TW202402325A - Pvrig/tigit雙特異性抗體藥物組合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種PVRIG/TIGIT雙特異性抗體藥物組合物及其用途。具體地，本發明涉及一種藥物組合物，其包含PVRIG/TIGIT雙特異性抗體以及緩衝液。進一步地，該藥物組合物還包含糖和表面活性劑。本發明中的藥物組合物用於治療癌症或感染性疾病。

Description

PVRIG/TIGIT雙特異性抗體藥物組合物及其用途
本申請要求於2022年6月8日提交中國專利局、申請號為202210641617.6、發明名稱為“一種PVRIG/TIGIT雙特異性抗體藥物組合物及其用途”的中國專利申請的優先權，其全部內容藉由引用結合在本發明中。
本發明關於藥物製劑領域，具體而言，關於一種包含PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段的藥物組合物。
免疫療法的基礎在於操控及/或調節免疫系統，包括先天免疫反應及後天免疫反應二者，其概括目標為藉由控制對“外來劑”(例如病原體或腫瘤細胞)的免疫反應來治療疾病。免疫系統是由眾多細胞類型所組成的高度複雜系統，這些細胞具有控制那些交互作用及反應的複雜且細微的系統。癌症免疫監測的概念是基於免疫系統可辨識腫瘤細胞、啟動免疫反應及抑制腫瘤發展及/或進展的理論。然而，明確的是許多癌細胞已發展出逃避免疫系統的機制，其可容許不受抑制的腫瘤生長。癌/腫瘤免疫療法著重於發展可活化及/或激活免疫系統的新型且新穎的激動和/或拮抗劑，以達成更有效的抗腫瘤反應，增強對腫瘤細胞的殺傷及/或抑制腫瘤生長。
近年來，針對免疫細胞共抑制受體的免疫檢查點治療在腫瘤免疫治療中取得了巨大進展，發現和驗證新的共抑制性受體成為一個全球競爭性的熱點。PVRIG在NK細胞和T細胞的細胞上表達，並且與其它已知的免疫檢查點具有若干相似之處。當PVRIG與其配體(PVRL2)結合時，引發抑制訊號，其起到減弱NK細胞和T細胞針對靶細胞的免疫反應(即類似於PD-1/PD-L1)的作用。阻斷PVRL2與PVRIG的結合會切斷PVRIG的這種抑制訊號，並因此調節NK細胞和T細胞的免疫反應。類似地，TIGIT是另一個所關注的標靶，已經證明與其同源配體PVR的結合藉由其細胞內ITIM域直接抑制NK細胞和T細胞的細胞毒性。TIGIT基因的敲除或TIGIT/PVR相互作用的阻斷抗體已展示在體外可以增強NK細胞殺傷，或者加劇體內自身免疫疾病。
TIGIT和PVRIG同屬於DNAM超家族，並被證明在多種腫瘤浸潤淋巴細胞中共表達發揮免疫抑制作用，能夠同時靶向PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體具有潛在的協同效果，是用於單一抗體療法的有吸引力的治療方式。
抗體屬於相對較高分子量的蛋白質，由於蛋白質在溶液中較不穩定，非常容易形成顆粒和聚集等，穩定性成為大分子蛋白類藥物開發的一個難題。因此，存在用於藥物用途，例如用於治療各種癌症和傳染病的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的穩定製劑的需求，這樣的製劑，在室溫或高溫環境中具有良好的穩定性，能夠降低抗體藥物在運輸和儲存的成本。
本發明揭露一種PVRIG/TIGIT雙特異性抗體藥物組合物及其用途。
一方面，本發明提供一種藥物組合物，其包含： （i）一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，所述雙特異性抗體或其抗原結合片段包含特異性結合PVRIG和TIGIT的結合域； （ii）緩衝液； （iii）非還原性糖；和 （iv）非離子表面活性劑， 其中，所述雙特異性抗體或其抗原結合片段包含： （a）第一抗原結合部分，其包括重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），所述VH和VL形成抗TIGIT抗原結合域；其中，所述TIGIT VH包含SEQ ID NO：12或14任一項所述VH的HCDR1、HCDR2和HCDR3；所述TIGIT VL包含SEQ ID NO：11或13任一項所述VL的LCDR1、LCDR2和LCDR3； （b）第二抗原結合部分，其包括特異性結合PVRIG的VHH，所述VHH包含SEQ ID NO：9或10任一項所述序列的CDR1、CDR2和CDR3。
較佳地，所述第一抗原結合部分包含以下序列的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3： （1）分別為SEQ ID NO：21、22、23、27、28和29；或 （2）分別為SEQ ID NO：24、25、26、30、31和32；或 （3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列，較佳地，所述替換為保守氨基酸的替換； 所述第二抗原結合部分包含以下序列的CDR1、CDR2和CDR3： （1）分別為SEQ ID NO：15、16和17；或 （2）分別為SEQ ID NO：18、19和20；或 （3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列，較佳地，所述替換為保守氨基酸的替換。
較佳地，所述第一抗原結合部分的VH包含與SEQ ID NO：12或14所示氨基酸序列至少90%同一性的序列；所述第一抗原結合部分的VL包含與SEQ ID NO：11或13所示氨基酸序列至少90%同一性的序列；所述第二抗原結合部分包含與SEQ ID NO：9或10所示氨基酸序列至少90%同一性的序列。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物，所述PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段的濃度為約10mg/ml至約200mg/ml，較佳的，為約10mg/ml至約150mg/ml，約15mg/ml至約120mg/ml，約20mg/ml至約100mg/ml，約20mg/ml至約80mg/ml，約20mg/ml至約70mg/ml，或約30mg/ml至約60mg/ml。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物，所述緩衝液選自醋酸-醋酸鈉緩衝液或組氨酸-鹽酸組氨酸緩衝液，較佳的，所述緩衝液濃度為約10mM至約80mM，約15mM至約70mM，約20mM至約60mM，約20mM至約50mM，約20mM至約40mM，或約20mM至約30mM。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物，所述非還原性糖選自蔗糖，山梨醇或海藻糖，較佳的，所述非還原性糖的濃度為約6%至約10%(w/v)，約6%至約9%(w/v)，約7%至約9%(w/v)，或約7%至約8%(w/v)。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物，所述非離子表面活性劑為聚山梨酯80，較佳的，所述非離子表面活性劑的濃度為約0.01%至約0.10%(w/v)，約0.01%至約0.08%(w/v)，約0.02%至約0.07%(w/v)，或約0.02%至約0.06%(w/v)。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物為注射劑，較佳為皮下注射劑、靜脈注射劑或靜脈輸注劑。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物包含： (i)約10mg/ml至約200mg/ml的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段； (ii)約10mM至約100mM的醋酸-醋酸鈉緩衝液； (iii)約6%至約10%(w/v)蔗糖； (iv)約0.01%至約0.10%(w/v)聚山梨酯80。
較佳地，所述藥物組合物包含約50mg/mL的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段、20mM 醋酸-醋酸鈉緩衝液、約8%w/v蔗糖、約0.02%聚山梨酯80。
較佳地，所述藥物組合物包含約50mg/mL的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段、20mM 醋酸-醋酸鈉緩衝液、約8%w/v蔗糖、約0.04%聚山梨酯80。
較佳地，所述藥物組合物包含約50mg/mL的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段、20mM 醋酸-醋酸鈉緩衝液、約8%w/v蔗糖、約0.06%聚山梨酯80。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物的pH為約4.5-5.5，較佳地，約5.0-5.2。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物在2℃至8℃下穩定至少4周，5周，6周，7周，8周，3月或6月。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物在25℃下穩定至少4周，5周，6周，7周，8周，3月或6月。
在一些實施例中，前面任一所述的藥物組合物在40℃下穩定至少1周，2周，3周或4周。
在另一方面，前面任一所述的藥物組合物在製備用於治療癌症或感染性疾病的藥物中的用途；其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤。
在一些實施例中，所述藥物組合物與另外的治療劑或與手術組合使用；其中所述另外的治療劑選自放射療法、化學療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、免疫刺激性抗體、免疫調節藥物、共刺激分子的活化劑（activator）、抑制性分子的抑制劑、疫苗或細胞免疫療法，所述手術是外科手術。
在另一方面，本發明提供了一種治療癌症或感染性疾病的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的前面任一所述的藥物組合物，其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤。
在另一方面，本發明提供了前面任一所述的藥物組合物用於治療癌症或感染性疾病；其中所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤。
術語定義和說明
除非另外說明，本文所用術語具有所屬技術領域普通技術人員通常理解的含義。對於本文中明確定義的術語，則該術語的含義以所述定義為準。
此外，除非本文另有說明，本文單數形式的術語應包括複數形式，複數形式的術語應包括單數形式。更具體地，如在本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，除非另外明確指出，否則單數形式“一種”和“這種”包括複數指示物。
本文術語“包括”、“包含”和“具有”之間可互換使用，旨在表示方案的包含性，意味著所述方案可存在除所列出的元素之外的其他元素。同時應當理解，在本文中使用“包括”、“包含”和“具有”描述，也提供“由……組成”方案。示例性地，“一種組合物，包括A和B”，應當理解為以下技術方案：由A和B組成的組合物，以及除A和B外，還含有其他組分的組合物，均落入前述“一種組合物”的範圍內。
術語“和/或”在本文使用時，包括“和”、“或”和“由所屬術語鏈接的要素的全部或任何其他組合”的含義。
本文在數值前使用“約”，表示可在改數值上下浮動，可選的浮動範圍為10%，例如，“約10%”表示“9%~11%”；在數值範圍前使用“約”表示可以在該數值範圍的端點值上下浮動，其中上端點為向上浮動，下端點為向下浮動，例如，“約10~20nM”表示的範圍為“9~22nM”。可選的，所述“約”的浮動範圍還可以為上下浮動5%，4%，2%或1%。
術語“具有Ig和ITIM域的T細胞免疫受體”、“TIGIT”、“TIGIT抗原”、、“Vstm3”和“WUCAM”可互換使用，並且包括各種哺乳動物同種型，例如人Tigit、人Tigit的直系同源物、和包含Tigit內的至少一個表位的類似物，以及具有至少一個與TIGIT共有的表位的類似物。TIGIT(例如人TIGIT)的氨基酸序列、以及編碼其的核苷酸序列是本領域已知的。
本文術語“PVRIG”或“PVRIG蛋白質”可以任選地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型PVRIG，以及任何天然產生的剪接變異體、氨基酸變異體或同工型，並且尤其是PVRIG的ECD片段。結合到PVRIG並且防止被PVRL2活化(例如，最常藉由阻斷PVRIG和PVLR2的相互作用)的“抗PVRIG抗體”(包括抗原結合片段)用於增強T細胞和/或NK細胞活化並且用於治療疾病，如癌症和病原體感染。
本發明的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體特異性地結合於人類TIGIT，並且較佳是人類TIGIT的ECD，以及PVRIG，並且再佳是人類PVRIG的ECD。
本文術語“特異性結合”是指抗原結合分子（例如抗體）通常以高親和力特異性結合抗原和實質上相同的抗原，但不以高親和力結合不相關抗原。親和力通常以平衡解離常數（equilibrium dissociation constant，KD）來反映，其中較低KD表示較高親和力。以抗體為例，高親和力通常指具有約1×10 -7M或更低、約1×10 -8M或更低、約1×10 -9M或更低、約1×10 -10M或更低、1×10 -11M或更低或1×10 -12M或更低的KD。KD計算方式如下：KD = Kd/Ka，其中Kd表示解離速率，Ka表示結合速率。可採用本領域周知的方法測量平衡解離常數KD，如表面電漿共振（例如Biacore）或平衡透析法測定。
本文術語“抗原結合分子”按最廣義使用，是指特異性結合抗原的分子。示例性地，抗原結合分子包括但不限於抗體或抗體模擬物。“抗體模擬物”是指能夠與抗原特異性結合，但與抗體結構無關的有機化合物或結合域，示例性地，抗體模擬物包括但不限於affibody、affitin、affilin、經設計的錨蛋白重複蛋白(DARPin)、核酸適體或Kunitz型結構域肽。
本文術語“抗體”按最廣義使用，是指包含來自免疫球蛋白重鏈可變區的足夠序列和/或來自免疫球蛋白輕鏈可變區的足夠序列，從而能夠特異性結合至抗原的多肽或多肽組合。本文“抗體”涵蓋各種形式和各種結構，只要它們展現出期望的抗原結合活性。本文“抗體”包括具有移植的互補決定區(CDR)或CDR衍生物的替代蛋白質支架或人工支架。此類支架包括抗體衍生的支架(其包含引入以例如穩定化抗體三維結構的突變)以及包含例如生物相容性聚合物的全合成支架。參見，例如Korndorfer et al.,2003,Proteins:Structure,Function,and Bioinformatics,53(1):121-129(2003)；Roque et al.,Biotechnol.Prog.20:639-654(2004)。此類支架還可以包括非抗體衍生的支架，例如本領域已知可用於移植CDR的支架蛋白，包括但不限於肌腱蛋白、纖連蛋白、肽適體等。
本文“抗體”可以來源於任何動物，包括但不限於人和非人動物，所述非人動物可選自靈長類動物、哺乳動物、齧齒動物和脊椎動物，例如駱駝科動物、大羊駝、原鴕、羊駝、羊、兔、小鼠、大鼠或軟骨魚綱（例如鯊）。
本文“抗體”包括但不限於單株抗體、多株抗體、單特異性抗體、多特異性抗體（例如雙特異性抗體）、單價抗體、多價抗體、完整抗體、完整抗體的片段、裸抗體、綴合抗體、嵌合抗體、人源化抗體或全人抗體。
