酶、荧光团或发色团标记的抗体可分别通过放射免疫分析(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)或基于单细胞分析的流式细胞术(如FACS分析)来检测。类似地，本文所述的核酸和/或载体可用于检测或诊断目的，例如在杂交试验中利用其标记的片段作为探针。标记方案可见于，例如JOHNSON,I.and Spence,M.T.Z.Molecular Probes Handbook,A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies.Life Technologies,2010.ISBN:0982927916。
组合物
本文所公开的本发明的抗体、任意结合成员、核酸序列或载体可在组合物中提供，所述组合物进一步包括合适的载剂、赋形剂或稀释剂。更优选的是，包括本文所述抗体的组合物。
这种组合物可以是，例如诊断组合物、美容组合物或药物组合物。为了治疗或美容的目的，所述组合物为包括药物载剂、赋形剂或稀释剂的药物组合物，即所使用的剂量和浓度是无毒的。
合适的“载剂”、“赋形剂”、或“稀释剂”包括但不限于：(i)诸如磷酸盐、柠檬酸盐或其他有机酸的缓冲剂；(ii)抗氧化剂，如抗坏血酸和生育酚；(iii)防腐剂，如3-戊醇、氯化六甲双铵、氯化苯甲烷铵、苯甲醇、烷基对羟基苯甲酸酯、邻苯二酚、或环己醇；(iv)氨基酸，如组氨酸、精氨酸；(v)肽，优选多达10个残基，如聚赖氨酸；(vi)蛋白，如牛或人血清白蛋白；(vii)亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；(viii)单糖、二糖、多糖和/或其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇、氨基葡聚糖或聚酰胺；(ix)螯合剂，如EDTA；(x)盐形成离子如钠；(xi)金属复合物(如Zn-蛋白复合物)；和/或(xii)离子或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
许多所述的示例性化合物具有不同的功能，并且例如，可用作载剂和稀释剂。还应当理解的是，组合物可包括各载剂、稀释剂或赋形剂中多于一种。所述抗体、结合成员、核酸序列或载体可在固相支持材料如微珠和微粒上提供。一般，将分子通过共价键(任选包括接头)、非共价地或掺和连接至这种载剂。所述微珠和微粒可包括，例如淀粉、纤维素、聚丙烯酸酯、聚乳酸聚乙醇酸酯(polylacetate polyglycolate)、聚(乙交酯-丙交酯)、乳胶或葡聚糖。
治疗应用
本文所述的分子，特别是所述抗体、结合成员、核酸或载体可用作药物。一般，这种药物包括治疗有效量的本文所提供的分子。因此，所述分子可用于生产可用于治疗IL-1β相关障碍的药物。
一方面，提供了治疗IL-1β相关障碍的方法，其包括给予有需要的受试者药学有效量的本文所述的分子特别是抗体的步骤。在一实施方案中，将包括这种药学有效量的抗体的上述药物组合物(即药物)给予所述受试者。
本文使用的术语“治疗”是指，给予有需要的受试者药学有效量的本发明的抗体、结合成员、核酸、载体或宿主细胞，以预防、治疗、延缓IL-1β相关障碍的一个或多个症状的发生和/或发展，减轻IL-1β相关障碍的一个或多个症状的严重程度，稳定、调节、治愈或改善IL-1β相关障碍的一个或多个症状。一般，将所述抗体、结合成员、核酸、载体或宿主细胞提供至包括本文前述的药物组合物中。
“治疗有效量”是指，实施给药方案时产生期望的治疗效果(即达到上述的治疗目的)的量。剂量将取决于各种因素，包括患者和临床因素(例如，年龄、体重、性别、患者的病史、障碍的严重程度和/或对治疗的响应)，待治疗的障碍的性质，待给予的具体组合物，给药途径和其他因素。
需要这种治疗的受试者可以是人或非人类动物，如小鼠、大鼠、兔、猴、狗、马、牛、鸡、豚鼠或猪。一般，受试者被诊断患有IL-1β相关障碍或可获得这种障碍。
IL-1β拮抗剂已在其中显示治疗效果的IL-1β相关障碍的实例包括但不限于：增殖性糖尿病视网膜病变、痛风性关节炎、施尼茨勒(Schnitzler)综合征、全身性幼年特发性关节炎、类风湿性关节炎、急性痛风性关节炎、慢性痛风性关节炎、荨麻疹、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、强直性脊柱炎、复发性多病灶性骨髓炎、复发性多软骨炎、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、白塞病、家族性地中海热、慢性阻塞性肺病、多肌痛风湿病、NALP3-突变、坏疽性脓皮病、慢性特发性荨麻疹、骨关节炎、湿性老年性黄斑变性、干眼综合征、脓疱性银屑病、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨质增生-骨炎综合征、巨噬细胞活化综合征、周期性发热腺炎咽炎口疮性溃疡综合征、成人斯蒂尔(StiIL's)病、甲羟戊酸激酶缺乏症、动脉粥样硬化、TNF-受体相关的周期性综合征(TRAPS)、寻常性痤疮和/或反常性痤疮。
术语“CAPS”或冷吡啉相关周期性综合征，被理解为包括家族性冷自身炎症综合征(FCAS)、穆-韦二氏(Muckle-WeILs)综合征(MWS)以及新生儿发病的多系统炎症性疾病(又被称为慢性婴儿神经皮肤关节(CINCA)综合征)中的每一种。
药学组合物可通过不同的给药途径施用。给药可于例如，但不限于：肠胃外进行，如大剂量肌内、皮下、静脉内给药，或通过关节内、滑膜内、脑内、脑脊内、鞘内、硬膜外或腹膜内连续输注；口服给药；直肠给药；局部给药，泌尿生殖道给药；外用，如至皮肤或眼睛；玻璃体内给药；静脉注射；眼睛内给药；耳部给药；鼻内给药；通过吸入法；皮肤给药，如皮内、皮下或透皮；舌下给药；例如颊部给药。优选的是外用、直肠、局部、鼻内、静脉内和/或皮内途径给药。
本发明的抗体、结合成员、核酸序列、载体或宿主细胞可与一种或多种另外的治疗有效的化合物组合。所述化合物可具有通过IL-1受体阻断信号转导的能力，或可选择地，抑制一个或多个不同的标靶，如炎症反应的其他介质。这些化合物可同时或按顺序给予。
为了治疗应用，还可将抗体用放射性同位素标记，或者连接至毒素，或连接至具有以上所述功能的其他效应因子。
诊断应用和/或检测目的
本发明的抗体可用于体内和/或体外检测或诊断目的。例如，涉及用于检测在特定细胞或组织中的表达的抗体的各种免疫测定是本领域技术人员所熟知的。同样地，前述的任何结合成员、核酸序列、载体和/或宿主细胞可相应地如本部分所详述的来使用。
对于这些应用，本文所公开的抗体、结合成员、核酸序列、载体或宿主细胞可以被标记或不标记。例如，可使用未标记的抗体，并通过识别在本文所述抗体上的表位的二抗来检测。
在另一实施方案中，将所述抗体、结合成员、核酸序列、载体和/或宿主细胞与可被检测物质识别的一种或多种物质偶联，例如，所述抗体与可被链霉亲和素检测的生物素偶联。同样地，本文所公开的核酸和/或载体可用于检测或诊断目的，例如在杂交试验中通过利用其标记的片段作为探针。
在某些实施方案中，本文所提供的任何分子，特别是抗体，可用于在样品优选生物样品中检测IL-1β的存在，所述IL-1β优选包括全长IL-1β、其片段和/或其前体。术语“检测”包括定量和/或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包括来自人患者的细胞或组织。生物样品的非限制性实例包括：血液、尿液、脑脊液、活体组织切片、淋巴和/或非血液组织。
在某些实施方案中，所述方法包括在允许抗体结合至IL-1β的条件下，将生物样品与本文所述的抗IL-1β抗体相接触，如果存在，并检测抗体与IL-1β之间是否有复合物形成。这种方法可以为体外或体内方法。在一实施方案中，使用抗IL-1β抗体来选择符合用本文所述抗体治疗的受试者，例如，其中IL-1β是选择患者的生物标记物。类似地，除了抗体，这种方法还可涉及利用上述结合成员或本文所述的T-body。
在另一方面，所述抗体可用于美容应用中，例如，为了改善皮肤的美容外表。
在另一方面，提供了试剂盒，其包括抗体、包装的试剂组合物以及实施检测或诊断测试的说明书。试剂一般以预定量的干燥粉末的形式提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其溶解后将提供具有合适浓度的试剂溶液。还可包括其他添加剂如稳定剂和/或缓冲液。如果抗体用酶标记，试剂盒一般包括相应的底物和辅助因子。同样地，前述的任何结合成员、核酸序列、载体和/或宿主细胞可相应地如本部分所详述的来使用。
序列表
本文公开的序列如下：
SEQ ID No:1-VH CDR1
FSLSSAAMA
SEQ ID No:2-VH CDR2
IIYDSASTYYASWAKG
SEQ ID No:3-VH CDR3
ERAIFSGDFVL
SEQ ID No:4-VL CDR1
QASQSIDNWLS
SEQ ID No:5-VL CDR2
RASTLAS
SEQ ID No:6-VL CDR3
QNTGGGVSIA
SEQ ID No:7-VH
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No:8-VL
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No:9-接头
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID No:10-DLX2323
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No:11-VH CDR1的CDR变体
FSLSXXAMA
SEQ ID No:12-VH CDR2的CDR变体
IIXXSASTXYASWAKG
SEQ ID No:13-VH CDR3的CDR变体
EXXXXXXXXXX
SEQ ID No:14-VL CDR1的CDR变体
QASQSIXXXLS
SEQ ID No:15-VL CDR2的CDR变体
XASXLAS
SEQ ID No:16-VL CDR3的CDR变体
QNXGXXXXIA
SEQ ID No:17-DLX2323的DNA序列
GAAATTGTTATGACCCAGAGCCCGAGCACCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGATCGTGTGATTATTACCTGTCAGGCAAGCCAGAGCATTGATAATTGGCTGAGCTGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCACCGAAACTGCTGATTTATCGTGCAAGCACCCTGGCAAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGTGCAGAATTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGATGATTTTGCAACCTATTATTGTCAGAATACCGGTGGTGGTGTTAGCATTGCATTTGGTCAGGGCACCAAACTGACCGTTCTGGGTGGTGGCGGTGGATCCGGTGGGGGTGGTAGCGGAGGTGGTGGTTCAGGCGGTGGTGGCAGCGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGTGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTACCGCAAGCGGTTTTAGCCTGAGCAGCGCAGCAATGGCATGGGTTCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGGTATTATCTATGATAGCGCAAGCACCTATTATGCAAGCTGGGCAAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATACCAGTAAAAATACCGTTTACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTGCACGTGAACGTGCAATTTTCAGCGGTGATTTTGTTCTGTGGGGTCA GGGAACCCTGGTTACCGTTAGCAGC
