JP2006265263A - ヒト−マウスキメラ抗呼吸シンシチアルウイルス抗体 - Google Patents

Abstract

【課題】少なくとも１つのモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち、少なくとも１個のＣＤＲを含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植ヒト抗ＲＳＶ抗原抗体を提供することである。モノクローナル抗体はいずれの非ヒト動物から誘導されてもよいが、望ましくは、げっ歯類、またもっとも望ましくはマウスの、モノクローナル抗体である。望ましくは、そのマウスモノクローナル抗体は中和抗体である。また、望ましくはマウス抗体は抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体である。
【解決手段】この発明は、少なくとも一つのマウスモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれに由来する一つのＣＤＲを含む、ＭＡｂ１１２９であるヒト抗呼吸シンシチアルウィルス抗体に関し、および、ＲＳＶ感染の予防および／または治療のためのヒト抗呼吸シンシチアルウィルス抗体の使用に関する。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ヒト−マウスキメラ抗呼吸シンシチアルウイルス抗体に関するものである。

この出願は１９９１年１２月２３日受理された米国出願番号０７／８１３，３７２号の一部継続出願である。

呼吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）は、入院幼児の急性呼吸器系疾患の主要な原因であり、地域診療では、入院児童のおよそ５倍の児童を治療するであろう。従ってこれは小児下気道感染のもっとも一般的な原因である。市中獲得型ＲＳＶ感染の大部分は１週間乃至１０日で自然治癒するが、多くの入院児童、とりわけ生後６ヶ月以内の幼児は補助換気を必要とする。

これまで効果的なワクチンを製造しようとする試みは不成功であった（非特許文献８）。ワクチン開発の上で、主要な障害は安全性である。すなわち、当初のホルマリン不活性化ＲＳＶワクチンは、予防接種を受けた児童において、ウイルス暴露によるＲＳＶ下気道疾病の発症率と死亡率を増加させた（非特許文献５）。

最近薬品リバビリンがＲＳＶ肺炎および細気管支炎の治療用として許可された（非特許文献２，３）が、その価値は議論の的となっている（非特許文献４）。リバビリンは効能を示したが、この薬品は１８時間にわたりエアロゾル吸入で投与されねばならない。加えて治療を中止した後二次感染の水準は未治療の患者よりも著しく高い。

高力価のＲＳＶ免疫グロブリンが動物モデルのＲＳＶ感染の予防と治療双方に有効であることを研究が示した（非特許文献６，７）。ＲＳＶ免疫グロブリンで治療された感染動物は肺免疫複合体疾患の徴候を示さなかった。

たとえＲＳＶ高度免疫グロブリンが高リスク児童のＲＳＶ下気道感染の発症率および重症度の減少を示したにせよ、いくつかの欠点がその使用を制限する。第１の欠点は事前集中治療のため静脈アクセスを制限されるこれら児童への静脈内注入の必要性があることである。第２の欠点は、とりわけこれらの児童は免疫反応が十分に発揮し得ない心肺機能を持つため大量のＲＳＶＩＧが保護のために必要とされることである。第３の欠点は、静脈内注入はＲＳＶシーズン中は毎月通院を必要とし、それがこれら児童を院内感染の危険にさらすということである（非特許文献１）。最後の問題はこの製品の要求に合致するＲＳＶ高免疫グロブリンを生産する十分な供与体を選択するということが非常に困難であることがわかっていることである。現在の所僅かに約８％の供与体が高度免疫グロブリンの生産に適格な十分に高いＲＳＶ中和抗体力価を持つに過ぎない。

もう一つのアプローチは、高免疫グロブリンに代替するものとして高い特異的中和活性を持つモノクローナル抗体の開発である。その抗体の治療効能を相殺し又は免疫複合体病理を誘発するようなヒト抗げっ歯類抗体反応の発生を最小にするために、マウスやラット抗体よりもヒトモノクローナル抗体を使用することが、必須ではないとしても、望ましい。しかし所望の特異性を持つヒトモノクローナル抗体の生成は難しく、ヒト細胞系からの生産水準はしばしば低く、それがこの開発の妨げとなっている。

代替的なアプローチの一つは、マウスの重鎖・軽鎖可変領域をコードする遺伝情報をヒトの重鎖・軽鎖定常領域をコードする遺伝子に固定したヒト−マウスキメラ抗体の生産である。生成するマウス−ヒトハイブリッド抗体は、マウス配列由来の完全免疫グロブリンの約３０％を有している。従って、数多くの研究所がマウス可変領域とヒト定常領域でキメラ抗体を構築してきた（非特許文献１０−１８）が、マウス可変領域は未だ体内で異物と認識されている（非特許文献１９）。

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従ってこの発明の目的は、少なくとも１つのモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち、少なくとも１個のＣＤＲを含む、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植ヒト抗ＲＳＶ抗原抗体を提供することである。モノクローナル抗体はいずれの非ヒト動物から誘導されてもよいが、望ましくは、げっ歯類、またもっとも望ましくはマウスの、モノクローナル抗体である。望ましくは、そのマウスモノクローナル抗体は中和抗体である。また、望ましくはマウス抗体は抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体である。

ここで使用される「動物」という用語はもっとも広い意味で用いられ、ヒトを含む哺乳類を含む。

マウスモノクローナル抗ＲＳＶ抗原抗体から誘導される可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれうち少なくとも１つのＣＤＲの遺伝情報のみのヒト抗体への移植が、動物中のＲＳＶの予防および治療に有効であることを出願人である発明者は発見した。望ましくはマウス抗体は抗ＲＳＶ中和抗体である。また本発明によれば、上記マウス抗体は抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体を用いることができる。望ましくはマウス抗体は抗ＲＳＶ Ｆ抗原中和抗体である。ヒト可変フレームワーク・セグメントをマウスＣＤＲと置換することにより、抗原であるＲＳＶ Ｆタンパク質への結合親和力と特異性を保持したまま、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答の可能性を最小限にする。ＣＤＲ配列はヒトまたはマウスに特徴的なモチーフを含まないので、マウス抗体のＣＤＲを含むヒト抗体は、完全なヒト抗体から本質的に区別できない。その結果、ＲＳＶ Ｆ抗原に対する結合親和力と特異性を保持したまま、ヒト抗体応答を最小限にする。

ヒト化抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体の開発は、マウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体から開始された。このタイプのマウス抗体の例は以下の通りである。ＭＡｂ １４３６Ｃ，ＭＡｂ１１３，ＭＡｂ１１２，ＭＡｂ１５１，ＭＡｂ１２００，ＭＡｂ１２１４，ＭＡｂ１２３７，ＭＡｂ１１２９，ＭＡｂ１１２１，ＭＡｂ１１０７，ＭＡｂ１３１−１，ＭＡｂ４３−１，ＭＡｂ１１１２，ＭＡｂ１２６９，ＭＡｂ１２４３，ＭＡｂ１３３１Ｈ，ＭＡｂ１３０８Ｆ、およびＭＡｂ１３０２Ａ（非特許文献２１参照）。

この発明の一つの側面は、上記ヒト抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、マウス抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち３つのＣＤＲから構成されることを提供する。

上記複数のマウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体は、競合結合アッセイおよびウイルス逃避変異体に対する反応性プロフィルにより、１６個の異なったエピトープを含む３つのブロード抗原部位（Ａ，Ｂ，Ｃ）にマッピングされた（２０）。抗原部位ＡおよびＣにあるエピトープは、天然に単離したもののうち最も種類が少なかった。