本文術語“單株抗體”是指從基本上同質的抗體群體獲得的抗體，即，除了可能的變異體(例如含有天然存在的突變或在製劑的生產過程中產生，此類變體通常以少量存在)之外，包含所述群體的各個抗體是相同的和/或結合相同的表位。與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多株抗體製劑相反，單株抗體製劑中的每種單株抗體針對抗原上的單一決定簇。本文修飾語“單株”不應解釋為需要藉由任何特定方法產生所述抗體或抗原結合分子。舉例來說，單株抗體可藉由多種技術制得，包括(但不限於)雜交瘤技術、重組DNA方法、噬菌體庫展示技術和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的轉殖基因動物的方法和其它本領域已知的方法。
本文“抗原結合片段”和“抗體片段”在本文中可互換使用，其不具備完整抗體的全部結構，僅包含完整抗體的局部或局部的變體，所述局部或局部的變體具備結合抗原的能力。本文“抗原結合片段”或“抗體片段”包括但不限於Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2、Fd、Fv、scFv、雙抗體（diabody）和單域抗體。
本文術語“雙特異性”是指具有至少兩個抗原結合位點，即至少“雙特異性”的，可以是“三特異性”、“四特異性”等；所述至少兩個抗原結合位點中的每一個抗原結合位點與相同抗原的不同表位或與不同抗原的不同表位結合。另外，“雙特異性”還可以是具有至少兩個抗原結合位點的抗體衍生分子，例如免疫綴合物。
本文術語“人源化抗體”是指，經基因工程改造的非人源抗體，其氨基酸序列經修飾以提高與人源抗體的序列的同源性。通常而言，人源化抗體的全部或部分CDR區來自於非人源抗體(供體抗體)，全部或部分的非CDR區(例如，可變區FR和/或恒定區)來自於人源免疫球蛋白(受體抗體)。人源化抗體通常保留或部分保留了供體抗體的預期性質，包括但不限於，抗原特異性、親和性、反應性、提高免疫細胞活性的能力、增強免疫應答的能力等。
本文術語“可變區”是指抗體重鏈或輕鏈中牽涉使抗體結合抗原的區域，“重鏈可變區”與“VH”、“HCVR”可互換使用，“輕鏈可變區”與“VL”、“LCVR”可互換使用。天然抗體的重鏈和輕鏈的可變域(分別是VH和VL)一般具有相似的結構,每個域包含四個保守的框架區(FR)和三個高變區(HVR)。參見例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。單個VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。本文術語“互補決定區”與“CDR”可互換使用，通常指重鏈可變區（VH）或輕鏈可變區（VL）的高變區（HVR），該部位因在空間結構上可與抗原表位形成精密的互補，故又稱為互補決定區，其中，重鏈可變區CDR可縮寫為HCDR，輕鏈可變區CDR可縮寫為LCDR。本術語“構架區”或“FR區”可互換，是指抗體重鏈可變區或輕鏈可變區中除CDR以外的那些氨基酸殘基。通常典型的抗體可變區由4個FR區和3個CDR區按以下順序組成：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
對於CDR的進一步描述，參考Kabat等人, J. Biol. Chem.,252:6609-6616 (1977)；Kabat等人, 美國衛生與公共服務部，“Sequences of proteins of immunological interest ”（1991）; Chothia等人,J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Al-Lazikani B.等人, J.Mol. Biol., 273: 927-948 (1997); MacCallum 等人, J. Mol.Biol. 262:732-745 (1996); Abhinandan和Martin, Mol. Immunol., 45: 3832-3839 (2008); Lefranc M.P.等人, Dev. Comp.Immunol., 27: 55-77 (2003); 以及Honegger和Plückthun, J. Mol. Biol., 309:657-670 (2001)。本文“CDR”可由本領域公知的方式加以標註和定義，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統或IMGT編號系統，使用的工具網站包括但不限於AbRSA網站（http://cao.labshare.cn/AbRSA/cdrs.php）、abYsis網站（www.abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi）和IMGT網站（http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi#results）。本文CDR包括不同定義方式的氨基酸殘基的重疊（overlap）和子集。
本文術語“Kabat編號系統”通常是指由Elvin A.Kabat提出的免疫球蛋白比對及編號系統(參見，例如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)。
本文術語“保守氨基酸”通常是指屬於同一類或具有類似特徵（例如電荷、側鏈大小、疏水性、親水性、主鏈構象和剛性）的氨基酸。示例性地，下述每組內的氨基酸屬於彼此的保守氨基酸殘基，組內氨基酸殘基的替換屬於保守氨基酸的替換：
示例性地，以下六組是被認為是互為保守性置換的氨基酸的實例： 1)丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)； 2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)； 3)天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)； 4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)、組氨酸（H）； 5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、纈氨酸(V)；和 6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
本文術語“同一性”可藉由以下方式計算獲得：為確定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的“同一性”百分數，將所述序列出於最佳比較目的比對(例如，可以為最佳比對而在第一和第二氨基酸序列或核酸序列之一或二者中引入空位或可以為比較目的而拋棄非同源序列)。隨後比較在對應氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當第一序列中的位置由第二序列中對應位置處的相同氨基酸殘基或核苷酸佔據時，則所述分子在這個位置處是相同的。
考慮到為最佳比對這兩個序列而需要引入的空位的數目和每個空位的長度，兩個序列之間的同一性百分數隨所述序列共有的相同位置變化而變化。
可以利用數學算法實現兩個序列間的序列比較和同一性百分數的計算。例如，使用已經集成至GCG套裝軟體的GAP程序中的Needlema和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48:444-453)算法(在www.gcg.com可獲得)，使用Blossum 62矩陣或PAM250矩陣和空位權重16、14、12、10、8、6或4和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個氨基酸序列之間的同一性百分數。又例如，使用GCG套裝軟體中的GAP程序(在www.gcg.com可獲得)，使用NWSgapdna.CMP矩陣和空位權重40、50、60、70或80和長度權重1、2、3、4、5或6，確定兩個核苷酸序列之間的同一性百分數。特別較佳的參數集合(和除非另外說明否則應當使用的一個參數集合)是採用空位罰分12、空位延伸罰分4和移碼空位罰分5的Blossum62評分矩陣。
還可以使用PAM120加權餘數表、空位長度罰分12，空位罰分4，利用已經併入ALIGN程序(2.0版)的E.Meyers和W.Miller算法,((1989)CABIOS,4:11-17)確定兩個氨基酸序列或核苷酸序列之間的同一性百分數。
額外地或備選地，可以進一步使用本發明所述的核酸序列和蛋白質序列作為“查詢序列”以針對公共數據庫執行檢索，以例如鑒定其他家族成員序列或相關序列。例如，可以使用Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的NBLAST及XBLAST程序(版本2.0)執行此類檢索。BLAST核苷酸檢索可以用NBLAST程序，評分=100、字長度=12執行，以獲得與本發明核酸(SEQ ID NO:1)分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質檢索可以用XBLAST程序、評分=50、字長度=3執行，以獲得與本發明蛋白質分子同源的氨基酸序列。為了出於比較目的獲得帶空位的比對結果，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所述那樣使用空位BLAST。當使用BLAST和空位BLAST程序時，可以使用相應程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默認參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。
本文術語“藥物組合物”是指這樣的製劑，其以允許包含在其中的活性成分的生物學活性有效的形式存在，並且不含有對施用所述藥物組合物的受試者具有不可接受的毒性的另外的成分。藥物組合物的目的是保持抗體活性成分的穩定性，促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。本文中，“藥物組合物”和“製劑”並不互相排斥。在一些實施方式中，本文術語“藥物組合物”包括抗體，抗體衍生分子如免疫綴合物。
本文術語“免疫綴合物”指包含至少一個效應分子和至少一個抗體或其功能片段的多肽分子。
本文術語“效應分子”是免疫綴合物的一部分，其意欲對所述免疫綴合物靶向的細胞具有需要的作用。效應分子還被稱為效應部分(effector moiety，EM)、治療劑或診斷劑或示蹤劑或類似的術語。
本文術語“穩定”是指製劑中的蛋白質在儲存時基本上保持其物理穩定性和/或化學穩定性和/或生物學活性的製劑。儲藏期一般基於藥物組合物的預定保存期來選擇。用於測量蛋白質穩定性的各種分析技術在本領域中是可用的。
穩定的藥物抗體製劑是在下述情況下沒有觀察到顯著變化的製劑：在冷藏溫度(2-8℃)保存至少3個月、較佳6個月、更佳1年。另外，穩定的液體製劑包括這樣的液體製劑：其在包括25℃和40℃在內的溫度保存包括1個月、3個月在內的時段後表現出期望的特徵。穩定性的製劑例如：藉由視覺分析，藥物抗體製劑是無色的，或澄清至稍微乳白色。所述製劑的濃度、pH和重量克分子滲透壓濃度具有不超過±10%變化。通常觀察到不超過約10%、較佳不超過約5%的截短。通常形成不超過約10%、較佳不超過約5%的聚集。
如果在目檢顏色和/或澄清度後，或者藉由UV光散射、尺寸排阻色譜法(SEC)和動態光散射(DLS)測得，抗體沒有顯示出顯著的聚集增加、沉澱和/或變性，那麼所述抗體在藥物製劑中“保留它的物理穩定性”。
如果抗體沒有顯示出顯著的化學改變，那麼所述抗體在藥物製劑中“保留它的化學穩定性”。藉由檢測和定量化學上改變的形式的蛋白，可以評估化學穩定性。經常改變蛋白化學結構的降解過程包括水解或截短(藉由諸如尺寸排阻色譜法和SDS-PAGE等方法來評價)、氧化(藉由諸如與質譜法或MALDI/TOF/MS結合的肽譜法等方法來評價)、脫醯胺作用(藉由諸如離子交換色譜法、毛細管等電聚焦、肽譜法、異天冬氨酸測量等方法來評價)和異構化(藉由測量異天冬氨酸含量、肽譜法等來評價)。
如果抗體在給定時間的生物活性是在製備藥物製劑時表現出的生物活性的預定範圍內，那麼所述抗體在藥物製劑中“保留它的生物活性”。抗體的生物活性可以例如藉由抗原結合測定來確定。
本文術語“緩衝液”涵蓋那些將本發明藥物組合物的溶液pH保持在可接受範圍內的試劑，包括醋酸鹽、琥珀酸鹽、葡萄糖酸鹽、組氨酸、草酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、延胡索酸鹽、甘氨醯甘氨酸和其它有機酸緩衝液。
本文術語“非還原性糖”可以包括選自海藻糖或蔗糖中的至少一種。
本文術語“非離子表面活性劑”選自非離子水溶性單甘油酯、非離子水溶性雙甘油酯、非離子水溶性三甘油酯、非離子水溶性聚乙二醇單脂肪酸酯、非離子水溶性聚乙二醇二脂肪酸酯、非離子水溶性山梨醇脂肪酸酯、非離子聚糖基化甘油酯、非離子水溶性三嵌段共聚物及其組合。在一些實施方案中，非離子表面活性劑是聚山梨酸酯80（聚氧乙烯（20）山梨醇單油酸酯）。
本文術語“Tm值”是指蛋白質熱變性溫度，即一半蛋白去折疊時的溫度，此時蛋白的空間結構被破壞，所以Tm值越高，蛋白熱穩定性越高。
本文術語“治療”是指外科手術或藥物處理（surgical or therapeutic treatment），其目的是預防、減緩（減少）治療對象中不希望的生理變化或病變，如癌症的進展。有益的或所希望的臨床結果包括但不限於症狀的減輕、疾病程度減弱、疾病狀態穩定（即，未惡化）、疾病進展的延遲或減慢、疾病狀態的改善或緩和、以及緩解（無論是部分緩解或完全緩解），無論是可檢測的或不可檢測的。需要治療的對象包括已患有病症或疾病的對象以及易於患上病症或疾病的對象或打算預防病症或疾病的對象。當提到減緩、減輕、減弱、緩和、緩解等術語時，其含義也包括消除、消失、不發生等情況。
本文術語“患者”是指接受對如本發明所述的特定疾病或病症的治療的生物體。對象和患者的實例包括接受疾病或病症治療的哺乳動物，如人、靈長類動物（例如，猴）或非靈長類哺乳動物。
本文術語“有效量”指單獨給予或與另一治療劑組合給予細胞、組織或對象時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。“有效量”還指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩解這些病症的速度增加的化合物用量。當將活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單指該成分。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無論是組合、連續或同時給予。
本文術語“癌症”指向或描述哺乳動物中典型地以不受調節的細胞生長為特徵的生理狀況。此定義中包括良性和惡性癌症。本文術語“腫瘤”或“瘤”是指所有贅生性(neoplastic)細胞生長和增殖,無論是惡性的還是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細胞和組織。術語“癌症”和“腫瘤”在本文中提到時並不互相排斥。
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。實施例中未註明具體條件者，按照常規條件或製造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以藉由市售購買獲得的常規產品。
本發明實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
名詞解釋
縮寫 含義
T0 表示“考察起點”
W 表示“周（week）”，例如，“1W”表示“1周”