SEQ ID No.:18-FW1.4的FR-L1
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITC
SEQ ID No.:19-FW1.4的FR-L2
WYQQKPGKAPKILIY
SEQ ID No.:20-FW1.4的FR-L3
GVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYC
SEQ ID No.:21-FW1.4的FR-L4
FGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:22-rFW1.4的FR-H1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASG
SEQ ID No.:23-rFW1.4的FR-H2
WVRQAPGKGLEWVG
SEQ ID No.:24-rFW1.4的FR-H3
RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
SEQ ID No.:25-rFW1.4的FR-H4
WGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:26-rFW1.4(V2)的FR-H1
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSG
SEQ ID No.:27-rFW1.4(V2)的FR-H2
WVRQAPGKGLEWVG
SEQ ID No.:28-rFW1.4(V2)的FR-H3
RFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAR
SEQ ID No.:29-rFW1.4(V2)的FR-H4
WGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:30-rFW1.4-SST的FR-H1
EVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCTASG
SEQ ID No.:31-rFW1.4-SST的FR-H2
WVRQAPGKGLEWVG
SEQ ID No.:32-rFW1.4-SST的FR-H3
RFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTASYYCAR
SEQ ID No.:33-rFW1.4-SST的FR-H4
WGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:34-CDR-L1_D32X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIXNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:35-CDR-L1_N33X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDXWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:36-CDR-L1_W40X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNXLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:37-CDR-L2_R58X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYXASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:38-CDR-L2_T69X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASXLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:39-CDR-L3_T109X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNXGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。
SEQ ID No.:40-CDR-L3_G111X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGXGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)和丝氨酸(S)。
SEQ ID No.:41-CDR-L3_G112X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGXVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:42-CDR-L3_V135X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGXSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:43-CDR-L3_S136X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVXIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:44-CDR-H1_S33X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSXAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:45-CDR-H1_A39X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSXAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:46-CDR-H2_Y59X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIXDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:47-CDR-H2_D60X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYXSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)和脯氨酸(P)。
SEQ ID No.:48-CDR-H2_Y69X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTXYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:49-CDR-H3_R110X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREXAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:50-CDR-H3_A111X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERXIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:51-CDR-H3_I112X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAXFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:52-CDR-H3_F113X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIXSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：苯丙氨酸(F)和异亮氨酸(I)。
SEQ ID No.:53-CDR-H3_S114X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFXGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。
SEQ ID No.:54-CDR-H3_G115X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSXDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)和天冬酰胺(N)。
SEQ ID No.:55-CDR-H3_D135X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGXFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
SEQ ID No.:56-CDR-H3_F136X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSG DXVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:57-CDR-H3_V137X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFXLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:58-CDR-H3_L138X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVXWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:59-DLX2464
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERQIFSGDMAGWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:60-DLX2465
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERNIFSGDMDLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:61-DLX2466
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIGKYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSDAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERNIFSGDMAGWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:62-DLX2467
