PT1259547E - Anticorpos recombinantes de alta potência e método para a sua produção - Google Patents

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Description

1
DESCRIÇÃO
"ANTICORPOS RECOMBINANTES DE ALTA POTÊNCIA E MÉTODO PARA A SUA PRODUÇÃO"
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a anticorpos de alta potência, métodos para aumentar a potência de anticorpos e à utilização de tais anticorpos para a prevenção e tratamento de doenças.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os anticorpos têm sido e estão atualmente a ser desenvolvidos para a prevenção e tratamento de várias doenças, especialmente aquelas causadas por microrganismos infecciosos, tais como os virus.
Uma abordagem tem sido o desenvolvimento de anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais neutralizantes, alguns com elevada atividade especifica de neutralização. Uma desvantagem desta abordagem é a necessidade de produzir anticorpos humanos em vez de anticorpos de ratinhos, ou ratos e, consequentemente, minimizar o desenvolvimento de respostas de anticorpos humanos anti-ratinho ou anti-rato, o que potencialmente resulta numa patologia imunológica adicional.
Uma abordagem alternativa tem sido a produção de anticorpos quiméricos humano-murinos, nos quais os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada de ratinhos e leve foram acoplados aos genes para as regiões constantes de cadeia pesada e leve de humanos para produzir anticorpos quiméricos ou híbridos. Por exemplo, um anticorpo 2 humanizado anti-RSV foi preparado e está atualmente a ser comercializado. [Ver: Johnson, Patente nos EUA. No. 5,824,307].
Em alguns casos, as regiões determinantes de complementaridade de ratinhos (CDRs) foram enxertadas em regiões de estrutura constantes humanas com uma parte dos aminoácidos da estrutura de ratinhos (aminoácidos da região variável do anticorpo, mas fora das CDRs) sendo substituídos por aminoácidos correspondentemente posicionados de um anticorpo humano de especificidade semelhante para proporcionar um designado anticorpo "humanizado". [Ver, por exemplo, Queen, Patente dos EUA. No. 5,693,761 e 5,693,762]. No entanto, tais anticorpos contêm regiões CDR de ratinho intactas e reuniram-se com eficácia mista e exibem afinidades muitas vezes não superiores a 107 a ΙΟ8 ΝΓ1. O documento W09833919 descreve o anticorpo humanizado Vitaxin® e anticorpos enxertados relacionados com base em LM609 monoclonal de ratinho. A produção de anticorpos de alta potência (isto é, anticorpos com atividade biológica elevada, tais como a capacidade do antigénio neutralizante) , incluindo anticorpos com afinidade ultra-elevada para o antigénio alvo, seria desejável do ponto de vista tanto da capacidade neutralizante de tal anticorpo, como dos aspetos mais práticos, em requerer menos anticorpos, de modo a atingir um grau desejado de eficácia clínica, deste modo reduzindo os custos de utilização. 3 A afinidade do anticorpo de é medida pela constante de ligação do anticorpo para com um antigénio particular, e tal constante de ligação, é geralmente calculada pela razão da constante de taxa para a formação do complexo anticorpo-antigénio (referido como valor "kon") para a constante de taxa de dissociação do referido complexo (o valor "k0ff"). De acordo com a presente invenção, determinou-se que a potência de anticorpos depende do valor de kon, independentemente da especificidade. A presente invenção fornece, assim, uma solução para os problemas de obtenção de anticorpos de alta potência em que quanto maior for o valor kon, maior será a potência do anticorpo produzindo assim anticorpos de alta potência e um método para os produzir.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
De acordo com um aspeto da presente invenção, proporcionam-se anticorpos de alta potência de acordo com a reivindicação 1, que são úteis no tratamento e/ou prevenção de uma doença. Noutro aspeto, a potência de um anticorpo é aumentada através do aumento da constante da taxa de formação do complexo antigénio-anticorpo (o valor "kon") .
Num aspecto, a presente invenção refere-se a anticorpos de alta potência, que não o vitaxin, incluindo porções imunologicamente ativas, fragmentos, ou segmentos do mesmo, tendo um kon de pelo menos 2,5 x ΙΟ5 ΝΓ1 seg-1, de preferência pelo menos cerca de 5 x ΙΟ5 M_1 s”1, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 7,5 x ΙΟ5 ΝΓ1 seg~ 1. Tais anticorpos também podem ter uma afinidade elevada (pelo menos cerca de ΙΟ9 ΝΓ1) . 4
Noutro aspeto, a presente invenção refere-se a anticorpos neutralizantes de alta potência, incluindo porções imunologicamente ativas, fragmentos, ou segmentos do mesmo, tendo um kon de pelo menos 2,5 x 105 M-1 seg^1, de preferência pelo menos cerca de 5 x 105 M-1 s-1, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 7,5 x ΙΟ5 ΝΓ1 seg~ 1. Tais anticorpos também podem ter uma afinidade elevada (pelo menos cerca de ΙΟ9 ΝΓ1) .
Também são descritos métodos para aumentar a potência de anticorpos neutralizantes, através do aumento do valor de kon em relação a um dado antigénio sem alterar o epitopo para ao qual o anticorpo se liga.
Também é descrito um meio de rastreio de anticorpos em termos das propriedades o que irá assegurar uma potência elevada em relação a um antigénio desejado, a referida potência sendo, pelo menos, 2 a 10 vezes mais em relação a anticorpos conhecidos.
Mais especificamente, é um objeto da presente invenção a produção de anticorpos que possuem valores kon pelo menos tão elevados quanto 2,5 x 105 M_1 seg-1, de preferência pelo menos 5 x 105 M_1 seg-1, e com mais preferência tão altos quanto 7,5 x 105 M”1 seg^1. É também um objectivo da presente invenção proporcionar uma elevada afinidade, anticorpos de alta potência com elevada especificidade para a proteína F de um vírus sincicial respiratório (RSV), que causa a infeção do sistema respiratório. 5
Numa forma de realização, a presente invenção fornece anticorpos que têm substancialmente ar regiões de estrutura de cadeia variável (FR) do anticorpo descrito na Figura 1 (com a mesma especificidade que o anticorpo presente), mas em que as estruturas polipept idicas contêm uma ou mais diferenças de aminoácidos em uma ou mais das CDRs (ou regiões determinantes de complementaridade) dos mesmos. Numa forma de realização preferida, os anticorpos da presente invenção poderão ser diferentes do anticorpo das Figuras 1 ou 2 (daqui em diante, a "estrutura de base" ou "estrutura de referência") apenas nas sequências de uma ou mais CDRs, incluindo Ll, L2, L3, Hl, H2 e H3. Uma sequência preferida é mostrada na Figura 3. É outro objeto da presente invenção proporcionar composições compreendendo os anticorpos aqui descritos, em que os referidos anticorpos são suspensos num veículo, diluente ou excipiente farmacologicamente aceitável. É ainda um outro objetivo da presente invenção proporcionar composições e medicamentos para utilização na prevenção e/ou tratamento de doenças, tais como os causados por vírus, especialmente vírus sincicial respiratório, em que as composições e medicamentos compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição contendo um anticorpo tal como aqui divulgado.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra a sequência de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo monoclonal de afinidade elevada cuja potência pode ser aumentada pelos métodos da presente invenção. Para fins de referência, este anticorpo é a sequência de anticorpos 6 MEDI-493 divulgada em Johnson et al, J. Infect. Dis., 176:1215-1224 (1997). Aqui, as regiões CDR estão sublinhadas enquanto que os resíduos não sublinhados formam as regiões estruturais das regiões variáveis de cada estrutura polipeptídica. Nesta estrutura, as CDRs são derivadas de um anticorpo de ratinho, enquanto que as regiões estruturais são derivadas de um anticorpo humano. As regiões constantes (não mostradas) são também obtidas a partir de um anticorpo humano. A Figura IA mostra a região variável da cadeia leve (SEQ ID N°: 1) e a Figura 1B mostra a região variável de cadeia pesada (SEQ ID N° : 2) das cadeias leves e pesadas, respetivamente. A Figura 2 mostra as regiões variáveis de cadeia pesada e leve para uma sequência polipeptídica de base ou de referência diferente. Mais uma vez, as regiões CDR estão sublinhadas. Esta sequência difere da da Figura 1, nos primeiros 4 resíduos da CDR LI da cadeia leve, resíduo 103 da cadeia leve e o resíduo 112 da cadeia pesada. Todas as estruturas Fab neutralizantes de alta potência da presente invenção (as estruturas de CDR mostradas na Tabela 2) utilizam as sequências estruturais desta estrutura de referência ou de base. A Fig. 2A mostra as regiões variáveis de cadeia leve (SEQ ID N° : 3) e a FIG. 2B mostra as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID N°: 4). A Figura 3 mostra as regiões variáveis de cadeia pesada (SEQ ID N°: 36) e de cadeia leve (SEQ ID N°: 35) de uma forma de realização preferida da presente invenção. Este anticorpo preferido tem várias CDRs de kon elevado (ou CDRs de alta potência) presentes, o que dá origem a maiores constantes de taxa de associação (ou seja, kon) do que o anticorpo de base ou de referência da Figura 2 e, portanto, 7 uma potência mais elevada. Este anticorpo preferido, tem as mesmas sequências de aminoácidos estruturais que a sequência da Figura 2, e, para os fins da presente divulgação, é denotado como "clone 15" nas Tabelas 2 e 3, a seguir. Estas sequências são facilmente geradas pelos métodos aqui descritos, os quais são facilmente conhecidos dos peritos na arte. As constantes cinéticas foram medidas de acordo com o procedimento do Exemplo 1, e a potência foi determinada tal como descrito no Exemplo 2. A Figura 4 mostra um diagrama esquemático da utilização do fago M 13 para a geração de fragmentos Fab de acordo com a presente invenção e utilizando uma sequência de marcadores de histidina (6 resíduos de histidina) para facilitar a purificação. A Figura 5 mostra um diagrama esquemático para o procedimento de rastreio utilizado para os anticorpos da presente invenção. "SPE" refere-se a um único ponto de ELISA. "H3-3F4" é uma designação para o clone 4 das Tabelas 2 e 3.
SUMÁRIO DETALHADO DA INVENÇÃO
De acordo com um aspeto da presente invenção, proporcionam-se anticorpos de alta potência de acordo com a reivindicação 1, que são úteis no tratamento e/ou prevenção de uma doença. Noutro aspeto, a potência de um anticorpo é aumentada através do aumento da constante da taxa de formação do complexo antigénio-anticorpo, que é referida como o valor "kon", através de substituição das sequências de CDR de tal anticorpo por sequências CDR de alta potência, no seu lugar. 8
Num aspeto, a presente invenção refere-se a anticorpos de alta potência, que não o vitaxin, incluindo porções imunologicamente ativas, fragmentos, ou segmentos dos referidos anticorpos de alta potência, tendo um kon de pelo menos 2,5 x 105 M”1 s”1, de preferência pelo menos cerca de 5 x 105 M-1 s-1, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 7,5 x 105 M”1 seg-1. Tais anticorpos também podem ter uma afinidade elevada (pelo menos cerca de 109 ΝΓ1).
Noutro aspeto, a presente invenção refere-se a anticorpos neutralizantes de alta potência, incluindo porções imunologicamente ativas, fragmentos, ou segmentos dos mesmos, tendo um kon de pelo menos 2,5 x ΙΟ5 ΝΓ1 s^1, de preferência pelo menos cerca de 5 x ΙΟ5 ΝΓ1 s”1, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 7,5 x 105 M_1 seg“ 1. Tais anticorpos também podem ter uma afinidade elevada (pelo menos cerca de ΙΟ9 ΝΓ1) .
Também são descritos métodos para a produção de anticorpos, neutralizantes ou não-neutralizantes, que tem elevada potência, ou atividade biológica, de preferência tendo uma afinidade de pelo menos cerca de ΙΟ9 M_1, e tendo um valor de kon de pelo menos cerca de 2,5 x ΙΟ5 ΝΓ1 s-1, de preferência pelo menos cerca de 5 x 105 M-1 s_1, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 7,5 x ΙΟ5 1ΧΓ1 s”1.
Com o advento de métodos da biologia molecular e da tecnologia do ADN recombinante, é agora possível produzir anticorpos, incluindo fragmentos ativos dos mesmos, por meios recombinantes e, assim, gerar sequências de genes que codificam sequências de aminoácidos específicas encontradas na estrutura polipeptídica dos anticorpos. Isto tem permitido a produção rápida de anticorpos possuindo 9 sequências características de anticorpos neutralizantes de espécies e fontes diferentes.
Independentemente de como eles são construídos, os anticorpos têm uma estrutura global tridimensional semelhante geralmente fornecida como L2H2 em que a molécula normalmente compreende 2 cadeias de aminoácidos leves (L) e 2 cadeias de aminoácidos pesadas (H) . Ambas as cadeias têm regiões capazes de interagir com um alvo antigénico estruturalmente complementar. As regiões que interagem com o alvo são referidas como regiões "variáveis" ou "V" e são caracterizadas por diferenças na sequência de aminoácidos de anticorpos de especificidade antigénica diferente.
As regiões variáveis das cadeias H ou L contêm as sequências de aminoácidos capazes de se ligarem especificamente a alvos antigénicos. Dentro destas sequências estão sequências menores batizadas de "hipervariáveis" por causa da sua extrema variabilidade entre os anticorpos de diferentes especificidades. Tais regiões hipervariáveis são chamadas de "regiões determinantes de complementaridade" ou regiões "CDR". Estas regiões CDR representam a especificidade básica do anticorpo para uma estrutura determinante antigénica particular.
As CDRs representam trechos de aminoácidos não contíguos dentro das regiões variáveis, mas constatou-se que os locais de posicionamento destas sequências de aminoácidos críticas no interior das regiões variáveis de cadeia pesada e leve têm locais semelhantes no interior das sequências de aminoácidos da estrutura da imunoglobulina. As cadeias variáveis leves e pesadas de todos os anticorpos têm cada 10 uma 3 regiões CDR, cada uma estando não-contígua com as outras (denominadas de Ll, L2, L3, Hl, H2, H3) em relação às cadeias leves e pesadas respetivas. As regiões CDR aceites foram descritas por Kabat et ai, J. Biol. Chem. 252:6609-6616 (1977). O sistema de numeração é mostrado nas Figuras 1-3, em que as CDRs estão sublinhadas e os números seguem o esquema de Kabat.
Em todas as espécies de mamíferos, os polipeptidos de anticorpos contêm regiões constantes (isto é, altamente conservadas) e variáveis compreendendo tanto as CDRs, como as chamadas "regiões estruturais", esta última sendo composta de sequências de aminoácidos no interior da região variável, mas no exterior das CDRs.
Entre as propriedades normalmente utilizadas para caracterizar um anticorpo, ou fragmento deste, estão a especificidade e afinidade do anticorpo. A especificidade refere-se ao ligante específico, ou estrutura antigénica, a que o anticorpo se liga fortemente, ou mais fortemente. A afinidade refere-se a uma medida quantitativa da força de ligação do anticorpo a um ligante particular, e é dada em termos de uma "constante de afinidade". Tais constantes de afinidade poderão ser definidas como constantes de associação ou de dissociação e representam a razão entre as concentrações de equilíbrio do ligante livre e do anticorpo livre no que diz respeito ao complexo anticorpo-ligante. Tal como aqui utilizado, o termo afinidade, será dado como uma constante de associação.
Tais constantes são geralmente medidas pela cinética da formação do complexo antigénio-anticorpo, com a constante de taxa de associação para formar o complexo a ser denotado 11 como kon e a constante de taxa da dissociação denotada como k0ff. A medição de tais constantes está bem incluída nas capacidades dos peritos na arte. 0 anticorpo e antigénio respetivo combinam-se para formar um complexo, como se segue:
Anticorpo (AB) + Antigénio (Ag) ----> Ab-Ag
Aqui, a constante de afinidade é fornecida como uma constante de associação e assim representa: [Ab-Ag]
Ka =-- [Ab] [Ag] em que Ka = constante de associação (ou afinidade) enquanto que os parêntesis indicam a concentração molar das espécies abrangidas. Para um dado conjunto de condições, tais como a pressão, temperatura e força iónica, a razão entre a concentração do complexo e o produto das concentrações das espécies reagentes é constante. Desde que as condições de saturação não sejam atingidas para o anticorpo ou antigénio (ligante), uma alteração na concentração de ambas as espécies de ligação irá alterar a concentração do complexo (Ab-Ag) por uma quantidade determinada pela equação acima (seno Ka é constante). Essa interação funciona de acordo com uma lei de ação de massa.
Além disso, esta relação depende de concentrações e não na quantidade absoluta das espécies presentes, de modo que o volume global é também relevante para quaisquer medições de afinidade. Assim, se a reação ocorrer em metade do volume, será formado o dobro do complexo porque cada espécie reagente (Ab e Ag) está agora presente no dobro da 12 concentração e assim quase quatro vezes mais complexo será formado. Por outro lado, a diluição pode reduzir bastante a concentração do complexo Ab-Aq. Em geral, a cinética da interação antigénio-anticorpo é bem conhecida dos peritos na arte.
