JP2006500905A - ヒト化gm−csf抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2002年2月13日出願の、ここにその全部を参考文献として合体させる出願第60/355,838号の優先権を主張する。
本発明は、分子免疫学の分野、一般に、タンパク質の発現に有用なベクター、特に、完全ヒト、ヒト化、及びキメラ抗体などの抗体、更に、真核細胞、特に哺乳動物細胞において、前記抗体とタンパク質又はタンパク質フラグメントを組み込んだ融合タンパク質、に関する。その結果得られる抗体と融合タンパク質も、本発明の特徴をなす。
ヒトの治療用にマウス抗体を使用することにおける1つの重大な問題は、それらによって、患者におけるその抗体の効力を低下させ、その連続投与を妨げるヒト抗マウス反応(HAMA)が即座に生じることである。他の、ヒト以外の種由来の抗体の投与でも類似の問題が生じる。この問題を克服する1つのアプローチは、所謂「キメラ」抗体を作り出すことである。これらは、マウス可変領域と、ヒト定常領域とを含むことができる(ブリアンヌ(Boulianne)他(1984) Nature 312(5995):643-646;ここにその全部を参考文献として合体させる)。キメラ抗体はマウス配列を含み、ヒトにおいて抗マウス反応を引き出す可能性があるが(ロ・ブリオ(LoBuglio)他(1989) Proc Natl. Acad. Sci. USA 86(11):4220-4224;ここにその全部を参考文献として合体させる)、血液病(例えば、非ホジキンリンパ腫;ヴィツィッヒ(Witzig)他(1999) J. Clin. Oncol. 17 (12):3793-3803;ここにその全部を参考文献として合体させる)又は自己免疫性疾患(例えば、関節リウマチ、慢性炎症腸疾患;ファン・デン・ボッシュ(Van den Bosch)他,Lancet 356 (9244):1821-2 (2000)、ここにその全部を参考文献として合体させる)の領域におけるキメラ抗体でのトライアルによって、FDAの承認が得られ、これらの分子が大きな臨床的な可能性と有効性を有するものであることが示されている。
本発明は、抗体、特に、完全ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、および、これらを含有する融合タンパク質等のタンパク質の発現に有用な発現ベクターを提供する。軽鎖と重鎖との両方を発現することができる。本発明の前記発現ベクターは、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーター/エンハンサー配列、内部リボソーム侵入サイト(IRES)配列(米国特許第4,937,190号、ここにその全部を参考文献として合体させる)、前記発現ベクターを含有する細胞にネオマイシン耐性を与えるヌクレオチド配列、そしてシミアンウイルス40プロモーター(SV40)の制御下で、前記発現ベクターを含有する細胞にアンピシリン耐性を与えるヌクレオチド配列、を含む。好適実施例において、前記EF1αプロモーター/エンハンサー配列は、キメラ軽鎖をコードするヌクレオチド配列の上流かつ近傍にある。
1. 定義
ここでの使用において、「キメラ」とは、ここでは、可変領域の重鎖と軽鎖は、ヒト由来ではなく、重鎖及び軽鎖の定常領域はヒト由来である、抗体などの免疫グロブリンを指す。
マウス19/2抗体を産生するハイブリドーマからの全RNAを標準RNA単離技術(チョムジンスキー(Chomczynski)他(1987) Anal. Biochem. 162:156-159、ここにその全部を参考文献として合体させる)を使用して取得した。一本鎖cDNAを、市販の一本鎖cDNA合成キットを使用し、重鎖と軽鎖との両方に対するd(T)18でのプライミングにより作成した(レンナー(Renner)他 (1998) Biotechniques 25(5):720-722、ここにその全部を参考文献として合体させる)。その結果得られたcDNAに対して、重鎖と軽鎖とに対するプライマーの組み合わせを使用したPCRを行った。重鎖と軽鎖との5’プライマーのヌクレオチド配列をそれぞれ、表1と表2とに示す。3’プライマーは表3に示されている。軽鎖プライマーは、V−C連結部から離れていないマウスカッパー定常領域内でハイブリダイズした。重鎖3’プライマーは、V−CH1連結部から離れていないマウス重鎖サブグループ1のCH−1定常領域内でハイブリダイズした。