従ってこの発明のもう一側面は、ＡまたはＣの抗原部位に特異的な、少なくとも一つのマウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち、少なくとも１つのＣＤＲを含むヒト抗体を提供する。一つの側面において、この発明は、上記マウス抗体は、マウス抗体ＭＡｂ１３０８Ｆの抗原部位でもある抗原部位Ｃに特異的な、マウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体であること、を提供する。

この発明のこのような一つの実施例において、ヒト抗体は、マウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体ＭＡｂ１３０８Ｆの可変重鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１３０８Ｆの可変重鎖のＣＤＲは、３つのＣＤＲから構成され、以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、Ｎｏ．３１から３５、Ｎｏ．４７から６０およびＮｏ．９９から１０６である。加えてこの実施例は、マウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体ＭＡｂ１３０８の可変軽鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１３０８の可変軽鎖のＣＤＲは、３つのＣＤＲから構成され、以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、Ｎｏ．２４から３４、Ｎｏ．５０から５６およびＮｏ．８９から９７である。

この発明のもう一側面は、抗原部位Ｃに特異的である、少なくとも１つのマウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体の可変重鎖および可変軽鎖のそれぞれのうち少なくとも１つのＣＤＲを含むヒト抗体を提供する。望ましくは、この発明は、マウス抗体ＭＡｂ１１２９の抗原部位でもある抗原部位Ｃに特異的なマウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体を提供する。

この発明の実施例において、ヒト抗体は、マウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体ＭＡｂ１１２９の可変重鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１１２９の可変重鎖のＣＤＲは、３つのＣＤＲから構成され、以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、アミノ酸番号３１から３６、アミノ酸番号５２から６７およびアミノ酸番号１００から１０９である。加えてこの実施例は、マウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体ＭＡｂ１３０８の可変軽鎖のＣＤＲを含む。ＭＡｂ１３０８の可変軽鎖のＣＤＲは、３つのＣＤＲから構成され、以下のアミノ酸配列を有する。すなわち、アミノ酸番号２４から３３、アミノ酸番号４９から５５およびアミノ酸番号８８から９６である。

加えて、出願人の発明の側面は、ＲＳＶ感染を予防し治療する一つの方法であり、この方法は、少なくとも１つのマウス抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体の可変重鎖および可変軽鎖のうち少なくとも１つのＣＤＲを含むヒト抗体の有効量を、動物に投与することによりなる。

また出願人の発明のもう一側面は、許容される薬理的担体と配合した上述したヒト抗体の有効投与量から構成される組成物である。許容される薬理的担体は、限定されないが、無毒緩衝液、充填剤、等張液などを含む。

出願人の発明による組成物は、局所的にあるいは全身に投与されてもよい。局所投与は、例えばヒト抗体組成物を含むエアロゾルの鼻腔内投与および吸入である。全身投与は、ヒト抗体組成物を静脈内あるいは筋肉内注射することにより達成されてもよい。

出願人の発明の好ましい一側面は、ヒト抗体として、多数のヒト抗ＲＳＶ Ｆ抗原抗体のうち一部が、投与されるということである。これらの抗体は、ＲＳＶ Ｆ抗原の同一もしくは異なるエピトープを標的するものでもよい。

加えて、この発明のヒト抗体は、患者にある呼吸シンシチアルウイルスを臨床的に診断するために使用してもよい。ＲＳＶ Ｆ抗原に対して親和性があるので、これらのヒト抗体は、サンプル例えば体液にあるＲＳＶ Ｆ抗原の存在および濃度を検出する既知の診断検定方法に利用することができる。この発明のヒト抗体は例えばラテックスビーズ、カラムなどのような固形支持物に付着あるいは結合してもよく、それは次いでＲＳＶ Ｆ抗原を含むものと考えられるサンプルと接触されて用いられる。

出願人のＲＳＶを予防するヒト抗体の開発は、in vitroでＲＳＶを中和し、ＲＳＶによる下気道感染からコットンラットを保護することが示されたマウスモノクローナル抗体を生産するマウスハイブリドーマ（融合雑種腫瘍細胞）細胞から始まった。

抗原部位Ｃに特異的である一つの抗体がマウス−ヒトキメラ抗体を生産するために選択された。この抗体は次の基準に基づいて選択された。すなわち、（ｉ）テストされた多数の菌株と反応したこと（単離された１４個のうち少なくとも１３個）、（ｉｉ）他の抗Ｆ抗体で選択されたウイルス逃避突然変異体に対し中和活性を保持したこと、（ｉｉｉ）鼻腔内ルートによりコットンラットに低い用量で投与したときに、ウイルス攻撃に対しＲＳＶ増複を遮断したこと、である。選択された抗体はそれぞれの領域において抗体の間の肺疾患ウイルスを著しく減少させた。ＲＳＶ Ｆタンパク質のＣ領域に特異的なマウス抗体１３０８Ｆがヒト化の最初の対象として選択された。

要約すると、ヒト抗体は下記の通り構築された。すなわち、ＲＮＡがマウス抗体生産細胞系から抽出され、抗体をＲＳＶに結合させる原因のマウス可変領域が複製ならびに配列決定され、その結果、マウス抗体ＣＤＲ配列を同定した。次いで、マウス抗体の可変重鎖および軽鎖配列と最高の相同性を持つヒト可変重鎖および軽鎖フレームワーク配列が選択された。前記のようなヒトフレームワーク配列はマウス誘導ＣＤＲと最良に適合する可能性のあるものである。

マウス１３０８Ｆの可変重鎖は各種のヒト生殖系列遺伝子と比較され、ヒト生殖系列遺伝子ＨＶ３と最高の相同性を示した。それら２つの配列は、全体で６２％相同であり、フレームワーク領域では６５％相同であった。重要なことに、ＦＲ２の５′末端を除き、ＣＤＲセグメントとフレームワークとの結合部で良好な相同性がある。つぎに、マウス誘導可変重鎖ＣＤＲは可変重鎖ヒト生殖系列遺伝子ＨＶ３中に置換された。マウス配列とヒトの配列は、この２個の潜在的ＣＤＲ移植組合体の配列とともに、図１で示される。

Ｖ_L領域に関する同様の分析がなされ、ヒト生殖系列Ｖ−Ｋａｐｐａ遺伝子Ｋ１０２との高い相同性を示すことを明らかにした。これらの配列のアラインメントは図２で示される。この場合、相同性は全体で６２％であり、フレームワーク領域では７３％であった。次いで、マウス由来の可変軽鎖ＣＤＲは、ヒト生殖系列遺伝子Ｋ１０２のヒト可変軽鎖中に置換された。それぞれの場合においてマウス配列と同一であるヒトＪ領域を選択してもよい。

もう一つの実施例において、マウス１１２９可変重鎖が各種のヒト可変領域アミノ酸配列と比較され、最高の相同性はヒト再配列ＣＯＲ配列と比較したものであった。２個のアミノ酸配列は全体で７５％相同であり、フレームワーク領域では８０％であった。重要なことに、ＣＤＲ分節およびフレームワークの結合部で良好な相同性が存在する。マウス誘導可変重鎖ＣＤＲは次いで可変重鎖ヒトＣＯＲ Ｖ_H配列中に置換された。マウスおよびヒト配列ならびにこの２個の潜在的ＣＤＲ移植組合体が図１で示される。