M 表示“月（month）”，例如，“3M”表示“3個月”
C 表述凍融的循環數(Cycle)，例如，“3C”表示凍融3輪，“5C”表示凍融5輪
D 表示“天（day）”，例如“7D”表示7天
H 表示“小時（hour）”
ND 表示“未檢測到”
F/T Freeze/Thaw，凍融
SE-HPLC 分子排阻高效液相色譜
CEX 陽離子交換色譜
CE-SDS（NR） 非還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳
CE-SDS（R） 還原型十二烷基硫酸鈉毛細管電泳
DLS 動態光散射
DSF 差示掃描熒光法
ELISA 酶聯免疫吸附試驗
如無特別說明，下文所述的ELISA Binding檢測採用以下方法。
PVRIG/TIGIT雙特異性抗體，一端能夠與hTIGIT-mFc特異性結合，另一端能與hPVRIG-His特異性結合。96孔板上預先包被抗原（hTIGIT-mFc）（廠家：Acro, 貨號：TIT-H5253），加入梯度稀釋至不同濃度的PVRIG&TIGIT雙特異性抗體與酶標板上的抗原結合，洗板去除不結合的各種成分，再加入一抗（hPVRIG-His）（廠家：Acro, 貨號：PVG-H52H4），培養後洗板去除不結合的一抗後加入二抗（His Tag Horseradish Peroxidase-conjugated Antibody）（廠家：R&D ,貨號：MAB050H）培養，培養完成後洗板去除未結合二抗，最後加入TMB顯色，並用終止液終止反應，使用酶標儀讀取OD值。
實施例1 PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的構建和表達純化
1.1 PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的構建
兩個抗PVRIG人源化VHH抗體（PVRIG-A50-H1b, PVRIG-A105-H1）及兩個抗TIGIT人源化單株抗體（TIGIT-002-H4L3, TIGIT-005-H2L1d），用G4S連接肽將抗PVRIG人源化VHH抗體連接到抗TIGIT人源化抗體重鏈的N端，產生抗PVRIGxTIGIT人源化雙特異性抗體，分別命名為LC-BsAb-002、LC-BsAb-006、LC-BsAb-009和LC-BsAb-010。表1所示為4種雙特異性抗體重鏈融合多肽（HC）和輕鏈多肽（LC）的序列，表2所示為雙特異性抗體的可變區序列，表3所示為雙特異性抗體按照Kabat劃分的CDR序列。
表1 雙特異抗體融合多肽序列
HC/LC 序列編號 sequence
LC-BsAb-002的LC SEQ ID NO：1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQNVRTAVAWYQQKPGQSPKLMIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 注釋： TIGIT-002-H4L3VL(單下劃線)
LC-BsAb-002 的HC SEQ ID NO：2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSDGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKKLEYIGYISYSGNTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 注釋： PVRIG-A50-H1b(雙下劃線)+(G4S)4 Linker(斜體部分)+ TIGIT-002-H4L3VH(單下劃線)
LC-BsAb-006 的LC SEQ ID NO：3 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSNAVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 注釋： TIGIT-005-H2L1dVL(單下劃線)
LC-BsAb-006 的HC SEQ ID NO：4 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSDGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQRLEWMGVINPGSGGTNYKEKFKGRVTITADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYFFFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 注釋： PVRIG-A50-H1b(雙下劃線)+(G4S)4 Linker(斜體部分)+ TIGIT-005-H2L1dVH(單下劃線)
LC-BsAb-009 的LC SEQ ID NO：5 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQNVRTAVAWYQQKPGQSPKLMIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 注釋： TIGIT-002-H4L3 VL(單下劃線)
LC-BsAb-009 的HC SEQ ID NO：6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMSWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKKLEYIGYISYSGNTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 注釋： PVRIG-A105-H1(雙下劃線)+(G4S)4 Linker(斜體部分)+ TIGIT-002-H4L3VH(單下劃線)
LC-BsAb-010 的LC SEQ ID NO：7 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSNAVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 注釋： TIGIT-005-H2L1dVL(單下劃線)
LC-BsAb-010 的HC SEQ ID NO：8 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMSWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQRLEWMGVINPGSGGTNYKEKFKGRVTITADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYFFFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 注釋： PVRIG-A105-H1(雙下劃線) + (G4S)4 Linker (斜體部分) +  TIGIT-005-H2L1dVH(單下劃線)
表2 雙特異性抗體的可變區序列
可變區 序列編號 sequence
PVRIG-A50-H1b SEQ ID NO：9 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYYDMSWVRQAPGKGLEWVSTINSDGGRTSYVDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCVEGDPHNFGLESLSLRDFGSWGQGTMVTVSS
PVRIG-A105-H1 SEQ ID NO：10 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFDRHTMSWFRQAPGKEREFVATASRIPGDTYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAATSAYCSEVDCYEKGSWYDNWGQGTMVTVSS
TIGIT-002-H4L3 VL SEQ ID NO：11 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQNVRTAVAWYQQKPGQSPKLMIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPWTFGGGTKVEIK
TIGIT-002-H4L3 VH SEQ ID NO：12 EVQLQESGPGLVKPSETLSLTCAVSGYSITSDSWNWIRQPPGKKLEYIGYISYSGNTYYNPSLKSRVTISRDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDFSNYGGAVDYWGQGTTVTVSS
TIGIT-005-H2L1d VL SEQ ID NO：13 DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQHVSNAVAWYQHKPGQSPKLLIYSASYRYTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYNTPHTFGGGTKVEIK
TIGIT-005-H2L1d VH SEQ ID NO：14 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVRQAPGQRLEWMGVINPGSGGTNYKEKFKGRVTITADKSSSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYFFFDYWGQGTTVTVSS
表3 雙特異性抗體的KABAT分析結果
可變區 CDR1 CDR2 CDR3
PVRIG-A50-H1b YYDMS SEQ ID NO：15 TINSNGGRTSYVDSVKG SEQ ID NO：16 GDPHNFGLENLSLRDFGS SEQ ID NO：17
PVRIG-A105-H1 RHTMS SEQ ID NO：18 TASRIPGDTYYVDSVKG SEQ ID NO：19 TSAYCSEVDCYEKGSWYDN SEQ ID NO：20
可變區 HCDR1 HCDR2 HCDR3
TIGIT-002-H4L3 VH SDSWN SEQ ID NO：21 YISYSGNTYYNPSLKS SEQ ID NO：22 LDFSNYGGAVDY SEQ ID NO：23
TIGIT-005-H2L1d VH NYLIE SEQ ID NO：24 VINPGSGGTNYKEKFKG SEQ ID NO：25 GEYFFFDY SEQ ID NO：26
可變區 LCDR1 LCDR2 LCDR3
TIGIT-002-H4L3 VL KASQNVRTAVA SEQ ID NO：27 SASYRYT SEQ ID NO：28 QQYYTTPWT SEQ ID NO：29
TIGIT-005-H2L1d VL KASQHVSNAVA SEQ ID NO：30 SASYRYT SEQ ID NO：31 QQHYNTPHT SEQ ID NO：32
1.2 PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的表達
採用基因工程技術將PVRIG/TIGIT雙特異抗體基因轉染至CHO-K1細胞中，並經過MSX壓力篩選出產量較高的選殖，在CD CHO培養基中進行傳代培養。PVRIG/TIGIT雙特異抗體運用分批補料培養方式進行表達。基礎培養基為奧普邁的CHO CDP9，培養週期14-16天，反應器控制參數為pH 6.6～7.2，溶解氧（DO）為≥20%，轉速75RPM～80RPM，初始培養溫度36.0°C～37.0°C；當培養至第6天時，降低培養溫度至33.5°C～34.5°C直到收穫。
補料培養基為奧普邁的XF04和CD FS08，從Day3開始隔天補，補料體積分別是體積的5%和0.5%，直至收穫。
1.3 PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的純化
PVRIG/TIGIT雙特異抗體的純化採用多步驟層析、濃縮和過濾單元操作依次對抗體進行純化。上清收穫液經過Protein A親和層析（AT ProteinA Diamond Plus）進行捕獲。捕獲後的抗體溶液採用低pH培養處理以滅活潛在的病毒。抗體溶液中和後藉由深層過濾除去沉澱。然後依次進行陰離子交換層析（Diamond Q）以去除HCD, HCP, 脫落Protein A等雜質，以及陽離子交換（Diamond S）層析以去除HCP和聚集體等雜質。藉由納濾膜包過濾以去除潛在的內外源病毒。之後用超濾膜包對抗體溶液進行濃縮，緩衝液置換，從而完成純化，獲得PVRIG/TIGIT雙特異抗體蛋白原液。
1.4 BIAcore檢測PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與人，食蟹猴和小鼠TIGIT及PVRIG蛋白的親和力
該實驗採用Protein A晶片，藉由手工操作（manual run）測定出晶片捕獲稀釋後的抗體所需要的時間，以使得能飽和結合抗原Rmax為50 RU。 將人、食蟹猴和小鼠TIGIT及PVRIG蛋白梯度稀釋至20，10，5，2.5，1.25 nM。採用多循環動力學測得抗體與抗原的親和力。在每一個循環中，注射抗體後再注入梯度濃度的人、食蟹猴和小鼠TIGIT及PVRIG蛋白，使抗原與抗體發生結合與解離過程。每個循環後用Glycine pH1.5進行Protein A晶片的再生（去除晶片上的蛋白）。應用BIAcore T200分析軟件擬合抗體抗原的親和力KD。表4結果可知，2個雙特異性抗體與人和食蟹猴TIGIT及PVRIG蛋白之間存在特異性結合，且親和力水平較高，但與小鼠TIGIT及PVRIG蛋白不結合。
表4 PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與不同種屬TIGIT及PVRIG蛋白的親和力
抗體 抗原 結合動力學
ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) Rmax (RU) Capture Level (RU)
LC-BsAb-002 hTIGIT 1.75E+06 2.59E-04 1.48E-10 100.3 727
cynoTIGIT 4.92E+05 6.43E-03 1.31E-08 112.9 726
mTIGIT / / / 0.1 726
hPVRIG 3.09E+05 5.87E-05 1.90E-10 106.6 557
cynoPVRIG 3.57E+04 1.31E-04 3.66E-09 109.7 659
mPVRIG / / / 0.1 579
LC-BsAb-006 hTIGIT 1.65E+06 2.14E-04 1.30E-10 99.4 696
cynoTIGIT 1.09E+06 1.84E-03 1.69E-09 108.0 695
mTIGIT / / / 0.9 695
hPVRIG 3.40E+05 5.01E-05 1.48E-10 103.6 538
cynoPVRIG 3.60E+04 1.42E-04 3.95E-09 109.8 631
mPVRIG / / / 0.2 1140
1.5 BIAcore檢測PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與人TIGIT及PVRIG蛋白的共結合