上述したクローニング法を使用して、マウス19/2のVH及びVLのPCR産物を、市販の製品および周知の技術を利用してクローニングした。マウス19/2VL領域については、マウスカッパー定常領域プライマーとプライマーMKV2及びMKV7(配列識別番号14&19)を使用してPCR産物を得た。マウス19/2VH領域については、マウスガンマ定常領域プライマーとプライマーMHV2,MHV5,MHV7(配列識別番号2,5および7)を使用してPCR産物を得た。クローニングされたV−領域インサートの拡張DNAシークエンシングは、二つの異なる軽鎖配列と2つの異なる重鎖配列とを明らかにした。重鎖と軽鎖に対する擬似遺伝子は増幅され、標準配列解析によって排除した。重鎖と軽鎖の両方について新規な免疫グロブリンコード配列が検出された。これを配列識別番号27,28,29及び30とし、これらは、マウス19/2重鎖可変領域(27と28)と軽鎖可変領域(29と30)のcDNA及びアミノ酸配列を表している。
上述したプライマーによって得られた19/2重鎖のリーダー配列のDNA配列を、データベースと比較したところ、19/2HCリーダー配列は、短く(17のアミノ酸)、公開データベースに対してユニークであるようであった。具体的には、アミノ酸2,3及び5は、データベースではS,W及びFであるのに対して、E,L及びMであった。データベースとの比較で、N末端領域の親水性アミノ酸は、それぞれ、中性又は塩基性アミノ酸によって分離されてあったが、リーダー配列の分泌能力に対するこれらの変化の影響は不明であることから、この配列は更なる実験においてもこのままであった。
キメラ19/2抗体を、マウス19/2VLとVH領域がそれぞれ、ヒトカッパー及びガンマ−1定常領域に結合されるように構築した。PCRプライマーを使用して、マウス19/2VL及びVH領域をコードするcDNA配列に隣接する5’及び3’配列を修飾した。19/2軽鎖V領域に対して特異的なPCRプライマーは、得られた19/2軽鎖V領域遺伝子の配列を使用して設計される。次に、これらの適合マウス19/2可変領域を、既にヒトカッパー(pREN−Neo ベクター)又はガンマ−1(pREN−DHFR ベクター)定常領域を含んでいる哺乳動物細胞発現ベクターにサブクローニングした。これらのベクターは、軽鎖と重鎖を効率的に転写するために、ヒト伸長因子1α(EF1α)プロモーター/エンハンサー配列の一部を使用している。これらのベクターは、更に、CHO細胞における、ストリジェント、バイシストロン性発現と、選択マーカーの制御とを可能にするマルチクローニング部位に続くIRES配列も含んでいる。このベクター対を、ここに記載の全ての組換え実験、即ち、全てのキメラ抗体の製造、に使用した。前記発現ベクターは、PmeI−BamHI DNAフラグメントとして挿入された前記可変領域を有するように設計された。PCRプライマーは、これらの制限部位を、V領域をコードするcDNAの5’−(PmeI)及び3’−(BamHI)末端に挿入するように構成された。更に、これらPCRプライマーは、効率的な翻訳を可能にするために、標準コザック(Kozak)配列(コザック(Kozak)(1987)Nucleic Acids Res. 15(20):8125-8148、ここにその全部を参考文献として合体させる)を前記軽鎖及び重鎖cDNAの両方の5’末端に導入するよう、かつ、前記定常領域にスプライシングされるように、可変領域の軽鎖と重鎖cDNAの両方の3’末端にスプライス供与部位を導入するように設計された。前記キメラ19/2軽鎖及び重鎖の構築に使用された前記PCRプライマーは、以下の通りであった。catgtttaaacgccfccaccatgggcttcaagatggagtca(5’末端、軽鎖可変領域、配列識別番号31);agaggatccactcacgtttcagttccacttggtcccag(3’末端、配列識別番号32);catgtttaaacgccgccaccatggagctgatcatgctcttcct(重鎖可変領域の5’末端に対するプライマー、配列認識番号33);agaggatccactcacctgaggagactctgagagtggt(重鎖可変領域の3’末端のプライマー:配列識別番号34)。前記マウス19/2VL及びVH領域のDNA及びアミノ酸配列を、キメラ19/2軽鎖及び重鎖の構築からの使用のために適合させた。それぞれ真核細胞発現ベクターpREN−Neo及びpREN−DHFRにクローニングされたマウス19/2軽鎖及び重鎖の全DNA配列を、その結果得られ、キメラ分子となった軽鎖及び重鎖とともに、配列識別番号35及び36に示す。具体的には、配列識別番号35において、ヌクレオチド1357−1756は、マウス軽鎖配列をコードし、ヌクレオチド1763−2206は、ヒトカッパー領域をコードする。この配列(1763−2206)内、イントロンとスプライス受容部位を構成する120塩基対領域は、ヌクレオチド1886から始まっている。配列識別番号36の内、ヌクレオチド1357−1770が、スプライス受容部位を有するマウス9/2重鎖配列をコードする。ヌクレオチド1777−2833は、ヒトIgG1定常領域をコードする。この配列内において、前記コード領域の前に、60塩基対イントロン領域及びスプライス受容部位がある。
