PT783525E

PT783525E - Anticorpos quiméricos de humano-murídeo contra o vírus sincicial respiratório

Info

Publication number: PT783525E
Application number: PT95928353T
Authority: PT
Inventors: Leslie Syd Johnson
Original assignee: Medimmune Inc
Priority date: 1994-08-15
Filing date: 1995-08-09
Publication date: 2007-01-31
Also published as: CA2197684A1; JP2012207022A; CA2197684C; JP2008024707A; EP0783525A1; EP1659133A2; EP1659133A3; EP1659133B1; DK1659133T3; ES2274518T3; JP3896160B2; EP0783525A4; DE69535253T2; US20120156195A1; EP2371858A2; US5824307A; DK0783525T3; JP2010241819A; US8562994B2; ES2442460T3

Description

ΡΕ0783525 1

DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS QUIMÉRICOS DE HUMANO-MURÍDEO CONTRA O VÍRUS SINCICIAL RESPIRATÓRIO"

ANTECEDENTES O vírus sincicial respiratório (RSV) é a principal causa de doença respiratória aguda em crianças jovens admitidas nos hospitais, e os centros de saúde tratarão talvez cinco vezes o número de crianças hospitalizadas. É, por isso, a causa mais comum de infecção do tracto respiratório inferior em crianças jovens. Embora a maioria das infecções com RSV adquiridas na comunidade de resolvam por elas próprias no período de uma semana a dez dias, muitas crianças hospitalizadas, especialmente com menos de seis meses de idade, requerem ventilação artificial .

Os esforços para produzir uma vacina eficaz foram fracassados (8). Um obstáculo principal para o desenvo-vimento de vacina é a segurança; a vacina de RSV inactivada com formalina inicial provocou uma incidência aumentada de doença do tracto respiratório inferior com RSV e morte em crianças imunizadas após exposição ao vírus (5).

Recentemente, o fármaco ribavirina foi licenciado 2 ΡΕ0783525 para terapêutica de pneumonia e bronquiolite com RSV (2,3); a sua utilidade é controversa (4) . Embora a ribavirina tenha demonstrado eficácia (9), o fármaco tem que ser administrado ao longo de um período de 18 horas através de inalação de aerossóis. Adicionalmente, o nível de infecções secundárias que se seguem à cessação do tratamento é significativamente mais elevado do que em doentes não tratados.

Estudos demonstraram que a imunoglobulina de RSV de título elevado foi eficaz tanto na profilaxia como na terapêutica para infecção com RSVs em modelos animais (6, 7). Animais infectados tratados com imunoglobulina de RSV, não apresentaram evidência de doença de imuno-complexo pulmonar (6, 7).

Mesmo se a hiperimunoglobulina de RSV demonstrar reduzir a incidência e severidade de infecção do tracto respiratório inferior com RSV em crianças de alto risco, várias desvantagens podem limitar a sua utilização. Um inconveniente é a necessidade de infusão intravenosa nas crianças que possuem acesso venoso limitado devido a terapêutica intensiva anterior. Uma segunda desvantagem é o grande volume de RSVIG necessário para protecção, particularmente dado que a maioria destas crianças possuem função cardiopulmonar comprometida. Uma terceira desvantagem é que a infusão intravenosa necessita de visitas mensais ao hospital durante a estação de RSV que coloca estas crianças em risco de infecção nosocomial com RSV (1). 3 ΡΕ0783525

Um problema final é que pode revelar-se difícil seleccionar dadores suficientes para produzir uma hiperimunoglobulina para RSV para satisfazer a procura para este produto. Presentemente, apenas cerca de 8% dos dadores normais possuem títulos de anticorpo neutralizante de RSV suficientemente elevados para se qualificarem para a produção de hiperimunoglobulina.

Outra abordagem pode ser o desenvolvimento de anticorpos monoclonais com actividade neutralizante específica elevada como uma alternativa a hiperimunoglobulina. É preferível, se não necessário, utilizar anticorpos monoclonais humanos em vez de anticorpos de murídeo de ou rato para minimizar o desenvolvimento de respostas de anticorpo anti-roedor humano que pode comprometer a eficácia terapêutica do anticorpo ou induzir a patologia de imuno-complexo. Todavia, a produção de anticorpos monoclonais humanos com a especificidade desejada pode ser difícil e o nível de produção de linhas celulares humanas é frequentemente baixo, impedindo o seu desenvolvimento.

Uma abordagem alternativa envolve a produção de anticorpos quiméricos humanos-murganho em que a informação genética codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve de murídeo estão fixadas aos genes codificando as regiões constantes pesada e leve humanas. O híbrido murganho-humano resultante tem cerca de 30% da imunoglobulina intacta derivada das sequências de murídeo. Por isso, embora vários laboratórios tenham construído 4 ΡΕ0783525 anticorpos quiméricos com domínios variáveis de murganho e constantes humanos (10-18), a região variável de murganho pode ainda ser considerada como estranha (19).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO É por isso um objecto da presente invenção proporcionar um anticorpo humano enxertado com região determinante de complementaridade (CDR) que contém pelo menos uma CDR de cada cadeia pesada variável e cadeia leve variável de pelo menos um anticorpo monoclonal, contra o antigénio de RSV. O anticorpo monoclonal pode ser derivado de qualquer animal não humano, preferencialmente todavia, é derivado de um roedor e, mais preferencialmente é um anticorpo monoclonal de murideo. Preferencialmente, o anticorpo monoclonal de murideo é um anticorpo neutra-lizante. É também preferível que o referido anticorpo de murideo seja um anticorpo contra o antigénio F de RSV. O termo "animal", como aqui utilizado no seu sentido mais lato inclui mamíferos incluindo humanos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS aqui descritos e não pretendem

Os desenhos apresentados e pretendem ilustrar a presente invenção limitar a invenção de modo algum, A Figura 1 apresenta a estrutura da sequência de 5 ΡΕ0783525 aminoácidos (AA) de VH de glicoproteína F anti-RSV enxertada com CDR. A figura apresenta a sequência de AA para a VH de HV3 humana antes da enxertia, VH enxertada com CDR, e VH de MAbl308F de murideo do qual a sequência de CDR foi enxertada. As regiões fortemente sublinhadas identificam uma sequência de CDR que foi enxertada na VH de HV3 humana e cada uma das três regiões é identificada como CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente. A Figura 2 apresenta a estrutura da sequência de aminoácidos (AA) da VL da Proteina F anti-RSV enxertada com CDR. A figura apresenta a sequência de AA para a VL de K102 humana antes da enxertia, VL enxertada com CDR, e VL de MAbl308F de murideo do qual a sequência de CDR foi enxertada. As regiões fortemente sublinhadas identificam a sequência de CDR que foi enxertada na VL de K102 humana e cada uma das três regiões é identificada como CDRl, CDR2 e CDR3, respectivamente. A Figura 3 apresenta os oligonucleótidos utilizados para produzir Hu1308Vh, as sequências que estão sublinhadas são as sequências de iniciador especificas. A Figura 4 apresenta os oligonucleótidos utilizados para produzir Hul308VL, as sequências que estão sublinhadas são as sequências de iniciador especificas. A Figura 5 apresenta a construção de plasmideo dos vectores de expressão para 1308 Humanizado. 6 ΡΕ0783525 A Figura 6 apresenta um gráfico da Neutralização de RSV como percentagem de neutralização versus ng de MAb por reacção para neutralizar com Cos Hul308F e com Mul308F. A Figura 7 apresenta a estrutura da sequência de aminoácidos (AA) de VH de glicoproteina F anti-RSV enxertada com CDR. A figura apresenta a sequência de AA para a VH de COR humana antes da enxertia, VH enxertado com CDR, e VH sw MAbll2 9 de murideo do qual a sequência de CDR foi enxertada. As regiões fortemente sublinhadas identificam a sequência de CDR que foi enxertada na VH de COR humana e cada uma das três regiões é identificada como CDR1, CDR2 e CDR3, respectivamente. A Figura 8 apresenta a estrutura da sequência de aminoácidos (AA) de VL da Proteína F anti-RSV enxertada com CDR. A figura apresenta a sequência de AA para a VL K102 humana antes da enxertia, VL enxertado com CDR, e VL de MAbll29 de murideo do qual a sequência de CDR foi enxertada. As regiões fortemente sublinhadas identificam a sequência de CDR que foi enxertada na VL de Kl02 humano e cada uma das três regiões é identificada como CDR1, CDR2 e CDR3,respectivamente. A Figura 9 apresenta os oligonucleótidos utilizados para construir a VH de 1129 humanizada. A Figura 10 apresenta os resultados de ligação para 1129 humanizada num ensaio de ELISA. ΡΕ0783525 7

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os requerentes descobriram que a transplantação num anticorpo humano, apenas da informação genética para pelo menos uma CDR de cada uma das cadeia pesada variável e leve variável derivada de anticorpo monoclonal de murideo contra antigénio de RSV, é eficaz para a prevenção e tratamento de RSV em animais. Preferencialmente, o anticorpo de murideo é um anticorpo neutralizante contra RSV. Outro aspecto da presente invenção proporciona que o anticorpo de murideo seja um anticorpo contra o antigénio F de RSV. Preferencialmente, o anticorpo de murideo é anticorpo neutralizante contra antigénio F de RSV. A substituição das CDR's de murganho nos segmentos da estrutura variável humana minimiza o potencial para respostas de anticorpo anti-murganho humano (HAMA) embora retendo afinidade de ligação e especificidade para o antigénio, proteína F de RSV. Dado que as CDR's não contêm motivos característicos de murideo ou humano, os anticorpos humanos contendo as CDR's de anticorpo de murideo são essencialmente indistinguíveis de anticorpos completamente humanos, minimizando, por isso, a resposta de anticorpo humano, embora retendo afinidade de ligação e especificidade para o antigénio F de RSV. O desenvolvimento de um anticorpo humanizado contra antigénio F de RSV começou com um anticorpo de murideo contra antigénio F de RSV. Exemplos de anticorpos ΡΕ0783525 de murídeo deste tipo são: MAb 1436C, MAb 113, MAb 112, MAb 151, MAb 1200, MAb 1214, MAb 1237, MAb 1129, MAb 1121, MAb 1107, MAb 131-1, MAb 43-1, MAb 1112, MAb 1269, MAb 1243, MAb 1331H, MAb 1308F e MAb 1302A (ver citação 21).