應用BIAcore表徵雙特異性抗體與兩抗原同時結合特性。首先用Protein A晶片捕獲抗體LC-BsAb-002和LC-BsAb-006，然後分別注射TIGIT和PVRIG his標簽蛋白，以及分別連續注射TIGIT和PVIRIG、PVRIG和TIGIT，記錄抗體和抗原的結合訊號，最後用Glycine pH1.5完成晶片再生，其中流動相為HBS-EP+ (10mM HEPES, 150mM NaCl, 3mM EDTA, 0.05% surfactant P20)，流速為30μL/min，與不同抗原結合時間均為300s，再生時間為30s，檢測溫度為25 °C，hTIGIT分析濃度為20 nM，hPVRIG分析濃度為50 nM。應用BIAcore 8K分析軟件（版本號2.0）對數據進行分析，記錄抗體捕獲水平Capture Level、不同抗原的結合訊號Binding Responses（RU），並根據抗原抗體分子量計算抗原抗體分子化學計量比，初步估計一個抗體分子可以結合幾個抗原。為了確認抗體LC-BsAb-002與抗原TIGIT&PVRIG的相互作用關係，開展了以下四步檢測：只結合hTIGIT單個抗原、只結合hPVRIG單個抗原、先結合hTIGIT後結合hPVRIG、先結合hPVRIG後結合hTIGIT，並且各抗原均達到飽和狀態。收集抗體抗原的結合曲線，記錄2個雙特異性抗體的捕獲水平、以及各試驗中TIGIT和PVIRIG的結合訊號，並以此計算了抗原抗體分子化學計量比，如表5所示，連續注射TIGIT和PVIRG產生的結合訊號，與單獨注射TIGIT和PVIRG產生的結合訊號幾乎一致；並且正反連續TIGIT和PVIRG產生的結合訊號也幾乎一致，這說明LC-BsAb-002和LC-BsAb-006可同時與hTIGIT和hPVRIG相結合，並且兩個抗原之間不存在互相影響；綜合考慮抗體和抗原的分子量、以及抗體的捕獲水平和抗原的結合水平，初步估算出TIGIT與LC-BsAb-002的化學計量比為1.76；TIGIT與LC-BsAb-006的化學計量比為1.86；PVIRIG與LC-BsAb-002的化學計量比為2.14，PVIRIG與LC-BsAb-006的化學計量比為2.18，兩抗原抗體化學計量比都接近於2，考慮到檢測方法帶來的誤差，我們推測一個LC-BsAb-002或一個LC-BsAb-006雙抗分子可以同時結合兩個TIGIT分子和兩個PVRIG分子。
表5 PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與TIGIT及PVRIG蛋白的BIAcore結合情況
Antibody Capture Level（RU） Antigen 01 Antigen 02
Name Binding Responses（RU） Antibody-Antigen Stoichiometry Name Binding Responses（RU） Antibody-Antigen Stoichiometry
LC-BsAb-002 673.6 TIGT 94.96 1.76 / / /
673.1 PVRIG 128.67 2.14 / / /
673.3 TIGT 94.87 1.76 PVRIG 121.11 2.02
673.7 PVRIG 128.79 2.15 TIGT 91.28 1.69
LC-BsAb-006 603.7 TIGT 89.83 1.86 / / /
602.9 PVRIG 117.08 2.18 / / /
603.4 TIGT 89.83 1.86 PVRIG 109.42 2.04
602.3 PVRIG 116.96 2.18 TIGT 83.88 1.74
1.6 PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的殺傷效果
PVRIG/TIGIT雙特異性抗體LC-BsAb-002和LC-BsAb-006能有效促進NK細胞對靶細胞WIDR的殺傷，也能顯示出對Treg細胞的濃度依賴性ADCC殺傷。
藉由將A375細胞接種於小鼠，待腫瘤生長到合適大小時，給藥PVRIG/TIGIT雙特異性抗體LC-BsAb-002和LC-BsAb-006，結果顯示雙特異性抗體對A375腫瘤生長有明顯抑制作用。
實施例2 pH/緩衝體系的篩選
研究方案 （1）設計12種不同的緩衝液處方F1-F12，候選處方的具體信息如表1所示。（2）藉由Millipore的超濾濃縮離心管，將實施例1獲得的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體LC-BsAb-002蛋白原液置換至F1-F12中，調整蛋白濃度至50 mg/mL。（3）藉由25℃和40℃加速穩定性試驗，綜合考察PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在12個候選處方中的穩定性，篩選出最優的pH/緩衝體系，用於下一步輔料開發。考察指標包括外觀、pH、蛋白濃度、動態光散射（DLS）、熱穩定性（DSF）、全柱成像毛細管等點聚焦電泳（iCIEF）、純度（分子排阻色譜法（SE-HPLC）、非還原十二烷基硫酸鈉毛細管電泳（CE-SDS（NR&R））和結合活性（ELISA-Binding）。考察方案詳見表6。
表6 pH/緩衝體系篩選處方和篩選考察方案
處方編號 緩衝體系，pH T0 25℃ 40℃
2W 4W 1W 2W 4W
F1 20mM 醋酸-醋酸鈉 4.5 X, Y, Z X X，Y X X X，Y
F2 5.0
F3 5.5
F4 20mM 枸櫞酸-枸櫞酸鈉 5.0
F5 5.5
F6 6.0
F7 20mM 組氨酸-鹽酸組氨酸 5.5
F8 6.0
F9 6.5
F10 20mM 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉 6.5
F11 7.0
F12 7.5
註： X=外觀，pH，蛋白濃度，DLS，iCIEF，SE-HPLC，CE-SDS(NR&R)； Y= ELISA-Binding； Z=DSF。 T0=考察起始點，W=周，下同。
篩選結果
pH/緩衝體系篩選主要結果匯總如下表7-表16所示：
表7 pH/緩衝體系篩選外觀檢測結果
處方編號 T0 25℃ 40℃
2W 4W 1W 2W 4W
F1 無色澄清， 無可見顆粒 無色澄清， 無可見顆粒 無色澄清， 無可見顆粒 無色澄清， 無可見顆粒 無色澄清， 無可見顆粒 無色澄清， 纖維狀顆粒
F2 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光 無可見顆粒 無色澄清， 無可見顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色澄清， 纖維狀顆粒
F3 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒 無色微乳光，少量纖維狀顆粒 無色微乳光， 纖維狀顆粒 無色微乳光， 纖維狀顆粒
F4 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒
F5 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒
F6 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒
F7 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光，少量纖維狀顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒
F8 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光，少量纖維狀顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒
F9 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光， 纖維狀顆粒 無色微乳光， 無可見顆粒 無色微乳光， 纖維狀顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒
F10 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒
F11 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒
F12 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，纖維狀顆粒 無色微乳光，纖維狀顆粒
表8 pH/緩衝體系篩選pH檢測結果
處方編號 T0 25℃ 40℃
2W 4W 1W 2W 4W
F1 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8 4.8
F2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2
F3 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6 5.6
F4 5.1 5.1 5.1 5.1 5.1 5.1
F5 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5
F6 5.9 5.9 6.0 5.9 5.9 5.9
F7 5.6 5.6 5.6 5.6 5.5 5.6
F8 6.1 6.1 6.1 6.1 6.0 6.2
F9 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5 6.5
F10 6.4 6.4 6.5 6.5 6.4 6.4
F11 6.9 6.9 6.9 6.9 6.9 6.9
F12 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3 7.3
表9 pH/緩衝體系篩選蛋白濃度（mg/mL）檢測結果
處方編號 T0 25℃ 40℃
2W 4W 1W 2W 4W
F1 50.1 50.2 50.3 50.4 50.1 50.3
F2 50.3 50.4 50.5 50.5 50.4 50.5
F3 51.0 50.9 50.9 51.2 51.2 51.1
F4 50.6 51.0 50.6 50.7 50.6 50.7
F5 50.1 50.3 50.1 50.2 49.3 50.2
F6 50.7 50.8 50.8 50.9 50.3 50.9
F7 49.6 49.7 49.7 50.0 49.8 49.9
F8 50.0 50.1 50.2 50.2 50.4 50.3
F9 50.2 50.3 50.4 50.3 50.3 50.3
F10 49.9 50.2 50.2 50.6 50.0 50.2
F11 49.8 50.0 49.9 50.4 50.1 50.0
F12 50.2 50.4 50.3 50.5 50.2 50.4
表10 pH/緩衝體系篩選DLS（直徑，nm）檢測結果
處方編號 T0 25℃ 40℃
2W 4W 1W 2W 4W
F1 6.2 5.7 5.7 6.2 5.9 7.4
F2 9.4 9.0 9.2 9.8 9.1 10.1
F3 12.1 12.3 12.3 13.5 12.5 13.9
F4 22.6 23.8 24.4 24.8 23.1 27.8
F5 23.3 23.3 27.6 29.7 25.4 27.6
F6 23.2 23.6 27.9 30.2 22.7 27.2
F7 12.6 11.9 13.4 14.3 12.3 13.3
F8 13.8 13.8 14.1 15.5 13.7 16.5
F9 15.7 15.9 16.1 16.1 15.8 18.9
F10 22.7 22.9 23.5 23.5 22.1 27.7
F11 20.8 23.5 24.7 24.0 22.7 27.7
F12 19.8 22.1 22.1 22.5 20.9 23.8
表11 pH/緩衝體系篩選T0取樣點DSF（℃）檢測結果
處方編號 T0
熔融溫度1(Tm1) 熔融溫度2(Tm2)
F1 68.6 78.3
F2 68.8 77.9
F3 68.9 77.9
F4 68.1 78.4
F5 68.3 78.3
F6 68.6 78.3
F7 68.9 78.9
F8 69.0 78.1
F9 68.9 77.9
F10 69.1 78.2
F11 69.0 78.1
F12 69.1 78.0
表12 pH/緩衝體系篩選iCIEF（%）檢測結果
處方編號 T0 25℃ 40℃
2W 4W 1W 2W 4W
MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP
F1 53.2 43.1 3.8 54.4 37.6 7.9 49.4 39.7 10.9 39.9 44.5 15.6 30.7 50.7 18.5 18.0 53.8 28.2
F2 53.2 42.6 4.3 55 38.2 6.8 49.9 41.1 9.0 42.8 43.5 13.8 33.3 50.7 15.9 23.6 54.1 22.3
F3 53 43.1 3.9 56.3 37.8 6 51.3 40.7 7.9 46.4 43.2 10.5 36 49.1 14.8 25.8 53.6 20.5
F4 52.5 43.5 4.1 54.4 38.7 6.8 47.1 42.6 10.1 38.6 48.3 13.1 33.5 49.6 16.7 19.9 57.4 22.7
F5 52.5 43.4 4.1 52.9 40.9 6.3 50.5 41.3 8.3 41.5 46.6 11.8 37.8 46.9 15.2 26.0 55.3 18.8
F6 51.6 43.5 4.9 54.7 40.4 5 51.5 41.5 7.2 45.5 45 9.5 38.4 49.3 12.4 26.4 56.1 17.6
F7 53.3 42.5 4.3 51.5 42.8 5.7 51.3 40.9 7.8 44.9 42.7 12.4 35.1 49.4 15.4 27.2 52.3 20.3
F8 53.8 42.5 3.7 48.5 47.2 4.4 52.1 41.4 6.6 46.1 43.5 10.5 38.7 48.4 13 36.5 45.1 18.5
F9 53.5 42.3 4.2 47.4 47.8 4.6 52.2 42.3 5.5 47.1 44.5 8.4 38.6 52 9.6 34.2 51.8 14.0
F10 54.2 42.7 3 55.4 40 4.7 51.2 42.7 6.1 45.9 46 8.1 37.5 52.2 10.3 37.3 49.4 13.4
F11 55.3 41 3.6 50 45.5 4.6 50.4 44.0 5.6 42.6 49.5 7.8 35.6 56.1 8.1 29.7 58.6 11.7
F12 51.9 44.4 3.6 52.9 42.4 4.8 46.9 46.7 6.4 37.3 54.5 8.2 35.7 56.5 7.8 15.5 71.3 13.2
註：MP: Main Peak，主峰；AP: Acidic Peak，酸性峰；BP: Basic Peak，鹼性峰
表13 pH/緩衝體系篩選SE-HPLC（%）檢測結果
處方編號 T0 25℃ 40℃
2W 4W 1W 2W 4W
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F1 98 2 ND 97.9 1.9 0.2 97.8 1.7 0.5 97.4 2.2 0.4 94.6 2.8 2.6 93.0 3.64 3.3
F2 97.9 2.1 ND 97.6 2.2 0.2 97.5 2.3 0.2 96.7 2.9 0.3 93.8 3.9 2.3 92.3 5.06 2.6