Tal reação anticorpo-antigénio pode ser descrita cineticamente como um equilíbrio dinâmico em que a constante de afinidade pode ser medida como a razão entre as constantes de taxa individuais para formação e dissociação do complexo:
Ab + Ag <-> Ab-Ag koff
Assim, o valor de kon é a constante da taxa, ou a taxa de reação específica, da reação frontal, ou de formação do complexo, medida em unidades: ΝΓ1 seg-1. 0 valor kCff é a constante de taxa, ou a taxa de reação específica, para a dissociação do complexo Ab-Ag e é medida em unidades de seg-1.
Os valores de kon para os anticorpos e fragmentos ativos dos mesmos, da presente invenção, foram medidos usando o protocolo de BIAcore e equipamento tal como descrito nos Exemplos.
Em conformidade com o acima exposto, a presente invenção refere-se a anticorpos neutralizantes de alta potência, incluindo porções imunologicamente ativas, fragmentos, e/ou segmentos dos mesmos, tendo um kon de pelo menos 2,5 x 105Μ~ s“\ de preferência pelo menos cerca de 5 x ΙΟ5 ΝΓ1 s_1, e i 13 ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 7,5 x 105 M1 s"1.
Tal como aqui utilizados, os termos "porção" "segmento", e "fragmento", quando utilizados em relação a polipeptidos, referem-se a uma sequência continua de resíduos, tais como resíduos de aminoácidos, cuja sequência forma um subconjunto de uma sequência maior. Por exemplo, se um polipeptídeo fosse sujeito a tratamento com qualquer uma das endopeptidases comuns, tais como a tripsina, quimotripsina, pepsina, papaína, etc., os oligopéptidos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos ou fragmentos do polipeptido de partida. Tais proteainases são comummente utilizadas para gerar fragmentos de anticorpos, tais como os descritos no presente documento, apesar de tais fragmentos poderem agora ser mais facilmente gerados por clonagem direta ou síntese do polipéptido particular desejado para ser produzido.
Os anticorpos da presente invenção são anticorpos de alta potência, geralmente exibindo valores de kon elevados. Para os fins da presente descrição, a "alta potência" refere-se a uma potência refletida por uma EC50 (ou concentração eficaz, pelo menos, mostrando uma redução de 50% na OD450 no ensaio de microneutralização descrito abaixo) inferior a cerca de 3 nM (nanomolar ou 1CT9 molar) . Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser neutralizantes (provocando a destruição das espécies-alvo, tal como um vírus, e, assim, diminuindo a carga virai). Um anticorpo não neutralizante para utilização pode ser neutralizante para uma utilização diferente. 14
Os anticorpos de alta potência podem ter uma especificidade para determinantes antigénicos encontrados em micróbios e que são capazes de neutralizar os referidos micróbios através de ligação aos mesmos. De acordo com a presente invenção, tais micróbios são na maioria das vezes virus, bactérias ou fungos, em particular organismos que causam doenças respiratórias e mais preferivelmente virus. Um exemplo especifico, utilizado nos exemplos aqui descritos, é o virus sincicial respiratório (RSV); um outro exemplo é o virus da parainfluenza (PIV).
Os anticorpos de alta potência podem também ter especificidade para antigénios indicados nas superfícies das células cancerígenas (mas geralmente não incluem anticorpos, tais como o vitaxin, que são não-neutralizantes (ver: Wu et al, Proc Natl Acad. Sei. 95:6037-6042 (1998)).
Os anticorpos de alta potência podem também ter especificidade para as substâncias químicas, tais como as substâncias tóxicas, ou toxinas, ou para os produtos de toxinas, incluindo, mas não se limitado a, produtos produzidos pelo metabolismo de um organismo de tal(ais) toxina(s). Por exemplo, os anticorpos de alta potência da presente invenção podem ser úteis em anular, ou de outro modo melhorar, os efeitos de drogas viciantes, tais como a cocaína.
Os anticorpos de alta potência da presente invenção também podem ter uma elevada afinidade para o antigénio F de RSV, e, quando tal alta afinidade for exposta, a constante de afinidade (Ka) de tais anticorpos é, pelo menos, de cerca de ΙΟ9 M_1, de preferência pelo menos cerca de IO10 M-1, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 1011 M_1. 15
Os anticorpos da presente invenção exibem uma potência elevada quando medidos no ensaio de microneutralização descrito no Exemplo 2. Nesse ensaio, a alta potência é medida pelo valor de EC50 e geralmente tem um valor de EC50 de menos do que cerca de 3,0 nM (nanomolar ou 1CT9 M) , e mais preferivelmente menos do que cerca de 1,0 nM. Em geral, quanto menor for o valor de EC50, maior será a potência, ou atividade biológica.
Os anticorpos de alta potência da presente invenção exibem tal alta potência devido aos seus valores de kon elevados, o que é determinado pelas sequências de aminoácidos que compõem a estrutura (FR) e regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Estes anticorpos, ou fragmentos ativos dos mesmos, têm regiões determinantes de complementaridade de alta potência (CDR) dentro das suas sequências de aminoácidos. Os anticorpos neutralizantes de alta potência da presente invenção podem compreender pelo menos 2 CDRs de elevada potência, ou 3 CDRs de elevada potência, ou até 4 CDRs de elevada potência, ou 5 CDRs de elevada potência, e podem mesmo compreender 6 CDRs de elevada potência. É claro que, neste último caso, todas as 6 CDRs do anticorpo ou fragmentos ativos do mesmo, são CDRs de elevada potência. De acordo com isto, tais anticorpos neutralizantes de alta potência da presente invenção têm CDRs de alta potência, que consistem cada uma das CDRs de cadeia leve LI (CDR Ll), L2 (CDR L2) e L3 (CDR L3) e CDRs de cadeia pesada Hl (CDR Hl), H2 (CDR H2) e H3 (CDR H3).
Em formas de realização especificas de tais anticorpos de alta potência, as referidas CDRs de alta potência têm sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo 16
que consiste em SEQ ID N° : 11, 12, 13, 56 ou 59 para CDR
Ll, SEQ ID N°: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 57, 58 e DTFRLAS DTFYLSS para CDR L2, SEQ ID N°: 23 para CDR L3, SEQ ID N° : 24 e 25 para CDR Hl, SEQ ID N°: 26, 27, 28, 29, 30, 55 e DIWWDGKKSYNPSLKS para CDR H2, SEQ ID N°: 31, 32, 33 e 34 para a CDR H3.
Em formas de realização preferidas, anticorpos neutralizantes de alta potência da presente invenção compreendem cadeias variáveis pesadas e leves, com sequências de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste na SEQ ID N°: 35 e 36.
Um processo para a produção de um anticorpo de alta potência pode compreender: (a) a produção de um anticorpo recombinante, incluindo fragmentos imunologicamente ativos do mesmo, compreendendo regiões constantes de cadeia pesada e leve derivadas de um anticorpo de mamífero e regiões variáveis de cadeia pesada e leve que contêm uma ou mais regiões estruturais e/ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) , tendo sequências de aminoácidos previamente selecionadas; (b) o rastreio dos referidos anticorpos recombinantes em termos de kon elevado, quando o referido anticorpo reage in vitro com um antigénio selecionado, e (c) a seleção de anticorpos com o referido kon elevado.
Os anticorpos produzidos de acordo com o processo descrito acima geralmente terão constantes de afinidade elevada e valores de kon elevados, este último produzindo elevada atividade biológica, ou potência. Em formas de realização específicas, os anticorpos de alta potência produzidos de 17 acordo com a presente invenção têm geralmente um kon de pelo menos cerca de 2,5 x 105 ΝΓ1 s-1, de preferência pelo menos cerca de 5 x M”1 s”1, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 7,5 x ΝΓ1 s_1.
Numa forma de realização, os processos aqui descritos produzem um anticorpo de alta potência em que as sequências de aminoácidos pré-selecionadas que produzem um kon elevado (e alta potência resultante) estão presentes, ou na região estrutural, e, pelo menos, duas ou três regiões CDR, talvez em todas as seis regiões CDR do anticorpo, ou estão limitadas a regiões CDR apenas.
Numa outra forma de realização, as sequências de aminoácidos pré-selecionadas que produzem um kon elevado estão presentes, ou na região estrutural e, pelo menos, três regiões CDR do anticorpo, ou estão limitadas a regiões CDR apenas.
Numa forma de realização adicional, as sequências de aminoácidos pré-selecionadas que produzem um kon elevado estão presentes, ou na região estrutural e, pelo menos, quatro regiões CDR do anticorpo ou estão limitadas a regiões CDR apenas.
Além disso, os anticorpos produzidos por meio dos processos aqui descritos podem ser anticorpos completos tetraméricos, tendo a estrutura H2L2, ou podem ser fragmentos de estruturas de anticorpos, que incluem anticorpos de cadeia simples ou fragmentos tais como os fragmentos Fab ou F(ab)2'. 18
De acordo com a presente invenção, o antigénio para o qual os anticorpos são específicos é expresso pelo vírus sincicial respiratório (RSV).
Um processo para a produção de um anticorpo de alta potência pode incluir a produção de um anticorpo recombinante compreendendo uma região constante de cadeia leve e pesada derivada de um anticorpo de mamífero e regiões variáveis de cadeia pesada e leve contendo regiões estruturais e/ou regiões determinantes de complementaridade (CDR) , em que pelo menos uma CDR é uma CDR de kon elevado (ou de alta potência) que possui uma sequência de aminoácidos não encontrada na natureza, e em que a presença da referida CDR resulta num kon elevado.
Em formas de realização específicas, o anticorpo recombinante de kon elevado compreende pelo menos duas CDRs de kon elevado, possivelmente três CDRs de kon elevado, e até mesmo quatro CDRs de kon elevado, e um máximo de cinco ou seis CDRs de kon elevado. A presença de tais sequências de CDR resulta em o anticorpo, ou fragmento, exibir um kon elevado e, assim, uma potência elevada.
Noutras formas de realização, a constante de associação elevada acima referida dos anticorpos produzidos pelos métodos da presente invenção são pelo menos cerca de 2,5 x 105 M-1 s-1, de preferência pelo menos cerca de 5 x ΙΟ5 ΝΓ1 s~ 1, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 7,5 x 105 105 ΝΓ1 s^1.
Um processo para a produção de um anticorpo de alta potência pode compreender: 19 (a) a produção de um anticorpo recombinante, incluindo fragmentos imunologicamente ativos do mesmo, compreendendo regiões constantes de cadeia pesada e leve derivadas de um anticorpo de mamífero e regiões variáveis de cadeia pesada e leve que contêm uma ou mais regiões estruturais e/ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs), tendo sequências de aminoácidos previamente selecionadas; (b) o rastreio dos referidos anticorpos recombinantes, tanto em termos de afinidade elevada, como kon elevado quando o referido anticorpo reage in vitro com um antigénio selecionado, e (c) a seleção de anticorpos, tanto com afinidade elevada, como kon elevado.
Os processos aqui descritos produzem anticorpos de alta potência com alta afinidade e kon elevado, em que a constante de afinidade é de pelo menos 109 M_1 e o kon é de pelo menos 2,5 x 105 M_1 s_1, especialmente em que a referida afinidade é de pelo menos IO10 M_1, e o referido kon é de pelo menos 2,5 x 105 M_1 s_1, mais particularmente em que a referida constante de afinidade é de pelo menos 1011 M_1, e o referido kon é de pelo menos 2,5 x 105 M 1 s 1, em que as formas de realização mais preferidas têm uma afinidade e um kon muito elevados, especialmente quando a referida afinidade é de pelo menos 109 M1, e o referido kon é de pelo menos 5 x 105 M 1 s 1, e, mais especialmente, quando a constante de afinidade é de pelo menos IO10 M 1 e o kon é de pelo menos 2,5 x 105 M 1 s 1, e uma forma de realização mais especialmente preferida seria a produção de um anticorpo de alta potência em que a constante de afinidade seja de pelo menos 1011 M 1 e o kon de pelo menos 7,5 x 105 M-1 s_1. Deve ser entendido que, no caso em que é 20 também procurada uma elevada afinidade, qualquer combinação da afinidade acima mencionada (Ka) e valores da associação cinética (kon) estará abrangida pela presente invenção.
Estas formas de realização incluem também os processos em que a sequência de aminoácidos produzida pré-seleccionada que produz um kon elevado está presente, tanto na região estrutural como nas regiões CDR, ou apenas nas regiões CDR, e em que tais sequências, selecionadas a partir da SEQ ID N°: 11 a 34 e 55 a 58, estão presentes em 1, 2, 3, 4, 5 ou todas as 6 regiões CDR, em que a sequência CDR individual é selecionada a partir das sequências individuais tal como aqui divulgado. Os métodos para fazê-lo são bem conhecidos do perito na arte e não serão mais discutidos.
Os métodos aqui descritos não estão limitados apenas à produção de novos anticorpos de alta afinidade, que sejam específicos para um antigénio particular, e que tenham sido produzidos sem levar em conta moléculas imunogénicas e estruturas já existentes. Assim, os métodos aqui descritos proporcionam um meio para as modificações selecionadas para as estruturas de moléculas de anticorpos conhecidos, desse modo produzindo aumentos no kon de tais anticorpos e concomitante aumento da atividade biológica. Isto é conseguido através da incorporação seletiva de sequências de CDR de alta potência aqui divulgada.
Em formas de realização específicas da presente invenção, o anticorpo, cuja potência é para ser aumentada, vai ter uma afinidade inicial e/ou final constante de pelo menos 109 M” 1, preferivelmente pelo menos cerca de IO10 M”1, e ainda mais preferivelmente menos pelo menos cerca de 1011 ΝΓ1 21
Os anticorpos produzidos de acordo com os métodos aqui descritos terão constantes altas de kon após as alterações de aminoácidos para produzir sequências de alta potência da invenção e, como resultado das referidas alterações de aminoácidos, em especial quando o valor kon após as ditas mudanças de aminoácidos é pelo menos 2,5 x 105 M 1 S 1, especialmente pelo menos cerca de 5 x 105 M-1 S_1 , e mais especialmente pelo menos cerca de 7,5 x 105 M 1 s-1 (independentemente da constante de afinidade particular) (ka) ·
Em conformidade com os métodos aqui descritos, é para ser entendido que as referidas alterações na sequência de aminoácidos usadas para aumentar a potência de um anticorpo, ou fragmentos ativos do mesmo, ou a utilização de certas sequências de aminoácidos para produzir anticorpos de alta potência, ou fragmentos ativos de alta potência do mesmo, alcançam a referida alta potência, ou potência aumentada, através da produção de valores de kon elevados. Porque a constante de afinidade é uma relação numérica de kon com koff, um kon aumentado pode resultar num aumento da afinidade quando k0ff não é alterado pelo mesmo fator. Assim, as potências elevadas dos anticorpos produzidos de acordo com os métodos da presente invenção são uma função do valor de kon e não do valor de Ka (a constante de afinidade). Por exemplo, a utilização de sequências de aminoácidos selecionadas nas CDRs de uma molécula de anticorpo pode resultar num aumento considerável nas constantes de taxas tanto de associação (kon) como de dissociação ( k0ff ) & r ambas forem aumentadas pelo mesmo fator, o resultado é um nível elevado, ou superior, de potência (devido ao kon mais elevado), mas sem um aumento resultante na Ka (porque a 22 razão entre o kon e koff é a mesma) . Por outro lado, sempre que a utilização de tais sequências de aminoácidos pré-selecionadas dentro das CDRs de um anticorpo de alta potência resultarem numa diminuição de kCff e não num kon aumentado, o resultado é um anticorpo, ou seu fragmento ativo, com maior afinidade, mas com pouco ou nenhum aumento na potência. Assim, verificou-se que há pouca ou nenhuma alteração na potência, onde o valor de koff altere por si só (porque Ka é a razão entre kon e koff) mas kon permanece constante, apesar de uma variação numérica em Ka.
De acordo com a presente invenção, vários métodos convenientes estão disponíveis para a medição da potência de anticorpos, ou fragmentos ativos destes, tais como os fragmentos Fab. Um tal método utiliza o modelo de rato do algodão, cujos detalhes estão descritos nos exemplos fornecidos abaixo. Outro é o ensaio de microneutralização (ver Exemplo 2).
Além disso, de acordo com a presente invenção, são proporcionadas composições e medicamentos para a prevenção ou tratamento de uma doença compreendendo uma quantidade terapeuticamente (ou profilaticamente) eficaz de um anticorpo de alta potência, ou seu fragmento ativo, que tem uma sequência polipeptídica tal como aqui divulgado ou produzida de acordo com os métodos aqui descritos. Numa forma de realização preferida, a doença é causada por um vírus sincicial respiratório e vírus de parainfluenza.
