ES2567198T3

ES2567198T3 - Antagonistas de la IL-1 beta humana

Info

Publication number: ES2567198T3
Application number: ES04703964.9T
Authority: ES
Inventors: Craig Duane Dickinson; Alain Philippe Vasserot; Jeffry Dean Watkins; Jirong Lu
Original assignee: Applied Molecular Evolution Inc
Current assignee: Applied Molecular Evolution Inc
Priority date: 2003-01-24
Filing date: 2004-01-21
Publication date: 2016-04-20
Anticipated expiration: 2024-01-21
Also published as: US20060140932A1; US7714120B2; WO2004067568A2; CA2509136A1; JP4538461B2; US20090209004A1; AU2004207741A1; JP2007531509A; WO2004067568A3; US7541033B2; AU2004207741B2; JP2010143929A; CN1780855A; CA2509136C; MXPA05007853A; CN1780855B; EP1590369A2; EP1590369B1

Abstract

Un anticuerpo aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une de forma específica a IL-1ß humana, en el que dicho anticuerpo comprende: a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 39; b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 41; d) una CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; e) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21; y, f) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 38.

Description

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Los restos del armazón de la región variable de cadena pesada y ligera se pueden obtener de las mismas o de distintas secuencias de anticuerpo de ser humano. Las secuencias de anticuerpo de ser humano pueden ser las secuencias de anticuerpos de ser humano de origen natural o pueden ser secuencias consenso de varios anticuerpos de ser humano. Las secuencias del armazón de ser humano preferentes para la región variable de la 5 cadena pesada de los anticuerpos humanizados de la presente invención incluyen el segmento de VH DP-5 (Tomlinson, y col. (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798) y el segmento de J JH4, JH1 o JH5 (Ravetch, y col. (1981) Cell

27: 583-591). El segmento de Vk L1 (Cox, y col. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 827-836) y el segmento de J Jk4 (Hieter, y col. (1982) J. Biol. Chem. 10: 1516-1522) son secuencias preferentes para proporcionar el armazón para la región variable de la cadena ligera humanizada.

10 Las secuencias de polinucleótidos de la región constante de la cadena pesada de ser humano preferentes, de los anticuerpos humanizados de la presente invención, incluyen la región constante de IgG 1 o la región constante de IgG4:

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15 La secuencia de polinucleótido de la región constante de la cadena ligera de ser humano preferente de los anticuerpos humanizados de la presente invención es la región constante de la cadena kappa:

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Los anticuerpos preferentes de la presente invención contienen la región constante de la cadena pesada de IgG1 [SEQ ID NO: 65] o la región constante de la cadena pesada de IgG4 [SEQ ID NO: 66] y la región constante de la

20 cadena ligera kappa [SEQ ID NO: 67], y se designan mediante el clon especificado en la Tabla 2 (es decir, W13, W17, etc.). Las secuencias de polinucleótidos de la región variable para los anticuerpos W13, W17, W18, W20 y U43 de la presente invención incluyen:

Cadena pesada de W13

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Cadena pesada de U43

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Cadena ligera de U43

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La presente invención abarca anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos que hacen uso de una o más de CDR1, CDR2, o CDR3 de cadena ligera, o CDR1 de cadena pesada, [SEQ ID NO: 1-4], del anticuerpo Mu007. Las CDR que abarcada la presente invención son las regiones hipervariables del anticuerpo Mu007 que proporcionan la mayoría de los restos de contacto para la unión del anticuerpo a un epítopo de IL-1β específico. Por lo tanto, las CDR descritas en el presente documento pueden utilizarse para fabricar anticuerpos de longitud completa, así como fragmentos funcionales y análogos, u otras proteínas, que cuando se unen a las CDR mantienen a las CDR en una conformación estructural activa, de modo que la afinidad de unión de la proteína que emplea las CDR es específica por IL-1β madura.

