CN1780855A - 人IL－1β拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明包含特异结合人成熟IL－1β的经分离抗体或其抗原结合部分。这些抗体或其抗原结合部分与天然抗体相比，通常显示高结合亲和力(低koff值)及脱酰胺作用降低，并可用于治疗多种疾病如类风湿性关节炎、骨关节炎或神经炎症。

Description

人IL-1β拮抗剂
发明背景
白细胞介素-1β(IL-1β)是促炎细胞因子。IL-1β的过量产生表明是多种疾病如类风湿性关节炎及骨关节炎的致病原因。显示IL-1β通过上调粘附分子、刺激前列腺素及金属蛋白酶的产生、抑制胶原蛋白及蛋白聚糖的合成以及刺激破骨细胞的骨再吸收，从而增强细胞迁移到发炎关节滑液中。由于此类特性，IL-1β是关节炎中骨及软骨破坏的主要介质之一。因此，降低IL-1β活性的试剂代表疾病如关节炎的可能治疗剂。
IL-1基因家族有三个成员：IL-1α、IL-1β及IL-1受体拮抗剂(IL-1ra)。IL-1α及IL-1β为IL-1受体的激动剂，而IL-1ra为特异的受体拮抗剂并因此为IL-1的内源性竞争抑制剂。在临床试验中向患者施用重组IL-1ra，与施用安慰剂的患者相比，患有严重类风湿性关节炎的患者有显著临床改善。此外，施用IL-1ra降低了进行性关节损伤的速度。然而，药物代谢动力学特性不佳以及必需施用大剂量使重组IL-1ra不能成为理想的治疗剂。
IL-1β的高亲和性中和抗体可成为较好的治疗剂。与重组IL-1ra相比，抗体典型的长清除半衰期与高亲和力结合在一起产生具有降低剂量及频率的治疗剂。虽然已对许多IL-1β抗体进行了描述，但鉴定具有高亲和性、高特异性及强效中和活性的单克隆抗体是非常困难的。
本发明包含衍生自针对人IL-1β的独特鼠抗体Mu007(参见PCT/US02/21281)的人源化IL-1β抗体。此类抗体为具有强效IL-1β中和活性并对IL-1β具有高度特异的具有改善稳定性的高亲和性抗体。
发明概述
本发明包含特异结合人IL-1β的经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含轻链及重链，并且其中所述轻链进一步包含选自SEQ IDNO：1、12、22、29、31、33、37或39的轻链CDR1；轻链CDR2；及选自SEQ ID NO：3、7、13、15、17、20、25、34或41的轻链CDR3；以及所述重链进一步包含选自SEQ ID NO：4或10的重链CDR1；选自SEQ ID NO：5、8、16、18、21、23或28的重链CDR2序列；及选自SEQ ID NO：6、9、11、14、19、24、26、27、30、32、35、36、38、40或42的重链CDR3；条件是所述抗体不是由SEQ ID NO：1的轻链CDR1、SEQ ID NO：2的轻链CDR2、SEQ ID NO：3的轻链CDR3、SEQ ID NO：4的重链CDR1、SEQID NO：5的重链CDR2及SEQ ID NO：6的重链CDR3组成。
本发明包括这样的抗体，通过表面胞质共振(HBS-EP缓冲液，于25℃pH7.4)确定所述抗体以Kd为1×10-11M或低于1×10-11M与人成熟IL-1β结合以及以koff速率常数为1×10-3s-1或低于1×10-3s-1与人成熟IL-1β解离，并在标准T1165.17增殖测定法中中和人IL-1β的活性。
本发明进一步提供了抗体，优选人源化抗体或其抗原结合部分，其中在重链互补决定区2(HCDR2；SEQ ID NO：44)的第55位去除脱酰胺作用导致稳定性改善。
本发明包括人源化抗体，所述人源化抗体包含人源的轻链可变构架及三个CDR以及人源的重链可变构架及具有由对应于SEQ ID NO：55-64的多核苷酸序列编码的氨基酸序列的三个CDR。
此外，本发明包括人源化抗体，所述人源化抗体包含人源的轻链可变构架及三个CDR以及人源的重链可变构架及具有对应于SEQ ID NO：48-54及68的氨基酸序列的三个CDR。
本发明包括经分离核酸，所述核酸包含编码文中描述及要求权利的抗体的多核苷酸。本发明也包含用表达文中描述及要求权利的抗体的此类多核苷酸转染的宿主细胞。
本发明包含治疗类风湿关节炎及骨关节炎的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的文中描述及要求权利的抗体，以及抑制易得关节炎或患关节炎受试者发生的软骨破坏的方法。
本发明进一步包含治疗与中风及局部缺血、兴奋性中毒及外伤性颅脑损伤(traumatic head injury)相关的神经炎症的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的文中描述及要求权利的抗体。
本发明又进一步包含抗体用于制备治疗患有类风湿关节炎、骨关节炎或抑制需要此种治疗的受试者软骨破坏的药物的用途。
最后，本发明进一步包含抗体用于制备治疗患有与中风及局部缺血、兴奋性中毒及外伤性颅脑损伤相关的神经炎症的受试者的药物的用途。
发明详述
本发明包含经分离人抗体或其抗原结合部分，基本上包含Mu007抗体的互补决定区(CDR)(SEQ ID NO：1-6)但其中多肽结构在其一个或多个CDRs中包含一个或多个氨基酸的不同。此类抗体的构架及其它部分可来自人胚系。Mu007的人源化形式与人IL-1β以高亲和力、慢解离速率结合，并具有高中和能力。本发明的多方面涉及抗体与抗体片段及其药物组合物，以及核酸、重组表达载体及用于制备此类抗体及片段的宿主细胞。用本发明所述抗体抑制人IL-1β活性的方法也包含在本发明中。
为了可更易于理解本发明，首先对一些术语进行定义。
如文中应用的术语“抗体”，意指的是包含四条多肽链的免疫球蛋白分子，两条重链(H)及两条轻链(L)通过二硫键互相连接。每条重链包含重链可变区(文中简称为HCVR或VH)及重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，CH1、CH2及CH3。每条轻链包含轻链可变区(文中简称为LCVR或VL)及轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH及VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其由较保守的称为构架区(FR)的区域分隔开。每条VH及VL包含三个CDR及四个FR，自氨基端至羧基端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
轻链分类为κ及λ。重链分类为γ、μ、α、δ或ε，并分别定义抗体的同种型为IgG、IgM、IgA、IgD及IgE。在轻链及重链中，可变区及恒定区通过约12个或12个以上氨基酸的“J”区连接，重链也包括约3个或3个以上氨基酸的“D”区。
IgG抗体是血清中最丰富的免疫球蛋白。在任何免疫球蛋白中IgG于血清中也具有最长的半衰期。与其它免疫球蛋白不同，IgG在结合FcRn后可有效地再循环。有四个IgG亚类G1、G2、G3及G4，每个具有不同的效应子功能。G1、G2和G3可结合Clq并固定补体而G4不能。虽然G3比G1能更有效的结合Clq，但G1在介导补体定向的细胞裂解中更有效。G2不能有效的固定补体。IgG中的Clq结合位点位于CH2结构域的羧端区域。
所有IgG亚类能结合Fc受体(CD16、CD32、CD64)，G1及G3比G2及G4更有效。IgG的Fc受体结合区域通过位于铰链区及CH2结构域的羧端区域的残基形成。
如文中应用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简单称为“抗体分子”)，指的是保留与抗原(例如，人IL-1β)特异结合能力的抗体的一个或多个片段。显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体片段进行。术语抗体的“抗原结合部分”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH及CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL及VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人，(1989)Nature 341：544-546)；以及(vi)经分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL及VH是通过单独基因编码的，使用重组方法，它们可通过合成接头连接成单一蛋白质链，其中所述单一蛋白质链中VL及VH区配对形成单价分子(也称为单链Fv(scFv)；参见例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426：及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。此类单链抗体也包含在术语抗体的“抗原结合部分”中。也包含单链抗体的其它形式如双抗体(diabody)。双抗体为二价、双特异抗体，其中VH及VL结构域在单一多肽链上表达，但用接头太短以至于同一链上的两个结构域之间不能配对，因此促使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见，例如，Holliger，P.等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448；Poljak，R.J.等人，(1994)Structure 2：1121-1123)。
又进一步，抗体或其抗原结合部分可为较大的免疫粘附分子的一部分，其中所述的较大免疫粘附分子是通过抗体或抗体部分与一个或多个其它蛋白质或肽共价或非共价连接形成。此类免疫粘附分子的实例包括用链亲和素核芯区域制备四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人，(1995)HumanAntibodies and Hybridomas 6：93-101)以及用半胱氨酸残基、标记肽及C-端多聚组氨酸标记制备二价及生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等人，(1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。抗体部分，如Fab及F(ab’)2片段，可用常规技术如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体，从而自完整抗体制备。此外，如文中描述的，用标准重组DNA技术可获得抗体、抗体部分及免疫粘附分子。
术语“人源化抗体”表示包含部分或全部衍生自人抗体种系的氨基酸序列或重排序列并通过改变具有非人互补决定区(CDR)的抗体序列制备的抗体。可变区的构架区由对应的人构架区替代。如文中讨论的，人源化抗体相关的抗体不限于全长抗体并可包括片段及单链形式。
