ES2390761T3 - Anticuerpos recombinantes de alta potencia y método para producción de los mismos - Google Patents
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Abstract
Un anticuerpo que se fija específicamente a la proteína F de un virus respiratorio sincitial (RSV), donde elanticuerpo:a. tiene una constante de velocidad de asociación (kon) de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1 como se mide porresonancia de plasmones de superficie;b. tiene un valor CE50 menor que 3,0 nM en un ensayo de microneutralización para RSV; yc. comprende las CDRs siguientes con uno o más cambios de aminoácidos en las posiciones subrayadas yen negrita en una o más de las CDRs:región de determinación de la complementariedad de la región variable de la cadena pesada (VH)(CDR)1 TSGMSVG (SEQ ID NO:8);VH CDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO:9);VH CDR3 SMITNWYFDV (SEQ ID NO:10);región variable de la cadena ligera (VL) CDR1 SASSSVGYMH (SEQ ID NO:5);VL CDR2 DTSKLAS (SEQ ID NO:6); yVL CDR3 FQGSGYPFT (SEQ ID NO:7),en donde dichos uno o más cambios de aminoácidos tienen el efecto de producir un aumento en el valor de kon yaumentar la actividad de microneutralización de dicho anticuerpo.
Description
Anticuerpos recombinantes de alta potencia y método para producción de los mismos.
La presente invención se refiere a anticuerpos de alta potencia, métodos de aumento de la potencia de los anticuerpos y uso de anticuerpos de este tipo para prevención y tratamiento de enfermedades.
Han sido desarrollados, y están siéndolo actualmente, anticuerpos para la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades, especialmente las causadas por microorganismos infecciosos, tales como los virus.
Un enfoque ha consistido en el desarrollo de anticuerpos, especialmente anticuerpos monoclonales neutralizantes, algunos de ellos con alta actividad específica de neutralización. Un inconveniente de este enfoque ha sido la necesidad de producir anticuerpos humanos en lugar de los de ratón o rata y minimizar con ello el desarrollo de respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón o anti-rata, lo cual da potencialmente como resultado una patología inmune adicional.
Un enfoque alternativo ha sido la producción de anticuerpos quiméricos humano-murino en los cuales los genes que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de ratón se han acoplado a los genes para regiones constantes de cadena pesada y ligera humanas a fin de producir anticuerpos quiméricos, o híbridos. Por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV humanizado ha sido preparado y está siendo comercializado actualmente. [Véase: Johnson, Patente U.S. No. 5.824.307].
En algunos casos, se han injertado regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de ratón en regiones constantes y de entramado humanas en las cuales se han insertado algunos de los aminoácidos de entramado de ratón (aminoácidos en la región variable del anticuerpo pero fuera de las CDRs) en sustitución de los aminoácidos posicionados correspondientemente de un anticuerpo humano de la misma especificidad a fin de proporcionar un anticuerpo denominado “humanizado”. [Véase, por ejemplo, Queen, Patentes U.S. No. 5.693.761 y 5.693.762]. Sin embargo, tales anticuerpos contienen regiones CDR de ratón intactas y han alcanzado una eficacia desigual, exhibiendo a menudo afinidades no mayores que 107 a 108 M-1.
WO 9.833.919 describe el anticuerpo humanizado Vitaxin® y anticuerpos injertados afines basados en LM609 monoclonal de ratón.
La producción de anticuerpos de alta potencia (es decir anticuerpos con alta actividad biológica, tal como actividad neutralizante de antígeno), con inclusión de anticuerpos con afinidad ultraelevada para el antígeno diana, sería deseable desde el punto de vista tanto de la capacidad neutralizante de un anticuerpo de este tipo como desde los aspectos más prácticos de requerir menor cantidad de anticuerpo a fin de conseguir un grado deseable de eficacia clínica, reduciendo con ello los costes de utilización.
La afinidad de los anticuerpos se mide por la constante de fijación del anticuerpo a un antígeno particular, y dicha constante de fijación se calcula a menudo por la ratio de la constante de velocidad para la formación del complejo anticuerpo-antígeno (a la que se hace referencia como el valor “kon”) a la constante de velocidad para la disociación de dicho complejo (el valor “koff”). De acuerdo con la presente invención, se ha determinado que la potencia de un anticuerpo es una función del valor kon, con indiferencia de la especificidad. La presente invención proporciona así una solución a los problemas de conseguir una alta potencia de anticuerpo en el sentido de que cuanto mayor es el valor kon, tanto mayor es la potencia del anticuerpo, proporcionando con ello anticuerpos de alta potencia y un método para producción de los mismos.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos de alta potencia de acuerdo con la reivindicación 1 útiles en el tratamiento y/o la prevención en una enfermedad. En otro aspecto, la potencia de un anticuerpo aumenta al aumentar la constante de velocidad para la formación del complejo antígeno-anticuerpo (el valor “kon”).
En un aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos de alta potencia, distintos de Vitaxin, que incluyen porciones inmunológicamente activas, fragmentos, o segmentos de los mismos, que tienen un kon de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, con prevalencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s-1. Tales anticuerpos pueden tener también afinidad alta (al menos aproximadamente 109 M-1).
En otro aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos neutralizantes de alta potencia, que incluyen porciones, fragmentos, o segmentos inmunológicamente activos de los mismos que tienen un kon de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s-1. Tales anticuerpos pueden tener también afinidad alta (al menos aproximadamente 109 M-1).
Se describen también métodos para aumentar la potencia de anticuerpos neutralizantes por aumento del valor kon con respecto a un antígeno dado sin cambiar el epítope al que se fija el anticuerpo.
Se describe también un medio de cribado de anticuerpos respecto a propiedades que aseguren alta potencia con respecto a un antígeno deseado, siendo dicha potencia al menos 2 a 10 veces mayor que la de los anticuerpos conocidos.
Más específicamente, es un objeto de la presente invención producir anticuerpos que tienen valores kon al menos tan altos como 2,5 x 105 M-1 s-1, preferiblemente al menos 5 x 105 M-1 s-1, y muy preferiblemente al menos tan altos como 7,5 x 105 M-1 s-1.
Es también un objeto de la presente invención proporcionar anticuerpos de alta afinidad y alta potencia que tienen especificidad alta para la proteína F de un virus respiratorio sincitial (RSV) causante de infección del sistema respiratorio.
En una realización, la presente invención proporciona anticuerpos que tienen sustancialmente las regiones de entramado (FR) de cadena variable del anticuerpo descrito en la Figura 1 (con la misma especificidad que este anticuerpo) pero en los cuales las estructuras polipeptídicas contienen una o más diferencias de aminoácido en una
o más de las CDRs (o regiones determinantes de la complementariedad) de los mismos. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención diferirán del anticuerpo de las Figuras 1 ó 2 (en lo sucesivo, la “estructura básica” o “estructura de referencia”) únicamente en las secuencias de una o más de las CDRs, que incluyen L1, L2, L3, H1, H2, y H3. Una secuencia preferida se muestra en la Figura 3.
Es otro objeto de la presente invención proporcionar composiciones que comprenden los anticuerpos descritos en esta memoria en donde dichos anticuerpos están suspendidos en un vehículo, diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable.
Es otro objeto adicional de la presente invención proporcionar composiciones y medicamentos para uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades, tales como las causadas por virus, especialmente el virus respiratorio sincitial, en donde las composiciones y medicamentos comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene un anticuerpo como se describe en esta memoria.
La Figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo monoclonal de afinidad alta cuya potencia puede ser aumentada por los métodos de la presente invención. Para propósitos de referencia, este anticuerpo es la secuencia de anticuerpo MEDI-493 descrita en Johnson et al., J. Infect. Dis., 176:1215-1224 (1997). En este caso, las regiones CDR están subrayadas, mientras que los residuos no subrayados forman las regiones de entramado de las regiones variables de cada estructura de polipéptido. En esta estructura, las CDRs se derivan de un anticuerpo de ratón, mientras que las regiones de entramado se derivan de un anticuerpo humano. Las regiones constantes (no representadas) se derivan también de un anticuerpo humano. La Figura 1A muestra la región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 1) y la Figura 1B muestra la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 2) de las cadenas ligera y pesada, respectivamente.
La Figura 2 muestra las regiones variables de la cadena pesada y ligera para una secuencia de polipéptido básica o de referencia diferente. De nuevo, las regiones CDR están subrayadas. Esta secuencia difiere de la Figura 1 en los cuatro primeros residuos de la CDR L1 de la cadena ligera, el residuo 103 de la cadena ligera y el residuo 112 de la cadena pesada. La totalidad de las estructuras Fab neutralizantes de alta potencia de la presente invención (estructuras CDR representadas en la Tabla 2) utilizan la secuencias de entramados de esta estructura de referencia
o básica. Fig. 2A muestra las regiones variables de la cadena ligera (SEQ ID NO: 3) y Fig. 2B muestra las regiones variables de la cadena pesada (SEQ ID NO: 4).
La Figura 3 muestra las regiones variables de la cadena pesada (SEQ ID NO: 36) y de la cadena ligera (SEQ ID NO: 35) de una realización preferida de la presente invención. Este anticuerpo preferido tiene varias CDRs de kon alto (o CDRs de alta potencia) presentes, que dan lugar a constantes de velocidad de asociación (es decir, kon) mayores que el anticuerpo básico o de referencia de la Figura 2, y por consiguiente mayor potencia. Este anticuerpo preferido tiene las mismas secuencias de aminoácidos de entramado que la secuencia de la Figura 2 y, para los propósitos de la presente exposición, se designa como “clon 15” en las Tablas 2 y 3, más adelante. Estas secuencias son generadas fácilmente por métodos descritos en esta memoria, todos los cuales son fácilmente conocidos para los expertos en la técnica. Las constantes cinéticas se midieron de acuerdo con el procedimiento del Ejemplo 1 y la potencia se determinó como se describe en el Ejemplo 2.
La Figura 4 muestra un diagrama esquemático del uso del fago M13 para generación de fragmentos Fab de acuerdo con la presente invención y la utilización de una secuencia marcadora de histidina (6 residuos histidina) a fin de facilitar la purificación.
La Figura 5 muestra un diagrama esquemático para el procedimiento de cribado utilizado para los anticuerpos de la presente invención. “SPE” se refiere a un ELISA de un solo punto. “H3-3F4” es una designación para el clon 4 de las Tablas 2 y 3.
De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos de alta potencia de acuerdo con la reivindicación 1 útiles en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades. En otro aspecto, la potencia del anticuerpo se incrementa por aumento de la constante de velocidad para la formación del complejo antígenoanticuerpo, a la que se hace referencia como el valor “kon”, por reemplazamiento de secuencias CDR de dicho anticuerpo con secuencias CDR de alta potencia en su lugar.
En un aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos de alta potencia, distintos de vitaxin, que incluyen porciones, fragmentos, o segmentos inmunológicamente activos de dichos anticuerpos de alta potencia, que tienen un kon de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s-1. Tales anticuerpos pueden tener también una afinidad alta (al menos aproximadamente 109 M-1).
En un aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos neutralizantes de alta potencia, que incluyen porciones, fragmentos o segmentos inmunológicamente activos de los mismos, que tienen un kon de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s-1. Tales anticuerpos pueden tener también una afinidad alta (al menos aproximadamente 109 M-1).
Se describen también métodos de producción de anticuerpos, neutralizantes o no neutralizantes, que tienen alta potencia, o actividad biológica, teniendo preferiblemente una afinidad de al menos aproximadamente 109 M1, y teniendo un kon de al menos aproximadamente 2,5 x 105 M-1 s-1, con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105
M-1-1
s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s.
Con la aparición de los métodos de biología molecular y la tecnología de DNA recombinante, es ahora posible producir anticuerpos, con inclusión de fragmentos activos de los mismos, por medios recombinantes y generar con ello secuencias génicas que codifican las secuencias específicas de aminoácidos encontradas en la estructura polipeptídica de los anticuerpos. Esto ha permitido la producción fácil de anticuerpos que tienen secuencias características de anticuerpos neutralizantes de diferentes especies químicas y fuentes.