Os anticorpos neutralizantes altamente potentes da presente invenção são alcançados através da geração de sequências de genes de anticorpos apropriadas, isto é, sequências de aminoácidos, através da disposição das sequências 23 nucleotídicas apropriadas e expressando-as numa linha celular adequada. Quaisquer sequências nucleotídicas desejadas podem ser produzidas utilizando o método de mutagénese à base de codões, tal como descrito, por exemplo, nas Patentes dos EUA. N° 5,264,563 e 5,523,388. Tais procedimentos permitem a produção de qualquer e todas as frequências de resíduos de aminoácidos em todas as posições de codões desejados dentro de um oligonucleótido. Isto pode incluir substituições completamente aleatórias de qualquer um dos 20 aminoácidos na posição desejada, ou em qualquer subgrupo específico dos mesmos. Alternativamente, este processo pode ser realizado de modo a alcançar um determinado aminoácido num local desejado dentro de uma cadeia de aminoácidos, tal como as novas sequências de CDR de acordo com a invenção. Em resumo, a sequência de nucleótidos apropriada para expressar qualquer sequência de aminoácidos desejada pode ser facilmente conseguida e, utilizando esses processos, as novas sequências de CDR da presente invenção podem ser reproduzidas. Isto resulta na capacidade para sintetizar polipeptidos, tais como anticorpos, com quaisquer sequências de aminoácidos desejadas. Por exemplo, é agora possível determinar as sequências de aminoácidos de quaisquer domínios desejados de um anticorpo de escolha e, opcionalmente, preparar cadeias homólogas com um ou mais aminoácidos substituídos por outros aminoácidos desejados, de modo a se obter uma gama de análogos substituídos.
Na aplicação de tais métodos, é para ser entendido que, devido à degenerescência do código genético, os métodos, tais como a síntese de oligonucleótidos aleatória e a síntese parcial de oligonucleótidos degenerados irá incorporar redundâncias de codões que especificam um 24 resíduo aminoácido particular numa posição particular, embora tais métodos possam ser utilizados para fornecer um conjunto principal de todas as possíveis sequências de aminoácidos e rastrear as mesmas para uma função ótima, como estruturas de anticorpos ou para outros fins. Tais métodos estão descritos em Cwirla et al, Proc. Natl. Acad. Sei. 87:6378-6382 (1990) e Devlin et al., Science 249:404— 406 (1990). Como alternativa, tais sequências de anticorpos podem ser sintetizadas quimicamente ou produzidas por outros meios bem conhecidos dos peritos na arte.
De acordo com a invenção aqui descrita, as variantes de anticorpos melhorados podem ser geradas através da combinação numa única estrutura polipeptídica uma, duas ou mais sequências de CDR novas como aqui divulgado (ver, por exemplo, SEQ ID N° : 11-34), cada um mostrando que resulta independentemente numa maior potência ou a atividade biológica. Desta maneira, várias novas sequências de aminoácidos podem ser combinadas num anticorpo, na mesma ou em diferentes CDRs, para produzir anticorpos com níveis desejáveis de atividade biológica. Tais níveis desejáveis, muitas vezes, resultam da produção de anticorpos, cujos valores de kon são pelo menos cerca de 2,5 X 105 ΝΓ1 s_1. A título de exemplo não limitativo, 3 novas sequências CDR de tal tipo podem ser empregues e os anticorpos resultantes podem ser rastreados em termos de potência, ou atividade biológica, utilizando quer o protocolo de rato do algodão ou o protocolo de microneutralização aqui descritos, em que o dito anticorpo demonstra elevada afinidade para uma estrutura antigénica particular, tal como o antigénio F de RSV. O resultado global seria, portanto, um processo iterativo de combinação de várias substituições de um único 25 aminoácido e rastreio dos anticorpos resultantes para a afinidade antigénica e potência numa maneira passo a passo, assegurando assim que a potência é aumentada sem sacrifício de um valor desejavelmente elevada, ou pelo menos mínimo para a afinidade.
Utilizando as novas sequências e métodos descritos no presente documento, tal abordagem permitiria evitar o tempo e os custos de geração e rastreio de todas as permutações e combinações possíveis de estruturas do anticorpo, num esforço para localizar o anticorpo com a máxima eficácia. Por outro lado, a escolha aleatória completa de um único resíduo de 10 aminoácidos CDR geraria mais de 10 triliões de variantes, um número virtualmente impossível de rastrear.
Este método iterativo pode ser usado para gerar substituições duplas e triplas de aminoácidos num processo passo a passo de modo a estreitar a busca de anticorpos com maior afinidade.
Por outro lado, deve notar-se que nem todos os locais dentro das sequências dos domínios de anticorpos diferentes podem ser iguais. Substituições de qualquer espécie num determinado local podem ser úteis ou prejudiciais. Além disso, as substituições de certos tipos de aminoácidos em locais determinados podem do mesmo modo ser um sinal positivo ou negativo em relação a uma afinidade. Por exemplo, pode não ser necessário tentar todos os possíveis aminoácidos hidrófobos numa dada posição. Pode ser que qualquer aminoácido hidrofóbico também surta efeito. Por outro lado, um aminoácido acídico ou básico num determinado local pode proporcionar grandes variações na afinidade 26 medida. É, portanto, necessário também para aprender as "regras" de fazer tais substituições, mas a determinação de tais "regras" não exige gue o estudo de todas as combinações possíveis e tendências de substituições se tornem aparentes após o examine de menos do que o número máximo de substituições.
De acordo com a presente invenção, tais regras determinam as mudanças de aminoácidos que devem ser feitas nas regiões CDR de anticorpos, ou as sequências de aminoácidos que têm de ser preparadas em polipeptidos de anticorpos inteiramente novos e sintéticos, de modo a alcançar altas afinidades. No entanto, foi agora descoberto que, ao passo que uma elevada afinidade é frequentemente uma propriedade de anticorpos úteis em aplicações terapêuticas, tais anticorpos não têm sempre uma potência suficiente para proporcionar utilidade prática em tais usos.
Como já foi descrito, a afinidade é medida pela razão entre as constantes de kon e kQ ff. Por exemplo, um kon de 105 M 1 seg-1 e um koff de 105 seg”1 iria combinar-se para dar uma constante de afinidade de IO10 M_1 (ver valores na Tabela 3) . No entanto, os anticorpos que apresentam tal afinidade elevada podem ainda não ter a potência necessária para torná-los em agentes terapêuticos úteis. De acordo com a presente invenção, a potência do anticorpo depende do valor da taxa de kon para a reação de ligação do anticorpo. Assim, um anticorpo, independentemente da afinidade para com o antigénio correspondente, irá apresentar um aumento na potência (tal como a capacidade de neutralização), onde o referido anticorpo tem um valor kon mais elevado, independentemente de Ka ou koff. 27
De acordo com os métodos aqui descritos, o aumento da potência de um anticorpo existente, independentemente da sua afinidade de antigénios, é obtido através de alterações seletivas de um ou mais dos aminoácidos presentes numa ou mais das regiões CDR do referido anticorpo, em que as referidas alterações de aminoácidos tem o efeito de produzir um aumento no kon para o referido anticorpo, de preferência, com um aumento na afinidade do anticorpo. A potência mais elevada pode ser obtida com um maior valor de kon, mesmo se a afinidade permanecer a mesma ou for reduzida um pouco. Tal anticorpo é mais vantajosamente produzido por síntese das cadeias polipeptídicas requeridas por meio de síntese em células apropriadamente modificadas tendo nelas incorporadas as sequências apropriadas de nucleótidos de codificação para as cadeias polipeptídicas que contêm os necessários segmentos alterados de CDR. Além disso, de acordo com os métodos aqui descritos, um novo anticorpo tendo um nível desejável de potência, ou de atividade biológica, pode ser preparado de novo por incorporação de aminoácidos selecionados em locais selecionados dentro das regiões CDR das referidas cadeias polipeptídicas do anticorpo utilizando células geneticamente modificadas tal como aqui descritas, ou na totalidade por síntese química das cadeias polipeptídicas requeridas com a consequente formação das ligações bissulfureto necessárias. A este respeito, deve-se ter em mente claramente que os anticorpos produzidos de acordo com os métodos aqui descritos podem ser anticorpos que possuam estruturas diméricas, tetraméricas ou monoméricas. Assim, o termo "anticorpo", tal como aqui utilizado, inclui moléculas de anticorpos tetraméricas inteiras, como são normalmente 28 encontradas na natureza, bem como as suas porções e fragmentos, incluindo L2H2, LH, Fab, F (ab')2, e outros fragmentos, em gue o único reguisito de tais estruturas é gue retenham a atividade biológica tal como medida pelos ensaios e protocolos aqui descritos.
Em conformidade com o acima exposto, os anticorpos da presente invenção são os anticorpos monoclonais de elevada afinidade. Tais anticorpos, no entanto, são monoclonais apenas no sentido em que eles podem ser derivados de um clone de um único tipo de células. No entanto, isto não pretende limitá-las a uma origem particular. Esses anticorpos podem rapidamente ser produzidos em células que normalmente não produzem anticorpos, tais como as células CHO ou COS. Além disso, estes anticorpos podem ser produzidos noutros tipos de células, especialmente células de mamiferos e até mesmo de plantas, por modificação genética de tais células para expressar e montar as cadeias leves e pesadas de polipéptidos que constituem o produto de anticorpo. Além disso, essas cadeias podem ser sintetizadas quimicamente mas, uma vez que seriam especificas para um dado determinante antigénico, ainda constituiriam anticorpos "monoclonais" dentro do espirito em que o termo é utilizado. Assim, tal como aqui utilizado, o termo anticorpo monoclonal destina-se a denotar mais a especificidade e pureza das moléculas de anticorpos produzidos pelos processos aqui descritos, em vez de o mero mecanismo utilizado para a produção dos referidos anticorpos.
Além disso, tal como aqui utilizado, o termo potência destina-se a descrever a dependência do efeito do anticorpo, quando utilizado para os fins a que se destina, 29 à concentração de tal anticorpo. Assim, a potência significa a atividade biológica em relação a um dado antigénio. A título de exemplo não limitativo, a potência ou a atividade biológica, ou efeito biológico, é medida para um anticorpo anti-RSV, por qualquer procedimento de rato do algodão ou do procedimento de microneutralização, como descrito na secção de Métodos.
Por outro lado, a afinidade de um anticorpo para o antigénio é simplesmente uma medida matemática da relação de kon para koff.
Além disso, as afinidades (Ka) dos anticorpos produzidos de acordo com os métodos aqui descritos serão tipicamente na gama de IO10 M'1. Este intervalo pode ser, por exemplo, 10 vezes, maior ou menor, de IO10 M_1, ou seja mais de 10 vezes maior do que IO10 M_1, ou pode mesmo ser numericamente igual a IO10 M_1. A afinidade do anticorpo para o antigénio é proporcional ao valor dessa constante (isto é, quanto maior for a constante, maior será a afinidade, devido a uma maior concentração do complexo - ver a equação para a constante de afinidade). Tal constante é medida por um método padrão para reacções de cinética de anticorpos (tal como descrito no Exemplo 1).
Numa forma de realização, os anticorpos produzidos de acordo com os métodos aqui descritos (exceto na medida em que o termo "anticorpo" significa uma porção ativa, fragmento ou segmento, todos os quais, para os fins da presente divulgação, são considerados como incluídos dentro do significado do termo anticorpo) irá geralmente compreender um mamífero, de preferência, uma região humana constante e uma região variável, a referida região variável 30 compreendendo as regiões estruturais de cadeia pesada e leve e CDRs de cadeia pesada e leve, em que as regiões estruturais de cadeia pesada e leve têm sequências caracteristicas de um anticorpo de mamífero, de preferência um anticorpo humano, e em que as sequências de CDR são semelhantes às de um anticorpo de algumas outras espécies que não a humana, de preferência um ratinho. Quando as sequências de aminoácidos estruturais são caracteristicas de um ser não-humano, este último é de preferência um ratinho.
Noutra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo humano, em que o anticorpo tem um valor de kon, tal como aqui descrito para estabelecer a potência aumentada.
Além disso, os anticorpos produzidos de acordo com o presente invento normalmente irão ligar-se ao mesmo epítopo que, antes de aplicar os métodos aqui descritos para aumentar o valor de kon. Assim, depois da aplicação dos métodos descritos neste documento, o anticorpo terá sequências CDR semelhantes, mas não idênticas, às sequências de CDR antes da aplicação dos métodos aqui revelados, em que pelo menos uma dos CDRs do referido anticorpo irá conter uma sequência de aminoácidos de alta potência, tal como uma selecionada a partir de SEQ ID N°: 11-34, 55-59, DIWWDGKHSYNPSLKS, DTFRLAS e DTFYLSS se o anticorpo for para ser utilizado para neutralizar um vírus, tal como o RSV.
De acordo com o exposto, e de modo a melhor descrever as sequências divulgadas de acordo com a invenção em relação a um anticorpo humanizado contra o RSV, uma sequência de base ou de partida de regiões variáveis de cadeias leves e 31 pesadas de um anticorpo, ou um seu fragmento, cuja eficácia é para ser aumentada, são mostrados na Figura IA (região variável de cadeia leve SEQ ID N°: 1) e Figura 1B (região variável de cadeia pesada SEQ ID N° : 2), ou um fragmento Fab de um tal anticorpo (por exemplo, as sequências da Figura 2a (região variável de cadeia leve SEQ ID N° : 3) e Figura 2B (região variável de cadeia pesada SEQ ID N°: 4). Também de acordo com a invenção, aminoácidos específicos diferentes dos destas sequências de partida foram gerados por métodos recombinantes, preparados a partir de sequências de nucleótidos concebidas para gerar as referidas sequências de aminoácidos, quando expressas em células recombinantes. Os produtos das referidas células são os anticorpos monoclonais da presente invenção. Alternativamente, tais anticorpos podem ser produzidos sem a utilização de uma célula modificada ou recombinante por meios sintéticos bem conhecidos na arte.
Numa forma de realização da presente invenção, a potência é aumentada, usando um anticorpo neutralizante contra o vírus sincicial respiratório (RSV), que tem uma constante de afinidade de pelo menos ΙΟ9 ΝΓ1 e, de preferência, pelo menos, 10 10 M_1 (para o antigénio F do mesmo) através do aumento do valor de kon para pelo menos 2,5 x 105 Nf1 sec"1. Os aminoácidos presentes nas CDRs de um tal fragmento de Fab são mostrados na Tabela 3 (por exemplo, o clone 5).
De um modo geral, o método utilizado para determinar a afinidade e as constantes de cinética de anticorpos, antes e depois da aplicação dos métodos da presente invenção para aumentar o valor de kon/· era o de gerar as sequências de nucleótidos para os genes que expressam as cadeias de anticorpos desejadas (em conformidade com a presente 32 invenção) e inseri-los em vetores que foram então usados para transformar células COS-1 por protocolos padrão. As células foram cultivadas em poços de e o sobrenadante foi amostrado e medido para a ligação do antigénio utilizando técnicas de ELISA convencionais. Esses polinucleótidos foram concebidos de modo a fornecer uma ou mais substituições de aminoácidos nas CDRs, que poderiam então ser rastreadas em termos de valores crescentes de kon/· com substituições benéficas (aquelas que produziram valores aumentados de kon) sendo seletivamente combinadas em termos de afinidade aumentada. Estas são então subsequentemente rastreadas em termos de afinidade de ligação ao antigénio correspondente, tal como o antigénio F de RSV em relação à estrutura de base ou de referência, determinando assim que nenhuma alteração grave na afinidade resultou do aumento dos valores de kon.
Em formas de realização especificas, a presente invenção refere-se a um anticorpo isolado compreendendo uma constante de afinidade de pelo menos ΙΟ9 M_1, de preferência, pelo menos, IO10 M”1 e mais preferivelmente, pelo menos, 1011 M-1 e em que o kon é pelo menos cerca de 2,5 x ΙΟ5 Μ-1 sec-1, de preferência pelo menos cerca de 5 x 105 M” 1 sec"1, e ainda mais preferivelmente pelo menos 7,5 x 105 M” 1 sec-1 (incluindo todas as suas combinações).
Além disso, de acordo com a presente invenção, tal anticorpo isolado pode ser qualquer tipo de anticorpo já conhecido ou recém-sintetizada e novo. Assim, os anticorpos produzidos de acordo com os métodos descritos neste documento incluem um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste de um anticorpo de mamífero de ocorrência natural, anticorpos humanos de ocorrência 33 natural, anticorpos de ratinhos de ocorrência natural, anticorpos de cadeia simples, anticorpos quiméricos (com regiões constantes de um anticorpo de uma espécie e regiões variáveis de um anticorpo de uma espécie diferente), anticorpos enxertados de CDR (com regiões CDR de um anticorpo de uma espécie e as regiões constantes e, possivelmente estruturais, de um anticorpo de uma espécie diferente), anticorpos humanizados ( em que os aminoácidos selecionados, tanto das regiões estruturais variáveis e/ou de CDR, foram alterados de forma a serem semelhante a um anticorpo humano, apesar de essas sequências serem em grande parte derivadas de uma espécie diferente, tal como um ratinho), de preferência anticorpos de ratinho humanizados, anticorpos alterados de mamíferos, de preferência ratinhos, mais preferencialmente humanos, (em que aminoácidos selecionados de um anticorpo existente foram alterados, em algum ponto da cadeia polipeptídica, geralmente através de técnicas de modificação genética, para produzir estruturas de anticorpos semelhantes às estruturas de anticorpos em que se baseiam), e novos anticorpos totalmente sintéticos, este último não existindo previamente por natureza. São também divulgados métodos de aumento da potência de um dos tipos mencionados em cima de anticorpos (como descrito anteriormente) que compreende a alteração seletiva dos aminoácidos dentro das regiões variáveis do anticorpo de modo a aumentar o valor de kon medido do referido anticorpo com respeito a um antigénio particular. Naturalmente, o valor de kon pode ser diferente para o mesmo anticorpo seguindo as mesmas alterações de aminoácidos em que a reação é medida usando um antigénio diferente ou determinante antigénico. No entanto, em tais casos, as 34 afinidades são também suscetíveis de mudar à medida que a identidade dos determinantes antigénicos altera.