F3 97.7 2.3 ND 97.4 2.6 ND 96.9 2.8 0.4 96 3.7 0.3 92.8 5 2.2 92.2 5.57 2.3
F4 97.5 2.5 ND 97 2.8 0.2 96.6 2.8 0.6 95.4 4.2 0.4 91.5 6 2.5 89.4 7.2 3.4
F5 97.4 2.6 ND 96.8 3 0.1 96.4 3.3 0.4 95.3 4.4 0.3 91.5 6.5 2 90.3 7.3 2.4
F6 97.4 2.6 ND 96.4 3.5 0.1 95.8 3.9 0.3 95 4.7 0.2 91.6 6.7 1.8 90.9 6.91 2.3
F7 97.9 2.1 ND 97.5 2.4 0.2 97.6 2.4 0 96.6 3.1 0.3 93.8 4.1 2.1 92.4 5.2 2.4
F8 97.7 2.3 ND 97.2 2.8 ND 96.6 3.1 0.3 96 3.8 0.2 93.2 4.9 1.9 92.6 5.35 2.1
F9 97.5 2.5 ND 96.6 3.3 0.1 95.9 3.7 0.4 95.3 4.5 0.2 92.6 5.4 1.9 92.0 5.78 2.2
F10 96.9 3.1 ND 95.7 4.2 0.1 94.8 4.9 0.3 93.9 5.8 0.2 92.7 6.8 0.5 90.2 7.5 2.3
F11 96.7 3.3 ND 95.2 4.7 0.1 94.3 5.3 0.5 94.1 5.6 0.2 92.8 6.5 0.6 90.3 6.9 2.8
F12 96.6 3.4 ND 95.3 4.6 0.1 94.1 5.5 0.4 94.3 5.4 0.3 93.1 6 0.9 89.6 6.2 4.2
註：MP: Main Peak，主峰HMW: High Molecular Weight，高聚體；LMW: Low Molecular Weight，低聚體；ND: Not Detected，未檢測到
表14 pH/緩衝體系篩選CE-SDS-NR（%）檢測結果
處方編號 T0 25℃ 40℃
2W 4W 1W 2W 4W
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F1 98.2 ND 1.8 97.4 ND 2.6 97.5 ND 2.5 97.6 ND 2.4 94.9 ND 5.1 91.3 ND 8.7
F2 97.8 ND 2.2 97.9 ND 2.1 97.0 ND 3.0 97.1 ND 2.9 96.3 ND 3.7 93.3 ND 6.8
F3 97.9 ND 2.1 97.4 ND 2.6 96.7 ND 3.3 96.5 ND 3.5 96.8 ND 3.2 92.7 ND 7.3
F4 97.9 ND 2.1 97.6 ND 2.4 95.9 ND 4.1 97.5 ND 2.5 95.0 ND 5.0 91.2 ND 8.8
F5 98.2 ND 1.8 97.8 ND 2.2 96.3 ND 3.7 97.3 ND 2.7 96.7 ND 3.3 92.1 ND 7.9
F6 98.0 ND 2.0 97.9 ND 2.1 96.3 ND 3.7 96.8 ND 3.2 96.7 ND 3.3 91.8 ND 8.3
F7 97.4 ND 2.6 97.9 ND 2.1 96.5 ND 3.6 97.0 ND 3.0 96.2 ND 3.8 92.9 ND 7.1
F8 97.9 ND 2.1 97.6 ND 2.4 96.2 ND 3.8 97.0 ND 3.0 97.1 ND 2.9 92.4 ND 7.6
F9 97.8 ND 2.2 97.9 ND 2.1 96.1 ND 3.9 97.1 ND 2.9 96.9 ND 3.1 91.2 ND 8.8
F10 98.4 ND 1.6 97.8 ND 2.2 96.1 ND 3.9 97.0 ND 3.0 96.2 ND 3.8 90.3 ND 9.7
F11 96.7 ND 3.3 97.8 ND 2.2 95.2 ND 4.8 96.1 ND 3.9 95.4 ND 4.6 87.0 ND 13.0
F12 97.5 ND 2.5 98.3 ND 1.7 94.7 ND 5.3 93.9 ND 6.1 94.2 ND 5.8 82.8 ND 17.2
註：MP: Main Peak，主峰；HMW: High Molecular Weight，高聚體；LMW: Low Molecular Weight，低聚體；ND: Not Detected，未檢測到
表15 pH/緩衝體系篩選CE-SDS-R（%）檢測結果
處方編號 T0 25℃ 40℃
1W 2W 1W 2W 4W
LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other
F1 97.6 2.4 97.5 2.5 96.9 3.1 97.2 2.8 94.9 5.1 92.9 7.1
F2 98.0 2.0 97.6 2.5 96.8 3.2 97 3 95.7 4.3 93.6 6.4
F3 97.8 2.2 97.6 2.4 97.2 2.8 97.2 2.8 95.4 4.6 94.4 5.6
F4 98.1 2.0 97.4 2.7 96.8 3.2 96.5 3.5 95.2 4.9 92.2 7.8
F5 98.0 2.0 97.5 2.5 97.2 2.8 97.2 2.8 96.2 3.8 93.6 6.4
F6 98.1 1.9 97.7 2.3 97.2 2.8 95.3 4.8 96.7 3.3 93.8 6.2
F7 98.7 1.3 97.6 2.4 97.1 2.9 97.2 2.9 96.0 4.0 94.0 6.0
F8 97.7 2.3 97.3 2.7 97.1 2.9 97.0 3.1 96.0 4.0 95.3 4.7
F9 98.6 1.4 97.4 2.6 97.3 2.7 96.5 3.5 95.8 4.2 94.9 5.1
F10 98.0 2.0 97.3 2.7 97.2 2.8 94.9 5.1 94.9 5.1 93.4 6.6
F11 98.1 1.9 97.0 3.0 97.2 2.9 94.2 5.8 93.8 6.2 91.4 8.6
F12 98.0 2.0 97.0 3.0 96.3 3.7 92.8 7.2 91.8 8.3 87.0 13.0
註：LC+HC: 輕鏈+重鏈；Other: 其它
表16 pH/緩衝體系篩選ELISA-Binding（%）檢測結果
處方編號 T0 25℃-4W 40℃-4W
F1 98 119 90
F2 111 111 87
F3 105 108 98
F4 98 123 85
F5 89 96 93
F6 100 101 99
F7 95 113 121
F8 90 117 110
F9 89 104 116
F10 89 97 85
F11 108 98 105
F12 107 103 103
結果分析 （1）外觀：醋酸體系的外觀性狀優於組氨酸、檸檬酸和磷酸緩衝液體系。 （2）pH值：所有緩衝體系的pH值在整個考察期間無明顯變化。 （3）蛋白濃度：所有緩衝體系的蛋白濃度在整個考察期間無明顯變化。 （4）熱穩定性DSF：所有緩衝體系在T0點Tm值無明顯差異。 （5）DLS：醋酸緩衝液體系的粒徑小於其它緩衝體系，其中F1 ＜ F2 ＜ F3。 （6）iCIEF：組氨酸緩衝液體系和醋酸緩衝液體系電荷異構體主峰明顯優於檸檬酸和磷酸體系。 （7）SE-HPLC：醋酸和組氨酸緩衝液體系單體純度無明顯差異。當樣品在40℃下儲存4W時，檸檬酸和磷酸體系單體純度明顯低於醋酸和組氨酸緩衝液體系。 （8）CE-SDS（NR）：當樣品在40℃下儲存4W時，F2處方的單體主峰比例最高，其蛋白純度最高。 （9）CE-SDS（R）：比較單體主峰的比例，醋酸和組氨酸緩衝液體系蛋白純度優於檸檬酸和磷酸體系，而醋酸和組氨酸緩衝液體系則無明顯差異。 （10）ELISA-Binding：所有緩衝體系的結合活性無明顯差異（註：ELISA的正常波動範圍為70~130）。
總結：藉由對12個候選處方各檢測指標的綜合評估發現，醋酸和組氨酸緩衝液體系檢測指標明顯優於檸檬酸和磷酸體系。而醋酸緩衝液體系在DLS、CE-SDS（R）等指標中略優於組氨酸緩衝液體系，其中F2處方（20 mM醋酸-醋酸鈉，pH5.0）與其它處方相比，在外觀、粒徑和純度方面均表現良好，穩定性略顯優異。因此，選擇F2處方用於後續的輔料篩選。
實施例3 輔料的篩選
研究方案 （1）在實施例2篩選得到的最優pH/緩衝體系（20mM 醋酸-醋酸鈉 pH 5.0）基礎上，設計加入6種不同的輔料，候選處方的具體信息如表12所示。 （2）藉由穩定性實驗，振搖實驗和凍融實驗綜合考察PVRIG/TIGIT雙特異性抗體LC-BsAb-002（蛋白濃度50 mg/mL）在6個候選處方中的穩定性，篩選出最優的輔料，用於下一步表面活性劑開發。考察指標包括：外觀、pH、蛋白濃度、動態光散射（DLS）、熱穩定性（DSF）、滲透壓、iCIEF、SE-HPLC、CE-SDS（NR&R）和結合活性（ELISA-Binding）。考察方案詳見表17。
表17 輔料篩選處方和篩選考察方案
處方編號 處方組成 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T a
pH/緩衝體系 輔料 4W 3M 2W 4W 3M 1W 2W 4W 1D 3D 3C 5C
F2-1 20mM 醋酸-醋酸鈉 pH 5.0; 0.04% PS80 2%甘氨酸* X, Y, Z X,Y X,Y X X,Y X,Y X X X,Y X X,Y X X,Y
F2-2 140 mM精氨酸鹽酸
F2-3 140 mM氯化鈉
F2-4 8%蔗糖*
F2-5 8%海藻糖*
F2-6 4.5%山梨醇*
註： X=外觀，pH，蛋白濃度，DLS，iCIEF，SE-HPLC，CE-SDS(NR&R)； Y= ELISA-Binding，不溶性微粒（MFI）； Z=DSF，滲透壓。 *表格中所有%均指%（w/v）。 aF/T：Freeze/Thaw，凍融。M=月，D=天，C=輪，下同。
篩選結果
輔料篩選主要結果匯總如下表18-表32所示：
表18 輔料篩選外觀檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 3M 2W 4W 3M 1W 2W 4W 1D 3D 3C 5C
F2-1 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒
F2-2 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒
F2-3 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒 無色乳光重，無可見顆粒
F2-4 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒
F2-5 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒
F2-6 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒 無色澄清，無可見顆粒
表19 輔料篩選pH檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 3M 2W 4W 3M 1W 2W 4W 1D 3D 3C 5C
F2-1 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2
F2-2 5.1 5.1 5.1 5.1 5.1 5.2 5.1 5.2 5.1 5.2 5.2 5.1 5.1
F2-3 5.2 5.1 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2
F2-4 5.2 5.2 5.2 5.1 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.1 5.2
F2-5 5.2 5.2 5.1 5.1 5.2 5.2 5.1 5.2 5.2 5.2 5.2 5.1 5.2
F2-6 5.1 5.1 5.2 5.1 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.1 5.2
表20 輔料篩選蛋白濃度（mg/mL）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 3M 2W 4W 3M 1W 2W 4W 1D 3D 3C 5C
F2-1 50.4 50.4 50.7 50.4 50.6 50.4 50.4 50.6 50.5 50.4 50.3 50.5 50.3
F2-2 50.6 50.5 50.5 50.6 50.6 50.8 50.7 50.6 50.6 50.5 50.8 50.7 50.6
F2-3 49.9 50.3 50.4 50.7 50.3 50.3 50.3 50.4 50.3 50.3 50.4 50.5 50.3
F2-4 51.7 52.0 52.4 51.9 52.0 51.8 51.8 51.9 51.9 51.6 51.7 51.7 51.7
F2-5 51.4 51.7 51.5 51.9 51.5 51.6 51.5 52.0 51.6 51.3 51.4 51.5 51.6
F2-6 50.7 50.7 50.7 50.8 51.0 50.7 50.6 50.8 50.9 50.5 50.4 50.6 50.5
表21 輔料篩選DLS（直徑，nm）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 3M 2W 4W 3M 1W 2W 4W 1D 3D 3C 5C
F2-1 8.4 8.1 8.0 8.2 8.2 8.0 8.3 8.5 9.5 7.7 8.2 9.5 8.9
F2-2 18.1 16.6 16.3 17.5 16.8 17.0 17.5 18.5 16.3 16.1 18.3 17.8 17.1
F2-3 23.9 21.1 20.8 23.1 21.3 21.7 23.0 25.2 23.2 23.1 24.2 23.6 22.9
F2-4 9.2 9.5 9.5 9.4 9.4 9.5 9.6 10.0 9.8 9.5 9.9 9.6 9.3
F2-5 9.9 9.1 9.1 9.3 8.7 9.4 8.8 9.9 9.8 9.4 9.8 9.4 9.3
F2-6 9.0 8.4 8.3 8.6 7.9 8.1 8.1 8.5 9.0 8.8 9.1 8.6 8.5
表22 輔料篩選不溶性微粒（MFI，個微粒/mL）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 3M 4W 3M 4W 3D 5C
≥10* ≥25* ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25
F2-1 2 0 21 0 59 0 75 3 25 3 64 5 128 16 35 0
F2-2 4 0 35 7 -- -- 37 0 30 7 7 0 10 0 0 0
F2-3 2 0 89 5 19 3 162 19 44 5 148 10 14 0 50 7
F2-4 13 4 16 0 -- -- 35 5 3 0 10 0 10 3 7 0
F2-5 88 0 5 0 -- -- 19 0 16 3 7 0 21 0 10 0
F2-6 51 2 59 5 10 5 32 3 16 10 10 0 7 0 87 7
≥10：直徑≥10 µm的粒子；≥25：直徑≥25µm的粒子.
