JP2023541217A - 抗ＩｇＥ改変抗体及びその適用 - Google Patents

抗ＩｇＥ改変抗体及びその適用 Download PDF

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Abstract

抗原結合タンパク質。オマリズマブの軽鎖及び重鎖可変領域配列と比較して、抗原結合タンパク質は、アミノ酸変異を含む。抗原結合タンパク質は、抗IgE改変抗体である。抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、及び異常なIgEレベルと関連する疾患を軽減又は処置するそれらの方法をさらに含む。【選択図】 なし

Description

本出願は、生物医学の分野、特に抗IgE改変抗体及びIgEが異常レベルの疾患におけるその使用に関する。
免疫グロブリンE(IgE)は、180KDの分子量を有するタンパク質である。IgEは、全血清Igの0.002%のみを占めるが、それはアレルギー疾患の病理過程に密接に関連する。種々の組織及び器官において、IgEのレベルの増加は、炎症性免疫応答を引き起こすことがあり、その最も一般的なものは、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎及び副鼻腔炎、アレルギー性結膜炎、全身性アレルギー、皮膚アレルギー及び蕁麻疹等である。
近年では、生物製剤、例えば抗IgEモノクローナル抗体は、IgEの異常レベルと関連する疾患の処置における研究のホットスポットになっている。2003年には、抗IgE抗体、オマリズマブが、喘息の処置のためにFDAによって初めて認可された。2014年には、米国食品医薬品局(FDA)が、慢性突発性蕁麻疹の処置のためにオマリズマブを認可した。オマリズマブの適用は、以下の問題を有する:(1)オマリズマブは遊離のIgEを標的化するが、薬学的に適切な用量でIgE/FcεRI(IgE Fc受容体)複合体の病原性種を標的化しない(又は、効果的に標的化できない);(2)オマリズマブの投与濃度及び間隔は、患者の体重及び遊離のIgEのレベルと直接関係し、患者の体重及び遊離のIgEのレベルがある特定の範囲を超える場合、その投与濃度並びに頻度が増加し、患者の疾患の調節及び管理の複雑性及び不便性が増加する;(3)オマリズマブのIgEとの親和性は、特に良好というわけではない。
したがって、有効性及びコンプライアンスが改善した新しい改変抗IgE抗体の早急な必要性がある。
本出願は、オマリズマブの抗体軽鎖及び重鎖配列への改変最適化が行われた抗原結合タンパク質を提供し、以下の特徴の少なくとも1つを含み得る:(1)オマリズマブと比較して、ヒト化度が改善し、抗薬物抗体の産生確率が減少し、潜在的有効性の喪失が減少する;(2)翻訳後修飾部位が変異され、化学的安定性(例えば、高温又はpH環境下での安定性)が改善される;(3)ヒトIgEとの親和性が酵母ディスプレイ法によって改善され、薬物有効性が改善され、抗原結合タンパク質が、高体重又は高濃度の遊離のIgEの患者に適用され得ると予想される;(4)高親和性でサルIgEに結合し、前臨床動物モデルでの薬力学的研究に役立つ;(5)IgE Fc受容体(FcεRI)へのIgEの結合を有効にブロックする;(6)その血清半減期が延長され、注射の頻度を減らし、患者の状態の調節を容易にすることができる。
一態様では、本出願は、抗体軽鎖可変領域(VL)を含む抗原結合タンパク質であって、VLが、配列番号22に示すアミノ酸配列と比較して、E55及びV104からなる群から選択される1つ以上の位置にアミノ酸変異を含む、抗原結合タンパク質を提供する。
一部の実施形態では、VLは、D30b、V29、D30、Y30a及びG30cからなる群から選択される1つ以上の位置にアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、VLは、以下の群:D30b、E55及びV104の位置にアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、VLは、(1)D30b、E55、V104、V29、D30、及びY30a;(2)D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30c;(3)D30b、E55、V104及びY30a;(4)D30b、E55、V104、Y30a及びG30c;(5)D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30c;並びに(6)D30b、E55、V104、D30及びY30aからなる群から選択される位置にアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、E55位のアミノ酸変異はE55Qを含む。
一部の実施形態では、V104位のアミノ酸変異はV104Lを含む。
一部の実施形態では、D30b位のアミノ酸変異はD30bEを含む。
一部の実施形態では、V29位のアミノ酸変異はV29Lを含む。
一部の実施形態では、Y30a位のアミノ酸変異は、Y30A、Y30aS及びY30aDからなる群から選択されるいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、D30位のアミノ酸変異は、D30Y、D30A、D30E、D30F、D30G及びD30Nからなる群から選択されるいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、G30c位のアミノ酸変異は、G30cA、G30cY及びG30cWからなる群から選択されるいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、VLは、以下の群のアミノ酸変異:D30bE、E55Q及びV104Lを含む。
一部の実施形態では、VLは、配列番号57に示すアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、VLは、配列番号23～34に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体重鎖可変領域(VH)を含み、VHは、配列番号50に示すアミノ酸配列と比較して、I37、A49、S50及びD54からなる群から選択される1つ以上の位置にアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、VHは、N60、P61、I67、T30、S31、S96及びH97からなる群から選択される1つ以上の位置にアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、VHは、以下の群:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54の位置にアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、I37位のアミノ酸変異はI37Vを含む。
一部の実施形態では、A49位のアミノ酸変異はA49Sを含む。
一部の実施形態では、S50位のアミノ酸変異はS50Vを含む。
一部の実施形態では、D54位のアミノ酸変異はD54Aを含む。
一部の実施形態では、N60位のアミノ酸変異はN60Aを含む。
一部の実施形態では、P61位のアミノ酸変異はP61Dを含む。
一部の実施形態では、I67位のアミノ酸変異はI67Fを含む。
一部の実施形態では、T30位のアミノ酸変異はT30Rを含む。
一部の実施形態では、S31位のアミノ酸変異はS31Qを含む。
一部の実施形態では、S96位のアミノ酸変異はS96Tを含む。
一部の実施形態では、H97位のアミノ酸変異はH97Nを含む。
一部の実施形態では、VHは、以下の群のアミノ酸変異:N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V及びD54Aを含む。
一部の実施形態では、VHは、配列番号58に示すアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、VHは、配列番号51～56に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、VLは、以下の位置:D30b、E55及びV104にアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54にアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、VL及びVHは、以下の群から選択される位置にアミノ酸変異を含む:(1)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104、V29、D30及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96及びH97にアミノ酸変異を含む;(2)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びT30にアミノ酸変異を含む;(3)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS96にアミノ酸変異を含む;(4)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54にアミノ酸変異を含む;(5)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54にアミノ酸変異を含む;(6)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びH97にアミノ酸変異を含む;(7)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54にアミノ酸変異を含む;(8)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104、D30及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びH97にアミノ酸変異を含む;(9)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS96にアミノ酸変異を含む;並びに(10)VLは、以下の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHは、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS31にアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体重鎖定常領域を含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質の抗体重鎖定常領域は、ヒトIgG定常領域由来である。
一部の実施形態では、ヒトIgG定常領域は、ヒトIgG1定常領域を含む。
一部の実施形態では、ヒトIgG1定常領域は、M252Y、S254T及びT256Eからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸変異を含む。
一部の実施形態では、ヒトIgG1定常領域は、配列番号60～61に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む。
