JP2010162025A - 高効力組換え抗体およびその産生法 - Google Patents

Abstract

【課題】高結合速度定数および任意の高親和性を持つ、免疫学的活性断片を含む高効力抗体を提供する。
【解決手段】高効力抗体は、特定の選択アミノ酸配列を持つ一つあるいはそれ以上の枠組み構造およびまたはＣＤＲを含む重鎖および軽鎖可変部より成る、免疫学的活性断片を含有する組換え抗体の産生、組換え抗体が試験管内で選択された抗原に反応した場合の高結合速度定数に対する前記組換え抗体のスクリーニング、および前記高結合速度定数を持つ抗体の選択からなる。
【選択図】図１

Description

本出願は２０００年３月１日出願された合衆国暫定特許出願番号６０／１８６２５２号の優先権を主張し、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。

本発明は、高効力抗体、抗体効力を強める方法、そして疾病の予防および処置にこのような抗体を用いる方法に関する。

抗体は、今までも、そして現在においても種々の疾病、特にウイルスなどの感染性微生物によって引き起こされる疾病の予防および処置のために開発されている。

その方法の一つは、特異性の高い中和活性を持つ抗体、特に中和モノクローナル抗体の開発である。この方法の一つの欠点は、マウスあるいはラットの抗体よりもヒト抗体を産生する必要があり、したがって、ヒト抗マウスあるいは抗ラット抗体応答の発生を最小限にしなければならず、その結果更なる免疫異常を引き起こす可能性があるということであった。

一つの代替方法は、キメラ、あるいはハイブリッド抗体を産生するために、マウス重鎖および軽鎖可変部をコード化する遺伝子がヒト重鎖および軽鎖定常部の遺伝子と結合したヒト−マウスキメラ抗体を産生することである。例として、ヒト化抗ＲＳＶ抗体が調製され、現在販売されている（ジョンソン、アメリカ合衆国特許番号５８２４３０７号参照）。

いくつかの場合において、マウス相補性決定領域（ＣＤＲ）は、いわゆる“ヒト化”抗体を提供するために、同様の特異性を持ったヒト抗体から相対的に置かれたアミノ酸に置換されるマウス枠組み構造アミノ酸（抗体の可変部内であるがＣＤＲ以外のアミノ酸）のいくつかを伴って、ヒト定常部および枠組み構造領域に移植される（例として、クィーン、アメリカ合衆国特許番号５６９３７６１号および５６９３７６２号参照）。しかし、このような抗体は完全なマウスＣＤＲ領域を含み、混合効果および１０^７から１０^８Ｍ^−１より低い親和性の提示が見出されている。

標的抗原に対する超高親和性を持つ抗体を含む高効力抗体（すなわち抗原中和能力などの高い生物学的活性を持つ抗体）の産生は、より少ない量の抗体で望ましい臨床効果を得て、それにより費用を削減することを要求するより実践的な見地からだけでなく、そのような抗体の中和能力の観点からも望ましいであろう。

抗体親和性は、抗体の特定抗原に対する結合定数により測定され、この結合定数はしばしば、抗原抗体複合体解離の速度定数（“Ｋ_ｏｆｆ”値と示す）に対する抗原抗体複合体形成の速度定数（“Ｋ_ｏｎ”値）の割合によって算出される。本発明にしたがって、抗体効力は、特異性に関係なくＫ_ｏｎ値の関数であると定められている。したがって、本発明は、Ｋ_ｏｎ値が高いほど抗体効力が高い高抗体効力の獲得、それによる高効力抗体の産生およびそれを産生する方法の問題に対する解決法を提供する。

アメリカ合衆国特許番号５８２４３０７号 アメリカ合衆国特許番号５６９３７６１号 アメリカ合衆国特許番号５６９３７６２号

本発明の一見地にしたがって、疾病の処置およびまたは予防に有益な高効力抗体が提供される。もう一つの見地において、抗体の効力は、抗原抗体複合体形成の速度定数（“Ｋ_ｏｎ”値）の増加により強まる。

一見地において、本発明はビタキシン以外の高効力抗体に関し、前記抗体は免疫学的活性を持つ部位、断片あるいは分節を含み、最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎ値を持つ。この抗体はまた高い親和性（最低約１０^９Ｍ^−１）を持つであろう。

もう一つの見地において、本発明は高効力中和抗体に関し、前記抗体は免疫学的活性を持つ部位、断片あるいは分節を含み、最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎ値を持つ。この抗体はまた高い親和性（最低約１０^９Ｍ^−１）を持つであろう。

本発明の更なる目的は、抗体が結合するエピトープを変化させることなく特定の抗原に対するＫ_ｏｎ値を増加させることにより中和抗体の効力を高める方法を提供することである。

本発明のまた更なる目的は、望ましい抗原に対する高効力を確保し、前記効力が既知の抗体の最低２から１０倍であるように調製するための、抗体をスクリーニングする方法を提供することである。

より特異的には、本発明の一つの目的は、最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、好ましくは最低５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、そして最も好ましくは７．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎ値を持つ抗体を産生することである。

本発明のまたもう一つの目的は、感染性微生物（あるいは細菌）、特に呼吸器系の感染を引き起こすもの、最も特にはウイルスにより提示される一つあるいはそれ以上の抗原に対する高い特異性を持つ高親和性、高効力抗体を提供することである。

一つの実施例において、本発明は、実質上図１に開示された抗体の可変鎖枠組み構造領域（ＦＲ）を持つ（この抗体と同一の特異性を持つ）抗体を提供する。しかしここで、そのポリペプチド構造は、一つあるいはそれ以上のＣＤＲ（あるいは相補性決定領域）内に一つあるいはそれ以上の異なるアミノ酸を含む。一つの好ましい実施例において、本発明の抗体は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２およびＨ３を含む一つまたはそれ以上のＣＤＲの配列においてのみ、図１または２の抗体（これ以降、“基本構造”あるいは“参照構造”）とは異なる。一つの好ましい配列は図３に示す。

本発明の別の目的は、ここに開示された抗体から成る合成物を提供することである。ここで前記抗体は薬理学的許容担体、希釈剤あるいは賦形剤中に懸濁される。

本発明のまた更なる目的は、ウイルス、特に呼吸器合胞体ウイルスにより引き起こされるような疾病を予防およびまたは処置する方法を提供することである。前記方法は、前記疾病の危険にある、あるいはそれに苦しむ患者に、治療上効果的な量のここに開示された抗体を含む合成物を投与することより成る。

その効力を本発明の方法により大きくすることができる高親和性モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖可変部のアミノ酸配列を示す図。参考として、この抗体は、ジョンソン他、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１７６巻：１２１５から１２２４ページ（１９９７年）に開示されたＭＥＤＩ−４９３抗体配列である。ここで、ＣＤＲ領域は下線部であり、一方下線部以外の残基は、各ポリペプチド構造の可変部の枠組み構造領域を形成する。この構造において、ＣＤＲはマウス抗体から得られ、一方枠組み構造領域はヒト抗体から得られる。定常部（不図示）もまたヒト抗体から得られる。軽鎖および重鎖それぞれについて、図１Ａは軽鎖可変部（配列識別番号：１）を示し、図１Ｂは重鎖可変部（配列識別番号：２）を示す。 別の基本あるいは参照ポリペプチド配列の重鎖および軽鎖可変部を示す図。同様に、ＣＤＲ領域は下線部である。この配列は軽鎖のＣＤＲ Ｌ１の最初の４残基、軽鎖の残基１０３および重鎖の残基１１２が図１と異なる。本発明の全ての高効力中和Ｆａｂ構造（表２に示すＣＤＲ構造）が、この参照あるいは基本構造の枠組み構造配列を用いる。図２Ａは軽鎖（配列識別番号：３）可変部を示し、図２Ｂは重鎖（配列識別番号：４）可変部を示す。 本発明の好ましい実施例の、重鎖（配列識別番号：３６）可変部および軽鎖（配列識別番号：３５）可変部を示す図。この好ましい抗体は、いくつかの高Ｋ_ｏｎＣＤＲ（あるいは高効力ＣＤＲ）を持ち、図２の基本あるいは参照抗体よりも高い結合速度定数（すなわちＫ_ｏｎ）を生じ、したがってより高い効力を持つ。この好ましい抗体は図２の配列と同一の枠組み構造アミノ酸配列を持ち、本開示に用いるにあたって、以下の表２および３において“クローン１５”と記された。これらの配列は、ここに開示された方法により容易に産生され、その全てはこの分野における通常の知識を有する者が容易に知ることができる。反応速度定数は実施例１の方法に従って測定され、効力は実施例２に示されたように測定された。 本発明にしたがったＦａｂ断片の産生のためのファージＭ１３の使用、および精製を容易にするためのヒスチジン タグ配列（６ヒスチジン残基）の使用の模式図を示した図。 本発明の抗体に用いたスクリーニング方法の模式図を示した図。“ＳＰＥ”は単一点ＥＬＩＳＡを示す。“Ｈ３−３Ｆ４”は表２および３のクローン４の名称である。

本発明の一見地にしたがって、疾病の処置およびまたは予防に有益な高効力抗体が提供される。もう一つの見地において、抗体の効力は、その抗体のＣＤＲ配列を高効力ＣＤＲ配列と置き換えることによる抗原抗体複合体形成の速度定数の増加により強まり、それは“Ｋ_ｏｎ”値として示される。

一見地において、本発明はビタキシン以外の高効力抗体に関し、前記抗体は免疫学的活性を持つ部位、断片あるいは分節を含み、最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎ値を持つ。この抗体はまた高い親和性（最低約１０^９Ｍ^−１）を持つであろう。

一見地において、本発明は高効力中和抗体に関し、前記抗体は免疫学的活性を持つ部位、断片あるいは分節を含み、最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎ値を持つ。この抗体はまた高い親和性（最低約１０^９Ｍ^−１）を持つであろう。

本発明は、高効力あるいは生物学的活性を持ち、好ましくは最低約１０^９Ｍ^−１の親和性および最低約２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１のＫ_ｏｎ値を持つ中和あるいは非中和抗体を産生する方法に向けられる。

分子生物学方法および組換えＤＮＡ技術の到来に伴い、現在では組換え法により、その活性断片を含む抗体を産生することが可能であり、それにより、抗体のポリペプチド構造中に見られる特異的なアミノ酸配列をコード化する遺伝子配列を発生させることができる。これは、異なる種あるいは源由来の中和抗体に特有の配列を持つ抗体の迅速な産生を可能にしてきた。

それらがどのように構成されたかに関係なく、抗体は、通常Ｌ_２Ｈ_２と表示される同様の全体的な３次元構造を持つ。ここで、通常その分子は、２本の軽（Ｌ）アミノ酸鎖および２本の重（Ｈ）アミノ酸鎖から成る。両鎖は、構造において相補的な抗原標的と相互作用可能な領域を持つ。標的と相互作用する領域は“可変”あるいは“Ｖ”領域と示され、抗原特異性の異なる抗体とはアミノ酸配列が異なるという特徴を持つ。