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIHNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASNLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGSSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSRAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERMIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:63-DLX2468
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIGNYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGTSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSSAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERNIFSGDMVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:64-DLX2475
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDKWLSWYQQKPGKAPKILIYQASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVHIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSYAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFKLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:65-DLX2476
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERDIFSGDFVGWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:66-DLX2480
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSDAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERQIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:67-DLX2543
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:68-DLX2529
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSIGNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASNLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:69-DLX2547
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:70-DLX2528
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIGNWLAWYQQKPGKAPKILIYQASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGATTIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:71-DLX2585
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:72-DLX2545
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERNIFSGDMVLWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:73-DLX2531
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSNSAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARERAIFSGDFALWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:74-DLX2586
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:75-DLX2530
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSDAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTFYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARERNIFSGDMALWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:76-DLX2548
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:77-DLX2676
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIGNWLAWYQQKPGKAPKILIYQASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGATTIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSDAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTFYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARERNIFSGDMALWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:78-DLX2677
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIGNWLAWYQQKPGKAPKILIYQASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGATTIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSNSAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARERAIFSGDFALWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:79-DLX2678
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIGNWLAWYQQKPGKAPKILIYQASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGATTIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:80-DLX2679
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIGNWLAWYQQKPGKAPKILIYQASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGATTIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:81-DLX2680
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSIGNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASNLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSDAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTFYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARERNIFSGDMALWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:82-DLX2681
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSIGNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASNLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSNSAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARERAIFSGDFALWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:83-DLX2682
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSIGNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASNLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:84-DLX2683
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSIGNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASNLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:85-DLX2684
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSDAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTFYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARERNIFSGDMALWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:86-DLX2685
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSNSAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARERAIFSGDFALWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:87-DLX2686
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:88-DLX2687