Além disso, de acordo com os métodos aqui descritos as mudanças de aminoácidos introduzidas nas sequências polipeptídicas de tais anticorpos são de preferência restritas para as porções de CDR das regiões variáveis dos anticorpos embora estas possam envolver alterações nas regiões estruturais, também.
Embora as sequências de CDR mais vantajosas sejam normalmente identificadas por rastreio de clones modificados de anticorpos, cuja potência é para ser aumentada pelos métodos aqui descritos, assim que estes clones de alta potência tenham sido identificados o anticorpo resultante é mais vantajosamente produzido por meio de síntese depois das cadeias polipeptídicas pesadas e leves apropriadas dentro de células animais ou vegetais adequadas, após a introdução em tais células de vetores adequados contendo as sequências de ADN adequadas que correspondem às sequências de aminoácidos desejadas, tirando partido do código genético para conceber as sequências de nucleótidos necessárias. Como consequência desta abordagem, os anticorpos totalmente novos com alta potência podem ser produzidos no início com as identidades de sequências de aminoácidos sugeridas pelos métodos aqui descritos sem a necessidade de selecionar sequências de anticorpos já existentes para a modificação. Assim, os métodos aqui descritos facilitam a produção de anticorpos de alta potência de uma estrutura completamente nova na medida em que as suas sequências de CDR são CDRs de elevada potência, conforme determinado pelos métodos aqui descritos, de modo a aumentar deliberadamente os valores de 35 kon de tais anticorpos e sem destruir a especificidade e afinidade de tal anticorpo para com o alvo antigénico pretendido.
Numa forma de realização dos métodos descritos no presente documento, um anticorpo já existente é modificado para aumentar a potência do mesmo, através do aumento do valor de kon· Numa forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo com afinidades elevadas, por exemplo, pelo menos cerca de 109 M”1 ou ΙΟ10 1ΧΓ1. 0 anticorpo é sintetizado, utilizando clones ou células animais ou vegetais geneticamente modificadas, de forma a introduzir alterações de aminoácidos nas cadeias polipeptidicas pesadas e/ou leves do referido anticorpo, de preferência em que as referidas alterações de anticorpos são introduzidas nas regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das referidas cadeias polipeptidicas, para aumentar o valor kon para ligação do referido anticorpo a um antigénio particular com o aumento concomitante da potência do anticorpo. Assim, os métodos aqui descritos são, vantajosamente, utilizados para produzir uma molécula de anticorpo, em que o valor de kon do referido anticorpo a seguir às alterações de aminoácidos das suas sequências, de preferência as regiões variáveis da referida sequência, ainda mais preferivelmente as porções de CDR, é maior do que o valor de kon exibido pelo dito anticorpo antes das referidas alterações de aminoácidos em que os valores de kon são medidas em relação ao mesmo antigeno.
De um modo geral, quando os métodos aqui descritos são aplicados aos anticorpos conhecidos, a kon dos referidos anticorpos será aumentada em, pelo menos, 2 vezes, de preferência pelo menos 5 vezes, e mais preferivelmente pelo 36 menos 10 vezes. Mais especif icamente, o valor de kon do referido anticorpo é aumentado para, pelo menos, cerca de 2,5 x 105 M”1 sec-1, de preferência aumentado para pelo menos 5 x 105 M-1 sec-1, mais preferivelmente pelo menos 7,5 x 105 M-1 sec-1.
Uma vez que os métodos aqui descritos são igualmente eficazes para a conceção de novos anticorpos recombinantes de alta potência previamente desconhecidos, também é divulgado um método para produzir um anticorpo que possui um valor de kon de pelo menos 2,5 x 105 M-1 s-1, compreendendo a preparação de um anticorpo cujas sequências polipeptidicas contêm aminoácidos selecionados em locais selecionados, especialmente nas sequências de CDR e, em seguida, os referidos anticorpos são submetidos a rastreio para verificar os que têm um valor de kon de pelo menos 2,5 x 105 M-1 s-1, ou um valor de kon de pelo menos 5 x 105 M 1 s-1, ou mesmo de 7,5 x 105 M-1 s-1. Tais anticorpos irão resultar da presença de uma ou mais das CDRs de alta potência, tal como aqui divulgadas. Tais anticorpos são facilmente rastreados em termos de valores de kon elevados.
Os métodos aqui descritos podem ser utilizados para a produção de anticorpos com elevada potência, ou anticorpos de potência aumentada, tendo afinidade para com um antigénio caracteristico do virus sincicial respiratório (RSV).
Noutra forma de realização, a presente invenção refere-se a composições e medicamentos para utilização na prevenção ou tratamento de uma doença que compreende a referida composição ou medicamento com quantidade terapeuticamente ativa de um anticorpo preparado pelos métodos aqui 37 descritos. Assim, tal anticorpo pode ser um anticorpo completamente novo ou um anticorpo conhecido e clinicamente útil, cuja potência foi aumentada pela aplicação de um dos métodos aqui descritos. A doença prevenida ou tratada por anticorpos preparados pelos métodos aqui descritos podem ser qeralmente doenças causadas por microrganismos, tais como bactérias e vírus, de preferência vírus e, mais preferencialmente RSV.
Os anticorpos assim divulgados também têm geralmente regiões estruturais derivadas de um anticorpo humano, mas quando não têm tal derivação, são de preferência de um ratinho.
Na geração dos clones, o anticorpo de base ou de referência (regiões variáveis de cadeia pesada e leve (CDRs mais Estrutura) mostradas nas Figuras 1 e 2) foi utilizado como o "template" para gerar as novas sequências de CDR dos anticorpos da presente invenção, esta última transmitindo valores mais elevados de kon. Abordagens padrão para caracterizar e sintetizar as seis bibliotecas de CDR de mutações simples foram utilizadas (ver Wu et al, Proc.
Natl. Acad. Sei. 95:6037-6042 (1998). A CDR alvo foi primeiramente suprimida de cada uma das bibliotecas antes do recozimento dos nucleótidos. Para a síntese das bibliotecas, as CDRs de um anticorpo de referência (ver figura 2) foram definidas como na Tabela 1. A mutagénese à base de codão foi aplicada para a síntese de oligonucleótidos, para se obter as sequências de CDR da presente invenção (tal como descrito acima).
As bibliotecas foram inicialmente rastreadas por captura ascendente para identificar as variantes de maior 38 afinidade. Subsequentemente, estes clones foram ainda caracterizados através de captura ELISA e, por titulação com antigénio imobilizado. Seguindo tal rastreio, os anticorpos são então rastreados em termos dos seus valores respetivos kon, cujos efeitos positivos são, em seguida, medidos por determinação da potência. As Figuras 4 e 5 mostram detalhes adicionais sobre os procedimentos de preparação e de rastreio aqui utilizados.
Tabela 1. Sequências de CDR de base, tal como previstas na
Figura 2. CDR Resíduos da Fig. 2 |Sequência SEQ ID N°. LI 24-33 ISASSSVGYMH 5 | L2 49-55 |dtskla.s 6 | L3 88-96 |FQGSGYPFT 7 Hl 31-37 TSGMSVG 8 |H2 52-67 | D IWWDDK|®YNP SLKS 9 |H3 100-109 ISMITOWYFDV 10
De acordo com a presente invenção, o ADN, a partir das variantes mais elevadas de kon foi sequenciado para determinar a natureza das substituições de potência benéfica ou alta. Após o rastreio, os anticorpos são então preparados com as substituições de aminoácidos de kon elevado, quer isoladamente ou em várias combinações, de modo a maximizar os efeitos de tais substituições e, assim, produzir anticorpos de elevada afinidade que também exibam uma potência elevada.
Como regra geral, verificou-se que as CDRs de kon elevado mais benéficas resultam de substituições de aminoácidos num máximo de 6 CDRs. Assim, os anticorpos neutralizantes de 39 alta potência (isto é, de kon elevado) aqui divulgados contêm sequências de aminoácidos que diferem das do anticorpo de base ou de referência (por exemplo, tal como mostrado nas Figuras 1 e 2) apenas em regiões determinantes de complementaridade LI (ou CDRL1) , L2 (ou CDRL2) , L3 (ou CDRL3), Hl (ou CDRH1) e H3 (ou CDRH3). TABELA 2: Sequências de CDRs que tendem a induzir uma potência elevada em anticorpos.
Clone | CDR |CDR de alta potência | Sequência ÍSEQ ID N°. i |i |li j- jSASSSVGYMH 5 | Jl2 X 1 DT@tI@ I14 i |L3 j- (fqgsgypft (7 i |hi X i t@gmsvg Í24 | |H2 i- í DIWWDDKKDYNP SLKS 19 | |------------------- Jh3 : :x í gMITN@VFDV l31 i |2 iL1 i- ! SASSSVGYMH (5 ( |l2 jx í DI^CLAS (] 5 i |l3 i- Ífqgsgypft í7 i IH1 |x j T0OMSVG ! 24 i |H2 j- | DIWWDDKKDYNP SLKS (9 i |H3 ix j g^M^NWYFDV í32 i I3 1li i_ (SASSSVGYMH Í5 i |L2 jx j DT0K@S 116 i |L3 : · (fqgsgypft (7 i |hi i ix i iQqmSVO Í24 i j 112 ( j- | DIWWDDKKDYNP SLKS (9 ( 1113 ; íx j @MJ§NWYFDV í32 i 4 |li : : — i! SASSSVGYMH Í5 i 40
Clone ÍCDR CDR de alta potência i Sequência í SEQ ID N°. í Jl2 X DT®L§S I17 |l3 - ÍFQGSGYPFT í7 |hi X : tQgmsvq I24 Jh2 - ídiwwddkkdynpslks I9 1 ] |H3 X 1 @kfl@NWYFDV I32 í ] 5 1L1 - ISASSSVGYMH õ !l2 X i dt§klas |i5 |L3 - ífqgsgypft I7 |hi X i T0CMSVG 124 í |h2 - j DIWWDDKKD YNP SLKS I9 |h3 X I 0Μ1ΤΝ§ΥΡθν I31 j 6 !l1 _ !SASSSVGYMH í 5 í |l2 X j DT@CLAS I15 Jl3 X i FQG5@YTFT I23 ] |H 1 X i T0GMSVO I24 1 i iH2 - ÍDIWWDDKKDYNPSLKS !9 ] |h3 X i SMIT*@YFDV !33 |7 iL1 X i SASS@VOYMH ín ÍL2 X í D10KLAS I15 ÍL3 - ÍFQGSGYPFT |7 |hi X Í T0OMSVG I24 i |H2 - ÍDIWWDDKKDYNPSLKS I9 í j |h3 X í @M1TN§YFDV I31 i i; |8 iL1 - íSASSSVGYMH I5 í |L2 X i D1@LAS í 60 í |L3 - ÍFQGSGYPFT !7 |hi X í T0OMSVG I24 1 |H2 - ÍDIWWDDKKDYNPSLKS I9 1 41
Clone jcDR CDR de alta potência j Sequência j SEQ ID N°. |H3 X 1 ©tflTNgYFDV I31 9 !li X ! S0S5@VOYMH í 12 |L2 X j D1@L@S í 61 |L3 - ÍFQGSGYPFT j 7 |hi X j tQgmsvo í 25 |H2 X ! DIWWDDKK0YNPSLK@ í 26 — |h3 X í @MI@N@YFDV j 34 10 iL1 X j S0SSgVGYMH 112 |L2 X i DT@ugs| j 18 |l3 - ÍFQGSGYPFT j 7 IH1 X ] T0QMSVO 125 ! H2 X j DrWWD@KK@YNPSLK@ j 27 |η3 X j @M^N@YFOV ! 34 11 Ili X j S0SS0VGYMH j 13 Jl2 X j PliWRtAS j 19 |l3 - ÍFQGSGYPFT j 7 !hi X j T@GMSVG j 2o Jh2 X i DtWWD@KX@YNPSLK@ j 27 |H3 X j @Vllgt^YFDV I34 12 |l1 X i sQssgVGYMH 112 Jl2 X í DT@Kt-{s}s j 20 |l3 - ÍFQGSGYPFT 17 !hi X : igGMSVG 124 |h2 X i DIWWD§KK0YNPSLK@ j 27 |H3 X ] @M1@N@YFDV I34 13 Ili X j SASS®VGYMH | ii |L2 X í DT^KLgs í 20 42
Clone jcDR CDR de alta potência j Sequência j SEQ ID N°. j |L3 - ÍFQGSGYPFT I7 (hi X j T0GMSVG 124 í |H2 X j D1WWCgKKDYNPSLK0 I28 — Jh3 X j ^MI@N@YFDV I34 1 14 !li X j S0SÍ0VGYMH I13 |L2 X j DT|YRHSE !21 |L3 - ÍFQGSGYPFT I7 Ihi X | T0GMSVG 124 j |H2 X : R1WWDDKK0YNPSLK0 129 ÍH3 X i @WI§NWYFDV 32 j 15 Ili X j S@SS@VGYMH 112 í |l2 X j DljMYOSlS 22 Jl3 - ÍFQGSGYPFT !7 IH1 X j 10GMSVG 124 j Jh2 X i OIWWt3@KK§YNPSLK@ I30 |h3 X j @MI^®YFDV 134 j 16 !l1 X I [kçJjlsvgymh I59 Jl2 - ídtsklas I6 1 |l3 - ífqgsgypft h í IH1 - ítsgmsvg I8 í |H2 - ídiwwddkkdynpslks I9 |h3 - 1 SMITNWYFDV |10 17 !l1 - 1SASSSVGYMH I5 I Jl2 X i DT@KLAS I15 í |l3 X i fqgsQypft I23 |hi X í T0GMSVG 124 Jh2 - ÍDIWWDDKKDYNPSLKS I9 1 |h3 X j SMlTIvgYFDV I33 i 43
Clone ΐ CDR i CDR de alta potência Sequência ÍSEQ ID N°. j 18 |L1 |x OjSS§VGYMH Í56 | |l2 x DllMYQSlS l22 ! |L3 i- FQGSGYPFT I7 I | |hi ix T0GMSVG j 24 I I Μ |x Dl WWD§ICK§YNPSLKS 152 1 j H3 X @MI@N@YFDV ] 34 | |_____________________|____________ 19 |li jx SASS^VGYMH i H | !l2 X D1@L@S 157 1 !l3 I- FQGSGYPFT \Ί i 1H1 |x -iQgmsvg j 24 j lH2 ix DIWWDDKK@YNPSLK@ 126 j I 1H3 X §MI§N@yFDV Í 34 j i 20 |L1 X sgss§VOYMH 113 \ |L2 X DT(RY9^S Ϊ 5S j |l2 FQGSGYPFT I7 i ] )hi X tQgMSVG 124 | ] |h2 ix DIWWDDKX§YNPSLK@ j55 ! ! ÍH3 Ix 0miÍInwyfdvI 132 \ . 1........... .............·.·.·.···· —————
Assim, para as sequências de aminoácidos da Figura 3, os aminoácidos selecionados da sequência da Figura 2, foram substituídos como um meio de aumentar a potência do anticorpo com sequências de cadeia leve e pesada, mostrado na Figura 2.
Os anticorpos selecionados com kon elevado (e fragmentos ativos dos mesmos) resultantes dos métodos aqui descritos são apresentados na Tabela 2 (todos eles têm as sequências 44 estruturais da Figura 2) em que o clone de referência é o clone com as sequências de região variável de cadeia pesada e leve apresentadas na Figura 2 (SEQ ID N°: 3 e 4 para as sequências de cadeia leve e pesada, respetivamente). A Tabela 2 indica as sequências de aminoácidos (todas as sequências de código de padrão de uma letra de aminoácidos) das CDRs de kon elevado empregues nos anticorpos de alta potência preparados de acordo com os métodos aqui descritos. Na tabela 2, as localizações das substituições chave de aminoácidos feitas nas CDRs correspondentes da tabela 1 (isto é, os locais em que as CDRs diferem em aminoácidos) são indicadas por uma caixa em torno do(s) amino ácido(s).
De acordo com a invenção, através da combinação de tais substituições de aminoácidos de modo a que mais do que um ocorresse na mesma molécula de anticorpo, foi possível aumentar grandemente a potência dos anticorpos aqui descritos.
De um modo geral, existe uma correlação entre kon e a potência do anticorpo, em que todas as variantes de k, mais elevado têm mais do que uma CDR benéfica de k, elevado, incluindo todas as seis CDRs substituídas.