Con indiferencia del modo de construcción de los mismos, los anticuerpos tienen una estructura tridimensional global similar indicada usualmente como L2H2 en donde la molécula comprende comúnmente 2 cadenas ligeras (L) de aminoácidos y 2 cadenas pesadas (H) de aminoácidos. Ambas cadenas tienen regiones capaces de interaccionar con una diana antigénica estructuralmente complementaria. Se hace referencia a las regiones que interaccionan con la diana como regiones “variables” o “V”, y se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de especificidad antigénica diferentes.
Las regiones variables de las cadenas H o L contienen la secuencia de aminoácidos capaces de fijarse específicamente a dianas antigénicas. Dentro de estas secuencias existen secuencias más pequeñas designadas “hipervariables” debido a su extremada variabilidad entre anticuerpos de especificidad diferente. Tales regiones hipervariables se denominan “regiones determinantes de la complementariedad” o regiones “CDR”. Estas regiones CDR dan cuenta de la especificidad básica del anticuerpo para una estructura determinante particular del antígeno.
Las CDRs representan tramos no contiguos de aminoácidos dentro de las regiones variables, pero se ha encontrado que las localizaciones posicionales de estas secuencias críticas de aminoácidos dentro de las regiones variables de cadena pesada y ligera tienen localizaciones similares dentro de las secuencias de aminoácidos de la estructura de las inmunoglobulinas. Las cadenas pesada y ligera variables de todos los anticuerpos tienen cada una 3 regiones CDR, no siendo contiguas ninguna de ellas a las otras (denominadas L1, L2, L3, H1, H2, H3) para las cadenas ligera y pesada respectivas. Las regiones CDR aceptadas han sido descritas por Kabat et al, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977). El esquema de numeración se muestra en las Figuras 1-3, donde las CDRs están subrayadas y los números siguen el esquema de Kabat.
En todas las especies de mamífero, los polipéptidos de los anticuerpos contienen regiones constantes (es decir, altamente conservadas) y variables que comprenden ambas CDRs y las denominadas “regiones de entramado”, constituidas las últimas por secuencias de aminoácidos dentro de la región variable pero fuera de las CDRs.
Entre las propiedades utilizadas comúnmente para caracterizar un anticuerpo, o fragmento del mismo, se encuentran la especificidad y afinidad del anticuerpo. La especificidad se refiere al ligando particular, o estructura antigénica, a la que se fija fuertemente, o muy fuertemente, el anticuerpo. La afinidad hace referencia a una medida cuantitativa de la fuerza de fijación del anticuerpo a un ligando particular y se da en términos de una “constante de afinidad”. Tales constantes de afinidad pueden ser determinadas como constantes de asociación o disociación y representan la ratio de las concentraciones de equilibrio del ligando libre y el anticuerpo libre respecto al complejo anticuerpo-ligando. Como se utiliza en esta memoria, la afinidad se dará como una constante de asociación.
Tales constantes son medidas comúnmente por la cinética de la formación del complejo antígeno-anticuerpo, designándose la constante de velocidad de asociación para formar el complejo como kon, y designándose la constante de velocidad de disociación como koff. La medida de tales constantes está plenamente dentro de las aptitudes de los expertos en la técnica. El anticuerpo y el antígeno respectivo se combinan para formar un complejo como sigue:
Aquí, la constante de afinidad se da como una constante de asociación y representa por tanto:
donde Ka = la constante de asociación (o afinidad), mientras que los corchetes indican concentración molar de la especie encerrada entre ellos. Para una serie dada de condiciones tales como temperatura, presión y fuerza iónica, la ratio de la concentración del complejo al producto de las concentraciones de las especies reaccionantes es constante. Con tal que no se alcancen condiciones de saturación para el anticuerpo o el antígeno (ligando), un
15 cambio en la concentración de cualquiera de las especies de fijación alterará la concentración del complejo (Ab-Ag) en una cantidad dictada por la ecuación anterior (puesto que Ka es constante). Dicha interacción opera de acuerdo con la ley de acción de las masas.
Adicionalmente, esta interrelación depende de las concentraciones y no de la cantidad absoluta de las especies químicas presentes, por lo que el volumen global es también relevante para cualquier medida de afinidad. Así, si la
20 reacción tiene lugar en la mitad del volumen, se formará una cantidad dos veces mayor de complejo debido a que cada especie reaccionante (Ab y Ag) está presente ahora a una concentración doble, y se formará por tanto una cantidad de complejo cuatro veces mayor. Inversamente, la dilución puede reducir notablemente la concentración del complejo Ab-Ag. En general, las cinéticas de la interacción antígeno-anticuerpo son bien conocidas por los expertos en la técnica.
25 Dicha reacción anticuerpo-antígeno puede describirse cinéticamente como un equilibrio dinámico en el que la constante de afinidad puede medirse como una ratio de las constantes de velocidad individuales para formación y disociación del complejo:
Así pues, el valor kon es la constante de velocidad, o velocidad de reacción específica, de la reacción directa, o de
30 formación del complejo, medida en unidades: M-1 s-1. El valor koff es la constante de velocidad, o velocidad de reacción específica, para la disociación del complejo Ab-Ag y se mide en unidades de s-1.
Los valores de kon para los anticuerpos, y fragmentos activos de los mismos, de la presente invención se midieron utilizando el protocolo y equipo BIAcore como se describe en los Ejemplos.
De acuerdo con lo que antecede, la presente invención se refiere a anticuerpos neutralizantes de alta potencia, con
35 inclusión de porciones, fragmentos y/o segmentos inmunológicamente activos de los mismos, que tienen un kon de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, teniendo con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s-1.
Como se utiliza en esta memoria, los términos “porción”, “segmento”, y “fragmento”, cuando se utilizan en relación con polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, tales como residuos de aminoácidos, 40 secuencia que forma un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se sometiera a
tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas comunes, tales como tripsina, quimotripsina, pepsina, papaína, etc., los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarían porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido de partida. Tales proteinasas se utilizan comúnmente para generar fragmentos de anticuerpos, tales como los descritos en esta memoria, aunque fragmentos de este tipo pueden generarse más fácilmente ahora por clonación o síntesis directa del polipéptido particular que se desea producir.
Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos de alta potencia, que exhiben generalmente valores kon altos. Para los propósitos de la presente exposición, el término “potencia alta” hace referencia a una potencia reflejada por una CE50 (o concentración eficaz que da lugar al menos a una reducción de 50% en el valor DO450 en el ensayo de microneutralización descrito más adelante) inferior a aproximadamente 3 nM (nanomolar o 10-9 molar). Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser neutralizantes (causantes de la destrucción de la especie diana, tal como un virus, y que reducen con ello la carga viral). Un anticuerpo no neutralizante para un uso puede ser neutralizante para un uso diferente.
Los anticuerpos de alta potencia pueden tener especificidad para determinantes antigénicos encontrados en los microbios y son capaces de neutralizar dichos microbios por fijación a los mismos. De acuerdo con la presente invención, tales microbios son en la mayoría de los casos virus, bacterias u hongos, especialmente organismos que causan enfermedad respiratoria y muy preferiblemente virus. Un ejemplo específico, utilizado en los ejemplos de esta memoria, es el virus respiratorio sincitial (RSV); otro ejemplo es el virus de la parainfluenza (PIV).
Los anticuerpos de alta potencia pueden tener también especificidad para antígenos exhibidos en las superficies de las células del cáncer (pero generalmente no incluirán anticuerpos, tales como vitaxin, que son no neutralizantes. (Véase: Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6037-6042 (1998)).
Los anticuerpos de alta potencia pueden tener también especificidad para sustancias químicas tales como sustancias tóxicas, o toxinas, o para los productos de toxinas, que incluyen, pero sin carácter limitante, productos producidos por el metabolismo de un organismo de tal o tales toxinas. Por ejemplo, los anticuerpos de alta potencia de la presente invención pueden ser útiles en la anulación, o mejora de cualquier otro modo, de los efectos de drogas adictivas, tales como la cocaína.
Los anticuerpos de alta potencia de la presente invención pueden tener también afinidad alta para el antígeno F de RSV, y, donde se exhibe dicha afinidad alta, la constante de afinidad (Ka) de tales anticuerpos es al menos aproximadamente 109 M-1, con preferencia al menos aproximadamente 1010 M-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 1011 M-1.
Los anticuerpos de la presente invención exhiben potencia alta cuando se mide en el ensayo de microneutralización descrito en el Ejemplo 2. En dicho ensayo, la potencia alta se mide por el valor CE50 y tiene comúnmente un valor CE50 menor que aproximadamente 3,0 nM (nanomolar o 10-9 M), y de modo muy preferible menor que aproximadamente 1,0 nM. En general, cuanto menor es el valor CE50, tanto mayor es la potencia, o actividad biológica.
Los anticuerpos de alta potencia de la presente invención exhiben dicha potencia elevada debido a sus altos valores kon, que está determinada por las secuencias de aminoácidos que constituyen las regiones de entramado (FR) y regiones determinantes de la complementariedad (CDRs). Estos anticuerpos, o fragmentos activos de los mismos, tienen regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de alta potencia, dentro de sus secuencias de aminoácidos. Los anticuerpos neutralizantes de alta potencia de la presente invención pueden comprender al menos 2 CDRs de alta potencia, o 3 CDRs de alta potencia, o incluso 4 CDRs de alta potencia o 5 CDRs de alta potencia, y pueden comprender incluso 6 CDRs de alta potencia. Por supuesto, en el último caso, la totalidad de las 6 CDRs del anticuerpo, o fragmentos activos del mismo, son CDRs de alta potencia. De acuerdo con ello, tales anticuerpos neutralizantes de alta potencia de la presente invención tienen CDRs de alta potencia que están constituidas por una de cada una de las CDRs de cadena ligera L1 (CDR L1), L2 (CDR L2), y L3 (CDR L3) y CDRs de cadena pesada H1 (CDR H1), H2 (CDR H2) y H3 (CDR H3).
En realizaciones específicas de tales anticuerpos de alta potencia, dichas CDRs de alta potencia tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 11, 12, 13, 56 o 59 para CDR L1, SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 57, 58 DTFRLAS y DTFYLSS para CDR L2, SEQ ID NO: 23 para CDR L3, SEQ ID NO: 24 y 25 para CDR H1, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 55 y DIWWDGKKSYNPSLKS para CDR H2, SEQ ID NO: 31, 32, 33 y 34 para CDR H3.
En realizaciones preferidas, los anticuerpos neutralizantes de alta potencia de la presente invención comprenden cadenas variables pesada y ligera con secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 35 y 36.
Un proceso para producir un anticuerpo de alta potencia puede comprender:
- (a)
- producir un anticuerpo recombinante, con inclusión de fragmentos inmunológicamente activos del mismo, que comprende regiones constantes de cadena pesada y ligera derivadas de un anticuerpo de mamífero y
regiones variables de cadena pesada y ligera que contienen una o más regiones de entramado y/o regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que tienen secuencias de aminoácidos preseleccionadas;
- (b)
- cribar dichos anticuerpos recombinantes respecto a kon altos cuando dicho anticuerpo reacciona in vitro con un antígeno seleccionado; y
- (c)
- seleccionar anticuerpos con dicho kon alto.
Los anticuerpos producidos de acuerdo con el proceso arriba descrito darán comúnmente constantes de afinidad altas y valores kon altos, produciendo los últimos alta actividad biológica, o potencia. En realizaciones específicas, los anticuerpos de alta potencia producidos de acuerdo con la presente invención tienen comúnmente un kon de al menos aproximadamente 2,5 x 105 M-1 s-1, con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s-1.
En una realización, los procesos descritos en esta memoria producen un anticuerpo de alta potencia en el cual las secuencias de aminoácidos preseleccionadas que producen un kon alto (y la alta potencia resultante) están presentes, o bien a la vez en la región de entramado y al menos en dos o tres regiones CDR, quizás en la totalidad de las 6 regiones CDR, del anticuerpo o están restringidas exclusivamente a regiones CDR.
En otra realización, las secuencias de aminoácidos preseleccionadas que producen un kon alto están presentes o bien a la vez en la región de entramado y al menos en 3 regiones CDR del anticuerpo o están restringidas exclusivamente a regiones CDR.
En una realización adicional, las secuencias de aminoácidos preseleccionadas que producen un kon alto están presentes o bien a la vez en la región de entramado y en al menos 4 regiones CDR del anticuerpo o están restringidas exclusivamente a regiones CDR.