Ｖ_L領域に関する同様の分析がなされ、ヒト生殖系列Ｋ１０２に対する高い相同性を示すことが明らかになった。これらの配列のアラインメントが図８で示される。この場合、相同性は全体で７３％であり、フレームワーク領域では８２％であった。マウス誘導可変軽鎖ＣＤＲは次いでヒト生殖系列Ｋ１０２のヒト可変軽鎖中に置換された。この場合マウス配列と類似するヒトＪ領域、ヒトＪＫ４が選択された。

その結果、ヒト抗体が発現され、遺伝子操作が抗体の結合特性を大幅に改変しなかったことを確認するために、元となったマウス抗体と比較して特性を調べる。

出願人はここで実施例を提示するが、それは請求されるべきこの発明を詳細に説明するためのものであり、この発明を限定するものではない。

［実施例１］ 抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体１３０８ＦのｃＤＮＡクローニングおよび配列決定
対象となった抗体のＶ_HおよびＶ_LのｃＤＮＡコピーは下記の通り生成された。第１鎖ｃＤＮＡ反応は、ＡＭＶ逆転写酵素と、特定の重鎖あるいは軽鎖アイソタイプの定常領域をコードするｍＲＮＡのセグメントに相補的なリン酸化オリゴヌクレオチドプライマーと、を用いて行われた。１３０８Ｆにとっては、アイソタイプはｇａｍｍａｌ、Ｋａｐｐａであり、特異的オリゴヌクレオチドはマウスｇａｍｍａｌ遺伝子のＣＨ１領域のコドン１２９−１３７に相補的である5'AGCGGATCCAGGGGCCAGTGGATAGACであり、またマウスＣ−Ｋａｐｐａ遺伝子のコドン１１６−１２２に相補的である5'TGGATGGTGGGAAGATGを用いた。このプライマーは可変領域に隣接するｍＲＮＡのセグメントにアニール化する。第２鎖ｃＤＮＡ合成はガブラーおよびホフマンにより記述されたように（遺伝子、２５巻、２６３ページ、１９８３年）、リボヌクレアーゼＨおよび大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩを用いて行われ、次いで平滑末端が生産されることを確かにするためにＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより行われた。

シグナル Ｖ Ｊ Ｃ ｍＲＮＡ
第１ 鎖 ｃＤＮＡ
第２ 鎖 ｃＤＮＡ

ｄｓ−ｃＤＮＡはｐＵＣ１８に連結され、後者は制限エンドヌクレアーゼで消化されアルカリ性ホスファターゼで処理された。大腸菌ＤＨ５ａをハナハンの方法により形質転換するためにライゲーションが使用された（分子生物学ジャーナル、１６６巻、５５７ページ、１９８３年）。第１鎖ｃＤＮＡプライマーおよびＶ領域の間に位置するＣ領域配列に対応するオリゴヌクレオチドプローブが、所望のｃＤＮＡセグメントを運ぶ形質転換細胞を同定するためコロニーハイブリッド形成で使用された。特異的プローブ配列はそれぞれマウスＣＨ１領域のコドン１２１−１２５に相補的であるGGCCAGTGGATAGACおよびＣ−Ｋａｐｐａのコドン１１０−１１５に相補的であるTACAGTTGGTGCAGCAであった。ハイブリッド形成で陽性を示したコロニーから単離された候補プラスミドは、ｃＤＮＡ挿入断片を放出させるために制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを用いた断片化により分析された。４００−５００塩基対の挿入断片をもつものが次のＤＮＡ配列決定に供された。

ｃＤＮＡ挿入断片は、二本鎖両方についてＤＮＡ配列を決定するために、Ｍ１３ ｍｐ１８とｍｐ１９に挿入された。生成された組換えバクテリオファージ由来の一本鎖ＤＮＡは単離され、ジデオキシ鎖終結法により配列化された（全米科学アカデミー紀要、７４巻、５４６３ページ、１９７７年）。

１３０８Ｆハイブリドーマから分離された、転位され体細胞変異されたＶ遺伝子ｃＤＮＡの対が１３０８Ｆ抗体中の遺伝子と同じ機能を果たすかを確認するため、一本鎖Ｆｖ遺伝子が生成され、哺乳類細胞で発現・分泌され、次いでＲＳウイルスへの結合を検定された。次いで競合結合実験が結合部位の確認を示すために用いられた。

［実施例 ２］ ヒト１３０８Ｆ Ｖ_HおよびＶ_Lのデザインおよびアセンブリ
Ｖ_HおよびＶ_LのＣＤＲ領域は、カバット（３８）に記述された通りアミノ酸配列を既知の配列と比較することで確認された。抗原結合部位の構造を保持するコンフォメーションで、マウス由来ＣＤＲ配列を最良に受け入れるヒトフレームワーク配列を選択するために、下記の戦略が採用された。まず、配列操作プログラムのウイスコンシンパッケージ中のワードサーチプログラムを用いてジェンバンクおよびＮＢＲＦタンパク質データバンク双方からの既知のヒト配列と、マウスＶ_HおよびＶ_L領域が、比較される（核酸研究、１２巻、３８７ページ）。次いで、さらに、フレームワーク領域の類似性、とりわけフレームワークとＣＤＲ領域との連結点での類似性に基づいて、いくつかの最良のヒトＶ領域が分析された（図１および２参照）。

それぞれヒトＶ領域のリーダー配列を含むＣＤＲ移植Ｖ_H領域が、長さ１００−１３７ヌクレオチドにわたる、４個のオーバーラップするオリゴヌクレオチドを用いて新規に合成された（図３参照）。オリゴヌクレオチドはまず対に組合せとなるようアニール化を許され、オーバーラッピング領域を含む約２００塩基対の二本鎖ＤＮＡ断片を生成するようＤＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ伸張された。断片は次いで混合され、一つの断片の３′末端および他の断片の５′末端でプライマーを使用するＰＣＲを受けた。これらの条件下で形成され得る唯一の生成物は全長Ｖ_Hセグメントである。特異的プライマー配列を図３で下線を付して示す。エンドヌクレアーゼＳａｃＩ部位は、それをヒト定常領域遺伝子セグメントに結合させるために、Ｖ_H配列の３′末端に含まれていた。

ＣＤＲ移植Ｖ_L領域は同様の方法で合成された（図４参照）。この実施例では、もとの２００塩基対断片は別個に増幅され別個のプラスミドに挿入された。アミノ末端をコードする断片はＮｃｏＩ−ＳｍａＩ断片としてｐＵＣ１８誘導体にクローニングされ、一方、カルボキシル末端をコード化する断片はＳｍａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片としてクローンされた。両断片は次いで接合部のＳｍａＩ部位を介して結合された。用いたオリゴヌクレオチドを図４で示す。ＨｉｎｄＩＩＩ部位は、それをヒトＣ−Ｋａｐｐａ遺伝子と連結させるために遺伝子分節の３′末端近くに含まれた。

［実施例 ３］ １３０８Ｆ発現のためのベクター構築
ヒト化Ｖ_Hを表すＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片がヒトｃ−Ｇａｍｍａｌ ｃＤＮＡを表すＳａｃＩ−ＮｏｔＩ断片と結合され、ｐＳ１８に挿入された（ｐＳ１８はｐＵＣ１８に、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩ制限部位を、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩ部位の間のポリリンカー領域に組み込んだものである）。ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ断片上のヒト化１３０８Ｆ−ｇａｍｍａｌ遺伝子は、次いで、ポリＡ追加部位を保有するｐＳＪ３７由来のＰｖｕＩ−ＮｏｔＩ断片、および、ＳＶ４０複製起点とｄｈｆｒ遺伝子とＣＭＶ即時型初期プロモーターとを保有するｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ｐＣＭＶ由来のＰｖｕＩ−ＳａｃＩ断片、と組合される。生成するプラスミドはｐＳＪ６０と名付けられた。