表23 輔料篩選T0取樣點DSF（℃）和滲透壓（mOsm/kg）檢測結果
處方編號 T0 滲透壓
Tm1 Tm2
F2-1 68.9 78.1 0.321
F2-2 68.8 77.7 0.295
F2-3 68.8 77.7 0.315
F2-4 68.6 77.5 0.331
F2-5 69.1 78.0 0.305
F2-6 68.9 78.0 0.321
表24 輔料篩選2~8℃和25℃穩定性實驗iCIEF（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃
4W 3M 2W 4W 3M
MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP
F2-1 58.9 36.6 4.5 58.2 36.3 5.7 58.9 34.8 6.3 54.7 37.5 7.8 52.9 37.1 10 40.4 44.7 14.9
F2-2 64.1 32.1 3.7 58.2 36.1 5.8 57.2 36.0 6.9 55.6 36.8 7.6 54.7 34 11.3 45.4 35.5 19.1
F2-3 61.4 34.7 3.9 59.2 35.5 5.5 57.4 35.8 6.7 54.9 37.5 7.7 53.4 35.3 11.3 45.5 36.0 18.6
F2-4 58.4 36.2 5.5 58.1 36.5 5.5 57.1 36.2 6.6 54.4 37.4 8.3 52.4 36.7 10.8 45.1 37.7 17.3
F2-5 55.8 39.3 4.9 58 36.4 5.7 57.2 36.2 6.7 54.1 38.2 7.7 52.4 36.8 10.8 45.8 37.6 16.6
F2-6 57.1 37.9 5 58.3 35.9 5.8 58.7 34.9 6.4 54.2 37.5 8.3 54 35 10.9 44.9 37.7 17.3
表25 輔料篩選40℃穩定性實驗、振搖實驗和凍融實驗iCIEF（%）檢測結果
處方編號 T0 40℃
1W 2W 4W
MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP
F2-1 58.9 36.6 4.5 49 38.5 12.6 36.1 47.1 16.7 22.5 53 24.5
F2-2 64.1 32.1 3.7 51.2 34.8 14.1 38.2 40.9 21 28 41.5 30.4
F2-3 61.4 34.7 3.9 51.7 34.2 14.1 36.7 41.1 22.2 27.7 42.6 29.8
F2-4 58.4 36.2 5.5 49.6 36.6 13.7 37.6 44.2 18.4 27.5 45.8 26.6
F2-5 55.8 39.3 4.9 50.7 36.1 13.3 38.2 43.8 18 27.6 45.8 26.6
F2-6 57.1 37.9 5 50.7 36.4 12.9 38 43.9 18.2 27.9 45.3 26.8
表25續
處方編號 T0 Agitation F/T
1D 3D 3C 5C
MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP
F2-1 58.9 36.6 4.5 52 42.9 5.3 53.9 41.1 5.1 60.2 34.9 4.8 58.9 36.7 4.5
F2-2 64.1 32.1 3.7 61.5 32.9 5.6 54.8 39.2 5.6 58.7 35.9 5.3 60 34.7 5.2
F2-3 61.4 34.7 3.9 59.4 35 5.6 59.3 36.7 4 59.9 35 5.2 60.8 34.7 4.4
F2-4 58.4 36.2 5.5 59.1 35.5 5.4 53.7 41.1 5.1 60.1 35.3 4.7 60.2 34.7 5
F2-5 55.8 39.3 4.9 51.2 44.2 4.6 55.9 38.9 5.2 60.5 34.6 5 60.2 34.8 4.9
F2-6 57.1 37.9 5 58.5 36.2 5.2 54.8 40 5.2 60.7 34.4 5 60.3 34.9 4.9
註：MP: Main Peak，主峰；AP: Acidic Peak，酸性峰；BP: Basic Peak，鹼性峰
表26 輔料篩選2~8℃和25℃穩定性實驗SE-HPLC（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃
4W 3M 2W 4W 3M
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-1 98.7 1.3 ND 98.9 1.1 ND 98.6 1.4 ND 98.7 1.3 ND 98.3 1.6 0.1 95.2 2.9 1.9
F2-2 98.7 1.3 ND 98.9 1.1 ND 98.6 1.4 ND 98.8 1.2 ND 98.3 1.5 0.2 95.3 2.9 1.8
F2-3 98 2 ND 98.5 1.5 ND 97.9 2.1 ND 98.2 1.8 ND 97.7 2.2 0.2 94.2 4 1.8
F2-4 98.7 1.3 ND 98.8 1.2 ND 98.6 1.4 ND 98.8 1.2 ND 98.4 1.5 0.1 96 2.3 1.7
F2-5 98.6 1.4 ND 98.9 1.1 ND 98.6 1.4 ND 98.8 1.2 ND 98.4 1.5 0.1 96.2 2.2 1.6
F2-6 98.7 1.3 ND 98.9 1.1 ND 98.6 1.4 ND 98.8 1.2 ND 98.4 1.5 0.1 96.1 2.2 1.7
表27 輔料篩選40℃穩定性實驗、振搖實驗和凍融實驗SE-HPLC（%）檢測結果
處方編號 T0 40℃
1W 2W 4W
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-1 98.7 1.3 ND 96.7 3.1 0.2 96.9 3 0.2 92 5 2.9
F2-2 98.7 1.3 ND 97.5 2.3 0.2 95.9 3.8 0.3 90.7 6 3.2
F2-3 98 2 ND 96.8 3 0.2 95.1 4.6 0.3 89.2 7.4 3.4
F2-4 98.7 1.3 ND 98.1 1.7 0.2 97.7 2.2 0.2 93.9 3.5 2.6
F2-5 98.6 1.4 ND 98.1 1.7 0.2 97.6 2.2 0.2 94.1 3.3 2.5
F2-6 98.7 1.3 ND 98 1.8 0.2 97.6 2.3 0.2 93.9 3.5 2.6
表27續
處方編號 T0 Agitation F/T
1D 3D 3C 5C
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-1 98.7 1.3 ND 97.5 2.4 0.1 98.7 1.3 0 95.1 4.8 ND 94.1 5.9 ND
F2-2 98.7 1.3 ND 98.6 1.3 0.1 97.4 2.6 0 98.6 1.4 ND 98.6 1.4 ND
F2-3 98 2 ND 98.7 1.3 0 98.3 1.7 0 98.3 1.7 ND 98.2 1.8 ND
F2-4 98.7 1.3 ND 98.7 1.3 0 98.6 1.3 0 98.7 1.3 ND 98.6 1.4 0
F2-5 98.6 1.4 ND 98.6 1.3 0 98.5 1.4 0 98.7 1.3 ND 98.6 1.4 ND
F2-6 98.7 1.3 ND 98.4 1.6 0 98.6 1.4 0 98.7 1.3 ND 98.5 1.4 0.1
註：MP: Main Peak，主峰；HMW: High Molecular Weight，高聚體；LMW: Low Molecular Weight，低聚體；ND: Not Detected，未檢測到
表28 輔料篩選2~8℃和25℃穩定性實驗CE-SDS-NR（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃
4W 3M 2W 4W 3M
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-1 96.8 ND 3.1 96.2 ND 3.8 95.0 ND 5.0 96.9 ND 3.1 96.1 ND 3.9 94.2 ND 5.8
F2-2 95.3 ND 4.7 96.4 ND 3.6 95.2 ND 4.8 96.8 ND 3.2 96.1 ND 4.0 94.6 ND 5.5
F2-3 94.4 ND 5.7 96.2 ND 3.8 95.6 ND 4.4 97.1 ND 3.0 95.9 ND 4.2 95.4 ND 4.6
F2-4 97.0 ND 3.0 95.4 ND 4.6 95.7 ND 4.3 95.2 ND 4.8 95.8 ND 4.2 94.5 ND 5.5
F2-5 96.7 ND 3.3 96.0 ND 4.0 95.8 ND 4.2 96.1 ND 3.9 96.3 ND 3.7 95.1 ND 4.9
F2-6 96.3 ND 3.7 96.3 ND 3.7 96.1 ND 3.9 96.3 ND 3.7 96.9 ND 3.1 95.0 ND 5.0
表29 輔料篩選40℃穩定性實驗、振搖實驗和凍融實驗CE-SDS-NR（%）檢測結果
處方編號 T0 40℃
1W 2W 4W
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-1 96.8 ND 3.1 95.5 ND 4.5 95.1 ND 4.9 93.2 ND 6.8
F2-2 95.3 ND 4.7 95.2 ND 4.8 95.9 ND 4.2 93.1 ND 6.9
F2-3 94.4 ND 5.7 95.4 ND 4.6 95.5 ND 4.5 93.8 ND 6.2
F2-4 97.0 ND 3.0 96.4 ND 3.6 95.3 ND 4.7 94.4 ND 5.7
F2-5 96.7 ND 3.3 96.0 ND 4.1 94.9 ND 5.1 93.4 ND 6.6
F2-6 96.3 ND 3.7 96.2 ND 3.8 95.7 ND 4.3 94.2 ND 5.8
表29續
處方編號 T0 Agitation F/T
1D 3D 3C 5C
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-1 96.8 ND 3.1 93.7 ND 6.4 97.3 ND 2.7 95.8 ND 4.3 95.8 ND 4.2
F2-2 95.3 ND 4.7 94.1 ND 5.9 97.0 ND 2.9 94.9 0 5.1 95.9 ND 4.1
F2-3 94.4 ND 5.7 95.3 ND 4.7 96.6 ND 3.4 95.7 ND 4.3 96.0 ND 4.0
F2-4 97.0 ND 3.0 97.1 ND 2.9 96.6 ND 3.4 95.8 ND 4.2 96.0 ND 4.0
F2-5 96.7 ND 3.3 96.6 ND 3.4 96.1 ND 3.9 96.5 ND 3.5 96.6 ND 3.5
F2-6 96.3 ND 3.7 95.2 ND 4.8 96.8 ND 3.2 96.4 ND 3.6 96.2 ND 3.9
註：MP: Main Peak，主峰；HMW: High Molecular Weight，高聚體；LMW: Low Molecular Weight，低聚體；ND: Not Detected，未檢測到
表30 輔料篩選2~8℃和25℃穩定性實驗CE-SDS-R（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃
4W 3M 2W 4W 3M
LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other
F2-1 99.4 0.7 98.8 1.2 98.5 1.5 98.7 1.3 98.3 1.7 97.5 2.5
F2-2 99.6 0.4 98.8 1.3 98.4 1.6 99.0 1.0 98.7 1.4 97.6 2.4
F2-3 99.5 0.5 98.3 1.7 98.5 1.5 98.9 1.1 98.6 1.4 97.4 2.6
F2-4 98.2 1.8 98.1 2.0 98.0 2.0 98.1 1.9 97.3 2.7 96.4 3.6
F2-5 97.9 2.1 97.9 2.1 97.2 2.8 97.6 2.4 95.2 4.8 95.8 4.2
F2-6 97.6 2.4 97.5 2.5 96.8 3.2 97.6 2.4 96.9 3.1 95.6 4.4
表31 輔料篩選40℃穩定性實驗、振搖實驗和凍融實驗CE-SDS-R（%）檢測結果
處方編號 T0 40℃
1W 2W 4W
LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other
F2-1 99.4 0.7 98.8 1.2 98.4 1.6 96.0 4.0
F2-2 99.6 0.4 99.0 1.0 98.1 1.9 96.6 3.4
F2-3 99.5 0.5 99.0 1.0 98.8 1.2 96.6 3.4
F2-4 98.2 1.8 97.5 2.5 97.0 3.0 97.0 3.1
F2-5 97.9 2.1 97.1 2.9 96.8 3.2 94.2 5.8
F2-6 97.6 2.4 97.4 2.6 96.7 3.3 94.9 5.1
表31續
處方編號 T0 Agitation F/T
1D 3D 3C 5C
LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other LC+HC Other
F2-1 99.4 0.7 99.4 0.7 99.3 0.7 99.3 0.7 99.3 0.7
F2-2 99.6 0.4 99.4 0.6 99.2 0.8 99.1 0.9 99.3 0.7
F2-3 99.5 0.5 99.3 0.7 99.0 1.0 99.3 0.7 99.3 0.7
F2-4 98.2 1.8 98.0 2.0 98.0 2.0 97.4 2.6 97.3 2.7
F2-5 97.9 2.1 97.4 2.7 97.3 2.7 97.5 2.5 96.5 3.5
F2-6 97.6 2.4 97.5 2.5 97.5 2.5 97.5 2.5 96.9 3.1
註：LC+HC: 輕鏈+重鏈；Other: 其它
表32 輔料篩選ELISA-Binding（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 3M 4W 3M 4W 3D 5C
F2-1 96.8 89.7 88.4 108.2 87.5 90.0 98.2 85.7
F2-2 105.8 92.9 87.2 110.7 86.2 80.1 101.9 87.9
F2-3 100.1 88.2 106.2 102.3 95.8 85.4 110.9 91.6
F2-4 98.8 93.8 97.8 106.4 85.5 93.8 95.9 90.3
F2-5 101.8 94.9 87.5 91.2 88.0 86.9 99.7 94.6
F2-6 108.4 108.6 97.6 101.8 88.5 90.2 105.4 97.2
結果分析 （1）外觀：精氨酸（F2-2）和氯化鈉（F2-3）輔料配製處方的外觀性狀明顯差於其它輔料配製處方，而甘氨酸（F2-1）、蔗糖（F2-4）、海藻糖（F2-5）、山梨醇（F2-6）的外觀性狀則無明顯差異。 （2）pH值：所有候選處方的pH值在整個考察期間無明顯差異。 （3）蛋白濃度：所有候選處方的蛋白濃度在整個考察期間無明顯變化。 （4）熱穩定性DSF：所有候選處方在T0點Tm值無明顯差異。 （5）DLS：精氨酸（F2-2）和氯化鈉（F2-3）輔料配製處方的粒徑大於其它輔料配製處方，而甘氨酸（F2-1）、蔗糖（F2-4）、海藻糖（F2-5）、山梨醇（F2-6）的粒徑則無明顯差異。 （6）不溶性微粒：蔗糖（F2-4）配製處方在控制不溶性微粒的產生方面表現略優於其它輔料配製處方。 （7）iCIEF：綜合所有考察條件，甘氨酸（F2-1）輔料配製處方電荷異構體主峰最低（例如40℃下儲存4W，25℃下儲存4W時），其他輔料配製處方則無明顯差異。 （8）SE-HPLC：蔗糖（F2-4）、海藻糖（F2-5）和山梨醇（F2-6）輔料配製處方單體純度無明顯差異。在高溫下進行長時間儲存時，F2-4至F2-6處方單體純度明顯高於F2-1至F2-3處方。 （9）CE-SDS（NR）：所有候選處方蛋白純度無明顯差異。 （10）CE-SDS（R）：當樣品在室溫或高溫下長時間貯存，蔗糖（F2-4）輔料配製處方表現略為優異，而振搖實驗和凍融實驗F2-1-F2-3表現略為優異。 （11）ELISA-Binding：所有候選處方的結合活性無明顯差異。