La afinidad de unión del anticuerpo Mu007 se determinó utilizando resonancia de plasmón superficial (BIAcore™) [véase el Ejemplo 1]. En estos experimentos el anticuerpo se capturó a densidad baja en un chip de BIAcore™ mediante proteína A o anticuerpo anti Fc, y el ligando se hizo pasar. Se midió la masa acumulada en la superficie del chip. Este procedimiento analítico permite la determinación en tiempo real de las velocidades on y off para obtener la de afinidad (Kd) de unión. El anticuerpo Mu007 tiene una Kd de aproximadamente 6,2 pM (picomolar). Los anticuerpos humanizados preferentes de la presente invención, es decir, W13, W17, W18, W20, y U43, tenían Kd de aproximadamente 2,8 pM, 2,8 pM, 4,2 pM, 2,7 pM, y 4,7 pM, respectivamente (véanse Ejemplo 1, la Tabla 3).

También es preferente que los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención se unan de forma específica a IL-1β y no a otros miembros de la familia IL-1 o a proteínas estructuralmente relacionadas dentro de la misma especie.

También es preferente que los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención neutralicen la actividad biológica de IL-1β. Se utilizaron dos ensayos distintos para analizar la capacidad de Mu007 y de los anticuerpos preferentes de la presente invención para neutralizar la actividad de IL-1β [véanse los Ejemplos 2 y 3].

En este primer ensayo se utilizó una línea celular murina, T1165.17, que necesita bajos niveles de IL-1β para proliferación. IL-1β humana estaba presente a un nivel constante en el medio y se añadió una serie de dilución de cada anticuerpo. La inhibición de la proliferación proporcionó una medida de la capacidad del anticuerpo para bloquear la activación de IL-1β del receptor de IL-1. Las medidas de proliferación para distintas concentraciones del anticuerpo dieron como resultado un valor de CI50 promedio de 20,6 pM para Mu007 y 1,2 pM para W13, 1,8 pM para W17, 2,0 pM para W18, y 4,0 pM para U43, respectivamente (véanse Ejemplo 2, la Tabla 4).

Es preferente que los anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la presente invención tengan un valor de CI50 que sea menor que el de Mu007. La "CI50" al que se hace referencia en el presente documento es la medida de la potencia de un anticuerpo para inhibir la actividad de IL-1β humana. La CI50 es la concentración de anticuerpo que da como resultado el 50 % de inhibición de IL-1β en un experimento de dosis única. La CI50 se puede medir mediante cualquier ensayo que detecte inhibición de la actividad de IL-1β humana. Sin embargo, los valores de la CI50 obtenidos pueden variar según el ensayo utilizado. Incluso puede haber alguna variabilidad entre experimentos que utilizan el mismo ensayo. Por ejemplo, el estado de las células dependientes de IL-1β discutidas en el presente documento, tiene un efecto sobre los valores de la CI50 obtenidos. Por lo tanto, el valor crítico para los fines de la presente invención es un valor con respecto al obtenido utilizando Mu007 o a los anticuerpos de la presente invención, en un experimento único.

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(continuación)

Clon CDR Secuencia SEQ ID NO. CI50 ts/Fab

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Clon CDR Secuencia SEQ ID NO. CI50 ts/Fab

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Clon CDR Secuencia SEQ ID NO. CI50 ts/Fab

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8. Preferentemente, el pH está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7,5. El pH de la formulación se puede seleccionar para equilibrar la estabilidad del anticuerpo (química y física) y que sea confortable para el paciente cuando se administra. La formulación también puede incluir una sal tal como NaCl. Además, la formulación puede incluir un detergente para evitar la agregación y ayudar a mantener la estabilidad.

La formulación puede esterilizarse por filtración después de fabricar la formulación, o hacerse microbiológicamente aceptable de otro modo. Se puede añadir un conservante tal como m-cresol o fenol, o una mezcla de los mismos, para evitar el crecimiento y contaminación microbianos.

Una composición típica para infusión intravenosa podría tener un volumen de líquido de tanto como 250 ml, tal como solución de Ringer estéril, y 1-100 mg por ml o más de concentración de anticuerpo. Los agentes terapéuticos de la invención se pueden congelar o liofilizar para el almacenamiento y reconstituir en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. La liofilización y reconstitución puede conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo (por ejemplo, con inmunoglobulinas convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG). Puede tener que ajustarse las dosificaciones para compensar.