Um aspecto da presente invenção proporciona que as CDRs do anticorpo humano sejam compreendidas por três regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de cada cadeia pesada variável e leve variável do anticorpo de murideo.

Os anticorpos de murideo contra antigénio F de RSV foram mapeados por ligação competitiva e perfis de reactividade de mutantes de escape de virus para os três sitios antigénicos largos (A, B, C) contendo 16 epitopos distintos (20) . Os epitopos nos sitios antigénicos A e C apresentaram a menor variabilidade em isolados naturais.

Por isso, outro aspecto desta invenção proporciona um anticorpo humano contendo pelo menos um CDR de cada cadeia pesada variável e leve variável de pelo menos um anticorpo de murideo contra antigénio F de RSV que é especifico para o sitio antigénico A ou C. Num aspecto, esta invenção proporciona o anticorpo de murideo contra antigénio F de RSV especifico para o sitio antigénico C, em que o anticorpo de murideo é MAb 1308F.

Numa tal forma de realização não coberta por esta invenção um anticorpo humano contém CDR's da cadeia pesada 9 ΡΕ0783525 variável de anticorpo de murideo MAb 1308F contra o antigénio F de RSV. A cadeia pesada variável de CDR de MAb 1308F compreende três CDRs possuindo as seguintes sequências de aminoácidos: Nos. 31 a 35, 47 a 60 e 99 a 106. Adicionalmente, esta forma de realização contém CDR's de uma cadeia leve variável de MAb 1308F de anticorpo de murideo contra antigénio F de RSV. A cadeia leve variável da CDR compreende três CDR's possuindo as seguintes sequências de aminoácidos: Nos. 24 a 34, 50 a 56 e 89 a 97.

Esta invenção proporciona um anticorpo humanizado como reivindicado na reivindicação 1, contendo pelo menos uma CDR de cada cadeia pesada variável e leve variável de pelo menos um anticorpo de murideo contra antigénio F de RSV que é especifico para o sitio antigénico A. Esta invenção proporciona o anticorpo de murideo contra antigénio F de RSV especifico para o sitio antigénico A, em que o anticorpo de murideo é MAb 1129.

Na forma de realização desta invenção um anticorpo humano que contém CDR's da cadeia pesada variável do anticorpo de murideo MAb 1129 contra o antigénio F de RSV. A cadeia pesada variável da CDR de MAb 1129 compreende três CDRs possuindo as seguintes sequências de aminoácidos: Nos. 31 a 36, 52 a 67 e 100 a 109. Adicionalmente, esta forma de realização contém CDR's da cadeia leve variável do MAb 1129 de anticorpo de murideo contra antigénio F de RSV. A cadeia leve variável de CDR compreende três CDR's possuindo as seguintes sequências de aminoácidos: Nos. 24 a 33, 51 a 56 e 89 a 96. 10 ΡΕ0783525

Um aspecto adicional da invenção dos requerentes é uma (utilização do anticorpo humanizado reivindicado na reivindicação 1 para a preparação de uma composição) para prevenir ou tratar infecção com RSV num humano.

Outro aspecto da invenção dos requerentes é uma composição compreendendo administrar uma quantidade eficaz do anticorpo humanizado como descrito acima e reivindicado na reivindicação 1, em conjunção com um veiculo farmacêutico aceitável. Veiculos farmacêuticos aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, tampões não tóxicos, filtros, soluções isotónicas, etc. A composição da invenção dos requerentes pode ser administrada topicamente ou sistemicamente. Exemplos de administração tópica são administração intranasal e inalação de um aerossol contendo a composição do anticorpo humano. A administração sistémica pode ser acompanhada por injecção intravenosa ou intramuscular da composição de anticorpo humano.

Um aspecto preferido da invenção dos Requerentes é que o anticorpo humano é administrado como parte de uma pluralidade de anticorpos humanos contra antigénio F de RSV. Estes anticorpos podem ser contra o mesmo ou diferentes epitopos do antigénio F de RSV.

Adicionalmente, o anticorpo humano desta invenção 11 ΡΕ0783525 pode ser utilizado clinicamente para diagnosticar virus sincicial respiratório em doentes. Devido à sua afinidade para antigénio F de RSV estes anticorpos humanos podem ser utilizados em processos de ensaio de diagnóstico conhecidos para detectar a presença e concentração de células com antigénio F de RSV em amostras, e.g., fluidos corporais. Os anticorpos humanos da presente invenção podem, for exemplo, ser unidos ou ligados a um suporte sólido, tal como esferas de látex, uma coluna, etc., que são então colocados em contacto com uma amostra que se crê conter antigénio F de RSV. 0 desenvolvimento de anticorpos humanos contra RSV pelos requerentes teve início com células de hibridoma de murídeo produzindo anticorpos monoclonais de murídeo que demonstraram neutralizar RSV in vitro e proteger ratos do algodão contra infecção do tracto respiratório inferior com RSV.

Foi seleccionado um desses anticorpos, que é específico para o sítio antigénico C, para produzir anticorpos quiméricos de murganho-humanos. Este anticorpo foi escolhido na base de que: (i) reagiu com um grande número de estirpes de vírus testadas (pelo menos 13 em 14 isoladas); (ii) reteve actividade neutralizante contra mutantes de escape de vírus seleccionados com outros anticorpos anti-F e (iii) bloqueou a replicação de RSV quando administrado a doses baixas a ratos do algodão, através da via intranasal antes do desafio do vírus. 0 12 ΡΕ0783525 anticorpo apresentou redução significativa no titulo do virus pulmonar entre anticorpos nessa região respectiva. 0 anticorpo de murideo 1308F, especifico para a região C da proteína F de RSV, foi escolhido como o alvo inicial para a humanização.

Em resumo, os anticorpos humanos foram construídos como se segue: o RNA foi extraído da linha celular produtora de anticorpo de murideo, as regiões variáveis de murideo que são responsáveis pela ligação do anticorpo ao RSV foram clonadas e sequenciadas, resultando na identificação das CDRs do anticorpo de murideo. Então, uma sequência de estrutura de cadeia pesada variável e leve variável humana possuindo a homologia mais elevada com o anticorpo de murideo de cadeia pesada e leve variável, foi seleccionada. Uma sequência de estrutura humana tal como a descrita acima é a mais capaz de aceitar as CDRs derivadas de murideo. A cadeia pesada variável 1308F de murideo foi comparada com vários genes de linhas germinais humanas, a homologia mais elevada foi com o gene HV3 da linha germinal humana. As duas sequências foram 62% homólogas no geral e 65% nas regiões da estrutura. Significativamente, existe uma boa homologia nas junções dos segmentos de CDR e das estruturas com a excepção da extremidade 5' de FR2. As CDRs de cadeia pesada variável derivadas de murideo foram então substituídas no gene HV3 da linha germinal humana da cadeia pesada. As sequências de murganho e humanas, assim como a 13 ΡΕ0783525 de uma combinação potencial das duas enxertada com CDR é apresentada na Figura 1.

Uma análise semelhante da região VL revelou homologia elevada com o gene K 102 da linha germinal humana V-Kappa. O alinhamento destas sequências é apresentado na Figura 2. Neste caso, a homologia é de 62% no geral e 73% nas regiões da estrutura. As CDRs de leve variável derivada de murideo foram então substituídas na cadeia leve variável humana do gene Kl02 da linha germinal humana. Em cada caso pode ser seleccionada a região J humana que é idêntica à sequência de murganho.

Para a presente invenção, a cadeia pesada variável de murideo 1129 foi comparada com várias sequências de aminoácidos da região variável humana, a homologia mais elevada foi com a sequência de COR rearranjada humana. As duas sequências de aminoácidos foram 75% homólogas no geral e 80% nas regiões de estrutura. Significativamente, existe uma boa homologia nas junções dos segmentos da CDR e as estruturas. As CDRs da cadeia pesada variável derivada de murideo foram então substituídas na sequência de VH de COR da cadeia pesada variável humana. As sequências de murganho e humana, assim como a de uma combinação potencial das duas enxertada com CDR é apresentada na Figura 7.

Uma análise semelhante da região VL revelou elevada homologia com a linha germinal humana K102. O alinhamento destas sequências é apresentado na Figura 8. 14 ΡΕ0783525

Neste caso, a homologia é de 73% no geral e 82% nas regiões da estrutura. As CDRs leve variáveis derivadas de murideo foram então substituídas na cadeia leve variável humana da linha germinal humana K102. Neste caso, foi seleccionada uma região J humana, JK4 humana, que é semelhante à sequência de murganho.

Por isso, os anticorpos humanos são expressos e caracterizados em relação aos anticorpos de murideo parentais para ser certo que a manipulação genética não alterou drasticamente as propriedades de ligação dos anticorpos.

Os requerentes apresentam aqui exemplos que são ilustrativos da invenção reivindicada, mas não pretendem limitar a invenção.