Adicionalmente, los anticuerpos producidos por los procesos descritos en esta memoria pueden ser anticuerpos tetrámeros completos, que tienen la estructura H2L2, o pueden ser fragmentos de tales estructuras de anticuerpo, con inclusión de anticuerpos monocatenarios o fragmentos tales como Fab o fragmentos F(ab)2’.
De acuerdo con la presente invención, el antígeno para el cual son específicos los anticuerpos es expresado por el virus respiratorio sincitial (RSV).
Un proceso para producir un anticuerpo de alta potencia puede comprender producir un anticuerpo recombinante que comprende la región constante de cadena pesada y ligera derivada de un anticuerpo de mamífero y regiones variables de cadena pesada y ligera que contienen regiones de entramado y/o regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las cuales al menos una CDR es una CDR de kon alto (o de alta potencia) que tiene una secuencia de aminoácidos no encontrada en la naturaleza y en donde la presencia de dicha CDR da como resultado un kon alto.
En realizaciones específicas, el anticuerpo recombinante de kon alto comprende al menos 2 CDRs de kon alto, posiblemente 3 CDRs de kon alto, e incluso 4 CDRs de valor kon alto, y tantas como 5 ó 6 CDRs de kon alto. La presencia de tales secuencias CDR da como resultado que el anticuerpo, o fragmento, exhiba un kon alto, y por consiguiente una potencia alta.
En otras realizaciones, la alta constante de asociación arriba mencionada de los anticuerpos producidos por los
M-1-1
métodos de la invención es al menos aproximadamente 2,5 x 105 s, con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s-1.
Un proceso para producir un anticuerpo de alta potencia puede comprender:
- (a)
- producir un anticuerpo recombinante, con inclusión de fragmentos inmunológicamente activos del mismo, que comprende regiones constantes de cadena pesada y ligera derivadas de un anticuerpo de mamífero y regiones variables de cadena pesada y ligera que contienen una o más regiones de entramado y/o regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) que tienen secuencias de aminoácidos preseleccionadas;
- (b)
- cribar dichos anticuerpos recombinantes tanto respecto a afinidad alta como a kon alto cuando dicho anticuerpo reacciona in vitro con un antígeno seleccionado; y
- (c)
- seleccionar anticuerpos que tengan a la vez afinidad alta y kon alto.
Los procesos descritos en esta memoria producen anticuerpos de alta potencia que tienen a la vez afinidad alta y kon alto en donde la constante de afinidad es al menos 109 M-1 y kon es al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, especialmente donde dicha afinidad es al menos 1010 M-1 y dicho kon es al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, muy especialmente donde dicha constante de afinidad es al menos 1011 M-1 y dicho kon es al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, teniendo las realizaciones más preferidas afinidad y kon muy altos, especialmente en los cuales dicha afinidad es al menos 109 M-1 y dicho kon es al menos 5 x 105 M-1 s-1, y muy especialmente en los cuales la constante de afinidad es al menos 1010 M-1, y kon es al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, siendo una realización muy especialmente preferida una que produce un anticuerpo de alta potencia en el que la constante de afinidad es al menos 1011 M-1, y el kon es al menos 7,5 x 105 M-1 s-1. Debe entenderse también que, cuando se busca también afinidad alta, cualquier combinación de los valores arriba mencionados de afinidad (Ka) y asociación cinética (kon) está dentro de la presente invención.
Estas realizaciones incluyen también procesos en los cuales la secuencia de aminoácidos preseleccionada que produce un kon alto está presente a la vez en la región de entramado y las regiones CDR, o sólo en las regiones CDR, y en los cuales tales secuencias, seleccionadas de SEQ ID NO: 11 a 34 y 55 a 58, están presentes en 1, 2, 3, 4, 5, o la totalidad de las 6 regiones CDR, donde la secuencia CDR individual se selecciona de las secuencias individuales descritas en esta memoria. Los métodos para hacer esto están plenamente dentro de la habilidad de los expertos en la técnica y no se expondrán con mayor detalle en esta memoria.
Los métodos descritos en esta memoria no se limitan a producir exclusivamente nuevos anticuerpos de afinidad alta que son específicos para un antígeno particular y que se han producido sin tener en cuenta moléculas y estructuras inmunógenas ya existentes. Así pues, los métodos descritos en esta memoria proporcionan un medio para modificaciones seleccionadas de las estructuras de moléculas de anticuerpos conocidas, produciendo con ello aumentos en el kon de dichos anticuerpos y la actividad biológica incrementada concomitante. Esto se consigue por incorporación selectiva de las secuencias CDR de alta potencia descritas en esta memoria.
En realizaciones separadas de la presente invención, el anticuerpo cuya potencia debe incrementarse tendrá una constante de afinidad inicial y/o final de al menos 109 M-1, con preferencia al menos aproximadamente 1010 M-1, y de modo muy preferible al menos aproximadamente 1011 M-1.
Los anticuerpos producidos de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria tendrán constantes kon mayores después de los cambios de aminoácidos para producir las secuencias de alta potencia de la invención y como resultado de dichos cambios de aminoácidos, especialmente en los cuales el valor kon después de dichos cambios de aminoácidos es al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, especialmente al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s-1, y de modo muy especial al menos aproximadamente 7,5 x 105 M-1 s-1 (con indiferencia de la constante de afinidad particular) (Ka).
En la aplicación de los métodos descritos en esta memoria debe entenderse que los cambios arriba mencionados en la secuencia de aminoácidos utilizados para aumentar la potencia de un anticuerpo, o fragmentos activos del mismo,
o el uso de secuencias seleccionadas de aminoácidos para producir anticuerpos de alta potencia, o fragmentos activos de alta potencia de los mismos, alcanzan dicha alta potencia, o potencia incrementada, por la producción de valores kon altos. Dado que la constante de afinidad es una ratio numérica de kon a koff, un kon incrementado puede dar como resultado afinidad incrementada si el valor koff no cambia en el mismo factor. Así pues, las potencias elevadas de los anticuerpos producidos de acuerdo con los presentes métodos son función del valor de kon y no del valor de Ka (la constante de afinidad). Por ejemplo, el uso de secuencias de aminoácidos seleccionadas en las CDRs de una molécula de anticuerpo puede dar como resultado un aumento apreciable en ambas constantes de velocidad de asociación (kon) y disociación (koff) y, si ambas constantes aumentan según el mismo factor, el resultado es una potencia alta, o mayor (debido al kon mayor), pero sin ningún aumento resultante en Ka (dado que la ratio de kon a koff es la misma). Inversamente, en los casos en que el uso de tales secuencias de aminoácidos preseleccionadas dentro de las CDRs de un anticuerpo de alta potencia da como resultado un koff reducido y sin aumento alguno de kon, el resultado es un anticuerpo, o fragmento activo del mismo, con mayor afinidad pero con poco o ningún aumento de potencia. Así pues, se ha encontrado que se produce poco o ningún cambio de potencia en los casos en que cambia únicamente el valor koff (dado que Ka es la ratio de kon a koff) pero kon se mantiene constante a pesar de un cambio numérico en Ka.
De acuerdo con la presente invención, están disponibles varios métodos convenientes para la medida de la potencia de los anticuerpos, o fragmentos activos de los mismos, tales como fragmentos Fab. Un método de este tipo utiliza el modelo de la rata del algodón, detalles del cual se exponen en los ejemplos proporcionados más adelante. Otro es el ensayo de microneutralización (véase el Ejemplo 2).
Así mismo de acuerdo con la presente invención, se proporcionan composiciones y medicamentos para prevención
o tratamiento de una enfermedad que comprenden una cantidad terapéutica (o profilácticamente) eficaz de un anticuerpo de alta potencia, o fragmento activo del mismo, que tiene una secuencia polipeptídica como se describe en esta memoria o producido de acuerdo con los métodos expuestos en esta memoria. En una realización preferida, la enfermedad está causada por un virus respiratorio sincitial y el virus de la parainfluenza.
Los anticuerpos neutralizantes de alta potencia de la presente invención se obtienen por generación de secuencias génicas de anticuerpos apropiadas, es decir, secuencias de aminoácidos, por disposición de las secuencias de nucleótidos apropiadas y expresión de éstas en una línea de células adecuada. Cualesquiera secuencias de nucleótidos deseadas pueden producirse utilizando el método de la mutagénesis basada en codones, como se describe, por ejemplo, en las patentes U.S. Núms. 5.264.563 y 5.523.388. Tales procedimientos permiten la producción de cualesquiera y la totalidad de frecuencias de residuos de aminoácidos en cualesquiera posiciones deseadas de codones dentro de un oligonucleótido. Esto puede incluir sustituciones completamente aleatorias de cualquiera de los 20 aminoácidos en una posición deseada o en cualquier subconjunto específico de éstas.
Alternativamente, este proceso puede llevarse a cabo de tal manera que se consiga un aminoácido particular en una localización deseada dentro de una cadena de aminoácidos, tal como las nuevas secuencias CDR de acuerdo con la invención. En suma, la secuencia de nucleótidos apropiada para expresar cualquier secuencia de aminoácidos deseada puede conseguirse fácilmente y utilizando tales procedimientos pueden reproducirse las nuevas secuencias CDR de la presente invención. Esto da como resultado la posibilidad de sintetizar polipéptidos, tales como anticuerpos, con cualquier secuencia de aminoácidos deseada. Por ejemplo, es posible ahora determinar las secuencias de aminoácidos de cualesquiera dominios deseados de un anticuerpo de elección y, opcionalmente, preparar cadenas homólogas que tienen uno o más aminoácidos reemplazados por otros aminoácidos deseados, a fin de obtener una gama de análogos sustituidos.
En la aplicación de tales métodos, debe apreciarse que debido a degeneración del código genético, métodos tales como la síntesis aleatoria de oligonucleótidos y la síntesis parcial de oligonucleótidos degenerados incorporarán redundancias para codones que especifiquen un residuo de aminoácido particular en una posición particular, aunque dichos métodos pueden utilizarse para proporcionar un conjunto maestro de todas las secuencias de aminoácidos posibles y cribar éstas respecto a función óptima como estructuras de anticuerpos o para otros propósitos. Tales métodos se describen en Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:6378-6382 (1990) y Devlin et al., Science 249:404406 (1990). Alternativamente, tales secuencias de anticuerpos pueden sintetizarse químicamente o generarse por otras vías bien conocidas por los expertos en la técnica.
De acuerdo con la invención descrita en esta memoria, pueden generarse variantes de anticuerpos mejoradas combinando en una sola estructura polipeptídica, una, dos o más secuencias CDR nuevas como las descritas en esta memoria (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 11-34), demostrándose que cada una de ellas da independientemente como resultado potencia o actividad biológica incrementadas. De esta manera, pueden combinarse varias secuencias nuevas de aminoácidos en un solo anticuerpo, en la misma o diferentes CDRs, para producir anticuerpos con niveles deseables de actividad biológica. Tales niveles deseables serán a menudo resultado de la producción de anticuerpos cuyos valores kon son al menos aproximadamente 2,5 x 105 M-1 s-1.
A modo de ejemplo no limitante, pueden emplearse 3 secuencias CDR nuevas de este tipo y los anticuerpos resultantes cribarse respecto a potencia, o actividad biológica, utilizando o bien el protocolo de la rata del algodón o el protocolo de microneutralización descritos en esta memoria, donde dicho anticuerpo demuestra afinidad alta para una estructura antigénica particular, tal como el antígeno F de RSV. El resultado global sería por tanto un proceso iterativo de combinación de diversas sustituciones simples de aminoácidos y cribado de los anticuerpos resultantes para afinidad antigénica y potencia en una modalidad de paso a paso, asegurándose de este modo que se incrementa la potencia sin sacrificio de un valor deseablemente alto, o al menos un valor mínimo, para la afinidad.
Utilizando las nuevas secuencias y métodos descritos en esta memoria, un enfoque de este tipo podría evitar el tiempo y el gasto de la generación y cribado de todas las permutaciones y combinaciones posibles de estructuras de anticuerpo en un esfuerzo para encontrar el anticuerpo con la eficacia máxima. Inversamente, la aleatorización completa de una sola CDR de 10 residuos de aminoácidos generaría más de 10 trillones de variantes, un número virtualmente imposible de cribar.