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGVSIAFGQGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:89-DLX2689
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNAGGGINIAFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSNSAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARERAIFSGDFALWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:90-DLX2690
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNAGGGINIAFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:91-DLX2691
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNAGGGINIAFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:92-DLX2692
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSDAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTFYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARERNIFSGDMALWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:93-DLX2693
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSNSAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTATYYCARERAIFSGDFALWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:94-DLX2694
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:95-DLX2695
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:96-VL CDR-L1_D32X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIXNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:97-VL CDR-L1_N33X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDXWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:98-VL CDR-L1_W40X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNXLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:99-VL CDR-L2_R58X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYXASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:100-VL CDR-L2_T69X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASXLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:101-VL CDR-L3_T109X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNXGGGVSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、异亮氨酸(I)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。
SEQ ID No.:102-VL CDR-L3_G111X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGXGVSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、脯氨酸(P)和丝氨酸(S)。
SEQ ID No.:103-VL CDR-L3_G112X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGXVSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:104-VL CDR-L3_V135X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGXSIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:105-VL CDR-L3_S136X
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVXIAFGQGTKLTVLG
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:106-VH CDR-H1_S33X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSXAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:107-VH CDR-H1_A39X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSXAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:108-VH CDR-H2_Y59X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIXDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:109-VH CDR-H2_D60X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYXSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：天冬氨酸(D)、天冬酰胺(N)和脯氨酸(P)。
SEQ ID No.:110-VH CDR-H2_Y69X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTXYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:111-VH CDR-H3_R110X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCAREXAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:112-VH CDR-H3_A111X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERXIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:113-VH CDR-H3_I12X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAXFSGDFVLWGQGTL VTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:114-VH CDR-H3_F113X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIXSGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：苯丙氨酸(F)和异亮氨酸(I)。
SEQ ID No.:115-VH CDR-H3_S114X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFXGDFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。
SEQ ID No.:116-VH CDR-H3_G115X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSXDFVLWGQGTLV TVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、甲硫氨酸(M)和天冬酰胺(N)。
SEQ ID No.:117-VH CDR-H3_D135X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGXFVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、组氨酸(H)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)。
SEQ ID No.:118-VH CDR-H3_F136X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDXVLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:119-VH CDR-H3_V137X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFXLWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:120-VH CDR-H3_L138X
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVXWGQGTLVTVSS
优选地，X选自：丙氨酸(A)、半胱氨酸(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、天冬酰胺(N)、脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
SEQ ID No.:121-VH DLX2464
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERQIFSGDMAGWGQGTL VTVSS
SEQ ID No.:122-VH DLX2465
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERNIFSGDMDLWGQGTL VTVSS
SEQ ID No.:123-VL DLX2466