如文中应用的，术语“重组人抗体”欲包括所有通过重组手段制备、表达、产生或分离的人抗体，如用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，分离自重组、组合人抗体文库的抗体，分离自用人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)的抗体(参见，例如，Taylor，L.D.，等人，(1992)Nucleic Acids Res.20：6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区及恒定区。然而在某些实施方案中，此类重组人抗体受体外诱变(或，当用人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)并且因此重组抗体的VH及VL区域的氨基酸序列为这样的序列，即虽然所述序列衍生自人种系VH及VL序列并与人种系VH及VL序列相关，但在体内人抗体种系所有组分中不是天然存在的。
如文中应用的，“经分离抗体”欲指基本上不包括具有不同抗原特异性的其它抗体(例如，特异结合人IL-1β的经分离抗体基本上不包括特异结合非人IL-1β抗原的抗体)的抗体。然而，特异结合人IL-1β的经分离抗体与其它抗原如来自其它物种的IL-1β分子可有交叉反应性。此外，经分离抗体可基本上不包括其它细胞材料和/或化学品。
如文中应用的，“中和抗体”(或“中和人IL-1β活性的抗体”)欲指与人IL-1β结合导致抑制人IL-1β生物学活性的抗体。如用T1165.17细胞生物测定法或文中描述的人IL-1β中和试验测定IL-1β生物学活性的一个或多个指示物能评价人IL-1β生物学活性的此抑制作用。
“特异结合”人成熟IL-1β的抗体包括如以上定义的结合本领域已知的人IL-1β成熟形式而不结合人成熟IL-1α的抗体。特异结合人成熟IL-1β的抗体显示出与来自其它物种的成熟IL-1β有一些交叉反应性。
如文中应用的，术语“表面胞质共振”是指例如用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden and Piscataway，N.J.)，在生物传感器基质中通过检测蛋白质浓度的变化可实时分析生物特异相互作用的光学现象，对进一步的描述，参见实施例1及Jonsson，U.，等人，(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson；U.，等人，(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，等人，(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；以及Johnnson，B.，等人，(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
如文中应用的，术语“kon”欲指向前反应或复合物形成反应的结合速率常数或反应比率，以单位：M-1sec-1表示。
如文中应用的，术语“koff”欲指抗体自抗体/抗原复合物中解离的解离速率常数或反应比率，以单位：sec-1表示。
如文中应用的，术语“Kd”欲指特定抗体抗原相互作用的解离常数。它通过公式：Koff/Kon＝Kd计算。
本发明所述抗体为高效力抗体，一般显示低Koff值。对于本公开，术语“高效力”是指通过低IC50(或在以下描述的生物测定法中显示的3H胸苷掺入降低50％的有效浓度)反映的效力。根据本发明的所述抗体可为中和性(引起靶标如IL-1β的破坏)。对于一种用途不是中和性的抗体对不同的用途可具有中和性。
如文中应用的，术语“核酸分子”欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可为单链或双链，但优选为双链DNA。
在谈及编码与人IL-1β结合的抗体或抗体部分(例如，VH、VL、CDR3)的核酸时，文中所用术语“经分离核酸分子”欲指这样的核酸分子，所述核酸分子中编码抗体或抗体部分的核苷酸序列不包含编码与除人IL-1β外的抗原结合的抗体或抗体部分的其它核苷酸序列，其中所述其它核苷酸序列可在人基因组DNA中的IL-1β核酸侧翼天然存在。因此，例如，编码抗人IL-1β抗体VH区域的本发明所述的经分离核酸不包含编码与除人IL-1β外的结合抗原的其它VH区域的其它序列。
术语“脱酰胺”或“脱酰胺作用”是指在蛋白质/肽中Asn或Gln残基的降解(Robinson，等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 12409-12413)。例如，对天冬酰胺脱酰胺作用的分子内途径是通过中间物琥珀酰亚胺的形成，产生天冬氨酰基及异天冬氨酰基残基的混合物(Harris，等人，(2001)J.of Chromatography 752：233-245)。脱酰胺作用导致蛋白质稳定性和/或蛋白质活性降低或丢失。脱酰胺作用在制备配方治疗剂期间可离体发生，可负面影响药剂的制造与储存。此外，脱酰胺作用可体内发生而影响抗体的效力及作用持续时间。
如文中应用的，术语“载体”欲指能转移与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型为“质粒”，所述质粒是指额外DNA片段可连接到其中的环状双链DNA环。另一类型的载体为病毒载体，其中额外DNA片段可连接到病毒基因组中。
如文中应用的，术语“重组宿主细胞”(或简称“宿主细胞”)欲指重组表达载体导入的细胞。
发现Mu007重链CDR2区域的脱酰胺作用位点影响包含此CDR2区域的人源化抗体的生物学特性(参见美国临时专利申请60/361423)。减慢或去除脱酰胺作用的人源化抗体的类似物产生具有稳定性改善的抗体。因此，本发明包括通过位点特异改变在重链互补决定区2(HCDR2)的Asn55位去除了脱酰胺作用的抗体。
本发明优选的抗体或其抗原结合部分一般显示改善的亲和力(低Kd)并与观察到的Mu007相似的结合特异性及效力以及在HCDR2的Asn55位去除了脱酰胺作用。定义本发明所述抗体的特性主要位于抗体的可变区，更特别地位于抗体的CDR区域。
对来自其它物种的抗体人源化的主要推动力是当作为治疗剂注射到人患者时，降低抗体引起免疫反应的可能性。人源化抗体中利用的人序列越多，免疫原性的危险性越小。此外，注射的人源化抗体比注射的非人抗体在循环中一般具有较长的半衰期。此外，如果需要效应子功能，由于效应子部分为人，它可与人免疫系统的其它部分更好地相互作用。可对文中描述的序列进行改变，条件是只要优选的重链及轻链区域不显著影响抗体的生物学特性。这对于不影响CDR与IL-1β结合能力的抗体恒定区及可变区部分尤其适用。
此外，如文中讨论的，在本发明中，可应用人构架可变区及其变体。然而，不管所选择的构架如何，如果降低免疫原性的危险性是主要目的，应将与所选择的人构架相关改变的数目降到最低。
重链及轻链可变区构架残基可衍生自同一或不同的人抗体序列。人抗体序列可为天然存在人抗体序列或可为几种人抗体的共有序列。对于本发明的人源化抗体重链可变区的优选人构架序列包括VH节段DP-5(Tomlinson，等人，(1992)J.Mol.Biol.227：776-798)及J节段JH4、JH1或JH5(Ravetch，等人，(1981)Cell 27：583-591)。Vk节段L1(Cox，等人，(1994)Eur.J.Immunol.24：827-836)及J节段Jk4(Hieter，等人，(1982)J.Biol.Chem.10：1516-1522)是提供人源化轻链可变区构架的优选序列。
本发明人源化抗体的优选人重链恒定区多核苷酸序列包括IgG1恒定区或IgG4恒定区：
tccaccaagggcccatcggtcttcccgctagcaccctcctccaagagcaccctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccg
aaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtg
gtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaa
tcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatg
atctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcata
atgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggag
tacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctg
cccccatcccgggacgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat
gggcagccggagaacaactacaagaccacgccccccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtgg
cagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
IgG1[SEQ ID NO：65]
ctagcgccctgctccaggagcacctccgagagcacagccgccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactca
ggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttggg
cacgaagacctacacctgcaacgtagatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagtccaaatatggtcccccatgcccaccctgccc
agcacctgagttcctggggggaccatcagtcttcctgttccccccaaaacccaaggacactctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggt
ggacgtgagccaggaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagttca
acagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccgtc
ctccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagagccacaggtgtacaccctgcccccatcccaggaggagatgaccaagaaccagg
tcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctc
ccgtgctggactccgacggctccttcctctacagcaggctaaccgtggacaagagcaggtggcaggaggggaatgtcttctcatgctccgtgatgcatg
aggctctgcacaaccactacacacagaagagcctctccctgtctctgggtaaat
IgG4[SEQ ID NO：66].