A pesar de que los procedimientos anteriores parecen ser las más convenientes y los más apropiados para la administración de proteínas tales como anticuerpos humanizados, mediante la adaptación adecuada, se pueden emplear otras técnicas para la administración, tales como administración transdérmica y administración oral siempre que se diseñe la formulación apropiada. Además, puede ser conveniente emplear formulaciones de liberación controlada utilizando películas y matrices biodegradables, o minibombas osmóticas, o sistemas de suministro basados en esferas de dextrano, alginato, o colágeno. En resumen, están disponibles formulaciones para la administración de anticuerpos de la invención, y se pueden elegir a partir de una diversidad de opciones.

Los niveles de dosificación normales se pueden optimizar utilizando técnicas clínicas convencionales y dependerán del modo de administración y del estado del paciente. En general, las dosis estarán en el intervalo de 10 μg/kg/mes hasta 10 mg/kg/mes.

La invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no pretenden ser limitantes en modo alguno.

Ejemplo 1

Afinidad y especificidad de unión

Las afinidades y especificidades de Mu007 y de los anticuerpos de la presente invención se determinaron utilizando las mediciones de BIAcore (Tabla 3). BIAcore™ es un sistema biosensor automatizado que mide interacciones moleculares. (Karlsson, y col. (1991) J. Immunol. Methods 145: 229-240). En estos experimentos el anticuerpo se capturó en una superficie a baja densidad en un chip de BIAcore™. Se utilizó etil-dimetilaminopropil-carbodiimida (EDC) para acoplar los grupos amino reactivos a la Proteína A a una celda de flujo de un chip sensor de BIAcore™ de carboximetilo (CM5). La Proteína A se diluyó en tampón acetato de sodio, pH 4,5, y se inmovilizó en una célula de flujo de un chip de CM5 utilizando EDC para producir 1000 unidades de respuesta. Los sitios que no reaccionaron se bloquearon con etanolamina. Se utilizó un caudal de 60 μl/min. Se realizaron múltiples ciclos de unión/dilución mediante la inyección de 10 μl de solución de 2 -μg/ml de los anticuerpos de la presente invención seguido de IL-1β humana a concentraciones decrecientes para cada ciclo (por ejemplo 1500, 750, 375, 188, 94, 47, 23,5, 12, y 0 picomolar). La elución se realizó con glicina-HCl, pH 1,5. Para analizar los datos de cinética se utilizó BIAevaluation™. El protocolo utilizado para la determinación de la afinidad de Mu007 es como se describe en el documento PCT/US02/21281.

Tabla 3. Propiedades de unión de los anticuerpos anti IL-1β a IL-1β humana, determinadas por BIAcore (tampón HBS-EP, pH 7,4 a 25 ºC)

CLON: kon (M-1s-1) koff (s-1) Kd (M)

W17 (IgG1): 3,1e7 0,9e-4 2,8e-12

U43 (IgG1): 4,7e7 2,2e-4 4,7e-12

W13 (IgG1): 6,1e7 1,7e-4 2,8e-12

W18 (IgG1): 4,1e7 1,8e-4 4,2e-12

W20 (IgG1): 3,8e7 1,0e-4 2,7e-12

Mu007: 2,6e7 1,6e-4 6,2e-12

W17(IgG4): 3,2e7 1,0e-4 3,3e-12

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Anticuerpo: Niveles séricos de IL-6 pg/ml DE