Este método iterativo puede utilizarse para generar reemplazamientos dobles y triples de aminoácidos en un proceso gradual a fin de estrechar la búsqueda para anticuerpos que tengan afinidad mayor.
Inversamente, debe apreciarse que no todas las localizaciones dentro de las secuencias de los diferentes dominios de anticuerpo pueden ser iguales. Las sustituciones de cualquier clase en una localización particular pueden ser favorables o perjudiciales. Adicionalmente, las sustituciones de ciertas clases de aminoácidos en ciertas localizaciones pueden representar análogamente un punto a favor o un punto desfavorable en lo que respecta a afinidad. Por ejemplo, puede no ser necesario probar todos los aminoácidos hidrófobos posibles en una posición dada. Es posible que cualquier aminoácido hidrófobo se comporte igualmente bien. Inversamente, un aminoácido de carácter ácido o básico en una localización dada puede proporcionar grandes fluctuaciones en la afinidad medida. Por consiguiente es necesario también aprender las “reglas” de la realización de tales sustituciones, pero la determinación de dichas “reglas” no requiere el estudio de todas las combinaciones y sustituciones posibles. Pueden hacerse evidentes tendencias después de examinar un número de sustituciones menor que el máximo.
De acuerdo con la presente invención, tales reglas determinan los cambios de aminoácidos que deben hacerse en las regiones CDR de los anticuerpos, o las secuencias de aminoácidos que tienen que prepararse en polipéptidos de anticuerpos totalmente nuevos y sintéticos, a fin de conseguir afinidades altas. No obstante, se ha descubierto ahora que, si bien la afinidad alta es a menudo una propiedad de los anticuerpos útil en aplicaciones terapéuticas, tales anticuerpos no siempre tienen una potencia suficiente para aportar utilidad práctica en dichos usos.
Como ya se ha descrito, la afinidad se mide por la ratio de las constantes kon y koff. Por ejemplo, un kon de 105 M-1 s-1 y un koff de 105 M-1 s-1 se combinarían para dar una constante de afinidad de 1010 M-1 (véanse los valores en la Tabla 3). Sin embargo, los anticuerpos que exhiben dicha afinidad alta pueden carecer a pesar de ello de la potencia requerida para hacerlos agentes terapéuticos útiles. De acuerdo con la presente invención, la potencia de los anticuerpos depende del valor de la velocidad kon para la reacción de fijación del anticuerpo. Así, un anticuerpo, con indiferencia de la afinidad para el antígeno respectivo, exhibirá un aumento de potencia (tal como actividad de neutralización) en el caso de que dicho anticuerpo tenga un valor kon más alto, con indiferencia de Ka o koff.
De acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, la potencia incrementada de un anticuerpo existente, con indiferencia de su afinidad para el antígeno, se consigue por cambios selectivos en uno o más de los aminoácidos presentes en una o más de las regiones CDR de dicho anticuerpo, por lo cual dichos cambios de aminoácidos tienen el efecto de producir un aumento en el valor kon para dicho anticuerpo, preferiblemente con un aumento en la afinidad del anticuerpo. Una potencia mayor puede conseguirse con un valor kon más alto aun cuando la afinidad se mantenga igual o se reduzca ligeramente. Un anticuerpo de este tipo se produce muy ventajosamente por síntesis de las cadenas de polipéptido requeridas por vía de la síntesis en células modificadas convenientemente por ingeniería genética que tienen incorporadas en ellas las secuencias de nucleótidos apropiadas que codifican las cadenas de polipéptido requeridas que contienen los segmentos CDR alterados. Asimismo de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, un nuevo anticuerpo que tenga un nivel deseable de potencia, o actividad biológica, puede prepararse de novo por incorporación de aminoácidos seleccionados en localizaciones seleccionadas dentro de las regiones CDR de dichas cadenas polipeptídicas del anticuerpo utilizando células modificadas por ingeniería genética como se describe en esta memoria o totalmente por síntesis química de las cadenas polipeptídicas requeridas con formación subsiguiente de los enlaces disulfuro necesarios.
A este respecto, debe tenerse claramente en cuenta que los anticuerpos producidos de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria pueden ser anticuerpos que posean estructuras tetrámeras, dímeras o monómeras. Así, el término “anticuerpo” como se utiliza en esta memoria incluye moléculas de anticuerpo tetrámeras enteras, como se encuentran comúnmente en la naturaleza, así como porciones y fragmentos de los mismos, con inclusión de L2H2, LH, Fab, F(ab’)2, y otros fragmentos, siendo el único requisito de tales estructuras que las mismas retengan actividad biológica como se mide por los ensayos y protocolos descritos en esta memoria.
De acuerdo con lo que antecede, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales de afinidad alta. Tales anticuerpos, sin embargo son monoclonales únicamente en el sentido de que los mismos pueden derivarse de un clon de un solo tipo de célula. Sin embargo, esto no debe entenderse como limitante de los mismos a un origen particular. Tales anticuerpos pueden producirse fácilmente en células que comúnmente no producen anticuerpos, tales como células CHO o COS. Adicionalmente, tales anticuerpos pueden producirse en otros tipos de células, especialmente células de mamífero o incluso células de plantas, por modificación mediante ingeniería genética de dichas células para expresar y ensamblar las cadenas ligera y pesada del polipéptido que forman el producto anticuerpo. Adicionalmente, tales cadenas pueden sintetizarse químicamente pero, dado que las mismas deberían ser específicas para un determinante antigénico dado, constituirían todavía anticuerpos "monoclonales” en el sentido en que se utiliza dicho término. Así, como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que el término anticuerpo monoclonal denota más la especificidad y pureza de las moléculas de anticuerpo producidas por los métodos descritos en esta memoria que el mero mecanismo utilizado para producción de dichos anticuerpos.
Asimismo, como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que el término potencia describe la dependencia del efecto del anticuerpo, cuando se utiliza para su propósito propuesto, de la concentración de dicho anticuerpo. Así, potencia significa actividad biológica con respecto a un antígeno dado. A modo de ejemplo no limitante, la potencia,
o actividad biológica, o efecto biológico, se mide para un anticuerpo anti-RSV, por el procedimiento de la rata del algodón o el procedimiento de microneutralización, como se describe en la sección de Métodos.
Inversamente, la afinidad de un anticuerpo para el antígeno es simplemente una medida matemática de la ratio de kon a koff.
Adicionalmente, las afinidades (Ka) de los anticuerpos producidos de acuerdo con el método descrito en esta memoria estarán comprendidas típicamente en el entorno de 1010 M-1. Este entorno puede, por ejemplo, ser del orden de 10 veces, mayor o menor, de 1010 M-1 o ser más de 10 veces mayor que 1010 M-1, o puede ser incluso numéricamente igual a 1010 M-1. La afinidad del anticuerpo para el antígeno es proporcional al valor de esta constante (es decir, cuanto mayor es la constante, tanto mayor es la afinidad debida a la mayor concentración del complejo – véase la ecuación para la constante de afinidad). Dicha constante se mide por metodología cinética estándar para reacciones de anticuerpos (como se describe en el Ejemplo 1).
En una realización, los anticuerpos producidos de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria (distintos del caso en que el término “anticuerpo” significa una porción, fragmento o segmento activo(a), todos los cuales, para los propósitos de la presente exposición, se considera que están incluidos dentro del significado del término anticuerpo) comprenderán comúnmente una región constante de mamífero, preferiblemente humana, y una región variable comprendiendo dicha región variable regiones de entramado de cadena pesada y ligera y CDRs de cadena pesada y ligera, en donde las regiones de entramado de cadena pesada y ligera tienen secuencias características de un anticuerpo de mamífero, preferiblemente un anticuerpo humano, y en donde las secuencias CDR son similares a las de un anticuerpo de cualquier especie distinta de un humano, preferiblemente un ratón. En el caso en que las secuencias de aminoácidos de entramado son características de las de un animal no humano, el último es preferiblemente un ratón.
En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo humano en el que el anticuerpo tiene un valor kon como se describe en esta memoria para proporcionar potencia mejorada.
Adicionalmente, los anticuerpos producidos de acuerdo con la presente invención fijarán comúnmente el mismo epítope que antes de aplicar los métodos descritos en esta memoria para aumentar el valor kon. Así, después de aplicar los métodos descritos en esta memoria, el anticuerpo tendrá secuencias CDR similares, pero no idénticas, a las secuencias CDR antes de la aplicación de los métodos expuestos en esta memoria, en el sentido de que al menos una de las CDRs de dicho anticuerpo contendrá una secuencia de aminoácidos de alta potencia, tal como una seleccionada de SEQ ID NO: 11-34, 55-59, DIWWDGKHSYNPSLKS, DTFRLAS y DTFYLSS si el anticuerpo va a utilizarse para neutralizar un virus tal como RSV.
En línea con lo anterior, y con objeto de describir mejor las secuencias expuestas de acuerdo con la invención con respecto a un anticuerpo humanizado contra RSV, una secuencia básica o secuencia de inicio de regiones variables de cadena ligera y pesada de un anticuerpo, o fragmento del mismo, cuya potencia debe aumentarse, se muestran en Figura 1A (región variable de cadena ligera - SEQ ID NO: 1) y Figura 1B (región variable de cadena pesada -SEQ ID NO: 2) o un fragmento Fab de un anticuerpo de este tipo (por ejemplo, las secuencias de Figura 2A (región variable de cadena ligera -SEQ ID NO: 3) y Figura 2B (región variable de cadena pesada - SEQ ID NO: 4). Asimismo de acuerdo con la invención, aminoácidos específicos diferentes de los de estas secuencias de inicio se generaron por métodos recombinantes partiendo de secuencias de nucleótidos preparadas diseñadas para generar dichas secuencias de aminoácidos cuando se expresan en células recombinantes. Los productos de dichas células son los anticuerpos monoclonales de la presente invención. Alternativamente, tales anticuerpos pueden producirse sin el uso de una célula modificada por ingeniería genética o recombinante por medios de síntesis bien conocidos en la técnica.
En una realización de la presente invención, la potencia se incrementa utilizando un anticuerpo neutralizante contra el virus respiratorio sincitial (RV) que tiene una constante de afinidad de al menos 109 M-1, y preferiblemente al menos 1010 M-1 (para el antígeno F del mismo) por amento del valor kon hasta al menos 2,5 x 105 M-1 s-1. Los aminoácidos presentes en las CDRs de un fragmento Fab de este tipo se muestran en la Tabla 3 (por ejemplo, el clon 5).
En general, el método utilizado para determinar la afinidad y las constantes cinéticas de los anticuerpos antes y después de la aplicación de los métodos de la invención para aumentar el valor kon, consistió en generar secuencias de nucleótidos para los genes que expresan las cadenas de anticuerpos deseadas (de acuerdo con la presente invención) e insertar éstas en vectores que se utilizaron luego para transformar células COS-1 por protocolos estándar. Las células se dejaron crecer en pocillos y el sobrenadante se muestreó y se midió respecto a fijación de antígeno utilizando técnicas estándar ELISA. Estos polinucleótidos se diseñaron de tal manera que proporcionaran uno o más reemplazamientos de aminoácidos en las CDRs que pudieran cribarse luego respecto a valores kon incrementados, combinándose selectivamente los reemplazamientos favorables (aquéllos que producían valores kon incrementados) para afinidad incrementada. Éstos se criban subsiguientemente respecto a afinidad de fijación para el antígeno respectivo, tal como el antígeno F de RSV frente a la estructura básica o de referencia, determinándose con ello que no se producía en ningún caso un cambio importante de afinidad como resultado del aumento en los valores kon.
En realizaciones específicas, la presente invención se refiere a un anticuerpo aislado que comprende una constante de afinidad de al menos 109 M-1, preferiblemente al menos 1010 M-1 y muy preferiblemente al menos 1011 M-1, y en
- -
donde kon es al menos aproximadamente 2,5 x 105 M-1 s-1, con preferencia al menos aproximadamente 5 x 105 M-1 s 1, y muy preferiblemente al menos 7,5 x 105 M-1 s-1 (con inclusión de todas las combinaciones de los mismos).