一部の実施形態では、抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖定常領域を含む。
一部の実施形態では、抗体軽鎖定常領域は、配列番号59に示すアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質をコードする1つ以上の単離された核酸分子を提供する。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載の核酸分子又はベクターを含む細胞を提供する。
別の態様では、本出願は、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を調製する方法であって、抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を培養するステップを含む方法を提供する。
別の態様では、本出願は、抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター及び/又は細胞、並びに場合により薬学的に許容されるベクターを含む組成物を提供する。
一方、本出願は、異常レベルのIgEと関連する疾患を緩和又は処置する医薬の調製における、抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞及び/又は組成物の使用を提供する。
別の態様では、本出願は、異常レベルのIgEと関連する疾患を緩和又は処置する方法であって、抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞及び/又は組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
本出願の他の態様及び利点は、以下の詳細な説明から当業者によって容易に理解され得る。本出願の例示的な実施形態のみが、以下の詳細な説明に示され、記載される。当業者が認識するように、本出願の内容から、本出願が関連する本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、当業者が、開示した特定の実施形態を変更することができる。したがって、本出願の図面及び明細書中の説明は、例示のみであり限定的ではない。
本出願が関連する本発明の特別な特徴は、添付の特許請求の範囲に記載する。本出願に関わる本発明の特徴及び利点は、以下に詳細に記載される例示的な実施形態及び添付の図面を参照してより理解されるであろう。図面の簡単な説明は以下の通りである。
図1は、経時的な、オマリズマブ、AB1904AM10及びAB1904AM15によるカニクイザル血清中の遊離IgEの阻害率を示す図である。 図2は、抗IgE抗体による、FcεRIα受容体タンパク質へのヒト全長IgEの結合のブロッキングを示す図である。 図3は、抗IgE抗体による、細胞表面CD23受容体タンパク質へのヒト全長IgEの結合のブロッキングを示す図である。 図4A及び図4Bは、抗IgE抗体による、FcεRI/RBL-2H3からのヒト全長IgE誘導ヒスタミン放出のブロッキングを示す図である。 図5は、ヒト全血からのヒスタミン放出を示す図である。 図6は、hFcRnマウス血清中の抗IgE抗体の経時的な曲線を示す図である。 図7は、カニクイザル血清中の抗IgE抗体の経時的な曲線を示す図である。
本発明の実施形態は、特定の例により以下に記載し、当業者は、本明細書に開示の内容から、本出願の発明の他の利点及び効果を容易に理解することができる。
用語の定義
本出願では、用語「IgE」は通常、哺乳動物内の抗体を指す。IgEは、多くの原因で患うアレルギー応答、例えば喘息、食物アレルギー、1型過敏症、及び家族性副鼻腔炎を媒介する免疫グロブリンファミリーのメンバーである。IgEはB細胞から分泌され、B細胞の表面で発現される。B細胞で合成されたIgEは、短い膜結合領域を介して成熟IgE配列に連結した膜貫通ドメインによってB細胞膜に係留される。IgEは、低親和性IgE受容体(FcεRII)へのそのFc領域の結合によってB細胞(並びに単球、好酸球、及び血小板)に結合することもできる。哺乳動物がアレルゲンに暴露された後、B細胞は無性生殖的に増殖し、アレルゲンに結合するIgEを合成する。このIgEは、B細胞によって循環中へとそれぞれ放出され、そこでB細胞によって(FcεRIIを介して)、並びにマスト細胞及び好塩基球の表面に見出されるいわゆる高親和性受容体(FcεRI)を介してマスト細胞及び好塩基球によって結合される。したがって、そのようなマスト細胞及び好塩基球は、アレルゲンに感作される。アレルゲンへの次の暴露は、これらの細胞上のFcεRIを架橋し、したがって臨床的な過敏症及びアナフィラキシーの要因であるヒスタミン及び他の因子のそれらの放出を活性化する。
本出願では、用語「抗原結合タンパク質」は、通常、抗原（例えばIgE）に特異的に結合する能力を保持する1つ以上の抗体の断片若しくは部分、又は抗原への所望の結合能を保持する抗体断片の合成されたバリアントを指す。示された抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片若しくは一部の部分、又はそのバリアントによって実行され得る。例は、2つ以上の異なる抗原又は抗原のいくつかのエピトープ若しくは別々の（discrete）エピトープ領域に特異的に結合することができる、二重特異性（bispecific）、二重特異性（dual specific）及び多重特異性フォーマットを含む。抗原結合タンパク質の例は、一本鎖抗体(すなわち全長重鎖及び軽鎖);Fab、改変Fab、Fab’、改変Fab’、F(ab’)2、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、単一ドメイン抗体(例えばVH又はVL又はVHH)(例えば、国際公開第2001/090190号に記載)、scFv、二価、三価又は四価の抗体、bi-scFv、ディアボディ、トリボディ、トリアボディ、テトラボディ及び上記のいずれかのエピトープ-抗原結合剤を含み得る(例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews-Online 2(3), 209-217参照)。これらの抗体断片を産生及び作成する方法は、当技術分野で周知である(例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181参照)。
本出願では、用語「抗体」は、一般に、4つのポリペプチド鎖(2つの重(H)鎖及び2つの軽(L)鎖)を含む任意の免疫グロブリン(Ig)分子又はIg分子のエピトープ結合特性の少なくとも一部を保持し、IgEへのその特異的結合を可能にするその任意の機能性断片、変異体、バリアント又は誘導体を指す。全長抗体では、各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと略される)及び重鎖定常領域(CH)からなる。重鎖定常領域は、4つのドメイン-CH1、ヒンジ、CH2及びCH3(重鎖ガンマ、アルファ及びデルタ)、又はCH1、CH2、CH3及びCH4(重鎖ミュー及びイプシロン)からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書ではVLと略される)及び軽鎖定常領域(CL)からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLからなる。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域によって散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域へとさらに分けることができる。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端に以下の順で配置された3つのCDR及び4つのFR：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4からなる。免疫グロブリン分子は、任意のアイソタイプ/クラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA、及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2)、又はサブクラスのものであり得る。
本出願では、用語「モノクローナル抗体」は、一般に異なる抗体の混合物を含有する「ポリクローナル」抗体調製物に対して、共通の重鎖アミノ酸配列及び軽鎖アミノ酸配列を共有する抗体分子の調製物、又はIg分子の軽鎖エピトープ結合特徴を少なくとも保持するその任意の機能性断片、変異体、バリアント又は誘導体を指す。モノクローナル抗体は、いくつかの公知の技術、例えばファージ、細菌、酵母又はリボソームディスプレイ並びに古典的な方法、例えばハイブリドーマ由来抗体、例えばハイブリドーマ技術、例えば標準的なKohlerとMilsteinのハイブリドーマ法((1975) Nature 256:495-497)によるハイブリドーマによって分泌された抗体によって産生され得る。
本出願では、用語「オマリズマブ」は、一般に、商品名Xolair(登録商標)の、ヒト免疫グロブリンE(IgE)に選択的に結合する組換えDNA由来ヒト化IgG1κモノクローナル抗体を指す。オマリズマブは、およそ149kDの分子量を有する。それは、抗生物質であるゲンタマイシンを含有する培地中のチャイニーズハムスター卵巣細胞の懸濁培養から産生される(欧州特許第602126号(及びこれに基づくSPC/GB06/005);国際公開第93/04173号;米国特許第6267958号(及びこれに基づくPTE);国際公開第97/04807号;国際公開第97/04801号; Presta et al. (1993) J. Immunol. 151:2623-2632参照)。オマリズマブが記載される場合、それは配列番号22に示す軽鎖可変領域及び配列番号50に示す重鎖可変領域を含有するIgG全長抗体を指す。オマリズマブは、現在、慢性的な空気アレルゲンに対する皮膚テスト又はin vitro反応性が陽性であり、吸入コルチコステロイドによって十分に制御されない症状の患者における中程度から重度の持続性喘息の治療に適応される。
本出願では、VH又はVL配列の共通の免疫グロブリン部分(CDR-相補性決定領域、又はFR-フレームワーク領域)を記載する場合、それらは標準的な順番で連結される(VH = HFR1.HCDR1.HFR2.HCDR2.HFR3.HCDR3.HFR4; VL = LFR1. LCDR1. LFR2. LCDR2. LFR3. LCDR3. LFR4)。