ここに記載の実験の目的は、CHO(チャイニーズハムスター卵巣)DG44細胞中においてキメラ19/2(c19/2)抗ヒトGM−CSFモノクローナル抗体(mAb)を発現する安定的な細胞ラインをつくり、分泌された抗体の結合特性をテストすることであった。これを行うために、DHFR陰性CHO細胞ラインDG044を使用した。ここにその全部を参考文献として合体させるモリス(Morris)他(1990) Gene 94(2):289-294を参照。前記CHO細胞を10%FCSとヒポキサンチン-チミジンを添加したRPMI中で培養した。トランスフェクション用のDNAを、市販製品とそこに提供されている指導書を使用して、E.coli細胞から精製した。全てのDNA調製物を制限酵素消化によって調べた。それぞれのベクターにおけるキメラ19/2mAb可変領域の配列を、ABI PRISM310又はLICORシーケンサーを使用して確認した。
CHO DG44細胞を、短時間、フルスピードにてエッペンドルフ微量遠心機で遠心分離した。PBSで一度洗浄し、再び、ペレット化した。前記細胞ペレットのSDS溶解とプロテイナーゼK処理後のエタノール沈殿によって、ゲノムDNAを調製した。
ttcttgaagt ctggtgatgc tgcc(配列識別番号37)、
そして、
caagctagcc ctctaagactc ctcccctgtt(配列識別番号38)、
である。
プラス、
gaactcgagt catttacccg gagacaggga gag(配列識別番号39)、
重鎖用。
CHO細胞ラインを、対応のプラスミドでトランスフェクトした。ジェネテシン耐性細胞が得られ、これらの細胞を、更に、メトトレキセート耐性について選択した。増幅の後、単一コロニーを選抜し、24ウェルプレートへトランスファーした。培養上清のキメラIgGを、3〜4日後、標準ドットブロットアッセイによってテストした。
細胞増殖と抗体産生を最適化するために、CHO DG44/pRENc19/2細胞ラインを先ず、10%CO2雰囲気中で、37℃で、10%FCSを含有する市販のIMDM中で培養した。次に、これらの細胞を、無血清培地中に引き離し、10%CO2雰囲気中で、37℃で、特注の培地、即ち、下記の添加剤を含むIMDM SFII、中で培養した。
プルロニック F68 1.0mg/ml
Hypep 4601 1.0mg/ml
Hypep 4605 DEV 0.5mg/ml
HEPES 5.958mg/ml
Na2HCO3 3.024mg/ml
添加剤 最終濃度
デキストラン硫酸 50.0μg/ml
プトレッシン 100.0nM
Albumax I 2.0mg/ml
塩化コリン 1.0mg/ml
微量元素
FeSO4・7H2O 0.8μg/ml
ZnSO4・7H2O 1.0μg/ml
CuSO4・5H2O 0.0025μg/ml
C6H5FeO7・H2O 5.0μg/ml
IGF−1 50.0ng/ml
トランスフェリン 35.0μg/ml
エタノールアミン 50.0μM
メルカプトエタノール 50.0μM
この例に記載の実験は、前記抗体の結合活性を測定するために構成された。
これらの実験は、前記抗体の結合活性と、それらが互いに交差反応するか否かの両方を調べるために構成された。
これらの実験は、前記抗GM−CSF抗体の中和活性をテストするように構成された。二つのヒトGM−CSF依存細胞ライン、即ち、TF−1とAML−193を使用した。0.5ng/mlの組換えヒトGM−CSFの存在又は不在下で、成長曲線を確立し、生存細胞数を、0,1,2,3,5及び7日目に、トリパンブルー排除(Trypan Blue exclusion)によって測定した。
キメラHRS−3抗体を作り出すために追加の実験を行った。この抗体のマウス形態は、ここに参考文献として合体させるホムバック(Hombach)他,Int. J. Cancer 55:830-836(1993)に、記載されている。
gcgccatggc ccaggtgcaa ctgcagcagt ca(配列識別番号40)
そして、
cagggatcca ctcacctgag gagacggtga ccgt(配列識別番号41)、
そして、軽鎖は
agcgccatgg acatcgagct cactcagtct cca(配列識別番号42)
そして
