KR20230042030A - 항-IgE 조작된 항체 및 이의 적용 - Google Patents

항-IgE 조작된 항체 및 이의 적용 Download PDF

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Abstract

항원 결합 단백질. 오말리주맙의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열과 비교하여, 항원 결합 단백질은 아미노산 돌연변이체를 포함한다. 항원-결합 단백질은 항-IgE 조작된 항체이다. 항원-결합 단백질을 포함하는 약학 조성물, 및 비정상적인 IgE 수준과 관련된 질환의 완화 또는 치료를 위한 방법을 또한 수반한다.

Description

항-IgE 조작된 항체 및 이의 적용
본원은 생의학 분야, 특히 항-IgE 조작된 항체 및 비정상적인 수준의 IgE를 갖는 질환에서의 그의 용도에 관한 것이다.
면역글로불린 E(IgE)는 분자량이 180 KD인 단백질이다. IgE는 전체 혈청 Ig의 0.002%에 불과하지만 알레르기 질환의 병리학적 과정과 밀접한 관련이 있다. 다른 조직과 기관에서, 증가된 IgE 수준은 염증성 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 가장 흔한 것은 알레르기성 천식, 알레르기성 비염 및 부비동염, 알레르기성 결막염, 전신성 알레르기, 피부 알레르기 및 두드러기 등이다.
최근 몇 년 동안 항-IgE 단클론 항체와 같은 생물학적 작용제는 비정상적인 수준의 IgE와 관련된 질환의 치료에 있어서 연구 핫스팟이 되었다. 2003년에 항-IgE 항체 오말리주맙이 천식 치료용으로 처음으로 FDA의 승인을 받았다. 2014년 미국 식품의약국(FDA)은 만성 특발성 두드러기 치료를 위해 오말리주맙을 승인하였다. 오말리주맙의 적용에는 하기와 같은 문제가 있다: (1) 오말리주맙은 유리 IgE를 표적화하지만 약학적으로 관련된 용량에서 IgE/FcεRI(IgE Fc 수용체)의 병원성 종을 표적화하지 않는다(또는 유효하게 표적화할 수 없다); (2) 오말리주맙의 투여 농도 및 투여 간격은 환자의 체중 및 유리 IgE 수준과 직접적인 관련이 있으므로, 환자의 체중 및 유리 IgE 수준이 일정 범위를 초과하면, 그의 투여 농도 및 빈도가 증가할 것이며, 이는 환자 질환의 억제 및 관리에 대한 복잡성과 불편함을 증가시킨다; (3) IgE와의 친화력이 그다지 좋지 않다.
따라서, 효능 및 순응도가 향상된 신규의 조작된 항-IgE 항체가 절실히 필요하다.
본원은 오말리주맙의 항체 경쇄 및 중쇄 서열에 대해 공학적으로 최적화된 항원-결합 단백질을 제공하며, 하기의 특징 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: (1) 오말리주맙과 비교하여 인간화 정도가 개선되고, 항-약물 항체 생성 확률이 감소 되며, 잠재적 효능의 손실이 감소되고; (2) 번역-후 변형 부위가 돌연변이되고 화학적 안정성(예를 들어, 고온 또는 pH 환경에서의 안정성)이 개선되며; (3) 효모 디스플레이법에 의해 인간 IgE와의 친화도가 개선되고, 약물 효능이 개선되며, 체중이 더 높거나 유리 IgE 농도가 더 높은 환자에게 항원-결합 단백질을 적용할 수 있을 것으로 기대되고; (4) 높은 친화도로 원숭이 IgE에 결합하며, 이는 전임상 동물 모델에서 약력학적 연구에 도움이 되고; (5) IgE Fc 수용체(FcεRI)에 대한 IgE의 결합을 유효하게 차단하며; (6) 혈청 반감기가 연장되고, 이는 주사 빈도를 줄이며 환자의 상태의 조절을 용이하게 한다.
하나의 태양에서, 본원은 항원-결합 단백질을 제공하고, 항원-결합 단백질은 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하며, 여기서 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여, VL은 E55 및 V104로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, VL은 D30b, V29, D30, Y30a 및 G30c로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, VL은 D30b, E55 및 V104 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, VL은 (1) D30b, E55, V104, V29, D30, 및 Y30a; (2) D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c; (3) D30b, E55, V104 및 Y30a; (4) D30b, E55, V104, Y30a 및 G30c; (5) D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c; 및 (6) D30b, E55, V104, D30 및 Y30a로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, E55 위치에서의 아미노산 돌연변이는 E55Q를 포함한다.
일부 구현예에서, V104 위치에서의 아미노산 돌연변이는 V104L을 포함한다.
일부 구현예에서, D30b 위치에서의 아미노산 돌연변이는 D30bE를 포함한다.
일부 구현예에서, V29 위치에서의 아미노산 돌연변이는 V29L을 포함한다.
일부 구현예에서, Y30a 위치에서의 아미노산 돌연변이는 Y30A, Y30aS 및 Y30aD로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, D30 위치에서의 아미노산 돌연변이는 D30Y, D30A, D30E, D30F, D30G 및 D30N으로 이루어지는 그룹에서 선택된 어느 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, G30c 위치에서의 아미노산 돌연변이는 G30cA, G30cY 및 G30cW로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, VL은 D30bE, E55Q 및 V104L 그룹의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, VL은 서열번호 57에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VL은 서열번호 23-34에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단백질은 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하며, 여기서 VH는 서열번호 50에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 I37, A49, S50 및 D54로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, VH는 N60, P61, I67, T30, S31, S96 및 H97로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, I37 위치에서의 아미노산 돌연변이는 I37V를 포함한다.
일부 구현예에서, A49 위치에서의 아미노산 돌연변이는 A49S를 포함한다.
일부 구현예에서, S50 위치에서의 아미노산 돌연변이는 S50V를 포함한다.
일부 구현예에서, D54 위치에서의 아미노산 돌연변이는 D54A를 포함한다.
일부 구현예에서, N60 위치에서의 아미노산 돌연변이는 N60A를 포함한다.
일부 구현예에서, P61 위치에서의 아미노산 돌연변이는 P61D를 포함한다.
일부 구현예에서, I67 위치에서의 아미노산 돌연변이는 I67F를 포함한다.
일부 구현예에서, T30 위치에서의 아미노산 돌연변이는 T30R을 포함한다.
일부 구현예에서, S31 위치에서의 아미노산 돌연변이는 S31Q를 포함한다.
일부 구현예에서, S96 위치에서의 아미노산 돌연변이는 S96T를 포함한다.
일부 구현예에서, H97 위치에서의 아미노산 돌연변이는 H97N을 포함한다.
일부 구현예에서, VH는 N60A, P61D, I67F, I37V, A49S, S50V 및 D54A 그룹의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, VH는 서열번호 58에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, VH는 서열번호 51-56에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, VL은 D30b, E55 및 V104 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, VL 및 VH는 하기로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다: (1) VL은 D30b, E55, V104, V29, D30, 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54, S96 및 H97 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; (2) VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54, 및 T30 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; (3) VL은 D30b, E55, V104, 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S96 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; (4) VL은 D30b, E55, V104 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고 (5) VL은 D30b, E55, V104, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고;(6) VL은 D30b, E55, V104 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 H97 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; (7) VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고 (8) VL은 D30b, E55, V104, D30 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 H97 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; (9) VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S96 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; (10) VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하고; VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S31 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단백질은 항체 중쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단백질의 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG 불변 영역으로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 인간 IgG 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IgG1 불변 영역은 M252Y, S254T 및 T256E로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다.
일부 구현예에서, 인간 IgG1 불변 영역은 서열번호 60-61에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원-결합 단백질은 항체 경쇄 불변 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 경쇄 불변 영역은 서열번호 59에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 태양에서, 본원은 본원에 기재된 항원-결합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 단리된 핵산 분자를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본원은 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본원은 본원에 기재된 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본원은 항원-결합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 항원-결합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본원은 항원-결합 단백질, 핵산 분자, 벡터 및/또는 세포, 및 임의로 약학적으로 허용되는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 한편으로, 본원은 비정상적인 수준의 IgE와 연관된 질환의 완화 또는 치료를 위한 약제의 제조에서 항원-결합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 세포 및/또는 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본원은 비정상적인 수준의 IgE와 연관된 질환의 완화 또는 치료가 필요한 피실험자에게 항원-결합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 세포 및/또는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 완화 또는 치료 방법을 제공한다.
본원의 다른 태양 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 당업자에 의해 쉽게 이해될 수 있다. 하기의 상세한 설명에서 단지 본원의 예시적인 구현예만을 나타내고 기재한다. 당업자가 인식하는 바와 같이, 본원의 내용은 당업자가 본원과 관련된 본 발명의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 개시된 특정 구현예를 변경할 수 있게 함을 알 것이다. 따라서, 본원의 명세서에 기재된 도면 및 설명은 단지 예시에 불과하며 제한적이지 않다.
본원과 관련된 본 발명의 특징은 첨부된 특허청구 범위에 기재되어 있다. 본원에 포함된 본 발명의 특징 및 이점은 이하에서 상세히 설명되는 예시적인 구현예 및 첨부된 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다. 도면에 대한 간략한 설명은 하기와 같다.
도 1은 시간에 따른 오말리주맙, AB1904AM10 및 AB1904AM15에 의한 키노몰구스 원숭이 혈청에서의 유리 IgE의 억제율을 도시한다.
도 2는 항-IgE 항체에 의한 FcεRIα 수용체 단백질에 대한 인간 완전길이 IgE의 결합의 차단을 도시한다.
도 3은 항-IgE 항체에 의한 세포 표면 CD23 수용체 단백질에 대한 인간 완전길이 IgE의 결합의 차단을 도시한다.
도 4A 및 4B는 항-IgE 항체에 의한 FcεRI/RBL-2H3으로부터의 인간 완전길이 IgE-유도된 히스타민 방출의 차단을 도시한다.
도 5는 인간 전혈로부터 히스타민 방출을 도시한다.
도 6은 hFcRn 마우스 혈청에서 시간에 따른 항-IgE 항체의 곡선을 도시한다.
도 7은 키노몰구스 원숭이 혈청에서 시간에 따른 항-IgE 항체의 곡선을 도시한다.
이하, 본 발명의 구현예를 구체적인 예를 들어 기재하며, 당업자는 본원에 개시된 내용으로부터 본원 발명의 다른 이점 및 효과를 용이하게 이해할 수 있을 것이다.
용어의 정의
본원에서, "IgE"라는 용어는 일반적으로 포유동물 내의 항체를 지칭한다. IgE는 천식, 식품 알레르기, 1형 과민증, 및 여러 가지 이유로 앓게되는 친숙한 부비동염과 같은 알레르기 반응을 매개하는 면역글로불린 패밀리의 구성원이다. IgE는 B 세포에 의해 분비되며 B 세포 표면상에서 발현된다. B-세포-합성된 IgE는 짧은 막-결합 영역을 통해 성숙한 IgE 서열에 연결된 막관통 도메인을 통해 B-세포 막에 고정된다. IgE는 친화도가 낮은 IgE 수용체(FcεRII)에 대한 그의 Fc 영역의 부착을 통해 B 세포(뿐만 아니라 단핵세포, 호산구 및 혈소판)에도 결합할 수 있다. 포유동물이 알레르겐에 노출된 후 B 세포는 무성적으로 증폭되어, 알레르겐에 결합하는 IgE를 합성한다. 이 IgE는 각각 B 세포에 의해 순환계로 방출되며, 여기서 B 세포(FcεRII를 통해)에 의해서, 및 비만 세포 및 호염기구의 표면에서 발견되는 소위 고-친화도 수용체(FcεRI)를 통해서 비만 세포 및 호염기구에 의해 결합된다. 따라서, 이러한 비만 세포 및 호염기구는 알레르겐에 감작된다. 알레르겐에 대한 노출에 이어서 이들 세포상의 FcεRI와 가교결합하여, 이들 세포의 임상적 과민증 및 아나필락시스를 유발하는 히스타민 및 기타 인자의 방출을 활성화한다.