ヒト化Ｖ_Lを表すＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ｐＳ１８のヒト化ｃ−Ｋａｐｐａ ｃＤＮＡを表すＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片と結合された。Ｓａ１Ｉ−ＮｏｔＩ断片のヒト化１３０８Ｆ−Ｋａｐｐａ遺伝子は、次いで、ポリＡ追加部位を保有するｐＳＪ３７由来のＰｖｕＩ−ＮｏｔＩ断片、および、ＳＶ４０複製起点とｄｈｆｒ遺伝子とＣＭＶ即時型初期プロモーターとを含むｐＳＶ２−ｄｈｆｒ−ｐＣＭＶから得たＰｖｕＩ−ＳａｌＩ断片と結合された。生成するプラスミドはｐＳＪ６１と名付けられた。

最後にｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１は軽鎖および重鎖ならびに発現シグナルを含む単一プラスミドに組合された。これは軽鎖を保有するｐＳＪ６１由来のＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩ断片と、長鎖を保有するｐＳＪ６０由来のＰｖｕＩ−ＢｇｌＩＩ断片とを、結合させ単離することによって、ｐＳＪ６６を生成して達成された（図５参照）。

［実施例 ４］ ｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１を用いたＣＯＳ ｌ細胞の形質移入
形質移入は下記の調製を伴うマッカッチャンおよびパガーノの方法に従って行われた（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．、４１巻：３５１−３５６ページ、１９６８年）。ＣＯＳ １細胞（ＡＴＣＣ．ＣＲＬ１６５０）は胎仔ウシ血清（ＦＢＳ、ジブコ＃２００−６１４０）およびＬ−グルタミン２ｍＭ（ＢＲＬ＃３２０−５０３０）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ジブコ＃３２０−１９６５）内で組織培養フラスコ７５ｃｍ²のＣＯ₂、５％加湿培養器で維持され、細胞が密に達した時の１：２０の分割比で継代させられた。形質移入の４８時間前に、５個の１００ｍｍ組織培養皿がＤＭＥＭ１２ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン−ストレプトマイシン１％（Ｐ−Ｓ、ジブコ＃６００−５０７０）内で皿当り１．５×１０⁶細胞で接種された。形質導入当日、プラスミドｐＳＪ６０およびｐＳＪ６１各１２０ｕｇが組合され、エタノール沈殿され、トリス緩衝食塩水２．５ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは、混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７−０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＬＥＭ、１０ｍｌに、滴状で加えられた。培地は１００ｍｍ皿のＣＯＳ １細胞から除去され、細胞は一度ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ジブコ＃３１０−４１９０）で洗浄され、ニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）で補充されたＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに加えられ、プレートはＤＮＡを混合するために渦動され、そして培養器に戻された。培養器で４時間後、上澄みが細胞から吸引され、細胞は１回Ｄ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。細胞は３分間１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５ｍｌを加えたＤ−ＰＢＳで室温でショックを与えられた。ＤＭＳＯが細胞から吸引され細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ／Ｌ−グルタミン２ｍＭ／Ｐ−Ｓ１％の１４ｍｌが各プレートに加えられた。プレートは培養器に戻された。

形質移入の３日後、培地はプレートから除去され、プールされ、−２０℃で貯蔵された。細胞は収穫され、プールされ、２個がＤＭＥＭ／ニューセラム１０％、４０ｍｌおよび２個がＤＭＥＭ／ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭ、４０ｍｌの４個の１５０ｃｍ²組織培養フラスコ内で接種された。培地は収集され、細胞が７、１０および１４日に再補給された。このようにして全体で１２５ｕｇのヒト化１３０８抗体がＦＢＳを補充した培地３１０ｍｌで蓄積されニューセラムで補充された培地２４０ｍｌで８５ｕｇが蓄積された。

［実施例 ５］ ｐＳＪ６６を用いるＣＯＳ １細胞の形質移入
形質移入４８時間前、５個の組織培養皿がＤＭＥＭ１２ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ペニシリン−ストレプトマイシン１％（Ｐ−Ｓ、ジブコ＃６００−５０７０）内で皿当り１．５×１０⁶細胞で接種された。形質導入当日、ｐＳＪ６６プラスミド１２５ｕｇでエタノール沈殿されトリス緩衝食塩水１．０ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７−０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＥＭ４．０ｍｌに滴状で加えられた。培地は１００ｍｍ皿のＣＯＳ １細胞から除去され、細胞はダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ）で１度洗浄され、ニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）を補充したＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに滴状に加えられ、プレートはＤＮＡを混合するため渦動され、それから培養器に戻された。培養器で４時間後、上澄みが細胞から吸引され、細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで１度洗浄された。細胞は３分間Ｄ−ＰＢＳにジメチルスルホキシド１０％（ＤＭＳＯ）を加え室温でショックを与えられた。ＤＭＳＯが細胞から吸引され、細胞はＤ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ／ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭ／Ｐ−Ｓ１％の１４ｍｌが各プレートに加えられプレートは培養器に戻された。

形質導入３日後培地はプレートから除去され、プールされ、−２０℃で貯蔵された。細胞が収穫され、プールされ、２個がＤＭＥＭ、ニューセラム１０％の４０ｍｌ、２個がＤＭＥＭ、ＦＢＳ１０％／Ｌ−グルタミン２ｍＭの４０ｍｌの４個の５０ｃｍ²織培養フラスコに接種された。培地は収集され、細胞が７、１０および１４日に再補給された。このようにして合体で１９０ｕｇのヒト化１３０８Ｆ抗体がＦＢＳで補充された培地３１０ｍｌで蓄積されまたニューセラムで補充されまた培地２４０ｍｌに１２０ｕｇが蓄積された。

ＣＯＳ １細胞から培地に分泌されたヒト化１３０８Ｆ抗体の濃度は捕捉エリザを用いて決定された。９６ウエルプレート上に被覆されたヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃがヒト化抗体を捕捉するために使用された。クロモーゲン基質で開発されたペルオキシダーゼ共役ヤギ抗ヒト全ＩｇＧが次いで結合抗体を検出するために使用された。精製ヒトＩｇＧ１／Ｋａｐｐａ調製物が検定を目盛り化するために使用された。

［実施例 ６］ ヒト化１３０８Ｆを用いるＲＳＶの中和
方法：
ＲＳＶは、ＣＯＳ細胞上澄みからのヒト化１３０８Ｆあるいは精製マウスモノクローナル抗体のいずれかで中和された。これは５０プラーク形成単位のＲＳＶを抗体の連続２倍希釈液で１時間３７℃で培養することにより行われた。２４ウエルパネルのＨｅｐ２細胞の密集単層が抗体処理ウイルス、未処理対照ウイルス、およびモック感染対照の１００μｌで感染された。１．５時間３７℃で加湿され、ＣＯ₂５％で培養され、またＥＭＥＭ１．５ｍｌ、ＦＢＳ１％、およびメチルセルロース１％で上塗りされた。細胞は固められ４日目にグルタルアルデヒドおよびクリスタルバイオレットで染色された。プラークは三重ウエルで計数され中和パーセントとしてプロットされた。図６で示されるこの結果はウエル当り５乃至１０ｎｇでの精製マウス１３０８Ｆモノクローナル抗体およびヒト化１３０８Ｆモノクローナル抗体のいずれもが、ＲＳＶプラークを同様に５０％減少させた結果を示している。