Ｈ鎖あるいはＬ鎖の可変部は、抗原標的と特異的に結合することが可能なアミノ酸配列を含む。これらの配列内には、特異性の異なる抗体間での極端な可変性のために“超可変”と呼ばれる小配列がある。この超可変領域は、“相補性決定領域”あるいは“ＣＤＲ”領域と呼ばれる。これらのＣＤＲ領域は、特定の抗原性決定構造に対する抗体の基本特異性をもたらす。

ＣＤＲは可変部内におけるアミノ酸の非連続の一続きであるが、重鎖および軽鎖可変部内のこれらの重要なアミノ酸配列の位置は、免疫グロブリン構造のアミノ酸配列内において同様の位置をとることが知られている。すべての抗体の可変重鎖および軽鎖がそれぞれ３つのＣＤＲ領域を持ち、重鎖および軽鎖それぞれにおいて、その他（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と称す）のＣＤＲ領域と非連続である。認識されたＣＤＲ領域は、カバット他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２巻：６６０９−６６１６ページ（１９７７年）に示されている。番号の付された配列表は図１から３に示され、ＣＤＲは下線が引かれ、番号はカバットの配列表に従う。

全ての哺乳動物種において、抗体ポリペプチドは、定常部（すなわち高度に保存された部位）および、ＣＤＲおよびいわゆる“枠組み構造領域”の双方から成る可変部を含み、枠組み構造領域は可変部内のＣＤＲ以外のアミノ酸配列を構成する。

通常抗体あるいはその断片を特徴付けるために用いる特性のうちの一つは、抗体の特異性および親和性である。特異性は、抗体が強く、あるいは最も強く結合する特定のリガンドすなわち抗原構造を示す。親和性は、特定のリガンドに対する抗体の結合の強さの量的な程度を示し、“親和定数”という用語で表示される。この親和定数は、結合あるいは解離定数のどちらかとして測定することが可能であり、抗体−リガンド複合体に対する遊離リガンドおよび遊離抗体の平衡濃度の割合で示す。ここで用いられたように、親和性は結合定数として得られる。

この定数は通常、Ｋ_ｏｎとして示される複合体を形成するための結合の速度定数と、Ｋ_ｏｆｆとして示される解離の速度定数を用いた、抗原抗体複合体形成の反応速度論により測定される。この定数の測定は、この分野における通常の知識を有する者が十分に行うことができる。抗体および対応する抗原は、複合体を形成するために以下のように結合する：

ここで、親和定数は結合定数として得られるため、したがって以下のように表す：

ここで、Ｋ_ａ＝結合（あるいは親和）定数であるが、角括弧は括弧内の物質のモル濃度を表す。温度、圧力およびイオン強度などの特定の条件下では、反応物質の濃度の積に対する複合体の濃度の割合は一定である。抗体あるいは抗原（リガンド）が飽和状態に達しない間は、各結合物質の濃度の変化が、上記反応式（サインＫ_ａが一定）により規定された量まで、複合体（Ａｂ−Ａｇ）の濃度を変化させる。この相互作用は、質量作用の法則に従って作用する。

加えて、この関係は濃度に依存し、存在する物質の絶対量には依存しない。したがって、全体量もまた親和性の測定に関する。したがって、半分量に反応が起こった場合には、二倍量の複合体が形成されるであろう。これは各反応物質（ＡｂおよびＡｇ）が２倍濃度であり、それによりほとんど４倍の複合体が形成されるためである。逆に、希釈によりＡｂ−Ａｇ複合体の濃度は大きく減少し得る。一般的に、抗原抗体相互作用の反応速度論は、この分野における通常の知識を有する者に十分に知られている。

この抗体抗原反応は、力学的平衡として反応速度論的に示すことができる。ここで親和定数は、複合体の形成および解離に対する個々の速度定数の割合として測定することができる：

したがって、Ｋ_ｏｎ値は、前記の速度定数あるいは特異的反応速度であり、すなわち単位：Ｍ^−１ｓｅｃ^−１で測定される複合体形成反応である。Ｋ_ｏｆｆ値は、Ａｂ−Ａｇ複合体の解離に対する速度定数あるいは特異的反応速度であり、単位ｓｅｃ^−１で測定される。

本発明の抗体およびその活性断片についてのＫ_ｏｎ値は、実施例に開示されたＢＩＡｃｏｒｅプロトコルおよび装置を用いて測定された。

前記にしたがって、本発明は高効力中和抗体に関し、前記抗体は免疫学的活性を持つ部位、断片およびまたは分節を含み、最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１のＫ_ｏｎ値を持つ。

ここで用いられたように、“部位”、“断片”および“分節”という用語は、ポリペプチドに関して用いられる場合には、アミノ酸残基などの残基の連続した配列を示し、前記配列はより大きい配列の集合を形成する。例として、ポリペプチドが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン等などの一般的なエンドペプチダーゼで処置された場合には、この処置で生じたオリゴペプチドは、当初のポリペプチドの部位、分節あるいは断片を示すであろう。このプロテアーゼは通常、ここに開示されたような抗体の断片を産生するために用いられるが、その断片は、現在では産生したい特定ポリペプチドの直接クローニングあるいは合成により、より容易に産生することができる。

本発明の抗体は高効力抗体であり、通常高Ｋ_ｏｎ値を提示する。本開示において用いられるにあたって、“高効力”という用語は、約６ｎＭ（ナノモルあるいは１０^−９モル）以下のＥＣ_５０（すなわち以下に開示された微小中和分析において、ＯＤ_４５０において最低５０％の減少を示す有効濃度）による影響を受ける効力を示す。本発明にしたがった抗体は中和することができる（ウイルスなどの標的種の破壊を引き起こし、それによりウイルスによる負担を減少させる）。一つの用法において中和をしない抗体は、別の異なる用法において中和することができる。

本発明の高効力抗体は、微生物上に見られる抗原決定基に対して特異性を持ち、前記微生物に結合することで、前記微生物を中和することができる。本発明にしたがって、前記微生物は、最も多くはウイルス、バクテリアあるいは菌類であり、特に呼吸器疾患を引き起こす生物、最も好ましくはウイルスである。ここに示された実施例において用いられる一つの特異的な例は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、別の例はパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）である。

本発明の高効力抗体は、ガン細胞の表面上に提示される抗原に対する特異性をも持ち得る（しかし通常、非中和性のビタキシンなどの抗体を含まない）（参照：ウー他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５巻：６０３７から６０４２ページ（１９９８年））。本発明の抗体はまた、その他の非中和反応に対する抗体をも含む。

本発明の高効力抗体はまた、毒性物質などの化学物質あるいは毒素、もしくは前記毒素の生体代謝により産生される産物を含むがこれに限定されない、毒素産物に対する特性を持つ。例として、本発明の高効力抗体は、コカインなどの習慣性薬物の影響を無効にするか、あるいはそうでなければ改善することにおいて有益であり得る。

本発明の高効力抗体はまた、ＲＳＶのＦ抗原などの特異的な抗原に対する高親和性を持ち、そしてここで前記高親和性は前記抗体の親和定数（Ｋ_ａ）で表され、前記親和定数（Ｋ_ａ）は最低１０^９Ｍ^−１、好ましくは最低約１０^１０Ｍ^−１、最も好ましくは最低約１０^１１Ｍ^−１である。

本発明の抗体は、例として実施例２に開示された微小中和分析で測定された場合に、高効力を示す。この分析において、高効力はＥＣ_５０値により測定され、通常約６．０ｎＭ（ナノモルあるいは１０^−９Ｍ）以下、好ましくは約３．０ｎＭ以下、もっとも好ましくは約１．０ｎＭ以下のＥＣ_５０を持つ。通常、ＥＣ_５０が低いほど、効力あるいは生物学的活性は高い。

本発明の高効力抗体は、その高Ｋ_ｏｎ値に起因する高効力を示すが、ここで前記高効力は、枠組み構造領域（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を構成するアミノ酸配列により決定する。これらの抗体あるいはその活性断片は、そのアミノ酸配列内に高効力相補性決定領域（ＣＤＲ）を持つ。本発明の高効力中和抗体は、最低２つの高効力ＣＤＲあるいは３つの高効力ＣＤＲ、もしくはさらに４つの高効力ＣＤＲあるいは５つの高効力ＣＤＲより成り、そしてさらに６つの高効力ＣＤＲより成ることもあり得る。もちろん、後者の場合は、抗体あるいはその活性断片の６つのＣＤＲ全てが高効力ＣＤＲである。これにしたがって、このような本発明の高効力中和抗体は、軽鎖ＣＤＲＬ１（ＣＤＲＬ１）、Ｌ２（ＣＤＲＬ２）、およびＬ３（ＣＤＲＬ３）と重鎖ＣＤＲＨ１（ＣＤＲＨ１）、Ｈ２（ＣＤＲＨ２）およびＨ３（ＣＤＲＨ３）それぞれのうちの一つから成る高効力ＣＤＲを持つ。

この高効力抗体の特異的な実施例において、前記高効力ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１については配列番号：１１、１２、１３および５６、ＣＤＲＬ２については配列識別番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、５７および５８、ＣＤＲＬ３については配列識別番号：２３、ＣＤＲＨ１については配列識別番号：２４および２５、ＣＤＲＨ２については配列識別番号：２６、２７、２８、２９、３０および５５、ＣＤＲＨ３については配列識別番号：３１、３２、３３および３４から成るグループから選択されたアミノ酸配列を持つ。

好ましい実施例において、本発明の高効力中和抗体は、配列識別番号：３５および３６から成るグループから選択されたアミノ酸配列を持つ可変部重鎖および軽鎖より成る。

本発明はさらに、高効力抗体を産生するためのプロセスに関し、
（ａ）哺乳動物抗体から得られた重鎖および軽鎖定常部と、前選択アミノ酸配列を持つ一つあるいはそれ以上の枠組み構造領域およびまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖および軽鎖可変部より成る、免疫学的活性断片を含む組換え抗体の産生、
（ｂ）前記抗体が試験管内で、選択された抗原に反応した場合の高Ｋ_ｏｎ値に対する前記組換え抗体のスクリーニング、および、
（ｃ）前記高Ｋ_ｏｎを持つ抗体の選択
から構成される。

本発明にしたがって産生された抗体は、通常高親和定数および高Ｋ_ｏｎ値を持ち、後者は高生物学的活性をもたらす。特異的な実施例において、本発明に従って産生された高効力抗体は、通常最低約２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１のＫ_ｏｎを持つ。

一つの実施例において、本発明のプロセスは高効力抗体を産生し、ここで高Ｋ_ｏｎをもたらす（およびその結果高効力を生じる）前選択アミノ酸配列は、抗体の枠組み構造領域および最低２つあるいは３つのＣＤＲ領域、場合によっては全６つのＣＤＲ領域の両方、もしくはＣＤＲ領域のみに限定されて存在する。