본원에서 "항원-결합 단백질"이라는 용어는 일반적으로 항원(예를 들어, IgE)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 부분, 또는 항원에 대한 목적하는 결합 능력을 보유하는 항체 단편의 합성된 변이체를 지칭한다. 항체의 발현된 항원-결합 기능은 완전길이 항체 또는 그의 변이체의 단편 또는 일부 부분에 의해 수행될 수 있다. 예는 2개 이상의 상이한 항원 또는 항원의 다수의 에피토프 또는 개별적인 에피토프 영역에 특이적으로 결합할 수 있는 이중특이성, 이중 특이성 및 다중특이성 포맷을 포함한다. 항원-결합 단백질의 예는 단쇄 항체(즉, 완전길이 중쇄 및 경쇄); Fab, 변형된 Fab, Fab', 변형된 Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, 단일 도메인 항체(예를 들어, VH 또는 VL 또는 VHH)(예를 들어, WO 2001090190에 기재된 바와 같은), scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, bi-scFv, 디아바디, 트리바디, 트리아바디, 테트라바디 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-항원 결합제를 포함할 수 있다(예를 들어 문헌[Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136]; [Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews-Online 2(3), 209-217]을 참조하시오). 이들 항체 단편의 생성 및 제조 방법은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 문헌[Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181]을 참조하시오).
본원에서, "항체"라는 용어는 4개의 폴리펩티드 쇄(2개의 중(H) 쇄 및 2개의 경(L) 쇄)로 구성된 임의의 면역글로불린(Ig) 분자, 또는 IgE에의 특이적인 결합을 허용하는 IgG 분자의 에피토프 결합 특징 중 적어도 일부를 보유하는 그의 임의의 기능적 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 지칭한다. 완전길이 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역(CH)으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 CH1, 힌지, CH2 및 CH3(중쇄 감마, 알파 및 델타) 또는 CH1, CH2, CH3 및 CH4(중쇄 뮤 및 입실론)의 4개 도메인으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역(CL)으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)이라고 하는 고가변 영역으로 더 세분될 수 있으며, 프레임워크 영역(FR)이라고 하는 보다 보존된 영역이 산재되어 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단에서 카복시 말단까지 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다. 면역글로불린 분자는 임의의 아이소타입/부류(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류를 가질 수 있다.
본원에서, "단클론 항체"라는 용어는 상이한 항체의 혼합물을 함유하는 "다클론" 항체 제제와 대조적으로, 일반적으로 공통 중쇄 아미노산 서열 및 경쇄 아미노산 서열을 공유하는 항체 분자의 제제, 또는 적어도 Ig 분자의 경쇄 에피토프 결합 특징을 보유하는 그의 임의의 기능적 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 를 지칭한다. 단클론 항체는 파지, 세균, 효모 또는 리보솜 디스플레이와 같은 다수의 공지된 기법뿐만 아니라 하이브리도마 유래 항체, 예를 들어 표준 Kohler 및 Milstein 하이브리도마 방법((1975) Nature 256:495-497))과 같은 하이브리도마 기술에 의해 하이브리도마에 의해 분비된 항체와 같은 고전적인 방법에 의해 생산될 수 있다.
본원에서, "오말리주맙"이라는 용어는 일반적으로 상표명 Xolair® 하의, 인간 면역글로불린 E(IgE)에 선택적으로 결합하는 재조합 DNA-유래 인간화된 IgG1κ 단클론 항체를 지칭한다. 오말리주맙의 분자량은 대략 149 kD이다. 이것은 항생제 젠타마이신을 함유하는 배지에서 중국 햄스터 난소 세포 현탁 배양물로부터 생성된다(EP602126(및 이에 기초한 SPC/GB06/005); WO93/04173; US6267958(및 이에 기초한 PTE)); WO97/04807; WO97/04801; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623-2632) 참조). 오말리주맙이 기술될 때, 이는 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 서열번호 50에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역을 함유하는 IgG 완전길이 항체를 지칭한다. 오말리주맙은 현재 만성적인 공기 알레르겐에 대해 양성의 피부 검사 또는 시험관내 반응 및 흡입용 코르티코스테로이드로 적절하게 조절되지 않는 증상이 있는 환자에서 중등도 내지 중증의 지속적인 천식의 치료에 대해 사용이 지시된다.
본원에서, VH 또는 VL 서열의 공통 면역글로불린 부분(CDR-상보성 결정 영역 또는 FR-프레임워크 영역)을 기술할 때, 이들은 표준 순서(VH = HFR1.HCDR1.HFR2.HCDR2.HFR3.HCDR3.HFR4; VL = LFR1. LCDR1. LFR2. LCDR2. LFR3. LCDR3. LFR4)로 연결된다.
본원의 항체 또는 항원-결합 단백질의 아미노산 넘버링에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단백질로부터 유래된 연속적인 아미노산 서열은 Chothia 넘버링 규칙에 따라 넘버링될 수 있다. 본원에서, "Chothia 도식", "Chothia 넘버링", "Chothia 정의"라는 용어는 호환적으로 사용되며 일반적으로 아미노산 잔기에 대한 넘버링 시스템을 지칭한다(Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)). Chothia 넘버링 규칙에 따르면, 오말리주맙의 경우, VL(서열번호 22)의 각 부분은 하기와 같이 정의되고: LFR1(L1-L23), LCDR1(L24-L34), LFR2(L35-L49), LCDR2(L50-L56), LFR3(L57-L88), LCDR3(L89-L97) 및 LFR4 (L98-L107), VH(서열번호 50)의 각 부분은 하기와 같이 정의되며: HFR1(H1-H25), HCDR1(H26-H32), HFR2(H33-H51), HCDR2(H52-H56), HFR5(H57-H94), HCDR3(H95-H102) 및 HFR4(H103-H113), 여기서 "Lx" 또는 "Hx"(x는 아라비아 숫자)는 경쇄(L) 가변 영역 또는 중쇄(H) 가변 영역에서 x로서 넘버링되는 아미노산을 나타내고, VL의 경우 L24는 Chothia 넘버링에 따른 VL의 24번 위치에 있는 아미노산을 나타낸다. VL 또는 VH 내부에 있을 때 Lx 또는 Hx 위치는 또한 문자와 x 위치의 아미노산에 대한 숫자로 표시될 수 있다. 예를 들어, 오말리주맙의 VL의 경우 L24 위치에 아르기닌(R)이 있으며, 따라서 VL의 24번 위치에 있는 아미노산은 R24로 표시될 수 있다. 본원에서, 위치에 대한 상기 두 가지 지정(예를 들어, L24 및 R24)은 호환적으로 사용될 수 있다. Chothia 넘버링 규칙에 따라, 오말리주맙의 상보성 결정 영역의 아미노산 위치를 하기 표 1 내지 6 에 나타낸다.
[표 1] 오말리주맙 LCDR1의 아미노산 넘버링(Chothia)
넘버링 L24 L25 L26 L27 L28 L29 L30 L30A L30B L30C L30D L31 L32 L33 L34
아미노산 R A S Q S V D Y D G D S Y M N
[표 2] 오말리주맙 LCDR2의 아미노산 넘버링(Chothia)
넘버링 L50 L51 L52 L53 L54 L55 L56
아미노산 A A S Y L E S
[표 3] 오말리주맙 LCDR3의 아미노산 넘버링(Chothia)
넘버링 L89 L90 L91 L92 L93 L94 L95 L96 L97
아미노산 Q Q S H E D P Y T
[표 4] 오말리주맙 HCDR1의 아미노산 넘버링(Chothia)
넘버링 H26 H27 H28 H29 H30 H31 H31A H32
아미노산 G Y S I T S G Y
[표 5] 오말리주맙 HCDR2의 아미노산 넘버링(Chothia)
넘버링 H52 H53 H54 H55 H56
아미노산 T Y A G S
[표 6] 오말리주맙 HCDR3의 아미노산 넘버링(Chothia)
넘버링 H95 H96 H97 H98 H99 H100 H100A H100B H100C H100D H101 H102
아미노산 G S H Y F G H W H F A V
본원의 아미노산 돌연변이에 대하여, 이는 "돌연변이 전 아미노산 + 위치 + 돌연변이 후 아미노산"의 표현에 의해 표현되며, 예를 들어 VL의 아미노산 돌연변이 "E55Q"는 VL의 55번 위치에 있는 아미노산이 글루탐산(E)에서 글루타민 아미드(Q)로 돌연변이됨을 의미한다.
본원에서, "Kd", "KD" 또는 "KD"라는 용어는 호환적으로 사용되며 일반적으로 당업계에 공지된 특정 항체-항원 상호작용에 대한 해리 상수를 지칭한다. 면역결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(kD 또는 kd)로 표현될 수 있으며, 여기서 KD가 작을수록 친화도는 더 크거나 더 높다. 선택된 폴리펩티드의 면역결합 성질은 당업계에 주지된 방법을 사용하여 정량화될 수 있다. 이러한 방법 중 하나는 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리의 속도를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 이러한 속도는 복합체 상대의 농도, 상호작용의 친화도 및 양 방향의 속도에 동일하게 영향을 미치는 기하학적 매개변수에 따라 달라진다. 따라서, "결합 속도 상수"("Kon") 및 "해리 속도 상수"("Koff")는 농도 및 실제 결합 및 해리 속도를 계산함으로써 결정될 수 있다. Koff/Kon 비는 친화도와 관련되지 않은 모든 매개변수를 상쇄하고 해리 상수 Kd와 동일하다.
본원의 항체 또는 항원-결합 단백질의 친화도 및 이들이 결합을 억제하는 정도는 문헌[Scatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))]에 기재된 바와 같은 통상적인 기법을 사용하여, ForteBio Octet®을 사용하는 생물막 층 광학 간섭측정(BLI) 기법에 의해, 또는 Biacore와 같은 시스템을 사용하는 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 당업자에 의해 측정될 수 있다. 생물막 층 광학 간섭측정의 경우, 내부 바이오 센서의 하단 끝을, 생물 분자와 결합하고 이를 고정화할 수 있는 생물막 층으로 덮는다. 특정한 대역폭의 가시광선을 생물막 층상에 수직으로 입사시키면, 생물막 층의 두 경계면에서 빛이 반사되어 특정한 파장의 간섭파를 형성한다. 고정화된 분자가 용액 중의 분자와 상호 작용하면 생물막 층의 두께가 증가하고 간섭 스펙트럼 곡선이 파장이 증가하는 방향으로 이동하며, 광파의 위상 이동이 워크스테이션에 의해 실시간으로 검출된다. 분자 수 변화 및 연관된 농도 및 동역학 데이터. 표면 플라스몬 공명의 경우, 표적 분자를 고체상에 고정화시키고 유동 셀을 따라 흐르는 이동상 중의 리간드에 노출시킨다. 고정화된 표적에 리간드 결합이 발생하면, 국소 굴절률이 변하여 SPR 각도가 변하게 되는데, 이를 반사광의 강도 변화를 감지하여 실시간으로 모니터링할 수 있다. SPR 신호의 변화율을 분석하여 결합 반응의 결합 및 해리 단계에 대한 겉보기 속도 상수를 생성시킬 수 있다. 이들 값의 비는 겉보기 평형 상수(친화도)를 산출한다.
본원에 제공된 항원-결합 단백질의 친화도를, 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법을 사용하여 변경시킬 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본원은 또한 IgE에 대해 개선된 친화도를 갖는 본원의 항원-결합 단백질의 변이체를 설계한다. 이러한 변이체는, CDR 돌연변이화(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995), 쇄 셔플링(Marks et al., Bio/Technology, 10,779- 783, 1992), 에스케리키아 콜라이를 사용하는 돌연변이유발 균주(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이(Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 성적 PCR(Crameri et al, Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함한, 다수의 친화도 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다.
본원에서, "단리된 핵산 분자(들)"라는 용어는 일반적으로 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 예를 들어 이중 가닥 DNA일 수 있다. 이러한 핵산은 전체 세포, 세포 용해물 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 공지된 다른 방법을 포함하는 표준 기법에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 불순물(예를 들어, 다른 세포 핵산 또는 단백질)로부터 핵산을 단리 및 정제할 때, 이들은 "단리"되거나 "실질적으로 순수하다."