［実施例 ７］ＣＤＲ移植Ａ部位抗体１１２９の生成
ポリＡ＋ＲＮＡがオリゴ−ｄｔセルロースを用いて２×１０⁷マウス１１２９ハイブリドーマ細胞の溶解液から精製された。第１鎖ｃＤＮＡは、ｐＡ＋ＲＮＡ１ｕｇから、ランダムヘキサマープライマー、ＡＭＶ逆転写酵素、ｐＡ＋ＲＮＡ１ｕｇ、ｐＨ８．５のトリス塩酸５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂．８ｍＭ、ＫＣｌ、３０ｍＭ、ジチオスレイトール１ｍＭ、ｄＮＴＰ１ｍＭ、胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤２５単位、ランダムヘキサマー３３ｕＭおよびＡＭＶ逆転写酵素１０単位を用いて、１時間４２℃で合成された。１１２９ＶＬ領域からのｃＤＮＡはオリゴヌクレオチドＳＪ４１およびＳＳ１１を用いるＰＣＲで増幅された（表１を参照）。１１２９ＶＨ領域からのｃＤＮＡは同様にオリゴヌクレオチドＳＪ４２およびＳＪ１０を用いて増幅された（表１を参照）。

ＰＣＲ条件
第１鎖ｃＤＮＡ０．５ｕＬ、ｐＨ８．３トリス塩酸１０ｍＭ、ＫＣｌ、５０ｍＭ、ＭｇＣｌ₂、１．５ｍＭ、ｄＮＴＰ０．２ｍＭ、ゼラチン０．００１％、各プライマー１ｕＭ、ＤＮＡ鋳型１ｎｇおよびアンプリターク（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ２．５ｕ（パーキン・エルマー−シータス）。９４°１分、５５°２分、７２°２分パーキン・エルマー４８０サーモサイクラーで２５サイクル。生成するＤＮＡ断片は次いでフェノール／クロロホルム（１／１）で１回抽出され、エタノール２．５量で沈殿され、適切な制限エンドヌクレアーゼ緩衝液で再懸濁され、クローニングのための付着末端を生成させるために制限エンドヌクレアーゼで消化された。生成断片は次いでアガロースゲル１％の電気泳動で分離された。臭化エチジウムでゲルを染色した後、断片は除去されフェノールの存在下で凍結および抽出によりアガロースから精製された。

断片は次いで制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化され、プラスミドｐＵＣ１８にクローンされた。挿入断片は次いで修飾されたＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ、ユーエス・バイオケミカル）を用いるジデオキシヌクレオチド鎖末端法により配列決定された。

翻訳化された配列はヒト抗体タンパク質配列と比較された。ＶＬはＫ１０２軽鎖ともっとも相同性があり、またＶＨはＣｏｒ ＶＨ領域ともっとも相同性があることが分かった。１１２９Ｆｖ領域は、１１２９ＶＬとＶＨ配列の由来の残基を、ＭＣＰＣ６０３抗体の結晶構造での対応する残基座標へ置換することによりモデル化された。残基は視覚的なモデルの検査で折りたたみ構造あるいは溶媒接触に不可欠であるとして確認された。

不可欠な配列であり、なおかつ、マウスおよびヒト配列で異なるいくつかの残基は、Ｆｖの完全性を維持するため、すなわち結合部位を維持するために、マウス残基として残された。この残基はＶＨ領域では３１、８３、１１３および１１６であり、ＶＬ領域では４７であった。生成配列は図７および８で示される。

設計されたヒト１１２９ＶＨはＰＣＲを用いて結合された合成オリゴヌクレオチドＳＪ１４７−ＳＪ１５３（図９）を用いて構築された。このＰＣＲの生成物は次いでＮｃｏＩおよびＳａｃＩで消化され、プラスミドベクターｐＳＪ４０にクローニングされた。ここでｐＳＪ４０は、あるフレームがＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片として挿入される場合に、フレーム外のｌａｃＺ１セグメントが、フレーム内Ｖ領域セグメントに融合してフレーム内に保持されるｐＵＣ１８派生物である。５個の突然変異が単一５０塩基対領域に密集している挿入断片を含むプラスミドが、次いでＰＣＲおよびプライマーＳＪ１６８およびＳＪ１６９を用いて、これらの改変の修復を受けた。表１参照。

ＶＬはヒト１３０８Ｆ軽鎖遺伝子の部位指向突然変異誘発により生成された。オリゴヌクレオチド、表１参照（ＣＤＲ１）およびＳＪ１５７（ＣＤＲ３）はＨ１３０８Ｌ遺伝子を別個に突然変異を起こさせるために使用された。突然変異誘発は、大腸菌株ＢＷ３１３（ｄｕｔ−、ｕｎｇ−）によって生成され次いで大腸菌株ＤＨ５（ｄｕｔ＋、ｕｎｇ＋）に形質転換された、ウラシルを含む一本鎖ＤＮＡ鋳型とＴ７ＤＮＡポリメラーゼを用いて実行された。２個の突然変異体は結合され、ＣＤＲ２は、オリゴヌクレオチドＳＪ１７０、ＳＪ１５４、表１参照、（５′末端）およびＳＪ１７１、ＳＪ５３、表１参照、（３′末端）を用いる組換えＰＣＲにより導入された。ＣＤＲ移植ＶＨおよびＶＬは、プラスミドｐＳＪ８１およびｐＳＪ１０５となるＨ１３０８ＦＶ領域セグメントにとって代るＮｃｏＩ−ＳａｃＩ断片として、それぞれｐＳＪ６０（実施例３参照）およびｐＳＪ６１（実施例３参照）に挿入された。加えてマウスＶＨおよびＶＬ ｃＤＮＡ分節は、発現ベクターｐＳＪ７５およびｐＳＪ８４を生成するためにそれぞれ同様にヒトＣ−ＧａｍｍａｌおよびＣ−Ｋａｐｐａに接続された。

［実施例 ８］ ＨＵ１１２９一過性発現
ＣＯＳ １細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１６５０）は胎仔ウシ血清１０％（ＦＢＳ、ジブコ＃２００−６１４０）およびＬ−グルタミン２ｍＭ（ジブコ＃３２０−５０３０）を補充されたダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ、ジブコ＃３２０−１９６５）で７５ｃｍ²組織培養フラスコの加湿ＣＯ₂５％培養器で維持され、密集到達直前に１：２０の分割比で継代された。