IL-1 β (3 μg/kg) + W17 Ctl. (13 μg/kg): 566,8 294,0

IL-1 β (3 μg/kg) + W 17 Ctl. (27 μg/kg): 410,1 107,5

IL-1 β (3 μg/kg) + W17 Ctl. (81 μg/kg): 113,7 42,3

IL-1 β (3 μg/kg) + W17 Ctl. (270 μg/kg): 27,5 19,6

IL-1 β (3 μg/kg) + W18 Ctl. (13 μg/kg): 398,5 143,2

IL-1 β (3 μg/kg) + W18 Ctl. (27 μg/kg): 231,8 32,2

IL-1 β (3 μg/kg) + W18 Ctl. (81 μg/kg): 77,9 24,7

IL-1 β (3 μg/kg) + W18 Ctl. (270 μg/kg): 18,0 5,9

IL-1 β (3 μg/kg) + U43 Ctl. (13 μg/kg): 755,7 299,7

IL-1 β(3 μg/kg) + U43 Ctl. (27 μg/kg): 509,3 99,6

IL-1 β (3 μg/kg) + U43 Ctl. (81 μg/kg): 186,4 80,8

IL-1 β (3 μg/kg) + U43 Ctl. (270 μg/kg): 39,3 17,7

Ejemplo 4

Expresión de anticuerpo

El siguiente protocolo se aplica a la expresión de cualquiera de los anticuerpos de la presente invención.

Los vectores de expresión que codifican una secuencia líder, y la región constante de la cadena ligera Kappa o la cadena pesada Gamma 1 se utilizaron para clonar las secuencias Fab, lo que dio como resultado genes de anticuerpos completos. Los vectores se pueden utilizar en múltiples líneas celulares de mamífero para la expresión transitoria y estable.

Se cambia la escala de los vectores para generar la cantidad de ADN necesaria para sustentar la transfección. El ADN final permanece como un vector circular cerrado cuando se utiliza en transfecciones transitorias, y se puede linealizar cuando se utiliza en una transfección estable. Para identificar la mejor proporción CL:CH deberían sustentarse transfecciones transitorias a pequeña escala. En cualquier transfección el vector que codifica la cadena ligera (CL) y la cadena pesada (CH) se mezclan juntos antes de transfectarlos en las células.

Se sustenta la transfección transitoria en células HEK 293 EBNA. La transfección se cambia de escala y se cultiva durante cinco a siete días después de la transfección. El sobrenadante se recolecta y el anticuerpo se purifica utilizando estrategias convencionales para anticuerpos.

Las transfecciones estables en células DG44-CHO (Ovario de Hámster Chino) se pueden sustentar utilizando los vectores descritos. La cantidad de ADN utilizado puede variar desde 20 μg a 200 μg. Las células (107) se transfectan utilizando una máquina BioRad Gene Pulsar II ajustado a 360 V/950 uF. Las células se recuperan durante 24-72 horas a 37 ºC/CO2 al 5 %, y después se siembran en placa en selección (medio sin hipoxantina y timidina, y con niveles variable de metotrexato, MTX, para presión adicional).

Las transfecciones estables en células NS0 (mieloma de ratón) se pueden sustentar trasladando los genes de la CL y la CH a vectores de expresión que codifican un gen de la glutamina sintasa. La cantidad de ADN utilizada es de 40 μg en total. Las células (107) se transfectaron utilizando una máquina BioRad Gene Pulsar II ajustada a 300 V/1000 uF. Las células se recuperan durante 24-72 horas a 37 ºC/CO2 al 10 % y después se siembran en placa en selección (medio sin glutamina y con metionina sulfoximina, MSX, para presión adicional).

Se sustenta una siembra en placa para ambos tipos de líneas celulares a las densidades de siembra específicas para la línea celular (500 c/p de CHO-DG44, 2000 c/p de NS0). Cuando se observa en los pocillos la formación visible de colonias, se puede explorar la producción de anticuerpo en las placas utilizando procedimientos basados en ELISA. Los pocillos que contienen células con una señal positiva para anticuerpo, se expanden en placas de 24 pocillos. Las líneas se cultivan y evalúan en experimentos de expresión para identificar una línea celular candidata con título y calidad de proteína aceptables. El objetivo del esfuerzo en la generación de la línea celular es para identificar un clon al que se le pueda cambiar la escala en condiciones de cultivo sin suero, con título, características de crecimiento y perfil de calidad de producto aceptables.

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Claims

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