Exemplo Não-Inventivo 1

Clonagem de cDNA e sequenciação de Proteína F de anticorpo 1308F anti-RSV

As cópias de cDNA de VH e VL do anticorpo alvo foram criados como se segue. A reacção da primeira cadeia de cDNA foi realizada utilizando transcriptase reversa de AMV e um iniciador oligonucleótido fosforilado complementar ao segmento do mRNA codificando para a região constante do isotipo particular da cadeia pesada ou leve. Para 1308F o isotipo é gammal, kappa e os oligonucleótidos específicos 15 ΡΕ0783525 foram 5'AGCGGATCCAGGGGCCAGTGGATAGAC complementar aos codões 129-137 da região CHI do gene Gammal de murídeo, e 5'TGGATGGTGGGAAGATG complementar aos codões 116-122 do gene C-kappa de murídeo. 0 iniciador emparelha com um segmente do mRNA adjacente à região variável. A síntese da segunda cadeia de cDNA foi realizada utilizando RNase H e polimerase I de DNA, de E. coli, como descrito por Gubler e Hoffman (Gene 25/263, 1983), seguido por polimerase de DNA de T4 para assegurar que as extremidades rombas são produzidas.

Sinal V J C mRNA

Ia cadeia de cDNA 2a cadeia de cDNA 0 ds-cDNA foi ligado a pUC18 que foi digerido com a endonuclease de restrição Sma I e tratado com fosfatase alcalina. A ligação foi utilizada para transformar E. coli DH5a pelo método de Hanahan (J. Mol. Biol. 166/557, 1983).

As sondas de oligonucleótido correspondem à sequência da região C que se localiza entre o iniciador da primeira cadeia de cDNA e a região V foram utilizados em hibridações de colónia para identificar transformantes comportando o segmento de cDNA desejado. As sequências de sonda específicas foram GGCCAGTGGATAGAC complementar aos codões 121-125 de regiões CHI de murídeo e TACAGTTGGTGCAGCA complementar aos codões 110-115 de c-Kappa, respectivamente. Os plas-mídeos candidatos, isolados a partir de colónias que foram positivos na hibridação, foram analisados por digestão com as endonucleases de restrição Eco RI e Hind III para 16 ΡΕ0783525 libertar a inserção do cDNA. Aqueles com inserções de 400-500 pb foram sujeitos a sequenciação de DNA.

As inserções de cDNA foram inseridas em Ml3 mpl8 e mpl9 para a determinação da sequência de DNA em ambas as cadeias. O DNA de cadeia simples do bacteriófago recombinante resultante foi isolado e sequenciado pelo método de terminação de cadeia com didesoxi (Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74; 5463, 1977).

De modo a confirmar que o par de cDNA's de gene V rearranjado e mutado somaticamente, isolado a partir do hibridoma 1308F representava aquele que estavam no anticorpo 1308F, foi criado um gene Fv de cadeia simples, expressado em e secretado a partir de células de mamíferos, depois ensaiado para ligação ao vírus RS. Foram então utilizadas experiências de ligação competitiva para demonstrar a identidade do sítio de ligação.

Exemplo Não Inventivo 2

Concepção e montagem de VH e Vl de 1308F humanas

As regiões CDR de VH e VL foram identificadas comparando as sequências aminoacídicas com sequências conhecidas como descrito por Kabat (38] ) . De modo a se seleccionar as sequências de estrutura humana com maior capacidade para aceitar as sequências de CDR derivadas de ratinho numa conformação que retém a estrutura do sítio de 17 ΡΕ0783525 combinação do antigénio, foi empregue a seguinte estratégia. Em primeiro lugar, as sequências das regiões VH e VL de murideo serão comparadas com sequências humanas conhecidas das bases de dados de proteínas do Genbank e NBRF utilizando o programa Wordsearch no pacote Wisconsin de programas de manipulação de sequências (Nucleic Acid Res. 12; 387) . As várias regiões V humanas melhores foram depois adicionalmente analisadas com base na similaridade nas regiões de estrutura, especialmente nas junções das estruturas e regiões CDR (ver Figuras. 1 e 2). A região VH enxertada com CDR em conjunto com as respectivas sequências líder do gene humano da região v foi sintetizada de novo utilizando quatro oligonucleótidos que se sobrepõem variando entre 100-137 nucleótidos em comprimento (ver Figura 3) . Primeiro permitiu-se que os oligonucleótidos emparelhassem em combinações aos pares e se estendessem com polimerase de DNA para produzir fragmentos de dsDNA aproximadamente de 200 pb com uma região de sobreposição, os fragmentos foram depois misturados e sujeitos a PCR utilizando iniciadores na extremidade 3' de um fragmento e a extremidade 5' do outro fragmento. O único produto que se pode formar nestas condições é o segmento de VH. de comprimento total As sequências específicas dos iniciadores estão sublinhadas na Figura 3. Foi incluído um sítio para a endonuclease Sac I na extremidade 3' da sequências VH de modo a juntá-la a um segmento de gene humano de região constante. 18 ΡΕ0783525 A região VL enxertada com CDR foi sintetizada de modo similar (ver Figura 4) . Nesta ocasião, os fragmentos iniciais de 200 pb foram amplificados separadamente e inseridos em plasmídeos separados. O fragmento que codifica para o terminal amino foi clonado em derivado de pUC18 como um fragmento Ncol-Smal enquanto que o fragmento que codifica para o terminal carboxilo foi clonado como um fragmento Smal para Hinci III. Os fragmentos foram subsequentemente combinados via um sitio Smal na junção. Os oligonucleótidos estão indicados na Figura 4. Foi incluído um sítio Hinci III perto da extremidade 3' do segmento de gene de modo a uni-lo a um gene C-kappa humano.

Exemplo Não Inventivo 3

Construção de Vectores para expressão de 1308F O fragmento NcoI-SacI representando a VH humanizada foi unido a um fragmento SacI-ATOtl representando um cDNA de c-Gamma I humano e inserido em pS é (que é pUC 18 com sítios de restrição Ncol e Not I incorporados na região múltipla de ligação entre os locais BamHI e ΚρηI). O gene 1308F-gammal humanizado num fragmento Sacl-Notl foi depois combinado com um fragmento Pvul-Notl de pSJ37 possuindo um sítio de adição poli A e um fragmento PvuI-SacI de pSV2-dhfr-pCMV possuindo a origem de replicação de SV40, um gene dhfr e o promotor precoce imediato de CMV. O plasmídeo resultante foi designado pSJ60. 19 ΡΕ0783525 0 fragmento NcoI-HindIII representando a VL humanizada foi unido com um fragmento HindIII-Notl representando um cDNA de c-Kappa humano em pS18. 0 gene 1308F-Kappa humanizado num fragmento Sall-Notl foi depois combinado com um fragmento Pvul-Notl de pSJ37 possuindo um sitio de adição poli A e um fragmento Pvul-Sall de pSV2-dhfr-pCMV, possuindo a origem de replicação de SV40, um gene dhfr e o promotor precoce imediato de CMV. 0 plasmideo resultante foi designado pSJ61.

Finalmente, o pSJ60 e pSJ61 foram combinados num único plasmideo contendo ambas as cadeias leve e pesada e sinais de expressão. Isto foi conseguido isolando um fragmento Pvul-Bam Hl de pSJ61 transportando a cadeia leve com um fragmento Pvul-Bgl II de pSJ60 transportando a cadeia pesada para produzir pSJ66. (Ver Figura 5).

Exemplo Não Inventivo 4

Transfecção de células Cosi com PSJ60 e PSJ61

As transfecções foram efectuadas de acordo com o método de McCutchan e Pagano (J. Nat. Can. Inst. 41: 351-356, 1968) com as seguintes modificações. As células COS 1 (ATCC CRL1650) foram mantidas numa incubadora humidificada com CO2 a 5% em frascos de cultura de tecidos de 75 cm2 em Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM, GIBCO #320-1965) suplementado com Soro Fetal Bovino a 10% (FBS, GIBCO #200- 20 ΡΕ0783525 6140) e L-glutamina a 2 mM (BRL #320-5030) e passadas a uma proporção de separação de 1:20 quando as células atingiram confluência. 48 horas antes da transfecção, foram semeadas 5 placas de cultura de tecidos de 100 mm com 1,5 X 106 células por placa em 12 mL de DMEM, FBS a 10%, L-glutamina a 2 mM, penicilina-estreptomicina a 1% (P-S, GIBCO #600-5070) . No dia da transfecção, foram combinados 120 yg de cada um dos plasmideos pSJ60 e pSJ61, precipitados com etanol, e ressuspendidos assepticamente em 2,5 mL de Soro Fisiológico Tamponado com Tris. O DNA ressuspenso foi adicionado gota a gota, com agitação, a 10 mL de DMLEM contendo 1 mg/mL DEAE-dextrano (Pharmacia #17-0350-01) e cloroquina a 250 μΜ (Sigma #C6628). O meio foi removido das células COSI nas placas de 100 mm e as células foram lavadas uma vez com soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (D-PBS, GIBCO #310-4190), e foram adicionados 2,5 mL de DMEM suplementado com NuSerum a 10% (Collaborative Research #55000) a cada placa. Foram adicionados 2,5 mL da mistura de DNA/DEAE-dextrano/cloro-quina gota a gota a cada placa, as placas foram rodadas para misturar o DNA, e foram colocadas de novo na incubadora. Após 4 horas na incubadora, o sobrenadante foi aspirado das células e as células foram lavadas uma vez com 5 mL de D-PBS. As células foram submetidas a choque durante 3 minutos pela adição de 5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% em D-PBS à temperatura ambiente. O DMSO foi aspirado das células e as células foram lavadas com 5 mL de D-PBS. Foram adicionados 14 mL de DMEM/FBS a 10%/ L-glutamina a 2 mM/P-S a 1% a cada placa e as placas foram colocadas de novo na incubadora. 21 ΡΕ0783525

Três dias após a transfecção o meio foi removido das placas, reunido, e armazenado a -20 °C. As células foram colhidas, reunidas, e semeadas em 4 frascos de cultura de tecidos de 150 cm2, dois com 40 mL de DMEM/NuSerum a 10% e dois com 40 mL DMEM/FBS a 10%/L-glutamina a 2 mM. O meio foi recolhido e as células realimentadas a 7, 10, e 14 dias. Deste modo foi acumulado um total de 125 yg de anticorpo 1308F humanizado em 310 mL de meio suplementado com FBS e 85 yg em 240 mL de meio suplementado com NuSerum.