本发明人源化抗体的优选人轻链恒定区多核苷酸序列为κ链恒定区：
cgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagag
aggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctc
agcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagag
cttcaacaggggagagtgctaa
[SEQ ID NO：67]
本发明优选的抗体包含IgG1重链恒定区[SEQ ID NO：65]或IgG4重链恒定区[SEQ ID NO：66]及κ轻链恒定区[SEQ ID NO：67]，并通过表2中指定的克隆命名(即，W13、W17等)。本发明所述抗体W13、W17、W18、W20及U43的可变区多核苷酸序列包括：
W13-重链
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgac
cgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcgacattaactacaatgagaagt
tcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgc
gcgcatgtactatgattacgaccagggctttgactactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgct
agc
[SEQ ID NO：55]
W13-轻链
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaagttcagtcaggacattgatcgcttcctgacctg
gtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggca
cagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcatccagtatgatgagtttccgtacaccttcggcggcggcaccaag
gtggagatcaaa
[SEQ ID NO：60]
W17-重链
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgac
cgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcgacattaactacaatgagaagt
tcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgc
gcgcatgtactatgattacgaccagggctttgacctgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgct
agc
[SEQ ID NO：56]
W17-轻链
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaagttcagtcaggacattgatcgcttcctgagctg
gtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggca
cagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcgttcagtatgatgagtttccgtacggtttcggcggcggcaccaagg
tggagatcaaa
[SEQ ID NO：61]
W18-重链
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgac
cgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcaccattaactacaatgagaagt
tcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgc
gcgcatgtactatgattacgaccagggctttgacaaactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgct
agc
[SEQ ID NO：57]
W18-轻链
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaagttcagtcaggacattgatcgcttcctgagctg
gtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggca
cagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcgttcagtatgatgagtttccgtacaccttcggcggcggcaccaagg
tggagatcaaa
[SEQ ID NO：62]
W20-重链
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgac
cgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatgggcgagattctgcctggcagcggcgacattaactacaatgagaagt
tcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgc
gcgcatgtactatgattacgaccagggctttgactactggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgct
agc
[SEQ ID NO：59]
W20-轻链
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaagttcagtcaggacattgatcgcttcctgagctg
gtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggca
cagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcgttcagtatgatgagtttccgtacaccttcggcggcggcaccaagg
tggagatcaaa
[SEQ ID NO：63]
U43-重链
ggatccactggtcaggtgcagctggtgcagtctggcgctgaggtgaagaagcctggctcctccgtgaaggtctcctgcaaggcttctggctacacattcgac
cgctattggatcgagtgggtgcgccaggcccctggccaaggcctggagtggatggcgagattctgcctggcagcggcgacattaactacaatgagaagt
tcaagggccgcgtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgcgctctgaggacacggccgtgtattactgtgc
gcgcatgtactatgattacgaccagggctttagcctgtggggccagggcaccctggtcaccgtctcctccgcctccaccaagggcccatcggtcttcccgct
agc
[SEQ ID NO：58]
U43-轻链
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggcgaccgcgtcaccatcacttgtaaggcgagtcaggacattgatcgcttcctgagct
ggtttcagcagaaaccaggcaaagcccctaagtccctgatctatcgcgtgaagcgcctggtggatggcgtcccatcccgcttcagcggcagtggctctggc
acagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgcgttcagtatgatgagtttccgtacaccttcggcggcggcaccaag
gtggagatcaaa
[SEQ ID NO：64]
在另一实施方案中，本发明所述抗体W13、W17、W18、W20及U43的成熟氨基酸序列包括：
W13-重链
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGDINY
NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFDYW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[SEQ ID NO：45]
W13-轻链
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKFSQDID RFLTWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCIQ YDEFPYTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
[SEQ ID NO：46]
W17-IgG1重链
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGDINY
NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFDLW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[SEQ ID NO：47]
W17-IgG4重链
QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFDRYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSGDINYNEKF
KGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARMYYDYDQGFDLWGQGTLVTVSSASTKGPSVF
PLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNK
GLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT
TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
[SEQ ID NO：68]
W17-轻链
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKFSQDID RFLSWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVQ YDEFPYGFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
[SEQ ID NO：48]
W18-重链
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGTINY
NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFDNW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGGLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTLS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[SEQ ID NO：49]
W18-轻链
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKFSQDID RFLSWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVQ YDEFPYTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGE
[SEQ ID NO：50]
W20-重链
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGDINY
NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFDYW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[SEQ ID NO：51]
W20-轻链
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKFSQDID RFLSWFQQKP GKAPKSLIYR VKRLVDGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVQ YDEFPYTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
[SEQ ID NO：52]
U43-重链
QVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGYTFD RYWIEWVRQA PGQGLEWMGE ILPGSGDINY
NEKFKGRVTI TADKSTSTAY MELSSLRSED TAVYYCARMY YDYDQGFSLW GQGTLVTVSS
ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLOSS
GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG
PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQYN
STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE
LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW
QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
[SEQ ID NO：53]
U43-轻链
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASQDID RFLSWFQQKP GKAPKSLIYR
VKRLVDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVQ YDEFPYTFGG
GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV
DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT LSKADYEKHK VYACEVTHQG
LSSPVTKSFN RGEC
[SEQ ID NO：54]
本发明包含利用抗体Mu007的一个或多个轻链CDR1、CDR2或CDR3或重链CDR1[SEQ ID NO：1-4]的抗体或其抗体结合部分。本发明包含的CDR为对抗体与特异IL-1β表位结合提供大多数接触残基的Mu007抗体高变区。因此，文中描述的CDR可用于制备全长抗体以及功能性片段和类似物或其它蛋白质，当与CDR连接时，所述全长抗体以及功能性片段和类似物或其它蛋白质保持CDR的活性结构构象以致利用CDR的蛋白质的结合亲和性对成熟IL-1β是特异的。
Mu007抗体的结合亲和性用表面胞质共振(BIAcoreTM)确定[参见实施例1]。在此类实验中，抗体通过蛋白A或抗-Fc抗体在BIAcoreTM芯片上以低密度捕获且配基流过去。对芯片表面累积的质量进行测定。此分析方法允许实时确定结合及解离速率以获得结合亲和力(Kd)。Mu007抗体的Kd约为6.2pM(皮摩尔)。本发明所述的优选人源化抗体，即W13、W17、W18、W20及U43的Kd分别约为2.8pM、2.8pM、4.2pM、2.7pM及4.7pM(参见实施例1，表3)。
也优选本发明所述抗体及其抗原结合部分与IL-1β特异结合而不与其它IL-1家族成员或同一类中结构相关的蛋白质结合。
也优选本发明所述抗体或其抗原结合部分中和IL-1β的生物学活性。用两个不同的测定法检测Mu007的能力且本发明所述的优选抗体中和IL-1β活性[参见实施例2及3]。
在第一个测定法中，应用需要低水平IL-1β用于增殖的鼠细胞系T1165.17。人IL-1β在培养基中以常量水平存在并加入系列稀释的每种抗体。增殖的抑制提供了抗体阻断IL-1β活化IL-1受体的能力的测定结果。对不同浓度抗体的增殖测定结果得到平均IC50值分别为：Mu007为20.6pM以及W13为1.2pM，W17为1.8pM，W18为2.0pM及U43为4.0pM(参见实施例2，表4)。
优选本发明所述抗体或其抗原结合部分IC50值比Mu007低。文中“IC50”是指测定的抗体抑制人IL-1β活性的效力。IC50为单一剂量实验中导致50％IL-1β抑制的抗体浓度。IC50可通过检测抑制人IL-1β活性的任何测定法测定。然而，取决于应用的测定法，获得的IC50值可发生变化。甚至使用同一测定法的实验之间也有一些差异性。例如，文中讨论的IL-1β依赖性细胞的状况对获得的IC50值有影响。因此，用于本发明目的临界值为用Mu007或本发明所述的优选抗体在单一实验中获得的相关值。
应用的第二个测定法为IL-6中和测定法。Mu007或本发明所述的优选抗体不与小鼠IL-1β交叉反应使得用小鼠模型检测体内中和活性是困难的。然而，IL-1β促炎活性的一个结果是诱导IL-6，所述IL-6为介导IL-1β一些非局限性作用的另一促炎细胞因子。人IL-1β能结合并刺激小鼠IL-1β受体，导致小鼠IL-6的升高。因此，具有中和活性的抗体在施用人IL-1β剂量的小鼠中可阻断对IL-6的诱导。Mu007及本发明所述的抗体证明在炎性刺激的小鼠模型中人IL-1β的强效中和性(参见实施例3)。
本发明也针对编码抗体的重组DNA，当所述DNA表达时，与人IL-1β特异结合。优选地，当DNA表达时，DNA编码的抗体包含Mu007一个或多个重链及轻链CDR[SEQ ID NO：1-6]以及一个或多个本发明所述的重链及轻链CDR[SEQ ID NO：7-42]。当表达时编码包含本发明所述优选抗体的重链可变区的多肽链的示例性DNA序列由SEQ ID NO：55-59代表。当表达时编码包含本发明所述优选抗体的轻链可变区的多肽链的示例性DNA序列由SEQ ID NO：60-64代表。
本发明所述的中和抗体是通过产生适当的抗体基因序列，即氨基酸序列是通过排列适当的核苷酸序列并在合适的细胞系中表达此类序列获得的。任何目的核苷酸序列可用例如在美国专利号5,264,563及5,523,388中描述的基于密码子诱变的方法产生的。此类方法允许在寡核苷酸中的任何目的密码子位置处产生任何及所有频率的氨基酸残基。这可包括在目的位置处任何20种氨基酸的完全随机替代。备选地，可进行此方法以在氨基酸链中的目的位置获得特定氨基酸，如本发明的新CDR序列。总之，可易于获得表达任何目的氨基酸序列的适当核苷酸序列并且用此方法可反复产生本发明所述的新CDR序列。这导致用任何目的氨基酸序列合成多肽如抗体的能力。例如，现在可确定所选抗体的任何目的结构域的氨基酸序列，并且任选地，通过其它所需氨基酸替代一个或多个氨基酸而制备同源链，以产生许多经替代类似物。
虽然此类方法可用于提供许多所有可能的氨基酸序列并根据作为抗体结构的最佳功能或其它目的进行筛选，在应用此类方法时，应当理解由于遗传密码的简并性，作为随机寡核苷酸合成及部分简并寡核苷酸合成的此类方法对在特定位置指定的特定氨基酸残基的密码子掺入了丰余性。此类方法在Cwirla等人，Proc.Natl.Acad.Sci.87：6378-6382(1990)和Devlin等人，Science 249：404-406(1990)中进行了描述。备选地，此类抗体序列可化学合成或以本领域技术人员公知的其它方式产生。