본원에서, "벡터"라는 용어는 일반적으로, 상기와 연결된 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. "벡터(들)"라는 용어는 플라스미드, 바이러스, 코스미드 및 인공 염색체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"로, 다른 DNA 분절이 결찰될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터로, 여기서 다른 DNA 분절이 바이러스 게놈에 결찰될 수 있이다. 일반적으로, 조작된 벡터는 복제 기원, 다중 클로닝 부위 및 선택 가능한 마커를 함유할 수 있다. 벡터 자체는 대개 삽입(트랜스유전자) 서열, 및 벡터의 "주쇄" 또는 "주된 쇄" 역할을 하는 더 큰 서열을 함유하는 뉴클레오티드 서열, 전형적으로는 DNA 서열이다. 최신 벡터는 트랜스유전자 삽입물 및 주쇄에 더해 프로모터, 유전자 마커, 항생제 내성, 리포터 유전자, 표적화 서열, 단백질 정제 태그와 같은 추가적인 특징을 함유할 수 있다.
본원에서, "세포"라는 용어는 일반적으로, 예를 들어 이종 폴리펩티드를 암호화하거나 또는 shRNA를 구성하는 핵산이 도입될 수 있거나 도입될 수도 있는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 벡터/플라스미드를 증식시키는데 사용될 수 있는 원핵생물 세포, 및 핵산 발현에 사용될 수 있는 진핵생물 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 진핵생물 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 또 다른 예에서, 포유동물 숙주 세포는 하기의 포유동물 세포 중에서 선택될 수 있다: CHO 세포(예를 들어, CHO K1 또는 CHO DG44), BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, HEK 293 세포, HEK 293EBNA 세포, PER.C6 세포 및 COS 세포. 특정 경우에, 포유동물 세포는 하이브리도마, 골수종 및 설치류 세포 중에서 선택될 수 있다. 골수종 세포는 래트 골수종 세포(예를 들어, YB2), 및 마우스 골수종 세포(예를 들어, NS0, SP2/0)를 포함할 수 있다. 약학적 적용을 위한 폴리펩티드 또는 단백질을 CHO 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, COS 세포, HEK 세포, BHK 세포, 세포 등과 같은 포유동물 세포에서 생성시킬 수 있다.
본원에서 "약학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 일반적으로 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 하나 이상의 무독성 물질을 의미한다. 이러한 제형은 통상적으로 염, 완충제, 보존제, 양립성 담체 및 임의로 다른 치료제를 함유할 수 있다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 또한 인간에게 투여하기에 적합한 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 함유할 수도 있다. 본원에 기재된 제형에 사용될 수 있는 다른 고려되는 담체, 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들어 풍미제, 항균제, 감미제, 산화방지제, 정전기 방지제, 지질, 단백질 부형제(예를 들어, 혈청 알부민, 젤라틴, 카제인), 염 형성 대이온(예를 들어, 나트륨) 등을 포함한다. 이들 및 본원에 기재된 제형에 사용하기에 적합한 다른 공지된 약학 담체, 부형제 및/또는 첨가제는 예를 들어 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences and Practice (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed., Pharmaceutical Press (2012)] 및 [Physician's Desk Reference Desk Reference)", 66th ed., Medical Economics (2012)]에 기재된 바와 같이, 당해 분야에 공지되어 있다. 목적하는 또는 요구되는 투여 방식, 용해도 및/또는 안정성을 위해 적합한 약학적으로 허용되는 담체가 통상적으로 선택될 수 있다.
본원에서, "비정상적인 수준의 IgE와 연관된 질환"이라는 용어는 일반적으로 비정상적인(예를 들어, 상승된) 수준의 혈청 IgE와 연관된 임의의 상태 또는 장애를 지칭한다. 비정상적인 수준의 IgE와 연관된 예시적인 질환은 기관지 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 두드러기, 알레르기 반응 또는 아토피성 피부염을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서, "폴리펩티드", "펩티드", "단백질" 및 "단백질들"이라는 용어는 호환적으로 사용될 수 있으며 일반적으로 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형이거나 또는 분지될 수 있고, 변형된 아미노산을 함유할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 이러한 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 이러한 변형은 하기를 포함할 수 있다: 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작(예를 들어, 표지화 성분에의 결합). "아미노산"이라는 용어는 글리신 및 D 및 L 광학 이성질체를 비롯한 천연 및/또는 비-천연 또는 합성 아미노산뿐만 아니라 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체를 포함한다.
본원에서, "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"라는 용어는 호환적으로 사용될 수 있으며 일반적으로 임의의 길이를 갖는 중합체 형태의 뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있고 공지되거나 공지되지 않은 임의의 기능을 수행할 수 있다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비-암호화 영역, 결찰 분석에 의해 정의된 다중 유전자좌(하나의 유전자좌), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전이 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 탐침, 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오티드 구조의 변형은 중합체 조립 전 또는 후에 수행될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 표지된 성분에의 접합에 의해서, 중합 후에 추가로 변형될 수 있다.
본원에 언급된 특정 단백질 및 뉴클레오티드에 더하여, 본원은 또한 기능적 변이체, 유도체, 유사체, 상동체 및 그의 단편을 포함할 수 있다.
"기능적 변이체"라는 용어는 자연 발생 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖거나 또는 자연 발생 서열과 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고 자연 발생 서열의 하나 이상의 활성을 가질 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 본원의 맥락에서, 임의의 주어진 서열의 변이체는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 적어도 하나의 내인성 기능을 실질적으로 유지하도록 특정 잔기 서열(아미노산 잔기든 또는 뉴클레오티드 잔기든)이 변형된 서열을 지칭한다. 변이체 서열은 원래의 기능적 활성이 남아있는 한, 자연 발생 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 적어도 하나의 아미노산 잔기 및/또는 뉴클레오티드 잔기의 부가, 결실, 치환, 변형, 교체 및/또는 변이에 의해 획득될 수 있다.
본원에서, "유도체"라는 용어는 일반적으로, 생성되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드가 그의 내인성 기능 중 적어도 하나를 실질적으로 유지하는 한, 본원의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 하나(또는 그 이상)의 아미노산 잔기의 임의의 치환, 변이, 변형, 교체, 결실 및/또는 부가를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본원에서, "유사체"라는 용어는 일반적으로 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 임의의 모방체를 포함하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드, 즉 모방체가 모방하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 적어도 하나의 내인성 기능을 갖는 화학적 화합물을 지칭한다.
일반적으로, 변형된 서열이 실질적으로 목적하는 활성이나 능력을 유지하는 한, 적어도 1개(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 20개 이상)의 아미노산 치환과 같은 아미노산 치환이 이루어질 수 있다. 아미노산 치환은 자연적으로 발생하지 않는 유사체의 사용을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 단백질 또는 폴리펩티드는 또한, 침묵 변화를 생성시키고 기능적으로 균등한 단백질을 생성시키는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 의도적인 아미노산 치환은 내인성 기능이 유지되는 한, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질의 유사성에 기초하여 이루어질 수 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아미노산에는 아스파트산 및 글루탐산이 포함되고; 양으로 하전된 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 포함되며; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드기를 함유하는 아미노산에는 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌 및 티로신이 포함된다.
본원에서, "상동체"라는 용어는 일반적으로 야생형 아미노산 서열 및 야생형 뉴클레오티드 서열에 대해 특정한 상동성을 갖는 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "상동성"이라는 용어는 서열 "일치성"과 동일할 수 있다. 상동성 서열은 대상 서열에 적어도 80%, 85%, 90%, 99.1 %, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 일치하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 전형적으로, 상동체는 대상 아미노산 서열과 동일한 활성 부위 등을 함유할 것이다. 상동성은 유사성(즉, 유사한 화학적 성질/기능을 가진 아미노산 잔기)에 관하여 고려될 수 있거나 서열 일치성에 관하여 표현될 수 있다. 본원에서, 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열의 서열번호 중 어느 하나에 대해 일치성 퍼센트를 갖는 서열은 참조 서열번호의 전체 길이에 걸쳐 상기 일치성 퍼센트를 갖는 서열을 의미한다.
서열 일치성을 측정하기 위해서, 당업자에게 공지된 다양한 수단에 의해, 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN, NEEDLE, 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어 등을 사용하여 수행될 수 있는 서열 정렬을 수행할 수 있다. 당업자는 비교되는 완전 길이 서열 중에서 최적 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 정렬에 적합한 매개변수를 결정할 수 있다.
본원에서 "및/또는"이라는 용어는 대안 중 하나 또는 모두를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 "포함하는"이라는 용어는 일반적으로, 명시적으로 명시된 특징을 포함하되, 다른 요소를 배제하지 않는 것을 의미한다.
본원에서 "약"이라는 용어는 일반적으로, 명시된 값 위 또는 아래 0.5%-10% 범위 내의 변화, 예를 들어 명시된 값 위 또는 아래 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%, 3.5%, 4%, 4.5%, 5%, 5.5%, 6%, 6.5%, 7%, 7.5%, 8%, 8.5%, 9%, 9.5%, 또는 10% 범위 내의 변화를 지칭한다.
구현예
하나의 태양에서, 본원은 항원-결합 단백질을 제공하며, 항원-결합 단백질은 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함할 수 있고, 여기서 오말리주맙의 경쇄 가변 영역(즉, 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열)과 비교하여, 본원에 기재된 항원-결합 단백질의 VL은 E55 및 V104로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 1개 또는 2개의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에서 항원-결합 단백질의 VL은 D30b, V29, D30, Y30a 및 G30c로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5)의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 VL은 D30b, E55 및 V104 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, V29, D30 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, D30 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에서, E55 위치의 아미노산 돌연변이는 E55Q를 포함할 수 있다.
본원에서, V104 위치의 아미노산 돌연변이는 V104L을 포함할 수 있다.
본원에서, D30b 위치의 아미노산 돌연변이는 D30bE를 포함할 수 있다.
본원에서, V29 위치의 아미노산 돌연변이는 V29L을 포함할 수 있다.
본원에서, Y30a 위치의 아미노산 돌연변이는 Y30A, Y30aS 및 Y30aD로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에서, D30 위치의 아미노산 돌연변이는 D30Y, D30A, D30E, D30F, D30G 및 D30N으로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에서, G30c 위치의 아미노산 돌연변이는 G30cA, G30cY 및 G30cW로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에서, VL은 하기 아미노산 돌연변이 그룹을 포함할 수 있다: D30bE, E55Q 및 V104L.
본원에서, VL은 서열번호 57에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서, 항원 결합 단백질의 VL은 서열번호 23-34에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L, V29L, D30Y 및 Y30aD를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L, D30A, Y30aD 및 G30cW를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 30bE, E55Q, V104L 및 Y30aA를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L 및 Y30aD를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L 및 Y30aS를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L, Y30aD 및 G30cY를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L, D30E, Y30aD 및 G30cW를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L, D30G, Y30aD 및 G30cA를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L, D30N, Y30aD 및 G30cA를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L, D30N, Y30aD 및 G30cW를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 아미노산 돌연변이 D30bE, E55Q, V104L, D30F 및 Y30aD를 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질은 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 경쇄 불변 영역은 인간 카파 경쇄에서 유래될 수 있다. 예를 들어, 경쇄 불변 영역은 서열번호 59에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질은 또한 항체 경쇄도 포함할 수 있다. 항체 경쇄는 항체 경쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항원-결합 단백질의 항체 경쇄는 서열번호 23-34에 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항원-결합 단백질은 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있으며, 여기서 오말리주맙의 중쇄 가변 영역(서열번호 50에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열)과 비교하여, 항원-결합 단백질의 VH는 I37, A49, S50 및 D54로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3 또는 4)의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질의 VH는 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7)의 위치: N60, P61, I67, T30, S31, S96 및 H97로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 아미노산 돌연변이를 추가로 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 VH는 하기 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다: N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54.
예를 들어, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54, S96 및 H97 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 T30 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함 할 수 있다.
예를 들어, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S96 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함 할 수 있다.
예를 들어, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S31 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 H97 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함 할 수 있다.
본원에서, I37 위치의 아미노산 돌연변이는 I37V를 포함할 수 있다.
본원에서, A49 위치의 아미노산 돌연변이는 A49S를 포함할 수 있다.
본원에서, S50 위치의 아미노산 돌연변이는 S50V를 포함할 수 있다.
본원에서, D54 위치의 아미노산 돌연변이는 D54A를 포함할 수 있다.
본원에서, N60 위치의 아미노산 돌연변이는 N60A를 포함할 수 있다.
본원에서, P61 위치의 아미노산 돌연변이는 P61D를 포함할 수 있다.
본원에서, I67 위치의 아미노산 돌연변이는 I67F를 포함할 수 있다.