Exemplo Não Inventivo 5

Transfecções de células COS 1 com PSJ66 48 horas antes da transfecção, 5 placas de cultura de tecidos de 100 mm foram semeadas com 1,5 X 106 células por placa em 12 mL de DMEM, FBS a 10%, L-glutamina a 2 mM, penicilina-estreptomicina a 1% (P—S, GIBCO #600-5070) . No dia da transfecção, 125 yg do plasmídeo pSJ66 foram precipitados com etanol e ressuspensos assepticamente em 1,0 mL de Soro fisiológico Tamponado com Tris. O DNA ressuspenso foi adicionado gota a gota, com mistura, a 4,0 mL de DMEM contendo 1 mg/mL de DEAE-dextrano (Pharmacia #17-0350-01) e cloroquina a 250 yM (Sigma #C6628) . O meio foi removido das células COSI nas placas de 100 mm e as células foram lavadas uma vez com soro fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (D-PBS, GIBCO #310-4190), e foram adicionados 2,5 mL de DMEM suplementado com NuSerum 22 ΡΕ0783525 a 10% (Collaborative Research #55000) a cada placa. Foram adicionados 2,5 mL da mistura DNA/DEAE-dextrano/cloroquina gota a gota a cada placa, as placas foram rodadas para misturar o DNA, e foram novamente colocadas na incubadora. Após 4 horas na incubadora, o sobrenadante foi aspirado das células e as células foram lavadas uma vez com 5 mL de D-PBS. As células foram sujeitas a choque durante 3 minutos pela adição de 5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% em D-PBS à temperatura ambiente. O DMSO foi aspirado das células e as células foram lavadas com 5 mL de D-PBS. Foram adicionados 14 mL de DMEM/ FBS a 10%/L-glutamina a 2 mM/P-S a 1% a cada placa e as placas foram devolvidas à incubadora.

Três dias após transfecção, o meio foi removido das placas, misturado, e armazenado a -20° C. As células foram recolhidas, misturadas, e semeadas em 4 frascos de cultura de tecidos de 150 cm2 com 40 mL de DMEM a 10% NuSerum e dois com 40 mL de DMEM FBS a 10%/L-glutamina a 2 mM. O meio foi recolhido e as células foram realimentadas a 7, 10, e 14 dias. Deste modo, um total de 190 pg de anticorpo 1308F humanizado foi acumulado em 310 mL de meio suplementado com FBS e 120 pg em 240 mL de meio suplementado com NuSerum. A concentração de anticorpo 1308F humanizado secretado das células Cosi no meio foi determinado utilizando uma ELISA de captura. Foi utilizado Fc de IgG anti-humano de cabra revestido em placas de 96 poços para 23 ΡΕ0783525 capturar o anticorpo humanizado. IgG humano total anti-humano de cabra conjugado com peroxidase revelado com um substrato cromogénico foi então utilizado para detectar o anticorpo ligado. Foi utilizada uma preparação de IgGl/Kappa humana purificada para calibrar o ensaio.

Exemplo 6 Não inventivo

Neutralização de RSV com 1308F humanizado MÉTODOS: 0 RSV foi neutralizado com 1308F humanizado a partir do sobrenadante de células COS ou de anticorpo monoclonal 1308F purificado. Isto foi efectuado por incubação de 50 unidades formadoras de placas de RSV com diluições seriadas de 2 vezes de anticorpo para 1,0 hora a 37 °C. As monocamadas confluentes de células Hep2 em painéis de 24 poços foram infectadas com 100 pL de virus tratado com anticorpo, vírus controlo não tratado, e controlos com infecção simulada. Incubados durante 1,5 horas a 37° C, humidificados, e com CO2 a 5% e recobertos com 1,5 mL de EMEM, FBS a 1%, e metilcelulose a 1%. As células foram fixadas e coradas com glutaraldeído e violeta de cristal no dia 4. As placas foram contadas em poços em triplicado e apresentadas como percentagem de neutralização. Os resultados apresentados na Figura 6 indicam que o anticorpo monoclonal 1308F purificado de murídeo e o anticorpo monoclonal 1308F humanizado a 5 a 10 ng por poço produziu reduções semelhantes de 50% em placas de RSV. - 24 - ΡΕ0783525

Exemplo 7

Produção de um anticorpo 1129 com um sitio A enxertado em CDR 0 RNA poliA+ foi purificado a partir de um lisado de 2 x 107 células de hibridoma 1129 de murideo utilizando oligo-dt celulose. A primeira cadeia de cDNA foi preparada a partir de 1 pg de RNA pA+ utilizando iniciadores hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa de AMV"1 pg de RNA pA+, 50 mM de Tris-HCl pH 8,5, 8 mM de MgCl2, 30 mM de KC1, 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de dNTP's, 25 unidades de inibidor de ribonuclease de placenta, 33 pM de hexâmeros aleatórios, e 10 unidades de transcriptase reversa de AMV durante uma hora a 42°C. O cDNA da região 1129 foi amplificado por PCR utilizando os oligonucleótidos SJ41 e SJ11, ver Tabela 1. O cDNA da região 1129 VH foi de modo semelhante amplificado utilizando os oligonucleótidos SJ42 e SJ10, ver Tabelas 1. TABELA 1 SJ10

AGCGGATCCAGGGGCCAGTGGATAGAC SJ11

GATGGATCCAGTTGGTGCAGCATC SJ41

CACGTCGACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA SJ42 ΡΕ0783525 25 CGGAATTCAGGTIIAICTGCAGIAGTC(A, T) GG {I = desoxi-Inosina} SJ53

CCCAAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTG SJ154 GGCGTCGACTCACCATGGACATGAGGGTCC(C/T)CGCTCAGC SJ155 (H1129L CDR 1)

GTCACCATCACTTGCAAGTGCCAGCTGAGTGTAGGTTACATGCACTGGTACC

AGCAG SJ157 (H1129L CDR 3)

GCAACTTATTACTGCTTTCAGGGGAGTGGGTACCCATTCACGTTCGGAGGGG

GG SJ168

GTGACCAACATGGACCCTGCTGATACTGCCAC SJ169

CCATGTTGGTCACTTTAAGGACCACCTGG SJ170

CCAGTTTACTAGTGTCATAGATCAGGAGCTTAGGGGC SJ171 TGACACTAGTAAACTGGCTTCTGGGGTCCCATCAAGG Condições de PCR: 0,5 pL da Ia cadeia de cDNA, 10 mM de Tris-HCl pH 8,3, 50 mM de KC1, 1,5 mM de MgCÍ2, 0,2 mM de dNTP's, 0,001% de gelatina, 1 μΜ de cada iniciador, 1 ng de DNA molde e 2,5 U de DNA polimerase AmpliTaq (TM) (Perkin Elmer-Cetus) . 94° 1 minuto, 55° 2 minutos, 12° 2 minutos num termociclador Perkin Elmer 480 durante 25 ciclos. O(s) 26 ΡΕ0783525 fragmento(s) de DNA resultante foi(foram) então extraído(s) uma vez com fenol/clorofórmio (1/1), precipitados com 2,5 volumes de ETOH, ressuspendidos no tampão da endonuclease de restrição apropriado e digerido com endonucleases de restrição para produzir extremidades coesivas para clonagem. Os fragmentos resultantes foram então separados por electroforese num gel de agarose a 1%. Após coloração do gel em brometo de etídeo, os fragmentos foram excisados e purificados a partir da agarose por congelação e extrac-ção na presença de fenol.

Os fragmentos foram então digeridos com as endonucleases de restrição EcoRI e BamRI e clonados no plasmídeo pUC18. As inserções foram então sequenciadas pelo método de terminação de cadeia com didesoxinucleótidos utilizando a polimerase T7 de DNA modificada (Sequenase, US Biochemical).