根据于此公开的本发明，增强的高效力抗体可在单一多肽结构中组合于此公开的一个或多个新CDR序列而产生，所述于此公开的一个或多个新CDR序列每个显示独立地导致效力或生物学活性增强及脱酰胺作用降低。在此方式中，几个新氨基酸序列可在同一或不同CDR中组合入一个抗体中，以产生具有所需水平生物学活性的抗体。此种所需水平常常产生自koff值优选低于10-3s-1，更优选低于5×10-4s-1，及甚至更优选低于1×10-4s-1的抗体。当抗体对特定抗原性结构，如人IL-1β显示高亲和力时，通过非限制性例子，可利用36个此类新CDR序列[SEQ ID NO：7-42]并用文中描述的T1165.17细胞生物测定法或人IL-1β中和试验对产生的抗体进行效力或生物学活性筛选。因此总体结果是对多种单一氨基酸替代进行组合及对产生抗体的抗原性亲和力及效力以一步一步的方式进行筛选的重复过程，因此确保效力增加而对所需的高亲和力或至少最低值没有影响。此重复方法可在分步过程中用于产生两个氨基酸及三个氨基酸替代以缩小寻找具有较高亲和力的抗体范围(参见WO 01/64751及US 2002/0098189)。结果，对Mu007抗体的每个CDR区域的氨基酸进行了系统替代并对产生抗体的抗原性亲和力进行了筛选。一般而言，确定在轻链CDR2中任何位置的氨基酸替代不会导致抗体亲和力的增加。因此，由于轻链CDR2的氨基酸的替代不会产生较高亲和力抗体，本发明的轻链CDR2优选Mu007轻链CDR2序列[SEQ ID NO：2]。
相反地，必需理解不同抗体结构域序列中的所有位置不是同等的，因为在特定位置的任何氨基酸形式的替代可以是有帮助的或有害的。此外，在某些位置某些形式的氨基酸替代可同样为增加或降低亲和力。例如，在给定位置尝试所有可能的疏水性氨基酸可以是不必要的。这可能是任何疏水性氨基酸作用相同。另一方面，在测定的亲和力中在给定位置处酸性或碱性氨基酸可提供大的变动。
如已经描述的，Kd通过kon及koff常数的比率进行测定。例如，将3.1×107(M-1s-1)的kon与0.9×10-4(s-1)的koff结合得到2.9×10-12M的Kd。因此，亲和力可通过增加kon或降低koff得到改善。因此，本发明所述抗体koff的降低可能产生更有效的治疗剂。
根据本发明，不管其抗原亲和力，对现存抗体效力的增加可通过在所述抗体的一个或多个CDR区域中的一个或多个氨基酸进行选择性改变获得，而所述氨基酸的改变对所述抗体的koff的降低，优选抗体亲和力的增加有作用。即使亲和力保持相同或多少有些降低，具有较低的koff值可得到较高效力。此抗体可通过在合适的工程化细胞中合成，通过合成所需多肽链最利地的产生，其中所述合适的工程化细胞具有掺入到其中的编码包含经改变CDR节段的所需多肽链的核苷酸序列。也根据本发明，具有所需水平效力或生物学活性的新抗体可从头进行制备，所述从头制备用如文中描述的遗传工程细胞通过在所述抗体多肽链的CDR区域中的经选择位置处掺入经选择的氨基酸，或完全通过化学合成所需多肽，接下来形成必需二硫键。
根据上述内容，本发明所述的抗体为高效力单克隆抗体。然而，此类抗体仅是在它们可衍生自单一细胞型克隆的意义上的单克隆。然而，这不表示限定它们为特定来源。此类抗体在通常不产生抗体的细胞如CHO、NSO或COS细胞中易于产生。此外，此类抗体可在其它型细胞，特别是哺乳动物细胞及甚至植物细胞中，通过将此类细胞进行基因工程改造以表达并装配形成抗体产物的多肽轻链及重链而产生。此外，此类链可化学合成，但由于它们对特定抗原性决定簇是特异的，它们仍可在“单克隆”抗体这一术语应用的范围中构成“单克隆”抗体。因此，如文中应用的，术语单克隆抗体用于表示抗体分子的更高特异性及纯度，而不仅限于用于产生所述抗体的机制。
也如在文中应用的，术语效力欲描述当用于它的预期治疗性目的时，抗体作用对此种抗体浓度的依赖性。因此，效力表示给定抗原的生物学活性。通过非限定性实例，效力或生物学活性或生物学作用是如文中描述的，通过T1165.17细胞生物测定法或人IL-1β中和试验用于测定抗IL-1β抗体。相反地，抗体对抗原的亲和力仅为kon对koff比率的数学测定。此外，根据本发明所述方法产生抗体的Kd一般在10-12M或低于10-12M的范围。
在一个实施方案中，本发明所述抗体或其抗原结合部分一般包含哺乳动物优选人的恒定区及可变区，所述可变区包含重链及轻链构架区和重链及轻链CDR，其中重链及轻链构架区具有哺乳动物抗体优选人抗体的特征性序列，并且其中CDR序列与除人外优选小鼠的一些物种抗体的CDR序列相似。Mu007的CDR序列如表1显示。
                表1
 在SEQ ID NO：43及44中提供的基础CDR序列
  CDR   序列   SEQ ID NO.
  L1   KASQDIDRYLS   1
  L2   RVKRLVD   2
  L3   LQYDEFPYT   3
  H1   GYTFSRYWIE   4
  H2   EILPGNGNINYNEKFKG   5
  H3   IYYDYDQGFTY   6
对应于上述内容，以及为了更好描述根据本发明公开的针对人IL-1β的人源化抗体的序列，Mu007的轻链及重链可变区的基础或起始序列在轻链可变区--SEQ ID NO：43及重链可变区--SEQ ID NO：44中显示。也根据本发明，当在重组细胞表达时，与此类起始序列不同的特定氨基酸通过重组方法产生，其中所述重组方法起始自经设计以产生所述氨基酸序列的经制备核苷酸序列。所述细胞的产物为本发明所述的单克隆抗体，条件是抗体不具有CDRL1的SEQ ID NO：1、CDR L2的SEQ ID NO：2、CDR L3的SEQ IDNO：3、CDR H1的SEQ ID NO：4、CDR H2的SEQ ID NO：5以及CDR H3的SEQ ID NO：6的组合。
在本发明的一个实施方案中，用具有Kd至少10-11M，并优选至少10-12M的针对人IL-1β的中和性抗体Fab片段通过降低koff值至至少10-3s-1，优选至少5×10-4s-1，更优选至少10-4s-1将效力升高。此类Fab片段CDR中存在的氨基酸在表2显示。
表2指示出本发明所述抗体中应用的CDR的氨基酸序列(所有序列为标准的单字母氨基酸)。在表2中，对应于表1CDR的关键氨基酸替代的位置(即CDR中具有氨基酸不同的位置)以加粗字体及下划线指示。Fab片段最初用标准ELISA进行筛选。通过T1165.17细胞增殖测定法测定的IC50值以野生型对照与重组产生的Fab变体之比(wt/Fab)表示。本发明所述的Fab变体及随后的抗体用来自表2的它们克隆的命名表示。
                            表2
                抗体中趋于诱导高效力的CDR的序列
  克隆   CDR   序列   SEQ ID NO.   IC50 wt/Fab
  U2U3U4U5   L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2   KASQDIDRYLSRVKRLVDVQYDEF NYTGYTFSRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DYKASQDIDRYLSRVKRLVDVQYDEF NYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DLKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEF NYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DLKASQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEF NYTGYTFSRYWI EEILPG TG TINYNEKFKG   127489127108111227108111221348   3320.5
  克隆   CDR   序列 SEQ ID NO.  IC50 wt/Fab
U6U7U8U9U10U11U12U13U14   H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3   VYYDYD YGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEF NYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEF NYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG TINYNEFKKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGFT LKASQDIDRYLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDIQYDEFPY LGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDIQYDEFPY LGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDIQYDEF NYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDIQYDEF NYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DN 141227108141227108141221510161412171018191217481412201081412201081412131021141213102114 32220.52543
  克隆   CDR   序列 SDQ ID NO.  IC50 wt/Fab
  U15U16U17U18U19U20U21U22U23U24   L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1   KASQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TGTINYNEKFKGVYYDYD YGF DYKASQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEF NYTGYTFSRYWIEEILPG SG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DYKASQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEF NYTGYTFSRYWIEEILPG SG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DYKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDIQYDEF NYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYD YDYGF DYKASQDIDRYLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DYKASQDIDRYLS 12215108912213416141221510891221341614122174181412174219122174181412131089121742191  20.5122222210
  克隆   CDR   序列   SEQ ID NO.   IC50 wt/Fab
U25U26U27U28U29U30U31U32U33   L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2   RVKRLVDIQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDIQYDEF NYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNK FSQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SGNINYNEKFKGVYYDYD YGF DYK FSQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DYKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYDQGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEF NYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YQGF DNK FSQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNK FSQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNK FSQDIDRYL TRVKRLVD   215418141213421142221542392221510219122171021241227421141217102114222179211422215102114222 0.522215111
  克隆   CDR   序列   SEQ ID NO.  IC50 wt/Fab
U34U35U36U37U38U39U40U41U43   L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3   VQYDEFPY LGYTF DRYWIEEILPG SGNINYNEKFKGVYYDYD YGF DNK FSQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SGNINYNEKFKGVYYDYD YGFTYKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPY LGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGFT NKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGFTYK FSQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DYKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEF NYTGYTFSRYWIEEILPG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNK FSQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNK FSQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPY LGYTFSRYWIEEILPG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DLK FSQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG TGNINYNEKFKGVYYDYD YGFT LKASQDIDR FLSRVKRLVDVQYDEFPYT   251023142221710232612225108271221710212622217421912274181422215418142222041811222174281929217 0.2152121110
  克隆   CDR   序列   SEQ ID NO.   IC50 wt/Fab
U44V3V4V5V6V7V8W1W2   H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1   GYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGMYYDYDQGF SLKASQDIDR FL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG TINYNEKFKGMYYDYDQGFT NKASQDIDR FLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGMYYDYDQGF SLKASQDIDR FL TRVKRLVDVQYDEF AYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGMYYDYDQGF DYKASQDIDR FL TRVKRLVDLQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGMYYDYDQGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPGYG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDRYL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGVYYDYD YGF DYKASQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEF NYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNK FSQDIDRYL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIE   102130312151016323321710213031234102135312310836122171081412217418141221510891227421142221710 5510532324
  克隆   CDR   序列 SEQ ID NO.   IC50 wt/Fab
W3W4W5W6W8W9W12W13W14   H2H3L1L2L3H1H2H3L1L1L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2   EILPG TG DINYNEKFKGVYYDYD YGF DNKASQDIDR FL TRVKRLVDLQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGMYYDYDQGF DYKASQDIDR FL TRVKRLVDLQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGMYYDYDQGF DYK FSQDIDR FL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGMYYDYDQGF SLK FSQDIDR FL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGMYYDYDQGFT NKASQDIDR FL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SG TINYNEKFKGMYYDYDQGF DYKASQDIDR FL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGMYYDYDQGF DLK FSQDIDR FLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SGNINYNEKFKGMYYDYDQGFT LK FSQDIDR FL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTFDRYWIEEILPGSGDINYNEKFKGMYYDYDQGF DYK FSQDIDR FLSRVKRLVDVQYDEFPY GGYTFSRYWIEEILPG TG DINYNEKFKG   181431231021353123108353721742130372171083231215416353121742138392171023403721510213539241418 101010555101510
  克隆   CDR   序列 SEQ ID NO. IC50 wt/Fab