總結：藉由對6個候選處方各檢測指標的綜合評估，F2-4處方（20 mM醋酸-醋酸鈉，pH5.0；0.04%（w/v）PS80；8%（w/v）蔗糖）與其它處方相比，在外觀、粒徑和純度方面均表現良好，在室溫或高溫長期儲存的穩定性方面略顯優異。因此，選擇F2-4處方用於後續的表面活性劑強度篩選。
實施例4 表面活性劑強度篩選
研究方案
（1）在實施例2和3篩選得到的最優pH/緩衝體系和輔料（20mM 醋酸-醋酸鈉 pH 5.0；8%（w/v）蔗糖）基礎上，設計加入3種不同濃度的表面活性劑（聚山梨酯80，PS80），候選處方的具體信息如表28所示。（2）藉由穩定性實驗，振搖實驗和凍融實驗綜合考察PVRIG/TIGIT雙特異性抗體LC-BsAb-002（蛋白濃度50 mg/mL）在3個候選處方中的穩定性，篩選出最優的表面活性劑強度。考察指標包括：外觀、pH、蛋白濃度、動態光散射（DLS）、陽離子交換色譜（CEX）、SE-HPLC、CE-SDS（NR）和結合活性（ELISA-Binding）。考察方案詳見表33。
表33 表面活性劑強度篩選處方和篩選考察方案
處方編號 處方組成 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
pH/緩衝體系/輔料 PS80 (w/v) 4W 2M 6M 4W 2M 6M 1W 2W 4W 4D 7D 3C 5C
F2-4-1 20mM醋酸-醋酸鈉pH 5.0; 8%蔗糖 0.02% X,Y X, Y X, Y X, Y X, Y X, Y X, Y X, Y X, Y X, Y X X,Y X X, Y
F2-4-2 0.04%
F2-4-3 0.06%
註： X=外觀，pH，蛋白濃度，DLS，iCIEF，SE-HPLC，CE-SDS(NR)； Y= ELISA-Binding，不溶性微粒（MFI）。
篩選結果
表面活性劑強度篩選主要結果匯總如下表34-表45所示：
表34 表面活性劑強度篩選外觀檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 2M 6M 4W 2M 6M 1W 2W 4W 4D 7D 3C 5C
F2-4-1 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒
F2-4-2 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒
F2-4-3 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒 無色微乳光，無可見顆粒
表35 表面活性劑強度篩選pH檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 2M 6M 4W 2M 6M 1W 2W 4W 4D 7D 3C 5C
F2-4-1 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2
F2-4-2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2
F2-4-3 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2
表36 表面活性劑強度篩選蛋白濃度（mg/mL）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 2M 6M 4W 2M 6M 1W 2W 4W 4D 7D 3C 5C
F2-4-1 50.5 50.3 50.5 50.4 50.6 50.7 51.2 50.3 51.1 50.5 50.4 50.2 50.6 50.8
F2-4-2 50.4 50.5 50.3 50.6 50.6 50.6 51.0 50.5 50.7 50.4 50.5 50.2 50.5 50.5
F2-4-3 50.4 50.5 50.5 50.5 50.3 50.7 50.7 50.4 50.4 50.6 50.5 50.4 50.6 50.3
表37 表面活性劑強度篩選DLS（粒徑，nm）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 2M 6M 4W 2M 6M 1W 2W 4W 4D 7D 3C 5C
F2-4-1 9.9 10.0 10.2 10.5 9.6 10.1 10.6 9.2 10.5 10.6 9.9 9.7 9.8 9.8
F2-4-2 9.8 9.9 10.1 10.6 9.7 9.9 10.7 9.2 10.4 10.4 9.6 9.8 10.2 9.6
F2-4-3 10.1 9.9 10.5 10.3 9.9 9.9 10.7 9.3 10.4 10.2 9.5 9.9 10.1 9.9
表38 表面活性劑強度篩選不溶性微粒（MFI，個微粒/mL）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃
4W 2M 6M 4W 2M 6M
≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25
F2-4-1 10 0 16 7 71 5 105 5 5 0 57 0 261 5
F2-4-2 7 5 3 0 46 7 373 5 0 0 57 14 44 0
F2-4-3 7 5 0 0 316 41 159 0 0 0 12 0 75 3
表38 續
處方編號 T0 40℃ Agitation F/T
1W 2W 4W 7D 5C
≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25 ≥10 ≥25
F2-4-1 10 0 3 0 78 3 10 0 3 3 3 0
F2-4-2 7 5 3 0 25 0 0 0 12 3 21 3
F2-4-3 7 5 5 0 7 3 5 0 7 0 3 3
表39 表面活性劑強度篩選2~8℃和25℃穩定性實驗CEX（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃
4W 2M 6M
MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP
F2-4-1 63.1 26.4 10.5 63.5 26.3 10.2 65 25.6 9.4 61.9 26.9 11.2
F2-4-2 63.3 26.3 10.4 63.6 26.2 10.1 64.7 25.5 8.1 62 26.4 11.6
F2-4-3 63.3 26.2 10.5 63.9 26 10.1 64.7 25.7 9.6 62.1 26.4 11.5
表39 續
處方編號 T0 25℃
4W 2M 6M
MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP
F2-4-1 63.1 26.4 10.5 60.7 27.1 12.2 57.9 29.5 12.7 43.6 39.3 17.1
F2-4-2 63.3 26.3 10.4 60.9 27.1 11.9 57.7 29.5 12.8 43.6 39.4 17
F2-4-3 63.3 26.2 10.5 61 27.1 12 57.8 29.5 12.8 43.4 39.6 16.9
表40 表面活性劑強度篩選40℃穩定性實驗、振搖實驗和凍融實驗CEX（%）檢測結果
處方編號 T0 40℃
1W 2W 4W
MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP
F2-4-1 63.1 26.4 10.5 56 30.5 13.6 50.3 34 15.6 39.9 41.6 18.5
F2-4-2 63.3 26.3 10.4 56 30.4 13.5 50.6 34 15.4 40.3 41.8 17.9
F2-4-3 63.3 26.2 10.5 56.3 30.4 13.4 50.5 34 15.5 39.7 41.9 18.4
表40 續
處方編號 T0 Agitation F/T
4D 7D 3C 5C
MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP MP AP BP
F2-4-1 63.1 26.4 10.5 63.3 26.2 10.5 63 26.1 10.9 63.8 26.3 9.9 63.6 26.3 10
F2-4-2 63.3 26.3 10.4 63.3 26.2 10.6 63 26.2 10.8 63.6 26.4 10 63.7 26.3 10
F2-4-3 63.3 26.2 10.5 63.2 26.2 10.6 63.1 26.1 10.9 63.7 26.3 10 63.8 26.2 10
註：MP: Main Peak，主峰；AP: Acidic Peak，酸性峰；BP: Basic Peak，鹼性峰
表41 表面活性劑強度篩選2~8℃和25℃穩定性實驗SE-HPLC（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃
4W 2M 6M
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-4-1 99.1 0.9 ND 98.8 1.2 ND 98.8 1.2 ND 98.6 1.4 ND
F2-4-2 99.1 0.9 ND 98.6 1.4 ND 98.8 1.2 ND 98.6 1.4 ND
F2-4-3 99.1 0.9 ND 98.7 1.3 ND 98.8 1.2 ND 98.6 1.4 ND
表41 續
處方編號 T0 25℃
4W 2M 6M
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-4-1 99.1 0.9 ND 98.3 1.6 0.2 96.3 1.7 2 94.7 2.5 2.8
F2-4-2 99.1 0.9 ND 98.2 1.6 0.2 96.4 1.7 2 94.6 2.6 2.8
F2-4-3 99.1 0.9 ND 98.2 1.6 0.2 96.3 1.7 2 94.7 2.4 2.8
表42 表面活性劑強度篩選40℃穩定性實驗、振搖實驗和凍融實驗SE-HPLC（%）檢測結果
處方編號 T0 40℃
1W 2W 4W
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-4-1 99.1 0.9 ND 96.7 1.5 1.7 95.6 2.2 2.2 92.6 3.6 3.8
F2-4-2 99.1 0.9 ND 96.9 1.4 1.7 95.4 2.2 2.4 92.5 3.6 3.9
F2-4-3 99.1 0.9 ND 96.7 1.5 1.7 95.4 2.2 2.3 92.7 3.5 3.8
表42續
處方編號 T0 Agitation F/T
4D 7D 3C 5C
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-4-1 99.1 0.9 ND 99 1 ND 98.7 1.1 0.1 99 1 ND 98.9 1.1 ND
F2-4-2 99.1 0.9 ND 98.9 1.1 ND 98.9 1 0.1 99.1 0.9 ND 99 1 ND
F2-4-3 99.1 0.9 ND 99 1 ND 98.9 1.1 0.1 99 1 ND 99 1 ND
註：MP: Main Peak，主峰；HMW: High Molecular Weight，高聚體；LMW: Low Molecular Weight，低聚體；ND: Not Detected，未檢測到
表43 表面活性劑強度篩選2~8℃和25℃穩定性實驗CE-SDS-NR（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃
4W 2M 6M
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-4-1 96.9 1 2 97.8 0.1 2.1 98.1 0.1 1.8 97.4 0.5 2.1
F2-4-2 97.9 0 2.1 97.9 0.1 2 98.1 0.1 1.8 97.0 0.6 2.5
F2-4-3 97.2 0.7 2.1 98 0.1 2 98 0.1 1.9 96.7 0.7 2.6
表43 續
處方編號 T0 25℃
4W 2M 6M
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-4-1 96.9 1 2 96.8 0.6 2.6 96.8 0.1 3.1 92.7 0.8 6.5
F2-4-2 97.9 0 2.1 97.2 0.5 2.4 96.9 0.1 3.1 93.0 0.8 6.2
F2-4-3 97.2 0.7 2.1 97.4 0 2.7 96.8 0.1 3 92.5 1.1 6.4
表44 表面活性劑強度篩選40℃穩定性實驗、振搖實驗和凍融實驗CE-SDS-NR（%）檢測結果
處方編號 T0 40℃
1W 2W 4W
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-4-1 96.9 1 2 96.6 0.1 3.3 95.3 0.4 4.2 93.3 0.6 6.2
F2-4-2 97.9 0 2.1 96.1 0.1 3.8 95.7 0.2 4.2 93.7 0.2 6
F2-4-3 97.2 0.7 2.1 96.4 0.1 3.4 95.5 0.2 4.2 93.5 0.4 6.1
表44續
處方編號 T0 Agitation F/T
4D 7D 3C 5C
MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW MP HMW LMW
F2-4-1 96.9 1 2 97.1 0.7 2.2 95.9 1.9 2.1 97.7 0.4 1.8 96.8 1.1 2.2
F2-4-2 97.9 0 2.1 97.5 0.5 2 95.5 2.3 2.1 97.1 0.8 2.1 97 0.8 2
F2-4-3 97.2 0.7 2.1 97.2 0.6 2.1 97.2 0.5 2.2 96.7 0.9 2.5 97.1 0.9 2
註：MP: Main Peak，主峰；HMW: High Molecular Weight，高聚體；LMW: Low Molecular Weight，低聚體
表45 表面活性劑強度篩選ELISA-Binding（%）檢測結果
處方編號 T0 2~8℃ 25℃ 40℃ Agitation F/T
4W 2M 6M 4W 2M 6M 1W 2W 4W 7D 5C
F2-4-1 100.52 97.97 96.99 87 86.4 91.16 75 87.18 95.78 84.34 90.79 85.96
F2-4-2 95.1 95.96 94.85 89 86.65 85.98 76 90.45 95.34 87.25 95.74 80.17
F2-4-3 94.18 94.97 100.59 83 99.3 91.71 90 81.62 92.93 84.26 92.08 95.93
結果分析 （1）外觀：所有候選處方的外觀性狀一致，在整個考察期間無明顯變化。 （2）pH值：所有候選處方的pH值在整個考察期間無明顯變化。 （3）蛋白濃度：所有候選處方的蛋白濃度在整個考察期間無明顯變化。 （4）不溶性微粒：根據質量標準（10µm及以上的微粒數≤6000粒，25µm及以上的微粒數≤600粒），所有候選處方的不溶性微粒在整個考察期間無明顯異常，符合質量標準，其中F2-4-2表現略優。 （5）DLS：所有候選處方的粒徑大小無明顯差異。 （6）CEX：所有候選處方的電荷異構體主峰無明顯差異。 （7）SE-HPLC：所有候選處方的單體純度無明顯差異。 （8）CE-SDS（NR）：所有候選處方的蛋白純度無明顯差異。 （9）ELISA-Binding：所有候選處方的結合活性無明顯差異。