As sequências traduzidas foram comparadas com sequências de proteína de anticorpo humano. Verificou-se que a VL apresentava maior homologia com a cadeia leve K102 e verificou-se que a VH apresentava maior homologia com a região Cor VH. A região 1129 Fv foi então modelada através da substituição dos resíduos das sequências de VL e VH de 1129 nas coordenadas dos resíduos correspondentes na estrutura do cristal do anticorpo MCPC603. Os resíduos foram identificados como integrantes da estrutura enrolada ou expostos por solvente através de inspecção visual do modelo. 27 ΡΕ0783525 Vários resíduos integrantes e que eram diferentes nas sequências de murganho e de humano foram deixadas como o resíduos de murganho de modo a manter a integridade da Fv e deste modo o sítio de ligação. Estes resíduos foram 31, 83, 113, e 116 na região VH e 47 na VL. As sequências resultantes estão representadas nas FIGS. 7 e 8. 0 1129 VH humanizado concebido foi construído utilizando os oligonucleótidos sintéticos SJ147-SJ153 (FIG. 9) (SEQ ID NO:36-42) que foram combinados utilizando PCR. Os produtos desta PCR foram depois digeridos com iVcol e Saci e clonados no vector plasmídico pSJ40 que é um derivado de pUC18 em que um segmento lacZl fora de grelha é recolocado em grelha como uma fusão com um segmento da região V em grelha quando tal segmento é inserido com um fragmento Ncol-Sacl. Um plasmídeo contendo uma inserção em que 5 mutações foram agrupadas numa única região de 50 pb foi depois submetido a reparação destas alterações utilizando PCR recombinante e os iniciadores SJ168 e SJ169, ver Tabela 1. A VL foi produzida por mutagénese dirigida do gene humanizado de cadeia leve 1308F. Foram utilizados os oligonucleótidos SJ155, ver Tabela 1, (CDR1), e SJ157 (CDR3) para separadamente mutagenizar o gene H1308L. A mutagénese foi realizada utilizando DNA polimerase T7 em uracilo contendo moldes de DNA de cadeia simples produzidos em estirpe de E. coli BW313 (dut-,ung-) e subsequentemente 28 ΡΕ0783525 transformados em estirpe de E. coli DH5 (dut + ,ung+) . Os dois mutantes foram combinados e foi introduzida CDR2 por PCR recombinante utilizando os oligonucleótidos SJ170, SJ154, ver Tabela 1, (extremidade 5') e SJ171, SJ53, ver

Tabela 1, (extremidade 3'). Os genes VH e VL enxertados em CDR foram colocados em pSJ60 (ver Exemplo 3) e pSJ61 (ver Exemplo 3) , respectivamente como fragmentos NcoI-SacI em vez dos segmentos da região V H1308F resultando nos plasmideos pSJ81 e pSJ105. Adicionalmente, os segmentos de cDNA murideo de VH e VL foram unidos de modo similar a C-Gammal e CKappa humano respectivamente para produzir os vectores de expressão pSJ75 e pSJ84.

Exemplo 8

Expressão Transiente de Hull29

As células COSI (ATCC CRL1650) foram mantidas num incubador humidificado com C02 a 5% em frascos de cultura de tecidos de 75 CM2 em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, GIBCO #320-1965) suplementado com soro de bovino fetal a 10% (FBS, GIBCO #200-6140) e L-glutamina a 2 mM (GIBCO #320-5030) e passadas a uma proporção de separação de 1:20 imediatamente antes de atingir a confluência.

As transfecções foram efectuadas de acordo com o método de McCutchan e Pagano (J. Nat. Can. Inst. 41: 351- 356, 1968) com as seguintes modificações. Vinte horas antes 29 ΡΕ0783525 da transfecção foram semeadas placas de cultura de tecidos de 100 mm (Corning #25020) com 2 X 106 células COSI por placa em 14 mL de DMEM, FBS a 10%, L-glutamina a 2 mM. No dia da transfecção 10 pg do plasmídeo de cadeia pesada Hull29 (pSJ81, do Exemplo 7 foram combinados com 10 pg do plasmideo de cadeia leve kappa Hull29 pSJ105, do Exemplo 7, o DNA foi precipitado com etanol e ressuspendido assepti-camente em 1,0 mL de Soro Fisiológico tamponado com Tris. O DNA ressuspendido foi adicionado gota a gota, com agitação, a 4,0 mL de DMEM contendo DEAE-dextrano a 1 mg/mL (Pharmacia #170350-01) e Cloroquina a 250 pM (Sigma #C6628) . O meio foi removido das placas com células COSI, as monocamadas de células foram lavadas uma vez com 10 mL de Soro Fisiológico tamponado com fosfato de Dulbecco (D-PBS, GIBCO #310-4190), e foram adicionados 2,5 mL de DMEM suplementado com NuSerum a 10% (Collaborative Research #55000) e L-glutamina a 2 mM a cada placa. Foram adicionados 2,5 mL da mistura de DNA/DEAE dextrano/cloroquina gota a gota a cada placa, as placas foram rodadas para misturar o DNA, e colocadas de novo no incubador. Após um período de adsorção de DNA de oito horas as placas foram removidas do incubador e o sobrenadante foi aspirado das placas. As células foram sujeitas a choque pela adição de 5 mL de DMSO a 10% em D-PBS por placa durante 3 minutos à temperatura ambiente, após o que o DMSO foi aspirado das células e as células foram lavadas uma vez com 5 mL de D-PBS. Foram adicionados 15 mL de DMEM, NuSerum a 10%, L-glutamina a 2 mM (meio de produção) a cada placa e as placas foram colocadas de novo no incubador. 30 ΡΕ0783525

Setenta e duas horas após transfecção o meio condicionado foi recolhido das placas e armazenado a -20 °C, e foi adicionado 5 mL de meio de produção às placas e as placas foram colocadas de novo incubador. Noventa e seis horas mais tarde o meio foi recolhido das placas e armazenado a 20 °C.

Exemplo 9

Quantificação de Hull29 A quantificação de anticorpo IgGl de Hull29 segregado para o meio pelas células COSI foi realizada utilizando uma ELISA do tipo sanduíche. Em resumo, foram revestidas Imunoplacas Nunc Maxisorp (Nunc #439454) com 50 yL/poço de Fc de IgG de cabra anti-humano a 0,5 yg/mL (Cappel #55071) em bicarbonato de sódio a 0,1 M pH 9,6 durante 3 horas à temperatura ambiente. Os poços foram lavados três vezes com fosfato de sódio a 0,01M pH 7,4,

NaCl a 0,15 M, Tween 20 a 0,1% (PBS-T) . A ligação não específica de proteínas à placa foi bloqueada por tratamento dos poços com 200 yL/poço de leite seco magro a 3% (p/v) em PBS durante 30 minutos à temperatura ambiente. Foi preparada uma IgGl kappa humana purificada convencional (Sigma #1-3889) a 100 ng/mL em PBS-T e diluída em série 1:2 para 1,56 ng/mL e foram adicionados à placa amostras de 50 yL. Após uma hora à temperatura ambiente os poços foram evacuados e lavados três vezes com PBS-T. Para detectar a 31 ΡΕ0783525 presença de anticorpo Hull29 ligado, foi diluida 1:1000 IgG anti-humano de cabra purificado por afinidade conjugado com peroxidase de rábano (molécula total, Cappel #3601-0081) em PBS-T e foi adicionado 50 pL a cada poço da placa de ensaio e incubado à temperatura ambiente durante uma hora. A placa foi lavada três vezes com PBS-T e 100 pL do substrato cromogénico TMBlue (TSI#TM102) foi adicionada a cada poço. A placa foi incubada à temperatura ambiente na escuridão durante 10 minutos e a reacção foi parada pela adição de 50 pL por poço de H2SO4 a 4,5 Μ. A placa foi lida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas Molecular Devices Vmax e a análise dos dados foi realizada utilizando software Softmax (Molecular Devices) correndo um computador IBM P/S2 modelo 80.

Durante as primeiras setenta e duas horas de produção as células COSI produziram 0,06 pg/mL de Hull29, durante um total de 0,9 pg. Nas noventa e seis horas seguintes, a produção de células COSI produziu 0,99 pg/mL de Hull29, para um total de 14,85 pg.

Exemplo 10

Ensaio de Ligação de Hull29

Os ensaios de ligação de Hull29 foram realizados numa ELISA de captura, essencialmente como para a ELISA de quantificação, mas com as seguintes alterações. As placas foram revestidas com o anticorpo Mui 331 a 0,5 pg/poço, os 32 ΡΕ0783525 poços foram bloqueados com leite magro a 3% em PBS-T e 50 pL de lisado de células HEP2 infectadas com RSV foi adicionado a cada poço e incubado à temperatura ambiente durante 1 hora. O restante do ensaio foi efectuado como para o ensaio de quantificação iniciando com a adição de amostras diluídas aos poços. Os resultados foram analisados como uma representação recíproca dupla da DO vs a concentração de anticorpo em que a Kd para a molécula H1129 de 0,7 nM foi determinado em comparação com 10 mM para o anticorpo Kappa MI129huGammaI.

Ensaios de neutralização nos anticorpos H1129 e chll29 foram efectuados de acordo com o seguinte procedimento: 1. Abrir as placas de cultura de células Costar de 96 poços na câmara. 2. Aquecer o Meio de Cultura (GM) a 37 °C. 3. Descongelar as células MA104 a 37 °C. Diluir para 150 000 células por mL com GM. Misturar as células e dispensar 200 pL por poço. 4. Cultivar as células a 37 °C, 5% de C02, e humidificadas durante a noite antes da infecção. 5. Diluir o Estoque de RSV para 10 000 pfu por mL no meio de manutenção (MM). 33 ΡΕ0783525 6. Misturar igual volume de Anticorpo diluído em MM com igual volume de RSV diluído. Incubar a 37 °C, 5% de CO2, e humidificado para 1,0 h antes da infecção. 7. Infectar poços em replicados de células MA104 com 200 pL da mistura de Anticorpo e Vírus. Infectar poços em replicado com o vírus e controlos com infecção simulada. 8. Fechar as placas em celofane e incubar a 37 °C, 95% de humidade, e 5% de CO2 durante 5 dias. 9. ELISA para RSV: Aspirar cada poço; adicionar 100 pL de 80% de Acetona/PBS (vol./vol.) e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos 10. Aspirar cada poço e secar ao ar durante 30 minutos na grelha de uma câmara de fluxo laminar. 11. Lavar 4 vezes com PBS, 0,05% de Tween 20. 12. Adicionar 100 pL de anticorpo monoclonal contra a proteína F de RSV a cada poço. Incubar durante 1,0 h a 37 °C. 13. Lavar 4 vezes com PBS, 0,05% de Tween 20. 14. Adicionar 100 pL de conjugado de peroxidase de rábano de soro de cabra com anticorpo anti-muríneo a cada poço. Incubar durante 1,0 h a 37 °C. 34 ΡΕ0783525 15. Lavar 4 vezes com PBS, 0,05% de Tween 20. 16. Adicionar 100 pL de uma mistura 1:1 de ABTS preparada de fresco e peróxido a cada poço. Incubar à temperatura ambiente até que a densidade óptica (405 nm) do virus controlo seja 5 a 10 vezes a dos controlos com infecção simulada.