本出願の抗体又は抗原結合タンパク質のアミノ酸番号付けでは、抗体又は抗原結合タンパク質由来の連続するアミノ酸配列が、Chothia番号付けルールに従って番号付けされ得る。本出願では、用語「Chothiaスキーム」、「Chothia番号付け」又は「Chothia定義」は交換可能に使用され、一般にアミノ酸残基の番号付けシステムを指す(Chothia et al., (1987) J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))。Chothia番号付けルールにより、オマリズマブについては、VL(配列番号22)の各部位が以下:LFR1(L1-L23)、LCDR1(L24-L34)、LFR2(L35-L49)、LCDR2(L50-L56)、LFR3(L57-L88)、LCDR3(L89-L97)及びLFR4(L98-L107)として規定され、VH(配列番号50)の各部位が以下:HFR1(H1-H25)、HCDR1(H26-H32)、HFR2(H33-H51)、HCDR2(H52-H56)、HFR5(H57-H94)、HCDR3(H95-H102)及びHFR4(H103-H113)として規定され、「Lx」又は「Hx」(ｘはアラビア数字である)は、軽鎖(L)可変領域又は重鎖(H)可変領域中ｘとして番号付けられるアミノ酸を表し、VLについては、L24はChothia番号付けによりVLの24位のアミノ酸を表す。VL又はVH内の場合、Lx又はHx位は、x位のアミノ酸の文字＋番号によっても表され得る。例えば、オマリズマブのVLについては、L24位はアルギニン(R)であり、VLの24位のアミノ酸は、R24によって表されてもよい。本出願では、位置の上記2つの命名(例えばL24及びR24)は、交換可能に使用され得る。Chothia番号付けルールにより、オマリズマブの相補性決定領域のアミノ酸位置を、以下の表1～6に示す。
Figure 2023541217000001
Figure 2023541217000002
Figure 2023541217000003
Figure 2023541217000004
Figure 2023541217000005
Figure 2023541217000006
本出願のアミノ酸変異について、「変異前のアミノ酸＋位置＋変異後のアミノ酸」の表現によって表され、例えばVLのアミノ酸変異「E55Q」は、VLの55位のアミノ酸がグルタミン酸(E)からグルタミンアミド(Q)に変異されることを意味する。
本出願では、用語「Kd」、「KD」又は「KD」は交換可能に使用され、一般に、当技術分野で公知のように特定の抗体-抗原相互作用の解離定数を指す。免疫結合相互作用の強さ又は親和性は、相互作用の解離定数(kD又はkd)で表すことができ、より小さいKDは、親和性がより大きい又はより高いことを表す。選択されたポリペプチドの免疫結合特性は、当分野で周知の方法を使用して定量され得る。そのような方法の1つは、抗原結合部位/抗原複合体形成及び解離の速度を測定することを含み、これらの速度は複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響する幾何学的パラメーターによる。したがって、「会合速度定数」(「Kon」)及び「解離速度定数」(「Koff」)は、濃度並びに会合及び解離の実際の速度を算出することにより決定され得る。Koff/Kon比は、親和性に関連しない全てのパラメーターを相殺し、解離定数Kdと等しい。
本出願の抗体又は抗原結合タンパク質の親和性及びそれらが結合を阻害する程度は、従来技術、例えばScatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949))によって記載されるもの、ForteBio Octet(登録商標)を使用するバイオフィルムレイヤー光学干渉法(BLI)技術、又はBiacore等のシステムを使用する表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して、当業者によって決定され得る。バイオフィルムレイヤーの光学干渉では、内部バイオセンサーの下端部はバイオフィルムレイヤーによって覆われ、生体分子を結合及び固定化することができる。特定の帯域幅を有する可視光がバイオフィルムレイヤーに垂直に投射される場合、バイオフィルムレイヤーの2つの界面で光が反射され、ある特定の波長の干渉波を形成する。固定化された分子が溶液中の分子と相互作用する場合、バイオフィルムレイヤーの厚みが増し、干渉スペクトラム曲線は波長が増加する方向に移動し、光波の位相変化がリアルタイムでワークステーションによって検出される。分子数変化及び関連濃度及び動的データ。表面プラズモン共鳴では、標的分子は、固相上に固定化され、フローセルを流れる移動相中のリガンドに暴露される。固定化した標的へのリガンド結合が生じる場合、局所的な反射率が変化し、SPR角度の変化が生じ、これは反射光の強度の変化を検出することによりリアルタイムでモニターされ得る。SPRシグナルの変化速度を解析し、結合反応の会合及び解離相の見掛けの速度定数を作成することができる。これらの値の比率は、見掛けの平衡定数(親和性)を生じる。
本明細書で提供される抗原結合タンパク質の親和性は、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して変更され得ることは理解されるであろう。したがって、本出願は、IgEへの親和性が改善した、本出願の抗原結合タンパク質のバリアントも設計する。そのようなバリアントは、CDRの変異(Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995)、鎖シャッフリング(Marks et al., Bio/Technology, 10,779- 783, 1992)、大腸菌(Escherichia coli)を使用する変異誘発株(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996)、DNAシャッフリング(Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724- 733, 1997)、ファージディスプレイ(Thompson et al, J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996)及びsexual PCR(Crameri et al, Nature, 391, 288-291, 1998)を含む、多くの親和性成熟プロトコールによって得ることができる。
本出願では、用語「単離された核酸分子」は、一般に、DNA分子及びRNA分子を含む。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であってよく、例えば、二本鎖DNAであってもよい。これらの核酸は、全細胞、細胞ライセート中、又は部分精製若しくは実質的に純粋形態で存在し得る。アルカリ/SDS処理、CsCl結合、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動を含む標準的な技術、及び当技術分野で公知の他の方法により、他の細胞成分又は他の不純物(例えば他の細胞性核酸若しくはタンパク質)から核酸が単離及び精製される場合、それらは「単離された」又は「実質的に純粋な」ものである。
本出願では、用語「ベクター」は、一般に、それが連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。用語「ベクター」は、限定はされないが、プラスミド、ウイルス、コスミド、及び人工染色体を包含する。ベクターの1つの型は「プラスミド」であり、他のDNAセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖DNAループを指す。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、他のDNAセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。一般に、改変ベクターは、複製起点、複数のクローニング部位、及び選択マーカーを含有し得る。ベクター自体は、通常ヌクレオチド配列、典型的にはDNA配列であり、インサート(導入遺伝子)配列及びベクターの「骨格」又は「主鎖」として機能するより大きな配列を含有する。現在のベクターは、導入遺伝子インサート及び骨格に加えてさらなる特徴を含有し得る:プロモーター、遺伝子マーカー、抗生物質耐性、レポーター遺伝子、ターゲティング配列、タンパク質精製タグ。
本出願では、用語「細胞」は、一般に、例えば、異種ポリペプチドをコードするか又はshRNAを構成する核酸を導入することができるか又は導入されてもよい細胞を指す。宿主細胞は、ベクター/プラスミドの増殖に使用され得る原核細胞、及び核酸の発現に使用され得る真核細胞を含み得る。例えば、真核細胞は、哺乳動物細胞であり得る。別の例では、哺乳動物宿主細胞は、以下の哺乳動物細胞: CHO細胞(例えばCHO K1又はCHO DG44)、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293EBNA細胞、PER.C6細胞及びCOS細胞から選択され得る。ある特定の例では、哺乳動物細胞は、ハイブリドーマ、ミエローマ、及び齧歯類細胞から選択され得る。ミエローマ細胞は、ラットミエローマ細胞(例えばYB2)、及びマウスミエローマ細胞(例えば、NS0、SP2/0)を含み得る。医薬適用のためのポリペプチド又はタンパク質は、哺乳動物細胞、例えばCHO細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞等で産生され得る。
本出願では、用語「薬学的に許容される担体」は、一般に、活性成分の生物活性の有効性に干渉しない1つ以上の非毒性物質を指す。そのような製剤は、伝統的に、塩、緩衝剤、防腐剤、適合性担体、及び場合により他の治療剤を含有し得る。そのような薬学的に許容される担体は、ヒトへの投与に好適な適合性の固体又は液体充填剤、希釈剤又はカプセル化物質も含有し得る。本明細書に記載の製剤中で使用され得る他の企図される担体、賦形剤、及び/又は添加剤は、例えば、香料、抗微生物剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、脂質、タンパク質賦形剤(例えば血清アルブミン、ゼラチン、カゼイン)、塩形成カウンターイオン(例えばナトリウム)等を含む。本明細書に記載の製剤での使用に好適なこれら及び他の公知の医薬担体、賦形剤、及び/又は添加剤は当技術分野で公知であり、例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences and Practice (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd ed., Pharmaceutical Press (2012) and Physician's Desk Reference Desk Reference)", 66th ed., Medical Economics (2012)に記載される。投与、可溶性及び/又は安定性の所望の又は必要とされるモードのための適切な薬学的に許容される担体が日常的に選択され得る。
本出願では、用語「異常レベルのIgEと関連する疾患」は、一般に、血清IgEの異常(例えば上昇)レベルと関連する任意の状態又は障害を指す。異常レベルのIgEと関連する例示的な疾患は、限定はされないが、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、アレルギー応答、又はアトピー性皮膚炎を含む。
本出願では、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質(protein)」及び「タンパク質(proteins)」は、交換可能に使用され、一般に任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、線状又は分岐状であってもよく、改変アミノ酸を含有してもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語は、改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。これらの改変は、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作(例えば標識成分への結合)を含み得る。用語「アミノ酸」は、グリシン並びにD及びL光学異性体、並びにアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含む、天然及び/又は非天然又は合成アミノ酸を含む。