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIGKYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGVSIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:124-VH DLX2466
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSDAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERNIFSGDMAGWGQGTL VTVSS
SEQ ID No.:125-VL DLX2467
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIHNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASNLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGSSIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:126-VH DLX2467
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSRAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERMIFSGDFVLWGQGTL VTVSS
SEQ ID No.:127-VL DLX2468
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIGNYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGTSIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:128-VH DLX2468
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSSAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERNIFSGDMVLWGQGTL VTVSS
SEQ ID No.:129-VL DLX2475
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDKWLSWYQQKPGKAPKILIYQASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVHIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:130-VH DLX2475
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSYAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFKLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:131-VL DLX2476
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGVSIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:132-VH DLX2476
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERDIFSGDFVGWGQGTL VTVSS
SEQ ID No.:133-VL DLX2480
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCQASQSIDNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:134-VH DLX2480
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSDAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERQIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:135-VL DLX2543
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSWLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGGVSIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:136-VL DLX2529
EIVMTQSPSTLSASVGDRVIITCRASQSIGNWLSWYQQKPGKAPKILIYRASNLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPEDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:137-VL DLX2547
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYRASTLASGVPSRFSGSGSGAEFTLTISSLQPDDFATYYCQNTGGGINIAFGQGTKLEIKR
SEQ ID No.:138-VH DLX2547
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SEQ ID No.:139-VL DLX2528
EIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSIGNWLAWYQQKPGKAPKILIYQASNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPDDFATYYCQNAGGATTIAFGQGTKLTVLG
SEQ ID No.:140-VH DLX2528
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SEQ ID No.:141-VL DLX2585
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SEQ ID No.:142-VH DLX2585
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SEQ ID No.:143-VL DLX2545
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SEQ ID No.:144-VH DLX2545
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SEQ ID No.:145-VL DLX2531
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SEQ ID No.:146-VH DLX2531
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SEQ ID No.:147-VL DLX2586
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SEQ ID No.:148-VH DLX2586
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTLV TVSS
SEQ ID No.:149-VL DLX2530
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SEQ ID No.:150-VH DLX2530
EVQLVESGGGNVQPGGSLRLSCTASGFSLSDAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTFYASWAKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTATYYCARERNIFSGDMALWGQGTTVTVSS
SEQ ID No.:151-VL DLX2548
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SEQ ID No.:152-VH DLX2548
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTVSGFSLSSYAMSWVRQAPGKGLEWIGIIYDSASTYYASWAKGRFTISKDTSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYFCARERQIFSGDMDGWGQGTTV TVSS
SEQ ID No.:153-VL DLX2544
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNAGGGINIAFGQGTKVEIKR
SEQ ID No.:154-DLX2544
ADIVMTQSPSTLSASVGDRVTITCQASQSISSYLSWYQQKPGKAPKILIYKASTLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQNAGGGINIAFGQGTKVEIKRGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFSLSSAAMAWVRQAPGKGLEWVGIIYDSASTYYASWAKGRFTISRDTSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARERAIFSGDFVLWGQGTLVTVSS
SEQ ID No.:155-DLX2531的CDR-H1
FSLSNSAMA
SEQ ID No.:156-DLX2531的CDR-H2
IIYDSASTYYASWAKG
SEQ ID No.:157-DLX2531的CDR-H3
ERAIFSGDFAL
SEQ ID No.:158-DLX2531的CDR-L1
QASQSIDNWLS
SEQ ID No.:159-DLX2531的CDR-L2
RASTLAS
SEQ ID No.:160-DLX2531的CDR-L3
QNTGGGVSIA
SEQ ID No.:161-DLX2681的CDR-L1
RASQSIGNWLS
SEQ ID No.:162-DLX2681的CDR-L2
RASNLAS
SEQ ID No.:163-DLX2681的CDR-L3
QNTGGGINIA
实施例
实施例1 rhIL-1β中和scFv的鉴定
兔子的免疫：用重组人IL-1β蛋白(Peprotech,USA，商品目录号200-01B)免疫兔子。最终加强之后分离淋巴结和脾细胞，并将细胞冷冻保存。
兔子B细胞的流式细胞术分选和培养：利用FACSAria III(BD Biosciences)，将IL-1β特异性记忆B细胞在96孔板中分选成单细胞。在饲养层细胞存在下培养单个B细胞克隆。
B细胞克隆的筛选：通过ELISA分析细胞培养物上清液中抗IL-1β-特异性IgG的存在。简而言之，4℃下在Maxisorp 96-孔微板上于PBS中，以2mcg/ml的浓度过夜包被rhIL-1β(Peprotech,商品目录号200-01B)。用5％脱脂奶粉封闭之后，添加细胞培养物上清液。通过抗兔IgG-HRP(Southern Biotech，商品目录号4050-05)检测IL-1β特异性IgG。用BM BluePOD底物(Roche Applied Science)显影ELISA。进一步分析rhIL-1β特异性的B细胞克隆在人成纤维细胞测试中的中和能力。