Apêndice:

Meio de Crescimento (GM): Meio essencial Mínimo (Eagle) com BSS de Earle, 2 mM de glutamina,

Aminoácidos não essenciais de Eagle 0,1 mM final,

Soro Fetal de bovino 10% (v/v),

Penicilina 50 unidades/mL,

Estreptomicina 50 mcg/mL

Meio de Manutenção (MM): como acima com soro reduzido a 1 a 2%.

Estoques de células MA104 são cultivados em frascos T150 com Meio de Crescimento. Os estoques são congelados com 3 x 106 células por frascos de 1,8 mL em 10% de DMSO e Meio de Crescimento. Armazenado num frigorífico LN2.

Estoques de RSV: são cultivados em células MA104 (rim de macaco) ou Hep 2 em frascos T150. Adicionar -0,2 mL (-100 000 pfu) de estoque de vírus por T150 confluente. Adsorção 35 ΡΕ0783525 durante 1,0 h à temperatura ambiente. Depois adicionar 20 mL de meio de manutenção com 1% de soro fetal de bovino. Incubar 4-5 dias a 31° C. Recolher as células imediatamente antes de 100% cpe por raspagem. Centrifugar as células; remover todo o sobrenadante menos 10 mL. Congelar (banho de gelo seco-etanol), descongelar o precpitado de células, levar ao vórtice, congelar de novo, e armazenar o estogue de virus no frigorifico LN2.

Tampão de Anticorpo de ELISA: PBS, 0,05% de Tween 20 (p/v), 2,0% de soro de cabra (v/v) e 0,5% de gelatina (p/v).

Anticorpo para proteína F de RSV: Chemicon Mab 858-1 anti-proteína de fusão de RSV diluído com ~1:5000 em Tampão de Anticorpo de ELISA.

Soro Anti-Murídeo: Peroxidadse de rábano de Fisher conjugada com anti-IgG de murganho de cabra (Específica para a Cadeia Pesada) diluída com -1:4000 em Tampão de Anticorpo de ELISA.

Os resultados são apresentados na Figura 10, e indicam que 25 ng/mL conseguiram 50% de neutralização neste ensaio enquanto que foi necessário 45 pg/mL do anticorpo chll29 para 50% de neutralização nesta experiência. Após uma série de 6 ensaios separados o valor médio para 50% de neutralização para H1129 foi de 17 ng/mL. Como um controlo e para comparar a potência, ensaiou-se também uma preparação de IgG policlonal humana a partir do plasma de 36 ΡΕ0783525 indivíduos com elevados títulos de neutralizantes para RSV. Esta preparação, denominada RSVig (lote#4), produziu um valor médio de 50% de neutralização de 2,3 pg/mL após 3 experiências. Assim, ο H1129 é 100 vezes mais potente neste ensaio como a preparação de policlonal enriquecida. EXEMPLO 11

Análise Cinética de Mabs para RSV Humanizados por

BlAcoreTM

A cinética de interacção entre Mabs humanizados para RSV e a proteína F de RSV foi estudada por ressonância de plasmões de superfície utilizando um biosensor Pharmacia BlAcoreTM. Um baculovírus recombinante que expressa uma proteína F truncada C-terminal proporcionou uma fonte abundante de antigénio para estudos cinéticos. O sobrena-dante, que continha a proteína F segregada, foi enriquecido aproximadamente 20 vezes por cromatografias sucessivas em colunas de concanavalina A ed Q-sepharose. As fracções combinadas foram dialisadas contra 10 mM de citrato de sódio (pH 5,5), e concentrado para aproximadamente 0,1 mg/mL. Uma alíquota da proteína F (100 mL) foi acoplada com amina ao chip sensor BIAcore. A quantidade imobilizada produziu aproximadamente 2000 unidades de resposta (Rmax) de sinal quando saturado com H1129 ou H1308F. Isto indicou que existia um número igual de sítios antigénicos "A" e "C" na preparação da proteína F após o procedimento de acoplamento. Dois Mabs irrelevantes não relacionados (RVFV 37 ΡΕ0783525 4D4 e CMV H758) não apresentaram interacção com a proteína F imobilizada. Um estudo cinético típico envolveu a injecção de 35 mL de Mab a várias concentrações (25-300 nM) em tampão PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS/Tween). A taxa de fluxo foi mantida a 5 mL/min, produzindo uma fase de ligação de 7 min. Após a injecção de Mab, o fluxo foi trocado com tampão PBS/Tween durante 30 min para determinação da taxa de dissociação. O chip sensor foi regenerado entre ciclos com um pulso de 2 min de 10 mM de HC1. O passo de regeneração causou uma perda mínima de capacidade de ligação da proteína F imobilizada (4% de perda por ciclo). Esta pequena diminuição não alterou os valores calculados das constantes da taxa para a ligação e dissociação. A afinidade dos vários Mabs para a ligação com a proteína F foi calculada a partir do quociente da constante de dissociação da taxa de primeira ordem com a constante de ligação para a taxa de segunda ordem (Kd kcliss /kassoc) · O valor para kasSoc foi calculado com base na equação de taxa seguinte: íl) íSR/dfc * - ífcwCKabl * em que R e Rmax são as unidades de resposta no tempo t e infinito, respectivamente. Uma representação de dr/dt como uma função de R produz um declive de (kassoc [Mab] + kdiss) - Uma vez que estes declives estão line- ΡΕ0783525 - 38 - armente relacionados com a [Mab] , o valor de kassoc pode ser derivado de uma nova representação dos declives versus a [Mab] . 0 declive da nova linha é igual a kassoc. Embora o valor de kdiss possa ser extrapolada da intercepção com os YY, um valor mais preciso foi determinado por medição directa de kdlss. Depois da fase de injecção do Mab, o tampão PBS/Tween flui através do chip sensor. A partir deste ponto, a [Mab]=0. A equação (1) reduz-se então a: (2) dir/dfe m or â&/n « A integração da equação (2) produz: Ϊ3Ϊ laí&a/R*) * em que Ro/Rt) são as unidades de resposta no tempo 0 (inicio da fase de dissociação) e t, respectivamente. Por último, representando o ln(Ro /Rt) como uma função de t obtém-se um declive de kdiss.

Constantes Cinéticas para Mabs de RSV ka(assoe) kd(dissoc) 11 /2 # Kd (kd/ka) Mab M"1 sec 1 sec-1 (Hrs) nM CHI12 9 5, 0 x 104 7,5 LO 1 O \—1 X 2, 6 1,5 Hl 12 9 4,9 x 104 6,9 LO 1 O \—1 X 2,8 1,4 Ml 12 9 3,5 x 104 4,0 1 o \—1 X 0,48 11,4 M1308F 3, 5 x 104 3, 8 LO 1 o \—1 X 5,1 1,1 H1308F 2,2 q1 O \—1 X 5, 5 LO o \—1 X 3,5 2,5 39 ΡΕ0783525

Exemplo 12

Protecção de Ratos do Algodão In vivo com Mab's Humanizados H1129 e H1308F foram cada um testados para a capacidade para reduzir a infecção no tecido de pulmão de ratos do algodão quando administrados intra-muscularmente. Os ratos do algodão (S. hispidus, 4 animais por grupo, peso médio de 100 gramas) foram anestesiados com metoxiflurano e foram dados 0,1 mL de solução de anticorpos, resultando em doses de 5 mg/kg, 1,67 mg/kg e 0,56 mg/kg respectivamente) por injecção intramuscular. Os animais controlo foram injectados com albumina de soro bovino. Um dia depois, os animais foram de novo anestesiados e expostos por instilação intranasal de 105 unidades formadoras de placas (PFU) da estirpe Longa de RSV. Quatro dias após exposição ao virus, todos os animais foram sacrificados por asfixia com dióxido de carbono. Os pulmões foram recolhidos e homogeneizados em 10 partes de sais em equilíbrio de Hanks (peso/vol). A suspensão resultante foi quantificada quanto ao conteúdo em vírus por ensaio em placa.