總結：藉由對3個候選處方各檢測指標的綜合評估，0.02-0.06%（w/v）PS80濃度對蛋白穩定性影響無明顯差異。因此，繼續沿用輔料篩選研究使用的0.04%（w/v）PS80濃度，選擇F2-4-2處方用於後續的處方確認穩定性研究。
實施例5 處方確認穩定性
5.1 研究方案 （1）處方選擇20 mM醋酸-醋酸鈉，pH5.0；8%（w/v）蔗糖；0.04%（w/v）PS80用於處方確認穩定性研究。（2）包材選擇10 mL西林瓶，10 mm膠塞和10 mm鋁塑蓋。（3）規格：50 mg/mL PVRIG/TIGIT雙抗LC-BsAb-002；裝量：6 mL/300 mg。考察指標包括：外觀、pH、蛋白濃度、動態光散射（DLS）、CEX、SE-HPLC、CE-SDS（NR&R）和結合活性（ELISA-Binding）。考察方案詳見表46。
表46 處方確認穩定性考察方案
放置條件 T0 2~8℃ 25℃ 40℃
4W 3M 6M 4W 3M 6M 2W 4W
正置（U） X X X X X X X X X
倒置（I）
註：X=外觀，pH，蛋白濃度，DLS，iCIEF，SE-HPLC，CE-SDS(NR)，ELISA-Binding，不溶性微粒（MFI）。
5.2 考察結果
處方確認穩定性主要結果匯總如下表47-表48所示：
表47 處方確認穩定性結果
取樣點 放置條件 外觀 pH 濃度 粒徑 結合活性（%）
T0 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 49.8 9.6 90.68
2~8℃ 4W U 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 50.2 9.4 92.98
I 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 50.4 9.2 89.65
3M U 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 49.9 9.2 79
I 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 49.9 8.9 82
6M U 無色微乳光，無可見顆粒 5.2 50.0 9.1 96
I 無色微乳光，無可見顆粒 5.2 50.0 9.2 93
25℃ 4W U 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 50.2 9.1 80.83
I 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 50.4 8.8 86.72
3M U 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 50.1 9.6 85
I 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 50.0 9.6 85
6M U 無色微乳光，無可見顆粒 5.2 50.0 10.9 80
I 無色微乳光，無可見顆粒 5.2 49.8 9.8 80
40℃ 2W U 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 50.1 9.2 87.97
I 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 49.7 9.2 90.82
4W U 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 49.9 10.2 74.14
I 無色微乳光，無可見顆粒 5.1 50.1 10.6 79.42
表48 處方確認穩定性結果
取樣點 放置條件 不溶性微粒(MFI，個微粒/mL) CEX (%) SE-HPLC (%) CE-SDS-NR (%) CE-SDS-R (%)
≥10 ≥25 MP AP BP MP HMW LMW MP HMW LMW LC+HC NGHC
T0 3 0 63.3 27.1 9.6 98.8 1.2 ND 98.3 0.3 1.3 98.0 2.0
2~8℃ 4W U 25 5 65.1 26.3 8.7 98.6 1.4 ND 97.6 0.2 2.2 97.8 2.2
I 7 0 64.8 26.4 8.9 98.7 1.3 ND 96.5 1.4 2.1 97.2 2.8
3M U 23 3 63.5 26.2 10.3 98.2 1.8 ND 97.7 0.9 1.4 97.8 2.2
I 12 3 63.4 26.3 10.3 98.3 1.7 ND 97.6 0.8 1.6 97.6 2.4
6M U 11 3 62.7 25.7 11.6 98.1 1.9 ND 98.0 0.4 1.6 97.5 0.8
I 8 0 62.9 25.7 11.4 98 2 ND 98.2 0.3 1.6 97.3 0.9
25℃ 4W U 14 0 61.6 27.3 11.1 97.7 2.1 0.2 97.0 1.2 1.9 96.2 3.8
I 3 0 62 27.3 10.8 97.8 2.1 0.1 96.5 1.4 2.0 97.4 2.6
3M U 100 0 52.9 31.5 15.5 95.9 2.7 1.4 96.3 1.0 2.8 95.3 4.7
I 94 10 52.3 31.7 16 95.5 2.7 1.7 96.7 0.8 2.6 95.4 4.6
6M U 11 0 45.3 36 18.6 95.3 2.9 1.8 94.2 1.2 4.7 94.2 1.0
I 16 0 43.9 36.3 19.7 94.7 3.3 2 94.3 1.2 4.5 93.3 1.0
40℃ 2W U 16 3 50.5 34.3 15.1 94.9 3 2.1 95.3 1.3 3.4 97.2 2.8
I 19 0 51.4 34.3 14.1 95 3 2 95.5 1.2 3.3 96.5 3.5
4W U 30 3 40.5 41.1 18.4 92.7 4.1 3.2 93.4 1.6 5.0 93.4 6.6
I 12 0 40.3 40.9 18.7 92.6 4.1 3.3 94.2 1.0 4.8 94.0 6.0 
5.3 結果分析 （1）外觀：該處方的外觀在整個考察期間無明顯變化。 （2）pH值：該處方的pH在整個考察期間無明顯變化。 （3）蛋白濃度：該處方的蛋白濃度在整個考察期間無明顯變化。 （4）不溶性微粒：該處方的不溶性微粒在整個考察期間無明顯異常，符合質量標準。 （5）DLS：該處方的粒徑大小在整個考察期間無明顯變化。 （6）CEX：當樣品在低溫、室溫和高溫下儲存時，該處方電荷異構體主峰變化符合質量標準。 （7）SE-HPLC：當樣品在低溫、室溫和高溫時，該處方單體純度穩定性良好。 （8）CE-SDS（NR&R）：當樣品在低溫、室溫和高溫時，該處方蛋白純度變化較小，穩定性良好。 （9）ELISA-Binding：該處方的結合活性在整個考察期間無明顯變化。
總結：該處方在2~8℃，25℃和40℃考察條件下各檢測指標均符合質量標準，穩定性表現良好，正置和倒置樣品無明顯差異。
綜上，經過pH/緩衝體系篩選、輔料篩選、表面活性劑強度篩選和處方確認穩定性研究，最終處方確定為50 mg/mL PVRIG/TIGIT雙特異性抗體；20 mM醋酸-醋酸鈉，pH5.0；8%（w/v）蔗糖；0.04%（w/v）PS80。
雖然本發明最終選擇20 mM醋酸-醋酸鈉，pH5.0；8%（w/v）蔗糖；0.04%（w/v）PS80用於處方，但是並不意味著只有該處方能夠實現穩定抗體的效果，如前述實施例的數據，採用組氨酸緩衝體系，以及採用山梨糖醇，海藻糖作為輔料同樣也能夠實現抗體的穩定儲存。
無
無
TW202402325A_112121212_SEQL.xml
無。

Claims (21)

  1. 一種藥物組合物，其包含： （i）一種雙特異性抗體或其抗原結合片段，所述雙特異性抗體或其抗原結合片段包含特異性結合PVRIG和TIGIT的結合域； （ii）緩衝液； （iii）非還原性糖；和 （iv）非離子表面活性劑， 其中，所述雙特異性抗體或其抗原結合片段包含： （a）第一抗原結合部分，其包括重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），所述VH和VL形成抗TIGIT抗原結合域；其中，所述TIGIT VH包含以下序列所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3： （1）HCDR1、HCDR2、HCDR3分別為SEQ ID NO：21、22、23；或 （2）HCDR1、HCDR2、HCDR3分別為SEQ ID NO：24、25、26；或 （3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列，較佳地，所述替換為保守氨基酸的替換； 所述TIGIT VL包含以下序列所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3： （1）LCDR1、LCDR2、LCDR3分別為SEQ ID NO：27、28、29；或 （2）LCDR1、LCDR2、LCDR3分別為SEQ ID NO：30、31、32；或 （3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列，較佳地，所述替換為保守氨基酸的替換； （b）第二抗原結合部分，其包括特異性結合PVRIG的VHH，所述VHH包含以下序列所示的CDR1、CDR2和CDR3： （1）CDR1、CDR2和CDR3分別為SEQ ID NO：15、16和17；或 （2）CDR1、CDR2和CDR3分別為SEQ ID NO：18、19和20；或 （3）與上述（1）至（2）所示序列具有至少90%同一性或具有1、2、3或更多個氨基酸插入、缺失和/或替換的序列，較佳地，所述替換為保守氨基酸的替換。
  2. 如請求項1所述之藥物組合物，其中，所述TIGIT VH包含SEQ ID NO：12或14任一項所示的氨基酸序列； 所述TIGIT VL包含SEQ ID NO：11或13任一項所示的氨基酸序列； 所述特異性結合PVRIG的VHH包含SEQ ID NO：9或10任一項所示的氨基酸序列。
  3. 如請求項1或2所述之藥物組合物，其中，所述雙特異性抗體或其抗原結合片段為，LC-BsAb-002、LC-BsAb-006、LC-BsAb-009、或LC-BsAb-010；較佳為LC-BsAb-002； 所述LC-BsAb-002包含： （1）氨基酸序列由SEQ ID NO：1 所示的LC；和 （2）氨基酸序列由SEQ ID NO：2 所示的HC； 所述LC-BsAb-006包含： （1）氨基酸序列由SEQ ID NO：3 所示的LC；和 （2）氨基酸序列由SEQ ID NO：4 所示的HC； 所述LC-BsAb-009包含： （1）氨基酸序列由SEQ ID NO：5 所示的LC；和 （2）氨基酸序列由SEQ ID NO：6 所示的HC； 所述LC-BsAb-010包含： （1）氨基酸序列由SEQ ID NO：7 所示的LC；和 （2）氨基酸序列由SEQ ID NO：8 所示的HC。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之藥物組合物，其中，所述雙特異性抗體或其抗原結合片段的濃度為約10mg/ml至約200mg/ml，較佳的，為約20mg/ml至約100mg/ml，約20mg/ml至約80mg/ml，或約30mg/ml至約60mg/ml；最佳的，為50 mg/mL。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之藥物組合物，其中，所述緩衝液選自醋酸-醋酸鈉緩衝液或組氨酸-鹽酸組氨酸緩衝液，較佳的，所述緩衝液濃度為約10mM至約80mM，約15mM至約70mM，約20mM至約60mM，或約20mM至約30mM；最佳的，為20mM 醋酸-醋酸鈉緩衝液。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之藥物組合物，其中，所述非還原性糖選自蔗糖、山梨醇或海藻糖，較佳的，所述非還原性糖的濃度為約6%至約9%(w/v)，約7%至約9%(w/v)，或約7%至約8%(w/v) ；最佳的，為8%w/v蔗糖。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之藥物組合物，其中，所述非離子表面活性劑為聚山梨酯80，較佳的，所述非離子表面活性劑的濃度為約0.01%至約0.10%(w/v)，或約0.02%至約0.06%(w/v) ；最佳的，為0.04%(w/v)聚山梨酯80。
  8. 如請求項1至7中任一項所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物為注射劑，較佳為皮下注射劑或靜脈注射劑。
  9. 如請求項1至8中任一項所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物包含： (i) 10mg/ml至200mg/ml的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段； (ii) 10mM至100mM的醋酸-醋酸鈉緩衝液； (iii) 6%至10%(w/v)蔗糖； (iv) 0.01%至0.10%(w/v)聚山梨酯80。
  10. 如請求項1至9中任一項所述之藥物組合物，其包含50mg/mL的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段、20mM 醋酸-醋酸鈉緩衝液、8%w/v蔗糖、0.02%(w/v)聚山梨酯80。
  11. 如請求項1至9中任一項所述之藥物組合物，其包含50mg/mL的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段、20mM 醋酸-醋酸鈉緩衝液、8%w/v蔗糖、0.04%(w/v)聚山梨酯80。
  12. 如請求項1至9中任一項所述之藥物組合物，其包含50mg/mL的PVRIG/TIGIT雙特異性抗體或其抗原結合片段、20mM 醋酸-醋酸鈉緩衝液、8%w/v蔗糖、0.06%(w/v)聚山梨酯80。
  13. 如請求項1至12中任一項所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物的pH為4.5-5.5。
  14. 如請求項13所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物的pH為5.0-5.2。
  15. 如請求項1至14中任一項所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物在2℃至8℃下穩定至少4周，5周，6周，7周，8周，3月或6月。
  16. 如請求項1至14中任一項所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物在25℃下穩定至少4周，5周，6周，7周，8周，3月或6月。
  17. 如請求項1至14中任一項所述之藥物組合物，其中，所述藥物組合物在40℃下穩定至少1周，2周，3周或4周。
  18. 一種如請求項1至17中任一項所述之藥物組合物在製備用於治療癌症或感染性疾病的藥物的用途，其中，所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤。
  19. 如請求項18所述之用途，其中，所述藥物組合物與另外的治療劑、放射療法或與手術組合使用，其中，所述另外的治療劑選自化學療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、細胞因子、免疫刺激性抗體、免疫調節藥物、共刺激分子的活化劑、抑制性分子的抑制劑、疫苗或細胞免疫療法。
  20. 一種治療癌症或感染性疾病的方法，包含向有此需要的患者施用有效量的如請求項1至17中任一項所述之藥物組合物，其中，所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤。
  21. 如請求項1至17中任一項所述之藥物組合物，用於治療癌症或感染性疾病，其中，所述癌症選自實體腫瘤和血液腫瘤。
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