Numa forma de realização, um anticorpo preparado de modo a ter um kon aumentado é um anticorpo neutralizante de RSV, com uma afinidade de pelo menos 109 M_1 e, de preferência, pelo menos, IO10 M-1, que também é um anticorpo humanizado que inclui uma região constante humana e uma estrutura para as cadeias pesada e leve, em que pelo menos uma parte da estrutura é derivada de um anticorpo humano (ou a partir de 45 uma sequência de consenso de uma estrutura de anticorpo humano).
Noutra forma de realização, toda a estrutura é derivada de um anticorpo humano (ou de uma sequência de consenso humana).
Noutra forma de realização, um anticorpo produzido de acordo com a presente invenção, com uma afinidade de pelo menos ΙΟ9 ΝΓ1 e, de preferência, pelo menos, ΙΟ10 M_1, é um anticorpo enxertado com uma região constante humana, uma ou mais CDRs que são derivadas de um anticorpo não-humano, em que pelo menos um dos aminoácidos em pelo menos uma das referidas CDRs é modificado, e em que a totalidade ou uma parte da estrutura é derivada de um anticorpo humano (ou de uma sequência de consenso de uma estrutura de anticorpo humano).
Contanto que as sequências desejadas de CDR, bem como a sequência constante e estrutural sejam conhecidas, os genes com as sequências desejadas podem ser montados e, utilizando uma variedade de vetores, inseridos em células adequadas para a expressão das moléculas de anticorpos tetraméricos funcionais. 0 acoplamento deste com a metodologia já descrita, permite o conjunto de bibliotecas de uma única mutação em que os anticorpos possuem as mesmas sequências que anticorpos enxertados correspondentes e, portanto, a mesma estrutura e afinidades de ligação.
As combinações de sequências de CDR descritas na Tabela 2 podem estar presentes em moléculas de anticorpos tetraméricos inteiras ou em fragmentos ativos, tais como o fragmento Fab. Os dados relativos ao potencial de clones de 46 1 a 15 apresentados na Tabela 3 são para os fragmentos Fab, enquanto que os dados para os clones 16 e 17 da Tabela 3 são para moléculas de anticorpos completas (clone 16 é MED1-493 com a sequência descrita em Johnson et al (1997)).
As moléculas de anticorpo inteiras de acordo com a presente invenção incluem moléculas de anticorpos com sequências de cadeias pesadas (região variável mais constante) selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51 e 53 e com as sequências de cadeia leve (região variável mais constante) selecionadas a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, e 54.
Os anticorpos com kon relativamente elevado da presente invenção podem estar presentes sob uma forma relativamente pura ou isolada, assim como um sobrenadante retirado das células cultivadas em poços ou em placas. Os anticorpos da invenção podem, assim, estar também presentes na forma de uma composição que compreende o anticorpo da presente invenção e em que o referido anticorpo é suspenso num diluente ou excipiente farmacologicamente aceitável. Os anticorpos da presente invenção podem estar presentes numa tal composição e a uma tal concentração, ou quantidade, suficiente para ter valor terapêutico ou farmacológico no tratamento ou prevenção de doenças (por exemplo, evitando a RSV, incluindo a maior incidência de asma e sibilos que muitas vezes ocorrem após tais infeções). Os referidos anticorpos podem também estar presentes numa composição numa forma mais diluída.
Em consequência, a invenção também é dirigida a proporcionar composições e medicamentos para utilização na 47 prevenção e/ou tratamento de doenças, especialmente doenças virais, mais especialmente infeções pelo vírus sincicial respiratório, a referida composição ou medicamento compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição de anticorpo aqui descrita.
Numa forma de realização particular, um anticorpo neutralizante de alta potência da presente invenção, tem as sequências de domínio de cadeia pesada e de domínio de cadeia leve representadas na Figura 3B (SED ID NO: 36) e Figura 3A (SEQ ID N°: 35), respetivamente. As CDRs de cadeia pesada e leve são as mesmas que as indicadas na Tabela 2 para o clone 15.
Deve-se ter em mente que, embora os anticorpos de kon aumentado da presente invenção poderiam ser montados a partir de regiões CDR e de regiões não-CDR derivadas de anticorpos neutralizantes reais pela união de segmentos de aminoácidos em conjunto (e os anticorpos assim reunidos estariam dentro do âmbito da invenção aqui descrita), os anticorpos da presente invenção, são mais convenientemente preparados por modificação genética de sequências de genes apropriadas em vetores que podem então ser transfectados para linhas de células adequadas para a expressão final de moléculas de anticorpos reunidos pelas células manipuladas. Na verdade, esses procedimentos recombinantes foram utilizados para preparar os anticorpos aqui descritos. Além disso, como as sequências das cadeias de anticorpos de elevada afinidade são conhecidas a partir da presente divulgação, estes anticorpos podem também ser reunidos por síntese direta das cadeias adequadas e depois deixados a se auto-organizar em estruturas de anticorpos tetraméricos. 48
Materiais e Métodos Gerais
Anticorpos monoclonais. MEDI-493 é uma igGl (COR)/kappa (K102) MAb humanizado (sequências de região variável de cadeia pesada e leve mostradas na Figura 1), contendo os determinantes de ligação de antigénio de MAb murino 1129 [Johnson et al, J. Infect. Dis, 176, 1215-1224 (1997);
Beeler e van Wyck Coelingh, J. Virol, 63, 2941-2950 (1989)].
Ensaio de Inibição de Fusão de RSV. A capacidade dos anticorpos para bloquear a fusão induzida por RSV após ligação virai às células foi determinada num ensaio de inibição de fusão. Este ensaio foi idêntico ao ensaio de microneutralização, exceto que as células foram infetadas com RSV (Longa) durante quatro horas antes da adição de anticorpo [Taylor et al, J. Gen. Virol., 73, 2217-2223 (1992)] .
Análise BIAcore. A análise do epitopo dos MAbs foi realizada utilizando um biossensor BIAcore (BIAcore, Piscataway, NJ) [Karlsson et al, J. Immunol. Methods, 145, 229-240 (1991); Johne, Mol. Biotechnol., 9, 65-71 (1998)] com um sistema microfluidico de ressonância por plasmina. O antigénio utilizado para este ensaio foi um RSV truncado (A2) de proteina F (aminoácidos 1-526), expressa em baculovirus. A proteina F de RSV purificada foi covalentemente acoplada a um chip de sensor CM5 ativado por W-hidroxisuccinimida/l-etil-3- [3-dimetilaminopropil]- carbodi-imida, de acordo com o protocolo do fabricante, e os grupos de ésteres ativos não reagidos foram feitos reagir com 1 M de etanolamina. A primeira injeção de 1 μΜ ou 10 μΜ de MEDI-493 foi seguida por um passo de lavagem 49 com HBSS, e em seguida, por uma injeção secundária de MEDI-493 ou RHSZI9. Os sensogramas foram analisados utilizando o software BIAevaluation.
Calorimetria de Titulação Isotérmica. A afinidade de solução de cada MAb para a proteina F de RSV foi determinada por calorimetria de titulação isotérmica [Wiseman et al, Anal. Biochem., 179, 131-137 (1989)]. Uma solução de 1,4 mL de 4,5 μΜ da proteina F de RSV foi titulada com 5,5 pL de injeções de 26 μΜ de MEDI-493 RSHZ19. Depois de cada injeção de MAb, a quantidade de calor libertado, a qual é proporcional à quantidade de ligação, foi medida. 0 antigénio usado foi um RSV (A2) truncado da proteina F (aminoácidos 25-524) expresso em células de drosofila. As titulações foram realizadas a 44° e 55 °C para se atingir um melhor sinal de ruido. A estabilidade térmica dos MAbs e da proteina F a estas temperaturas foi demonstrada por experiências de desdobramento por dicroísmo circular. As afinidades foram corrigidas para 37 °C por comparação com dados in vivo utilizando a equação de van't Hoff integrada [Doyle e Hensley, Methods Enzymol., 295, 88-99 (1998)]. A correção de van't Hoff é baseada unicamente na variação de entalpia de ligação da proteina F que foi medida diretamente por calorimetria. Uma vez que as mudanças de entalpia de ligação para a MEDI-493 e RSHZ19 demonstraram ser muito semelhantes, as correcções de temperatura para os seus Kds foram quase idênticas.
Profilaxia do Rato de Algodão. A eficácia in vivo é determinada utilizando o modelo de ratos do algodão [Prince et al, J. Virol., 55, 517-520 (1985)]. Os ratos do algodão (Sigmodon hispidus, peso médio de 100 g) foram anestesiados 50 com metoxiflurano, sangrados, e administrados com 0,1 mL de MAb purificado por injeção intramuscular (i.m.) em doses de 5, 2,5, 1,25, ou 0,625 mg/kg de peso corporal, ou controlo de seroalbumina de bovino (BSA) a 5 mg/kg de peso corporal. Vinte e quatro horas mais tarde, os animais são novamente anestesiados, sangrados para determinação dos níveis de concentração de MAb e inoculados por via instilação intranasal (i.n.) de 105 PFU de estirpes A (Longa) ou B (18537) de RSV. Quatro dias mais tarde, os animais são sacrificados e os seus pulmões são recolhidos. Os pulmões são homogeneizados em 10 partes (p/vol) de solução salina equilibrada de Hanks e a suspensão resultante foi utilizada para determinar os títulos virais pulmonares por ensaio de placas. Os títulos de anticorpos no soro, no momento da inoculação são determinados por um anti-IgG humana de ELISA. EXEMPLO 1
Análise cinética dos Mabs de RSV humanizados por BIAcoreTM A cinética da interacção entre Mabs anti-RSV de elevada afinidade e a proteína F de RSV foi estudada por ressonância de plasma de superfície utilizando um biossensor BIAcoreTM Pharmacia. Um baculovírus recombinante que expressa uma proteína F truncada de C-terminal proporcionou uma fonte abundante de antigénios para os estudos cinéticos. O sobrenadante, que continha a proteína F segregada, foi enriquecido aproximadamente 20 vezes por sucessivas cromatografias em colunas de concanavalina A e Q-sefarose. As frações reunidas foram dialisadas contra 10 mM de citrato de sódio (pH 5,5), e concentradas a cerca de 0,1 mg/mL. Numa experiência típica, uma alíquota da 51
proteína F (100 mL) estava ligada a amina ao chip do sensor BIAcore. A quantidade imobilizada deu cerca de 2000 unidades de resposta (Rmax) do sinal, quando saturada com H1129 ou H1308F (preparados tal como na Patente dos EUA 5,824,307). Isto indicou que houve um número igual de locais antigénicos "A" e "C" na preparação da proteína F após o procedimento de acoplamento. Dois Mabs independentes irrelevantes (RVFV 4D4 e CMV H758) não demonstraram qualquer interação com a proteína de F imobilizada. Um estudo típico de cinética envolveu a injeção de 35 mL de Mab em diferentes concentrações (25-300 nM) em tampão PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS/Tween). O caudal foi mantido a 5 mL/min, dando uma fase de ligação 7 min. Após a injeção de Mab, o fluxo foi trocado com tampão PBS/Tween durante 30 minutos para determinar a taxa de dissociação. O chip do sensor foi regenerado entre os ciclos com um impulso de 2 minutos, de 10 mM de HC1 . 0 passo de regeneração causou uma perda mínima de capacidade de ligação da proteína F imobilizada (perda de 4% por ciclo).
Este pequeno decréscimo não alterou os valores calculados das constantes de taxa de ligação e dissociação (também designadas de kon e kQff, respetivamente) .
Mais especificamente, para a medição da kassoc (ou kon) , a proteína F foi imobilizada diretamente pelo método de EDC/NHS (EDC = N-etil-N'-[3-dietilaminopropil)- carbodiimida). Resumidamente, 4 pg/mL de proteína F em 10 mM de NaOAc, pH 4,0 foi preparada e cerca de 30 pL de uma injeção dá cerca de 500 RU (unidades de resposta) de proteína F imobilizada sob as condições acima mencionadas. A célula de fluxo em branco (superfície de dextrano CM imobilizada VnR) foi subtraída para análise cinética. A coluna poderia ser regenerada utilizando HC1 a 100 mM (com 52 72 segundos de tempo de contacto a ser necessários para a regeneração completa). Este tratamento removeu Fab ligados por completo sem danificar o antigénio imobilizado e poderia ser usado por mais de 40 regenerações. Para medições de kon r as concentrações de Fab foram de 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM e 400 nM. A fase de dissociação foi analisada a partir de 230 segundos (30 segundos após o início da fase de dissociação) para 900 segundos. A cinética foi analisada por ajuste de Langmuir a 1:1 (ajuste global). As medições foram feitas em tampão HBS-EP (10 mM de HEPES, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,005% (v/v) de tensioativo P20.
Para as medições de clones combinatórios, como aqui divulgadas, o kon e koff foram medidos separadamente. O kon foi medido em condições que eram as mesmas que as dos clones de mutação simples e foi analisado de forma semelhante.
Para a medição do koff (ou kdlssoc) as condições que se seguem foram empregues. Resumidamente, 4100 RU de proteína F foram imobilizadas (como descrito em cima) com CM-dextrano utilizado como em branco. Aqui, 3000 RU de Fab foram ligadas (com o Fab dissociado o suficiente para compensar a flutuação da máquina) . HBS mais 5 nM de proteína F (cerca de 350-2000 vezes mais elevada do que a kdlssoc ou Kd - a constante de equilíbrio de dissociação), foi utilizado como tampão. A fase de dissociação foi de 6 - 15 horas, a uma taxa de fluxo de 5 pL/min. Sob as condições utilizadas na presente invenção, a re-ligação do Fab dissociado foi mínima. Para mais detalhes, consultar o manual do biossensor. 53 A ligação dos anticorpos anti-RSV de elevada afinidade com a proteína F, ou de outros sítios epitópicos no RSV, aqui divulgados, foi calculada a partir da razão entre a constante de taxa de primeira ordem para a dissociação da constante de taxa de segunda ordem para a ligação ou associação (Kd = kdiss/kassoc) . 0 valor para kassoc foi calculado com base na equação de taxa a seguir:
dR/dt=ka$$oc[M3b]Rmax (K assoe [Mab]+kdtss)R em que R e Rmax são as unidades de resposta no tempo t e infinito, respetivamente. Um lote de dr/dt em função de R dá uma inclinação de (kassoc [Mab] + kdiss)-Uma vez que estas inclinações estão relacionadas linearmente com o [Mab], o valor kassoc pode ser derivado a partir de um transplante das inclinações versus [Mab]. A inclinação da nova linha é igual a kassoc. Embora o valor de kdlss possa ser extrapolado a partir da interceção Y, um valor mais preciso foi determinado pela medição direta de kdiss · ApÓS 3. fase de injeção do Mab, o tampão PBS/Tween flui através do chip sensor. A partir deste ponto, [Mab] = 0. A equação acima indicada para dR/dt, portanto, reduz- se a: dr/dt = kdiss R or dR/R = kdiss dt A integração desta equação, então resulta em: ln(Ro /Rt) ^ Kdisa t em que R0/Rt) são as unidades de resposta no tempo 0 (início da fase de dissociação) e t, respetivamente. Por último, o plotting In (Ro/Rt) como uma função de t dá uma 54 inclinação de kd±Ss · Na presente forma de realização preferida, os valores numéricos a partir de tais variantes de anticorpos estão apresentados na Tabela 3.
Para os clones nas Tabelas 2 e 3, o clone de referência é o fragmento Fab com as sequências apresentadas na Figura 2 e CDRs mostradas na Tabela 1. Os clones 1-15 são fragmentos Fab que têm as sequências estruturais da Figura 2 e as combinações CDR indicadas dos clones 1-15 da Tabela 2 (em que "X" indica uma CDR de alta potência (por exemplo, uma CDR cuja presença versus a sequência de referência resultam numa potência elevada e numa potência mais elevada do que o Fab de referência) ) . Quando nenhum "X" aparece ao lado da CDR da Tabela 2, a sequência é apenas a sequência correspondente do Fab de referência (a partir da Tabela 1 e Figura 2).
Tabela 3. Resumo das Constantes Cinéticas para Anticorpos de Alta Potência. iClone N°. Kon x 105 (M^V1) |Koff x IO"4 (s_1) ECso (nM) | | Re f. 1,85 16, 5 3,52 | |i 3, 65 ! 3,2 6 2,26 | j 2 5,31 4,22 5, 05 | |3 6, 05 ! 4,22 4,70 | |4 7,57 4, 62 3,55 | j 5 4,16 3,06 2, 61 | j 6 1,85 3,20 2,88 | I 7 3,70 2,51 1,59 | i 8 3,75 |2,73 2, 67 | '9 6, 63 2,82 0,29 | ]io 5,27 |2, 99 1,06 | 11 5, 71 17,17 20, 9 | 12 7, 9 í4,53 3,24 | 55 55 IClone N°. |κοη x 105 (M 4s 4) |Koff x 10 4 (s 4) |eC5o (nM) 113 !7,4 3 j 2,3 C 10,81 ]14 17,35 ! 2,5 0 12,23 15 j 7,81 2,80 | , 5β ! 16 j2,04 77,35 16, 12 117 j 1, 09 !2,49 12,7
Tabela 4. Titulações de Microneutralização de RSV Final em igGs e Fabs de TAXA Mutante
Tipo|Clone |n°.
pg/iriL Média j IC50 ! Diferença | Media IC50 ! Padrão ;; Diferença | Número de| IC50 !Padrão jde ! (Controlo) ! (IC50 de! de |Repetições | j !Duplicaçãojpg/mL iControlo) iDuplicação!do Ensaio j || ! | | (IC50 de| | | I j i jControlo) I !