También de acuerdo con la presente invención, un anticuerpo aislado de este tipo puede ser cualquier clase de anticuerpo ya conocido o recién sintetizado y nuevo. Así, los anticuerpos producidos de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria incluirán un anticuerpo seleccionado del grupo constituido por anticuerpos de mamífero existentes naturalmente, anticuerpos humanos existentes naturalmente, anticuerpos de ratón existentes naturalmente, anticuerpos monocatenarios, anticuerpos quiméricos (que tienen regiones constantes de un anticuerpo de una especie y regiones variables de un anticuerpo de una especie diferente), anticuerpos injertados en CDR (que tienen las regiones CDR de un anticuerpo de una especie y las regiones constantes y, posiblemente, regiones de entramado de un anticuerpo de una especie diferente), anticuerpos humanizados (en los cuales aminoácidos seleccionados, de las regiones variables de entramado y/o las regiones CDR, han sido alterados de manera que son similares a un anticuerpo humano a pesar de que tales secuencias se derivan en gran parte de una especie diferente, tal como un ratón), preferiblemente anticuerpos humanizados de ratón, anticuerpos alterados de mamífero, preferiblemente ratón, muy preferiblemente humanos) en los cuales los aminoácidos seleccionados de un anticuerpo existente se han alterado en algún punto de la cadena polipeptídica, comúnmente por las técnicas de ingeniería genética, a fin de proporcionar estructuras de anticuerpo similares a las estructuras de anticuerpo en las que se basan los mismos), y anticuerpos nuevos totalmente sintéticos, no existiendo estos últimos con anterioridad en la naturaleza.
Se describen también métodos de aumento de la potencia de uno de los tipos de anticuerpos mencionados anteriormente (descritos con anterioridad) que comprenden cambiar selectivamente los aminoácidos dentro de las regiones variables del anticuerpo a fin de aumentar el valor kon medido de dicho anticuerpo con respecto a un antígeno particular. Por supuesto, el valor kon puede ser diferente para el mismo anticuerpo después de los mismos cambios de aminoácidos en los que se mide la reacción utilizando un antígeno o determinante antigénico diferente. Sin embargo, en tales casos, las afinidades cambiarán también probablemente a medida que cambia la identidad del determinante antigénico.
Asimismo de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria, los cambios de aminoácidos introducidos en las secuencias de los polipéptidos de tales anticuerpos se limitan preferiblemente a las porciones CDR de las regiones variables de los anticuerpos aunque éstas podrían implicar también cambios en las regiones de entramado.
Aunque las secuencias CDR más ventajosas se identifican comúnmente por cribado de clones modificados de anticuerpos cuya potencia debe aumentarse por los métodos descritos en esta memoria, una vez que tales clones de alta potencia han sido identificados, el anticuerpo resultante se produce muy ventajosamente después por síntesis de las cadenas polipeptídicas pesada y ligera apropiadas en células adecuadas animales o vegetales después de introducción en dichas células de vectores adecuados que contienen las secuencias de DNA apropiadas correspondientes a las secuencias deseadas de aminoácidos, aprovechando la ventaja del código genético para diseñar las secuencias nucleotídicas requeridas. Como consecuencia de este enfoque, pueden producirse inicialmente anticuerpos totalmente nuevos con alta potencia utilizando las identidades de secuencia de aminoácidos sugeridas por los métodos descritos en esta memoria sin necesidad de seleccionar secuencias de anticuerpos ya existentes para modificación. Así pues, los métodos descritos en esta memoria facilitan la producción de anticuerpos de alta potencia con una estructura completamente nueva en el sentido de que sus secuencias CDR son CDRs de alta potencia como se determina por los métodos descritos en esta memoria a fin de aumentar deliberadamente los valores kon de tales anticuerpos y sin destruir la especificidad y afinidad de dichos anticuerpos para la diana antigénica propuesta.
En una realización de los métodos descritos en esta memoria, se modifica un anticuerpo ya existente para aumentar la potencia del mismo por aumento del valor kon. En una realización preferida, el anticuerpo es uno con afinidades altas, v.g., al menos aproximadamente 109 M-1 o 1010 M-1. El anticuerpo se sintetiza, utilizando clones o células animales o vegetales modificadas genéticamente, a fin de introducir cambios de aminoácidos en las cadenas polipeptídicas pesada y/o ligera de dicho anticuerpo, preferiblemente de tal manera que dichos cambios de anticuerpo se introducen en las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de dichas cadenas polipeptídicas, para aumentar el valor kon para la fijación de dicho anticuerpo a un antígeno particular con aumento concomitante en la potencia del anticuerpo. Así, los métodos descritos en esta memoria se utilizan ventajosamente para producir una molécula de anticuerpo en la cual el valor kon de dicho anticuerpo después de los cambios de aminoácidos en su secuencia, preferiblemente las regiones variables de dicha secuencia, muy preferiblemente las porciones CDR, es mayor que el valor kon exhibido por dicho anticuerpo antes de dichos cambios de aminoácidos cuando los valores kon se miden con respecto al mismo antígeno.
En general, en el caso en que los métodos descritos en esta memoria se aplican a anticuerpos conocidos, el kon de dichos anticuerpos se incrementará al menos en 2 veces, preferiblemente al menos 5 veces, y muy preferiblemente al menos 10 veces. Más específicamente, el valor kon de dicho anticuerpo se incrementa hasta al menos
M-1 M-1-1
aproximadamente 2,5 x 105 s-1, incrementándose preferiblemente hasta al menos 5 x 105 s, y muy preferiblemente al menos 7,5 x 105 M-1 s-1.
Dado que los métodos descritos en esta memoria son igualmente eficaces para el diseño de nuevos anticuerpos recombinantes de alta potencia desconocidos con anterioridad, se da a conocer también un método de producción de un anticuerpo que tiene un valor kon de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, que comprende preparar un anticuerpo cuyas secuencias polipeptídicas contienen aminoácidos seleccionados en localizaciones seleccionadas, especialmente dentro de las secuencias CDR, seguido por cribado de dichos anticuerpos buscando aquéllos que tengan un valor kon de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1, o un valor kon de al menos 5 x 105 M-1 s-1 o incluso 7,5 x 105 M-1 s-1. Tales anticuerpos serán resultado de la presencia de una o más de las CDRs de alta potencia que se describen en esta memoria. Tales anticuerpos se criban fácilmente respecto a valores kon altos.
Los métodos descritos en esta memoria pueden utilizarse para la producción de anticuerpos con alta potencia, o anticuerpos de potencia incrementada, que tienen afinidad para un antígeno característico del virus respiratorio sincitial (RSV).
En otra realización, la presente invención se refiere a composiciones y medicamentos para uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad que comprenden dicha cantidad terapéuticamente activa de la composición o medicamento de un anticuerpo preparado por los métodos descritos en esta memoria. Así, un anticuerpo de este tipo puede ser un anticuerpo completamente nuevo o un anticuerpo conocido y clínicamente útil cuya potencia se ha incrementado por aplicación de los métodos descritos en esta memoria. Las enfermedades que se previenen o se tratan por los anticuerpos preparados por los métodos descritos en esta memoria pueden ser comúnmente enfermedades causadas por microorganismos, tales como bacterias o virus, preferiblemente virus y muy preferiblemente RSV.
Los anticuerpos dados a conocer de este modo tendrán también comúnmente regiones de entramado derivadas de un anticuerpo humano pero, en el caso de no ser de origen humano, son preferiblemente de ratón.
En la generación de los clones, el anticuerpo básico o de referencia (regiones variables de cadena pesada y ligera (CDRs más entramado) representadas en las Figuras 1 y 2) se utilizó como el “molde” para generar las nuevas 5 secuencias CDR de los anticuerpos de la presente invención, impartiendo las últimas valores kon mayores. Se utilizaron métodos estándar para caracterizar y sintetizar las 6 bibliotecas de CDR de mutaciones simples (véase Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6037-6042 (1998). La CDR diana se delecionó primeramente para cada una de las bibliotecas antes de la reasociación de los nucleótidos. Para la síntesis de las bibliotecas, las CDRs de un anticuerpo de referencia (véase la Figura 2) se definieron como en la Tabla 1. Se empleó mutagénesis basada en codones para
10 la síntesis de oligonucleótidos a fin de producir las secuencias CDR de la invención (como se ha descrito arriba).
Las bibliotecas se cribaron inicialmente por levantamiento de captura para identificar las variantes de afinidad máxima. Se caracterizaron luego adicionalmente estos clones utilizando ELISA de captura y por titulación sobre un antígeno inmovilizado. Después de dicho cribado, los anticuerpos se criban luego por sus respectivos valores kon, cuyos efectos positivos se miden después por determinación de la potencia. Las Figuras 4 y 5 muestran detalles
15 adicionales acerca de los procedimientos de la preparación y cribado utilizados en esta memoria.
Tabla 1. Secuencias CDR básicas como se proporcionan en la Figura 2.
CDR Residuos de Fig. 22 Secuencia SEQ ID NO.
L1 24-33 SASSSVGYMH 5
L2 49-55 DTSKLAS6
L3 88-96 FQGSGYPFT7
H1 31-37 TSGMSVG 8
H2 52-67 DIWWDDKKDYNPSLKS 9
H3 100-109 SMITNWYFDV 10
De acuerdo con la presente invención, el DNA de las variantes kon más altas se secuenció para determinar la naturaleza de los reemplazamientos beneficiosos o de alta potencia. Después del cribado, los anticuerpos se preparan luego con los reemplazamientos de aminoácidos de kon alto, sea individualmente o en diversas
20 combinaciones, a fin de maximizar los efectos de tales sustituciones y producir con ello anticuerpos de afinidad alta que exhiben también alta potencia.
Como regla general, se encontró que las más beneficiosas de las CDRs de kon alto eran el resultado de reemplazamientos de aminoácidos en hasta 6 CDRs. Así pues, los anticuerpos neutralizantes de alta potencia (es decir, kon alto) dados a conocer en esta memoria contienen secuencias de aminoácidos que difieren de la del
25 anticuerpo base o de referencia (por ejemplo, como se muestra en las Figuras 1 y 2) únicamente en las regiones determinantes de la complementariedad L1 (o CDRL1), L2 (o CDRL2), L3 (o CDRL3), H1 (o CDRH1) y H3 (o CDRH3).
Tabla 2. Secuencias de CDRs que tienden a inducir alta potencia en los anticuerpos
- Clon
- CDR CDR Alta Potencia Secuencia SEQ ID NO.
- 1
- L1 - SASSSVGYMH 5
- L2
- X 14
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- Clon
- CDR CDR Alta Potencia Secuencia SEQ ID NO.
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 31
- 2
- L1 - SASSSVGYMH 5
- L2
- X 15
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 32
- 3
- L1 - SASSSVGYMH 5
- L2
- X 16
- L3
- . FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 32
- 4
- L1 - SASSSVGYMH 5
- L2
- X 17
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 32
- Clon
- CDR CDR Alta Potencia Secuencia SEQ ID NO.
- 5
- L1 - SASSSVGYMH
- 5
- L2
- X 15
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 31
- 6
- L1 - SASSSVGYMH 5
- L2
- X 15
- L3
- X 23
- H 1
- X 24
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 33
- 7
- L1 X 11
- L2
- X 15
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 31
- 8
- L1 - SASSSVGYMH 5
- Clon
- CDR CDR Alta Potencia Secuencia SEQ ID NO.
- L2
- X 60
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 31
- 9
- L1 X 12
- L2
- X 61
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 25
- H2
- X 26
- H3
- X 34
- 10
- L1 X 12
- L2
- X 18
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 25
- H2
- X 27
- H3
- X 34
- 11
- L1 X 13
- L2
- X 19
- Clon
- CDR CDR Alta Potencia Secuencia SEQ ID NO.
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 25
- H2
- X 27
- H3
- X 34
- 12
- L1 X
- 12
- L2
- X 20
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- X 27
- H3
- X 34
- 13
- L1 X 11
- L2
- X 20
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- X 28
- H3
- X 34
- 14
- L1 X 13
- L2
- X 21
- Clon
- CDR CDR Alta Potencia Secuencia SEQ ID NO.