본원에서, T30 위치의 아미노산 돌연변이는 T30R을 포함할 수 있다.
본원에서, S31 위치의 아미노산 돌연변이는 S31Q를 포함할 수 있다.
본원에서, S96 위치의 아미노산 돌연변이는 S96T를 포함할 수 있다.
본원에서, H97 위치의 아미노산 돌연변이는 H97N을 포함할 수 있다.
본원에서, VH는 하기의 아미노산 돌연변이 그룹을 포함할 수 있다: N60A, P61D, I67F, I37V, A49S, S50V 및 D54A.
본원에서, VH는 서열번호 58에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질의 VH는 서열번호 51-56에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 VH는 아미노산 돌연변이 N60A, P61D, I67F, I37V, A49S, S50V, D54A, S96T 및 H97N을 포함할 수 있다.
예를 들어, VH는 아미노산 돌연변이 N60A, P61D, I67F, I37V, A49S, S50V, D54A 및 T30R을 포함할 수 있다.
예를 들어, VH는 아미노산 돌연변이 N60A, P61D, I67F, I37V, A49S, S50V, D54A 및 S96T를 포함할 수 있다.
예를 들어, VH는 아미노산 돌연변이 N60A, P61D, I67F, I37V, A49S, S50V, D54A 및 S31Q를 포함할 수 있다.
예를 들어, VH는 아미노산 돌연변이 N60A, P61D, I67F, I37V, A49S, S50V, D54A 및 H97N을 포함할 수 있다.
본원에서, 항원 결합 단백질은 HCDR1, HCDR 2 및 HCDR3을 포함할 수 있으며, HCDR1은 서열번호 62에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, HCDR2는 서열번호 62에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, HCDR3은 서열번호 63에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함할 수 있고, HCDR1은 서열번호 36-37에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, HCDR2는 서열번호 42에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, HCDR3은 서열번호 45-48에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있으며, LCDR1은 서열번호 64에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, LCDR2는 서열번호 17에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, LCDR3은 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원 결합 단백질은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고, LCDR1은 서열번호 3-14에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, LCDR2는 서열번호 17에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, LCDR3은 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3은 각각 서열번호 62, 42, 63, 64, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있고, HCDR1은 서열번호 36-37에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, HCDR2는 서열번호 42에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, HCDR3은 서열번호 45-48에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, LCDR1은 서열번호 3-14에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, LCDR2는 서열번호 17에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, LCDR3은 서열번호 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열번호 36, 42, 45, 3, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 46, 4, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 37, 42, 45, 5, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 47, 6, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 45, 7, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 45, 8, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 48, 9, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 45, 10, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 48, 11, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 45, 12, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 47, 12, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 36, 42, 47, 13, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
예를 들어, 항원-결합 단백질은 서열 번호 38, 42, 45, 14, 17 및 19에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 각각 포함할 수 있는 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질은 프레임워크 영역 HFR1, HFR2, HFR3, HFR4, LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함할 수 있고, 이들은 각각 35, 40, 44, 49, 1, 15, 18 및 21에 나타낸 바와 같은 서열번호 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질은 항체 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 특정 경우에, 항체 중쇄 불변 영역은 인간 IgG 불변 영역으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG 불변 영역은 인간 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 특정 예에서, 인간 IgG1 불변 영역은 M252Y, S254T 및 T256E(Chothia 넘버링 규칙)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인간 IgG1 불변 영역은 하기 그룹의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다: M252Y, S254T 및 T256E(Chothia 넘버링 규칙). 특정 예에서, 본원에 기재된 항원-결합 단백질의 항체 중쇄 불변 영역은 서열번호 60-61에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질은 또한 항체 중쇄를 포함할 수 있다. 항체 중쇄는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 불변 영역(VH)을 포함할 수 있으며, 여기서 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여, VL은 E55 및 V104로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 1개 또는 2개의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있으며, 서열번호 50에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여, VH는 I37, A49, S50 및 D54로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상(예를 들어, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
특정 예에서, 항원-결합 단백질의 VL은 하기 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고: D30b, E55 및 V104, VH는 하기 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다: N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54.
예를 들어, 항원-결합 단백질의 VL은 D30b, E55, V104, V29, D30 및 Y30a 위치의 그룹에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54, S96 및 H97 위치의 그룹에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원의 항원-결합 단백질의 VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 T30 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104 및 Y30a 위치의 그룹에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S96 위치의 그룹에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104 및 Y30a 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, Y30a 및 G30c 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104 및 Y30a 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 H97 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, D30 및 Y30a 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 H97 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S96 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있고, VH는 N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S31 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.
본원에서 각 위치의 아미노산 돌연변이의 종은 상기 언급한 것일 수 있다.
본원에서, 항원-결합 단백질의 VL은 서열번호 23-34에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있고, VH는 서열번호 51-56에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 23에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 51에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 24에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 52에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 25에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 53에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 26에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 54에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 27에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 51에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 28에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 51에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 29에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 55에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 30에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 51에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 31에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 55에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 32에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 51에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 32에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 54에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 33에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 54에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
예를 들어, VL은 서열번호 34에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있고, VH는 서열번호 56에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항원-결합 단백질은 높은 화학적 안정성을 갖는다. 예를 들어, 고온, 낮은 pH 및/또는 반복된 동결 및 해동에서 안정하다. 예를 들어, 40℃에서 0일 내지 28일 동안, 또는 pH 5.0 및 40℃에서 0일 내지 28일 동안, 본원의 항원-결합 단백질은 오말리주맙과 비교하여 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 15%, 20%, 25%, 30% 또는 그 이상) 더 적게 응집체를 생성시킨다(예를 들어, 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피 SEC-HPLC에 의해 검출됨). 예를 들어, 40℃에서 0 내지 28일 동안, 또는 pH 5.0 및 40℃에서 0 내지 28일 동안, 본원에 기재된 항원-결합 단백질의 주요 피크 함량은 오말리주맙의 경우와 비교하여 적어도 5%(예를 들어, 적어도 10%, 15%, 20% 또는 그 이상) 더 높다(예를 들어, 전체-컬럼 영상화 모세관 등전점 전기영동(iCIEF 검출)에 의해).
본원에 기재된 항원-결합 단백질은 인간 IgE 또는 그의 단편에 대해, 예를 들어 인간 IgE CH3-CH4에의 결합에 대해 5×10-10 M 미만(예를 들어, 4×10-10 M, 3×10-10 M, 2×10-10 M, 2.8×10-10 M, 2.6×10-10 M, 2.4×10-10 M, 2.2×10-10 M, 2.0×10-10 M, 1.8×10-10 M, 1.6×10-10 M, 1.410-10 M, 1.2×10-10 M, 1.0×10-10 M 미만 또는 심지어 더 적은)(예를 들어, Octet Red에 의해 검출된 바와 같음)의 KD 값으로; 또 다른 예의 경우, 인간 완전길이 IgE에의 결합에 대해 2×10-9 M 미만(예를 들어, 1.5×10-9 M, 1.2×10-9 M, 1×10-9M 미만 또는 심지어 더 적은)(예를 들어, Octet Red에 의해 검출된 바와 같음)의 KD 값으로; 보다 또 다른 예의 경우, 인간 완전길이 IgE에의 결합에 대해 5×10-9 M 미만(예를 들어, 4.8×10-9 M, 4.6×10-9 M, 4.4×10-9 M, 4.2×10-9 M, 4.0×10-9 M, 3.8×10-9 M 미만 또는 심지어 더 적은)(예를 들어, Biacore에 의해 검출된 바와 같음)의 KD 값으로 높은 결합 친화도를 갖는다.
본원에 기재된 항원 결합 단백질은 원숭이 IgE에 높은 친화도로, 예를 들어 키노몰구스 원숭이의 IgE CH3-CH4에의 결합에 대해 3.0×10-10 M 미만(예를 들어, 2.5×10-10 M, 2.4×10-10 M, 2.3×10-10 M, 2.2×10-10 M, 2.1×10-10 M, 2.0×10-10 M, 1.9×10-10 M, 1.8×10-10 M 미만 또는 심지어 더 적은)(예를 들어, Octet Red에 의해 검출된 바와 같음)의 KD 값; 또 다른 예의 경우, 원숭이 IgE CH3-CH4에의 결합에 대해 4.0×10-9 M 미만(예를 들어, 3.9×10-9 M, 3.8×10-9 M, 3.7×10-9 M, 3.6×10-9 M, 3.5×10-9 M 미만 또는 심지어 더 적은)(예를 들어, Biacore에 의해 검출된 바와 같음)의 KD 값의 높은 친화도로 결합할 수 있으며, 이는 전임상 동물 모델에서, 약력학 연구를 촉진할 수 있다.
본원에 기재된 항원 결합 단백질은, 예를 들어 FcεRI에 대한 인간 완전길이 IgE의 결합 차단에 대해서 1.5 nM 미만(예를 들어, 1.4 nM, 1.3 nM, 1.2 nM, 1.1 nM, 1.0 nM, 0.9 nM 미만 또는 심지어 더 적은)(예를 들어, ELISA에 의해 검출된 바와 같음)의 EC50 값으로, 또 다른 예의 경우 FcεRI-발현 세포로부터의 IgE-자극된 히스타민 방출의 차단에 대해서 4.0 nM 미만(예를 들어, 3.9 nM, 3.8 nM, 3.7 nM, 3.6 nM, 3.5 nM, 3.4 nM, 3.3 nM, 3.2 nM, 3.1 nM, 3.0 nM 미만 또는 심지어 더 적은)의 EC50 값으로, IgE Fc 수용체(FcεRI)에 대한 IgE의 결합을 유효하게 차단할 수 있다.
본원의 항원-결합 단백질은 혈중 반감기가 길기 때문에 주사 빈도를 줄이고 환자의 질환 억제를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 항원-결합 단백질의 반감기는 비-구획 모델 분석 또는 ELISA 분석을 사용한 유리 IgE 농도에 의해 계산된 바와 같이, 오말리주맙보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% 또는 그 이상 증가한다.
핵산 분자, 벡터 및 세포
본원은 또한 본원의 항원-결합 단백질의 중쇄 및/또는 경쇄를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 적합하게는, 핵산 분자는 본원의 항원-결합 단백질의 중쇄 또는 경쇄를 암호화한다. 본원의 핵산 분자는, 예를 들어 화학적 처리에 의해 생성된 합성 DNA, cDNA, 게놈 DNA, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원의 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 당업자에게 주지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부 또는 전부를 암호화하는 핵산 분자를, 분석된 핵산 분자로부터 또는 상응하는 아미노산 서열에 기초 하여 목적하는 대로 합성할 수 있다. 본원의 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 분자 생물학의 표준 기법을 사용하여 제조할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 합성 기법을 사용하여 목적하는 핵산 분자를 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다. 적합한 경우 부위-지향된 돌연변이유발 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기법을 사용할 수 있다.
본원은 또한 본원의 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본원의 항원-결합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터를 제공한다. 대안적으로, 클로닝 또는 발현 벡터는 각각 본원의 항원-결합 단백질의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 2개의 핵산 분자 및 적합한 신호 서열을 포함할 수 있다.
본원은 또한 본원의 항원-결합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 사용하여 본원의 항원-결합 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 발현시킬 수 있다. 에스케리키아 콜라이와 같은 세균 및 기타 미생물 시스템이 사용되거나, 또는 포유동물과 같은 진핵생물, 숙주 세포 발현 시스템이 또한 사용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주 세포는 CHO, 골수종 또는 하이브리도마 세포를 포함한다.
제조 방법
본원은 항원-결합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 세포를 배양하는 것을 포함하는, 본원에 기재된 항원-결합 단백질의 생성 방법을 제공한다. 항원-결합 단백질은 단지 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있으며, 이 경우 중쇄 또는 경쇄에 대한 암호화 서열만이 숙주 세포로 형질감염될 수 있다. 중쇄와 경쇄를 모두 포함하는 생성물을 생성시키기 위해서 세포주를 2개의 벡터, 즉 경쇄 폴리펩티드를 암호화하는 제1 벡터 및 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 제2 벡터로 형질감염시킬 수 있다. 대안적으로, 단일 벡터를 사용할 수 있으며, 벡터는 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다.
본원은 숙주 세포를 배양하고, 항원-결합 단백질 또는 이의 단편을 발현, 단리 및 정제하는 방법을 제공한다.