IgG | 16 24 0,4527| 0,208 j 0,0625! 0,0268 | 7 0,5351 0,0645 0,238 0,0223 4 5 6 18 23 21 0,03421 0,022 j 13 j 0,0354 j 0,0187 j 15 0,02171 0,0331 | 21 | 0,0289 | 0,0110 | 19 0,0231] 0,0141 I 20 j 0,0223 1 0,0083 j 24 Fáb 20 25 22 26 0,0337| 0,0309 0,0357! 0,0316 0, 0242 I 0,0163 0,0376! 0,0268 19 0,0171! 0,0018 13 13 19 12 27 0,0383 0,0354 0,0235 0,0375 0,0154 0,0283 0,0261 0,0076 0,0213 0,00417 14 15 23 14 35 5 7 7 6 2 12 27 11 0,157 0,0179! >1,00 | 3 25 0,125 0,0171 >1,00 4 31 0,0407! 0,0112 28 13 10 15 0,177 | 0,0287 j 0,00417j 0,0464|0,00791| 0,0264|0,00141| 11 3 16 10 17 0,0326 0,157 0,0310 0,0351 0,0258 0,009 0,00982 0,0126 0,00071 16 34 17 15 21 29 14 30 0,0414I - ! 11 ! 0,0411 j - j 13 0,120 | 0,0222 ! 4 j 0,1022 | 0,0260 ! 5 0,194 | 0,462 ! 2 j 0,176 j 0,0625 | 3 56
Os resultados da Tabela 4 comparam os fragmentos Fab e as moléculas de anticorpos tetraméricos completas enquanto relacionados com os valores de IC5o (ou concentração em pg/mL dando 50% de inibição versus controlos semelhantes aos da Tabela 3) . O clone 16 da tabela é o anticorpo de referência, com CDRs descritas na Tabela 2.
Os clones 16 e 17 da Tabela 3 são anticorpos monoclonais reais com as sequências estruturais da Figura 1 e as regiões constantes como descritas em Johnson et al (1997). As sequências estruturais destes anticorpos podem ser ligeiramente diferentes das dos fragmentos Fab.
Os clones 18 a 26 da Tabela 4 são moléculas de anticorpos tetraméricos semelhantes aos clones 16 e 17, mas tendo sequências de CDR de alta potência. O clone de anticorpo 21 tem as mesmas sequências de CDR que o clone de Fab 9, o clone do anticorpo 22 tem as mesmas sequências de CDR que o clone de Fab 10, o clone do anticorpo 23 tem as mesmas sequências de CDR que o clone de Fab 11, o clone do anticorpo 24 tem as mesmas sequências de CDR que o clone de Fab 12, o clone do anticorpo 25 tem as mesmas sequências de CDR que o clone de Fab 13, e o clone do anticorpo 26 tem as mesmas sequências de CDR que o clone de Fab 15. Os clones dos anticorpos 18, 19 e 20 da Tabela 3 são anticorpos tetraméricos de comprimento completo com combinações de CDR dadas na Tabela 2. As sequências estruturais destes anticorpos podem ser ligeiramente diferentes das dos fragmentos Fab.
Os aminoácidos sublinhados das sequências CDR da Tabela 2 representam os residuos de aminoácidos localizados nas posições-chave dentro das CDRs de alta potência dos 57 anticorpos de alta potência produzidos pelos métodos da presente invenção. Por exemplo, para aumentar a potência de um anticorpo através da produção de um valor mais elevado kon, os aminoácidos localizados nas posições-chave, conforme aqui ensinado pelos resíduos em negrito e sublinhados na Tabela 1 para o anticorpo de referência, poderiam ser substituídos pelos aminoácidos listados sob CDRs na Tabela 2 (e também em negrito e a sublinhado) . Assim, estes códigos de uma letra representam dos aminoácidos que substituem os aminoácidos de referência nas posições-chave (ou posições críticas) das CDRs mostradas na
Figura 2 (resíduos a negrito nas sequências da Tabela 2) para um anticorpo de referência cuja potência é para ser aumentada. Para os clones da Tabela 4, o clone 18 tem as sequências de comprimento completo dadas pela SEQ ID N° : 41 (cadeia pesada) e 42 (cadeia leve), o clone 19 tem as sequências de comprimento completo dadas pela SEQ ID N° : 45 (cadeia pesada) e 46 (cadeia leve), o clone 20 tem as sequências de comprimento completo dadas pela SEQ ID N° : 47 (cadeia pesada) e 48 (cadeia leve), o clone 21 tem as sequências de comprimento completo dadas pela SEQ ID N° : 51 (cadeia pesada) e 52 (cadeia leve), o clone 22 tem as sequências de comprimento completo dadas pela SEQ ID N° : 53 (cadeia pesada) e 54 (cadeia leve), o clone 23 tem as sequências de comprimento completo dadas pela SEQ ID N° : 49 (cadeia pesada) e 50 (cadeia leve), o clone 24 tem as sequências de comprimento completo dadas pela SEQ ID N° : 43 (cadeia pesada) e 44 (cadeia leve), o clone 25 tem as sequências de comprimento completo dadas pela SEQ ID N° : 37 (cadeia pesada) e 38 (cadeia leve) e o clone 2 6 tem as sequências 58 de comprimento completo dadas pela SEQ ID N°: 39 (cadeia pesada) e 40 (cadeia leve).
Aqui, o clone 18 (IgG) e o clone 27 (Fab) têm as mesmas CDRs, 0 clone 19 (IgG) e o clone 29 (Fab) têm as mesmas CDRs, 0 clone 20 (igG) e o clone 28 (Fab) têm as mesmas CDRs, o clone 21 dgG) e 0 clone 9 (Fab) têm as mesmas CDRs, o clone 22 dgG) e o clone 10 (Fab) têm as mesmas CDRs, o clone 23 dgG) e o clone 11 (Fab) têm as mesmas CDRs , O clone 24 (IgG) e o clone 12 (Fab) têm as mesmas CDRs, o clone 25 dgG) e o clone 13 (Fab) têm as mesmas CDRs, o clone 26 dgG) e o clone 15 (Fab) têm as mesmas CDRs. Assim, os dados da Tabela 4 correlacionam a atividade dos fragmentos de Fab com a de uma molécula de anticorpo completa.
Assim, a presente invenção inclui os anticorpos neutralizantes de alta potência completamente tetraméricos, em que o referido anticorpo tem uma sequência de aminoácidos de cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID N°: 37, 39, 41, 45, 47, 49, 43, 51 e 53, e uma sequência de aminoácidos de cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID N° : 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 e 54, de preferência na medida em que os referidos anticorpos são anticorpos dos clones 18-26. EXEMPLO 2
Ensaio microneutralização A neutralização dos anticorpos da presente invenção foi determinada por ensaio de microneutralização. Este ensaio de microneutralização é uma modificação dos procedimentos 59 descritos por Anderson et al ["Microneutralization test for respiratory syncytial virus based on an enzyme immunoassay", J. Clin. Microbiol. 22, 1050-1052 (1985)]. O procedimento utilizado aqui é descrito em Johnson et al [J. Infectious Diseases, 180, 35-40 (1999)]. As diluições de anticorpos foram efetuadas em triplicado, utilizando uma placa de 96 poços Ten TCID50 do virus sincicial respiratório (RSV - estirpe Longa), foram incubadas com diluições em série do anticorpo (ou Fabs) para serem testadas durante 2 horas a 37 °C em poços de uma placa de 96 poços. Células sensíveis a RSV HEp-2 (2,5 x 104) foram então adicionadas a cada poço e cultivadas durante 5 dias a 37 °C em C02 a 5%. Após 5 dias, o meio foi aspirado e as células foram lavadas e fixadas às placas com 80% de metanol e 20% de PBS. A replicação do RSV foi então determinada por expressão da proteína F. As células fixadas foram incubadas com um anticorpo monoclonal anti-proteína F conjugado com biotina (proteína pan F, Mab específico do local C 133-1H) e lavadas e avidina conjugada com peroxidase de rábano foi adicionada aos poços. Os poços foram lavados novamente e a renovação do substrato TMB (ácido tionitrobenzóico) foi medida a 450 nm. A titulação de neutralização foi expressa como a concentração de anticorpos que causou a redução de pelo menos 50% em absorvência a 450 nm (OD450) a partir de células de controlo exclusivo de vírus. 60
LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Young, James F.
Koenig, Scott Johnson, Leslie S.
Huse, William D.
Wu, Herren Watkins, Jeffry D. <120> Anticorpos Recombinantes de alta potência e métodos para a sua produção <130> 469201-525 <140> <141> <150> U.S. 60/186,252 <151> 2000-03-01 <160> 59 <170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de região variável de cadeia leve do anticorpo humanizado Medi-4 93. 61 <4 Ο 0> 1
Aflp 1 ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala ser Vai 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 He Thr Cys Lys Cys 25 Gin Leu Ser Vai Gly 30 Tyr Met Hls Trp Tyx 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu lie Tyr Asp Thr 50 Ser Lys Leu Ala Ser 55 Gly Vai Pro Ser Arg Phe 60 Ser Gly Ser Gly 65 Ser Gly Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Asp 00 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Phe Gin Gly 90 Ser Gly Tyr Pro Phe 95 Thr Pha 0 Gly Gly Gly 100 Thr Lys Leu Glu Ile 105 Lys
<211> 120 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sequência de região variável de cadeia pesada do anticorpo humanizado Medi-4 93. <400> 2 62
Gin Vai Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Vai Lys Pro Thr Gin 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp lie Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Vai 65 70 75 80 Vai Leu Lys Vai Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cye Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 3 <211> 106 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência de região variável de cadeia leve de um anticorpo humanizado. <400> 3
Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr pro Phe Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys 100 105 63
<210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Sequência de região variável de cadeia pesada de um anticorpo humanizado. <400> 4
Gin 1 Vai Thr Leu Arg Glu ser Gly 5 Pro Ala 10 Leu Vai Lys Pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr Cys Thr Phe Ser 25 Gly Phe Ser Leu Ser 30 Thr Ser Gly Met Ser 55 Vai Gly Trp Ile Arg 40 Gin Pro Pro Gly Lys 45 Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp Ile Trp Trp Asp 55 Asp Lys Lys Asp Tyr 60 Asn Pro Ser Leu 65 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser 70 Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin Vai 80 Vai Leu Lys Vai Thr Asn Met Asp as Pro Ala 90 Asp Thr Ala Thr Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Ser 100 Met Ile Thr Asn Trp 105 Tyr Phe Asp Vai Trp 110 Gly Gin
Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120
<210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência de referência CDR de cadeia leve. <400> 5 64
Ser Ala Ser Ser Ser Vai Gly Tyr Met His 15 10
<210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência de referência CDR de cadeia leve. <400> 6
Aap Thr Ser Lya Leu Ala Ser 1 5
<210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência de referência CDR de cadeia leve. <400> 7
Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 1 5
<210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> 65 <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência de referência CDR de cadeia pesada. <4 0 0> 8 Thr Ser Gly Met Ser Vai Gly 1 5 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência de referência CDR de cadeia pesada. <4 0 0> 9 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Ijys Lys Aap Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência de referência CDR de cadeia pesada. <4 0 0> 10 Ser Het Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Vai 15 10 <210> 11 <211> 10 66 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 11
Ser Ala Ser Ser Arg Vai Gly Tyr Met His 15 10 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 12 Ser Leu Ser Ser Arg Vai Gly Tyr Met His 15 10 <210> 13 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 13 67
Ser Pro Ser Ser Arg Vai Gly Tyr Met Hls 15 10
<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 14
Asp Thr Phe Lys Leu Thr Ser 1 5
<210> 15 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 15
Asp Thr Phe Lys Leu Ala Ser l 5
<210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> 68 <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 16
Asp Thr Tyr Lys Gin Thr Ser 1 5
<210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 17
Asp Thr Arg Tyr Leu Ser Ser 1 Ξ
<210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 18
Asp Thr Arg Gly Leu Pro Ser 1 5 <210> 19 <211> 7 69
<212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 19 Asp Thr Met Arg Leu Ala Ser 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 20 Asp Thr Phe Lys Leu Ser Ser 1 5 <210> 21
<211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 21 70
Asp Thr Tyr Arg His Ser Ser 1 5
<210> 22 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 22
Asp Thr Met Tyr Gin Ser Ser 1 5 <210> 23
<211> 9 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 23
Phe Gin Gly Ser Phe Tyr Pro Phe Thr 1 5
<210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial 71 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 24
Thr Ala Gly Met Ser Vai Gly 1 5
<210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 25
Thr Pro Gly Met Ser Vai Gly 1 5
<210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 26
Asp He Trp Trp Asp Aap Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15 <210> 27 72 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 27 Asp Ile Trp Trp Αερ Gly Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <4 0 0> 28 Asp Ile Trp Trp Asp Gly Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. 73 <400> 29
Asp Ile Txp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15
<210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 30
Asp Ile Trp Trp Asp Gly Lys Lys Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asp 15 10 15
<210> 31 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 31
Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Vai 15 10
<210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial 74 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 32
Asp Met Ile Phe Asn Trp Tyr Phe Asp Vai 1 5 10
<210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 33
Ser Met 11e Thr Asn Phe Tyr Phe Asp Vai 1 S 10
<210> 34 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 34
Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Vai 15 10 <210> 35 75
<211> 106 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 35
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Vai Gly 15 10 15
Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Vai Gly Tyr Met 20 25 30
His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45
Asp Thr Met Tyr Gin Ser Ser Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly ser S0 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Asp 65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 100 105
<210> 36 <211> 120 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 36 76
Gin Vai 1 Thr Leu Arg 5 Glu Ser Gly Pro Ala 1Ó Leu vai Lys Pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr Cys Thr Phe Ser 25 Gly Phe Ser Leu Ser 30 Thr Ala Gly Met Ser 35 vai Gly Trp Ile Arg 40 Gin Pro Pro Gly Lye 4S Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp lie Trp Trp 55 Asp Gly Lys Lys Ser 60 Tyr Asn pro Ser Leu Lye 65 Asp **3 Leu Thr 70 lie Ser Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin Vai 80 Vai Leu Lys vai Thr 85 Asn Met Asp Pro Ala 90 Asp Thr Ala Thr Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Asp 100 Met lie Phe Asn Phe 105 Tyr phe Asp Vai Trp 110 Gly Gin Gly Thr Thr 115 Vai Thr Vai Ser Ser 120
<210> 37 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 37
Gin 1 Vai Thr Leu Arg 5 Glu Ser Gly pro Ala 10 Leu Vai Lys Pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr Cys Thr Phe Ser 25 Gly Phe Ser Leu Ser 30 Thr Ala Gly Met Ser 35 Vai Gly Trp Ile Arg 40 Gin Pro Pro Gly Lys 4S Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp Ile Trp Trp 55 Asp Gly Lys Lys Asp 60 Tyr Asn Pro Ser Leu 65 Lys Asp Arg Leu Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin Val 80 Vai Leu Lys Vai Thr 85 Asn Met Asp Pro Ala 90 Asp Thr Ala Thr Tyr 95 Tyr Cya Ala Arg Asp 100 Met lie Phe Asn Phe 105 Tyr Phe Asp Vai Trp 110 Gly Gin Gly Thr Thr 115 Vai Thr Vai Ser Ser 120 Ala Ser Thr Lys Gly 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser LVS Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly 145 Cys Leu Vai Lys 150 Asp Tyr Phe Pro Glu 155 Pro Vai Thr Val Ser 160 Trp Asn Ser Gly Ala 165 Leu Thr Ser Gly Vai 170 His Thr Phe Pro Ala 175 Val Leu Gin Ser Ser 180 Gly Leu Tyr Ser Leu 185 Ser Ser Vai val Thr 190 Val Pro Ser Ser Ser 195 Leu Gly Thr Gin Thr 200 Tyr Ile Cys Asn vai 205 Asn Hls Lys Pro Ser 210 Asn Thr Lys Vai Asp 215 Lys Arg Vai Glu Pro 220 Lys Ser Cys Asp Lys 225 Thr Hls Thr Cys Pro 230 Pro Cys Pro Ala Pro 235 Glu Leu Leu Gly Gly 240 Pro Ser Vai Phe Leu 245 Phe Pro Pro Lys Pro 250 Lys Asp Thr Leu Met 255 Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Vai Thr Cys Vai 265 Vai Vai Asp Val Ser 270 Hls Glu 78
Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Vai Vai Ser vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 325 330 335 Lys Thr ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin val Tyr 340 345 3S0 Thr Leu pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met: His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Sex Pro 43 5 440 445 Gly Lys 450
<210> 38 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 38
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly I I Val Thr 20 Ile Thr Cys Ser Ala 25 Ser Ser Arg val Gly 30 Tyr Met His Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Asp Thr 50 Phe Lys Leu Ser Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser 79