本出願では、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」及び「オリゴヌクレオチド」は交換可能に使用され、一般に、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、例えばデオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有し、公知の又は未知の任意の機能を実施し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子又は遺伝子断片のコード若しくは非コード領域、ライゲーション解析によって規定された複数の遺伝子座(1つの遺伝子座)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、短鎖干渉RNA(siRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、及びプライマー。ポリヌクレオチドは、1つ以上の改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含有し得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変は、ポリマーアセンブリーの前又は後に実施され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば標識した成分へのコンジュゲーションにより、重合後にさらに改変され得る。
本明細書に記載の特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本出願は、それらの機能性バリアント、誘導体、類似体、相同体、及び断片も含み得る。
用語「機能性バリアント」は、天然の配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するか又は実質的に同じヌクレオチド配列によってコードされ、天然の配列の1つ以上の活性を保持することができるポリペプチドを指す。本出願の文脈では、任意の所与の配列のバリアントは、残基(アミノ酸又はヌクレオチド残基)の特定の配列が改変され、ポリペプチド又はポリヌクレオチドが少なくとも1つの内在機能を実質的に保持する配列を指す。バリアント配列は、元の機能的活性を保持する限り、天然のタンパク質及び/又はポリヌクレオチドに存在する少なくとも1つのアミノ酸残基及び/又はヌクレオチド残基の付加、欠失、置換、改変、交換、及び/又はバリエーションにより得ることができる。
本出願では、用語「誘導体」は、一般に、生じるポリペプチド又はポリヌクレオチドがその内在機能の少なくとも1つを実質的に保持する限り、本出願のポリペプチド又はポリヌクレオチドの/のための1つ(又はそれ以上)のアミノ酸残基の任意の置換、バリエーション、改変、交換、欠失及び/又は付加を含む、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
本出願では、用語「類似体」は、一般に、ポリペプチド又はポリヌクレオチドの任意の模倣体、すなわち模倣体が真似るポリペプチド又はポリヌクレオチドの少なくとも1つの内在機能を保持する化学化合物を含む、ポリペプチド又はポリヌクレオチドを指す。
一般に、改変配列が実質的に所望の活性又は能力を保持する限り、アミノ酸置換、例えば少なくとも1つ(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10又は20以上)のアミノ酸置換が行われ得る。アミノ酸置換は、非天然の類似体の使用を含み得る。
本出願で使用されるタンパク質又はポリペプチドは、サイレント変化をもたらし、機能的に等価なタンパク質を生じるアミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も有し得る。意図的なアミノ酸置換は、内在機能が保持される限り、残基による極性、荷電、可溶性、疎水性、親水性、及び/又は両親媒性の類似性に基づいて行われ得る。例えば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含み;正に荷電したアミノ酸はリジン及びアルギニンを含み;並びに類似の親水性値を有する無電荷の極性頭部を有するアミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン及びチロシンを含む。
本出願では、用語「相同体」は、一般に、野生型アミノ酸配列及び野生型ヌクレオチド配列に対してある特定の相同性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。用語「相同性」は、配列「同一性」と同等であり得る。相同配列は、対象配列に対して少なくとも80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、又は99.9%同一なアミノ酸配列を含み得る。典型的には、相同体は、対象アミノ酸配列と同じ活性部位等を含有するであろう。相同性は、類似性(すなわち、類似の化学特性/機能を有するアミノ酸残基)から考えられ得るか、又は配列同一性から表され得る。本出願では、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の配列番号のいずれか1つとあるパーセント同一性を有する配列は、参照する配列番号の全長にわたり前記パーセント同一性を有する配列を意味する。
配列同一性を決定するため、当業者に公知の様々な手段、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等を使用することによって実施され得る配列アライメントが実施され得る。当業者は、比較される全長配列間の最適なアライメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメントの適切なパラメーターを決定し得る。
本出願では、用語「及び/又は」は、代替物のいずれか又は両方を意味すると理解されるべきである。
本出願では、用語「含む」は、一般に、明確に特定された特徴を含むが、他の要素を除外しないことを意味する。
本出願では、用語「約」は、一般に、特定の値より0.5%～10%高いか又は低い範囲内の変化、例えば特定の値より0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、又は10%高いか又は低い範囲内の変化を指す。
実施形態
一態様では、本出願は、抗体軽鎖可変領域(VL)を含み得る抗原結合タンパク質であって、オマリズマブの軽鎖可変領域(すなわち、配列番号22に示すアミノ酸配列)と比較して、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のVLが、E55及びV104からなる群から選択される1つ又は2つの位置にアミノ酸変異を含み得る、抗原結合タンパク質を提供する。
本出願では、抗原結合タンパク質のVLは、D30b、V29、D30、Y30a及びG30cからなる群から選択される1つ以上(例えば、1、2、3、4、又は5つ)の位置にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、抗原結合タンパク質のVLは、以下の群:D30b、E55及びV104の位置にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VLは、D30b、E55、V104、V29、D30及びY30a位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VLは、D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30c位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VLは、D30b、E55、V104及びY30a位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VLは、D30b、E55、V104、Y30a及びG30c位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VLは、D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30c位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VLは、D30b、E55、V104、D30及びY30a位にアミノ酸変異を含み得る。
本出願では、E55位のアミノ酸変異は、E55Qを含み得る。
本出願では、V104位のアミノ酸変異は、V104Lを含み得る。
本出願では、D30b位のアミノ酸変異は、D30bEを含み得る。
本出願では、V29位のアミノ酸変異は、V29Lを含み得る。
本出願では、Y30a位のアミノ酸変異は、Y30A、Y30aS、及びY30aDからなる群から選択されるいずれか1つを含み得る。
本出願では、D30位のアミノ酸変異は、D30Y、D30A、D30E、D30F、D30G及びD30Nからなる群から選択されるいずれか1つを含む。
本出願では、G30c位のアミノ酸変異は、G30cA、G30cY、及びG30cWからなる群から選択されるいずれか1つを含み得る。
本出願では、VLは、以下の群のアミノ酸変異:D30bE、E55Q及びV104Lを含み得る。
本出願では、VLは、配列番号57に示すアミノ酸配列を含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質のVLは、配列番号23～34に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、抗原結合タンパク質のVLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L、V29L、D30Y及びY30aDを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L、D30A、Y30aD及びG30cWを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異30bE、E55Q、V104L及びY30aAを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L及びY30aDを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L及びY30aSを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L、Y30aD及びG30cYを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L、D30E、Y30aD及びG30cWを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L、D30G、Y30aD及びG30cAを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L、D30N、Y30aD及びG30cAを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L、D30N、Y30aD及びG30cWを含み得る。