하나의 구현예에서, 불순물은 컬럼상에 유지되고 항체는 용출되도록 비-결합 방식으로 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 항원-결합 단백질의 정제 방법을 제공한다.
일례로, 정제는 단백질 A 컬럼상에서의 친화도 포획에 이어서 적정을 사용할 수 있다. 일례로, 정제는 단백질 G 컬럼상에서의 친화도 포획에 이어서 HPLC 적정을 사용할 수 있다. 일례로, 정제는 IgE 컬럼상에서의 친화도 포획에 이어서 적정을 사용할 수 있다. 정제 방법은 또한 정용여과 단계 또는 HPLC 여과 단계와 같은 하나 이상의 여과 단계를 포함할 수 있다.
약학 조성물, 방법 및 용도
본원의 항원-결합 단백질은 병리학적 상태의 치료 및/또는 예방에 적합하기 때문에, 본원은 또한 본원의 항원-결합 단백질을 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약학적 또는 진단학적 조성물을 제공 한다. 따라서, 본원은 또한 약학 조성물의 제조에서 본원의 항원-결합 단백질의 용도를 제공한다.
본원은 또한 본원의 항체 또는 항원 결합제를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 첨가하고 혼합하는 것을 포함하는 약학적 또는 진단학적 조성물의 제조 방법을 제공한다. 항원-결합 단백질은 약학적 또는 진단학적 조성물에서 유일한 활성 성분으로 작용하거나, 또는 다른 항체 또는 비-항체 성분, 예를 들어 스테로이드 또는 다른 약물 분자, 특히 반감기가 IgE 결합과 관련되지 않는 약물 분자를 포함한 다른 활성 성분을 동반할 수 있다.
조성물을 환자에게 개별적으로 투여하거나 또는 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 함께 (예를 들어 동시에, 순차적으로 또는 별도로) 투여할 수 있다.
다른 한편으로, 본원은 비정상적인 수준의 IgE와 연관된 질환을 완화시키거나 또는 치료하기 위한 약제의 제조에서 항원-결합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 세포 및/또는 조성물의 용도를 제공한다.
또 다른 태양에서, 본원은 비정상적인 수준의 IgE와 연관된 질환을 완화시키거나 또는 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 방법은 완화 또는 치료가 필요한 피실험자에게 항원-결합 단백질, 핵산 분자, 벡터, 세포 및/또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
약학 조성물은 치료 유효량의 본원의 항체 또는 항원-결합 단백질을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료 유효량"이란 용어는 표적 질환 또는 상태를 치료, 개선 또는 예방하거나 검출가능한 치료 또는 예방 효과를 나타내는 데 필요한 치료제의 양을 지칭한다. 임의의 개시된 항체 또는 항원-결합 단백질에 대해, 치료 유효량은 초기에 세포 배양 분석 또는 동물 모델, 전형적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서 추정될 수 있다. 동물 모델을 또한 사용하여 적합한 농도 범위와 투여 경로를 결정할 수도 있다. 그런 다음 이 정보를 사용하여 인간에게 투여하기에 적합한 용량과 경로를 결정할 수 있다. 인간 피실험자에 대한 정확한 치료 유효량은 질병 상태의 중증도, 피실험자의 전반적인 건강, 피실험자의 연령, 체중 및 성별, 식사, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합, 반응 민감도 및 치료법에 대한 내성/반응에 따라 달라질 것이다.
본원의 약학 조성물은 경구, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 척수강내, 심실내, 경피, 피부경유, 피하, 복강내, 비강내, 경장, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물을 또한 무바늘 주사 장치를 사용하여 투여할 수 있다. 전형적으로, 치료 조성물을 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로서 제조한다. 주사 전에 액체 비히클에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태도 또한 제조할 수 있다.
본원의 항원-결합 단백질을 포함하는 약학 조성물의 치료 용량은 생체내에서 유의한 독성 효과를 나타내지 않는다. 또한, 연속 용량의 본원의 항원-결합 단백질을 투여함으로써, 피실험자에서 IgE 활성의 수준을 적합하게 정상(예를 들어, 감소된) 수준으로 유지시킬 수 있다.
어떠한 이론에도 구애받지 않으면서, 하기의 실시예는 단지 본원의 융합 단백질, 제조 방법 및 용도 등을 예시하고자 하는 것일 뿐이며, 본원 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 오말리주맙 조작된 최적화된 항체의 설계 및 발현
오말리주맙의 경쇄 및 중쇄 가변 영역(경쇄 가변 영역 서열은 서열번호 22에 나타내고, 중쇄 가변영역 서열은 서열번호 50에 나타낸다)을 기반으로, 경쇄 및 중쇄의 최적화된 설계, 인간화된 돌연변이 및 번역-후 변형(PTM) 부위의 제거를 수행하여 신규의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 획득한다.
이어서, 완전길이 재조합 항체의 경쇄 및 중쇄 단백질 서열의 코돈 최적화를 수행하고, 코돈-최적화된 DNA 단편(Genscript)을 유전적으로 합성하였다. 클로닝 후, IgG1 형태의 합성된 유전자 단편을 발현 벡터 pcDNA3.4(Life Technologies)에 삽입하였다. 발현 플라스미드를 증폭시키고 플라스미드를 추출한 후, 두 플라스미드를 ExpiCHO 세포(ThermoFisher Scientific, A29133)에 동시-형질감염시키고, 이어서 항체를 제조사의 ExpiCHO 발현 시스템의 방법에 따라, Expi CHO 세포를 8% 이산화탄소 농도, 36.5℃에서 배지 25 ㎖의 총 배양 부피로 6 × 106/㎖의 밀도로 배양하고, ExpiFectamine 형질감염 시약을 사용하여 각각 10 ㎍의 항체 경쇄 및 중쇄 발현 플라스미드를 각각 세포내로 형질전환시키고; 형질감염 하루 후에, 150 ㎕ 및 4 ㎖의 ExpiCHO 인핸서 및 ExpiCHO 보충 물질을 배양된 세포에 가하고, 세포를 9일 동안 배양한 다음 4도에서 3500 rpm에서 원심분리시켜 상등액을 수득함으로써 일시적으로 발현시켰다. AmMagTM 단백질 A 자기 비드(Genscript, L00695) 및 항체 발현 상등액을 혼합한 다음, 실온에서 2 시간 동안 배양하고, PBS로 2회 세척한 후 상등액을 버리고, 이어서 적합한 양의 용출 완충제 단백질 G 또는 A SefinosTM 용출 완충제(Sangon, C600481)를 가한 다음, 충분히 혼합한 후에 이를 튜브 받침대에 올려놓아 5분간 배양하고, 배양 기간 동안 자기 비드를 2-3회 재현탁시킨 다음 2회 용출시킨 직후, 중화 및 보관을 위해 적합한 양의 중화 용액 1 M Tris-HCl, pH 7.5(Sangon, B548124)를 가하였다. 수득된 정제된 항체를 표 7에 나타낸다(AB1904HzL0H0는 오말리주맙을 나타낸다).
[표 7]
인간화 및 PTM 돌연변이 제거 후 항체
Figure pct00001
실시예 2 인간 IgE 친화도 분석
항체를 먼저 비오틴화된 인간 IgE CH3-CH4(비오틴-hIgE CH3-CH4, Sino Biological, Cat. No. 29702-H08H, 사내에서 비오틴-표지함)와의 친화도에 대해 시험하고 하기의 실험 과정에 따라 해리 속도에 의해 분류하였다:
(1) 항원 및 항체의 희석: 항원과 항체를 모두 1 x 동역학적 완충제(Kinetic Buffer, Fortebio, 18-1105)로 희석하였으며, 항원의 사용 농도는 1 ㎍/㎖이고, 항체의 사용 농도는 100 nM이었다.
(2) 기계 상에서 샘플의 검출(Octet Data Acquisition 11.1.0.11): 먼저, 샘플을 96-웰 플레이트(Greiner bio-one, 655209)에 하기 표에 따라 200 ㎕/웰로 가하였다. 이어서 소프트웨어 매개 변수를 설정하고, 플레이트 온도를 30℃로 설정하고, 표준 동역학적 신호의 주파수를 5.0 Hz에서 수집하였다. 이어서, 1xPBST가 포함된 CH1 센서(Fortebio, 18-0039)를 10분 동안 미리-습윤시키고, 이어서 기계 상에서 시험하였다. 각 주기는 하기의 단계를 포함한다: 1) 완충제에 60s 동안 침지시키고; 2) 항원이 센서에 비-특이적으로 결합하는 지의 여부를 검출하고; 3) 10 mM pH 1.7의 글리신 용액으로 재생시키고; 4) 완충제에 60s 동안 침지시키고; 5) 항체를 센서 상에 30s 동안 고정화시키고; 6) 센서를 완충제에 180s 동안 침지시키고; 7) 항원-항체를 180s 동안 결합시키고; 8) 항원-항체를 10분 동안 해리시키고; 9) 센서를 재생시킨다.
(3) 데이터 분석: Fortebio's Data Analysis 11.1 소프트웨어를 사용하여 항원-항체의 결합 속도(Ka)와 해리 속도(Kd)를 1:1 결합 방식으로 측정하여 항체의 평형 해리 상수(KD)를 계산하고, 결과를 표 2에 나타낸다.
실시예 3 항체의 물리화학적 성질의 검출
3.1 SEC-HPLC 순도 분석
(1) 샘플을 1 ㎎/㎖로 희석하고, 충분히 혼합하고, 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리시킨 다음, 상등액을 수득하고 이를 샘플 병으로 옮긴 후에, HPLC 샘플 선반에 놓았다. 크로마토그래피 조건을 하기와 같이 설정하였다:
Figure pct00002
(2) 컬럼을 이동상(200 mM 포스페이트 완충제, pH 6.8)으로 평형화시킨 후에, 샘플을 주입하고 분석하였으며, 데이터를 크로마토그래피 소프트웨어에 의해 분석하고, 각 피크의 피크 면적 백분율을 피크 면적 정규화 방법에 의해 계산하였다.
3.2 HIC-HPLC 분석
(1) 샘플을 1 ㎎/㎖로 희석하고, 충분히 혼합하고, 12,000 rpm에서 5분 동안 원심분리시킨 다음, 상등액을 수득하고 이를 샘플 병으로 옮긴 후에, HPLC 샘플 선반에 놓았다. 크로마토그래피 조건을 하기와 같이 설정하였다:
Figure pct00003
(3) 구배 용출 분석을, 이동상 A(50 mM 포스페이트 완충제/1 M 암모늄 설페이트, pH 7.0) 및 이동상 B(50 mM 포스페이트 완충제, pH 7.0)로 수행하였으며, 데이터 분석을 크로마토그래피 소프트웨어에 의해 수행하였다. 체류 시간을 기준으로, 각 샘플의 친수성 계수를 계산하였다.
3.3 용융 온도(Tm) 값 분석
시험하고자 하는 샘플을 샘플 완충제로 1 ㎎/㎖로 희석하고, 이어서 13 ㎕의 시험 용액을 Protein Thermal Shift™ Starter Kit(Cat. No. 4461146)의 설명에 따라 PCR 튜브에 가한 다음, 5 ㎕의 Protein Thermal shiftTM 완충제 및 2 ㎕의 10× 염색 용액을 가하여 20 ㎕의 반응 부피를 만들고, 혼합 전에 12000 rpm에서 5분 동안 원심분리시켜 기포를 제거하였다. 시험하고자 하는 샘플을 PCR 기계에 놓고, 분석하고, 샘플의 Tm 값을 기록하였다.
3.4 ICIEF 분석
샘플 용액을 하기의 충분히-혼합된 시스템에 가하였다: 1% 메틸셀룰로스(Cat. No. 101876) 70 ㎕, 우레아(Cat. No. U6504) 4 M, 양성전해질 Pharmalyte pH 3-10(Cat. No. 17-0456-01) 8 ㎕, 각각 2 ㎕의 pI 마커 5.5(Cat. No. A58325) 및 9.5(Cat. No. A358357). 적합한 분량의 초순수를 200 ㎕로 가하고 충분히 혼합하였다. 모든 샘플을 6000 rpm에서 3분 동안 원심분리시켜 기포를 제거하고, 이어서 상등액을 샘플 병으로 옮기고, 샘플 선반에 올려놓고, 샘플 위치를 기록하였다. 작업 시작 후, 스펙트럼 통합 처리를 위해 결과 파일을 Chrom Perfect 소프트웨어로 가져오고 각 피크의 등전점과 각 피크의 백분율을 계산하였다. 항체의 물리화학적 시험 결과를 표 8에 나타낸다.