他の実施例において、高Ｋ_ｏｎをもたらす前選択アミノ酸配列は、抗体の枠組み構造領域および最低３つのＣＤＲ領域の両方、もしくはＣＤＲ領域のみに限定されて存在する。

一つの追加の実施例において、高Ｋ_ｏｎをもたらす前選択アミノ酸配列は、抗体の枠組み構造領域および最低４つのＣＤＲ領域の両方、もしくはＣＤＲ領域のみに限定されて存在する。

加えて、本発明にしたがって産生された抗体は、Ｈ_２Ｌ_２構造を有する完全４量体構造、あるいは、単鎖抗体もしくはＦａｂあるいはＦ（ａｂ）_２′断片などの断片を含む前記抗体構造の断片であり得る。

本発明にしたがって、抗体が特異的に結合する抗原は、しばしば、しかし常にではなく、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）あるいはパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）などのウイルスが発現する抗原である。

本発明はまた、高効力抗体を産生するためのプロセスに関し、哺乳動物抗体から得られた重鎖および軽鎖定常部と、枠組み構造領域およびまたは、最低１つのＣＤＲが、本来見られないアミノ酸配列を持つ高Ｋ_ｏｎ（あるいは高効力）ＣＤＲである相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖および軽鎖可変部より構成される組換え抗体を産生することより成る。ここで前記ＣＤＲの存在が、結果として高Ｋ_ｏｎを生じる。

特異的な実施例において、本発明のプロセスは高効力組換え抗体を産生し、ここで組換え高Ｋ_ｏｎ抗体は、最低２つの高Ｋ_ｏｎＣＤＲ、あるいは３つの高Ｋ_ｏｎＣＤＲ、そしてさらには４つの高Ｋ_ｏｎＣＤＲ、および５つあるいは６つの高Ｋ_ｏｎＣＤＲより成る。このＣＤＲ配列の存在が、結果として抗体あるいは断片に高Ｋ_ｏｎを示し、それにより高効力をもたらす。

本発明の方法のさらなる実施例において、前記の本発明の方法により産生された抗体の高結合定数は、最低約２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１である。

本発明はさらに、高効力抗体を産生するためのプロセスに関し、
（ａ）哺乳動物抗体から得られた重鎖および軽鎖定常部と、前選択アミノ酸配列を持つ一つあるいはそれ以上の枠組み構造領域およびまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖および軽鎖可変部より成る、免疫学的活性断片を含む組換え抗体の産生、
（ｂ）前記抗体が試験管内で、選択された抗原に反応した場合の高効力および高Ｋ_ｏｎの両方に対する前記組換え抗体のスクリーニング、および、
（ｃ）前記高効力および高Ｋ_ｏｎの両方を持つ抗体の選択
から構成される。

本発明の好ましい実施例において、ここに開示されたプロセスは、高親和性および高Ｋ_ｏｎの両方を持つ高効力抗体を産生する。ここで親和定数は最低１０^９Ｍ^−１、Ｋ_ｏｎは最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であり、特にここで前記親和性は最低１０^１０Ｍ^−１、前記Ｋ_ｏｎは最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であり、最も特には、前記親和定数は最低１０^１１Ｍ^−１、前記Ｋ_ｏｎは最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１である。超高親和定数およびＫ_ｏｎを持つ最も好ましい実施例においては、特にここで前記親和性は最低１０^９Ｍ^−１、前記Ｋ_ｏｎは最低５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であり、最も特には、親和定数は最低１０^１０Ｍ^−１、Ｋ_ｏｎは最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１である。最も特に好ましい実施例の一つは、高効力抗体を産生する本発明のプロセスであり、ここで親和定数は最低１０^１１Ｍ^−１、Ｋ_ｏｎは最低７．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１である。考慮すべきことは、高親和性はまた試みられ、前記親和性（Ｋ_ａ）および速度性結合（Ｋ_ｏｎ）値の任意の組み合わせが本発明中にあるということである。

本発明のこれらの実施例はまた、高Ｋ_ｏｎをもたらす前選択アミノ酸配列が枠組み構造領域およびＣＤＲ領域の両方、あるいはＣＤＲ領域のみに存在し、配列識別番号：１１から３４および５５から５８より選択された前記配列が、１、２、３、４、５あるいは全６つのＣＤＲ領域に存在し、個々のＣＤＲ配列がここに開示された個々の配列より選択されるプロセスを含む。これを行う方法は、この技術の属する分野における通常の知識を有する者の間でよく知られており、ここではさらなる開示は行わない。

本発明の方法は、単に、特定の抗原に対して特異的であり、既に存在する免疫原性分子および構造物に無関係に産生される新規高親和性抗体を産生することに限定されない。したがって、ここに開示された方法は、既知の抗体分子の構造に対する選択的な修飾と、それにより前記抗体のＫ_ｏｎの増加をもたらし生物学的活性の増加を伴う方法を提供する。これは、ここに開示された高効力ＣＤＲ配列の選択的取り込みにより達成される。

本発明の別の実施例において、効力を高めることが可能な抗体は、最低１０^９Ｍ^−１、好ましくは最低約１０^１０Ｍ^−１、最も好ましくは最低約１０^１１Ｍ^−１の初期のおよびまたは最終的な親和定数を持つ。

本発明にしたがって、本発明の方法にしたがって産生された抗体は、本発明の高効力配列を産生するためのアミノ酸変換後に、より高いＫ_ｏｎ定数を持ち、前記アミノ酸変換の結果、特に前記アミノ酸変換後のＫ_ｏｎ値は、（特定の親和定数（ｋ_ａ）に関わらず）最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、特に最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１、最も特に最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１である。

本発明の方法の適用において考慮するべきは、抗体あるいはその活性断片の効力を高めるために用いられるアミノ酸配列における前記変換、もしくは高効力抗体あるいはその活性高効力断片を産生するための選択アミノ酸配列の使用が、高Ｋ_ｏｎ値の産生を通して、前記高効力あるいは効力の増加を獲得するということである。親和定数はＫ_ｏｆｆに対するＫ_ｏｎの数値割合であるため、同一因子によりＫ_ｏｆｆが変換されなかった場合には、増加したＫ_ｏｎは結果的に親和性の増加となり得る。したがって、本方法にしたがって産生された抗体の高効力は、Ｋ_ｏｎ値の作用であり、ｋ_ａ値（親和定数）の作用ではない。例えば、抗体分子のＣＤＲにおける選択アミノ酸配列の使用は、結合（Ｋ_ｏｎ）および解離（Ｋ_ｏｆｆ）速度定数の両方において相当な増加を生じさせ、同一因子によって両方が増加した場合には、その結果は、（より高いＫ_ｏｎに起因する）高い、あるいはより高い効力となるが、ｋ_ａの増加とはならない（Ｋ_ｏｆｆに対するＫ_ｏｎの割合が同じであるため）。逆に、高効力抗体のＣＤＲ内における前記前選択アミノ酸配列の使用が、Ｋ_ｏｆｆを減少させるがＫ_ｏｎは増加させない場合には、その結果は、より高い親和性を伴うが効力がほとんど増加していないかあるいはまったく増加していない抗体あるいはその活性断片となる。このように、Ｋ_ｏｆｆ値が単独で変化するが、Ｋ_ａにおける数的変化にも関わらずＫ_ｏｎが一定のままである（Ｋ_ａはＫ_ｏｆｆに対するＫ_ｏｎの割合であるため）状態で、効力がほとんど変換されないかあるいはまったく変換されないことが知られている。

本発明にしたがって、いくつかの簡便な方法が、Ｆａｂ断片などの抗体あるいはその活性断片の効力の測定に利用できる。そのような方法の一つはコットンラットモデルを用い、その詳細は以下に提供された実施例に開示される。別の一つは、微小中和分析である（実施例２参照）。

また、本発明にしたがって、疾病を予防または処置するためのプロセスが提供され、前記プロセスは前記疾病の危険にある、あるいは前記疾病に苦しむ患者に、治療上（あるいは予防上）効果的な量の、ここに開示された、あるいはここに開示された方法に従って産生されたポリペプチド配列を持つ高効力抗体あるいはその活性断片を投与することより成る。好ましい実施例において、前記疾病はウイルス、特に呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスのグループから選択された一つにより引き起こされる。

本発明の高効力中和抗体は、適切なヌクレオチド配列を配列し、適した細胞系列中でこれらを発現させることにより、適切な抗体遺伝子配列、すなわちアミノ酸配列を産生することによって獲得される。望ましいヌクレオチド配列は、例として合衆国特許番号５２６４５６３および５５２３３８８（その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている。）に開示されたコドンベースの突然変異誘発法を用いて産生することができる。前記方法は、オリゴヌクレオチド内の望ましいコドン部位に、任意のおよび全ての頻度のアミノ酸残基の産生が可能である。これは、望ましい部位あるいはこれらの特異的なサブセット内への任意の２０アミノ酸の完全ランダム置換を含み得る。あるいはこのプロセスは、本発明したがった新規ＣＤＲ配列などのアミノ酸鎖内の望ましい部位に、特定のアミノ酸を獲得するために実施することができる。要約すると、望ましいアミノ酸配列を発現させるための適切なヌクレオチド配列は容易に獲得でき、前記方法を用いることで、本発明の新規ＣＤＲ配列は複製することができる。これは、結果的に望ましいアミノ酸配列を持つ、抗体などのポリペプチドを合成する能力を生じさせる。例として、現在、選択した抗体の望ましいドメインのアミノ酸配列を決定することおよび、付随して、一連の置換類似体を得るために、他の望ましいアミノ酸に置換された一つあるいはそれ以上のアミノ酸を伴う相同性鎖を調製することが可能である。

前記方法を用いるにあたって認識すべきことは、遺伝子コードの縮重によって、ランダムオリゴヌクレオチド合成および部分的縮重オリゴヌクレオチド合成としての前記方法は、特定部位における特定アミノ酸残基に特性を持たせるコドンの重複性を含むが、前記方法は、可能性のある全アミノ酸配列の親組を提供し、これらを抗体構造体としての最適な機能あるいはその他の目的についてスクリーンするために用いることができるということである。前記方法は、スワ―ラ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７巻：６３７８から６３８２ページ（１９９０年）およびデブリン他、サイエンス ２４９巻：４０４から４０６ページ（１９９０年）に開示されている。あるいは、前記抗体配列は、化学的に合成することが可能であり、あるいはこの技術の属する分野における通常の技術を有する者が十分に知っているその他の方法において産生することが可能である。

ここに開示された発明にしたがって、増強抗体変異体は、単一ポリペプチド構造体に、それぞれが増強した効力あるいは生物学的活性を生じさせる、ここに開示された１つ、２つあるいはそれ以上の新規ＣＤＲ配列（例として、配列識別番号：１１から３４を参照）を結合させることにより産生することができる。この方法において、複数の新規アミノ酸配列が、望ましい水準の生物学的活性を持つ抗体を産生するために、一つの抗体中の同一あるいは異なるＣＤＲに結合することが可能である。前記の望ましい水準は、しばしばＫ_ｏｎ値が最低約２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１の抗体を産生することより生じる。