对中和IgG的IL-1β进行测序：使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen Germany,商品目录号74106)，对产生中和抗IL-1β抗体的全部兔B细胞克隆进行mRNA分离。根据厂商手册(一步RT-PCR试剂盒,Qiagen Germany,商品目录号210212)，将mRNA用作逆转录的模板。随后，利用寡核苷酸进行PCR反应，以特异性地扩增兔IgG重链和轻链编码序列(BiometraThermocycler T3)。各自测序重链和轻链PCR片段(ABI,Sanger 3730x1；Microsynth AG,Balgach,Switzerland)，然后利用EMBOSS Transeq(http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/)将所获得的DNA序列翻译成蛋白序列，并利用CLUSTALW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)比对。
抗IL-1βscFv基因的构建和scFv蛋白表达：鉴定以上所定义的兔IgG的轻链和重链CDR区，并将其分别移植至包括SEQ ID Nos.:18-21和22-25的人轻链和重链受体框架。产生编码scFv蛋白的细菌表达载体，所述scFv蛋白具有由序列SEQ ID No:9连接的N-端可变轻链和C-端可变重链。ScFv蛋白作为包涵体表达于大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen,USA,商品目录号69450-3)中，将其纯化、溶解并使蛋白重折叠。通过标准尺寸排阻色谱纯化重折叠的scFvs，并收集单体峰级分。通过ELISA分析所纯化的scFvs对IL-1β的结合。对于发现特异性结合rhIL-1β的ScFv，在人成纤维细胞测试中进行IL-1β中和的检测。通过该步骤，鉴定出有效的IL-1β抑制剂scFv DLX2323和其他抗IL-1βscFv。
实施例2 人IL-1β的识别
首先，通过ELISA验证由DLX2323特异性识别rhIL-1β(图1)。简而言之，4℃下于Maxisorp 96-孔微板的PBS中，以2mcg/ml的浓度包被rhIL-1β(Peprotech,商品目录号200-01B)过夜。用5％脱脂奶粉封闭之后，添加浓度渐增的scFvs(10-300ng/ml)，并通过蛋白L-辣根过氧化物酶(蛋白L-HRP)(Sigma-Aldrich,商品目录号P3226)检测scFvs。用BM BluePOD底物(Roche Applied Science)显影ELISA。使用无关特异性的scFv作为阴性对照。该结果显示DLX2323特异性结合至rhIL-1β。
为了证实DLX2323和对照scFv被蛋白L-HRP识别，并且在上述ELISA中缺少针对rhIL-1β结合的信号并非是由于检测问题，进行了另一个实验。将scFvs直接包被于平板上并如上所述通过蛋白L-HRP检测。所有的scFvs都在PBS中以2mcg/ml的浓度包被。该ELISA实验显示，DLX2323和对照scFv被检测因子蛋白L-HRP识别。
在另一ELISA(图2)中，验证了DLX2323识别人天然IL-1β。如公知的，在非人细胞的细胞中表达人蛋白可能会引起变化，例如翻译后修饰和/或构象的变化。这可能导致抗体对重组蛋白和天然蛋白的差异识别。用10ng/ml的PMA(Sigma-Aldrich,商品目录号P1585)、1mg/ml的LPS(Sigma-Aldrich,商品目录号L4391)和2mM的ATP(Sigma-Aldrich,商品目录号A6559-25UMO)刺激THP-1细胞(DSMZ Germany,商品目录号ACC 16)后分泌天然人IL-1β。收集细胞上清液，并利用人IL-1 β/IL-1 F2ELISA DuoSet(R&D Systems,商品目录号DY201)定量所分泌的人天然IL-1β。在DPBS(pH 7.4)中，以5mcg/ml的包被密度将DLX2323包被于96孔微板上(Maxisorp,Nunc)。将重组表达形式(Peprotech,商品目录号200-01B)的或天然分泌形式的人IL-1β以0.5-4ng/ml的终浓度范围施用。通过生物素化的山羊抗-hIL-1β抗体(R&D Systems,商品目录号DY201)和链霉亲和素-HRP(BD Pharmingen,商品目录号554060)检测结合的IL-1β。利用BM Blue POD底物(Roche Applied Science)进行ELISA显影。为了定量的目的，利用VersaMax酶标仪(Molecular Devices,USA)测量450nm处的吸光度。结果显示(参见图2)，重组的和天然的人IL-1β均被DLX2323以类似的水平识别。
实施例3 rhIL-1β生物学活性的中和
在人皮肤成纤维细胞测试(NHDF-Neo,商品目录号CC-2509,Lonza WalkersviILeUSA)中检测抗体和scFvs的IL-1β中和能力。用IL-1β活化这些成纤维细胞导致特异性IL-6释放，其通过ELISA定量。特异性抗体抑制IL-1β减少了IL-6从这些成纤维细胞中释放的量。抗IL-1β抗体的抑制性效价通过测定IL-1β诱导IL-6释放的半数最高减少(IC50)来定量。在添加IL-1β之前16-20小时，将人皮肤成纤维细胞以5000细胞/孔接种于96-孔微板中。在含有如细胞供应厂商(Lonza WalkersviILe USA:CloneticsTMDermal Fibroblast CeILSystems)所述的补充剂(hFGF-B,Insulin,FBS,GA-1000)的成纤维细胞基本培养基(FBM；Lonza,商品目录号CC-3131)中培养成纤维细胞。然后将FBM去除，用杜尔伯克氏改良伊格尔培养基(DMEM；Gibco,Life Technologies,商品目录号11880)冲洗细胞，以去除生长因子。然后将细胞在DMEM培养基中孵育7小时。于37℃，在DMEM中预先孵育抗体或scFvs和rhIL-1β1小时。将混合物以10pg/ml IL-1β的终浓度添加至细胞中。将不含任何抗IL-1β抗体的10pg/ml的IL-1β添加至细胞中作为阴性对照。施用抗IL-1β的小鼠单克隆抗体(R&Dsystems,USA,商品目录号MAB201)作为阳性对照。用IL-1β/抗IL-1β抗体混合物孵育细胞18-24小时，然后根据厂商说明书，利用人IL-6DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,USA,商品目录号DY206)分析细胞培养物上清液中IL-6释放。
在8个独立的测试中确定DLX2323的IC50为3pM±1.05。
实施例4 与可商购的IL-1β抑制剂进行中和效价的比较
DLX2323被鉴定为中和IL-1β的scFv。在如实施例3所述的人皮肤成纤维细胞测试中评估DLX2323和其他抑制剂的生物效价。在添加至孔之前，用浓度渐增的scFv DLX2323、抗人IL-1β单克隆IgG抗体MAB201、IL-1β受体拮抗剂(rhIL-1ra)(R&D systems,商品目录号280-RA-010/CF)或FDA批准销售的卡那单抗IgG(Novartis,)预先孵育重组人IL-1β。进行了两个独立的实验：图3A示出了DLX2323与MAB201的比较，而图3B示出了DLX2323与rhIL-1ra和卡那单抗的比较。确定了以下IC50值：MAB201:2-3pM；DLX2323:2-4pM；rhIL-1ra:40pM，以及卡那单抗:90pM。总之，单价单体scFv DLX2323与双价单克隆小鼠抗体MAB201的效价几乎一样。与销售的抑制剂卡那单抗和rhIL-1ra相比，在中和人IL-1β时其显示了明显更高的效价。此外，DLX2323可完全阻断IL-1β诱导的IL-6释放。
实施例5 可溶性
将DLX2323保存于pH 7.2的PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液1X,Gibco,LifeTechnologiesTM,商品目录号20012)中。为了确定其最大溶解度、利用Vivaspin 20浓缩离心管(Sartorius Stedim Biotech,商品目录号VS2001)于室温下浓缩DLX2323。由于样品的高粘度，在71mg/ml时停止浓缩处理。所获得的DLX2323蛋白溶液是粘的、清澈的，目测观察无沉淀。
实施例6 稳定性
对于scFvs的稳定性，可观测到促成其不稳定的两种不同处理。首先，scFv易于发生二聚化，之后常常低聚化，并最终聚集在一起。其次，scFv可随着时间而发生降解，形成更小的片段。为判断DLX2323是否稳定，设置HPLC(Dionex,Summit system)尺寸排阻色谱(Tosoh,TSKgel G2000SWxl,商品目录号08540)，以确定在特定时间点不同蛋白浓度和温度(如4℃、室温(RT)和37℃)下，未降解的scFv蛋白单体的百分比。在研究开始时(T0)和一个月后测定1mg/ml的DLX2323的单体百分比，在另一实验中，在两周后测定50mg/ml的DLX2323溶液。蛋白配制于pH 7.2的PBS中。稳定性研究的结果列于表1和表2中。
表1
表2
通过差示扫描荧光分析(DSF)评估DLX2323的热稳定性。为了该测量，实时PCR仪(Corbett,Rotor-Gene)以30℃至95℃(以1℃的步骤升高，每步等待5秒)的温度梯度加热DLX2323。蛋白样品包含0.5mg/ml的DLX2323和在PBS中的20xOrange(Sigma-Aldrich,商品目录号S5692、5000x)。蛋白一开始解链，Sypro Orange就变成发荧光。在梯度运行期间在线测定该荧光(470nm的激发波长；555nm的发射波长)。利用Rotor-Gene 6000系列软件1.7，计算出DLX2323的中点解链温度(Tm)为74℃。
实施例7 交叉反应性
用ELISA评估DLX2323对其他非人类物种的IL-1β同系物的交叉反应性。研究了结合至重组表达的以下物种的IL-1β蛋白：食蟹猴(Sino Biological Inc.USA,商品目录号90010-CNAE)、恒河猴(R&D Systems,USA,商品目录号1318-RL/CF)、猪(KingfisherBiotech,USA,商品目录号RP0297S-025)、犬(Kingfisher Biotech,USA,商品目录号RP0085D-025)、豚鼠(Kingfisher Biotech,商品目录号RP0343GP-025)、大鼠(Peprotech,商品目录号400-01B)以及小鼠(BioLegend,商品目录号575102)。DLX2323的结合与ELISA-阳性对照抗体(R&D Systems,USA，山羊抗人IL-1β多克隆IgG，商品目录号AB-201-NA；BioLegend,Inc.USA，生物素抗小鼠/大鼠IL-1β抗体，商品目录号503505)进行比较。简而言之，在4℃下将蛋白以2mcg/ml的浓度包被于Maxisorp 96-孔微板的PBS中过夜。用5％脱脂奶粉封闭之后，将浓度渐增的DLX2323(0.1mcg/ml、0.3mcg/ml和1.0mcg/ml)添加至孔中。利用IL-1β特异性对照抗体分别验证每种蛋白的成功包被。通过蛋白L-HRP(Sigma-Aldrich,USA,商品目录号P3226)检测DLX2323，通过链霉亲和素-HRP(BD Pharmingen,USA,商品目录号554060)或用HRP标记的其他合适的二抗来检测对照抗体。用BM Blue POD底物(RocheApplied Science)显影ELISA，于450nm处测定吸光度。DLX2323识别直系同源的四个物种的IL-1β，即人、食蟹猴、恒河猴和大鼠的IL-1β。未观测到猪、豚鼠、犬和小鼠IL-1β的交叉反应。