Os resultados destas experiências, a seguir apresentadas, indicam que H1129 e H1308F são eficazes na redução nos títulos virais nos pulmões de ratos do algodão quando injectados um dia antes da exposição a RSV. 40 ΡΕ0783525

Anticorpo Dose Iniectada Titulo do Virus (pfu/gm) em tecido de Pulmão Nenhum 6,3 x 104 1129 Humanizado 5 mg/kg 1,2 x 102 1,67 mg/kg 1,4 x 102 0,56 mg/kg 5,7 x 101 2 3 1308F de Murideo 5 mg/kg 6,8 x 101 1,67 mg/kg 1,3 x 104 056 mg/kg 2,6 x 104 1308F Humanizado 5 mg/kg 2,7 x 101 1,67 mg/kg 1,3 x 104 0,56 mg/kg 2,1 x 104

Referências 1. Hall, C. B., Doiuglas, R. G., Geiman, J. M. et al., N.Engl.J.Med. 293:1343, 1975. 2. Hall, C. B., McBride, J. T., Walsh, E. E. et al., N.Engl.J.Med. 308:1443, 1983. 1

Hall, C. B., McBride, J. T., Gala, C. L. et al., JAMA 254:3047, 1985. 2

Wald, E. R., et al., J.Pediat. 112:154, 1988. 3

Kapikian, A. Z., Mithcell, R. H., Chanock, R. M. et al., Am. J. Epidemiol. 89:405, 1969. 41 ΡΕ0783525 6. Prince, G. A., Hemming, V. G., Horswood, R. L. et al., Vírus Res. 3:193, 1985. 7. Hemming, V. G., Prince, G. A., Horswood, R. L. et al., J.Infect.Dis. 152:1083, 1985. 8. Wright, P. F., Belshe, R. B., et al., Infect.Immun. 37:397, 1982. 9. Conrad, D. A., Christenson, J. C., et al., Peditr.Infect.Dis.J. 6:152, 1987. 10. LoBuglio, A. F., Wheeler, R. L., Trang, J. et al., Proc. Natl.Acad. Sei. 86:4220, 1989. 11. Steplewski, Z., Sun, L. K., Shearman, C. W. et al., Proc.Natl.Acad. Sei. 85:4852, 1988. 12. Boulianne, G. L., Hozumi, N., Shulman, M. J. Nature. 312:643, 1984. 13. Sun, L. K., Curtis, P., Rakowicz-Szulczynska, E. et al., Proc. Natl.Acad. Sei. 84:214, 1987. 14. Liu, A. Y., Mack, P. W., Champion, C. I., Robinson, R. R., Gene 54:33, 1987. ΡΕ0783525 42 L. A. , J. et

Honj o, 38:275 1989. 15. Morrison, S. L., Johnson, M. J., Hersenber, Oi, V. T. Proc. Natl. Acad. Sei. 81:6851, 1984. 16. Morrison, S. L. Science 229:1202, 1985. 17. Sahagan, B. G., Dorai, H., Saltzgaber-Muller, ai., J. Immunol. 137:1066, 1986. 18. Taked, S., Naito, T., Hama, K., Noma, T., T., Nature 314:452, 1985. 19. Carson, D. A., Freimark, B. D., Adv. Immunol. 1986. 20. Beeler, J. A., et ai., J.Virol. 63:2941-2950, 21. Coelingh, et ai., Virology, 143:569-582, 1985. ΡΕ0783525 43

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: MEDIMMUNE, INC.

35 West Watkins Mill Road Gaithersburg, MD 20878, US (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Anticorpos Quiméricos de Murideo e Humano Contra o Virus Sincicial Respiratório (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 42 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA:

(A) DESTINATÁRIO: LOUIS, PÕHLAU, LOHRENTZ & SEGETH (B) RUA: Merianstrasse 26 (C) CIDADE: Nurnberg (D) ESTADO: Alemanha (E) CÓDIGO POSTAL: 90409 (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR:

(A) TIPO DE MEIO: DISQUETE DE 3,5 POLEGADAS

(B) COMPUTADOR: COMPAQ

(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTADOR: WORD 4.0 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: EP 95928353.2 (B) DATA DE PEDIDO: 9 de AGOSTO de 1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: 6

(vii) DADOS DE PEDIDO ANTERIOR (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US95/10053 (B) DATA DE PEDIDO: 9 de Agosto de 1995

(vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/290,592 (B) DATA DE PEDIDO: 15 de Agosto de 1994 (viii) INFORMAÇÃO DO MANDATÁRIO/AGENTE:

(A) NOME: Wolfgang SEGETH (B) NÚMERO DO REGISTO: (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/DOSSIER: 33.773ep/40/hs (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 0911/510 360 (B) TELEFAX: 0911/511 342 44 ΡΕ0783525 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 27 PARES DE BASES

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: AGCGGATCCA GGGGCCAGTG GATAGAC 27 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 17 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: TGGATGGTGG GAAGATG 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 15 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

GGCCAGTGGA TAGAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 16 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES 15 45 ΡΕ0783525

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4 TACAGTTGGT GCAGCA 2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 24 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5

GATGGATCCA GTTGGTGCAG CATC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 30 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6

CACGTCGACA TTCAGCTGAC CCAGTCTCCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 30 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7

CGGAATTCAG GTNNANCTGC AGNAGTCWGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: 46 ΡΕ0783525

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 28 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

CCCAAGCTTG GTCCCCCCTC CGAACGTG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 39 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: GGCGTCGACT CACCATGGAC ATGAGGGTCC YCGCTCAGC 39 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 57 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: GTCACCATCA CTTGCAAGTG CCAGCTGAGT GTAGGTTACA TGCACTGGTA CCAGCAG 57 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 54 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido 54 54 47 ΡΕ0783525 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11: GCAACTTATT ACTGCTTTCA GGGGAGTGGG TACCCATTCA CGTTCGGAGG GGGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 32 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido 32

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: GTGACCAACA TGGACCCTGC TGATACTGCC AC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 29 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido 29

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: CCATGTTGGT CACTTTAAGG ACCACCTGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 37 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: CCAGTTTACT AGTGTCATAG ATCAGGAGCT TAGGGGC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 37 NUCLEÓTIDOS 37 48 ΡΕ0783525

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15: TGACACTAGT AAACTGGCTT CTGGGGTCCC ATCAAGG 37 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 97 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Gin Vai hy$ Lys Pro Gly 5 10 15

Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Asn 20 25 30

Ser Tyr Tyr Met Eis Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Lee 35 40 45

Glu Trp Hat Gly lie lie Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr 50 55 m

Ala Gin Lys Phe Gin Gly Arg vai Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser 65 70 75

Thr Ser Thr Vai Tyr Met Glu Leu Ser ser Leu Arg Ser Glu Asp 80 85 50

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys Ala 95 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 117 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA 49 ΡΕ0783525 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Gin Vai Lys Lys Pro Gly S 10 is

Ala Ser Vai Lys Vai Ser Cys hys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30

Asp Tyr Tyr Ile Tyr Trp Vai Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Vai Phe 50 55 50

Asp Pxo Lys Phe Gin Gly Arg vai Thr Het Thr Arg Asp Thr Ser 55 70 75

Thr Ser Thr Vai Tyr Hefc Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp 30 85 90

Thr Ala Vai Tyr Tyr Cyg Ala Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Phe Asp 95 100 105

Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser HO 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 117 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

Glu Vai Gin Leu Gin Gin ser Gly Ala Glu Leu Vai Arg pro Gly 5 10 15

Ala Leu Vai Lys Leu Ser Cys hys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 20 25 30

Asp Tyr Tyr Ile Tyr Trp Vai Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu 35 40 45

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asa Gly Asn Thr Vai Phe

SÔ 55 SQ

Asp Pro Lys Phe Gin Gly Lys Ala Ser ile Thr Ser Asp Thr Ser 65 70 75 50 ΡΕ0783525

Ser Asn Thr Ala Tyr Leu Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp 80 85 90

Thr Ala ¥al Tyr Tyr Cys Ala Tyr Tyr Gly Thr Ser Ser Phe Asp

95 100 10S

Phe Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Vai Ser Ser 110 115 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 95 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19:

Asp lie Gin Mefc Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Vai 5 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser 20 25 30

Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly vai Pro Ser

50 55 SO

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile S5 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 86 85 90

Tyr Asn Ser Tyr Ser 95 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 107 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20: 51 ΡΕ0783525

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ma Ser Vai 5 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr He Thr Cys Lya Ala Ser Gin Asp He Asn 20 25 30

Arg Tyr Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu He Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Vai Asp Gly Vai Pro Ser 5Ô 55 Sô

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He 6S 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90

Phe Sis Glu Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lye Leu Glu 95 100 105

He Lys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 107 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21:

Asp Ile Lys Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Tyr Vai Ser Leu 5 10 15

Gly Glu Arg Vai Thr Ile thr cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Asn 20 25 30

Arg Tyr Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys 35 40 45

Thr Leu He His Arg Ala Asn Arg Leu Vai Asp Gly Vai Pro Ser 50 55 €0

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gin Glu Tyr Ser Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Glu Phe Glu Asp Met Gly ile Tyr Tyr Cys Leu Gin 80 85 90 52 ΡΕ0783525

Plie His Glu Plxe Pro Tyr Tlir Phe Gly Gly Giy Ίίϊτ I*ys Leu Giu

95 IÒ0 10S lie Lys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 117 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22:

ÇÇATGGACTG GACCTGGAGG GTCTTÇTGCT TGCTGGCTGT AGCRCCAGGT GCCCACTCCÇ 60 ÁGCÍTGCAGCT GGTGCAGTCT fíGAfíerGAGG TGAAGAAGCC TGGtAGCCTCA GTGAAGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 23:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 120 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23: ÇAÇTTCTTQ3 GAÇÇTCGGJyS TCACTTCÇAA ãjSGAÇGTTCC GTAGACCTAA 60 cmmmm csarotm ccgmotcac cmcccracc isô (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 24:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 119 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24: GG®GTCS»ST GGKTSGSTTG QAT3X*ftCCCT «EàOEGfGTX 60 TCCRSSGC&S AGTCACCATG ACCA3GGRCA. GCTCCACGAG CACftGTCrAC ATGGJUGCTG 11$ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 25: 53 ΡΕ0783525

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 137 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25 «O 120 137

fíCmSCTCGTG TCaQOTSTAC CTGGACTCGT OSGACTCTA5 ACTCCTGTGC TísACACGCAT GATGCÉSMtQS* TCGAGOÃAAC tTSZAGACCCC GGTTCCGTGG ACTCGAGTAT TCCTÁGG (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 26:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 106 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26: £0 106 ccAmmcÁt oasgotcccc ectCAscrcc wssiwcér ctoc^síits cchAATGrm mTCCzmm mm&metc citccaccct gtctsc (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 27:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 107 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27: 107