Gly Ser Gly 65 Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Asp 80 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Phe Gin Gly 90 Ser Gly Tyr Pro Phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 Lys Val Glu Xle 105 Lys Arg Thr Val Ala Ala 110 Pro Ser val Phe 115 Xle Phe Pro Pro Ser Asp 120 Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val 130 Val Cys Leu Leu 135 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 140 Glu Ala Lys Val Gin Trp 145 Lys Val Asp ISO Asn Ala Leu Gin Ser 155 Gly Asn ser Gin Glu 160 Ser val Thr Glu Gin 165 Asp Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser Thr Leu Thr Leu 180 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys Val Tyr 190 Ala Cys Glu Val 195 Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Val Thr 205 Lys Ser Phe
Asn Arg Gly Glu Cye 210
<210> 39 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 39
Gin 1 val Thr Leu Arg 5 Glu Ser Gly Pro Ala 10 Leu Val Lys Pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr Cys Thr Phe Ser 25 Gly Phe Ser Leu Ser 30 Thr Ala Gly Met Ser 35 Val Gly Trp Ile Arg Gin 40 Pro Pro Gly Lys 4S Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp Ile Trp Trp 55 Asp Gly Lys Lys Ser Tyr 60 Asn Pro Ser Leu 65 Lys Asp Arg Leu Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin Val 80 val Leu Lys Val Thr as Asn Met Asp Pro Ala 90 Asp Thr Ala Thr Tyr 95 Tyr 80
Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Ttar Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140
Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Arg Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys pro pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 25Ξ Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 37S 380 Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 43 0 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
Gly Lys 450 <210> 40 81
<211> 213 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. 40 Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr ile Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Met Tyr Gin ser Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro Asp 65 70 75 80 ASp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Vai Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Vai Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Sex Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160 Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala ISO 185 190 Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 19S 200 205
Asn Arg <31y Glu Cys 210
<210> 41 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial 82 <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 41 83
Gin 1 Vai Thr Leu Arg 5 Glu Ser Gly Pro Ala 10 Leu Val Lys Pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr Cys Thr Phe Ser 25 Gly Phe Ser Leu Ser 30 Thr Ala Gly Met Ser 35 Vai Gly Trp Ile Arg 40 Gin Pro Pro Gly Lys 45 Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp Ile Trp Trp 55 Asp Gly Lys Lys Ser 60 Tyr Asn Pro Ser Leu 65 Lys Asp Arg Leu Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin val eo Vai Leu Lys Vai Thr 35 Asn Met Asp Pro Ala 90 Asp Thr Ala Thr Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Asp 100 Met Ile Phe Asn Phe 105 Tyr Phe Asp Val Trp 110 Gly Gin Gly Thr Thr 115 val Thr Val Ser Ser 120 Ala Ser Thr Lys Gly 125 Pro Ser val Phe Pro 130 Leu Ala Pro Ser Ser 135 Lys Ser Thr Ser Gly 140 Gly Thr Ala Ala Leu 145 Gly Cys Leu Val Lys 150 Asp Tyr Phe Pro Glu 155 Pro val Thr Val Ser 160 Trp Asn Ser Gly Ala 165 Leu Thr Ser Gly Val 170 Kls Thr Phe Pro Ala 175 Val Leu Gin Ser Ser ISO Gly Leu Tyr Ser Leu 185 Ser Ser Val Val Thr 190 val Pro Ser Ser Ser 195 Leu Gly Thr Gin Thr 200 Tyr Ile Cys Asn Val 205 Asn His Lys Pro Ser 210 Asn Thr Lys Val Asp 215 Lys Arg Val Glu Pro 220 Lys Ser Cys Asp Lys 225 Thr His Thr Cys Pro 230 Pro Cys Pro Ala Pro 235 Glu Leu Leu Gly Gly 240 84
Pro Ser Vai Phe Leu 245 Phe Pro Pro Lys Pro 250 Lys Asp Thr Leu Met 255 Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Val Thr Cys Val 265 Val Val Asp Val Ser 270 His Glu Asp Pro Glu 275 Vai Lys Phe Asn Trp 260 Tyr Val Asp Gly Val 265 Glu Val His Asn Ala 290 Lys Thr Lys Pro Arg 295 Glu Glu Gin Tyr Asn 300 Ser Thr Tyr Arg Vai 305 Vai Ser Vai Leu Thr 310 Val Leu His Gin Asp 315 Trp Leu Asn Gly Lye 320 Olu Tyr Lys Cys Lys 325 val Ser Asn Lys Ala 330 Leu Pro Ala Pro Ile 335 Glu Lys Thr Ile Ser 340 Lys Ala Lys Gly Gin 345 Pro Arg Glu Pro Gin 350 Val Tyr Thr Leu Pro 355 Pro Ser Arg Glu Glu 360 Met Thr Lys Asn Gin 365 Val Ser Leu Thr Cys 370 Leu Val Lys Gly Phe 375 Tyr Pro Ser Asp Ile 380 Ala Val Glu Trp Glu 385 Ser Asn Gly Gin Pro 390 Glu Asn Asn Tyr Lys 395 Thr Thr Pro Pro Val 400 Leu Asp Ser Asp Gly 405 Ser Phe Phe Leu Tyr 410 Ser Lys Leu Thr Val 415 Asp Lys Ser Arg Trp 420 Gin Gin Gly Asn Val 425 Phe Ser Cys Ser val 430 Met His Glu Ala Leu 435 His Asn His Tyr Thr 440 Gin Lys Ser Leu Ser 445 Leu Ser Pro
Gly Lye 450
<210> 42 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 42 85
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Leu Pro 25 Ser Ser Arg Val Gly Tyr Met 30 His Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Lys 40 Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Asp Thr 50 Met Tyr Gin Ser Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg Phe 60 Ser Gly Ser Gly 65 Ser Gly Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser Ser 75 Leu Gin Pro Asp 80 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Phe Gin Gly 90 Ser Gly Tyr Pro Phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Val Glu Ile 105 Lys Arg Thr val Ala 110 Ala Pro Ser Vai Phe 115 Ile Phe Pro Pro Ser 120 Asp Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser 130 Val Val Cys Leu Leu 135 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 140 Glu Ala Lys Vai 145 Gin Trp Lys Val Asp 150 Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn 155 Ser Gin Glu 160 Ser Vai Thr Glu Gin 165 Asp Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser Thr Leu Thr Leu 180 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys Val 190 Tyr Ala Cys Glu Val 19S Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Val Thr 205 Lys Ser Phe Asn Arg 210 Gly Glu Cys
<210> 43 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 43 86
Gin 1 Vai Thr Leu Arg 5 Glu Ser Gly Pro Ala 10 Leu Vai Lys Pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr Cya Thr Phe Ser Gly 25 Phe Ser Leu Ser 30 Thr Ala Gly Met Ser 35 Vai Gly Trp Ile Arg Gin Pro 40 pro Gly Lys 45 Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp Ile Trp Trp 55 Asp Gly Lys Lys His 60 Tyr Asn Pro Ser 87
Leu Lys 65 ASp Arg Leu Thr 70 Ile Vai Leu Lys Vai Thr 65 Asn Met Cys Ala Arg Asp 100 Met Ile Phe Gly Thr Thr 115 Vai Thr Vai Ser Phe Pro 130 Leu Ala Pro ser Ser 135 Leu Gly Cys 145 Leu Vai Lys Asp 150 Trp Asn Ser Gly Ala 165 Leu Thr Leu Gin Ser Ser 180 Gly Leu Tyr Ser Ser Ser 195 Leu Gly Thr Gin Pro Ser 210 Asn Thr Lys Vai Asp 215 Lys 225 Thr His Thr Cys Pro 230 Pro Pro Ser Vai Phe Leu 245 Phe Pro Ser Arg Thr Pro 260 Glu Vai Thr Asp Pro Glu 275 Vai Lys Phe Asn Asn Ala Lys 290 Thr Lys Pro Arg 295 Vai 305 Vai Ser Vai Leu Thr 310 Vai Glu Tyr Lys Cys Lys 325 Vai Ser Lys Thr Ile Ser 340 Lys Ala Lys Thr Leu Pro 355 Pro Ser Arg Glu
Lys Αβρ Thr Ser Lys Asn Gin Vai 75 60
Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 90 95
Trp Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin 105 110
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai 125
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 140
Phe Pro Glu Pro Vai Thr Vai Ser 155 160
Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai 170 175
Leu Ser Ser vai vai Thr Vai Pro 165 190
Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys 205
Arg Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp 220
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 250 255
Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu 265 270
Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His 285
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 300
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 315 320
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 330 335
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr 345 350
Met Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu 365
Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Vai Glu Trp 88
370 37S
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 385 390
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Pbe 405
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 420
Glu Ala Leu Hls Asn Hie Tyr Thr 435 440 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai 395 400
Leu Tyr Ser Lye Leu Thr vai Asp 410 415
Vai Phe Ser Cya Ser Vai Met Hls 425 430
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 445
Gly Lys 450
<210> 44 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 44 89
Asp Ile Gin ft Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Ser Leu Ser Ser Arg Vai Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Phe Lys Leu Ser Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro AQp 65 70 75 BO Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phc Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Vai Phe Xle Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu 145 150 155 160 Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr Ala 180 185 190 Cys Qlu Vai Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser Phe 195 200 20S Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 45 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 45 90
Gin Vai Thr Leu Arg Glu Ser Gly 1 5 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe 20 Gly Met Ser Vai Gly Trp Zle Arg 35 40 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp 50 55 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser 65 70 Vai Leu Lys Vai Thr Asn Met Asp 85 Ti Phe 100 Gly Thr Thr Vai Thr vai Ser Ser 115 120 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 130 135 Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr 145 150 Trp Aen Ser Gly Ala Leu Thr Ser 165 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 180 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
Pro Ala Leu Vai Lys Pro Thr Gin 10 15 Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 25 30 Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 45 Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser 60 Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val 75 80 Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 90 95 Fh? Vai /M*·# 105 110 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 125 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 140 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 155 160 Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Val 170 175 Leu Ser Ser vai Val Thr Val Pro 185 190 Tyr Ile Cys Aen Val Asn His Lys 91 195 200 205 Pro ser 210 Asn Thr Lys val Asp Lys Arg 215 Val Glu Pro 220 Lys Ser cys Asp Lys Thr 225 His Thr Cys Pro 230 Pro Cys Pro Ala Pro 235 Glu Leu Leu Gly Gly 240 Pro Ser Vai Phe Leu 245 Phe Pro Pro Lys Pro 250 Lys Asp Thr Leu Met 255 lie Ser Arg Thr Pro 260 GlU Val Thr Cys Val 265 Val Val Asp Val Ser Hie 270 Glu Asp Pro Glu 275 val Lys Phe Asn Trp Tyr 280 Val Asp Gly Val 285 Glu Val His Asn Ala 290 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 295 Gin Tyr Asn 300 Ser Thr Tyr Arg Vai Vai 305 Ser Val Leu Thr 310 Val Leu His Gin Asp 315 Trp Leu Asn Gly Lys 320 Glu Tyr Lys Cys Lys 325 Val Ser Asn Lys Ala 330 Leu Pro Ala Pro Ile 335 Glu Lye Thr Ile Ser 340 Lys Ala Lys Gly Gin 345 Pro Arg Glu Pro Gin Val 350 Tyr Thr Leu Pro 355 Pro Ser Arg Glu Glu Met 360 Thr Lys Asn Gin 365 Val ser Leu Thr Cys 370 Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 375 Ser Asp Ile 380 Ala Val Glu Trp Glu Ser 385 Asn Gly Gin. Pro 390 Glu Asn Asn Tyr Lys 395 Thr Thr Pro Pro Val 400 Leu Asp Ser Asp Gly 405 Ser Phe Phe Leu Tyr 410 Ser Lys Leu Thr Val 415 Asp Lys Ser Arg Trp 420 Gin Gin Gly Asn Val 425 Phe Ser Cys Ser Val Met 430 His Glu Ala Leu 435 His Asn His Tyr Thr Gin 440 Lys Ser Leu Ser 445 Leu Ser Pro
Gly Lys 450
<210> 46 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 46 92
Asp 1 Xle Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Ser Ala 25 Ser Ser Arg Vai Gly 30 Tyr Met His Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Asp Thr 50 Phe Phe Leu Asp Ser 55 Gly Vai Pro Ser Arg 60 Phe Ser Qly Ser Qly 65 Ser Gly Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Asp 80 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Phe Gin Gly 90 Ser Gly Tyr Pro Phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Vai Glu Ile 105 Lys Arg Thr Vai Ala 110 Ala Pro Ser Vai Phe 115 Xle Phe Pro Pro Ser Asp 120 Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser 130 vai Vai cys Leu Leu 135 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 140 Glu Ala Lys Vai 145 Gin Trp Lys Vai Asp 150 Asn Ala Leu Gin Ser 155 Gly Asn Ser- Gin Glu 160 Ser Vai Thr Glu Gin 16S Asp Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser Thr Leu Thr Leu 180 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys vai 190 Tyr Ala Cys Glu Vai 195 Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Vai Thr Lys 205 Ser Phe Asn Arg 210 Gly Glu Cys
<210> 47 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 47 93
Gin 1 Vai Thr Leu Arg Glu 5 Ser Gly Pro Ala 10 Leu Val Lys Pro Thr 15 Gin Ttar Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ala 20 25 30 Gly Met Ser 35 Vai Gly Trp Ile Arg 40 Gin Pro Pro Gly Lys 45 Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp Ile Trp Trp 55 Asp Asp Lys Lys Ser 60 Tyr Asn Pro Ser Leu 65 Lys Asp Arg Leu Thr 70 Ile Ser Lya Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin Val 80 Vai Leu Lys vai Thr 85 Asn Met Asp Pro Ala 90 Asp Thr Ala Thr Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Asp 100 Met Ile Phe Asn Trp 105 Tyr Phe Asp Val Trp Gly HO Gin Gly Thr Thr 115 Vai Thr Vai Ser Ser 120 Ala Ser Thr Lys Gly 12S Pro Ser Val Pbe Pro 130 Leu Ala Pro Ser Ser 135 Lys Ser Thr Ser Gly 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 Cys Leu Vai Lya 150 Asp Tyr Phe Pro Glu 155 Pro Val Thr Val Ser 160 Trp Aan Ser Gly Ala 165 Leu Thr Ser Gly Vai 170 Hls Thr Phe Pro Ala 175 Val Leu Gin Ser Ser 180 Gly Leu Tyr Ser Leu 185 Ser Ser Val Val Thr Val 190 Pro Ser Ser Ser 195 Leu Gly Thr Gin Thr 200 Tyr Ile Cys Asn Val 205 Asn Hie Lys Pro Ser 210 Asn Thr Lys Vai Asp 215 Lya Arg Vai Glu Pro 220 Lys Ser Cys Asp Lys 225 Thr Kis Thr Cya Pro 230 Pro Cys Pro Ala Pro 235 Glu Leu Leu Gly Gly 240 Pro Ser vai Phe Leu 245 Phe Pro Pro Lys Pro 250 Lys Asp Thr Leu Met 255 Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Vai Thr Cya Vai 265 Vai Val Asp Val Ser Hls 270 Glu Asp Pro Glu 275 Vai Lya Phe Asn Trp 280 Tyr Val Asp Gly Val 285 Glu Val Hls Asn Ala 290 Lys Thr Lya Pro Arg 295 Glu Glu Gin Tyr Asn 300 Ser Thr Tyr Arg Vai 305 Vai Ser Vai Leu Thr 310 Vai Leu Hls Gin Asp 315 Trp Leu Asn Gly Lys 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu 32S 330 33S 94
Lys Thr Ile Ser 340 Lys Ala Lys Gly Gin 345 Pro Arg Glu Pro Gin 350 Val Tyr Thr Leu Pro 355 Pro Ser Arg Glu Glu 360 Met Thr Lys Asn Gin 365 Val Ser Leu Thr Cys 370 Leu Val Lys Gly Phe 375 Tyr Pro Ser Asp Ile 380 Ala Val Glu Trp Glu 385 Ser Asn Gly Gin Pro 390 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 395 Thr Pro Pro Val 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 Phe Phe Leu Tyr 410 Ser Lys Leu Thr Val 415 Asp Lys Ser Arg Trp 420 Gin Gin Gly Asn Val 425 Phe ser Cys Ser Val 430 Met Hls Glu Ala Leu 435 His Asn His Tyr Thr 440 Gin Lys Ser Leu Ser 445 Leu Ser Pro
Gly Lys 450
<210> 48 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 48 95
Asp 1 0> H H Gin Met Thr S Gin Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Asp Arg Vai Thr Ile 20 Thr Cys Ser Pro 25 Ser Ser Arg Vai Gly Tyr Met 30 HÍS Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala 40 Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Asp Thr Arg Tyr Gin 50 Ser Ser 55 Gly Vai Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 Gly Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Asp 80 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Phe Gin Gly 90 Ser Gly Tyr Pro Phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr 100 Lys Vai Glu Ile Lys Arg 105 Thr Vai Ala Ala 110 Pro Ser Vai Phe 115 Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 120 Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser 13 0 Vai Vai Cys Leu Leu 135 Asn Asn phe Tyr Pro Arg 140 Glu Ala Lys Vai 145 Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala 150 Leu Gin Ser 155 Gly Asn ser Gin Glu 160 Ser Vai Thr Glu Gin Asp 165 Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 180 Tyr 185 Glu Lys Kis Lys Vai 190 Tyr Ala Cys Glu Vai 195 Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Vai Thr 205 Lys Ser Phe