cagggatcca actcacgtttg atttccagct tggt(配列識別番号43)。
構成物が確立されると、それらを上述したようにDGO44細胞にトランスフェクトした。
前記キメラHRS−3抗体の結合能力を、前述のレンナー(Renner)他に従って、フローサイトメトリーによって測定した。簡単に説明すると、CD−30を発現した標的腫瘍ラインの1x106の細胞をPBS中で二回洗浄し、次に、可変濃度の抗体と、4℃で30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、FITC又はPEのいずれかに共役した、軽鎖に対する二次抗体とインキュベートした。
前記キメラHRS−3抗体の抗体依存細胞毒性(ADCC)と補体依存毒性とを、前述のホムバック(Hombach)他と前述のレンナー(Renner)他とに記載されているようにユーロピウム放出アッセイを使用して測定した。
この例では、キメラG250特異的抗体と、腫瘍壊死因子(以後、”TNF”という)との融合タンパク質の産生について詳述する。
前記キメラHRS−3抗体について、前述したように、今回は、前記融合タンパク質と、G250陽性腫瘍細胞とを使用してFACSを行った。キメラG250抗体を陽性コントロールとし、無関係なキメラIgG1抗体を陰性コントロールとして、二つの異なる精製ランをテストした。
これらの実験は前記融合タンパク質が細胞死を仲介するTNFの能力を維持しているか否かを調べるように構成された。
TNFは、ヒト白血球によるH2O2放出を刺激することが知られている。そこで、前記キメラタンパク質をこの特性についてテストした。
Claims (16)
- キメラ化GM−CSF特異的抗体軽鎖をコードする単離核酸分子であって、そのアミノ酸配列が、配列番号:35のヌクレオチド1886〜2203によってコードされるアミノ酸配列が連結された、配列番号:35のヌクレオチド1357〜1752によってコードされるアミノ酸からなる、
単離核酸分子。 - キメラ化GM−CSF特異的抗体重鎖をコードする単離核酸分子であって、そのアミノ酸配列が、配列番号:36のヌクレオチド1839〜2825によってコードされるアミノ酸配列が連結された、配列番号:36のヌクレオチド1357〜1764によってコードされるアミノ酸からなる、
単離核酸分子。 - キメラ化GM−CSF特異的抗体であって、
そのアミノ酸配列が、配列番号:35のヌクレオチド1886〜2203によってコードされるアミノ酸配列に連結された、配列番号:35のヌクレオチド1357〜1752によってコードされるアミノ酸からなる、軽鎖と、
そのアミノ酸配列が、配列番号:36のヌクレオチド1839〜2825によってコードされるアミノ酸配列に連結された、配列番号:36のヌクレオチド1357〜1764によってコードされるアミノ酸からなる、重鎖、とからなる、
キメラ化GM−CSF特異的抗体。 - プロモーターに作動可能に連結された、請求項1に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
- プロモーターに作動可能に連結された、請求項2に記載の単離核酸分子を含む、発現ベクター。
- 配列番号35のヌクレオチド配列からなる、請求項4に記載の発現ベクター。
- 配列番号36のヌクレオチド配列からなる、請求項5に記載の発現ベクター。
- 請求項1に記載の単離核酸分子、若しくは、請求項4に記載の発現ベクターで、トランスフォーム若しくはトランスフェクションされた、組換え細胞。
- 請求項2に記載の単離核酸分子、若しくは、請求項5に記載の発現ベクターで、トランスフォーム若しくはトランスフェクションされた、組換え細胞。
- 配列番号:35のヌクレオチド1357〜1752と、1886〜2203とを含む、請求項1に記載の単離核酸分子。
- 配列番号:36のヌクレオチド1357〜1764と、1839〜2825とを含む、請求項2に記載の単離核酸分子。
- また、請求項2に記載の単離核酸分子、若しくは、請求項5に記載の発現ベクターで、トランスフォーム若しくはトランスフェクションされた、請求項8に記載の組換え細胞。
- 前記細胞が、哺乳類動物のものである、請求項8若しくは9に記載の組換え細胞。
- 前記哺乳類動物細胞が、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、請求項13に記載の組換え細胞。
- 請求項1に記載の単離核酸分子によってコードされる、キメラ化された軽鎖。
- 請求項2に記載の単離核酸分子によってコードされる、キメラ化された重鎖。
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