[표 8]
인간화 및 PTM 돌연변이 후 항체의 물리화학적 성질
Figure pct00004
결과는 AB1904L1p1H3p2(경쇄 가변 영역 서열번호 23, 중쇄 가변 영역 서열번호 51)가 더 높은 친화도를 가지며, 동시에 잠재적인 번역-후 변형 부위를 제거하여, 화학적 안정성을 더욱 개선시킴을 나타낸다.
실시예 4 신규 항체에 대한 효모 친화도 성숙
AB1904L1P1H3P2를 효모 친화도 성숙을 위해서 선택하였으며, 표 9에 나타낸 항체 AB1904Am1 내지 AB1904Am15를 수득하였고, 여기서 YTE(M252Y/S254T/T256E) 조작된 돌연변이를 Fc 단편상에서 수행하였으며, 이를 각각 AB1904Am13, AB1904Am14, 및 AB1904Am15라 명명하였다.
[표 9]
친화도 성숙되고 YTE 조작된 돌연변이 항체
Figure pct00005
표 9의 항체에 대한 물리화학적 성질을 실시예 3의 방법으로 시험하였으며, 그 결과를 표 10에 나타낸다.
[표 10]
친화성 성숙 및 YTE 조작된 돌연변이 후 항체의 물리화학적 성질
Figure pct00006
실시예 5 항체는 인간 IgE CH3-CH4, 인간 완전길이 IgE 및 키노몰구스 원숭이 IgE CH3-CH4(Octet Red 검출)에 결합한다
5.1 본원에 기재된 항체는 인간 IgE CH3-CH4에 결합할 수 있다
인간 IgE CH3-CH4(hIgE CH3-CH4, Sino Biological, Cat. No.: 29702-H08H)에 대한 항체 AB1904Am 1- AB1904Am 12의 친화도를 Octet RED96e(Fortebio)에 의해 측정하였다. 항원과 항체 모두 1xPBST(1xPBS: Sango, B548117-0500; 0.02% Tween 20: sigma-alorich, P1379)를 사용하여 희석하고, 항원을 50 nM의 농도로 사용하고, 항체를 33.3 nM의 농도로 사용하였다. 실시예 2의 방법에 따라 On-machine 검출을 수행하였다. 그 결과를 표 11에 나타내었으며, 이는 항체가 인간 IgE CH3-CH4에 대해 높은 친화도를 갖고, KD 값이 오말리주맙의 값과 유사하거나 이보다 낮음을 가리킨다.
[표 11]
인간 IgE CH3 - CH4에 대한 항체의 결합 친화도 결과
Figure pct00007
5.2 본원에 기재된 항체는 인간 완전길이 IgE에 결합할 수 있다
인간 완전길이 IgE(FL hIgE, ABBIOTEC, Cat. No. 250205)에 대한 항체의 친화도를 실시예 2의 방법에 따라 측정하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다. 모든 항체가 인간 완전길이 IgE에 높은 친화도로 결합할 수 있다.
[표 12]
인간 완전길이 IgE에 대한 항체의 결합 친화도 결과
Figure pct00008
5.3 본원에 기재된 항체는 키노몰구스 원숭이 IgE CH3-CH4에 결합할 수 있다
항체와 비오틴화된 키노몰구스 원숭이 IgE CH3-CH4(비오틴 - 키노 IgE CH3-CH4, Kactus Biosystems)와의 친화도를 실시예 2의 방법에 따라 시험하였으며, 그 결과를 표 13에 나타낸다. 모든 항체가 비오틴화된 키노몰구스 원숭이 IgE CH3-CH4에 높은 친화도로 결합할 수 있었다.
[표 13]
비오틴화된 키노몰구스 원숭이 IgE CH3-CH4에 대한 항체의 결합 친화도 결과
Figure pct00009
실시예 6 항체는 인간 완전길이 IgE 및 키노몰구스 원숭이 IgE CH3-CH4에 결합한다(Biacore 검출)
먼저, 비오틴 CAPture 시약을 CAP 칩(GE Healthcare, Cat. No. 28-9202-34) 상에 2 ㎕/분의 유량으로 300s 동안 포획하였다. HBS-EP+를 실험 완충제로서 사용하였다. 포획된 항원에 대한 특정 농도의 항체의 결합을 각각의 주입 주기에 대해 측정하였으며, 여기서 각 주기는 항원의 포획, 상이한 농도의 항체 주입 및 재생을 포함한다. 2 ㎍/㎖의 비오틴화된 인간 완전길이 IgE(비오틴-FL hIgE, Abbiotec, Cat. No. 250205, 자체적으로 비오틴화함) 또는 0.25 ㎍/㎖의 비오틴화된 키노몰구스 원숭이 IgE CH3-CH4(비오틴-키노 IgE, Kactus Biosystems에서 맞춤)를 60s 동안 10 ㎕/분의 유량으로 2 채널 상에 포획하였으며, 1 채널은 블랭크 참조 채널로 사용되었다. 30 ㎕/분의 유량으로, 연속 희석된 항체(100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM, 3.125 nM, 1.5625 nM, 0 nM)를 채널 1 및 2에 순차적으로 주입하고 결합 및 해리를 측정하였다. 포획된 항원 및 항체를 제거하기 위해서 10 ㎕/분의 유량으로 재생 완충제(6 M 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.25 M 수산화나트륨)로 칩 재생을 수행하였다. Biacore 8K 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. 소프트웨어 분석에 사용되는 모델은 1:1 결합용이다.
표 14에 나타낸 결과는 본원에 기재된 모든 항체가 비오틴화된 인간 완전길이 IgE 및 키노몰구스 원숭이 IgE CH3-CH4 모두에 결합할 수 있고, 이때 KD 값은 오말리주맙의 값과 그다지 상이하지 않거나 이보다 더 작았음을 가리킨다.
[표 14]
비오틴화된 인간 완전길이 IgE 및 키노몰구스 원숭이 IgE CH3 - CH4에 대한 항체의 결합 친화도 결과
Figure pct00010
실시예 7 항체는 인간 및 키노몰구스 FcRn에 결합한다(Octet Red에 의해 검출됨)
인간 FcRn(Acro, FCN-H52W7) 및 키노몰구스 원숭이 FcRn(Acro, FCM-C52W9)에 대한 항체의 친화도를 Octet RED96e(Fortebio)를 사용하여 실시예 2의 방법에 따라 측정하였다. 여기서, 인간 FcRn과 키노몰구스 FcRn을 각각 1xPBS(10 mM Na2HPO4.12H2O, 2 mM KH2PO4, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, pH 6.0)로 5 ㎍/㎖로 희석하고, 비오틴-접합된 THETM His-태그된 마우스 단클론 항체를 2 ㎍/㎖로 희석하고; 시험하고자 하는 항체를 1xPBST(1xPBS, 0.02% Tween 20, pH6.0)로 희석하였으며, 항체 희석 농도는 1000 nM - 31.3 nM의 범위였다. 결과를 표 15에 나타낸다. 모든 항체는 키노몰구스 원숭이 및 인간 FcRn에 결합 할 수 있었다.
[표 15]
항체와 키노몰구스 원숭이 및 인간 FcRn과의 친화도 결과
Figure pct00011
실시예 8 항체는 비오틴화된 인간 완전길이 IgE의 FcεRI에의 결합을 차단한다
FcεRIα(R&D, 6678-Fc)를 PBS를 사용하여 100 ㎕/웰로 코팅된 효소 표지화 플레이트에서 0.5 ㎍/㎖로 희석하고, 밀봉 필름을 부착한 후 37℃에서 1시간 동안 배양한 다음 플레이트를 세척 용액(PBS + 0.05 % TWEEN-20)으로 3회 세척하였다. 이어서, 세척 용액으로 차단 용액(PBS + 0.05% TWEEN-20 + 2% BSA)을 제조하고, 각 웰에 차단 용액 300 ㎕를 가하고, 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 160 ng/㎖ 농도의 비오틴화된 인간 완전길이 IgE(비오틴-FL hIgE, Abbiotec, Cat. No. 250205, 사내에서 비오틴화함)를 차단 용액 중에서 제조하고; 이어서 항-IgE 항체를, 4 ㎍/㎖에서 초기 농도로 시작하여 3배 연속 희석(7개 농도 점 + 1개 0 농도 점으로 희석)으로 차단 용액 중에서 제조하고; 이어서 60 ㎕의 항-IgE 항체를 60 ㎕의 비오틴-FL hIgE에 가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서 차단된 ELISA 플레이트를 꺼내어, 세척 용액으로 3회 세척하고, 37℃에서 예비-배양된 항-IgE 항체 및 비오틴화된 인간 완전길이 단백질 복합체 용액을 100 ㎕/웰에 가하고, 이어서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 세척 용액으로 3회 세척하고, SA-HRP(sigma, S2438-250UG)를 차단 용액으로 1/5000으로 희석한 후에 ELISA 플레이트에 100 ㎕/웰로 가하고 37℃에서 1시간 동안 배양하고; 플레이트를 세척 용액으로 3회 세척하고, 이어서 TMB 발색성 용액(Biopanda, 제품 번호: TMB-S-003)을 100 ㎕/웰로 가하고, 실온의 암실에서 10분 동안 반응시킨 다음 정지액(Solarbio, 제품 번호: C1058)을 50 ㎕/웰로 가하여 반응을 정지시킨 후 450 ㎚의 파장에서 흡광도 값을 측정하였다. 도 2에 나타낸 바와 같은 결과는 본원에 기재된 항체가 FcεRI에 대한 비오틴화된 IgE의 결합을 차단할 수 있고, EC50 값이 오말리주맙의 값보다 낮다는 것을 가리킨다.
실시예 9 항체는 IM-9 세포 표면 상의 CD23에 대한 비오틴화된 인간 완전길이 IgE의 결합을 차단한다
IM-9 세포를 RPMI1640 + 10% FBS(RPMI1640, FBS, Thermo Fisher)를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소에서 배양하였다. IM-9 세포를 수집하고, FACS 완충제(PBS + 2% FBS)로 1회 세척하고, 2.5*106 세포/㎖의 세포 밀도로 FACS 완충 용액에 재현탁시켰다. 세포 현탁액(웰당 100 ㎕)을 U-바닥 96-웰 세포 배양 플레이트에 가하고, 이어서 4도 냉장고에 30분 동안 두었다. 비오틴화된 인간 완전길이 IgE(hIgE, ABBIOTEC, Cat. No. 250205, 사내에서 비오틴화함)를 20 ㎍/㎖의 농도로 FACS 완충 용액에서 제조하고; 이어서 항-IgE 항체를 60 ㎍/㎖의 시작 농도로 FACS 완충제를 사용하여 제조하고, 3배 연속 희석하고(7개 농도 점 + 1개의 0 농도 점으로 희석), 이어서 60 ㎕의 항-IgE 항체를 60 ㎕의 비오틴-FL hIgE에 가한 다음, 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 동시에 2.5 ㎕의 Fc Block(BD Pharmingen, Cat. No. 564220)을 세포의 각 웰에 가하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하고; 96-웰 세포 배양 플레이트를 4℃ 냉장고에서 꺼내어 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리한 후, 상등액을 버리고, 이어서 예비-배양된 항-IgE 항체 및 비오틴화된 인간 완전길이 IgE 단백질 복합체 용액을 100 ㎕/웰로 가하고, 4℃에서 1시간 동안 배양하고, 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리시킨 다음, 상등액을 버리고 FACS 완충 용액으로 3회 세척하였다. FITC-커플링된 스트렙트아비딘(Invitrogen, Cat. No: SA1001)을 1:500으로 희석한 후, 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 4도에서 1시간 동안 배양하고, 2000 rpm에서 5분 동안 원심분리시킨 다음, 상등액을 버린 후에, FACS 완충 용액으로 3회 세척하고; 이어서 세포를 FACS 완충 용액으로 1:2로 희석하고, Guava easyCyte 6-2L Benchtop 유식 세포계를 사용하여 검출하였다. 도 3에 나타낸 바와 같은 결과는 본원에 기재된 항체가 IM-9 세포 표면 상의 CD23에 대한 비오틴화된 인간 완전길이 IgE의 결합을 차단할 수 있었음을 가리킨다.