例えば、VLは、アミノ酸変異D30bE、E55Q、V104L、D30F及びY30aDを含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質は、軽鎖定常領域をさらに含み得る。例えば、軽鎖定常領域はヒトカッパ軽鎖由来であり得る。例えば、軽鎖定常領域は配列番号59に示すアミノ酸配列を含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖も含み得る。抗体軽鎖は、抗体軽鎖可変領域及び抗体軽鎖定常領域を含み得る。例えば、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の抗体軽鎖は、配列番号23～34に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含み得る。
本出願に記載の抗原結合タンパク質は、抗体重鎖可変領域(VH)を含んでもよく、オマリズマブの重鎖可変領域(配列番号50に示すアミノ酸配列)と比較して、抗原結合タンパク質のVHは、I37、A49、S50及びD54からなる群から選択される1つ以上(例えば1、2、3又は4つ)の位置にアミノ酸変異を含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質のVHは、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6又は7つ)の位置:N60、P61、I67、T30、S31、S96及びH97からなる群から選択されるアミノ酸変異をさらに含み得る。
例えば、抗原結合タンパク質のVHは、以下の群:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54の位置にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VHは、N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96及びH97位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VHは、N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びT30位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VHは、N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS96位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VHは、N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS31位にアミノ酸変異を含み得る。
例えば、VHは、N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びH97位にアミノ酸変異を含み得る。
本出願では、I37位のアミノ酸変異は、I37Vを含み得る。
本出願では、A49位のアミノ酸変異は、A49Sを含み得る。
本出願では、S50位のアミノ酸変異は、S50Vを含み得る。
本出願では、D54位のアミノ酸変異は、D54Aを含み得る。
本出願では、N60位のアミノ酸変異は、N60Aを含み得る。
本出願では、P61位のアミノ酸変異は、P61Dを含み得る。
本出願では、I67位のアミノ酸変異は、I67Fを含み得る。
本出願では、T30位のアミノ酸変異は、T30Rを含み得る。
本出願では、S31位のアミノ酸変異は、S31Qを含み得る。
本出願では、S96位のアミノ酸変異は、S96Tを含み得る。
本出願では、H97位のアミノ酸変異は、H97Nを含み得る。
本出願では、VHは、以下の群のアミノ酸変異:N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V及びD54Aを含み得る。
本出願では、VHは、配列番号58に示すアミノ酸配列を含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質のVHは、配列番号51～56に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含み得る。
例えば、抗原結合タンパク質のVHは、アミノ酸変異N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A、S96T及びH97Nを含み得る。
例えば、VHは、アミノ酸変異N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A及びT30Rを含み得る。
例えば、VHは、アミノ酸変異N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A及びS96Tを含み得る。
例えば、VHは、アミノ酸変異N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A及びS31Qを含み得る。
例えば、VHは、アミノ酸変異N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A及びH97Nを含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質は、HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含んでもよく、HCDR1は配列番号62に示すアミノ酸配列を含んでもよく、HCDR2は配列番号42に示すアミノ酸配列を含んでもよく、HCDR3は配列番号63に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、HCDR1、HCDR2及びHCDR3を含んでもよく、HCDR1は配列番号36～37に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよく、HCDR2は配列番号42に示すアミノ酸配列を含んでもよく、HCDR3は配列番号45～48に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよい。
本出願では、抗原結合タンパク質は、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含み、LCDR1は配列番号64に示すアミノ酸配列を含んでもよく、LCDR2は配列番号17に示すアミノ酸配列を含んでもよく、LCDR3は配列番号19に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよく、LCDR1は配列番号3～14に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよく、LCDR2は配列番号17に示すアミノ酸配列を含んでもよく、LCDR3は配列番号19に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
本出願では、抗原結合タンパク質は、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよく、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3は、それぞれ配列番号62、42、63、64、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得る。
例えば、抗原結合タンパク質は、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよく、HCDR1は配列番号36～37に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよく、HCDR2は配列番号42に示すアミノ酸配列を含んでもよく、HCDR3は配列番号45～48に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよく、LCDR1は配列番号3～14に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよく、LCDR2は配列番号17に示すアミノ酸配列を含んでもよく、LCDR3は配列番号19に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、45、3、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、46、4、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号37、42、45、5、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、47、6、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、45、7、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、45、8、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、48、9、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、45、10、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、48、11、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、45、12、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、47、12、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号36、42、47、13、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号38、42、45、14、17及び19に示すアミノ酸配列を含み得るHCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2及びLCDR3を含んでもよい。
本出願では、抗原結合タンパク質は、フレームワーク領域HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3及びLFR4を含んでもよく、それぞれ配列番号35、40、44、49、1、15、18及び21に示すアミノ酸配列を含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質は、抗体重鎖定常領域をさらに含み得る。ある特定の例では、抗体重鎖定常領域は、ヒトIgG定常領域由来であり得る。例えば、ヒトIgG定常領域は、ヒトIgG1定常領域を含み得る。ある特定の例では、ヒトIgG1定常領域は、M252Y、S254T、及びT256E(Chothia番号付けルール)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸変異を含み得る。例えば、ヒトIgG1定常領域は、以下の群のアミノ酸変異: M252Y、S254T、及びT256E(Chothia番号付けルール)を含み得る。ある特定の例では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の抗体重鎖定常領域は、配列番号60～61に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質は、抗体重鎖も含み得る。抗体重鎖は、抗体重鎖可変領域及び抗体重鎖定常領域を含み得る。