限定されない例として、３つの前記新規ＣＤＲ配列が使用され、その結果生じた抗体は、ここに開示されたコットンラットプロトコルあるいは微小中和プロトコルを用いて、効力あるいは生物学的活性についてスクリーンされ、ここで前記抗体はＲＳＶのＦ抗原などの特定の抗原構造に対して高親和性を示す。このように全体的な結果は、着実な方法における種々の単一アミノ酸置換体の結合およびその結果生じた抗体の抗原親和性および効力についてのスクリーニングの反復プロセスであり、それによって、望ましくは高い、あるいは最低でも最低限値の親和性を犠牲にすることなく、確実に効力を増加する。

本発明の新規配列および方法の使用にあったて、前記方法は、最大の効力を持つ抗体を発見する試みにおいて、可能性のある全ての抗体構造の置換および結合を産生しスクリーニングする時間と費用を回避し得る。逆に、単一１０アミノ酸残基ＣＤＲの完全無作為化は、事実上スクリーン不可能な数である、１０兆以上の変異体を産生し得る。

この反復方法は、より高い効力を持つ抗体の検出に絞るための、段階的なプロセスにおける２重および３重アミノ酸置換体を産生するために用いることができる。

逆に、種々の抗体ドメインの配列内の全ての部位が同一ではないことは認識しなければならない。特定部位におけるある種の置換は有用あるいは有害であり得る。加えて、特定の部位における特定の種類のアミノ酸の置換は、親和性に関して同様にプラスあるいはマイナスであり得る。例えば、特定の部位に可能性のある全ての疎水性アミノ酸を試みることは、必要ないであろう。任意の疎水性アミノ酸を試みる方が良いであろう。逆に、特定の部位における酸性あるいは塩基性アミノ酸は、測定される親和性の大きな増加を提供し得る。したがって、前記置換を行うことの“規定”を知ることはまた必要であるが、前記“規定”の決定は、可能性のある全ての結合および置換についての研究を必要とせず、傾向は最大数の置換より少数の置換を調べた後に明らかになるであろう。

本発明にしたがって、前記規定は、高親和性を獲得するための、必ず抗体のＣＤＲ領域内で行われるアミノ酸変換、あるいは完全新規に調製されたアミノ酸配列および合成抗体ポリペプチドを決定する。しかし現在では、高親和性はしばしば治療上の使用において有益な抗体の特性である一方、前記抗体は前記使用において実施上利益をもたらす十分な効力を常に持つわけではないということが発見されている。

すでに開示したように、親和性はＫ_ｏｎ定数およびＫ_ｏｆｆ定数の割合により測定される。例として、１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎおよび１０^−５ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｆｆは、組み合わさって１０^１０Ｍ^−１の親和定数となる（表３の値を参照）。しかし、前記高親和性を示す抗体は、有益な治療薬となるために必要な効力を欠いたままである。本発明にしたがって、抗体効力は、抗体結合反応に対するＫ_ｏｎ速度の値に依存する。したがって、抗体は、各抗原に対する親和性とは無関係に効力の増加を示し（中和抗体など）、ここで前記抗体はｋ_ａあるいはＫ_ｏｆｆとは無関係に、より高いＫ_ｏｎ値を持つ。

本発明の方法にしたがって、現行の抗体の増強効力は、その抗原親和性とは無関係に、前記抗体の一つあるいはそれ以上のＣＤＲ領域中に存在する一つあるいはそれ以上のアミノ酸の選択変換を通して獲得される。これは前記アミノ酸変換が、好ましくは抗体親和性における増加を伴う、前記抗体に対するＫ_ｏｎの増加をもたらす効果を持つためである。親和性が変化しないあるいは多少減少したとしても、より高い効力はより高いＫ_ｏｎ値を伴って獲得される。前記抗体は、適切に処理された細胞内での合成を通した必要とされるポリペプチド鎖の合成により、最も有益に産生される。前記細胞は、細胞中に、変換されたＣＤＲ分節を含む望ましいポリペプチド鎖をコードした適切なヌクレオチド配列を組込まれたものである。また本発明の方法にしたがって、望ましい水準の効力あるいは生物学的活性を持つ新規抗体は、ここに開示された遺伝子操作された細胞を用いて、あるいは完全に必要とされるポリペプチド鎖の化学合成と続いて起こる必要なジスルフィド結合の形成を通して、前記抗体ポリペプチド鎖のＣＤＲ領域内における選択部位への選択アミノ酸の組込みにより新規に調製することができる。

この点において、本発明の方法にしたがって産生された抗体は４量体、２量体あるいは単量体構造を持つ抗体であり得ることは、明確に意識すべきである。したがって、ここで用いられる“抗体”という用語は、Ｌ_２Ｈ_２、ＬＨ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）_２およびその他の断片を含む部位および断片だけでなく、自然界に通常見られるような４量体抗体分子全体も含み、前記構造体に必要なのは、ここに開示された分析およびプロトコルにより測定される生物学的活性を保持していることだけである。

前記にしたがって、本発明の抗体は高親和性モノクローナル抗体である。しかし、前記抗体は、それらが単一細胞型のクローンから得られるという意味においてのみモノクローナルである。しかし、これは、それらを特定の起源に限定することを意味するのではない。前記抗体は、ＣＨＯあるいはＣＯＳ細胞などの通常抗体を産生しない細胞中で容易に産生することができる。加えて、前記抗体は、抗体産物を形成するポリペプチド軽鎖および重鎖を発現し組み立てるように細胞を遺伝子操作することにより、その他の型の細胞、特に哺乳動物細胞そして更には植物細胞中でも産生される。加えて、前記鎖は化学的に合成することができるが、それらは特定の抗原決定基に対して特異的であるため、その用語が用いられるところの特質としての、“モノクローナル”抗体を構成し得る。したがって、ここで用いられたように、モノクローナル抗体という用語は、前記抗体の産生のために用いられる単なる機構に比べて、ここに開示された方法により産生された抗体分子の方が特異性および精製度が高いことを示すことを意図する。

また、ここで用いられたように、効力という用語は、意図された目的のために用いられた場合に、抗体濃度に対する抗体の効果の依存性を示すことを意図する。したがって、効力は特定抗原に対する生物学的活性を意味する。限定しない例として、効力あるいは生物学的活性もしくは生物学的効果は、方法の項で開示されたようなコットンラット法あるいは微小中和方法により、抗ＲＳＶ抗体に対して測定される。逆に、抗原に対する抗体の親和性は、単純にＫ_ｏｆｆに対するＫ_ｏｎの割合の数字上での測定である。

加えて、本発明の方法にしたがって産生された抗体の親和性（Ｋ_ａ）は、概して１０^１０Ｍ^−１の範囲内にある。例として、この範囲は１０^１０Ｍ^−１の上下１０倍、あるいは１０^１０Ｍ^−１より１０倍以上大きく、あるいは更には数字上１０^１０Ｍ^−１と同等であり得る。抗原に対する抗体の親和性はこの定数の値と比例する（すなわち、定数が高いほど、複合体の濃度がより高いことにより親和性はより高くなる−親和定数に対する反応式を参照）。前記定数は、（実施例１に開示されたような）抗体反応に対する標準反応速度方法論により測定される。

一つの実施例において、本発明の方法にしたがって産生された抗体（ここで“抗体”という用語が活性部位、断片あるいは分節を意味する他に、本開示の目的のための全てのものが抗体という用語の意味の中に含まれると考慮される）は、通常哺乳動物、好ましくはヒトの定常部および可変部から成り、前記可変部は重鎖および軽鎖枠組み構造領域と重鎖および軽鎖ＣＤＲから成り、ここで重鎖および軽鎖枠組み構造領域は哺乳動物抗体、好ましくはヒト抗体の特性を有する配列を持ち、そしてここでＣＤＲ配列はヒト以外の種、好ましくはマウスの抗体のＣＤＲ配列と類似する。ここで枠組み構造アミノ酸配列は、非ヒト枠組み構造アミノ酸配列の特徴を持ち、後者は好ましくはマウスである。

他の実施例において、抗体はヒト抗体であり、ここで抗体は、改良された効力を提供するためにここに開示されたようなＫ_ｏｎ値を持つ。

加えて、本発明にしたがって産生された抗体は、通常、ここに開示されたＫ_ｏｎ値を増加させるための方法の適用前と同一のエピトープに結合し得る。したがって本発明の方法の適用後、抗体は、ここに開示された方法の適用前のＣＤＲ配列と同様の、しかし完全に同一ではない、ＣＤＲ配列を持ち得る。ここで、抗体がＲＳＶなどのウイルスを中和するために用いられる場合には、前記抗体のＣＤＲの最低一つは、配列識別番号：１１から３４から選択された一つ等の高効力アミノ酸配列を含み得る。

前記の内容を持ち続けながら、またＲＳＶに対するヒト化抗体に関する本発明にしたがって開示された配列をより良く記載するために、効力が増加され得る抗体あるいはその断片の軽鎖および重鎖可変部の基本配列あるいは開始配列が図１Ａ（軽鎖可変部−配列識別番号：１）および図１Ｂ（重鎖可変部−配列識別番号：２）あるいは前記抗体のＦａｂ断片（例えば、図２ａの配列（軽鎖可変部−配列識別番号：３））および図２Ｂ（重鎖可変部−配列識別番号：４）に示される。また本発明にしたがって、これらの開始配列のものとは異なる特異的アミノ酸は、まず第一に、組換え細胞中に発現した場合に、前記アミノ酸配列を産生するように設計されたヌクレオチド配列を調製する組換え法により産生される。前記細胞産物は、本発明のモノクローナル抗体である。代わりに、前記抗体は、本発明の属する分野においてよく知られた合成法により遺伝子操作された細胞あるいは組換え細胞を使用することなく産生することができる。

本発明の一つの実施例において、効力は、Ｋ_ｏｎ値を最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１に増加させることにより、（ＲＳＶのＦ抗原に対して）最低１０^９Ｍ^−１、および好ましくは最低１０^１０Ｍ^−１の親和定数を持つ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する中和抗体を用いて、高められる。前記Ｆａｂ断片のＣＤＲ中に存在するアミノ酸は表３に示される（例えば、クローン５）。

一般的に、Ｋ_ｏｎ値を増加させるための本発明の方法の適用前後における抗体の親和定数および反応速度定数を決定するために用いられる手法は、（本発明にしたがって）望ましい抗体鎖を発現する遺伝子に対するヌクレオチド配列を産生し、これらを、標準プロトコルによりＣＯＳ−１細胞を形質転換させるために用いられるベクターに挿入するためのものである。細胞はウェル中で成育され、上清が抽出され、標準ＥＬＩＳＡ技術を用いて抗原結合について測定される。これらのポリヌクレオチドは、ＣＤＲにおける一つあるいはそれ以上のアミノ酸置換を提供するために設計され、前記ＣＤＲはその後、親和性の増加のために選択的に結合した有益な置換（これらがＫ_ｏｎ値の増加をもたらす）を伴う増加したＫ_ｏｎ値についてスクリーンされる。これらはその後続いて、基本構造あるいは参照構造に対する、ＲＳＶのＦ抗原などの各々の抗原への結合親和性についてスクリーンされ、それにより、Ｋ_ｏｎ値の増加の結果生じた親和性に大きな変化が無いことを確認する。