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- X 29
- H3
- X 32
- 15
- L1 X 12
- L2
- X 22
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- X 30
- H3
- X 34
- 16
- L1 X 59
- L2
- - DTSKLAS 6
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- - TSGMSVG 8
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- - SMITNWYFDV 10
- 17
- L1 - SASSSVGYMH 5
- L2
- X 15
- L3
- X 23
- Clon
- CDR CDR Alta Potencia Secuencia SEQ ID NO.
- H1
- X 24
- H2
- - DIWWDDKKDYNPSLKS 9
- H3
- X 33
- 18
- L1 X 56
- L2
- X 22
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- X 62
- H3
- X 34
- 19
- L1 X 11
- L2
- X 57
- L3
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- X 26
- H3
- X 34
- 20
- L1 X 13
- L2
- X 58
- Clon
- CDR CDR Alta Potencia Secuencia SEQ ID NO.
- L2
- - FQGSGYPFT 7
- H1
- X 24
- H2
- X 55
- H3
- X 32
Así, para las secuencias de aminoácidos de la Figura 3, se reemplazaron aminoácidos seleccionados de la secuencia de la Figura 2 como medio para aumentar la potencia del anticuerpo con las secuencias de las cadenas pesada y ligera que se muestran en la Figura 2.
Los anticuerpos seleccionados de kon alto (y fragmentos activos de los mismos) resultantes de los métodos dados a
5 conocer en esta memoria se muestran en la Tabla 2 (todos los cuales tienen las secuencias de entramado de la Figura 2) donde el clon de referencia es el clon que tiene las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera que se muestran en la Figura 2 (SEQ ID NO: 3 y 4 para las secuencias ligera y pesada, respectivamente).
La Tabla 2 indica las secuencias de aminoácidos (todas las secuencias en el código estándar de aminoácidos de una sola letra) de las CDRs de alto kon empleadas en los anticuerpos de alta potencia preparados de acuerdo con
10 los métodos dados a conocer en esta memoria. En la Tabla 2, las localizaciones de las sustituciones de aminoácidos fundamentales hechas en las CDRs correspondientes de la Tabla 1 (es decir, las localizaciones en las cuales las CDRs difieren en aminoácidos) se indican por un recuadro alrededor del o de los aminoácidos.
De acuerdo con la invención, por combinación de tales sustituciones de aminoácidos de tal manera que ocurriera más de una en la misma molécula de anticuerpo, fue posible amentar notablemente la potencia de los anticuerpos
15 dados a conocer en esta memoria.
En general, existe una correlación entre kon y potencia del anticuerpo, teniendo la totalidad de las variantes de kon más alto más de una CDR beneficiosa o de kon alto, teniendo incluso la totalidad de las 6 CDRs sustituidas.
En una realización, un anticuerpo preparado de tal manera que tenga kon incrementado es un anticuerpo neutralizante de RSV, con una afinidad de al menos 109 M-1 y preferiblemente al menos 1010 M-1, que es también un
20 anticuerpo humanizado que incluye una región constante humana y una región de entramado para las cadenas pesada y ligera en donde al menos una porción del entramado se deriva de un anticuerpo humano (o de una secuencia de consenso de un entramado de anticuerpo humano).
En otra realización, la totalidad del entramado se deriva de un anticuerpo humano (o una secuencia de consenso humana).
25 En otra realización, un anticuerpo producido de acuerdo con la presente invención, con una afinidad de al menos 109 M-1 y preferiblemente al menos 1010 M-1, es un anticuerpo injertado que tiene una región constante humana, una o más CDRs que se derivan de un anticuerpo no humano en el cual al menos uno de los aminoácidos en al menos una de dichas CDRs está cambiado y en el cual la totalidad o una parte del entramado se deriva de un anticuerpo humano (o una secuencia de consenso de un entramado de anticuerpo humano).
30 Con tal que las secuencias CDR deseadas, y la secuencia constante y de entramado sean conocidas, pueden ensamblarse genes con las secuencias deseadas y, utilizando una diversidad de vectores, insertarse en células apropiadas para expresión de las moléculas de anticuerpo tetrámeras funcionales. El acoplamiento de esto con la metodología ya descrita, permite el ensamblado de bibliotecas de mutaciones simples en las cuales los anticuerpos poseen las mismas secuencias que los anticuerpos injertados correspondientes y, por consiguiente, las mismas
35 estructura y afinidades de fijación.
Las combinaciones de las secuencias CDR descritas en la Tabla 2 pueden estar presentes en moléculas de anticuerpos tetrámeros enteros o en fragmentos activos, tales como un fragmento Fab. Los datos de potencia para los clones 1 a 5 que se muestran en la Tabla 3 corresponden a fragmentos Fab, mientras que los datos para los clones 16 y 17 de la Tabla 3 corresponden a moléculas de anticuerpo enteras (el clon 16 es MEDI-493 con la
40 secuencia descrita en Johnson et al (1997)).
Las moléculas de anticuerpos enteros de acuerdo con la presente invención incluyen moléculas de anticuerpo que tienen secuencias de cadena pesada (región variable más constante) seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 y 53 y con secuencias de cadena ligera (región variable más constante) seleccionadas del grupo constituido por SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, y 54.
Los anticuerpos de kon relativamente alto de la invención pueden estar presentes en una forma relativamente pura o aislada así como en un sobrenadante extraído de células cultivadas en pocillos o en placas. Los anticuerpos de la invención pueden estar presentes también por tanto en la forma de una composición que comprende el anticuerpo de la invención y en la cual dicho anticuerpo está suspendido en un diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable. Los anticuerpos de la invención pueden estar presentes en una composición de este tipo a una concentración, o en una cantidad, suficiente para ser terapéutica o farmacológicamente valiosa en el tratamiento o la prevención de enfermedades (por ejemplo, prevención de RSV, con inclusión de la mayor incidencia de asma y respiración jadeante que ocurren a menudo después de tales infecciones). Dichos anticuerpos pueden estar presentes también en una composición en forma más diluida.
Por consiguiente, la invención está dirigida también a proporcionar composiciones y medicamentos para el uso en la prevención y/o el tratamiento de enfermedades, especialmente enfermedades víricas, muy especialmente infecciones del virus respiratorio sincitial, comprendiendo dicha composición o medicamento una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de anticuerpos descrita en esta memoria.
En una realización particular, un anticuerpo neutralizante de alta potencia de la presente invención tiene las secuencias de dominios de cadena pesada y dominios de cadena ligera representadas en la Figura 3B (SEQ ID NO: 36) y la Figura 3A (SEQ ID NO: 35), respectivamente. Las CDRs de las cadenas pesada y ligera son las mismas que las dadas en la Tabla 2 para el clon 15.
Debe tenerse en cuenta que si bien los anticuerpos de kon incrementado de la presente invención podrían ensamblarse a partir de regiones CDR y regiones no-CDR derivadas de anticuerpos reales neutralizantes por remodelación conjunta de segmentos de aminoácidos (y los anticuerpos así ensamblados estarían dentro de la invención descrita en esta memoria), los anticuerpos de la presente invención se preparan más convenientemente modificando por ingeniería genética secuencias génicas apropiadas para producir vectores que pueden transfectarse luego a líneas de células adecuadas para expresión eventual de las moléculas de anticuerpo ensambladas por las células modificadas. De hecho, tales procedimientos recombinantes se emplearon para preparar los anticuerpos descritos en esta memoria. Adicionalmente, dado que las secuencias de las cadenas de los anticuerpos de afinidad alta son conocidas por la exposición de esta memoria, tales anticuerpos podrían ensamblarse también por síntesis directa de las cadenas apropiadas dejando luego que éstas se autoensamblaran en estructuras de anticuerpos tetrámeros.
Materiales y Métodos Generales
Anticuerpos Monoclonales. MEDI-493 es un MAb humanizado de IgG1 (COR)/kappa (K102) (las secuencias de región variable de cadena pesada y ligera se representan en la Figura 1) que contiene los determinantes de fijación de antígeno de MAb 1129 murino [Johnson et al, J. Infect. Dis., 176, 1215-1224 (1997); Beeler y van Wyck Coelingh,
J. Virol., 63, 2941-2950 (1989)].
Ensayo de Inhibición de la Fusión de RSV. La aptitud de los anticuerpos para bloquear la fusión inducida por RSV después de fijación viral a las células se determinó en un ensayo de inhibición de la fusión. Este ensayo era idéntico al ensayo de microneutralización, excepto que las células se infectaron con RSV (largo) durante 4 horas antes de la adición del anticuerpo [Taylor et al., J. Gen. Virol., 73, 2217-2223 (1992)].
Análisis BIAcore. El análisis de epítopes de los MAbs se realizó utilizando un biosensor BIAcore (BIAcore, Piscataway, NJ) [Karlsson et al, J. Immunol. Methods, 145, 229-240 (1991); Johne, Mol. Biotechnol., 9, 65-71 (1998)] con un sistema Microfluidics de resonancia de plasmones. El antígeno utilizado para este ensayo era una proteína RSV truncada (A2) F (aminoácidos 1-526) expresada en baculovirus. La proteína F de RSV purificada se acopló covalentemente a un chip sensor CM5 activado con N-hidroxisuccinimida/1-etil-3-[3-dimetilaminopropil]-carbodiimida de acuerdo con el protocolo del fabricante, y los grupos éster activos sin reaccionar se hicieron reaccionar con etanolamina 1M. Una inyección primaria de 1 μm o 10 μM MEDI-493 fue seguida por un paso de lavado con HBSS, y luego por una inyección secundaria de MEDI-493 o RHSZ19. Los sensogramas se analizaron utilizando software de evaluación BIA.
Calorimetría de Titulación Isotérmica. La afinidad de la solución de cada MAb para la proteína F del RSV se determinó por calorimetría de titulación isotérmica [Wiseman et al., Anal. Biochem., 179, 131-137 (1989)]. Una solución de 1,4 ml de proteína F de RSV 4,5 μM se tituló con inyecciones de 5,5 μl de MEDI-493 26 μM o RSHZ19. Después de cada inyección de MAb, se midió la cantidad de calor desprendida, que es proporcional a la cantidad de fijación. El antígeno utilizado era una proteína F de RSV truncada (A2) (aminoácidos 25-524) expresada en células de Drosophila. Las titulaciones se realizaron a 44º y 55ºC hasta alcanzar la ratio óptima de señal a ruido. La estabilidad térmica de los MAbs y la proteína F a estas temperaturas se demostró por experimentos de despliegue por dicroísmo circular. Las afinidades se corrigieron a 37ºC para comparación con datos in vivo utilizando la ecuación integrada de van’t Hoff [Doyle y Hensley, Methods Enzymol., 295, 88-99 (1998)]. La corrección de van’t Hoff está basada exclusivamente en el cambio de entalpía de fijación de la proteína F que se medía directamente por calorimetría. Dado que se encontró que los cambios de entalpía de fijación para MEDI-493 y RSHZ19 eran muy similares, las correcciones de temperatura para sus Kds eran casi idénticas.
Profilaxis de la Rata del Algodón. La eficacia in vivo se determina utilizando el modelo de la rata del algodón [Prince et al, J. Virol., 55, 517-520 (1985)]. Las ratas del algodón (Sigmodon hispidus, peso medio 100 gramos) se anestesian con metoxifluorano, se sangran, y reciben 0,1 ml de MAb purificado por inyección intramuscular (i.m.) a dosis de 5, 2,5, 1,25, ó 0,625 mg/kg de peso corporal, o control de seroalbúmina bovina (BSA) a 5 mg/kg de peso corporal. 24 horas más tarde, los animales se pesan nuevamente, se sangran para determinación de la concentración de MAB en el suero, y se enfrentan por instigación intranasal (i.n.) de 105 PFU a cepas A (larga) o B (18537) de RSV. 4 días más tarde se sacrifican los animales y se extirpan sus pulmones. Los pulmones se homogeneízan en 10 partes (peso/volumen) de solución salina equilibrada de Hanks, y la suspensión resultante se utilizó para determinar los títulos virales pulmonares por ensayo de calvas. Los títulos de anticuerpos en suero en el momento del enfrentamiento se determinan por un ELISA de IgG anti-humana.