실시예 10 항체는 FcεRI/RBL-2H3으로부터 비오틴화된 인간 완전길이 IgE-자극된 히스타민 방출을 차단한다
FcεRI/RBL-2H3 세포(Genechem gene에 의해 구성됨)를 37℃, 5% 이산화 탄소의 조건 하에서 FcεRI/RBL-2H3 배지(MEM + 15 % FBS + 1 mM 나트륨 피루베이트 + 1 ㎍/㎖ 퓨로마이신)를 사용하여 배양하였다. 인간 완전길이 IgE 단백질(ABBIOTEC, Cat. No: 250205)을 2.4 ㎍/㎖의 농도로 세포 배양 배지를 사용하여 제조하고; 이어서 항-IgE 항체를, 15 ㎍/㎖의 농도에서 시작하여 2배 연속 희석(9개 농도 점 + 1개의 0 농도)으로 세포 배양 배지를 사용함으로써 제조하였다. 50 ㎕의 인간 완전길이 IgE 단백질을 먼저 96-웰 편평-바닥 세포 배양 플레이트에 가하고, 이어서 제조된 항-IgE 항체 50 ㎕를 가하였다. 동시에, FcεRI/RBL-2H3 세포를 수집하고, 2*106 세포/㎖의 세포 농도로 배지에 재현탁하고, 50 ㎕/웰로 상응하는 96-웰 편평 바닥 세포 배양 플레이트에 가하고, 이어서 세포 배양 플레이트를 세포 배양기에서 37℃, 5% 이산화탄소에서 밤새 배양하였다. 다음날, 상등액을 흡출하여 버리고, 세포를 분석 완충제(Tyrode's 완충제(130 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 nM HEPES, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2.6H2O, 5.6 mM 글루코스, 0.1%BSA), pH7.4)를 사용하여 2회 세척한 다음, 각 웰에 1 ㎍/㎖ 다클론 항-IgE 항체(R&D, Cat. No.: G-107-C) 200 ㎕를 가한 후, 세포 배양기에서 37℃, 5% 이산화 탄소로 30분 동안 배양하고; 상등액을 흡인하고 Histamine Dynamic 키트(CISBIO, 제품 번호: 62HTMDPEG)를 사용하여 키트 설명에 기반한 검출 방법에 따라 검출하였다. 결과를 도 4A 및 도 4B에 나타내며, 이는 항체가, 유도된 FcεRI/RBL-2H3으로부터 FL hIgE 유도된 히스타민 방출을 억제할 수 있고, IC50 값이 오말리주맙의 값보다 낮음을 보이며, 이는 억제 효과가 오말리주맙의 효과보다 우수함을 가리킨다.
실시예 11 인간 전혈 히스타민 방출 분석
자원봉사자는 알레르기-유발 약물, 항히스타민제, 경구 코르티코스테로이드, 및 H2 수용체를 차단하는 임의의 물질을 헌혈 24시간 전에 복용해서는 안 된다. 전혈을 항응고제로서 헤파린으로 처리하였다.
히스타민 방출을 하기와 같이 키트(Sigma, Cat. No.: IB89145)의 조작 단계에 따라 수행하였다: 시험하고자 하는 항체를 PBS로 6000, 600, 60 및 6 nM로 희석하고, 키트 중의 양성 대조용 항-IgE 혈청을 사용 전에 히스타민 방출 완충 용액으로 1000배 희석하였다. 히스타민 방출 공정을 수행하기 위한 샘플 로딩 및 조작을 하기 표 16에 나타내었다.
[표 16]
히스타민 방출의 샘플 로딩에 대한 설명
Figure pct00012
히스타민 ELISA를 키트(Sigma, Cat. No: IB89128)의 조작 단계에 따라 하기와 같이 수행하였다. 50 ㎕의 상등액 또는 표준 및 대조용 물질을 탈이온수로 1배 희석하고 각각 상응하는 웰에 가하였다. 이어서 각 웰에 아세틸화 완충 용액 25 ㎕ 및 아세틸화 용액 25 ㎕를 가하고 실온에서 45분 동안 600 rpm으로 진탕시켰다. 마지막으로, 100 ㎕의 탈이온수를 가하고, 실온에서 15분 동안 600 rpm으로 진탕시켰다. 샘플을 아세틸화한 후, 히스타민 코팅된 플레이트에 25 ㎕를 가하고, 이어서 항히스타민 혈청 100 ㎕를 가한 다음 밀봉 필름으로 밀봉한 후 실온에서 600 rpm으로 3시간 동안 진탕하였다. 배양 후, 웰 플레이트의 액체를 버리고, 이어서 각 웰에 세척 용액 300 ㎕를 가하여 4회 세척한 후, 각 웰에 효소-결합된 2차 항체 100 ㎕를 가하고, 이어서 실온에서 30분 동안 600 rpm으로 진탕하였다. 웰 플레이트의 액체를 버리고, 이어서 각 웰에 세척 용액 300 ㎕를 가하여 4회 세척한 후, 각 웰에 기질 100 ㎕를 가하고, 이어서 실온에서 30분 동안 600 rpm으로 진탕하였다. 마지막으로, 100 ㎕의 정지 용액을 가하여 반응을 정지시키고, Envision 마이크로플레이트 판독기(PerkinElmer)를 사용하여 10분 이내에 450 ㎚ 및 570 ㎚에서의 흡광도 값을 수집하였다.
그 결과를 도 5에 나타내며, 이는 항-IgE 혈청이 FcεRI에 결합된 IgE를 가교 결합 또는 활성화시킬 수 있고 히스타민 방출을 유도할 수 있는 반면, 오말리주맙, AB1904A m10 및 AB1904A m15는 그렇지 않음을 나타낸다.
실시예 12 항체 안정성 연구
후보 항체의 안정성을 고온, 낮은 pH, 및 반복된 동결-해동의 안정성 실험 조건을 통해 종합적으로 평가한다. 안정성 연구의 주요 시험 항목은 주로 SEC-HPLC, iCIEF 및 비-환원 CE-SDS를 포함한, 생성물의 주요 순도 지표를 대상으로 한다.
11.1 고온 안정성 시험
이 연구는 고온 조건 하에서 후보 항체의 안정성을 조사하는 데 중점을 두었다. 샘플을 40 ± 2℃의 실험 조건하에 두고, 0일, 3일, 7일, 14일, 21일 및 28일째에 SEC-HPLC 순도, 전하 이성질체 순도, nrCE-SDS 순도에 대해 검출하였다. 실험 결과는 하기와 같다:
[표 17]
고온에서 항체 안정성 결과
Figure pct00013
11.2 낮은 pH 안정성 시험
낮은 pH 조건 하에서 후보 항체의 안정성을 주로 조사하였으며, 여기서 샘플의 pH를 염산으로 5.0으로 조절하고, 40 ± 2℃에 두고, SEC-HPLC 순도, 전하 이성질체 순도, 각각 0h, 6h, 24h, 48h, 72h에서의 nrCE-SDS 순도에 대해 검출하였다. 실험 결과는 하기와 같다.
[표 18]
낮은 pH에서 항체 안정성의 결과
Figure pct00014
11.3 반복된 동결-해동 안정성 시험
반복된 동결 및 해동 조건 하에서 후보 항체의 안정성을 주로 조사하였으며, 여기서 주기는 샘플을 -70±10℃에서 동결 한 후 실온에서 해동 할 때까지였다. 샘플을 각각 세 번째 주기 및 여섯 번째 주기에서 시험하였다. 실험 결과는 하기와 같다:
[표 19]
반복된 동결 -해동 주기 하에서 항체 안정성의 결과
Figure pct00015
AB1904Am10, AB1904Am15 및 오말리주맙의 고온 안정성, 낮은 pH 안정성 및 반복된 동결-해동 안정성을 연구하였다. 고온 및 낮은 pH 안정성 연구의 결과는 후보 항체 AB1904Am10 및 AB1904Am15의 안정성이 고온 및 낮은 pH 조건 하에서, 특히 SEC-HPLC 검출에서 응집체 양의 감소, 및 iCIEF 검출에서 주요 피크의 감소가 오말리주맙의 경우보다 우수함을 보여주었으며, 이는 후보 항체 AB1904Am10 및 AB1904Am15가 온도 및 낮은 pH에 대해 더 허용성이고 더 안정성이며, 이에 의해 생산, 보관 및 사용 중에 더 안정함을 가리킨다. 반복된 동결-해동 안정성 연구는 순도에 대한 AB1904Am10 및 AB1904Am15의 모든 주요 품질 지표가 6회 동안 반복된 동결 및 해동 후에도 안정성이 양호함을 입증하였다.
실시예 13 인간화된 FcRn 마우스 모델에서의 약동학(PK) 연구
인간화된 FcRn 마우스를 단일 피하 투여 후 3개의 시험 약물인 오말리주맙, AB1904Am10 및 AB1904Am15의 약동학 지표를 연구하기 위한 시험 동물로서 사용하였다. 모든 동물 실험 프로토콜은 IACUC에서 검토되고 승인되었다. hFcRn 마우스를 Beijing Biositu에서 구입하였으며, 이는 수컷이고, 6-8주령이며, 체중이 23-26g이었고, 이를 SPF 동물실에 수용하고, 표준 펠릿 사료를 공급하였으며, 자유롭게 먹고 마시게 하고, 실온 18-24℃, 상대 습도 40% ~ 50%, 낮과 밤을 번갈아 가며 하루 12시간을 지내게 하였다. 총 12마리의 실험 동물을 무작위로 3개 그룹으로 나누어 각 그룹에 4마리씩 10 ㎎/kg의 단일 용량을 피하 투여하였으며 투여 부피는 10 ㎖/kg이었다. 채혈 시점은 투여 전, 투여 후 2h, 6h, 24h(1일), 2일, 3일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 42일이다. 60 ㎕의 전혈을 뺨 천자에 의해 EP 튜브에 수집하고 실온에서 30분 동안 방치한 후 원심분리시켜(2000 g, 4℃, 5분) 혈청을 분리하였다. 각 샘플을 2개 부분(시험 튜브 및 백업 튜브), 10㎕/튜브로 나누어, -80℃에 보관한다.
상이한 시점에서 3개 약물의 약동학을 Elisa 간접 방법에 의해 분석하였다. 코팅 항원은 항-인간 IgG1 항체(Fc 특이적)(Abeam, 카탈로그 번호: ab1927)(2 ㎍/㎖, 100 ul/웰, 37℃, 2h)였다. 플레이트를 세척한 후, 차단 용액 200 ul/웰을 사용하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 혈청 샘플을 50 ㎕/웰, 37℃, 1h 동안 가하였다. 검출 항체는 마우스 항-인간 Fab HRP(1:10000)(Abcam, Cat. No.: ab87422)(100 ㎕/웰, 37℃, 0.5h)였다. TMB 발색성 용액(KPL, Cat. No: 52-00-03)을 사용하여 발색시키고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)를 사용하여 OD450에서 값을 수집하였다. 표준 곡선에 따라 약물 농도를 획득하고, PK Solver 비-구획 모델을 사용하여 데이터를 처리함으로써 PK 매개변수를 획득하였다.
그 결과를 도 6에 나타낸다. 오말리주맙 투여 후, 반감기(t1/2)=10.9일, 및 최고 농도(Cmax)는 53214.1 ng/㎖이고; AUC는 900661 ng/㎖*d이고; AB1904AM10 투여 후, 반감기(t1/2)= 13.5일, 최고 농도(Cmax)는 60441.4 ng/㎖이고; AUC는 1220787 ng/㎖*d이고; AB1904AM15 투여 후, 반감기(t1/2)=26.6일, 최고 농도(Cmax)는 57355.7 ng/㎖이었다. AUC 1284785 ng/㎖*d.
실시예 14 키노몰구스 원숭이 모델에서의 약동학-약력학(PK/PD) 연구
키노몰구스 원숭이를 피실험 동물로 사용하여, 단일 피하 투여 후 3개의 시험 약물 오말리주맙, AB1904Am10 및 AB1904Am15의 약동학 및 약력학을 연구하였다.