形質移入は以下の修正を加えたマッカッチャンおよびパガーノの方法（Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎ．Ｉｎｓｔ．、４１巻：３５１−３５６ページ、１９６８年）に従って行われた。形質移入の２４時間前に、１００ｍｍ組織培養皿（コーニング＃２５０２０）はＤＭＥＭ１４ｍｌ、ＦＢＳ１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭで皿当り２×１０⁶ＣＯＳ １細胞で播種された。形質導入当日、実施例７からのＨｕ１１２９重鎖プラスミド（ｐＳＪ８１）１０ｕｇが実施例７からのＨｕ１１２９Ｋａｐｐａ軽鎖プラスミドｐＳＪ１０５の１０ｕｇと組合され、ＤＮＡはエタノール沈殿されトリス緩衝食塩水１．０ｍｌで無菌再懸濁された。再懸濁ＤＮＡは混合しながらＤＥＡＥデキストラン１ｍｇ／ｍｌ（ファルマチア＃１７０３５０−０１）およびクロロキン２５０ｕＭ（シグマ＃Ｃ６６２８）を含むＤＭＥＭ４．０ｍｌに滴状で加えられた。培地はＣＯＳ１細胞皿から除去され、細胞単層は１回ダルベッコリン酸緩衝食塩水（Ｄ−ＰＢＳ、ジブコ＃３１０−４１９０）１０ｍｌで洗浄され、またニューセラム１０％（コラボレイティブ・リサーチ＃５５０００）およびＬ−グルタミン２ｍＭを補充したＤＭＥＭ２．５ｍｌが各プレートに加えられた。ＤＮＡ／ＤＥＡＥデキストラン／クロロキン混合物２．５ｍｌが各プレートに滴状で加えられ、プレートはＤＮＡを混合するために渦動され、培養器に戻された。ＤＮＡ吸着期間８時間後にプレートが培養器から除去され、上澄みがプレートから吸引された。細胞はプレート当りＤ−ＰＢＳ内でＤＭＳＯ、１０％の５ｍｌの追加で３分室温でショックを与えられ、その後ＤＭＳＯが細胞から吸引され細胞は１度Ｄ−ＰＢＳ５ｍｌで洗浄された。ＤＭＥＭ１５ｍｌ、ニューセラム１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ（生産培地）が各プレートに加えられ、プレート培養器に戻された。

形質移入７２時間後、コンディション培地がプレートから回収され−２０℃で貯蔵され、生産培地１５ｍｌがプレートに加えられプレートは培養器に戻された。９６時間後配置がプレートから収集され−２０℃で貯蔵された。

［実施例 ９］ Ｈｕ１１２９の定量化
ＣＯＳ １細胞により培地に分泌されたＨｕ１１２９の定量化はサンドイッチ型ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を用いて行われた。要約すると、ナンク・マクシソープ・イムノプレート（ナンク＃４３９４５４）が室温で３時間ｐＨ９．６の重炭酸ナトリウム０．１Ｍ内でヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（カッペル＃５５０７１）０．５ｕｇ／ｍｌの５０ｕｌ／ウエルで被覆された。ウエルは３回ｐＨ７．４リン酸ナトリウム０．０１Ｍ、ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、トウィーン２０（ＰＢＳ−Ｔ）０．１％で洗浄された。プレートへの非特異的タンパク質結合は室温で３０分ＰＢＳ内の脱脂粉乳３％（Ｗ／Ｖ）の２００ｕｌ／ウエルの処理で遮断された。精製ヒトＩｇＧ１ Ｋａｐｐａ標準（シグマ＃１−３８８９）はＰＢＳ−Ｔ内１００ｎｇ／ｍｌで作られ１：２から１．５６ｎｇ／ｍｌまで連続的に希釈され、各５０ｕｌが検定プレートの二重ウエルに加えられた。ＣＯＳ １細胞上澄みはＰＢＳ−Ｔで希釈され、二重の５０ｕｌサンプルがプレートに加えられた。室温培養で１時間後、ウエルは空にされ３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄された。結合Ｈｕ１１２９抗体の存在を検出するために、ホースラディッシュ共役親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ（全分子、カッペル＃３６０１−００８１）がＰＢＳ−Ｔ内で１：１０００で希釈され、５０ｕｌがこの検定プレートの各ウエルに加えられ室温で１時間培養された。プレートは３回ＰＢＳ−Ｔで洗浄され、クロモーゲン基質ＴＭブルー（ＴＳＩ＃ＴＭ１０２）１００ｕｌが各ウエルに加えられた。プレートは室温で１０分暗条件で培養され、Ｈ₂ＳＯ₄、４．５Ｍのウエル当り５０ｕｌの追加で反応が停止された。プレートはモレキュラー・デバイシズ・ヴイマックス・マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍで読みとられ、データ分析はソフトマックス・ソフトウエア（モレキュラー・デバイス）を用いてＩＢＭ Ｐ／Ｓモデル８０コンピューターを実行させて、達成された。

生産の最初の７２時間の間に、ＣＯＳ １細胞はＨｕ１１２９、０．０６ｎｇ／ｍｌ、全体で０．９ｕｇを生産した。次の９６時間の生産でＣＯＳ １細胞はＨｕ１１２９、０．９９ｕｇ／ｍｌ、全体で１４．８５ｕｇを生産した。

［実施例 １０］ Ｈｕ１１２９結合検定
Ｈｕ１１２９の結合検定は、以下の変更を加えた、捕捉ＥＬＩＳＡで、基本的には定量化ＥＬＩＳＡにより、達成された。プレートは０．５ｕｇ／ウエルでＭｕ１３３１抗体を使って被覆され、ウエルはＰＢＳ−Ｔ内で脱脂乳３％でブロッキングされ、ＲＳＶ感染ＨＥＰ２細胞溶解液が各ウエルに加えられ室温で１時間培養された。検定の残りは、希釈サンプルをウエルに追加することで開始する定量化検定に関して行われた。結果は、ＯＤ、対、抗体濃度の二重の交互プロットを用いて、交互プロットからＭ１１２９ＨｕＧａｍｍａｌ、Ｋａｐｐａ抗体の１０ｎＭとの比較により０．７ｎＭのＨ１１２９分子に対する見かけのＫｄを決定することにより、分析された。

Ｈ１１２９およびｃｈ１１２９抗体についてのＲＳＶ中和検定が下記の手順に従って実施された：
１．覆いのある９６ウエル・コスター細胞培養プレートの包装を解く。
２．成長培地（ＧＭ）を３７℃に温める。
３．ＭＡ１０４細胞を３７℃で解凍する。ＧＭを用いて、〜１５０，０００細胞／ｍＬに希釈する。細胞を混合しウエル当り２００μｌに調合する。
４．細胞を３７℃、ＣＯ₂５％で培養し、感染前一晩加湿する。
５．ＲＳＶ株を維持液（ＭＭ）で１０，０００ｐｆｕ／ｍＬまで希釈する。
６．ＭＭで希釈した抗体の等量を希釈ＲＳＶの等量と混合する。３７℃、ＣＯ₂５％で培養し、感染前１時間加湿する。
７．ＭＡ１０４細胞のレプリケートウエルを抗体およびウイルス混合物２００μｌで感染させる。レプリケートウエルをウイルスおよびモック感染対照で感染させる。
８．プレートをセロハンで包み３７℃、湿度９５％、およびＣＯ₂、５％で５日培養する。
９．ＲＳＶのためのＥＬＩＳＡ：各ウエルを吸引し、アセトン／ＰＢＳ８０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）１００μｌを加え室温で３０分培養する。
１０．各ウエルを吸引し、薄流フードの鉄板上で３０分空気乾燥する。
１１．ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１２．各ウエルでＲＳＶ Ｆタンパク質にモノクローナル抗体１００μｌを加える。３７℃で１時間培養する。
１３．ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１４．ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ヤギ抗マウス抗体血清１００μｌを各ウエルに加える。３７℃で１時間培養する。
１５．ＢＰＳ、トウィーン２０、０．０５％を用いて４回洗浄する。
１６．新鮮に調製されたＡＢＴＳおよび過酸化物１：１混合物１００μｌを各ウエルに加える。ウイルス対照の不透明度（４０５ｎｍ）がモック感染対照のそれの５乃至１０倍になるまで室温で培養する。