W17W18W19W20W21W22   H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3L1L2L3H1H2H3   MYYDYDQGF DNK FSQDIDR FLSRVKRLVDVQYDEFPY GGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGMYYDYDQGF DLK FSQDIDR FLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG TINYNEKFKGMYYDYDQGF DNK FSQDIDR FLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTFSRYWIEEILPG SGNINYNEKFKGMYYDYDQGFTYK FSQDIDR FLSRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG DINYNEKFKGMYYDYDQGF DYK FSQDIDRFL TRVKRLVDIQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG SG TINYNEKFKGMYYDYDQGF DYKASQDIDR FL TRVKRLVDVQYDEFPYTGYTF DRYWIEEILPG TG TINYNEKFKGMYYDYDQGFDY   363924110213839217101636392174234239217102135372151016353121710835 2010101085
在具体实施方案中，本发明涉及经分离抗体，所述经分离抗体包含Kd至少为10-11M及最优选为至少10-12M以及其中koff为至少约10-3s-1，优选至少约5×10-4s-1及最优选至少1×10-4s-1(包括所有其组合)。
与人成熟IL-1β以Kd 1×10-11或低于1×10-11结合、具有koff速率常数为1×10-3s-1或低于1×10-3s-1、具有中和人IL-1β活性以及其中脱酰胺作用在HCDR2的第55位为去除的本发明所述的优选抗体选自SEQ ID NO：45-54。
应用了定性及合成单突变CDR文库的标准方法(参见Wu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 95：6037-6042(1998))。核苷酸退火前首先将每个文库的靶CDR去除。对于合成文库，参照抗体的CDR如表1中定义(参见图1及图2)。应用了用于寡核苷酸合成以产生本发明CDR序列的基于密码子的诱变。
文库最初通过捕获淋巴细胞免疫荧光试验(capture lift)进行筛选以鉴定最高亲和力变体。捕获淋巴细胞免疫荧光试验方法(Watkins，MethodsMol.Biol.178：187-193，(2002))是本领域已知的并在WO/0164751及US2002/0098189中进行了描述。随后，此类克隆用捕获ELISA表征并在固定化抗原上滴定进一步表征。此类筛选后，然后对抗体各自的koff值进行筛选。然后其中的阳性作用通过效力进行测定。
文中公开的抗体包含与Mu007在互补决定区L1(或LCDR1)、L3(或LCDR3)、H1(或HCDR1)、H2(HCDR2)及H3(或HCDR3)不同的CDR。
经选择Fab片段的CDR在表2显示(它们均具有图3及图4的构架序列)，其中参照克隆为具有图1及图2显示的重链及轻链可变区序列的克隆(对于轻链及重链序列，分别为SEQ ID NO：43及44)。
根据本发明，通过组合此类氨基酸替代以使多于一个的替代发生在同一抗体分子，大大增加文中公开抗体的效力是可能的。
总而言之，低koff及抗体的效力之间具有相关性，所有较低koff变体具有一个以上有益CDR，包括具有达5个经替代CDR。
表2公开的CDR序列的组合可在完整四聚体抗体分子或活性片段如Fab片段中存在。表2显示的克隆的效力数据是针对Fab片段的，而表4显示的克隆的数据是针对完整抗体分子与参照抗体Mu007的比较。
本发明所述的抗体可以相对纯的或经分离形式，以及在孔中或在培养板上生长细胞中提取上清的形式存在。因此本发明所述的抗体也可以包含本发明所述抗体且其中所述抗体在可药用稀释剂或赋形剂中悬浮的组合物的形式存在。本发明所述抗体可在组合物中以浓度或数量在治疗或预防疾病(例如，预防类风湿性关节炎及骨关节炎)中足以具有治疗性或药学价值的形式存在。抗体也可以更稀释的形式存在于组合物中。
编码本发明所述抗体的DNA一般进一步包括与抗体编码序列可操纵连接的表达调控多核苷酸序列，包括天然相关或异源的启动子区域。优选地，在能转化或转染真核宿主细胞的载体中表达调控序列为真核启动子系统，但也可应用原核宿主的调控序列。一旦载体掺入到适当的宿主细胞系，宿主细胞在适于表达核苷酸序列的条件下增殖以及根据需要，用于收集和纯化轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体、结合片段或其它免疫球蛋白形式。
用多种公知技术中的任一种技术，能最终表达所需抗体的本发明所述的核酸序列可自多种不同的多核苷酸(基因组或cDNA、RNA、合成寡核苷酸等)及组分(例如V、J、D及C区域)形成。连接适当的基因组及合成序列是产生的常规方法，但也可用cDNA序列。
根据公知方法，人恒定区DNA序列可自多种人细胞中分离，但优选自永生化B细胞分离。多核苷酸序列的合适源细胞及用于免疫球蛋白表达及和分泌的宿主细胞可自多种本领域公知的来源获得。
如文中描述的，除文中具体描述的抗体外，其它“基本同源”的经修饰抗体可用多种本领域技术人员公知的重组DNA技术易于设计及制备。例如，构架区可通过几个氨基酸替代、末端及中间添加及缺失等等而与天然序列在一级结构水平不同。此外，多种不同的人构架区作为本发明所述的人源化免疫球蛋白基础可单独或组合应用。一般而言，通过多种公知技术如定点诱变易于完成基因的修饰。
备选地，可产生只包含部分一级抗体结构的多肽片段，所述片段具有免疫球蛋白的一种或多种活性(例如，补体固定活性)。这些多肽片段可通过本领域公知的方法通过蛋白酶剪切完整抗体产生，或用定点诱变在载体中的所需部位通过插入终止密码子产生，如在CH1后插入终止子产生Fab片段或在铰链区后插入终止子产生F(ab’)2片段。通过用DNA接头连接VL及VH可产生单链抗体。
如以前谈及的，在序列与表达调控序列可操纵地连接(即，定位以保证功能)后，多核苷酸可在宿主中表达。此类表达载体一般在宿主体内以游离形式或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。一般地，表达载体包含选择标记，例如四环素、新霉素及二氢叶酸还原酶，以允许检测用目的DNA序列转化的那些细胞。
大肠杆菌(E.coli)为特别用于克隆本发明所述多核苷酸的原核宿主。其它适合应用的微生物宿主包括芽孢杆菌(bacilli)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，及其它肠杆菌科如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)以及多种假单胞菌(Pseudomonas)物种。在此类原核宿主中，也可制备一般包含与宿主细胞相容的表达调控序列(例如复制起点)的表达载体。此外，可存在许多公知启动子中的任一种启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子一般控制表达，任选地与操纵子序列并具有核糖体结合位点序列等等，用于起始并完成转录和翻译。
其它微生物如酵母也可用于表达。酵母(Saccharomyces)为优选的宿主，其中具有表达调控序列如启动子，包括3-磷酸甘油激酶或其它糖酵解酶以及复制起点、终止序列等等的合适载体。
除微生物外，植物细胞也可用于表达。植物转化的最佳方法取决于植物类型而变化。例如参见WO00/53794。
哺乳动物组织细胞培养物也可用于表达并产生本发明所述的多肽。真核细胞为事实上优选的，因为本领域已研发了许多能分泌完整免疫球蛋白的合适宿主细胞系，包括CHO细胞系、多种COS细胞系、叙利亚仓鼠卵巢细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、经转化B细胞、人胚肾细胞系或杂交瘤。优选的细胞系为CHO及骨髓瘤细胞系如SP2/0和NS0。
这些细胞的表达载体可包括表达调控序列，如复制起点、启动子、增强子及必需的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点以及转录终止子序列。优选的表达调控序列为衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头状瘤病毒、巨细胞病毒等等的启动子。优选的多腺苷酸化位点包括衍生自SV40及牛生长激素的序列。
包含目的多核苷酸序列(例如，重链及轻链编码序列和表达调控序列)的载体可通过公知的方法转移到宿主细胞，所述方法取决于细胞宿主类型而变化。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其它细胞宿主。
一旦表达，抗体可根据标准方法，包括硫酸铵沉淀、离子交换、亲和(例如，蛋白A)、反相、疏水作用柱层析、凝胶电泳等等进行纯化。对于药用，具有至少约90至95％纯度的基本上纯的免疫球蛋白是优选的，且98至99％或以上纯度为最优选的。如需要的，一旦部分纯化或经纯化达到均一，然后多肽可如文中所示的进行治疗性或预防性应用。
本发明也涉及治疗患有IL-1β介导的炎性疾病的人的方法，所述方法包括向需要治疗的患者施用有效量的IL-1β抗体。本发明所述的抗体结合并阻止IL-1β与IL-1β受体结合和起始信号。IL-1β介导的多种疾病包括类风湿性关节炎(RA)、骨关节炎(OA)、变态反应、败血或内毒素休克、败血病、哮喘、移植物抗宿主病、局限性结肠炎及其它炎性肠疾病。此外，IL-1β介导针对局部及全身疾病以及损伤的宿主防御反应，并介导神经变性疾病如中风、局部缺血、兴奋性中毒以及外伤性颅脑损伤中神经炎症及细胞死亡的宿主防御反应。IL-1β也参与慢性变性疾病，特别是多发性硬化症、帕金森氏病及阿尔茨海默氏病中。优选地，本发明包含的IL-1β抗体用于治疗RA和/或OA。
RA患者遭受关节的慢性肿胀和炎症以及软骨和骨的进行性破坏。IL-1β及TNF-α为在RA发病机理中的最关键的细胞因子。然而，虽然IL-1β及TNF-α均介导炎性反应，IL-1β为骨及软骨破坏的主要介导物。滑液组织中经活化的单核细胞和成纤维细胞产生IL-1β，所产生的IL-1β接下来刺激其它促炎细胞因子、前列腺素和基质金属蛋白酶的产生。滑液内层成为肥大性、侵袭性及侵蚀性骨及软骨。
缓解疾病的抗风湿药(DMARDS)如羟氯喹、经口或可注射金、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、青霉胺及柳氮磺吡啶在治疗RA中应用有一定的成功。在缓解RA的过程中，认为它们的活性是由于抑制或缓解炎性介导物如IL-1β。例如，每周7.5至10mg剂量的甲氨蝶呤引起RA患者中IL-1β血浆浓度降低。用皮质类固醇观察到相似结果。因此，本发明所述的IL-1β抗体可单独应用或与可在血浆中降低IL-1β蛋白质水平的DMARDS组合应用。
有效量的本发明所述的IL-1β抗体为提供临床功效而没有不可耐受的副作用或毒性的量。对RA患者的临床功效可用美国风湿病学学院定义的改善(ACR20)进行评价。如果患者在触痛关节计数、肿胀关节计数中显示20％改善以及在包括患者疼痛评价、患者整体评价、医生整体评价、健康评价问卷以及血清C-反应蛋白的5项其它组分中的3项显示改善，认为患者为应答者。结构性损伤的预防可通过对放射显影图(侵蚀计数、关节腔收缩)的Sharp评分系统的van der Heijde修饰进行评价。
本发明所述的IL-1β也可用于治疗患有骨关节炎(OA)的患者。OA为人关节最常见疾病，并以关节软骨丢失及骨赘形成为特征。临床特征包括关节痛、强直、增大、不稳定、活动受限及功能障碍。将OA分类为自发性(原发性)及继发性形式。用于膝及髋的OA分类标准已通过美国风湿病学学院在临床、反射显影图及实验室参数的基础上进行了发展。
有效量的本发明所述的IL-1β抗体为如通过疼痛及功能的改善以及结构性损伤的防止而测量的在OA患者中显示临床功效的量。疼痛及功能的改善可用WOMAC OA指数中疼痛及躯体功能子标准进行评价。指数指出了在疼痛、强直及躯体功能方面临床重要的患者相关症状。结构性损伤的防止可通过在膝或髋的放射显影图上测定关节腔宽度进行评价。
由于在人神经变性疾病如中风及脑损伤中显示IL-1β水平升高(Rothwell，N.J.，等人，TINS 23(12)：618-625，2000)，本发明包含的抗IL-1β抗体也可用于治疗与中风及局部缺血、兴奋性中毒以及外伤性颅脑损伤相关的神经炎症。
本发明所述的抗体用标准施用技术施用，优选通过静脉内、腹膜内、皮下、肺、经皮肤、肌内、鼻内、经口、舌下或栓剂外周(即，不是施用到中枢神经系统中)施用。
将用于施用的药物组合物设计为适合用于所选择的施用方式，且根据需要可应用可药用赋形剂如缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂、稳定剂等等。文中引用作为参考的Remington′s PharmaceuticalSciences(Mack出版公司，Easton PA，最新版)提供了一般对开业医生已知的剂型技术的纲要。
根据所选择的特定施用方式，剂型中IL-1β抗体的浓度可自低至占重量的约0.1％至高达15或20％并主要基于流体量、粘度、稳定性等等进行选择。优选的IL-1β抗体浓度一般在1至约100mg/mL，优选地，在10至约50mg/mL的范围。
剂型可包括缓冲剂。优选地缓冲剂为柠檬酸盐缓冲剂或磷酸盐缓冲剂或其组合。一般地，剂型的pH在约4和约8之间。优选地，pH在约5和约7.5之间。可选择剂型的pH以平衡抗体稳定性(化学和物理稳定性)并且在施用时对患者是舒适的。剂型也可包括盐如NaCl。此外，剂型可包括去污剂以防止聚集并有助于维持稳定性。
在制成剂型后剂型可经无菌过滤，或者制成微生物学可接受的。可加入防腐剂如间甲酚或酚或其混合物以防止微生物生长及污染。
用于静脉内输注的典型组合物可具有达250mL液体的体积，如无菌林格液，且抗体浓度为每mL具有1-100mg或100mg以上。本发明所述的治疗剂可为冷冻的或冻干的用于储藏并在应用前用合适的无菌载体重新溶解。冻干及重新溶解可导致不同程度的抗体活性丢失(例如，对于常规免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体趋向于更大的活性丢失)。可调整剂量以进行补偿。
虽然前述方法显示为最方便且最适当的用于施用蛋白质如人源化抗体的方法，如果设计了适当的剂型，通过适当的调节，可用其它用于施用的技术，如经皮肤施用及经口施用。此外，利用可生物降解膜及基质或小渗透泵、或基于葡聚糖珠、藻酸盐或胶原蛋白的递送系统的受控制释放剂型是令人希望的。总而言之，所述剂型可用于施用本发明所述抗体并可自多种选择中对剂型进行选择。
一般剂量水平可用标准临床技术进行优化并且一般剂量水平取决于施用方式及患者的疾病。一般地，剂量在每个月10μg/kg至每个月10mg/kg的范围。
本发明通过以下不以任何方式限制本发明的实施例阐述。
实施例1
结合亲和性及特异性
Mu007及本发明所述抗体的亲和性及特异性用BIAcore测量方法确定(表3)。BIAcoreTM为测量分子相互作用的自动化生物传感器系统(Karlsson，等人，(1991)J.ImmunoL Methods 145：229-240)。在这些实验中，将抗体以低密度捕获到BIAcoreTM芯片表面。乙基-二甲氨基丙基-碳二亚胺(EDC)用于将蛋白A的反应性氨基偶联到羧基-甲基(CM5)BIAcoreTM传感器芯片的流动小室。蛋白A在醋酸钠缓冲液，pH4.5中稀释，并用EDC固定到CM5芯片的流动小室以得到1000个反应单位。未反应的位点用乙醇胺封闭。用60μl/分钟的流速。通过注射2μg/mL本发明所述抗体的10μl溶液接着通过以每个循环降低人IL-1β浓度(例如，1500、750、375、188、94、47、23.5、12及0皮摩尔)进行多轮结合/洗脱循环。用甘氨酸-HCl，pH1.5洗脱。用BIAevaluationTM分析动力学数据。用于确定Mu007亲和性的方法如在PCT/US02/21281中的描述。
表3.通过BIAcore(HBS-EP缓冲液，pH7.4于25℃)确定的针对人IL-1β的抗IL-1β抗体的结合特性
  克隆  kon(M-1s-1)   koff(s-1)   Kd(M)
  W17(IgG1)  3.1e7   0.9e-4   2.8e-12
  U43(IgG1)  4.7e7   2.2e-4   4.7e-12
  W13(IgG1)  6.1e7   1.7e-4   2.8e-12
  W18(IgG1)  4.1e7   1.8e-4   4.2e-12
  W20(IgG1)  3.8e7   1.0e-4   2.7e-12
  Mu007  2.6e7   1.6e-4   6.2e-12
  W17(IgG4)  3.2e7   1.0e-4   3.3e-12
实施例2
抗体效力
需要低水平IL-1β用于增殖的鼠细胞用于确定本发明所述抗体及Mu007中和人IL-1β的能力。不在对数生长期的T1165.17细胞用添加10％胎牛血清GibcoBRL Cat.#10082-147)、1mM丙酮酸钠、50μM β-巯基乙醇及抗生素/抗真菌剂(GibcoBRL Cat.#15240-062)的RPMI 1640(GibcoBRL Cat.#22400-089)洗3次。将细胞以每孔5,000个细胞在96孔培养板上培养。人IL-1β以0.3pM恒定水平存在并加入系列稀释的抗体。将细胞在37℃/5％CO2培养箱孵育20小时，此时，每孔加入1μCi3H-胸苷并在培养箱中再孵育4小时。将细胞收获并通过闪烁计数器确定掺入的放射性。表4阐述了通过Mu007及本发明所述抗体(如指示的IgG同种型)对IL-1β刺激增殖的抑制。
表4：T1165.17细胞增殖测定法中测定的IC50
  样本   IC50pM   效力增加倍数
  Mu007   20.6±0.5   1
  W17(IgG1)   1.8±0.3   11
  U43(IgG1)   4.0±0.2   5
  W18(IgG1)   2.0±0.1   10
  W13(IgG1)   1.2±0.1   17
  W20(IgG1)   1.2±0.1   17
  W17(IgG4)   1.7±0.1   12
实施例3
对人IL-1β的体内中和作用
人IL-1β能结合并刺激小鼠IL-1β受体，导致小鼠IL-6升高。进行了时间及剂量范围实验以鉴定用于诱导小鼠IL-6的人IL-1β的最佳剂量及最佳时间。这些实验表明3μg/kg人IL-1β的剂量及IL-1β施用后2小时时在小鼠血清中IL-6水平最高。在皮下注射人IL-1β1小时前，向小鼠以13、27、81及270μg/kg静脉内施用本发明所述的抗体。施用IL-1β2小时后，将小鼠处死，通过ELISA确定IL-6水平。同种型匹配抗体用作阴性对照。本发明所述的抗体以剂量依赖的方式阻断IL-1β刺激小鼠IL-1β受体、导致小鼠IL-6升高的作用(表5)。
表5
  抗体   IL-6血清水平pg/ml   标准差
  IL-1β对照(3μg/kg)   462.0   279.1
  人IgG对照(270μg/kg)   1.0   1.0
  IL-1β对照(3μg/kg)+人IgG对照(270μg/kg)   592.3   303.0
  W13对照(270μg/kg)   4.1   2.4
  W17对照(270μg/kg)   3.2   2.9
  W18对照(270μg/kg)   5.2   2.4
  U43对照(270μg/kg)   1.3   1.0
  IL-1β(3μg/kg)+W13对照(13μg/kg)   655.4   78.0
  IL-1β(3μg/kg)+W13对照(27μg/kg)   277.4   97.3
  IL-1β(3μg/kg)+W13对照(81μg/kg)   129.2   20.2
  IL-1β(3μg/kg)+W13对照(270μg/kg)   23.4   5.3
  IL-1β(3μg/kg)+W17对照(13μg/kg)   566.8   294.0
  IL-1β(3μg/kg)+W17对照(27μg/kg)   410.1   107.5
  IL-1β(3μg/kg)+W17对照(81μg/kg)   113.7   42.3
  IL-1β(3μg/kg)+W17对照(270μg/kg)   27.5   19.6
  IL-1β(3μg/kg)+W18对照(13μg/kg)   398.5   143.2
  IL-1β(3μg/kg)+W18对照(27μg/kg)   231.8   32.2
  IL-1β(3μg/kg)+W18对照(81μg/kg)   77.9   24.7
  IL-1β(3μg/kg)+W18对照(270μg/kg)   18.0   5.9
  IL-1β(3μg/kg)+U43对照(13μg/kg)   755.7   299.7
  IL-1β(3μg/kg)+U43对照(27μg/kg)   509.3   99.6
  IL-1β(3μg/kg)+U43对照(81μg/kg)   186.4   80.8