모든 동물 실험 프로토콜은 IACUC에서 검토되고 승인되었다. 9 마리의 SPF 등급 수컷 키노몰구스 원숭이는 4세 이상이었으며, 체중 4.1-5.7 kg이 실험에 사용되었고, SPF 등급 동물실에 수용되었으며, 자유롭게 먹고 마시게 하였다. 투여량은 10 ㎎/kg이었고; 투여 경로는 피하 주사였으며; 투여 부피를 약물의 특정 농도에 따라 계산하였다. 키노몰구스 원숭이를 TA당 3마리의 키노몰구스 원숭이로, 3개의 TA로 분류하였고; 투여의 경우: 투여 부피를 체중에 따라 계산하고, 약물을 1회 피하 주사하고, 투여 시간을 기록하였으며; 수집 시점의 경우: 투여 전, 투여 후 2시간, 6h, 24h(1일), 2일, 3일, 4일, 7일, 10일, 14일, 21일, 28일, 35일, 42일 및 56일에, 각각 300 ㎕의 전혈을 두정맥 및 복재 정맥으로부터 EP 튜브에 수집하고, 채혈 시간을 기록하였으며; 샘플 처리의 경우: 전혈을 실온에서 1h 동안 정치시키고, 6,000g, 25℃, 10분 원심분리시키고, 혈청을 분리시킨 다음 각각의 샘플을 5개 부분(시험 튜브 1개, 및 백업 튜브 4개), 30 ㎕/튜브로 나누고, -80℃에서 보관하였다.
상이한 시점에서 3개 약물의 약동학을 Elisa 간접 방법에 의해 분석하였다. 코팅 항원은 항-인간 IgG1 항체(Fc 특이적)(Abeam, Cat. No.: ab1927)(2 ㎍/㎖, 100 ul/웰, 37℃, 2h)였다. 플레이트를 세척한 후, 차단 용액 200 ul/웰을 사용하여 4℃에서 밤새 배양하였다. 혈청 샘플을 50 ㎕/웰, 37℃, 1h 동안 가하였다. 검출 시약은 인간 IgE-비오틴(Abbiotec, Cat. No.: 250205, 자체적으로 비오틴화된 표지화) + SA-HRP(sigma, Cat. No.: S2438-250UG)이었으며, 100 ul/웰, 37℃, 0.5h 동안 가하였다. TMB 발색성 용액(KPL, Cat. No: 52-00-03)을 사용하여 발색시키고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)를 사용하여 OD450에서 값을 수집하였다. 표준 곡선에 따라 약물 농도를 획득하고, PK Solver 비-구획 모델을 사용하여 데이터를 처리함으로써 PK 매개변수를 획득하였다.
그 결과를 도 7에 나타낸다. 오말리주맙 투여 후, 반감기(t1/2)=6.35일, 최고 농도(Cmax)는 112493 ng/㎖이고, AUC는 1704601 ng/㎖*d이고; AB1904AM10 투여 후, 반감기(t1/2)=11.15일, 최고 농도(Cmax)는 83940 ng/㎖이고, AUC는 1324493 ng/㎖*d이고; AB1904AM15 투여 후, 반감기(t1/2)=12.2일, 최고 농도(Cmax)는 142880 ng/㎖이고, AUC는 3061056 ng/㎖*d이었다.
이어서 Elisa 간접 방법에 의해 혈청 중의 유리 IgE를 검출하였다. 코팅 항원은 AB1904Am15(0.5 ㎍/㎖, 100 ul/웰, 4℃에서 밤새)였다. 플레이트를 세척한 후, 200ul/웰 차단 용액을 사용하여 37℃에서 1h 동안 배양하였다. 혈청 샘플을 50 ul/웰로 37℃에서 1.5h 동안 가하였다. 500 ng/㎖의 비오틴-표지된 오말리주맙을 웰당 100 uL로 1h 동안 가하고; 이어서 SA-HRP(1:10000, sigma, Cat. No.: S2438-250UG)를 100 ul/웰에 37℃에서 1h 동안 가하였다. TMB 발색성 용액(KPL, Cat. No.: 52-00-03)을 사용하여 발색시키고, 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, SpectraMax M3)를 사용하여 OD450을 판독하였다. 표준 곡선에 따라 유리 IgE 농도를 획득하였다.
그 결과를 도 1에 나타낸다. 오말리주맙 투여 후, 유리 IgE가 초기 농도로 회복되는 데 걸리는 시간은 약 21일이었고; AB1904Am10 투여 후, 유리 IgE가 초기 농도로 회복되는 데 걸리는 시간은 약 28일이었으며; AB1904Am15 투여 후, 유리 IgE가 초기 농도로 회복되는 데 걸리는 시간은 약 42-56일이었다.
<110> SHANGHAI JEMINCARE PHARM CO., LTD. JIANGXI JEMINCARE GROUP CO., LTD. <120> Anti-IgE engineered antibody and application thereof <130> 0134-PA-015 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LFR1 <400> 1 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 2 Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 3 Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Glu Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 4 Arg Ala Ser Gln Ser Leu Tyr Asp Glu Gly Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 5 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ala Asp Glu Trp Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 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Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Val Ile Thr Tyr Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Thr His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 55 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 55 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Val Ile Thr Tyr Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Asn Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 56 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 56 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Thr Gln Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Val Ile Thr Tyr Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser His Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <220> <221> MISC_FEATURE <222> (29) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> Xaa = Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Asn or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> Xaa = Ala, Asp, Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (33) <223> Xaa = Ala, Gly, Trp or Tyr <400> 57 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Xaa Xaa Xaa Glu 20 25 30 Xaa Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 58 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <220> <221> MISC_FEATURE <222> (30) <223> Xaa = Arg or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (31) <223> Xaa = Gln or Ser <220> <221> MISC_FEATURE <222> (100) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (101) <223> Xaa = His or Asn <400> 58 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Tyr Ser Ile Xaa Xaa Gly 20 25 30 Tyr Ser Trp Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Val Ile Thr Tyr Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Phe Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Xaa Xaa Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 59 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> light chain constant region <400> 59 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 60 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 constant region none mutation <400> 60 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 61 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 constant region YTE mutation <400> 61 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 62 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1general formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5) <223> Xaa = Arg or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa = Gln or Ser <400> 62 Gly Tyr Ser Ile Xaa Xaa Gly Tyr 1 5 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 general formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2) <223> Xaa = Ser or Thr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3) <223> Xaa = His or Asn <400> 63 Gly Xaa Xaa Tyr Phe Gly His Trp His Phe Ala Val 1 5 10 <210> 64 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 general formula <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6) <223> Xaa = Leu or Val <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7) <223> Xaa = Ala, Asp, Glu, Phe, Gly, Asn or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8) <223> Xaa = Ala, Asp, Ser or Tyr <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10) <223> Xaa = Ala, Gly, Trp or Tyr <400> 64 Arg Ala Ser Gln Ser Xaa Xaa Xaa Glu Xaa Asp Ser Tyr Met Asn 1 5 10 15

Claims (50)

  1. 항체 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 항원-결합 단백질로서, 여기서 VL이 서열번호 22에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여, E55 및 V104로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서,
    VL이 D30b, V29, D30, Y30a 및 G30c로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    VL이 D30b, E55 및 V104 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    VL이 (1) D30b, E55, V104, V29, D30, 및 Y30a;
    (2) D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c;
    (3) D30b, E55, V104 및 Y30a;
    (4) D30b, E55, V104, Y30a 및 G30c;
    (5) D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c; 및
    (6) D30b, E55, V104, D30 및 Y30a
    로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    E55 위치에서의 아미노산 돌연변이가 E55Q를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    V104 위치에서의 아미노산 돌연변이가 V104L을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    D30b 위치에서의 아미노산 돌연변이가 D30bE를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    V29 위치에서의 아미노산 돌연변이가 V29L을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    Y30a 위치에서의 아미노산 돌연변이가 Y30A, Y30aS 및 Y30aD로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    D30 위치에서의 아미노산 돌연변이가 D30Y, D30A, D30E, D30F, D30G 및 D30N으로 이루어지는 그룹에서 선택된 어느 하나를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  11. 제2항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    G30c 위치에서의 아미노산 돌연변이가 G30cA, G30cY 및 G30cW로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 어느 하나를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    VL이 D30bE, E55Q 및 V104L 그룹의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    VL이 서열번호 57에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    VL이 서열번호 23-34에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함하며, 여기서 VH가 서열번호 50에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열과 비교하여 I37, A49, S50 및 D54로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  16. 제15항에 있어서,
    VH가 N60, P61, I67, T30, S31, S96 및 H97로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    VH가 N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 그룹의 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    VH가 (1) N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54, S96 및 H97;
    (2) N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 T30;
    (3) N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S96;
    (4) N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S31; 및
    (5) N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 H97
    로 이루어지는 임의의 그룹 중에서 선택된 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    I37 위치의 아미노산 돌연변이가 I37V를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    A49 위치의 아미노산 돌연변이가 A49S를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    S50 위치의 아미노산 돌연변이가 S50V를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    D54 위치의 아미노산 돌연변이가 D54A를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    N60 위치의 아미노산 돌연변이가 N60A를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  24. 제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    P61 위치의 아미노산 돌연변이가 P61D를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    I67 위치의 아미노산 돌연변이가 I67F를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  26. 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    T30 위치의 아미노산 돌연변이가 T30R을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  27. 제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    S31 위치의 아미노산 돌연변이가 S31Q를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  28. 제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    S96 위치의 아미노산 돌연변이가 S96T를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  29. 제16항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    H97 위치의 아미노산 돌연변이가 H97N을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  30. 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    VH가 N60A, P61D, I67F, I37V, A49S, S50V 및 D54A 그룹의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  31. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    VH가 서열번호 58에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  32. 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    VH가 서열번호 51-56에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  33. 제15항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    VL 및 VH가
    (1) D30b, E55, V104, V29, D30 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54, S96 및 H97 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH;
    (2) D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 T30 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH;
    (3) D30b, E55, V104 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S96 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH;
    (4) D30b, E55, V104 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH;
    (5) D30b, E55, V104, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH;
    (6) D30b, E55, V104 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 H97 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH;
    (7) D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50 및 D54 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH;
    (8) D30b, E55, V104, D30 및 Y30a 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 H97 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH;
    (9) D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S96 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 HV; 및
    (10) D30b, E55, V104, D30, Y30a 및 G30c 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VL; N60, P61, I67, I37, A49, S50, D54 및 S31 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는 VH
    로 이루어지는 임의의 그룹 중에서 선택된 위치에서 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 중쇄 불변 영역을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  35. 제34항에 있어서,
    항체 중쇄 불변 영역이 인간 IgG 불변 영역으로부터 유래되는, 항원-결합 단백질.
  36. 제35항에 있어서,
    인간 IgG 불변 영역이 인간 IgG1 불변 영역을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  37. 제36항에 있어서,
    인간 IgG1 불변 영역이 M252Y, S254T 및 T256E로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  38. 제37항에 있어서,
    인간 IgG1 불변 영역이 서열번호 60-61에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는, 항원-결합 단백질.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 경쇄 불변 영역을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  40. 제39항에 있어서,
    항체 경쇄 불변 영역이 서열번호 59에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 단리된 핵산 분자.
  42. 제41항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  43. 제41항의 핵산 분자 또는 제42항의 벡터를 포함하는 세포.
  44. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질의 발현을 허용하는 조건 하에서 제43항의 세포를 배양하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질의 제조 방법.
  45. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질, 제41항의 핵산 분자, 제42항의 벡터 및/또는 제43항의 세포, 및 임의로 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  46. 비정상적인 수준의 IgE와 연관된 질환의 완화 또는 치료를 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질, 제41항의 핵산 분자, 제42항의 벡터, 제43항의 세포 및/또는 제45항의 약학 조성물의 용도.
  47. 비정상적인 수준의 IgE와 연관된 질환의 완화 또는 치료가 필요한 피실험자에게 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질, 제41항의 핵산 분자, 제42항의 벡터, 제43항의 세포 및/또는 제45항의 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 상기 질환의 완화 또는 치료 방법.
  48. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질을 포함하는 폴리펩티드.
  49. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질을 포함하는 면역접합체.
  50. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질, 제41항의 핵산 분자, 제42항의 벡터, 제43항의 세포 및/또는 제45항의 약학 조성물을 포함하는 키트.
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