付録：
成長培地（ＧＭ）：最小必須培地（イーグル）およびアールＢＳＳ、
グルタミン２ｍＭ
イーグル可欠アミノ酸、最終０．１ｍＭ、
胎仔ウシ血清１０％（ｖ／ｖ）、
ペニシリン５０単位／ｍｌ、
ストレプトマイシン５０ｍｃｇ／ｍｌ、
維持液（ＭＭ）：血清を１乃至２％に減少させた前記のもの。
ＭＡ１０４細胞株は成長培地を用いてＴ１５０フラスコ内で成長する。株はＤＭＳＯ、１０％および成長培地内で１．８ｍＬガラス瓶当り３×１０⁶細胞で凍結される。ＬＮ₂冷蔵庫で貯蔵される。
ＲＳＶ株：Ｔ１５０フラスコのＭＡ１０４（サル腎臓）あるいはＨｅｐ２細胞内で成長する。密集Ｔ１５０当り〜０．２ｍｌ（〜１００，０００ｐｆｕ）ウイルス株を加える。室温で１時間吸着。次いで胎仔ウシ血清１％を加えた維持液２０ｍＬを加える。３７℃で４−５日培養する。１００％ｃｐｅの直前にスクレーピングにより細胞を収集する。細胞を回転で落し、上澄み１０ｍＬを残して全て除去する。細胞ペレットを凍結（ドライアイス−エタノール浴）解凍し、ボルテックスさせ、再凍結しウイルス株をＬＮ₂冷蔵庫で貯蔵する。
ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液：ＰＢＳ、トウィーン２０、０．０５％（Ｗ／Ｖ）、ヤギ血清２．０％（Ｖ／Ｖ）およびゼラチン０．５％（Ｗ／Ｖ）
ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体：ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液で〜１：５０００まで希釈されたケミコンＭａｂ８５８−１抗ＲＳＶ融合タンパク質。
抗マウス血清：ＥＬＩＳＡ抗体緩衝液で〜１：５０００に希釈されたヤギ抗マウスＩｇＧ（重鎖特異性）に共役されたフィッシャーホースラディッシュペルオキシダーゼ。

結果を図１０で示す。結果は、２５ｎｇ／ｍｌがこの検定で中和５０％を達成し、一方ｃｈ１１２９抗体４５ｕｇ／ｍｌがこの実験で中和５０％のために必要とされたことを示している。一連の６個の異なる検定によって、Ｈ１１２９の５０％中和の平均値は１７ｎｇ／ｍｌであった。対照として、また効能を比較するために、われわれはまたＲＳＶに対する高い中和力価を持つ個人の血漿から作られたポリクローナルヒトＩｇＧ調製品を検定した。この調製品（ＲＳＶｉｇと名付けられる（lot#4））は３回の実験によって２．３ｕｇ／ｍｌの５０％中和平均値を示した。かくしてＨ１１２９はこの実験で強化ポリクローナル調製品に比べて１００倍大きい効能を持っている。

［実施例 １１］ ＢｌＡｃｏｒｅＴＭによるヒト化ＲＳＶ Ｍａｂのカイネティクス分析
ヒト化ＲＳＶ ＭａｂおよびＲＳＶ Ｆタンパク質の間の相互作用のカイネティクスがファルマシアＢｌＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサーを用いる表面プラスモン共鳴により調査された。Ｃ末端切断型Ｆタンパク質を発現する組換えバキュロウイルスは、カイネティクス調査のための豊富な抗原の情報源を提供した。上澄み（分泌Ｆタンパク質を含む）は、コンカナバリンＡおよびＱセファロースカラムを用いた連続クロマトグラフィーにより約２０倍に濃縮された。プールされた画分はクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．５）１０ｍＭに対して透析され、約０．１ｍｇ／ｍｌまで濃縮された。Ｆタンパク質（１００ｍｌ）の画分がＢｌＡコアセンサーチップに対してアミン結合された。固定された量はＨ１１２９あるいはＨ１３０８Ｆのいずれかで飽和された時にシグナルの約２０００応答単位（Ｒｍａｘ）を与えた。これは、結合手順に従ったＦタンパク質調製物において等数の「Ａ」および「Ｃ」抗原部位が存在することを示していた。２個の無関係の関連性のないＭａｂｓ（ＲＶＦＶ ４Ｄ４およびＣＭＶ Ｈ７５８）は固定されたＦタンパク質とは何らの相互作用を示さなかった。典型的なカイネティクス調査は、トウィーン２０、０．０５％を含むＰＢＳ緩衝液（ＰＢＳ／トウィーン）内での異なった濃度（２５−３００ｎＭ）でＭａｂ３５ｍｌを注入することを含んでいた。フローレートは５ｍｌ／分を維持し７分結合相を提供した。Ｍａｂの注入に続き、フローは解離速度を決定するために３０分でＰＢＳ／トウィーン緩衝液で置換した。センサーチップは塩酸１０ｍＭの２分パルスを持つサイクルの間で再生された。再生段階は固定Ｆタンパク質の結合能力に最少の損失（サイクル当り４％の損失）しか生じさせなかった。この小さな減少は、結合および解離のための速度定数の計算値を変更しなかった。

Ｆタンパク質への結合に対する各種Ｍａｂの親和性は、解離を示す第１次定数の、結合を示す第２次速度定数に対する割合（Ｋ_d＝Ｋ_diss／Ｋ_assoc）から計算された。Ｋ_assocの値は下記の率方程式に基づいて計算された。
（１）dR/dt=K_assoc[Mab]R_max-(K_assoc[Mab]+K_diss)R

ここでＲおよびＲｍａｘはそれぞれ時間ｔおよび無限大での応答単位である。Ｒの関数としてのｄｒ／ｄｔのプロットは（Ｋ_assoc［Ｍａｂ］＋Ｋ_diss）の傾きを与える。これらの傾きは［Ｍａｂ］と線形に関連しているため、Ｋ_assoc値は、傾き 対 ［Ｍａｂ］の再プロットから導き出すことができる。新しい線の傾きはＫ_assocと等しい。Ｋ_diss値はＹ切片から推定することができるが、より正確な値はＫ_dissの直接測定で決定された。Ｍａｂの注入相に続き、ＰＢＳ／トウィーン緩衝液はセンサーチップを横切って流れる。この時点から［Ｍａｂ］＝０となる。方程式（１）はかくして
（２）dr/dt=K_dissあるいはdR/R=K_dissdt
に変形される。方程式（２）の積分は
（３）１ｎ（Ｒｏ／Ｒｔ）＝Ｋ_dissｔ
となり、ここでＲｏとＲｔはそれぞれ時間ゼロ（解離相の開始）および時間ｔでの応答単位である。最後にｔの関数としてのＩｎ（Ｒｏ／Ｒｔ）はＫ_dissの傾きを与える。

［実施例 １２］ ヒト化Ｍａｂを用いたコットンラットのin vivo保護
Ｈ１１２９およびＨ１３０８Ｆは筋肉内投与された際にコットンラットの肺組織内で感染を減少する能力をそれぞれ検査された。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス、グループ当り４動物、平均重量１００グラム）がメトキシフルレンで麻酔され、筋肉内注射により抗体溶液１．０ｍｌを与えられた（最終濃度はそれぞれ５ｍｇ／ｋｇ、１．６７ｍｇ／ｋｇおよび０．５６ｍｇ／ｋｇの用量を生じる）。対照動物はウシ血清アルブミンを注射された。１日後、動物は再び麻酔され、ＲＳＶのロング菌株、１０^5.0プラーク形成単位（ＰＦＵ）の鼻腔内点滴により攻撃（免疫性をテスト）された。ウイルス攻撃の４日後、すべての動物は二酸化炭素窒息により屠殺された。肺が採取されハンクス平衡食塩水１０部（ｗｔ／ｖｏｌ）でホモゲナイズされた。生成懸濁液はウイルス量をプラーク検定により定量化された。