Asa. Arg Gly Glu Cya 210
<210> 49 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 49 96
Gin Vai 1 Thr Leu Arg 5 Glu Ser Gly Pro Ala 10 Leu Val Lys Pro Thr 15 Gin Thr Leu Thr Leu 20 Thr Cys Thr Phe Ser 25 Gly Phe Ser Leu Ser 30 Thr Pro Gly Met Ser 35 Vai Gly Trp Ile Arg 40 Gin Pro Pro Gly Lys 45 Ala Leu Glu Trp Leu 50 Ala Asp lie Trp Trp 55 Asp Gly Lys Lys His 60 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 65 Asp Arg Leu Thr 70 Ile Ser Lys Asp Thr 75 Ser Lys Asn Gin Val 80 Vai Leu Lys Val Thr 85 Asn Met Asp Pro Ala 90 Asp Thr Ala Thr Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Asp 100 Met rle Phe Asn Trp 105 Tyr Phe Asp Val Trp 110 Gly Gin Gly Thr Tlir· 115 val Thr val Ser Ser 120 Ala Ser Thr Lys Gly 125 Pro Ser Val phe Pro 130 Leu Ala Pro Ser ser 13S Lys Ser Thr Ser Gly 140 Gly Thr Ala Ala Leu Gly 145 Cys Leu Val Lys 150 Asp Tyr Phe Pro Glu 155 Pro Val Thr Val Ser 160 97
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hls Thr Phe Pro Ala val 165 170 175 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Arg val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr Hls Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 24S 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Hls Glu 260 265 270 Aap Pro Glu Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 2B0 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Vai Vai Ser vai Leu Thr val Leu Hls Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 43 0 Glu Ala Leu His Asn Hls Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
Gly Lys 450
<210> 50 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> 98 <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 50
Asp 1 ile Gin Met Thr 5 Gin Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Vai 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 Ile Thr Cys Ser Pro 25 Ser Ser Arg Vai Gly Tyr 30 Met His Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Lys 40 Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Asp Thr 50 Met Arg Leu Ala Ser 55 Gly Vai Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser es Gly Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Asp 80 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cye Phe Gin Gly Ser Gly 90 Tyr Pro Phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Vai Glu Ile 105 Lys Arg Thr Vai Ala Ala 110 Pro Ser Vai Phe 115 Ile Phe Pro Pro Ser Asp 120 Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser 130 Vai Vai Cys Leu Leu 135 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 140 Glu Ala Lys Vai 145 Gin Trp Lye Vai Asp Asn 150 Ala Leu Gin Ser Gly Asn 155 Ser Gin Glu 160 Ser Vai Thr Glu Gin. Asp 165 Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser Thr Leu Thr Leu 180 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 185 Lys His Lys Vai 190 Tyr Ala Cye Glu vai 195 Thr Hls Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Vai Thr 205 Lys Ser Phe Asn Arg 210 Gly Glu Cys
<210> 51 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. 99 <4Ο0> 51 100
Gin Vai Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gin 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Pro 20 25 30 Gly Mat Ser Val Gly Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Hls Tyr Asn Pro Ser 50 5S 60 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val 65 70 75 80 Vai Leu Lys val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Met Ile Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 11S 120 125 Ph· Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Glv Cys Leu Val Lys Asd Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val Hls Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg val Glu Pro Lys Ser Cys ASp 210 215 220 Lys Thr Hls Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro ser val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys Val Val Val Asp Val Ser Hls Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly val Glu val Hls 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 101
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr ile Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr 340 345 350 Thr Leu pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Aep Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
Gly Lys 4SO
<210> 52 <211> 213 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 52 102
Asp 1 Ile Gin Met Thr 5 Gln Ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly Asp Arg Vai Thr 20 ile Thr Cys Ser Leu 25 Ser Ser Arg Val Gly Tyr 30 Met HÍS Trp Tyr Gin 35 Gin Lys Pro Gly 40 Lys Ala Pro Lys Leu 45 Leu Ile Tyr Asp Thr 50 Phe Tyr Leu Ser Ser 55 Gly Val Pro Ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly «5 Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gln Pro Asp 80 Asp Phe Ala Thr Tyr 85 Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr 90 Pro Phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys Val Glu Ile 105 Lys Arg Thr Val Ala 110 Ala Pro Ser Vai Phe 115 Ile Phe Pro Pro Ser 120 Asp Glu Gln Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser 130 val Val Cys Leu Leu 135 Asn Asn Phe Tyr Pro 140 Arg Glu Ala Lys Vai 145 Gin Trp Lys Val Asp 150 Aen Ala Leu Gln Ser 155 Gly Asn Ser Gln Glu 160 Ser Val Thr Glu Gln 165 Asp Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr Ser Leu Ser 175 Ser Thr Leu Thr Leu ISO Ser Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys His Lys val 190 Tyr Ala Cys Glu Val 195 Thr His Gln Gly Leu 200 Ser Ser Pro Val Thr 205 Lys Ser Phe Asn Arg 210 Gly Glu Cys
<210> 53 <211> 450 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia pesada de anticorpo de alta potência. <400> 53 103
Gin Vai Thr Leu Arg eiu Ser Gly Pro Ala Leu Vai Lys Pro Thr Gin 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Pro 20 25 30 Gly Met Ser vai Gly Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys Ala. Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys His Tyr Asn Pro Ser 50 55 80 Leu Lys Asp Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Val €5 70 75 80 Vai Leu Lys Vai Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Met He Phe Asn Phe Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Gin 100 105 110 Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 104
Phe Pro 130 Leu Ala Pro Ser ser Lys 135 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 140 Ala Leu Gly Cys 145 Leu Val Lys 150 Asp Tyr Phe Pro Glu 155 Pro Val Thr Val Ser 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu 165 Thr Ser Gly Val His 170 Thr Phe Pro Ala 175 Val Leu Gin Ser Ser 180 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 185 Val Val Thr Val 190 Pro Ser Ser Ser 195 Leu Gly Thr Gin Thr 200 Tyr Ile Cys Asn Val 205 Asn Hls Lys Pro Ser 210 Asn Thr Lys Val Asp Lys 215 Arg Val Glu Pro Lys 220 Ser Cys Asp Lys 235 Thr Kis Thr Cys pro 230 Pro Cys Pro Ala Pro 235 Glu Leu Leu Gly Gly 240 Pro Ser val Phe Leu Phe 245 Pro Pro Lys Pro Lys 250 Asp Thr Leu Met 255 Ile Ser Arg Thr Pro 260 Glu Val Thr Cys Val Val Val 265 Asp Val Ser Hls 270 Glu Asp Pro Glu 275 Val Lys Phe Asn Trp 280 Tyr Val Asp Gly Val 285 Glu Val Hls Asn Ala 290 Lys Thr Lys Pro Arg Glu 295 Glu Gin Tyr Asn Ser 300 Thr Tyr Arg Vai 305 Vai Ser Val Leu Thr 310 Val Leu Hls Gin Asp 315 Trp Leu Asn Gly Lys 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val 325 Ser Asn Lys Ala Leu 330 Pro Ala Pro Ile 335 Glu Lys Thr ile Ser 340 Lye Ala Lys Gly Gin Pro Arg 345 Glu Pro Gin Val 350 Tyr Thr Leu Pro 355 Pro Ser Arg Glu Glu 360 Met Thr Lys Asn Gin 365 Val Ser Leu Thr Cys Leu 370 Val Lys Gly Phe Tyr 375 Pro Ser Asp Ile Ala 380 Val Glu Trp Glu 385 ser Asn Gly Gin Pro 390 Glu Asn Asn Tyr Lys 395 Thr Thr Pro Pro Val 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser 405 Phe Phe Leu Tyr Ser 410 Lys Leu Thr Val 415 Asp Lys Ser Arg Trp 420 Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser 425 Cys Ser Val Met 430 Hls Glu Ala Leu Hls Asn Hls Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445
Gly Lys 450
<210> 54 <211> 213 <212> PRT 105 <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: cadeia leve de anticorpo de alta potência. <400> 54
AjSp 1 ile Gin Met Thr 5 Gin ser Pro Ser Thr 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Ser Leu 25 Ser Ser Arg Val Gly Tyr 30 Met Ris Trp Tyr 35 Gin Gin Lys Pro Gly Lys 40 Ala Pro Lys Leu 45 Leu ile Tyr Asp Thr 50 Arg Gly Leu Pro âer 55 Gly Val Pro ser Arg 60 Phe Ser Gly Ser Gly 65 Ser Gly Thr Glu Phe 70 Thr Leu Thr Ile Ser 75 Ser Leu Gin Pro Asp 60 Asp Phe Ala Thr Tyr 65 Tyr Cys Phe Gin Gly 90 Ser Gly Tyr Pro Phe 95 Thr Phe Gly Gly Gly 100 Thr Lys val Glu Ile 105 Lys Arg Thr Val Ala 110 Ala Pro Ser Vai Phe 115 lie Phe Pro Pro Ser 120 Asp Glu Gin Leu Lys 125 Ser Gly Thr Ala Ser 130 Val val Cys Leu Leu 135 Asn Asn Phe Tyr Pro 140 Arg Glu Ala Lys Vai 145 Gin Trp Lys Val Asp 150 Asn Ala Leu Gin Ser 155 Gly Asn Ser Gin Glu 160 ser Val Thr Glu Gin Asp 165 Ser Lys Asp Ser 170 Thr Tyr ser Leu Ser 175 Ser Thr Leu Thr Leu 1B0 Ser Lys Ala Asp Tyr 185 Glu Lys HiS Lys Val 190 Tyr Ala Cys Glu Val 195 Thr His Gin Gly Leu 200 Ser Ser Pro Val Thr 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly 210 Glu Cys <210> 55
<211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial 106 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 55
Asp Ile Trp Trp Asp Gly Lys Lyg ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lya Asp 15 10 15
<210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 56
Leu Pro Ser Ser Arg Vai Gly Tyr Met His 15 10
<210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 57
Asp Thr Phe Phe Leu Asp Ser 1 5
<210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial 107 <22 0> <223> Descrição de Sequência Artificial: Sequência CDR de alta potência. <400> 58
Asp Thr Arg Tyr Gin Ser Ser 1 5
<210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Descrição da sequência Artificial: Sequência CDR Básica. <400> 59
Lye Cys Gin Leu Ser Vai Gly Tyr Met Hia 15 10

Claims (22)

  1. REIVINDICAÇÕES Um anticorpo que se liga especificamente à proteína F de um vírus sincicial respiratório (RSV), caracterizado por o anticorpo: a. tem uma taxa constante de associação (kon) de pelo menos 2,5 x 105M_1s_1 como medida por ressonância de plasma de superfície; b. tem uma EC50 de menos de 3,0 nM num ensaio de microneutralização por RSV; e c. compreende as seguintes CDRs, com uma ou mais alterações de aminoácidos nas posições sublinhadas e em negrito numa ou mais das CDRs: região de determinação de complementaridade (CDR) 1 de região variável de cadeia pesada (VH) TSGMSVG (SEQ ID N°:8); VH CDR2 DIWWDDKKDYNPSLKS (SEQ ID N°:9); VH CDR3 SMITNWYFDV (SEQ I D NO:10); CDR1 de região variável de cadeia leve (VL) SASSSVGYMH (SEQ ID N°:5); VL CDR2 DTSKLAS (SEQ ID N°:6); e VL CDR3 FQGSGYPFT (SEQ ID N°:7), em que a referida uma ou mais alterações de aminoácidos tem o efeito de produzir um aumento na kon e de melhorar a atividade de microneutralização do referido anticorpo. O anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo compreender as regiões de estrutura da Figura 1 ou 2. 2 3. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por o mesmo ser isolado. 4. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por o anticorpo se ligar ao mesmo epítopo do antigénio F de RSV como um anticorpo que compreende uma VH tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 4 (Figura 2B) e uma VL tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°: 3 (Figura 2A). 5. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o kon ser pelo menos 5 x 105M_1s_1. 6. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 1, 2, 3 ou 4, caracterizado por a kon ser de pelo menos 7,5 x 105M-1s~ i 7 . 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado por o anticorpo ter uma CE50 de menos de 1,0 nM. 8. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o anticorpo ter uma constante de afinidade de (Ka) de pelo menos cerca de 10¾1. 9. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o anticorpo ter uma Ka de pelo menos cerca de 1010Μ_1. 3
  2. 10. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o anticorpo ter uma Ka de pelo menos cerca de 10nM-1.
  3. 11. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o anticorpo isolado incluir uma CDRl VH tendo a sequência de aminoácidos TAGMSVG (SEQ ID N° : 24) ou TPGMSVG (SEQ ID N° : 25) .
  4. 12. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o anticorpo compreender uma CDR2 VH tendo a sequência de aminoácidos DIWWDGKKHYNP SLKD (SEQ ID N°:27), DIWWDDKKHYNPSLKD (SEQ ID N°:26), DIWWDGKKDYNP SLKD (SEQ ID N°:2 8), DIWWDDKKHYNPSLKD (SEQ ID N°:29), DIWWDGKKS YNP S LKD (SEQ ID N°:30), DIWWDDKKSYNPSLKD (SEQ ID N°:55), ou DIWWDGKKSYNPSLKS.
  5. 13. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o anticorpo compreender uma CDR3 VH tendo a sequência de aminoácidos DMITNFYFDV (SEQ ID N°: 31), DMIFNWYFDV (SEQ ID N° : 32), SMITNFYFDV (SEQ ID N° : 33) ou DMIFNFYFDV (SEQ ID N°: 34).
  6. 14. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o anticorpo compreender uma CDRl VL com a sequência de aminoácidos SASSRVGYMH (SEQ ID N°: 11), SLSSRVGYMH (SEQ ID N°: 12), SPSSRVGYMH (SEQ ID N° : 13), LPSSRVGTYMH (SEQ ID N° : 56), ou KCQLSVGYMH (SEQ ID N°: 59). 4 15. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o anticorpo compreender uma CDR2 VL tendo as sequências de aminoácidos DTFKLTS (SEQ ID N°:14), DTFKLAS (SEQ ID N° : 15) , DTYKQTS (SEQ ID N°:16), DTRYLSS (SEQ ID N°:17), DTRGLPS (SEQ ID N°:18), DTMRLAS (SEQ ID N°:19), DTFKLSS (SEQ ID N°:20), DTYRHSS (SEQ ID N°:21), DTMYQSS (SEQ ID N°:22), DTFFLDS (SEQ ID N°:57), DTRYQSS (SEQ ID N°:58), DTFRLAS, ou DTFYLSS.
  7. 16. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado por o anticorpo compreender uma CDR3 VL com a sequência de aminoácidos FQGSFYPFT (SEQ ID N°: 23).
  8. 17. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o anticorpo isolado ser um anticorpo monoclonal.
  9. 18. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por o anticorpo ser um fragmento Fab ou F(ab')2.
  10. 19. O anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por o anticorpo ser uma molécula de anticorpo totalmente tetramérica.
  11. 20. Uma composição caracterizada por compreender o anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes e um diluente ou excipiente farmacologicamente aceitável. 5
  12. 21. A composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ser para utilização como medicamento.
  13. 22. A composição de acordo com a reivindicação 21, caracterizada por ser para utilização na prevenção de uma doença causada por RSV num paciente em risco de tal doença.
  14. 23. A composição de acordo com a reivindicação 21 caracterizada por ser para utilização no tratamento de uma doença causada por RSV num paciente afetado com a doença.
  15. 24. Utilização da composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ser para o fabrico de um medicamento para a prevenção de uma doença causada por RSV num paciente em risco de tal doença.
  16. 25. Utilização da composição de acordo com a reivindicação 20, caracterizada por ser para o fabrico de um medicamento para tratar uma doença causada por RSV num paciente afetado com a doença. 26. 0 anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19 caracterizado por ser para utilização como medicamento. 27. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por ser para utilização na prevenção de uma doença causada por RSV num paciente em risco de tal doença. 6 28. 0 anticorpo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por ser para utilização no tratamento de uma doença causada por RSV num paciente afetado com a doença.
  17. 29. Utilização do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada por ser para o fabrico de um medicamento para a prevenção de uma doença causada por RSV num paciente em risco de tal doença.
  18. 30. Utilização do anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada por ser para o fabrico de um medicamento para tratar uma doença causada por RSV num paciente afetado com a doença.
  19. 31. A composição de acordo com a reivindicação 22 ou 23, caracterizada por o paciente ser um ser humano.
  20. 32. A utilização de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada por o paciente ser um ser humano.
  21. 33. O anticorpo de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizado por o paciente ser um ser humano.
  22. 34. A utilização de acordo com a reivindicação 29 ou 30, caracterizada por o paciente ser um ser humano.
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