本出願では、抗原結合タンパク質は、抗体軽鎖可変領域(VL)及び抗体重鎖定常領域(VH)を含んでもよく、配列番号22に示すアミノ酸配列と比較して、VLはE55及びV104からなる群から選択される1つ又は2つの位置にアミノ酸変異を含んでもよく、配列番号50に示すアミノ酸配列と比較して、VHはI37、A49、S50及びD54からなる群から選択される1つ以上の位置(例えば1、2、3、4又は5つ)にアミノ酸変異を含んでもよい。
ある特定の例では、抗原結合タンパク質のVLは以下の群:D30b、E55及びV104の位置にアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54の位置にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、抗原結合タンパク質のVLは以下の群の位置D30b、E55、V104、V29、D30及びY30aにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96及びH97にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、本出願の抗原結合タンパク質のVLは、以下の群:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cの位置にアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びT30の位置にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、VLは以下の群の位置D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS96にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、VLは以下の群の位置:D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、及びD54にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、VLは以下の群の位置:D30b、E55、V104、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、及びD54にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、VLは以下の群の位置:D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びH97にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、VLは以下の群の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、VLは以下の群の位置:D30b、E55、V104、D30及びY30aにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びH97にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、VLは以下の群の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS96にアミノ酸変異を含んでもよい。
例えば、VLは以下の群の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含んでもよく、VHは以下の群の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS31にアミノ酸変異を含み得る。
本出願では、それぞれの位置のアミノ酸変異の種は、上記のものであり得る。
本出願では、抗原結合タンパク質のVLは配列番号23～34に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよく、VHは配列番号51～56に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含んでもよい。
例えば、VLは配列番号23に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号51に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号24に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号52に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号25に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号53に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号26に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号54に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号27に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号51に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号28に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号51に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号29に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号55に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号30に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号51に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号31に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号55に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号32に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号51に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号32に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号54に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号33に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号54に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
例えば、VLは配列番号34に示すアミノ酸配列を含んでもよく、VHは配列番号56に示すアミノ酸配列を含んでもよい。
本出願に記載の抗原結合タンパク質は、高い化学安定性を有する。例えば、それは、高温、低pH及び/又は反復凍結融解に安定である。例えば、40℃で0～28日間、又はpH5.0及び40℃で0～28日間、本出願の抗原結合タンパク質は、オマリズマブと比較して少なくとも5%(例えば少なくとも10%、15%、20%、25%、30%又はそれ以上)少ない凝集を産生する(例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィーSEC-HPLCによって検出される)。例えば、40℃で0～28日間、又はpH5.0及び40℃で0～28日間、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の主要ピーク含量は、オマリズマブのものよりも少なくとも5%(例えば少なくとも10%、15%、20%又はそれ以上)高い(例えば、全カラムイメージングキャピラリー等電点電気泳動(iCIEF検出)により)。
本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、例えばヒトIgE CH3-CH4への結合については、(例えばOctet Redによって検出して)5×10-10M未満(例えば、4×10-10M、3×10-10M、2×10-10M、2.8×10-10M、2.6×10-10M、2.4×10-10M、2.2×10-10M、2.0×10-10M、1.8×10-10M、1.6×10-10M、1.4×10-10M、1.2×10-10M、1.0×10-10M未満又はそれより小さい)KD値により;別の例では、ヒト全長IgEへの結合については、(例えばOctet Redによって検出して)2×10-9M未満(例えば、1.5×10-9M、1.2×10-9M、1×10-9M未満又はそれより小さい)KD値により;さらに別の例では、ヒト全長IgEヘの結合については、(例えばBiacoreによって検出して)5×10-9M未満(例えば4.8×10-9M、4.6×10-9M、4.4×10-9M、4.2×10-9M、4.0×10-9M、3.8×10-9M未満又はそれより小さい)KD値により、ヒトIgE又はその断片に高い結合親和性を有する。
本出願に記載の抗原結合タンパク質は、例えば、カニクイザルのIgE CH3-CH4への結合については、(例えばOctet Redによって検出して)3.0×10-10M未満(例えば、2.5×10-10M、2.4×10-10M、2.3×10-10M、2.2×10-10M、2.1×10-10M、2.0×10-10M、1.9×10-10M、1.8×10-10M未満又はそれより小さい)KD値により;別の例では、サルIgE CH3-CH4への結合については、(例えばBiacoreによって検出して)4.0×10-9M未満(例えば、3.9×10-9M、3.8×10-9M、3.7×10-9M、3.6×10-9M、3.5×10-9M未満又はそれより小さい)KD値により、高親和性でサルIgEに結合し、前臨床動物モデルの薬力学研究を容易にすることができる。
本出願に記載の抗原結合タンパク質は、例えば、FcεRIへのヒト全長IgEの結合のブロックについては、(例えばELISAによって検出して)1.5nM未満(例えば、1.4nM、1.3nM、1.2nM、1.1nM、1.0nM、0.9nM未満又はそれより小さい)EC50値により;別の例では、FcεRI発現細胞からのIgE刺激ヒスタミン放出のブロックについては、4.0nM未満(例えば、3.9nM、3.8nM、3.7nM、3.6nM、3.5nM、3.4nM、3.3nM、3.2nM、3.1nM、3.0nM未満又はそれより小さい)EC50値により、IgE Fc受容体(FcεRI)へのIgEの結合を効果的にブロックすることができる。