除了DLX2323对其他非人类物种的IL-1β同系物的交叉反应性之外，还测量了DLX2323对于不同的人IL-1家族成员和其他细胞因子的识别模式：rhIL-1ra(R&D systems,USA,商品目录号280-RA-010/CF)、rhIL-1α(PeproTech,商品目录号200-01A)、rhIL-18(BioVision,商品目录号4179-25)、rhIL-33(Peprotech,商品目录号200-33)、IL-36ra(R&DSystems,商品目录号1275-1L/CF)、rhTNFα(Peprotech,Hamburg,Germany,商品目录号300-01A)以及rhIL-6(Peprotech,商品目录号200-06)。在使用的ELISA测试中，以下抗体用作阳性对照：生物素抗人IL-1ra(BioLegend,商品目录号509501)、生物素抗人IL-1α(BioLegend,商品目录号515703)、抗人IL-18多克隆抗体(BioVision,商品目录号5179-100)、生物素抗人IL-33抗体(Peprotech,商品目录号500-P261Bt)、抗人TNFαscFv DLX105(Delenex所有的抗体，描述于WO 2006/131013A中)、生物素抗人IL-6(R&D systems,DY206,商品目录号840114)、抗人IL-36ra(R&D systems,商品目录号AF1275)。基本上如上所述进行ELISA。未检测到DLX2323对任何一种这些测试的人IL-1家族成员和细胞因子的交叉反应。
实施例8 体内效力
在本实施例中，证明了DLX2323对人IL-1β活性的体内抑制。人IL-1β可结合并活化小鼠IL-1受体，从而在小鼠体内诱导炎症性反应。炎症引起血清中包括小鼠IL-6(mIL-6)的细胞因子水平升高。将重组人IL-1β(Peprotech,商品目录号200-01B)以1.5mcg/kg体重的剂量皮下给予8周大的雄性BALB/c小鼠(Charles River,Germany)。2小时后，血清中mIL-6水平显著升高。为了测试DLX2323在体内的中和能力，在给予IL-1β剂量之前2小时进行腹膜内(i.p.)注射。一组小鼠用5mg/kg剂量的DLX2323注射，第二组用15mg/kg剂量的DLX2323注射。阴性对照组用PBS i.p.或无相关特异性的scFvs处理。第五组小鼠用10mg/kg的卡那单抗(Novartis,)进行静脉内注射，作为阳性对照。施用rhIL-1β两小时后，取血样，并根据厂商说明书，利用小鼠IL-6DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,商品目录号DY406)测量血清的mIL-6水平。对于用DLX2323和卡那单抗处理的小鼠组，仅检测到非常少量的mIL-6或未检测到mIL-6(0.0-2pg/ml的mIL-6；图4)。接受PBS或对照scFv的小鼠显示50至170pg/ml的显著升高的IL-6水平。DLX2323在体内环境中非常有效地中和人IL-1β，即使剂量为5mg/kg。
实施例9 CDR文库
为了更好的表征DLX2323与人IL-1β的结合，设计氨基酸突变并位点特异性地插入至DLX2323的CDR区。基于其表面暴露而选择CDR位点用于进行诱变，预期的与人IL-1β的相互作用由同源模型或与先前的兔IgG进行序列比对来推导。在轻链中，选择CDR-L1中的基序DNW(SEQ ID No:14)、CDR-L2中的氨基酸残基R和T(SEQ ID No:15)、CDR-L3中的苏氨酸及基序GGVS(SEQ ID No:16)来设计DLX2323的变体。在重链中，选择CDR-H1中的基序SA(SEQ IDNo:11)、CDR-H2中的基序YD和之后的酪氨酸(SEQ ID No:12)。在CDR-H3中，选择除了N-端谷氨酸(E)外的全部位点进行取代(SEQ ID No:13)。所有的所述位点在SEQ ID Nos.11-16中分别用X表示。定点诱变、克隆的测序以及文库组装均通过GeneArt(Life TechnologiesTM，Regensburg,Germany)进行。
将所得到的scFv突变体表达于96孔板中大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen,USA,商品目录号69450-3)的1ml培养物中。表达期间，该系统中的大部分scFv蛋白在细胞内形成不溶性包涵体，但是细胞裂解之后可从可溶部分提取出相当大量的蛋白，发现这足够用于通过rhIL-1βELISA的分析(详见实施例2)。通过冷冻后再解冻，将细胞裂解于96孔板的裂解缓冲液中(1mM EDTA、0.1mg/ml溶菌酶、PBS pH7.2)。通过离心澄清所得到的粗提物。将上清液添加至每孔包被50ng/ml的rhIL-1β(Peprotech)的微量滴定板的孔中。冲洗之后，通过蛋白L-HRP检测所结合的scFvs，并通过BM Blue POD底物(Roche Applied Science)定量结合至rhIL-1β的量。
表3列出明确允许rhIL-1β结合的单点突变，由至少超过阴性对照2倍但不小于0.1光单位的ELISA信号所定义。
表3
这些结合数据具有预测价值，还涉及中和rhIL-1β的生物学功能，如通过以大规模形式表达5个示例性单点突变体，纯化成同质，并与同样纯化的DLX2323蛋白一起经历基于细胞的分析所验证。
将DLX2323_CDR-H1_A39N(具有X＝N的SEQ ID No.45)、DLX2323_CDR-H3_A111N(具有X＝N的SEQ ID No.:50)、DLX2323_CDR-H3_F136N(具有X＝N的SEQ ID No.56)、DLX2323_CDR-H3_V137D(具有X＝D的SEQ ID No.:57)、DLX2323_CDR-H3_L138D(具有X＝D的SEQ IDNo.:58)以及相应的亲本scFv—DLX2323，以2升规模表达于大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen)细胞中。经超声裂解细胞之后，通过离心富集包涵体，冲洗，使蛋白溶解于胍缓冲液(6M胍/HCl，100mM Tris，1mM EDTA，pH8.5)中，在尿素缓冲液(4M尿素、50mM甘氨酸、2mM胱氨酸、2mM半胱氨酸，pH10)中重折叠，于50mM甘氨酸、50mM NaCl(pH10)中浓缩，通过尺寸排阻色谱纯化成同质。将该步骤中的单体峰级分浓缩成最终蛋白含量约0.5-5mg/ml，通过无菌过滤器元件，并同样地经历如实施例3所述的基于细胞的分析。表4示出在独立的两轮操作中确定的每种突变体的中和效价IC50。
表4
克隆ID IC<sub>50</sub>
DLX2323 2-4pM
DLX2323_CDR-H1_A39N 10pM
DLX2323_CDR-H3_A111N 2-4pM
DLX2323_CDR-H3_F136N 2-4pM
DLX2323_CDR-H3_V137D 5pM
DLX2323_CDR-H3_L138D 10pM
与之前的ELISA结果总体良好一致，所选择的全部5个单点突变体都观测到低pM范围的IC50值。所选择突变体子集的每个成员对rhIL-1β具有与亲本scFv DLX2323相当的中和能力。因此，DLX2323及其变体对rhIL-1β的结合表明，允许有效程度的序列可变性而同时保留了关键的功能特征。
实施例10 产生组合的变体
基于以上所述，设计组合有3至9个之前所研究的CDR单点变化的DLX2323的组合突变体。基于以下选择个别残基变化：(i)与亲本抗体DLX2323相当或超过其的强ELISA结合结果，(ii)会同时影响多个CDR区的远扩散的(far-spread)单点变化的组合，以及(iii)单独的CDR-H3累积调控。在实施例3的人成纤维细胞测试中评估中和能力之前，将所设计的突变体以大规模形式表达，并如上所述纯化单个突变体。在表5中详述了每条序列中单个氨基酸变化和相应的scFv蛋白的IC50数据。这些分离的scFv蛋白在体外全部具有针对rhIL1β的中和活性。最佳的5个备选者显示低皮摩尔级的IC50值，因而与亲本scFv DLX2323高度相当。
表5
设计在可变轻链和/或可变重链的CDR区和侧翼框架中携带多于6个氨基酸取代的变体。总的来说，产生和表达10个组合的备选者(4个VL和6个VH突变体序列)，并进行针对rhIL1β结合(ELISA)和如实施例3所述的体外中和(人成纤维细胞测试)的功能性分析。表6总结了各点突变以及各克隆在两个独立实验中测定的中和效价。
表6
在体外人成纤维细胞测试中，发现所有10个scFv蛋白有效地中和rhIL1β，具有高飞摩尔(femtomolar)级至低皮摩尔级的IC50值。克隆DLX2531、DLX2548、DLX2585、DLX2530、DLX2529和DLX2586可重现地产生比亲本scFv DLX2323更低的IC50值。
最后，将上述VL和VH序列进行链改组。用19条链改组的VL和VH突变体转化的大肠杆菌BL21Origami细胞的澄清裂解物验证了与rhIL1β的结合。表7总结了这些取代。
表7
如果获得>0.1光单位的ELISA信号，其为阴性对照的至少2倍高，则结合被认为是特异性的。结果示出于图6中。例如，虽然DLX2690和DLX2691少量通过截止滤波器(cut-offfilter)，但是被检测为阳性的。其余收集的VL和VH链改组的突变体以与DLX2323相当或甚至更高的绝对ELISA信号与rhIL1β相结合。
在如上所述的人成纤维细胞测试中确定DLX2681和DLX2693的IC50值。发现DLX2681中和rhIL1β具有0.6pM的IC50值，而DLX2693的IC50值测定为12.5pM。
虽然示出并描述了本发明目前优选的实施方案，但是应当理解的是，本发明并不限于此，可在所附权利要求范围内另外不同地呈现和实施。对本领域技术人员而言，由于本发明的众多修改和替代实施方案是显而易见的，本说明书仅被视为是说明性的，且目的为教导本领域技术人员实施本发明的最佳方式。因此，所有合适的修改和等效物可被认为落入所附的权利要求范围内。

Claims (70)

1.抗IL-1β的抗体或抗体片段，其包括
a.以下重链可变区(VH)CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3：
(i)分别如SEQ ID Nos.:1、2和3所示，或
(ii)分别如SEQ ID Nos.:155、156和157所示；和
b.以下轻链可变区(VL)CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3：
(i)分别如SEQ ID Nos.:4、5和6所示，或
(ii)分别如SEQ ID Nos.:161、162和163所示。
2.权利要求1所述的抗体或抗体片段，其对于抑制人IL-1β的生物学效应具有低于50pM的IC50，所述IC50通过抑制IL-1β刺激的从人成纤维细胞中释放IL-6而确定。
3.权利要求2所述的抗体或抗体片段，其中所述IC50低于5pM。
4.权利要求1所述的抗体或抗体片段，其为单价抗体片段。
5.权利要求4所述的抗体或抗体片段，其为Fab、Fab'、scFv或Fv片段。
6.权利要求1所述的抗体或抗体片段，其为全长免疫球蛋白或双价抗体片段。
7.权利要求1所述的抗体或抗体片段，其为F(ab')2。
8.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，其包括至少一种SEQ ID No.:18的轻链可变区框架区FR-L1、SEQ ID No.:19的轻链可变区框架区FR-L2、SEQ ID No.:20的轻链可变区框架区FR-L3和/或SEQ ID No.:21的轻链可变区框架区FR-L4。