Ejemplo 1
Análisis Cinético de Mabs de RSV Humanizados por BIAcore TM
La cinética de interacción entre los Mabs anti-RSV de afinidad alta y la proteína F de RSV se estudió por resonancia de plasmones de superficie utilizando un biosensor BIAcoreTM de Pharmacia. Un baculovirus recombinante que expresaba una proteína F C-terminal truncada proporcionó una fuente abundante de antígeno para estudios cinéticos. El sobrenadante, que contenía la proteína F secretada, se enriqueció aproximadamente 20 veces por cromatografía sucesiva en columnas de concanavalina A y Q-Sepharose. Las fracciones agrupadas se dializaron contra citrato de sodio 10 mM (pH 5,5), y se concentraron a aproximadamente 0,1 mg/ml. En un experimento típico, una parte alícuota de la proteína F (100 ml) se sometió a acoplamiento amínico al chip del sensor BIAcore. La cantidad inmovilizada daba aproximadamente 2000 unidades de respuesta (Rmax) de señal cuando se saturaba con H1129 o H1308F (preparados de acuerdo con la patente U.S. 5.824.307). Esto indicaba que existía un número igual de sitios antigénicos “A” y “C” en la preparación de proteína F después del procedimiento de acoplamiento. Dos Mabs irrelevantes no afines (RVFV 4D4 y CMV H758) no exhibían interacción alguna con la proteína F inmovilizada. Un estudio cinético típico implicó la inyección de 35 ml de Mab a concentraciones variables (25-300 nM) en tampón PBS que contenía 0,05% Tween-20 (PBS/Tween). El caudal se mantuvo a 5 ml/min, dando una fase de fijación de 7 min. Después de la inyección de Mab, se cambió el flujo con tampón PBS/Tween durante 30 min para determinar la velocidad de disociación. El chip sensor se regeneró entre los ciclos con un pulso de 2 min de HCl 10 mM. El paso de regeneración causó una pérdida mínima de capacidad de fijación de la proteína F inmovilizada (4% de pérdida por ciclo). Esta pequeña disminución no cambiaba los valores calculados de las constantes de velocidad para fijación y disociación (denominadas también kon y koff, respectivamente).
De modo más específico, para la medida de Kassoc (o kon), la proteína F se inmovilizó directamente por el método EDC/NHS (EDC = N-etil-N’-[3-dietilaminopropil)-carbodiimida]). Resumidamente, se prepararon 4 μg/ml de proteína F en NaOAc 10 mM, de pH 4,0 y una inyección de aproximadamente 30 μl da aproximadamente 500 RU (unidades de respuesta) de proteína F inmovilizada en las condiciones referidas anteriormente. La célula de flujo en blanco (VnR inmovilizada-superficie CM de dextrano) se sustrajo para análisis cinético. La columna pudo regenerarse utilizando HCl 100 mM (requiriéndose 72 segundos de tiempo de contacto para regeneración plena). Este tratamiento eliminaba completamente el Fab fijado sin dañar el antígeno inmovilizado, y podía utilizarse durante más de 40 regeneraciones. Para las medidas de kon, las concentraciones de Fab eran 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, y 400 nM. La fase de disociación se analizó desde 230 segundos (30 segundos después del comienzo de la fase de disociación) hasta 900 segundos. Las cinéticas se realizaron por el ajuste 1:1 de Langmuir (ajuste global). Las medidas se realizaron en tampón HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, 0,005% (v/v) de Agente Tensioactivo P20.
Para las medidas de clones combinatorios, como se exponen en esta memoria, se midieron por separado los valores kon y koff. El valor kon se midió en condiciones que eran iguales que las utilizadas para los clones de mutación simple y se realizó análogamente.
Para la medida de koff (o kdissoc) se emplearon las condiciones siguientes. Resumidamente, se inmovilizaron 4100 RU de proteína F (como anteriormente) con CM-dextrano utilizado como el blanco. En este caso, se fijaban 3000 RU de Fab (con Fab disociado suficientemente alto para contrarrestar la fluctuación de la máquina). Como tampón se utilizó HBS más 5 nM de proteína F (aproximadamente 350-2000 veces mayor que la kdissoc o kd - la constante de disociación en equilibrio). La fase de disociación fue de 6 a 15 horas a un caudal de 5 μl/min. En las condiciones utilizadas en esta memoria, la re-fijación del Fab disociado era mínima. Para más detalles, véase el manual con el biosensor.
La fijación de los anticuerpos anti-RSV de afinidad alta a la proteína F, u otros sitios epitópicos en RSV, descritos en esta memoria se calculó a partir de la ratio de la constante de velocidad de primer orden para disociación de la constante de velocidad de segundo orden para fijación o asociación (kd = kdiss/kassoc). El valor para kassoc se calculó basándose en la ecuación de velocidad siguiente:
donde R y Rmax son las unidades de respuesta en el tiempo t y en el infinito, respectivamente. Una gráfica de dr/dt en
5 función de R da una pendiente de (kassoc [Mab] + kdiss). Dado que estas pendientes están relacionadas linealmente con el valor [Mab], el valor Kassoc puede derivarse de una repetición de la gráfica de las pendientes frente a [Mab]. La pendiente de la nueva línea es igual a Kassoc. Aunque el valor de kdiss puede extrapolarse a partir de la intersección con el eje Y, un valor más exacto se determinó por medida directa de kdiss. Después de la fase de inyección del Mab, el tampón PBS/Tween se deja fluir a través del chip sensor. A partir de este punto, [Mab] = 0. La ecuación expuesta
10 anteriormente para dR/dt se reduce por tanto a:
La integración de esta ecuación da luego:
donde R0/Rt son las unidades de respuesta para el tiempo 0 (comienzo de la fase de disociación) y t,
15 respectivamente. Por último, la representación gráfica de ln (R0/Rt) en función de t da una pendiente de kdiss. En la realización preferida de esta memoria, los valores numéricos de tales variantes de anticuerpo se muestran en la Tabla 3.
Para los clones de las Tablas 2 y 3, el clon de referencia es el fragmento Fab con las secuencias que se muestran en la Figura 2 y las CDRs que se muestran en la Tabla 1. Los clones 1-15 son fragmentos Fab que tienen las
20 secuencias de entramado de la Figura 2 y las combinaciones de CDR indicadas de los clones 1-15 de la Tabla 2 (donde la “X” indica una CDR de alta potencia (es decir, una CDR cuya presencia frente a la secuencia de referencia da como resultado potencia elevada y una potencia mayor que la Fab de referencia)). Donde no aparece ninguna “X” al lado de la CDR de la Tabla 2, la secuencia es justamente la secuencia correspondiente del Fab de referencia (a partir de la Tabla 1 y la Figura 2).
25 Tabla 3. Sumario de las Constantes Cinéticas para Anticuerpos de alta Potencia
Clon No. Kon x 105 (M-1s-1) Koff x 10-4 (s-1) EC50 (nM)
Ref. 1,85 6,5 3,52 1 3,65 3,26 2,26 2 5,31 4,22 5,05 3 6,05 4,22 4,70 4 7,57 4,62 3,55 5 4,16 3,06 2,61 6 1,85 3,20 2,88 7 3,70 2,51 1,59 8 3,75 2,73 2,67 9 6,63 2,82 0,29 10 5,27 2,99 1,06 11 5,71 7,17 20,9 12 7,9 4,53 3,24 13 7,43 2,30 0,81 14 7,35 2,50 2,23 15 7,81 2,80 0,56 16 2,04 7,35 6,12 17 1,09 2,49 2,7
Tabla 4. Títulos de Microneutralización de RSV en el Punto Final de IgGs y Fabs Mutantes de Velocidad on “Alta”
- Tipo
- Clon No. Media CI50 �g/ml Estándar CI50 Diferencia, veces Media CI50 (Control) �g/ml Estándar (Control CI50) Diferencia, veces (Control CI50) Número de Repeticiones del Ensayo
- IgG
- 16 0,4527 0,208 - 0,5351 0,238 - 8
- "
- 24 0,0625 0,0268 7 0,0645 0,0223 8 3
- "
- 18 0,0342 0,022 13 0,0354 0,0187 15 4
- "
- 23 0,0217 0,0331 21 0,0289 0,0110 19 5
- "
- 21 0,0231 0,0141 20 0,0223 0,0083 24 6
- "
- 20 0,0337 0,0309 13 0,0383 0,0283 14 5
- "
- 25 0,0357 0,0316 13 0,0354 0,0261 15 7
- "
- 22 0,0242 0,0163 19 0,0235 0,0076 23 7
- "
- 26 0,0376 0,0268 12 0,0375 0,0213 14 6
- "
- 19 0,0171 0,0018 27 0,0154 0,00417 35 2
- Fab
- 12 0,157 - 3 0,125 - 4 1
- "
- 27 0,0179 - 25 0,0171 - 31 1
- "
- 11 >1,00 - - >1,00 - - 1
- "
- 9 0,0407 0,0112 11 0,0326 0,009 16 2
- "
- 28 0,177 - 3 0,157 - 34 1
- "
- 13 0,0287 0,00417 16 0,0310 0,00982 17 2
- "
- 10 0,0464 0,00791 10 0,0351 0,0126 15 2
- "
- 15 0,0264 0,00141 17 0,0258 0,00071 21 2
- "
- 29 0,0414 - 11 0,0411 - 13 1
- "
- 14 0,120 0,0222 4 0,1022 0,0260 5 2
- "
- 30 0,194 0,462 2 0,176 0,0625 3 2
Los resultados de la Tabla 4 comparan fragmentos Fab y moléculas de anticuerpos tetrámeros enteros relacionadas por los valores CI50 (o la concentración en μg/ml que da 50% de inhibición frente a controles similares a los de la Tabla 3). El clon 16 de la Tabla es el anticuerpo de referencia con las CDRs descritas en la Tabla 2.
5 Los clones 16 y 17 de la Tabla 3 son anticuerpos monoclonales reales con las secuencias de entramado de la Figura 1 y regiones constantes como las descritas en Johnson et al (1997). Las secuencias de entramado de estos anticuerpos pueden diferir ligeramente de las de los fragmentos Fab.
Los clones 18 a 26 de la Tabla 4 son moléculas de anticuerpo tetrámeras similares a los clones 16 y 17 pero que tienen secuencias CDR de alta potencia. El clon 21 del anticuerpo tiene las mismas secuencias CDR que el clon 9 10 de Fab, el clon 22 del anticuerpo tiene las mismas secuencias CDR que el clon 10 de Fab, el clon 23 del anticuerpo
tiene las mismas secuencias CDR que el clon 11 de Fab, el clon 24 del anticuerpo tiene las mismas secuencias CDR que el clon 12 de Fab, el clon 25 del anticuerpo tiene las mismas secuencias CDR que el clon 13 de Fab, y el clon 26 del anticuerpo tiene las mismas secuencias CDR que el clon 15 de Fab. Los clones 18, 19 y 20 del anticuerpo de la Tabla 3 son anticuerpos tetrámeros de longitud total con las combinaciones CDR dadas en la Tabla 2. Las secuencias de entramado de estos anticuerpos pueden diferir ligeramente de las de los fragmentos Fab.
Los aminoácidos subrayados de las secuencias CDR de la Tabla 2 representan los residuos de aminoácidos localizados en las localizaciones clave dentro de las CDRs de alta potencia de los anticuerpos de alta potencia producidos por los métodos de la presente invención. Por ejemplo, para aumentar la potencia de un anticuerpo por producción de un valor kon mayor, los aminoácidos localizados en las posiciones clave expuestas en esta memoria por los residuos en negrita y subrayados en la Tabla 1 para el anticuerpo de referencia se reemplazarían por los aminoácidos listados bajo CDRs de la Tabla 2 (también con negrita y subrayados). Así pues, estos códigos de una sola letra representan los aminoácidos que reemplazan a los aminoácidos de referencia en las posiciones clave (o posiciones críticas) de las CDRs que se muestran en la Figura 2 (residuos en negrita en las secuencias de la Tabla 2) para un anticuerpo de referencia cuya potencia debe aumentarse.