特異的な実施例において、本発明は、最低１０^９Ｍ^−１、好ましくは最低１０^１０Ｍ^−１、そして最も好ましくは最低１０^１１Ｍ^−１の親和定数より成る単離された抗体に関し、ここでＫ_ｏｎは、最低約２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、好ましくは最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、最も好ましくは最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１である（その組み合わせの全てを含む）。

また本発明にしたがって、前記単離抗体は、既知のあるいは新しく合成された新規の抗体であり得る。したがって、本発明の方法にしたがって産生された抗体は、自然発生哺乳動物抗体、自然発生ヒト抗体、自然発生マウス抗体、単一鎖抗体、（一つの種の抗体の定常部および異なる種の抗体の可変部を持つ）キメラ抗体、（一つの種の抗体のＣＤＲ領域と異なる種の抗体の定常部およびあるいは枠組み構造領域を持つ）ＣＤＲ移植抗体、ヒト化抗体（可変枠組み構造領域およびまたはＣＤＲ領域の選択アミノ酸が、前記配列の大部分がマウスなどの異なる種から得られたものであるにも関わらず、ヒト抗体と類似するように変換されている）、好ましくはヒト化マウス抗体、好ましくはマウス、最も好ましくはヒトの変換哺乳動物抗体（ここで、既存の抗体の選択アミノ酸は、通常基本となる抗体構造と類似した抗体構造をもたらすための遺伝子操作技術を通して、ポリペプチド鎖のいくつかの点で変換されている）、および完全合成新規抗体より成るグループから選択された抗体を含む。後者は自然には存在しないものである。

本発明はまた、特定抗原に対する前記抗体の測定Ｋ_ｏｎ値を増加させるための、抗体の可変部内のアミノ酸の選択的変換より成る、（前記のように）前記の抗体型の一つの効力を高める方法に関する。もちろん、Ｋ_ｏｎ値は、同一のアミノ酸変換に続く同一抗体と異なり得る。ここで反応は、異なる抗原あるいは抗原決定基を用いて測定される。しかし、そのような場合において、親和性はまた、抗原決定基の同一性が変換するにつれて変換する可能性がある。

また本発明の方法にしたがって、前記抗体のポリペプチドの配列内に導入されたアミノ酸変換は、好ましくは抗体の可変部のＣＤＲ部位に限定されるが、これらは枠組み構造領域に対する変換も含み得る。

しかし、最も有益なＣＤＲ配列は、通常ここに開示された方法により効力を高めることができる抗体の修飾クローンのスクリーニングにより同定されるけれども、前記高効力クローンは同定されると、その結果生じた抗体は、必要とされるヌクレオチド配列を設計するための遺伝子コードを利用して、望ましいアミノ酸配列に一致する適切なＤＮＡ配列を含む適当なベクターの動物あるいは植物細胞への導入に続き、このような細胞内での適当な重鎖および軽鎖ポリペプチドの合成を通して、その後最も有益に産生される。この手法の結果として、高効力完全新規抗体は、修飾するための既存抗体配列の選択を必要とすることなく、本発明の方法により示されたアミノ酸配列同定を用いて最初から産生することができる。したがって、ここに開示された方法は、完全新規構造の高効力抗体の産生を容易にする。ここで前記高効力抗体のＣＤＲ配列は、前記抗体の予定された抗原標的に対する特異性および親和性を損なうことなく、計画的に前記抗体のＫ_ｏｎ値を増加させるためにここに開示された方法により決定されたように、高効力ＣＤＲである。

本発明の方法の一つの実施例において、既存抗体は、Ｋ_ｏｎ値を増加させることによりその効力を高めるために修飾される。好ましい実施例において、抗体は、例えば最低約１０^９Ｍ^−１あるいは１０^１０Ｍ^−１の高親和性を伴う抗体である。抗体は、前記抗体の重鎖およびまたは軽鎖ポリペプチド内へのアミノ酸変換の導入のために、クローンあるいは遺伝子操作動物あるいは植物細胞を用いて産生される。好ましくはここで、抗体効力の増加を伴って前記抗体の特定抗原に対する結合についてのＫ_ｏｎ値を増加させるために、前記抗体変換は前記ポリペプチド鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）内へ導入される。したがって、本発明の方法は、抗体分子を産生するために有益に用いられる。ここで、配列、好ましくは前記配列の可変部、最も好ましくはＣＤＲ部位のアミノ酸変換を伴う前記抗体のＫ_ｏｎ値は、Ｋ_ｏｎ値が同一抗原に対して測定された場合に、前記アミノ酸変換前の前記抗体が示すＫ_ｏｎ値よりも高い。

通常、本発明の方法は、既知の抗体に対して適用され、前記抗体のＫ_ｏｎ値は、最低２倍、好ましくは最低５倍、そして最も好ましくは最低１０倍増加され得る。より特異的には、前記抗体のＫ_ｏｎ値は、最低約２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、好ましくは最低５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１、最も好ましくは最低７．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１まで増加する。

ここに開示された方法は、未知の新規組換え高効力抗体の設計に対して同様に有効であるため、本発明はまた、ポリペプチド配列が選択部位、特にＣＤＲ配列内に選択アミノ酸を含む抗体を調製し、その後最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎ値を、あるいは最低５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１あるいは更に７．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎ値を持つことについて、前記抗体をスクリーニングすることより成る、最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１のＫ_ｏｎ値を持つ抗体を産生する方法に関する。前記抗体は、一つあるいはそれ以上のここに開示された高効力ＣＤＲの存在の結果生じ得る。前記抗体は高Ｋ_ｏｎ値について容易に検査される。

本発明の方法は、望ましい抗原に対する親和性を持つ、高効力抗体あるいは効力増加抗体の産生に対しても利用することができるが、前記抗原は、好ましくはバクテリア、ウイルスあるいは菌類、好ましくはウイルス（例として、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））などの微生物に特有の抗原である。

他の実施例において、本発明は、前記疾病の危険にあるあるいは前記疾病に苦しむ患者に、ここに開示された方法により調製された治療上有効な量の抗体を投与することより成る、疾病を予防あるいは処置する方法に関する。したがって、前記抗体は、本発明の方法の適用により増加した効力を持つ完全新規抗体あるいは既知の臨床上有効な抗体であり得る。ここに開示された方法により調製された抗体により予防あるいは処置された疾病は、通常バクテリアおよびウイルス、好ましくはウイルス、そして最も好ましくはＲＳＶなどの微生物により引き起こされる疾病である。

このように開示された抗体はまた、通常ヒト抗体より得られた、そうでなくとも好ましくはマウスから得られた枠組み構造領域を持つ。

クローンの産生において、基本あるいは参照抗体（図１および図２に示された重鎖および軽鎖可変部（ＣＤＲプラス枠組み構造領域））は、本発明の抗体の新規ＣＤＲ配列を産生するための“鋳型”として用いられ、後者はより高いＫ_ｏｎ値を与える。単一突然変異の６個のＣＤＲライブラリーの特性を示し、そして合成するための標準方法が用いられた（ウー他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５巻：６０３７−６０４２ページ（１９９８年）参照、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている）。標的ＣＤＲは、ヌクレオチドのアニーリングの前に、最初に各ライブラリーから削除される。ライブラリーの合成のために、参照抗体（図２参照）のＣＤＲは表１のように定義された。（上記のように）本発明のＣＤＲ配列を産生するためのオリゴヌクレオチド合成のためにコドンベースの突然変異誘発が用いられた。

ライブラリーは、最高親和性変異体を同定するために、キャプチャーリフトにより最初にスクリーンされた。続いて、これらのクローンは更に、キャプチャーＥＬＩＳＡの使用および固定抗原に対する滴定により特徴付けられた。前記スクリーニングに続いて、抗体は個々のＫ_ｏｎ値についてスクリーンされ、その陽性の効果はその後、効力の測定により測定される。図４および５は、ここで用いられる調製およびスクリーニング法に対する補助的な詳細を示す。

本発明にしたがって、最高Ｋ_ｏｎ変異体由来のＤＮＡは、有益なあるいは高効力の置換体の性質を確認するために配列決定された。スクリーニング後、前記置換体の効果を最大にし、それにより高効力も示す高親和性抗体を産生するために、抗体は、単一あるいは種々の組み合わせにおいて、高Ｋ_ｏｎアミノ酸置換体について調製される。

通常、最も有益な高Ｋ_ｏｎＣＤＲは、６個のＣＤＲにおけるアミノ酸置換の結果生じることが分かっている。したがって、ここに開示された高効力（すなわち高Ｋ_ｏｎ）中和抗体は、相補性決定領域Ｌ１（あるいはＣＤＲＬ１）、Ｌ２（あるいはＣＤＲＬ２）、Ｌ３（あるいはＣＤＲＬ３）、Ｈ１（あるいはＣＤＲＨ１）、およびＨ３（あるいはＣＤＲＨ３）においてのみ［原文通り］、（例として、図１および２に示された）基本あるいは参照抗体とは異なるアミノ酸配列を含む。

したがって、図３のアミノ酸配列のために、図２の配列の選択アミノ酸は、図２に示された重鎖および軽鎖配列を持つ抗体の効力を増加させるための手段として置換された。

ここに開示された方法によって生じた選択高Ｋ_ｏｎ抗体（およびその活性断片）は、表２に示される（その全てが図２の枠組み構造配列を持つ）。ここで参照クローンは、図２に示された重鎖および軽鎖可変部配列（軽鎖および重鎖配列それぞれに対して配列識別番号：３および４）を持つクローンである。

表２は、ここに開示された方法にしたがって調製された高効力抗体に用いられる高Ｋ_ｏｎＣＤＲのアミノ酸配列（標準アミノ酸一文字アルファベットコードで表記された全配列）を示す。表２において、対応する表１のＣＤＲにおいてなされた主要なアミノ酸置換の部位（すなわち、アミノ酸においてＣＤＲの異なる部位）は、太文字および下線で示される。

本発明にしたがって、同一抗体分子に一つ以上起こる前記アミノ酸置換を組み合わせることにより、ここに開示された抗体の効力を大きく増加させることが可能となった。

通常、抗体のＫ_ｏｎおよび効力間には相互関係があり、前記抗体は一つ以上の有益なあるいは高いＫ_ｏｎＣＤＲを持つ全てのより高いＫ_ｏｎ変異体を伴い、全６個のＣＤＲが置換された変異体も含む。

一つの実施例において、増加したＫ_ｏｎを持つように調製された抗体は、最低１０^９Ｍ^−１および好ましくは最低１０^１０Ｍ^−１の親和性を伴うＲＳＶ中和抗体であり、また重鎖および軽鎖についてのヒト定常部および枠組み構造を含むヒト化抗体である。ここで少なくとも枠組み構造の一部分はヒト抗体から（あるいはヒト抗体枠組み構造の共通配列から）得られる。