9.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，其包括至少一种SEQ ID Nos.:22、26或30的重链可变区框架区FR-H1；SEQ ID Nos.:23、27或31的重链可变区框架区FR-H2；SEQ ID Nos.:24、28或32的重链可变区框架区FR-H3；和/或SEQ ID Nos.:25、29或33的重链可变区框架区FR-H4。
10.权利要求1至7中任一项所述的抗IL-1β的抗体或抗体片段，其包括
a.具有选自SEQ ID No.:7和SEQ ID No.:146的序列的VH序列；和/或
b.具有选自SEQ ID No.:8、SEQ ID No.:136和SEQ ID No.:145的序列的VL序列。
11.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，其包括SEQ ID No.:9的接头序列。
12.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，其具有选自SEQ ID No.:10、SEQID No.:73和SEQ ID No.:82的序列。
13.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，其为人源化的。
14.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，其与食蟹猴IL-1β、恒河猴IL-1β和/或大鼠IL-1β交叉反应。
15.结合成员，其包括权利要求1所述的抗体或抗体片段的轻链可变区和重链可变区序列。
16.权利要求15所述的结合成员，其为单价或多价的。
17.权利要求16所述的结合成员，其为多价且多特异性的。
18.权利要求16所述的结合成员，其为单价结合成员Fab、Fab'、scFv、或Fv片段。
19.权利要求16所述的结合成员，其为多价结合成员全长免疫球蛋白、双体抗体或bis-scFv。
20.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段或者权利要求15所述的结合成员，其为化学修饰的或生物学修饰的。
21.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段或者权利要求15所述的结合成员，其被修饰为延长在体内血清中的半衰期停留时间。
22.分离的核酸，其编码权利要求1所述的抗体或抗体片段。
23.分离的核酸，其编码权利要求15所述的结合成员。
24.权利要求22或23所述的核酸，其包括SEQ ID No.:17。
25.载体，其包括权利要求22所述的核酸。
26.载体，其包括权利要求23所述的核酸。
27.权利要求25或26所述的载体，其为克隆载体或表达载体。
28.宿主细胞，其包括权利要求22所述的核酸。
29.宿主细胞，其包括权利要求23所述的核酸。
30.宿主细胞，其包括权利要求25所述的载体。
31.宿主细胞，其包括权利要求26所述的载体。
32.权利要求28至31中任一项所述的宿主细胞，其为原核细胞或真核细胞。
33.组合物，其包括权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，权利要求15所述的结合成员，权利要求22或23所述的核酸，权利要求25或26所述的载体，或者权利要求28至31中任一项所述的宿主细胞；以及还包括稀释剂或赋形剂。
34.权利要求33所述的组合物，其为美容组合物、诊断组合物或药物组合物。
35.权利要求34所述的组合物，其为药物组合物并且包括药学可接受的稀释剂或赋形剂。
36.权利要求35所述的组合物，其配制为用于肠胃外、口服或外用给药。
37.如权利要求36所述的组合物,其配制为用于直肠、泌尿生殖器、眼内或鼻内给药。
38.如权利要求36所述的组合物,其配制为用于吸入给药。
39.如权利要求36所述的组合物,其配制为用于静脉内给药。
40.权利要求36所述的组合物，其配制为用于玻璃体内、皮肤或舌下给药。
41.权利要求36所述的组合物，其配制为用于耳部或颊部给药。
42.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，权利要求15所述的结合成员，权利要求22或23所述的核酸，权利要求25或26所述的载体，或者权利要求28至31中任一项所述的宿主细胞在制备用于治疗IL-1β介导的疾病的药物中的用途。
43.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，权利要求15所述的结合成员，权利要求22或23所述的核酸，权利要求25或26所述的载体，或者权利要求28至31中任一项所述的宿主细胞在制备用于诊断IL-1β介导的疾病的药物中的用途。
44.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，权利要求15所述的结合成员，权利要求22或23所述的核酸，权利要求25或26所述的载体，或者权利要求28至31中任一项所述的宿主细胞在制备用于美容的美容组合物中的用途。
45.权利要求42所述的用途，其中所述IL-1β介导的疾病为：增殖性糖尿病视网膜病变、痛风性关节炎、施尼茨勒综合征、全身性幼年特发性关节炎、类风湿性关节炎、荨麻疹、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、强直性脊柱炎、复发性多病灶性骨髓炎、复发性多软骨炎、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、白塞病、家族性地中海热、慢性阻塞性肺病、多肌痛风湿病、坏疽性脓皮病、慢性特发性荨麻疹、骨关节炎、湿性老年性黄斑变性、干眼综合征、脓疱性银屑病、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨质增生-骨炎综合征、巨噬细胞活化综合征、周期性发热腺炎咽炎口疮性溃疡综合征、成人斯蒂尔病、甲羟戊酸激酶缺乏症、动脉粥样硬化、TNF-受体相关的周期性综合征(TRAPS)、寻常性痤疮和/或反常性痤疮。
46.权利要求45所述的用途，其中所述IL-1β介导的疾病为：急性痛风性关节炎或慢性痛风性关节炎。
47.权利要求43所述的用途，其中所述IL-1β介导的疾病为：增殖性糖尿病视网膜病变、痛风性关节炎、施尼茨勒综合征、全身性幼年特发性关节炎、类风湿性关节炎、荨麻疹、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、强直性脊柱炎、复发性多病灶性骨髓炎、复发性多软骨炎、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、白塞病、家族性地中海热、慢性阻塞性肺病、多肌痛风湿病、坏疽性脓皮病、慢性特发性荨麻疹、骨关节炎、湿性老年性黄斑变性、干眼综合征、脓疱性银屑病、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨质增生-骨炎综合征、巨噬细胞活化综合征、周期性发热腺炎咽炎口疮性溃疡综合征、成人斯蒂尔病、甲羟戊酸激酶缺乏症、动脉粥样硬化、TNF-受体相关的周期性综合征(TRAPS)、寻常性痤疮和/或反常性痤疮。
48.权利要求47所述的用途，其中所述IL-1β介导的疾病为：急性痛风性关节炎或慢性痛风性关节炎。
49.产生权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段或者权利要求15所述的结合成员的体外方法，其包括以下步骤：
(i)培养权利要求28至31中任一项所述的宿主细胞，以便表达抗体或抗体片段或结合成员；
(ii)回收；以及
(ii)分别纯化抗体或抗体片段或结合成员。
50.产生权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段或者权利要求15所述的结合成员的体外方法，其包括以下步骤：
(i)提供无细胞的系统；
(ii)提供核酸产物模板；
(iii)允许所述核酸产物模板转录和翻译；以及
(iv)分别回收抗体或抗体片段或结合成员。
51.权利要求50所述的体外方法，其还包括以下步骤：
(v)分别纯化抗体或抗体片段或结合成员。
52.产生权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段或者权利要求15所述的结合成员的体外方法，其包括至少一个化学合成的步骤。
53.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段，权利要求15所述的结合成员，权利要求22或23所述的核酸，权利要求25或26所述的载体，或者权利要求28至31中任一项所述的宿主细胞在制备用于治疗受试者IL-1β相关疾病的药物中的用途。
54.权利要求53所述的用途，其中所述IL-1β介导的疾病为：增殖性糖尿病视网膜病变、痛风性关节炎、施尼茨勒综合征、全身性幼年特发性关节炎、类风湿性关节炎、荨麻疹、血管炎、1型糖尿病、2型糖尿病、强直性脊柱炎、复发性多病灶性骨髓炎、复发性多软骨炎、冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、白塞病、家族性地中海热、慢性阻塞性肺病、多肌痛风湿病、坏疽性脓皮病、慢性特发性荨麻疹、骨关节炎、湿性老年性黄斑变性、干眼综合征、脓疱性银屑病、滑膜炎-痤疮-脓疱病-骨质增生-骨炎综合征、巨噬细胞活化综合征、周期性发热腺炎咽炎口疮性溃疡综合征、成人斯蒂尔病、甲羟戊酸激酶缺乏症、动脉粥样硬化、TNF-受体相关的周期性综合征(TRAPS)、寻常性痤疮和/或反常性痤疮。
55.权利要求54所述的用途，其中所述IL-1β介导的疾病为：急性痛风性关节炎或慢性痛风性关节炎。
56.权利要求53所述的用途，其中所述受试者为人。
57.权利要求53所述的用途，其中将所述药物提供成药物组合物形式。
58.权利要求53所述的用途，其中所述抗体或抗体片段、所述结合成员、所述核酸、所述载体或者所述宿主细胞通过肠胃外、口服或外用给药。
59.权利要求58所述的用途，其通过直肠、泌尿生殖器、眼内或鼻内给药。
60.权利要求58所述的用途，其通过吸入给药。
61.权利要求58所述的用途，其通过静脉内给药。
62.权利要求58所述的用途，其中所述抗体或抗体片段、所述结合成员、所述核酸、所述载体或者所述宿主细胞通过玻璃体内、皮肤或舌下给药。
63.权利要求62所述的用途，其中所述抗体或抗体片段、所述结合成员、所述核酸、所述载体或者所述宿主细胞通过耳部或颊部给药。
64.权利要求53所述的用途，其中所述抗体或抗体片段、所述结合成员、所述核酸、所述载体或者所述宿主细胞分别与至少一种另外的治疗有效的化合物一起提供。
65.权利要求64所述的用途，其中所述化合物与所述抗体或抗体片段、所述结合成员、所述核酸,、所述载体或所述宿主细胞同时或依次给予。
66.权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段或者权利要求15所述的结合成员在制备用于检测生物样品中存在IL-1β的试剂盒中的用途。
67.权利要求66所述的用途，其中所述生物样品为人来源的。
68.权利要求66所述的用途，其中所述生物样品为血液、尿液、脑脊液、活组织切片和/或淋巴液。
69.权利要求66所述的用途，其中所述试剂盒用于选择符合治疗的受试者。
70.试剂盒，其包括权利要求1至7中任一项所述的抗体或抗体片段或者权利要求15所述的结合成员，以及包装的试剂组合和使用说明书。
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