以下に示されるこれら実験の結果は、Ｈ１１２９およびＨ１３０８ＦがＲＳＶ攻撃１日前に注射されると、コットンラットの肺でのウイルス力価を減少するのに有効であることを示している。

ここで描かれ記載された図面は、この発明をより詳細に説明することを意図しており、どのような方法であってもこの発明を限定することを意図するものではない。

図１はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質抗体のＶ_Hのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は、移植前のヒトＨＶ３Ｖ_H、ＣＤＲ移植Ｖ_H、および移植されたＣＤＲ配列の元となったマウスＭＡｂ１３０８Ｆ Ｖ_HのＡＡ配列を表す。太字下線部はヒトＨＶ３ Ｖ_Hに移植されたＣＤＲを特定し、各々３つの領域は、それぞれＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を表す。 図１Ａに接続する図である。 図２はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体のＶ_Lのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＫ１０２Ｖ_L、ＣＤＲ移植Ｖ_Lおよび移植されたＣＤＲ配列の元となったマウスＭＡｂ１３０８Ｆ Ｖ_LのＡＡ配列を示す。太字下線部はヒトＫ１０２ Ｖ_Lに移植されたＣＤＲ配列を特定し、各々３つの領域は、それぞれＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を表す。 図２Ａに接続する図である。 図３はＨｕ１３０８Ｖ_Hを作るために使用されたオリゴヌクレオチドを示し、下線のある配列は特異的プライマー配列である。 図３Ａに接続する図である。 図４はＨｕ１３０８Ｖ_Lを作るために使用されたオリゴヌクレオチドを示し、下線のある配列は特異的なプライマー配列である。 図４Ａに接続する図である。 図５はヒト化(Humanized)１３０８のための発現ベクターのプラスミド構成を示す。 図６は中和パーセント対Ｃｏｓ Ｈｕ１３０８ＦおよびＭｕ１３０８Ｆでの中和に対する反応当りＭＡｂ ｎｇで表したＲＳＶの中和のグラフを示す。 図７はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ Ｆ糖タンパク質抗体のＶ_Hのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＣＯＲ Ｖ_H、ＣＤＲ移植Ｖ_H、および移植されたＣＤＲ配列の元となったマウスＭＡｂ１１２９ Ｖ_HのＡＡ配列を示す。太字下線部はヒトＣＯＲ Ｖ_Hに移植されたＣＤＲ配列を特定し、各々３つの領域は、それぞれＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を表す。 図７Ａに接続する図である。 図８はＣＤＲ移植抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体のＶ_Lのアミノ酸（ＡＡ）配列デザインを示す。図は移植前のヒトＫ１０２Ｖ_L、ＣＤＲ移植Ｖ_L、および移植されたＣＤＲ配列の元となったマウスＭＡｂ１１２９ Ｖ_LＡＡ配列を示す。太字下線部はヒトＫ１０２ Ｖ_Lに移植されたＣＤＲ配列を特定し、各々３個の領域は、それぞれＣＤＲ１，ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を表す。 図８Ａに接続する図である。 図９はヒト化１１２９ＶＨを構築するために使用されたオリゴヌクレオチドを示す）。 図９Ａに接続する図である。 図１０はＥＬＩＳＡ検定によるヒト化１１２９の結合度データを示す。

Claims (14)

1. 抗呼吸シンシチアルウイルス（ＲＳＶ）中和抗体であって、ヒト定常部および可変部を含み、前記可変部は重鎖および軽鎖フレームワーク領域と重鎖および軽鎖ＣＤＲとを含み、少なくとも一部の前記重鎖および軽鎖フレームワーク領域はヒト抗体から誘導され、前記ＣＤＲは、配列番号３１のアミノ酸番号３１−３７、５２−６７および１００−１０９のアミノ酸を含む３個の重鎖ＣＤＲのうち少なくとも一つと、配列番号３４のアミノ酸番号２４−３３、４９−５５および８８−９６のアミノ酸を含む３個の軽鎖ＣＤＲのうち少なくとも一つとを含む中和抗体。
2. 請求項１に記載の中和抗体であって、前記抗体は、配列番号３１のアミノ酸番号３１−３７、５２−６７および１００−１０９のアミノ酸を含む３個の重鎖ＣＤＲのうち少なくとも一つと、配列番号３４のアミノ酸番号２４−３３、４９−５５および８８−９６のアミノ酸を含む３個の軽鎖ＣＤＲのうち少なくとも一つとを含む抗体と、同一のエピトープに結合することを特徴とする中和抗体。
3. 請求項１または２に記載の中和抗体であって、前記重鎖フレームワーク領域は、配列番号３０、３１または３２に記載の重鎖フレームワーク領域を含むことを特徴とする中和抗体。
4. 請求項１または２に記載の中和抗体であって、前記軽鎖フレームワーク領域は配列番号３３、３４または３５に記載の軽鎖フレームワーク領域を含むことを特徴とする中和抗体。
5. 請求項１または２に記載の中和抗体であって、前記重鎖フレームワーク領域は、配列番号３０、３１または３２に記載の重鎖フレームワーク領域を含み、および／または、前記軽鎖フレームワーク領域は配列番号３３、３４または３５に記載の軽鎖フレームワーク領域を含むことを特徴とする中和抗体。
6. 請求項１または２に記載の中和抗体であって、前記中和抗体の重鎖は配列番号３０、３１または３２に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする中和抗体。
7. 請求項１または２に記載の中和抗体であって、前記中和抗体の軽鎖は配列番号３３、３４または３５に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする中和抗体。
8. 請求項１または２に記載の中和抗体であって、前記中和抗体の重鎖は配列番号３０、３１または３２に記載のポリペプチドを含み、かつ前記中和抗体の軽鎖は配列番号３３、３４または３５に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする中和抗体。
9. 可変重鎖ヒトＣＯＲ Ｖｈ配列中に置換されたマウス１１２９可変重鎖ＣＤＲを含む抗ＲＳＶ中和抗体。
10. ヒト生殖系列Ｋ１０２の可変軽鎖配列中に置換されたマウス１１２９可変軽鎖ＣＤＲを含む抗ＲＳＶ中和抗体。
11. 抗ＲＳＶ中和抗体であって、可変重鎖ヒトＣＯＲ Ｖｈ配列中に置換されたマウス１１２９可変重鎖ＣＤＲを含み、さらに、ヒト生殖系列Ｋ１０２の可変軽鎖配列中に置換されたマウス１１２９可変軽鎖ＣＤＲを含む抗ＲＳＶ中和抗体。
12. 薬剤組成物であって、
    （ａ）請求項１乃至請求項１１に記載の中和抗体、および、
    （ｂ）薬剤許容希釈剤
    を含む薬剤組成物。
13. ヒトの呼吸シンシチアルウイルス感染を治療または予防するための組成物であって、請求項１乃至請求項１１に記載の中和抗体を含む組成物。
14. ヒトの呼吸シンシチアルウイルス感染を予防するための組成物であって、請求項１乃至請求項１１に記載の中和抗体を含む組成物。
    
    
    

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