Para los clones de la Tabla 4, el clon 18 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 41 (cadena pesada) y 42 (cadena ligera); el clon 19 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 45 (cadena pesada) y 46 (cadena ligera), el clon 20 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 47 (cadena pesada) y 48 (cadena ligera), el clon 21 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 51 (cadena pesada) y 52 (cadena ligera), el clon 22 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 53 (cadena pesada) y 54 (cadena ligera), el clon 23 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 49 (cadena pesada) y 50 (cadena ligera), el clon 24 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 43 (cadena pesada) y 44 (cadena ligera), el clon 25 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 37 (cadena pesada) y 38 (cadena ligera), y el clon 26 tiene las secuencias de longitud total dadas por SEQ ID NO: 39 (cadena pesada) y 40 (cadena ligera).
En este caso, el clon 18 (IgG) y el clon 27 (Fab) tienen las mismas CDRs, el clon 19 (IgG) y el clon 29 (Fab) tienen las mismas CDRs, el clon 20 (IgG) y el clon 28 (Fab) tienen las mismas CDRs, el clon 21 (IgG) y el clon 9 (Fab) tienen las mismas CDRs, el clon 22 (IgG) y el clon 10 (Fab) tienen las mismas CDRs, el clon 23 (IgG) y el clon 11 (Fab) tienen las mismas CDRs, el clon 24 (IgG) y el clon 12 (Fab) tienen las mismas CDRs, el clon 25 (IgG) y el clon 13 (Fab) tienen las mismas CDRs, el clon 26 (IgG) y el clon 15 (Fab) tienen las mismas CDRs. Así pues, los datos de la Tabla 4 correlacionan la actividad de los fragmentos Fab con la de una molécula de anticuerpo completa.
Por tanto, la presente invención incluye anticuerpos neutralizantes tetrámeros enteros de alta potencia en los cuales dicho anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 37, 39, 41, 45, 47, 49, 43, 51 y 53, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 y 54, preferiblemente donde dichos anticuerpos son los anticuerpos de los clones 18-26.
Ejemplo 2
Ensayo de Microneutralización
La neutralización de los anticuerpos de la presente invención se determinó por ensayo de microneutralización. Este ensayo de microneutralización es una modificación de los procedimientos descritos por Anderson et al ["Microneutralization test for respiratory syncytial virus based on an enzyme immunoassay, J. Clin. Microbiol. 22, 1050-1052 (1985)]. El procedimiento utilizado aquí se describe en Johnson et al [J. Infectious Diseases, 180, 35-40 (1999)]. Se hicieron diluciones de los anticuerpos por triplicado utilizando una placa de 96 pocillos. Se incubaron 10 TCID50 del virus respiratorio sincitial (RSV - cadena larga) con diluciones seriadas del anticuerpo (o Fabs) para testado durante 2 horas a 37º en los pocillos de una placa de 96 pocillos. Se añadieron luego a cada pocillo células HEp-2 sensibles a RSV (2,5 x 104) y se cultivaron durante 5 días a 37ºC en 5% CO2. Después de 5 días, se aspiró el medio y las células se lavaron y se fijaron a las placas con 80% metanol y 20% PBS. Se determinó luego la replicación del RSV por expresión de la proteína F. Las células fijadas se incubaron con un anticuerpo monoclonal anti-proteína F conjugado con biotina (proteína pan F, Mab 133-1H específico del sitio C) se lavaron y se añadió a los pocillos avidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Los pocillos se lavaron nuevamente y se midió la renovación del sustrato TMB (ácido tionitrobenzoico) a 450 nm. El título de neutralización se expresó como la concentración de anticuerpo que causaba al menos 50% de reducción en la absorbencia a 450 nm (la DO450) a partir de células de control que contenían únicamente el virus.
<110> Young, James F.
Koenig, Scott
5 Johnson, Leslie S.
Huse, William D.
Wu, Herren
Watkins, Jeffry D.
<120> Anticuerpos recombinantes de alta potencia y métodos para producirlos
<140>
<141>
<150> U.S. 60/186,252
<151>
15 <160> 59
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 106
<212> PRT 20 <213> Secuencia Artificial
<220>
<223> Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia de región variable de la cadena ligera de anticuerpo humanizado Medi-493.
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<210> 2
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- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia CDR de alta potencia.
- <400>
- 32
- <210>
- 33
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia CDR de alta potencia.
- <400>
- 33
- <210>
- 34
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia CDR de alta potencia.
- <400>
- 34
- <210>
- 35
- <211>
- 106
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 35
- 5
- <210><211><212><213> 36 120 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena ligera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 36
- <210><211><212><213>
- 37 450 PRT Secuencia Artificial
- 5
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 37
- 5
- <210><211><212><213> 38 213 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena ligera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 38
- 5
- <210><211><212><213> 39 450 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 39
- 5
- <210><211><212><213> 40 213 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena ligera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 40
- 5
- <210><211><212><213> 41 450 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 41
- 5
- <210><211><212><213> 42 213 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena ligera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 42
- 5
- <210><211><212><213> 43 450 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 43
- 5
- <210><211><212><213> 44 213 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena ligera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 44
- 5
- <210><211><212><213> 45 450 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 45
- 5
- <210><211><212><213> 46 213 PRT Secuencia Artificial
- 51
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena ligera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 46
- 5
- <210><211><212><213> 47 450 PRT Secuencia Artificial
- 10
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 47
- 5
- <210><211><212><213> 48 213 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena ligera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 48
- 5
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- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 49
- <210><211><212><213>
- 50 213 PRT Secuencia Artificial
- 5
- <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 50
- <210>
- 51
- 10
- <211> 450
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 51
- 5
- <210><211><212><213> 52 213 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena ligera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
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- 5
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- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena pesada de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
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- <210><211><212><213> 54 213 PRT Secuencia Artificial
- <220> <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Cadena lgiera de anticuerpo de alta potencia.
- <400>
- 54
- <210>
- 55
- <211>
- 16
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia CDR de alta potencia.
- <400>
- 55
- <210>
- 56
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia CDR de alta potencia.
- <400>
- 56
- <210>
- 57
- <211>
- 7
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia CDR de alta potencia.
- <400>
- 57
- <210>
- 58
- <211>
- 7
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia CDR de alta potencia.
- <400>
- 58
- <210>
- 59
- <211>
- 10
- <212>
- PRT
- <213>
- Secuencia Artificial
- <220>
- <223>
- Descripción de la Secuencia Artificial: Secuencia CDR Básica.
- <400>
- 59
Claims (34)
- REIVINDICACIONES1. Un anticuerpo que se fija específicamente a la proteína F de un virus respiratorio sincitial (RSV), donde el anticuerpo:
- a.
- tiene una constante de velocidad de asociación (kon) de al menos 2,5 x 105 M-1 s-1 como se mide por resonancia de plasmones de superficie;
- b.
- tiene un valor CE50 menor que 3,0 nM en un ensayo de microneutralización para RSV; y
- c.
- comprende las CDRs siguientes con uno o más cambios de aminoácidos en las posiciones subrayadas y
en negrita en una o más de las CDRs: región de determinación de la complementariedad de la región variable de la cadena pesada (VH) (CDR)1 TSGMSVG (SEQ ID NO:8);VH CDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID NO:9); VH CDR3 SMITNWYFDV (SEQ ID NO:10); región variable de la cadena ligera (VL) CDR1 SASSSVGYMH (SEQ ID NO:5); VL CDR2 DTSKLAS (SEQ ID NO:6); y VL CDR3 FQGSGYPFT (SEQ ID NO:7),en donde dichos uno o más cambios de aminoácidos tienen el efecto de producir un aumento en el valor de kon y aumentar la actividad de microneutralización de dicho anticuerpo. -
- 2.
- El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende las regiones de entramado de las Figuras 1 ó 2.
-
- 3.
- El anticuerpo de la reivindicación 1 ó 2 que está aislado.
-
- 4.
- El anticuerpo de la reivindicación 1, 2, ó 3, en donde el anticuerpo se fija al mismo epítope del antígeno F de RSV que un anticuerpo que comprende una VH que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (Figura 2B) y una VL que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (Figura 2A).
-
- 5.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la kon es al menos 5 x 105 M-1
- -
- 1
s. -
- 6.
- El anticuerpo de la reivindicación 1, 2, 3, ó 4, en donde la kon es al menos 7,5 x 105 M-1 s-1.
-
- 7.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo tiene una CE50 menor que 1,0 nM.
-
- 8.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo tiene una constante de afinidad de (Ka) de al menos aproximadamente 109 M-1.
-
- 9.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo tiene un Ka de al menos aproximadamente 1010 M-1.
-
- 10.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el anticuerpo tiene un Ka de al menos aproximadamente 1011 M-1.
-
- 11.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo aislado comprende una VH CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos TAGMSVG (SEQ ID NO: 24) o TPGMSVG (SEQ ID NO: 25).
-
- 12.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VH CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos DIWWDGKKHYNPSLKD (SEQ ID NO:27), DIWWDDKKHYNPSLKD (SEQ ID NO:26), DIWWDGKKDYNPSLKD (SEQ ID NO:28), DIWWDDKKHYNPSLKD (SEQ ID NO:29), DIWWDGKKSYNPSLKD (SEQ ID NO: 30), DIWWDDKKSYNPSLKD (SEQ ID NO:55), o DIWWDGKKSYNPSLKS.
-
- 13.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VH CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos DMITNFYFDV (SEQ ID NO:31), DMIFNWYFDV (SEQ ID NO:32), SMITNFYFDV (SEQ ID NO:33) o DMIFNFYFDV (SEQ ID NO:34).
-
- 14.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VL CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos SASSRVGYMH (SEQ ID NO:11), SLSSRVGYMH (SEQ ID NO:12), SPSSRVGYMH (SEQ ID NO:13), LPSSRVGTYMH (SEQ ID NO:56), o KCQLSVGYMH (SEQ ID NO:59).
-
- 15.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VL CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos DTFKLTS (SEQ ID NO:14), DTFKLAS (SEQ ID NO:15), DTYKQTS (SEQ ID NO:16), DTRYLSS (SEQ ID NO:17), DTRGLPS (SEQ ID NO:18), DTMRLAS (SEQ ID NO:19), DTFKLSS (SEQ ID NO:20), DTYRHSS (SEQ ID NO:21), DTMYQSS (SEQ ID NO:22), DTFFLDS (SEQ ID NO:57), DTRYQSS (SEQ ID NO:58), DTFRLAS, o DTFYLSS.
-
- 16.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el anticuerpo comprende una VL CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos FQGSFYPFT (SEQ ID NO: 23).
-
- 17.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo aislado es un anticuerpo monoclonal.
-
- 18.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el anticuerpo es un fragmento Fab
o F(ab’)2. -
- 19.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde el anticuerpo es una molécula entera de anticuerpo tetrámero.
-
- 20.
- Una composición que comprende un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un diluyente o excipiente farmacológicamente aceptable.
-
- 21.
- La composición de la reivindicación 20, para uso como medicamento.
-
- 22.
- La composición de la reivindicación 21, para uso en la prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente que corre riesgo de padecer dicha enfermedad.
-
- 23.
- La composición de la reivindicación 21, para uso en el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente afectado por dicha enfermedad.
-
- 24.
- Uso de la composición de la reivindicación 20, para fabricación de un medicamento para prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente que corre riesgo de dicha enfermedad.
-
- 25.
- Uso de la composición de la reivindicación 20, para fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente afectado por dicha enfermedad.
-
- 26.
- El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 para uso como medicamento.
-
- 27.
- El anticuerpo de la reivindicación 26, para uso en la prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente que corre riesgo de padecer dicha enfermedad.
-
- 28.
- El anticuerpo de la reivindicación 26, para uso en el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente afectado por dicha enfermedad.
-
- 29.
- Uso de un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para fabricación de un medicamento para la prevención de una enfermedad causada por RSV en un paciente que corre riesgo de padecer dicha enfermedad.
-
- 30.
- Uso del anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad causada por RSV en un paciente afectado por dicha enfermedad.
-
- 31.
- La composición de la reivindicación 22 ó 23, en la cual el paciente es un humano.
-
- 32.
- El uso de la reivindicación 24 ó 25, en el cual el paciente es un humano.
-
- 33.
- El anticuerpo de la reivindicación 27 ó 28, en el cual el paciente es un humano.
-
- 34.
- El uso de la reivindicación 29 ó 30, en el cual el paciente es un humano.
FIGURA 1FIGURA 2FIGURA 3
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