本出願の抗原結合タンパク質は、長い血中半減期を有し、その注射の頻度を減らし、患者の疾患の調節を容易にすることができる。例えば、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の半減期は、ノンコンパートメントモデル解析又はELISAアッセイを使用する遊離IgE濃度によって算出した場合、オマリズマブよりも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%又はそれ以上上昇する。
核酸分子、ベクター及び細胞
本出願は、本出願の抗原結合タンパク質の重鎖及び/又は軽鎖をコードする単離された核酸分子も提供する。好適には、核酸分子は、本出願の抗原結合タンパク質の重鎖又は軽鎖をコードする。本出願の核酸分子は、例えば化学プロセシングによって産生された合成DNA、cDNA、ゲノムDNA、又はこれらの任意の組合せを含み得る。
本出願の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、当業者に周知の方法によって得ることができる。例えば、抗体重鎖及び軽鎖の一部又は全てをコードする核酸分子は、所望によりアッセイした核酸分子から、又は相当するアミノ酸配列に基づいて合成され得る。本出願の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子は、分子生物学の標準的な技術を使用して調製され得る。所望の核酸分子は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して完全に又は一部合成され得る。適切な場合、部位特異的変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術が使用され得る。
本出願は、本出願の1つ以上の核酸分子を含むクローニング又は発現ベクターにも関する。したがって、本出願の抗原結合タンパク質をコードする1つ以上の核酸分子を含むクローニング又は発現ベクターを提供する。あるいは、クローニング又は発現ベクターは、それぞれ本出願の抗原結合タンパク質の軽鎖及び重鎖をコードする2つの核酸分子、及び好適なシグナル配列を含み得る。
本出願は、本出願の抗原結合タンパク質をコードする1つ以上の核酸分子を含む1つ以上のクローニング又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。任意の好適な宿主細胞/ベクターシステムは、本出願の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を発現するために使用され得る。細菌、例えば大腸菌(E.coli)及び他の微生物系が使用されるか、又は真核生物、例えば哺乳動物宿主細胞発現系も使用され得る。好適な哺乳動物宿主細胞は、CHO、ミエローマ又はハイブリドーマ細胞を含む。
調製方法
本出願は、抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で細胞を培養するステップを含む、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を産生する方法も提供する。抗原結合タンパク質は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含んでもよく、その場合、重鎖又は軽鎖のコード配列のみが宿主細胞にトランスフェクトされ得る。重鎖と軽鎖の両方を含む産物を産生するため、細胞系は2つのベクターによってトランスフェクトされてもよく、第1のベクターは軽鎖ポリペプチドをコードし、第2のベクターは重鎖ポリペプチドをコードする。あるいは、1つのベクターが使用されてもよく、ベクターは軽鎖及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む。
本出願は、宿主細胞を培養する、並びに抗原結合タンパク質又はその断片を発現する、単離する及び精製する方法を提供する。
一実施形態では、不純物がカラム上に保持され、抗体が溶出されるように、非結合モードで陰イオン交換クロマトグラフィーを実施するステップを含む抗原結合タンパク質を精製する方法を提供する。
一例では、精製は、プロテインAカラムでのアフィニティーキャプチャー後にタイトレーションを用いることができる。一例では、精製は、プロテインGカラムでのアフィニティーキャプチャー後にHPLCタイトレーションを用いることができる。一例では、精製は、IgEカラムでのアフィニティーキャプチャー後にタイトレーションを用いることができる。精製する方法は、1つ以上の濾過ステップ、例えば透析濾過ステップ又はHPLC濾過ステップも含み得る。
医薬組成物、方法及び使用
本出願の抗原結合タンパク質は、病的状態の治療及び/又は予防に好適であるため、本出願は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と組み合わせて、本出願の抗原結合タンパク質を含む医薬又は診断組成物も提供する。したがって、本出願は、医薬組成物の調製における本出願の抗原結合タンパク質の使用も提供する。
本出願は、1つ以上の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体と共に本出願の抗体又は抗原結合剤を添加及び混合するステップを含む、医薬又は診断組成物を調製する方法も提供する。抗原結合タンパク質は、医薬又は診断組成物中の唯一の活性成分として寄与し得るか、又は他の抗体若しくは非抗体成分、例えばステロイド又は他の薬物分子、特にその半減期がIgE結合と関連しない薬物分子を含む他の活性成分を伴い得る。
組成物は、個々に患者に投与され得るか、又は他の薬剤、薬物若しくはホルモンと組み合わせて(例えば、同時に、順に又は別々に)投与され得る。
一方、本出願は、IgEの異常レベルと関連する疾患を緩和又は治療するための医薬の調製における、抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞及び/又は組成物の使用を提供する。
別の態様では、本出願は、IgEの異常レベルと関連する疾患を緩和又は治療する方法であって、抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞及び/又は組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法を提供する。
医薬組成物は、治療有効量の本出願の抗体又は抗原結合タンパク質を含み得る。本明細書で使用する場合、用語「治療有効量」は、標的疾患又は状態を治療、緩和若しくは予防する、又は検出可能な治療若しくは予防効果を示すのに必要な治療剤の量を指す。任意の開示された抗体又は抗原結合タンパク質については、治療有効量は、初めに、細胞培養アッセイ又は動物モデル、典型的には齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、若しくは霊長類で評価され得る。動物モデルは、適切な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用され得る。この情報は、次いで、ヒトへの投与に好適な投与量及び経路を決定するために使用され得る。ヒト対象のための正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、対象の健康全般、対象の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、合剤、応答の感度並びに治療に対する耐用性/応答によるであろう。
本出願の医薬組成物は、限定はされないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮的、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む様々な経路によって投与され得る。本発明の医薬組成物は、無針注射デバイスを使用しても投与され得る。典型的には、治療用組成物は、溶液又は懸濁液として注射可能に調整される。注射前に液体ビヒクル中の溶液又は懸濁液とするのに好適な固体形態も調製され得る。
本出願の抗原結合タンパク質を含む医薬組成物の治療用量は、in vivoで顕著な毒物学的効果を示さない。また、本出願の抗原結合タンパク質の連続用量を投与することにより、対象におけるIgE活性のレベルが適切な正常(例えば、低減した)レベルに維持され得る。
いずれの理論によっても限定されないが、以下の実施例は、本出願の融合タンパク質、調製方法及び使用等を例示することのみが意図され、本出願の発明の範囲を限定することを意図しない。
［実施例1］
オマリズマブ改変最適化抗体の設計及び発現
オマリズマブの軽鎖及び重鎖可変領域(軽鎖可変領域配列は配列番号22に示し、重鎖可変領域配列は配列番号50に示す)に基づき、最適化設計、軽鎖及び重鎖のヒト化変異、並びに翻訳後修飾(PTM)部位の除去を行い、新しい軽鎖及び重鎖可変領域を得る。
次いで、全長組換え抗体の軽鎖及び重鎖のタンパク質配列のコドン最適化を実施し、コドン最適化DNA断片(Genscript)を遺伝学的に合成した。クローニング後、IgG1の形態を有する合成した遺伝子断片を、発現ベクターpcDNA3.4(Life Technologies)に挿入した。発現プラスミドを増幅し、プラスミドを抽出した後、2つのプラスミドをExpiCHO細胞(ThermoFisher Scientific, A29133)にコトランスフェクトし、次いで、製造業者のExpiCHO発現システムの方法に従って、ExpiCHO細胞を、総培養容積25mlの培地中、8%二酸化炭素濃度、36.5℃で、6×106個の細胞/mLの密度までインキュベートし、ExpiFectamineトランスフェクション試薬を使用して、それぞれ10μgの抗体軽鎖及び重鎖発現プラスミドで細胞を形質転換することにより、抗体を一過的に発現させ；トランスフェクションの1日後、150μL及び4mLのExpiCHOエンハンサー及びExpiCHO補助物質を培養細胞に添加し、9日間細胞を培養した後、4℃で3500rpmの遠心分離により上清を得た。AmMagTMプロテインA磁気ビーズ(Genscript, L00695)及び抗体発現上清を混合した後、室温で2時間インキュベートし、上清を捨てる前にPBSで2回洗浄し、次いで適切な量の溶出緩衝液プロテインG又はA SefinoseTM Elution緩衝液(Sangon, C600481)を添加した後、5分間のインキュベーションのためにチューブラックにそれを置く前に完全に混合し、インキュベーション中に磁気ビーズを2～3回再懸濁した後、中和及び保存のために適切な量の中和溶液1M Tris-HCl、pH7.5(Sangon, B548124)を添加する直前に2回溶出した。得られた精製抗体を表7に示す(AB1904HzL0H0はオマリズマブを意味する)。
Figure 2023541217000007
［実施例2］
ヒトIgE親和性のアッセイ
抗体を、まず、ビオチン化ヒトIgE CH3-CH4(Biotin-hIgE CH3-CH4, Sino Biological, カタログ番号29702-H08H、インハウスでビオチン標識)との親和性について試験し、以下の実験プロセスによるオフ速度によってソートした。