他の実施例において、枠組み構造の全てがヒト抗体（あるいはヒト共通配列）から得られる。

他の実施例において、本発明にしたがって産生された抗体は、最低１０^９Ｍ^−１および好ましくは最低１０^１０Ｍ^−１の親和性を伴い、ヒト定常部、最低一つのＣＤＲにおける最低一つのアミノ酸が変換された非ヒト抗体から得られた一つあるいはそれ以上のＣＤＲおよび枠組み構造の全てあるいは一部分がヒト抗体（あるいはヒト抗体枠組み構造の共通配列）から得られたものを持つ移植抗体である。

望ましいＣＤＲ配列と定常部および枠組み構造配列が既知であるならば、望ましい配列を持つ遺伝子は、組み立てられそして種々のベクターを用いて、機能的４量体抗体分子の発現のために適切な細胞中に挿入することができる。これとすでに開示された方法論の組み合わせにより、単一突然変異ライブラリーの組立てが可能となる。ここで抗体は対応する移植抗体と同一の配列を所有し、それにより同一の構造および結合親和性を持つ。

表２に開示されたＣＤＲ配列の組み合わせは、完全４量体抗体分子あるいはＦａｂ断片などの活性断片において存在し得る。表３に示されたクローン１から１５に対する効力データはＦａｂ断片に対するものであり、一方表３のクローン１６および１７に対するデータは完全抗体分子に対するものである（クローン１６は、ジョンソン他（１９９７年）に開示された配列を持つＭＥＤＩ−４９３である）。

本発明に基づく完全抗体分子は、配列識別番号：３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１および５３より成るグループから選択された重鎖配列（可変部プラス定常部）を持ち、配列識別番号：３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４より成るグループから選択された軽鎖配列（可変部プラス定常部）を伴う抗体分子を含む。

本発明の比較的高いＫ_ｏｎの抗体は、比較的精製あるいは単離された状態として、同じくウェル中であるいはプレート上で生育された細胞から抽出した上清として存在し得る。したがって本発明の抗体はまた、本発明の抗体より成る組成物の形状として存在し得る。そしてここで前記抗体は、薬理学的許容希釈剤あるいは賦形剤中に懸濁される。本発明の抗体は、濃縮された組成物あるいは、疾病の処置あるいは予防（例として、感染に伴って発症するぜん息およびぜん鳴のより高い発生率を伴うＲＳＶの予防）において治療上あるいは薬理学上の有益な価値を持つ量として存在し得る。前記抗体はまた、より希釈された状態の組成物として存在し得る。

続いて、本発明はまた、疾病、特にウイルス疾病、最も特に呼吸器合胞体ウイルス感染を予防およびまたは処置する方法の提供に指向する。前記方法は、前記疾病の危険のある患者あるいは前記疾病に苦しむ患者に、治療上有効な量のここに開示された抗体組成物を投与することより成る。

一つの特定の実施例において、本発明の高効力中和抗体は、図３（表２に特定されたクローン１５のＣＤＲを持つクローン１５に対する配列識別番号：１０１および１０２）の配列を持つ。

本発明の増加Ｋ_ｏｎ抗体は、アミノ酸分節のスプライシングにより、実際の中和抗体から得られたＣＤＲ領域および非ＣＤＲ領域から組み立てることができる（そして組み立てられた抗体はここに開示された発明内の範囲内にある）一方、本発明の抗体は、適切な遺伝子配列を、遺伝子操作された細胞による組み立てられた抗体分子の最終的な発現のために、処理後適切な細胞系列に形質移入されるベクター内に、遺伝子操作することにより最も容易に調製されることは、考慮されるべきである。実際、前記組換え方法は、ここに開示された抗体を調製するために用いられる。加えて、高親和性抗体鎖の配列がここでの開示から公知であるため、前記抗体はまた、適切な鎖の直接合成により組み立てることができ、その後４量体抗体構造への自己組み立てが可能である。

一般材料および方法
モノクローナル抗体
ＭＥＤＩ−４９３は、マウスＭＡｂ１１２９の抗原結合決定基を含むＩｇＧ_１（ＣＯＲ）／カッパ（Ｋ１０２）ヒト化ＭＡｂ（図１に示された重鎖および軽鎖可変部配列）である（ジョンソン他、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１７６巻、１２１５から１２２４ページ（１９９７年）；ベーラーとヴァン ウィック コーリン、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６３巻、２９４１から２９５０ページ（１９８９年））。

ＲＳＶ融合抑制分析
細胞へのウイルス付着後のＲＳＶの引き起こす融合を妨げる抗体の能力は、融合抑制分析において測定された。この分析は、細胞が抗体の添加前に４時間、ＲＳＶ（ロング）に感染されることを除いて、微小中和分析と同一である（テーラー他、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７３巻、２２１７から２２２３ページ（１９９２年））。

ＢＩＡｃｏｒｅ分析
ＭＡｂｓのエピトープ分析は、プラスミン共鳴微小流体素子工学システムと共に、ＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサー（ＢＩＡｃｏｒｅ、ピスケータウェイ、ニュージャージー）を用いて行われた（カールソン他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．メソッズ、１４５巻、２２９から２４０ページ（１９９１年）；ジョン、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９巻、６５から７１ページ（１９９８年））。この分析のために用いられる抗原は、バキュロウイルスで発現する切端ＲＳＶ（Ａ２）Ｆタンパク質（アミノ酸１から５２６）である。精製ＲＳＶ Ｆタンパク質は、製造プロトコルにしたがって、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド／ｌ−エチル−３−〔３−ジメチルアミノプロピル〕−カルボジイミド−活性化ＣＭ５センサーチップと共有結合し、未反応活性エステルグループは、１Ｍエタノールアミンで反応させた。１μＭあるいは１０μＭのＭＥＤＩ−４９３の初期注入の後に、ＨＢＳＳ洗浄段階が続き、その後ＭＥＤＩ−４９３あるいはＲＨＳＺ１９の２次注入が続く。センサーグラムは、ＢＩＡ数値算出ソフトウェアを用いて分析した。

等温滴定熱量測定
各ＲＳＶ Ｆタンパク質に対するＭＡｂの分解親和性は、等温滴定熱量測定により測定された（ワイズマン他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７９巻、１３１から１３７ページ（１９８９年））。４．５μＭ ＲＳＶ Ｆタンパク質の溶液１．４ｍＬが、２６μＭ ＭＥＤＩ−４９３あるいはＲＳＨＺ１９の５．５μＬの注入で滴定された。ＭＡｂの各注入後、結合の量と比例する熱放出量が測定された。用いられた抗原は、ショウジョウバエ細胞中で発現するＲＳＶ（Ａ２）Ｆタンパク質切端（アミノ酸２５−５２４）である。滴定は、ノイズに対する最適シグナルを獲得するために４４℃および５５℃で行われた。これらの温度におけるＭＡｂｓおよびＦタンパク質の熱安定性は、円偏光二色性変性実験により示された。親和性は、生体内データとの比較のため、完全なファントホッフの式を用いて３７℃に調整された（ドイルとヘンスリー、メソッズ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２９５巻、８８から９９ページ（１９９８年））。ファントホッフ調整は、熱量測定により直接測定されたＦタンパク質結合エンタルピー変化にのみ基づく。ＭＥＤＩ−４９３およびＲＳＨＺ１９に対する結合エンタルピー変化は非常に類似していることが発見されたため、それらのＫｄｓに対する温度調節はほぼ同一であった。

コットンラット予防法
生体内効力はコットンラットモデルを用いて測定される（プリンス他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、５５巻、５１７から５２０ページ（１９８５年））。コットンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ ｈｉｓｐｉｄｕｓ、平均体重１００グラム）は、メトキシフルランで麻酔され、放血され、投与量５、２．５、１．２５、０．６２５ｍｇ／ｋｇ体重の精製ＭＡｂあるいは５ｍｇ／ｋｇ体重のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コントロールの０．１ｍＬが、筋肉内注射（ｉ．ｍ．）により注入された。２４時間後、動物は再び麻酔され、血清ＭＡｂ濃度測定のために放血され、１０^５ＰＦＵのＲＳＶのＡ（ロング）あるいはＢ（１８５３７）変種の鼻腔内点滴注入（ｉ．ｎ．）により、免疫有効性が試験された。４日後、動物は犠牲となり、その肺は回収された。肺は、ハンクス調整塩溶液の１０パーツ（ｗｔ／ｖｏｌ）中でホモジネートされ、その結果生じた懸濁液は、プラーク分析による肺疾患ウイルス力価を測定するために用いられた。免疫有効性試験時の血清抗体力価は、抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡにより測定される。

（実施例１）
ＢＩＡｃｏｒｅＴＭによるヒト化ＲＳＶ Ｍａｂｓの反応速度分析
高親和性坑ＲＳＶ ＭａｂｓおよびＲＳＶ Ｆタンパク質の間の相互作用の反応速度は、ファルマシアＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサーを用いて、表面プラスモン共鳴により研究された。Ｃ末端切端Ｆタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスは、反応速度試験に対する抗原の豊富な源を提供した。分泌されたＦタンパク質を含む上清は、コンカナバリンＡおよびＱセファロースカラムでの連続クロマトグラフィーにより、おおよそ２０倍に濃縮された。プールされた分画は、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）に対して透析され、おおよそ０．１ｍｇ／ｍｌに濃縮された。典型的な実験において、Ｆタンパク質の一部（１００ｍｌ）は、ＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップにアミン結合した。（合衆国特許番号５８２４３０７（その開示は引用例としてここに組み込まれている）において調製された）Ｈ１１２９あるいはＨ１３０８Ｆで飽和した場合において、固定された量は、シグナルのおおよそ２０００反応単位（Ｒ_ｍａｘ）であった。これは、結合方法を伴うＦタンパク質調製において、同数の“Ａ”および“Ｃ”抗原部位が存在することを示す。２つの関連のないＭａｂｓ（ＲＶＦＶ ４Ｄ４およびＣＭＶ Ｈ７５８）は、固定されたＦタンパク質と相互作用を示さなかった。典型的な反応速度試験は、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ）中の異なる濃度（２５−３００ｎＭ）での３５ｍｌのＭａｂの注入を伴う。流出速度は５ｍｌ／ｍｉｎに維持され、７分間の結合段階を与えた。Ｍａｂの注入に続いて、解離速度を測定するために、流出は３０分間ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液に変換された。センサーチップは、１０ｍＭ ＨＣｌの２分間のパルスでのサイクル間で再生された。再生段階は、固定Ｆタンパク質の結合能力の損失を最小限にした（サイクル当たり４％の損失）。この微量の減少は、（それぞれＫ_ｏｎおよびＫ_ｏｆｆとも呼ばれる）結合および解離の速度定数の算定値を変化させなかった。