GTCAOAGGÁA AOST&GACÃT CrFCTSTCrC ASTOGmOTO AAC6TTCCGC

TCAGTCCTGT AATFATCCAT AÍ^TTTGACC ATGCTCGTCT TTGGGCC 2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 28:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 107 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 28: 54 ΡΕ0783525 tSAAAGCCCCT ÃftSCrCCTSÃ TCTATCGTGC AAACASATTO OTAGATQGGCJ TCCCATCAftG 6¾ GTXCftílOGGC AGTGGATCTG íSSACAJSÃATT CACTCXCRCC ATCftGCA 107 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 29:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 116 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 29: GTCTTAW3TG AÇAGTGST&G TCSTtXSGACG TOGGACTACT AAAAÇGTTUtÃ ATAATQACÇG €0 ATGTCAAAGT ACTCAAAGGC ATGTGCMGC CTCCCCCCTG GTTCGAACTP TATTTT XI6 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 30:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 123 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 30:

Gin Vai Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Vai Ly& Pro Ser s 10 15

Gin Thr Leu Thr Leu Thr cye Ser Phô Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30

Ser Ser Gly Met Cys Vai Gly Trp Ile Arg Gin Pro Pro Gly Lys 35 40 45

Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Glu Trp Asp Asp Asp Lys Asp 50 55 60

Tyr Asn Thr Ser Leu Asp Thr Arg Leu Thr lie Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Lys Asn Gin Vai Vai Leu Thr Vai Thr Asn Vai Asp Pro Ala BO 85 90

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Thr Vai Ile Pro Ala 95 100 105

Pro Ala Gly Tyr Met Asp Vai Trp Gly Arg Gly Thr Pro Vai Thr 110 115 120

Vai Ser Ser 55 ΡΕ0783525 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 31:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 120 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31:

Gin Vai Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pró Ala Leu Vai Lys Pro Ser 5 10 15

Gin Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Mefc Ser Vai Gly Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly Lys 35 40 45

Ala Leu Glu Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp 50 5$ sa

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 65 ?0 75

Ser Lys Asn Glu Vai Vai Leu Lys vai Thr Asn vai Asp Pro Ala 80 85 m

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Mefc ile Thr Asn Trp

»5 100 LOS

Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Ala Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 110 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 32:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 120 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32: 56 ΡΕ0783525

Gin Thr Leu Ser Leu, Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser 20 25 30

Thr Ser Gly Met Ser Vai Gly Trp lie Arg Gin Pro Ser Gly Glu 35 40 45

Gly Leu Glu Trp Leu ala Asp II e Trp Ttp Asp Asp Lys Lys Asp 50 55 €0

Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr 65 70 75

Ser Ser Asn Gin Vai Phe Leu Lys Ile Thr Gly Vai Asp Thr Ala 80 85 90

Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Met Ile Thr Asn Trp 95 100 105

Tyr Phe Asp Vai Trp Gly Ala Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 110 115 120 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 33:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 95 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33:

Asp ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Vai S 10 15

Gly Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser 20 25 30

Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 35 40 45

Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Giy Vai Pro ser 50 55 50

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Ser Ser Leu Gin Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin 80 85 50

Tyr Asn Ser Tyr Ser 95 57 ΡΕ0783525 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 34:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 106 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 34:

Asp 11.6 Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu ser Ala Ser Vai s 10 15

Gly Asp Arg Vai Thr Ile Thr cys Lye Cys Gin Leu Ser Vai Gly 20 25 30

Tyr met His Ttp Tyr gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45

Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Vai Pro Ser Arg 50 55 * 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr GXu Phe Thr Lm Thr Ile Ser 65 70 75

Ser Leu Gin Pro Aãp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 80 85 90

Ser Gly Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 95 100 105

Lys (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 35:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 106 AMINOÁCIDOS

(B) TIPO: AMINOÁCIDO (C) TIPO DE CADEIA:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 35: 58 ΡΕ0783525

Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro 5 10 15

Gly Glu Lys Vai Thr Mefc Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Vai Gly 20 25 30

Tyr Met His Trp Tyr Glu Gin Lys Ser Ser Thr Ser Pro Lys Leu 35 40 45

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser €5 70 75

Ser Ile Gin Ala Glu Asp Vai Ma Thr Tyr Tyr Cys Phê Gin Gly 80 85 m

Lys (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 36:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 63 NUCLEOTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 36: GCcmÁfícit: AoaTimccG tGGTceeoee etxcoumcÃ tcsmgtmc se

CfiT gj (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 37:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 79 NUCLEOTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 37: GTT©7mACT TTM8GÃCCA CCTGGTnTT GGUtôGTATCC TíKKíAGMTS TQASCCSKjCT «0 mmmxm τκαα n 59 ΡΕ0783525 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 38:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 89 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 38: ocsccrrccc mmezmh coumx&sc omcftercKf accagmgto es ACCCfiSASAA SGTPS&SeTC Ã0PSTO3U3Q $9 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 39:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 70 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 39: coseerCACc ιτΑΑββαΜΟτ awec GONSsmAAA raymeMm ccom»er m mmmoMX: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 40:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 78 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 40: CA0CCCCCA.G (maSGCCOT «OASTCGCTT GmOSG&TGA CAMíyySOAC eo (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 41:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 64 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR 60 ΡΕ0783525 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 41: oewmm mmecmc ww mcmw s-mcrosími TATtí (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 42:

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA

(A) COMPRIMENTO: 72 NUCLEÓTIDOS

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CADEIA: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 42:

GGOGTOSACT CACCATGGAt TGGftCCT£3A GGGTCTtCTe OTGCTÔSCÍ Gt*0CÁCCAÍJ CTGCCt^CTÇ çc

Lisboa, 22 de Dezembro de 2006

Claims

ΡΕ0783525 1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humanizado que neutraliza RS :v que possui p 810 menos uma CDR de cadeia pesav cla não humana e pelo menos u. Tilei CDR de ca.; de ia li eve não huma na . das CDRs de ca. de i a pes a d a. d .e MEDI-493 da Ei gura 7 e as CDRs de ca.d.eia. leve de ME DI-49 3 d.a Fiqur, a 8, ei n que a estri J.t' ura de cadeia leve do í 3 n t i c c rrpo human izado compreende a estrutura e C8 dei 8 -i-.ev· e de J MEDI-493 dr í Fiqur a 8 e a estar u.t u r a d e c a de .r a p Θ S cl d cl. cl o a.n t i( sorpo huma; oi zado compreende a. estrutura, de cadeia pesada de MEDI-493 da Figura 7.
2. Anticorpo humanizado da reivindicação 1, em que a cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende o polipéptido de MEDI-493 da Figura 7.
3. Anticorpo humana.zado da reivindicação 1, em que a cadeia leve do anticorpo humanizado compreende o polipéptido de MEDI-493 da. Figura 8.
4. Anticorpo humana.zado da reivindicação I, em que a cade: do anticorpo humanizado comp. γ-ps ,μι jo p ps r·', polipéptido de MEDI- -4 93 da Figura 7 e a cadeia leve do anticorpo h .uman izado compreende o polipéptido de MEDI-493 da Fiaura 8.
5 . Composição farmacêutica compreendendo: (a) o anticorpo humanizado da reivindicação 1 (b) um. veiculo farmaceuticame nte aceitável. 2 ΡΕ0783525
6. Composição farmacêutica da reivindicação 5, em que a cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende < polipéptido de MEDI-433 da Figura 7. reivindicação Composição íarmaceuLica em σ < cadeia do anticorpo humanizado compreende polipéptido de MEDI-493 da Figura Utr 1 izacãc 0.0 :orp( humanizado d. a J. Ç ã O p cl. T. ci o nuin ser reivindicação J. para a í prevenir rnfecção com o v humano. oeparaçao oe uma compo: rus sincicio respiratór Q O o Composr ção farmac reivindicação 5, em que a ca de .1 a pesada do antxco: roo humaniz :ado compreende o polipépti do de cade i a pesa.d.a de M.EDI-493 Gd .D iqura ‘ e a C 3 G 0 Ϊ 3 leve do ar rt i corpo humanizado compreende o polipépti r* r-‘ ά r·' adeia. I eve de MED: 1-493 da Fi .gura 8.
10. Ur ilizaçSo da reivindicação 9, em que a c a ο Θ ί a pesada do anticorpo humanizado compreenoe r'', :>o 1: séotic de MEDI - da Figura
11. Util c cl oe .1 cl igvu d o polipéptido de MEDI Z 3- p ci C j O- ci rei v l e iX j_ G õ. C ci C j anticorpo humanizado 493 da Figura 8. 9, em que oompreende a
12. Ui a ç a eivir :m que a 3 ΡΕ0783525 cadeia pesada do anticorpo humanizadc ; compreende polipéptido de caaeia pesadia de MEDI-493 da Figurei 7 cadeia leve do anticorpo humanizado c o mp r e e n d e polipéptido da :n 1 ,-4 '6,417' h * m-m-m 1. Λ rlw ‘..T \ Ç / -w A-nJ - Dr-493 aa r Igura 8.
13 . Utrlizaç ão do anticorpo ha manizado da reivindicação 1, para a preparação de uma comp< osiçâo para o tratamento de infecção com o virus sincicio respiratório num ser humane.
14. Utilização da reivrndicaça.o 13, em que a cadeia pesa.d.a do anticorpo humanizado compreende o polipéptido de MEDI-493 da Figura 7.
15. Utilização da reivrndicaça.o 13, em que a cadeia leve do anticorpo humanizado compreende o polipéptido de ΜΕΌΪ-433 da Figura 8.
16. Utilização da reivindicação 13, em que a cadeia pesada do anticorpo humanizado compreende o polipéptido da cadeia pesada de MEDI-493 da Figura 7 e a cadeia leve do anticorpo humanizado compreende o .qura o . )olipéotido da cadeia leve de MEDI Lisboa, 22 de Dezembro de 2006