  IL-1β(3μg/kg)+U43对照(270μg/kg)   39.3   17.7
实施例4
抗体表达
以下方法应用于本发明所述任何抗体的表达。
编码前导序列以及κ轻链或γ1重链的恒定区的表达载体用于克隆Fab序列，产生完整抗体基因。载体可用于多种哺乳动物细胞系进行瞬时及稳定表达。
将载体扩大以产生进行转染需要的DNA量。当用于瞬时转染时，最终DNA作为闭合环状载体，当在稳定转染中应用时，可作为线性化载体。可用小规模瞬时转染以鉴定LC∶HC的最佳比率。在两种转染的任一种转染中，在转染至细胞中前，将编码轻链(LC)及重链(HC)的载体混合在一起。
HEK 293 EBNA细胞用于瞬时转染。将转染扩大并在转染后培养五至七天。收获上清液，并用用于抗体的常规方法纯化抗体。
用所述的载体可稳定转染CHO(中国仓鼠卵巢)-DG44细胞。应用的DNA量可自20μg至200μg变化。用BioRad Gene Pulsar II于360V/950μF对细胞(107)进行转染。于37℃/5％CO2培养箱中孵育24-72小时使细胞恢复，然后在选择条件下(培养基不含次黄嘌呤及胸苷，但含不同水平氨甲蝶呤MTX用于额外加压)在培养板上培养。
稳定转染到NS0(小鼠骨髓瘤)细胞可通过将LC及HC的基因移入编码谷氨酰胺合成酶基因的表达载体中进行。应用的DNA总量为40μg。用BioRad Gene Pulsar II于300V/1000μF转染细胞(107)。于37℃/5％CO2培养箱中孵育24-72小时使细胞恢复，并然后在选择条件下(培养基不含谷氨酰胺，但含甲硫氨酸砜亚胺(methionine sulphoximine)MSX用于额外加压)在培养板上培养。
以对细胞系特异的接种密度(CHO-DG44为500个细胞/孔，NS0为2000个细胞/孔)将两种类型的细胞系培养在96孔培养板上。当在孔中有可见集落形成时，用基于ELISA的方法对培养板的抗体产生进行筛选。将包含抗体阳性信号的孔在24孔培养板进行扩大。对细胞系进行培养并通过表达实验评价以鉴定具有可接受滴度及蛋白质质量的候选细胞系。细胞系增殖作用的目的是鉴定可在无血清培养条件下扩大具有可接受滴度、生长特征及产品质量特性的克隆。
序列表
<110>应用分子进化公司
<120>人IL-1β拮抗剂
<130>x-15950
<150>60/442,798
<151>2003-01-24
<160>68
<170>PatentIn版本3.2
<210>1
<211>11
<212>PRT
<213>鼠
<400>1
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr Leu Ser
1               5                   10
<210>2
<211>7
<212>PRT
<213>鼠
<400>2
Arg Val Lys Arg Leu Val Asp
1               5
<210>3
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>3
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1               5
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>鼠
<400>4
Gly Tyr Thr Phe Ser Arg Tyr Trp Ile Glu
1               5                   10
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>鼠
<400>5
Glu Ile Leu Pro Gly Asn Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>鼠
<400>6
Ile Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Thr Tyr
1               5                   10
<210>7
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>7
Val Gln Tyr Asp Glu Phe Asn lyr Thr
1               5
<210>8
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>8
Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Thr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>9
<211>
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>9
Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Gly Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>10
Gly Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr Trp Ile Glu
1               5                   10
<210>11
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<23>合成构建体
<400>11
Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Gly Phe Asp Leu
1               5                   10
<210>12
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>12
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr Leu Thr
1               5                   10
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>13
Ile Gln Tyr Asp Glu Phe Asn Tyr Thr
1               5
<210>14
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>14
Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Gly Phe Asp Asn
1               5                   10
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>15
Ile Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1               5
<210>16
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>16
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>17
Val Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr
1               5
<210>18
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>18
Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>19
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>19
Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Gly Phe Thr Leu
1               5                   10
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>20
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1               5
<210>21
<211>17
<212> PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>21
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>22
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>22
Lys Phe Ser Gln Asp Ile Asp Arg Tyr Leu Thr
1               5                   10
<210>23
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>23
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asn Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>24
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>24
Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp Asn
1               5                   10
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>25
Val Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Leu
1               5
<210>26
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>26
Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Gly Phe Thr Tyr
1               5                   10
<210>27
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>27
Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Tyr Gly Phe Thr Asn
1               5                   10
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>28
Glu Ile Leu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Asn Thr Asn Glu Lys Phe Lys
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Gly
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>29
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe Leu Ser
1               5                   10
<210>30
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>30
Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Ser Leu
1               5                   10
<210>31
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>31
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe Leu Thr
1               5                   10
<210>32
<211>11
<212>PRT
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<220>
<223>合成构建体
<400>32
Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Thr Asn
1               5                   10
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<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>33
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe Leu Ser
1               5                   10
<210>34
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>34
Val Gln Tyr Asp Glu Phe Ala Tyr Thr
1               5
<210>35
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>35
Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>36
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>36
Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp Asn
1               5                   10
<210>37
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>37
Lys Phe Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe Leu Thr
1               5                   10
<210>38
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>38
Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp Leu
1               5                   10
<210>39
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>39
Lys Phe Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe Leu Ser
1               5                   10
<210>40
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>40
Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Thr Leu
1               5                   10
<210>41
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>41
Val Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Gly
1               5
<210>42
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>42
Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Thr Tyr
1               5                   10
<210>43
<211>387
<212>DNA
<213>鼠
<400>43
atggacatga ggacccctgc tcagtttctt ggaatctttt tcttctggtt tccaggtatc     60
agatgtgaca tcaagatgac ccagtctcca tcttccatgt atgcatctct aggagagaga    120
gtcactatca cttgcaaggc gagtcaggac attgataggt atttaagttg gttccagcag    180
aaaccaggga aatctcctaa gaccctgatc tatcgtgtaa agagattggt agatggggtc    240
ccatcaaggt tcagtggcag cgcatctggg caagattatt ctctcaccat cagcagcctg    300
cagtatgaag atatgggaat ttattattgt ctacagtatg atgagtttcc gtacacgttc    360
ggagggggga ccaagctgga aataaaa                                        387
<210>44
<211>417
<212>DNA
<213>鼠
<400>44
atggaatgga cctgggtctt tctcttcctc ctgtcagtaa ctgcaggtgt ccactcccag     60
gttcagctgc agcagtctgg agctgagctg atgaagcctg gggcctcagt gaagatatcc    120
tgcaaggcta ctggctacac attcagtagg tattggatag agtggataaa gcagaggcct    180
ggacatggcc ttgagtggat tggagagatt ttacctggaa atggaaatat taactacaat    240
gagaagttca agggcaaggc cacaatctct gcagattctt cctccgaaac agcctacatg    300
caactcagca gcctgtcctc tgaggactct gccgtctatt attgttcaac aatctactat    360
gattacgacc aggggtttac ttactggggc caagggactc tggtcactgt ttctgca       417
<210>45
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列
<220
<223>合成构建体
<400>45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp Tyr Tro Gly Gln
            l00                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
               165                  170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                230                  235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys
    450
<210>46
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Phe Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe
            20                  25                  30
Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Arg Val Lys Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr CysIle Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>47
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp Leu Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys ThrThr Pro Pro Val
385                 390                 395                400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys
    450
<210>48
<211>214
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Phe Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Arg Val Lys Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
                85                  90                  95
Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
    210
<210>49
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Thr Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp Asn Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305                 310                 315                 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys
    450
<210>50
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>50
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arn Val Thr Ile Thr Cys Lys Phe Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe
            20                  25                  30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Arg Val Lys Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
        115                 120                 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
    130                 135                 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145                 150                 155                 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
            180                 185                 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Gly Glu
    210
<210>51
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Het
        35                  40                  45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
    130                 135                 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
    210                 215                 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
                245                 250                 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
            260                 265                 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
        275                 280                 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
    290                 295                 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
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Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
                325                 330                 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
            340                 345                 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
        355                 360                 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
            420                 425                 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
        435                 440                 445
Gly Lys
    450
<210>52
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>52
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Phe Ser Gln Asp Ile Asp Arg Phe
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Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Arg Val Lys Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr AspGlu Phe Pro Tyr
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
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Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
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    210
<210>53
<211>450
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asp Arg Tyr
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Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr Asn Glu Lys Phe
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65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Ser Leu Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
        115                 120                 125
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Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
                165                 170                 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
            180                 185                 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
        195                 200                 205
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225                 230                 235                 240
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    370                 375                 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385                 390                 395                 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
                405                 410                 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
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Gly Lys
    450
<210>54
<211>213
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
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Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
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<213>人
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<211>407
<212>DNA
<213>人
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<211>407
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<211>407
<212>DNA
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<211>407
<212>DNA
<213>人
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<211>321
<212>DNA
<213>人
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<210>61
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>61
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgcgtcacc     60
atcacttgta agttcagtca ggacattgat cgcttcctga gctggtttca gcagaaacca    120
ggcaaagccc ctaagtccct gatctatcgc gtgaagcgcc tggtggatgg cgtcccatcc    180
cgcttcagcg gcagtggctc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgcgttcag tatgatgagt ttccgtacgg tttcggcggc    300
ggcaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>62
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>62
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgcgtcacc     60
atcacttgta agttcagtca ggacattgat cgcttcctga gctggtttca gcagaaacca    120
ggcaaagccc ctaagtccct gatctatcgc gtgaagcgcc tggtggatgg cgtcccatcc    180
cgcttcagcg gcagtggctc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgcgttcag tatgatgagt ttccgtacac cttcggcggc    300
ggcaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>63
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>63
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgcgtcacc     60
atcacttgta agttcagtca ggacattgat cgcttcctga gctggtttca gcagaaacca    120
ggcaaagccc ctaagtccct gatctatcgc gtgaagcgcc tggtggatgg cgtcccatcc    180
cgcttcagcg gcagtggctc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgcgttcag tatgatgagt ttccgtacac cttcggcggc    300
ggcaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>64
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>64
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggcga ccgcgtcacc     60
atcacttgta aggcgagtca ggacattgat cgcttcctga gctggtttca gcagaaacca    120
ggcaaagccc ctaagtccct gatctatcgc gtgaagcgcc tggtggatgg cgtcccatcc    180
cgcttcagcg gcagtggctc tggcacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gaagattttg caacttatta ctgcgttcag tatgatgagt ttccgtacac cttcggcggc    300
ggcaccaagg tggagatcaa a                                              321
<210>65
<211>900
<212>DNA
<213>人
<400>65
tccaccaagg gcccatcggt cttcccgcta gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc     60
acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg    120
aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga    180
ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac    240
atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa    300
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg    360
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag    420
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac    480
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc    540
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag    600
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa    660
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggacgagctg    720
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc    780
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc ccccgtgctg    840
gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag    900
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag    960
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga                                     990
<210>66
<211>952
<212>DNA
<213>人
<400>66
ctagcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag     60
gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg    120
cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc    180
gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc    240
aacaccaagg tggacaagag agttgagtcc aaatatggtc ccccatgccc accctgccca    300
gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact    360
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac    420
cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag    480
ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac    540
caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc    600
tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc    660
ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa    720
ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac    780
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaggcta    840
accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aatgtcttct catgctccgt gatgcatgag    900
gctctgcaca accactacac acagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa at            952
<210>67
<211>324
<212>DNA
<213>人
<400>67
cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct     60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag    120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac    180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag    240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag    300
agcttcaaca ggggagagtg ctaa                                           324
<210>68
<211>467
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成构建体
<400>68
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1               5                   10                  15
Gly Ser Thr Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
            20                  25                  30
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
        35                  40                  45
Phe Asp Arg Tyr Trp Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
    50                  55                  60
Leu Glu Trp Met Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Asp Ile Asn Tyr
65                  70                  75                  80
Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr
                85                  90                  95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
            100                 105                 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Met Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gln Gly Phe Asp
        115                 120                 125
Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
    130                 135                 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu
145                 150                 155                 160
Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
                165                 170                 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
            180                 185                 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
        195                 200                 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn
    210                 215                 220
Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser
225                 230                 235                 240
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
                245                 250                 255
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
            260                 265                 270
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
        275                 280                 285
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
    290                 295                 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
305                 310                 315                 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
                325                 330                 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
           340                  345                 350
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
        355                 360                 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
    370                 375                 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
385                 390                 395                 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
                405                 410                 415
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Arg Leu Thr Val
            420                 425                 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
        435                 440                 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
    450                 455                 460
Leu Gly Lys
465

Claims (35)

1.特异结合人IL-1β的经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含轻链及重链并且其中：
(a)所述轻链包含选自SEQ ID NO：1、12、22、29、31、33、37或39的轻链CDR1；选自SEQ ID NO：2的轻链CDR2；及选自SEQ ID NO：3、7、13、15、17、20、25、34或41的轻链CDR3；
(b)所述重链包含选自SEQ ID NO：4或10的重链CDR1；选自SEQ IDNO：5、8、16、18、21、23或28的重链CDR2；及选自SEQ ID NO：6、9、11、14、19、24、26、27、30、32、35、36、38、40或42的重链CDR3；且，
(c)条件是所述抗体不是由SEQ ID NO：1的轻链CDR1、SEQ ID NO：2的轻链CDR2、SEQ ID NO：3的CDR3、SEQ ID NO：4的重链CDR1、SEQ ID NO：5的重链CDR2及SEQ ID NO：6的重链CDR3组成。
2.权利要求1所述的经分离抗体或其抗原结合部分，其为人源化抗体。
3.经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含：
a)包含SEQ ID NO：39氨基酸序列的轻链CDR1；
b)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR2；
c)包含SEQ ID NO：41氨基酸序列的轻链CDR3；
d)包含SEQ ID NO：10氨基酸序列的重链CDR1；
e)包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR2；
f)包含SEQ ID NO：38氨基酸序列的重链CDR3。
4.权利要求3所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：56中显示的多核苷酸序列编码的重链可变区及由如SEQ ID NO：61中显示的多核苷酸序列编码的轻链可变区。
5.权利要求3所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：47中显示的氨基酸序列编码的重链及由如SEQ ID NO：48中显示的氨基酸序列编码的轻链。
6.权利要求3所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：68中显示的氨基酸序列编码的重链及由如SEQ ID NO：48中显示的氨基酸序列编码的轻链。
7.经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含：
a)包含SEQ ID NO：37氨基酸序列的轻链CDR1；
b)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR2；
c)包含SEQ ID NO：15氨基酸序列的轻链CDR3；
d)包含SEQ ID NO：10氨基酸序列的重链CDR1；
e)包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR2；以及，
f)包含SEQ ID NO：35氨基酸序列的重链CDR3。
8.权利要求7所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：55中显示的多核苷酸序列编码的重链可变区及由如SEQ ID NO：60中显示的多核苷酸序列编码的轻链可变区。
9.权利要求7所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：45中显示的氨基酸序列编码的重链及由如SEQ ID NO：46中显示的氨基酸序列编码的轻链。
10.经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含：
a)包含SEQ ID NO：39氨基酸序列的轻链CDR1；
b)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR2；
c)包含SEQ ID NO：17氨基酸序列的轻链CDR3；
d)包含SEQ ID NO：10氨基酸序列的重链CDR1；
e)包含SEQ ID NO：16氨基酸序列的重链CDR2；以及，
f)包含SEQ ID NO：36氨基酸序列的重链CDR3。
11.权利要求10所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：57中显示的多核苷酸序列编码的重链可变区及由如SEQ ID NO：62中显示的多核苷酸序列编码的轻链可变区。
12.权利要求10所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：49中显示的氨基酸序列编码的重链及由如SEQ ID NO：50中显示的氨基酸序列编码的轻链。
13.经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含：
a)包含SEQ ID NO：39氨基酸序列的轻链CDR1；
b)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR2；
c)包含SEQ ID NO：17氨基酸序列的轻链CDR3；
d)包含SEQ ID NO：10氨基酸序列的重链CDR1；
e)包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR2；以及，
f)包含SEQ ID NO：35氨基酸序列的重链CDR3。
14.权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：59中显示的多核苷酸序列编码的重链可变区及由如SEQ ID NO：63中显示的多核苷酸序列编码的轻链可变区。
15.权利要求13所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：51中显示的氨基酸序列编码的重链及由如SEQ ID NO：52中显示的氨基酸序列编码的轻链。
16.经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体包含：
a)包含SEQ ID NO：29氨基酸序列的轻链CDR1；
b)包含SEQ ID NO：2氨基酸序列的轻链CDR2；
c)包含SEQ ID NO：17氨基酸序列的轻链CDR3；
d)包含SEQ ID NO：10氨基酸序列的重链CDR1；
e)包含SEQ ID NO：21氨基酸序列的重链CDR2；以及，
f)包含SEQ ID NO：30氨基酸序列的重链CDR3。
17.权利要求16所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：58中显示的多核苷酸序列编码的重链可变区及由如SEQ ID NO：64中显示的多核苷酸序列编码的轻链可变区。
18.权利要求16所述的抗体，其中所述抗体包含由如SEQ ID NO：53中显示的氨基酸序列编码的重链及由如SEQ ID NO：54中显示的氨基酸序列编码的轻链。
19.权利要求1至18中任意一项所述的经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有IgG同种型。
20.权利要求19所述的经分离抗体或其抗原结合部分，其中同种型选自重链恒定区IgG1及IgG4。
21.权利要求20所述的经分离抗体或其抗原结合部分，其中同种型为由SEQ ID NO：65中显示的多核苷酸编码的IgG1。
22.权利要求20所述的经分离抗体或其抗原结合部分，其中同种型为由SEQ ID NO：66中显示的多核苷酸编码的IgG4。
23.权利要求1至18中任意一项所述的经分离抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体具有由SEQ ID NO：67中显示的多核苷酸编码的轻链κ链恒定区。
24.经分离核酸，其包含编码权利要求1至23中任意一项所述抗体的轻链或重链的多核苷酸。
25.表达载体，其包含根据权利要求24所述的核酸。
26.用权利要求25所述的表达载体稳定转染的宿主细胞，其中宿主细胞表达权利要求1至23中任意一项所述的蛋白质。
27.权利要求26所述的宿主细胞，其中宿主细胞选自中国仓鼠卵巢细胞、SP2/0骨髓瘤细胞、NS0骨髓瘤细胞、叙利亚仓鼠卵巢细胞及胚肾细胞。
28.权利要求27所述的宿主细胞，其为NS0骨髓瘤细胞。
29.药物组合物，其包含权利要求1至23中任意一项所述的抗体。
30.治疗类风湿性关节炎或骨关节炎的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1至23中任意一项所述的抗体。
31.抑制软骨破坏的方法，其包含向需要治疗的受试者施用有效量的权利要求1至23中任意一项所述的抗体。
32.权利要求1至23中任意一项所述抗体的用途，其用于制备治疗患类风湿性关节炎或骨关节炎的受试者的药物。
33.权利要求1至23中任意一项所述抗体的用途，其用于制备抑制需要治疗的受试者中软骨破坏的药物。
34.治疗与中风或局部缺血、兴奋性中毒或外伤性颅脑损伤相关的神经炎症的方法，其包括向受试者施用有效量的权利要求1至23中任意一项所述的抗体。
35.权利要求1至23中任意一项所述抗体的用途，其用于制备治疗患有中风或局部缺血、兴奋性中毒或外伤性颅脑损伤相关的神经炎症的受试者的药物。
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