より特異的には、Ｋ_{ａｓｓｏｃ}（あるいはＫ_ｏｎ）の測定のために、Ｆタンパク質は、ＥＤＣ／ＮＨＳ法（ＥＤＣ＝Ｎ−エチル−Ｎ′―〔３−ジエチルアミノプロピル〕−カルボジイミド）により直接固定された。要約すると、１０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０におけるＦタンパク質の４μｇ／ｍｌは調製され、約３０μｌ注入が、上記条件下で約５００ＲＵ（反応単位）の固定Ｆタンパク質を生じた。ブランク流出細胞（ＶｎＲ固定ＣＭデキストラン表面）は、反応速度分析のために差し引かれた。カラムは１００ｍＭ ＨＣｌ（完全再生に必要な７２秒の一定時間を伴う）を用いて再生することができた。この処置は、固定抗原を損傷させること無く完全に結合Ｆａｂを除去し、４０超の再生に用いることができた。Ｋ_ｏｎ測定に対して、Ｆａｂ濃度は、１２．５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭおよび４００ｎＭであった。解離段階は、２３０秒（解離段階の開始後３０秒）から９００秒まで分析された。反応速度は、１：１ラングミュアフィッティング（グローバルフィッティング）により分析された。測定は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％（ｖ／ｖ）サーファクタントＰ２０）中で行われた。

無作為配列クローンの測定については、ここに開示されたように、Ｋ_ｏｎおよびＫ_ｏｆｆは別々に測定された。Ｋ_ｏｎは、単一突然変異クローンについての場合と同一条件で測定され、同様に分析された。

Ｋ_ｏｆｆ（あるいはＫ_{ｄｉｓｓｏｃ}）の測定のために、以下の条件が適用された。要約すると、４１００ＲＵのＦタンパク質は、ブランクとして用いられるＣＭ−デキストランに（上記のように）固定された。ここで、３０００ＲＵのＦａｂが（装置誤差を相殺するには十分高い解離Ｆａｂで）結合した。ＨＢＳプラス５ｎＭ Ｆタンパク質（Ｋ_{ｄｉｓｓｏｃ}あるいはＫ_ｏｆｆ−解離平衡定数よりも約３５０から２０００倍高い）は、緩衝液として用いられた。解離段階は、５μｌ／ｍｉｎの流出速度で６から１５時間であった。ここで用いられた条件下において、解離Ｆａｂの再結合は最小であった。更なる詳細については、バイオセンサー付属の操作説明書を参照されたい。

ここに開示された、Ｆタンパク質あるいはＲＳＶ上のその他のエピトープ部位に対する高親和性抗ＲＳＶ抗体の結合は、結合についての二次次数速度定数に対する解離についての一次次数速度定数の割合（Ｋ_ｄ＝Ｋ_ｄｉｓｓ／Ｋ_{ａｓｓｏｃ}）から算出された。Ｋ_{ａｓｓｏｃ}の値は、以下の速度式に基づいて算出された：
ｄＲ／ｄｔ＝Ｋ_{ａｓｓｏｃ}［Ｍａｂ］Ｒ_ｍａｘ−（Ｋ_{ａｓｓｏｃ}［Ｍａｂ］＋Ｋ_ｄｉｓｓ）Ｒ
ここで、ＲおよびＲ_ｍａｘは、それぞれ時間ｔおよび無限大における反応単位である。Ｒの関数としてのｄｒ／ｄｔのプロットは、（Ｋ_{ａｓｓｏｃ}［Ｍａｂ］＋Ｋ_ｄｉｓｓ）の傾きを与える。これらの傾きは［Ｍａｂ］と比例の関係にあるため、Ｋ_{ａｓｓｏｃ}値は、傾き対［Ｍａｂ］の再プロットから得ることができる。新しい直線の傾きは、Ｋ_{ａｓｓｏｃ}に等しい。Ｋ_ｄｉｓｓ値は、Ｙ切片から推定することができるが、より正確な値がＫ_ｄｉｓｓの直接測定により測定された。Ｍａｂの注入段階に続いて、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液は、センサーチップを横断して流出する。この時点から［Ｍａｂ］＝０である。したがってｄＲ／ｄｔに対する上記の式は、次のように縮小される：
ｄｒ／ｄｔ＝Ｋ_ｄｉｓｓＲ あるいは ｄＲ／Ｒ＝Ｋ_ｄｉｓｓｄｔ
この式の積分は次のようになる：
Ｉｎ（Ｒ_０／Ｒ_ｔ）＝Ｋ_ｄｉｓｓｔ
ここで（Ｒ_０／Ｒ_ｔ）は、それぞれ０時（解離段階の開始）およびｔ時における反応単位である。最後に、ｔの関数としてのＩｎ（Ｒ_０／Ｒ_ｔ）のプロッティングは、Ｋ_ｄｉｓｓの傾きを与える。ここでの好ましい実施例において、前記抗体変異種から得た数値は表３に示される。

表２および３におけるクローンについて、参照クローンは、図２に示された配列および表１に示されたＣＤＲを持つＦａｂ断片である。クローン１から１５は、図２の枠組み構造配列および、表２（ここで“Ｘ”は、高効力ＣＤＲ（すなわち、参照配列に対するその存在が、高い効力および参照Ｆａｂよりも高い効力をもたらすＣＤＲ）を示す。）に表示されたクローン１から１５のＣＤＲ結合を持つＦａｂ断片である。ここで表２のＣＤＲの項の次に“Ｘ”が無いものは、（表１および図２の）参照Ｆａｂに相当する配列である。

表４における結果は、ＩＣ_５０値（あるいは、表３と同様のコントロールと比較して５０％の抑制を生じるμｇ／ｍｌ濃度）に関して、Ｆａｂ断片と完全４量体抗体分子を比較する。表のクローン１６は、表２に開示されたＣＤＲを持つ参照抗体である。

表３のクローン１６および１７は、図１の枠組み構造配列およびジョンソン他（１９９７年）に開示された定常部を持つ、事実上のモノクローナル抗体である。これらの抗体の枠組み構造配列は、Ｆａｂ断片がわずかに異なりうる。

表４のクローン１８から２６は、クローン１６および１７と類似するが、高効力ＣＤＲ配列を持つ４量体抗体分子である。抗体クローン２１は、Ｆａｂクローン９と同一のＣＤＲ配列を持ち、抗体クローン２２は、Ｆａｂクローン１０と同一のＣＤＲ配列を持ち、抗体クローン２３は、Ｆａｂクローン１１と同一のＣＤＲ配列を持ち、抗体クローン２４は、Ｆａｂクローン１２と同一のＣＤＲ配列を持ち、抗体クローン２５は、Ｆａｂクローン１３と同一のＣＤＲ配列を持ち、そして抗体クローン２６は、Ｆａｂクローン１５と同一のＣＤＲ配列を持つ。表３の抗体クローン１８、１９および２０は、表２に特定されたＣＤＲ結合を伴う全長４量体抗体である。これらの抗体の枠組み構造配列は、Ｆａｂ断片がわずかに異なり得る。

表２のＣＤＲ配列の下線のアミノ酸は、本発明の方法により産生される高効力抗体の高効力ＣＤＲ内の主要部位に位置するアミノ酸残基を表す。例えば、より高いＫ_ｏｎ値をもたらすことにより抗体の効力を高めるために、参照抗体についての表１において、太文字および下線の残基としてここで示唆された主要部位に位置するアミノ酸は、表２においてＣＤＲの下に表記された（そしてまた太文字と下線の引かれた）アミノ酸により置換され得る。したがって、これらの一文字コードは、効力を高めることができる参照抗体についての図２に示されるＣＤＲの主要部位（あるいは決定的な部位）（表２の配列における太文字で示された残基）において、参照アミノ酸を置換するアミノ酸を表す。

表４のクローンについては、クローン１８は、配列識別番号：４１（重鎖）および４２（軽鎖）により特定される全長配列を持ち、クローン１９は、配列識別番号：４５（重鎖）および４６（軽鎖）により特定される全長配列を持ち、クローン２０は、配列識別番号：４７（重鎖）および４８（軽鎖）により特定される全長配列を持ち、クローン２１は、配列識別番号：５１（重鎖）および５２（軽鎖）により特定される全長配列を持ち、クローン２２は、配列識別番号：５３（重鎖）および５４（軽鎖）により特定される全長配列を持ち、クローン２３は、配列識別番号：４９（重鎖）および５０（軽鎖）により特定される全長配列を持ち、クローン２４は、配列識別番号：４３（重鎖）および４４（軽鎖）により特定される全長配列を持ち、クローン２５は、配列識別番号：３７（重鎖）および３８（軽鎖）により特定される全長配列を持ち、そしてクローン２６は、配列識別番号：３９（重鎖）および４０（軽鎖）により特定される全長配列を持つ。

ここで、クローン１８（ＩｇＧ）およびクローン２７（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持ち、クローン１９（ＩｇＧ）およびクローン２９（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持ち、クローン２０（ＩｇＧ）およびクローン２８（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持ち、クローン２１（ＩｇＧ）およびクローン９（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持ち、クローン２２（ＩｇＧ）およびクローン１０（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持ち、クローン２３（ＩｇＧ）およびクローン１１（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持ち、クローン２４（ＩｇＧ）およびクローン１２（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持ち、クローン２５（ＩｇＧ）およびクローン１３（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持ち、クローン２６（ＩｇＧ）およびクローン１５（Ｆａｂ）は同一ＣＤＲを持つ。したがって、表４のデータは、Ｆａｂ断片の活性と完全抗体分子の活性との関連性を示す。

したがって、本発明は完全４量体高効力中和抗体を含み、ここで前記抗体は、配列識別番号：３７、３９、４１、４５、４７、４９、５１および５３より成るグループから選択された重鎖アミノ酸配列および、配列識別番号：３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４より成るグループから選択された軽鎖アミノ酸配列を持ち、好ましくはここで前記抗体は、クローン１８−２６の抗体である。

（実施例２）
微小中和分析
本発明の抗体の中和は、微小中和分析により測定された。この微小中和分析は、アンダーソン他により開示された方法（“酵素免疫測定法に基づく呼吸器合胞体ウイルスに対する微小中和試験”、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２２巻、１０５０から１０５２ページ（１９８５年）、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている）の改良法である。ここで用いられた方法は、ジョンソン他（Ｊ．インフェクシャス ディジージーズ、１８０巻、３５から４０ページ（１９９９年）、その開示は全体で引用例としてここに組み込まれている）に開示されている。抗体希釈は、９６ウェルプレートを用いた三つ組み中で行われた。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ−ロング株）の１０ＴＣＩＤ_５０は、９６ウェルプレートのウェル中で、３７℃で２時間試験するために、種々の抗体（あるいはＦａｂ）希釈濃度でインキュベートされた。ＲＳＶ感受性ＨＥｐ−２細胞（２．５×１０^４）が、その後各ウェル中に添加され、３７℃、５％二酸化炭素濃度で５日間培養された。５日後、培地は吸引され、細胞は洗浄され、８０％メタノールおよび２０％ＰＢＳでプレートに固定された。ＲＳＶ複製は、その後Ｆタンパク質の発現により測定された。固定細胞は、ビオチン接合抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体（ｐａｎＦタンパク質、Ｃ部位特異的ＭＡｂ １３３−１Ｈ）と共にインキュベートされ、洗浄された。そして西洋ワサビペルオキシダーゼ接合アビジンが、ウェルに添加された。ウェルは、再び洗浄され、基質ＴＭＢ（チオニトロ安息香酸）の代謝量は、４５０ｎｍで測定された。中和力価は、４５０ｎｍの吸光度（ＯＤ_４５０）において、ウイルス単独コントロール細胞に対して最低５０％の減少を引き起こす抗体濃度として表された。

Claims (57)

1. 免疫学的活性部位、断片あるいは分節を含有する、ビタキシン以外の一つの高効力抗体であって、最低２．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１のＫ_ｏｎを持つ抗体。
2. 請求項１記載の高効力抗体であって、ここで前記Ｋ_ｏｎが最低約５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であることを特徴とする抗体。
3. 請求項１記載の高効力抗体であって、ここで前記Ｋ_ｏｎが最低約７．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であることを特徴とする抗体。
4. 請求項１記載の高効力抗体であって、ここで前記抗体が中和抗体であることを特徴とする抗体。
5. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が微生物上に検出される抗原決定基に対して特異性を持つことを特徴とする抗体。
6. 請求項５記載の高効力中和抗体であって、ここで前記微生物がウイルス、バクテリアおよび菌類より成るグループから選択されることを特徴とする抗体。
7. 請求項５記載の高効力中和抗体であって、ここで前記微生物がウイルスであることを特徴とする抗体。
8. 請求項７記載の高効力中和抗体であって、ここで前記ウイルスが呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）より成るグループから選択されることを特徴とする抗体。
9. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体がガン細胞上に検出される抗原に対して特異的であることを特徴とする抗体。
10. 請求項１記載の高効力抗体であって、ここで前記抗体が毒性物質あるいは毒性物質の産物に対して特異的であることを特徴とする抗体。
11. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が最低約１０^９Ｍ^−１の親和定数（Ｋ_ａ）を持つことを特徴とする抗体。
12. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が最低約１０^１０Ｍ^−１の親和定数（Ｋ_ａ）を持つことを特徴とする抗体。
13. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が最低約１０^１１Ｍ^−１の親和定数（Ｋ_ａ）を持つことを特徴とする抗体。
14. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が６．０ｎＭ以下のＥＣ_５０を持つことを特徴とする抗体。
15. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が３．０ｎＭ以下のＥＣ_５０を持つことを特徴とする抗体。
16. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が１．０ｎＭ以下のＥＣ_５０を持つことを特徴とする抗体。
17. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が一つあるいはそれ以上の高効力相補性決定領域（ＣＤＲ）より成ることを特徴とする抗体。
18. 請求項１７記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が最低２つの高効力ＣＤＲより成ることを特徴とする抗体。
19. 請求項１８記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が最低４つの高効力ＣＤＲより成ることを特徴とする抗体。
20. 請求項１９記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が６つの高効力ＣＤＲより成ることを特徴とする抗体。
21. 請求項１９記載の高効力中和抗体であって、ここで前記高効力ＣＤＲが、軽鎖ＣＤＲＬ１（ＣＤＲＬ１）、Ｌ２（ＣＤＲＬ２）、Ｌ３（ＣＤＲＬ３）および重鎖ＣＤＲＨ１（ＣＤＲＨ１）、Ｈ２（ＣＤＲＨ２）、Ｈ３（ＣＤＲＨ３）それぞれのうちの一つより成ることを特徴とする抗体。
22. 請求項１７記載の高効力中和抗体であって、ここで前記高効力ＣＤＲが、ＣＤＲＬ１に対しては配列識別番号：１１、１２、１３および５６、ＣＤＲＬ２に対しては配列識別番号：１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、５７および５８、ＣＤＲＬ３に対しては配列識別番号：２３、ＣＤＲＨ１に対しては配列識別番号：２４および２５、ＣＤＲＨ２に対しては配列識別番号：２６、２７、２８、２９、３０および５５、ＣＤＲＨ３に対しては配列識別番号：３１、３２、３３および３４より成るグループから選択されたアミノ酸配列を持つことを特徴とする抗体。
23. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が、配列識別番号：３７、３９、４１、４５、４７、４９、５１および５３より成るグループから選択された重鎖アミノ酸配列および配列識別番号：３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４より成るグループから選択された軽鎖アミノ酸配列を持つことを特徴とする。
24. 高効力中和抗体を産生するための一つのプロセスであって、（ａ）前選択アミノ酸配列を持つ一つあるいはそれ以上の枠組み構造およびまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖および軽鎖可変部より成る、免疫学的活性断片を含有する組換え抗体の産生、（ｂ）前記抗体が試験管内で選択された抗原に反応した場合の高結合速度定数（Ｋ_ｏｎ）に対する前記組換え抗体のスクリーニング、および（ｃ）前記高結合速度定数（Ｋ_ｏｎ）を持つ抗体の選択、より成るプロセス。
25. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記Ｋ_ｏｎが最低３×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であることを特徴とするプロセス。
26. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記Ｋ_ｏｎが最低１０^６Ｍ^−１ｓ^−１であることを特徴とするプロセス。
27. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで高Ｋ_ｏｎをもたらす前選択アミノ酸配列が、抗体の枠組み構造領域および最低一つのＣＤＲ領域の両方に存在することを特徴とするプロセス。
28. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで高Ｋ_ｏｎをもたらす前選択アミノ酸配列が、抗体の枠組み構造領域および最低２つのＣＤＲ領域の両方に存在することを特徴とするプロセス。
29. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで高Ｋ_ｏｎをもたらす前選択アミノ酸配列が、抗体の枠組み構造領域および最低４つのＣＤＲ領域の両方に存在することを特徴とするプロセス。
30. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで高Ｋ_ｏｎをもたらす前選択アミノ酸配列が、抗体の枠組み構造領域および６つのＣＤＲ領域の両方に存在することを特徴とするプロセス。
31. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記抗体が、段階（ｂ）において最低１０^９Ｍ^−１の親和定数について更にスクリーンされることを特徴とするプロセス。
32. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記抗体が、段階（ｂ）において最低１０^１０Ｍ^−１の親和定数について更にスクリーンされることを特徴とするプロセス。
33. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記抗体が、段階（ｂ）において最低１０^１１Ｍ^−１の親和定数について更にスクリーンされることを特徴とするプロセス。
34. 請求項２４記載のプロセスであって、ここで前記高親和定数が最低１０^１０Ｍ^−１であり前記高結合定数が最低５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であることを特徴とするプロセス。
35. 高効力中和抗体を産生するための一つのプロセスであって、枠組み構造領域およびまたは最低一つのＣＤＲが高Ｋ_ｏｎＣＤＲであり、前記ＣＤＲの存在が結果的に高Ｋ_ｏｎをもたらす相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する重鎖および軽鎖可変部より成る組換え抗体を産生することより成るプロセス。
36. 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記組換え高Ｋ_ｏｎ抗体が最低２つの高Ｋ_ｏｎＣＤＲを包含することを特徴とするプロセス。
37. 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記組換え高Ｋ_ｏｎ抗体が最低４つの高Ｋ_ｏｎＣＤＲを包含することを特徴とするプロセス。
38. 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記組換え高Ｋ_ｏｎ抗体が６つの高Ｋ_ｏｎＣＤＲを包含し、ここで前記高効力ＣＤＲが軽鎖ＣＤＲＬ１（ＣＤＲＬ１）、Ｌ２（ＣＤＲＬ２）、Ｌ３（ＣＤＲＬ３）および重鎖ＣＤＲＨ１（ＣＤＲＨ１）、Ｈ２（ＣＤＲＨ２）、Ｈ３（ＣＤＲＨ３）それぞれのうちの一つより成ることを特徴とするプロセス。
39. 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記Ｋ_ｏｎが最低５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であることを特徴とするプロセス。
40. 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記Ｋ_ｏｎが最低７．５×１０^５Ｍ^−１ｓ^−１であることを特徴とするプロセス。
41. 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記抗体がまた最低１０^９Ｍ^−１の親和定数（Ｋ_ａ）を持つことを特徴とするプロセス。
42. 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記抗体がまた最低１０^１０Ｍ^−１の親和定数（Ｋ_ａ）を持つことを特徴とするプロセス。
43. 請求項３５記載のプロセスであって、ここで前記抗体がまた最低１０^１１Ｍ^−１の親和定数（Ｋ_ａ）を持つことを特徴とするプロセス。
44. 抗体の効力を高めるための一つのプロセスであって、前記抗体の測定されたＫ_ｏｎ値を増加させるために、抗体の可変部枠組み構造領域およびまたはＣＤＲ領域内の一つあるいはそれ以上のアミノ酸を選択的に変換することより成るプロセス。
45. 請求項４４記載のプロセスであって、ここでアミノ酸変換が前記可変部のＣＤＲ部位に限定されることを特徴とするプロセス。
46. 請求項４４記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸変換前の前記抗体の親和性が最低１０^９Ｍ^−１であることを特徴とするプロセス。
47. 請求項４４記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸変換前の前記抗体の親和性が最低１０^１０Ｍ^−１であることを特徴とするプロセス。
48. 請求項４４記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸変換前の前記抗体の親和性が最低１０^１１Ｍ^−１であることを特徴とするプロセス。
49. 請求項４４記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸変換後のＫ_ｏｎ値が最低５×１０^５Ｍ^−１ｓｅｃ^−１であることを特徴とするプロセス。
50. 請求項４４記載のプロセスであって、ここで前記アミノ酸変換後のＫ_ｏｎ値が最低１０^６Ｍ^−１ｓｅｃ^−１であることを特徴とするプロセス。
51. 疾病を予防あるいは処置するための一つのプロセスであって、前記疾病の危険にあるあるいは前記疾病に苦しむ患者に、治療上効果的な量の請求項１、２４、３５および４４の抗体より成るグループから選択された抗体あるいはその断片を投与することより成るプロセス。
52. 請求項５１記載のプロセスであって、ここで前記疾病がウイルスにより引き起こされることを特徴とするプロセス。
53. 請求項５２記載のプロセスであって、ここで前記ウイルスが呼吸器合胞体ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスより成るグループから選択されることを特徴とするプロセス。
54. 請求項５１記載のプロセスであって、ここで抗体あるいはその活性断片が、配列識別番号３５のアミノ酸配列を持つ軽鎖可変部および配列識別番号３６のアミノ酸配列を持つ重鎖可変部を持つことを特徴とするプロセス。
55. 請求項５１記載のプロセスであって、ここで前記抗体がＦａｂ断片であることを特徴とするプロセス。
56. 請求項４記載の高効力中和抗体であって、ここで前記抗体が最低約１０^９Ｍ^−１の親和定数（Ｋ_ａ）を持つことを特徴とする抗体。
57. 最低一つの軽鎖および最低一つの重鎖を持つ高効力中和抗体であって、ここで前記軽鎖が配列識別番号：３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２および５４より成るグループから選択され、前記重鎖が配列識別番号：３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１および５３より成るグループから選択されることを特徴とする抗体。

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