(1)抗原及び抗体の希釈:抗原と抗体の両方を、1×Kinetic Buffer(Kinetic Buffer, Fortebio, 18-1105)によって希釈し、使用のための抗原の濃度は1μg/ml、使用のための抗体の濃度は100nMとした。
(2)機械(Octet Data Acquisition 11.1.0.11)での試料の検出:まず、以下の表に従って、200μL/ウェルで96ウェルプレート(Greiner bio-one, 655209)に試料を添加した。次いで、ソフトウェアパラメーターを設定し、プレート温度を30℃に設定し、標準動的シグナルの頻度を5.0Hzで収集した。次に、CH1センサー(Fortebio, 18-0039)を1×PBSTにより10分間プレウェットし、次いで機械で試験した。各サイクルは以下のステップを含む:1)60秒間緩衝液中に浸すステップ; 2)抗原がセンサーに非特異的に結合するかどうか検出するステップ; 3)10mM pH1.7でグリシン溶液により再生するステップ; 4)60秒間緩衝液中に浸すステップ; 5)30秒間センサー上に抗体を固定化するステップ; 6)180秒間緩衝液中にセンサーを浸すステップ; 7)180秒間抗原－抗体の会合ステップ; 8)10分間抗原－抗体の解離ステップ; 9)センサーを再生するステップ。
(3)データ解析:Fortebio’s Data Analysis 11.1ソフトウェアを使用して、1:1結合の抗原－抗体の会合速度(Ka)及び解離速度(Kd)を測定し、抗体の平衡解離定数(KD)を算出し、結果を表2に示す。
［実施例3］
抗体の物理的及び化学的性質の検出
3.1 SEC-HPLC純度解析
(1)試料は、1mg/mLに希釈し、よく混合し、5分間12000rpmで遠心分離した後、上清を得て、それを試料ボトルに移した後、HPLC試料トレイに置いた。クロマトグラフ条件は以下のように設定した:
Figure 2023541217000008
 (2)移動相(200mM リン酸緩衝液、pH6.8)によってカラムを平衡化した後、試料を注入及び解析し、データはクロマトグラフィーソフトウェアによって解析し、各ピークのピーク面積パーセンテージをピーク面積正規化法によって算出した。
3.2 HIC-HPLC解析
(1)試料は、1mg/mLに希釈し、よく混合し、5分間12000rpmで遠心分離した後、上清を得て、それを試料ボトルに移した後、HPLC試料トレイに置いた。クロマトグラフ条件は以下のように設定した:
Figure 2023541217000009
 (3)勾配溶出解析は、移動相A(50mMリン酸緩衝液/1M硫酸アンモニウム、pH7.0)及び移動相B(50mMリン酸緩衝液、pH7.0)によって実施し、データ解析は、クロマトグラフィーソフトウェアによって実施した。保持時間に基づき、各試料の親水性係数を算出した。
3.3 融解温度(Tm)値解析
Protein Thermal Shift(商標) Starter Kit (カタログ番号4461146)の説明書に従って、試験する試料を試料緩衝液によって1mg/mLに希釈し、次いで13μLの試験溶液をPCRチューブに添加した後、5μLのProtein Thermal shift TM Buffer及び2μLの10×Staining溶液を添加して20μLの反応容量にし、混合する前に、5分間12000rpmで遠心分離して気泡を除去した。試験する試料を、PCR装置に入れ、解析し、試料のTm値を記録した。
3.4 ICIEF解析
試料溶液を、以下のよく混合したシステムに添加した:1% メチルセルロース(カタログ番号101876)70μL、尿素(カタログ番号U6504) 4M、両性電解質Pharmalyte pH3～10(カタログ番号17-0456-01)8μl、それぞれ2μlのpIマーカー5.5(カタログ番号A58325)及び9.5(カタログ番号A358357)。適切な容量の超純水を添加して200μlにし、よく混合した。全ての試料を3分間6000rpmで遠心分離して気泡を除去し、次いで上清を試料ボトルに移し、試料トレイに置き、試料位置を記録した。操作の開始後、スペクトル統合処理並びに各ピークの等電点及び各ピークのパーセンテージの算出のため、結果ファイルをChrom Perfectソフトウェアにインポートした。抗体の物理的及び化学的試験結果を表8に示す。
Figure 2023541217000010
結果は、AB1904L1p1H3p2(軽鎖可変領域 配列番号23、重鎖可変領域 配列番号51)がより高い親和性を有し、同時に、潜在的な翻訳後修飾部位も除去し、さらに化学的安定性が改善することを示す。
［実施例4］
新規抗体のための酵母親和性成熟
AB1904L1P1H3P2を、酵母親和性成熟のために選択し、表9に示す抗体AB1904Am1からAB1904Am15を得、YTE(M252Y/S254T/T256E)改変変異をFc断片に実施し、それぞれAB1904Am13、AB1904Am14、及びAB1904Am15と名付けた。
Figure 2023541217000011
 表9の抗体の物理的及び化学的性質を実施例3の方法を使用して試験し、結果を表10に示す。
Figure 2023541217000012
［実施例5］
抗体は、ヒトIgE CH3-CH4、ヒト全長IgE及びカニクイザルIgE CH3-CH4に結合する(Octet Red検出)
5.1 本明細書に記載の抗体は、ヒトIgE CH3-CH4に結合することができる
抗体AB1904Am1～AB1904Am12のヒトIgE CH3-CH4(hIgE CH3-CH4、Sino Biological、カタログ番号: 29702-H08H)に対する親和性を、Octet RED96e(Fortebio)によって決定した。抗原及び抗体は両方とも、1×PBST(1×PBS: Sango、B548117-0500; 0.02% Tween 20: sigma-alorich、P1379)を使用して希釈し、抗原は50nMの濃度で使用し、抗体は、33.3nMの濃度で使用した。オンマシン検出は、実施例2の方法に従って実行した。結果は表11に示し、抗体がヒトIgE CH3-CH4に対して高い親和性を有し、KD値がオマリズマブと類似か又はそれより低いことを示している。
Figure 2023541217000013
5.2 本明細書に記載の抗体は、ヒト全長IgEに結合することができる
ヒト全長IgE(FL hIgE、ABBIOTEC、カタログ番号250205)への抗体の親和性を、実施例2の方法に従って決定した。結果を表12に示す。全ての抗体は、高親和性でヒト全長IgEに結合することができる。
Figure 2023541217000014
5.3 本明細書に記載の抗体は、カニクイザルIgE CH3-CH4に結合することができる
ビオチン化カニクイザルIgE CH3-CH4(Biotin - cyno IgE CH3-CH4、Kactus Biosystems)との抗体の親和性を、実施例2の方法に従って試験し、結果を表13に示す。全ての抗体は、高親和性でビオチン化カニクイザルIgE CH3-CH4に結合することができた。
Figure 2023541217000015
［実施例6］
抗体は、ヒト全長IgE及びカニクイザルIgE CH3-CH4に結合する(Biacore検出)
まず、Biotin CAPture試薬を、300秒間2μL/分の流速でCAPチップ(GE Healthcare、カタログ番号28-9202-34)上に捕捉させた。HBS-EP+を実験緩衝液として使用した。ある特定の濃度の抗体の捕捉した抗原への結合を、各注入サイクルについて決定し、各サイクルは抗原の捕捉、異なる濃度の抗体の注入、及び再生を含む。2μg/mlのビオチン化ヒト全長IgE(Biotin-FL hIgE、Abbiotec、カタログ番号250205、本発明者ら自身によるビオチン化)又は0.25μg/mlのビオチン化カニクイザルIgE CH3-CH4(Biotin-cyno IgE、Kactus Biosystemsによってカスタマイズされた)を、60秒間10μL/分の流速で2つのチャンネルで捕捉し、1つのチャンネルをブランク参照チャンネルとして使用した。30μL/分の流速で、段階希釈した抗体(100nM、50nM、25nM、12.5nM、6.25nM、3.125nM、1.5625nM、0nM)をチャンネル1及び2に順に注入し、会合及び解離を決定した。チップ再生は、10μL/分の流速で再生緩衝液(6M 塩酸グアニジン、0.25M 水酸化ナトリウム)によって実施し、捕捉した抗原及び抗体を除去した。データは、Biacore 8K解析ソフトウェアを使用して解析した。ソフトウェア解析のために使用したモデルは、1：1結合用である。
表14に示す結果は、本出願に記載の全ての抗体が、オマリズマブと有意には異ならないか又はそれ以下であるKD値で、ビオチン化ヒト全長IgEとカニクイザルIgE CH3-CH4の両方に結合することができたことを示す。
Figure 2023541217000016
［実施例7］
抗体は、ヒト及びカニクイザルFcRnに結合する(Octet Redによって検出された)
ヒトFcRn(Acro、FCN-H52W7)及びカニクイザルFcRn(Acro、FCM-C52W9)への抗体の親和性を、Octet RED96e(Fortebio)を使用して、実施例2の方法に従って決定した。ここでは、ヒトFcRn及びカニクイザルFcRnは、それぞれ1×PBS(10mM Na2HPO4.12H2O、2mM KH2PO4、137mM NaCl、2.7mM KCl、pH6.0)によって5μg/mlに希釈し、ビオチンコンジュゲートTHETM Hisタグマウスモノクローナル抗体は2μg/mlに希釈し;試験する抗体は、1×PBST(1xPBS、0.02% Tween 20、pH6.0)によって希釈し、抗体希釈濃度は1000nM～31.3nMの範囲とした。結果を表15に示す。全ての抗体は、カニクイザル及びヒトFcRnに結合することができた。
Figure 2023541217000017
［実施例8］
抗体はFcεRIへのビオチン化ヒト全長IgEの結合をブロックする
FcεRIα(R＆D、6678-Fc)を、PBSを使用して100μl/ウェルでコートした酵素標識プレート中0.5μg/mlに希釈し、1時間37℃でのインキュベーションの前にシーリングフィルムを貼り付け、その後プレートを洗浄溶液(PBS+0.05% TWEEN-20)で3回洗浄した。次いで、ブロッキング溶液(PBS+0.05% TWEEN-20+2% BSA)を洗浄溶液によって調製し、300μlのブロッキング溶液を各ウェルに添加し、1時間37℃でインキュベートした。160ng/mlの濃度のビオチン化ヒト全長IgE(Biotin-FL hIgE、Abbiotec、カタログ番号250205、インハウスでビオチン化)をブロッキング溶液中で調製し;次いで、抗IgE抗体をブロッキング溶液中で、初濃度は4μg/mlで開始し、3倍段階希釈(7濃度点+1つの0濃度点に希釈)で調製し;次いで60μLの抗IgE抗体を60μL Biotin-FL hIgEに添加し、37℃で2時間インキュベートした。次いで、ブロッキングしたELISAプレートを取り出し、洗浄溶液によって3回洗浄し、37℃でプレインキュベートした抗IgE抗体及びビオチン化ヒト全長タンパク質複合体溶液を添加して100μl/ウェルにし、次いで1時間37℃でインキュベートした。プレートを洗浄溶液で3回洗浄し、SA-HRP(sigma、S2438-250UG)をブロッキング溶液によって1/5000に希釈して、100μl/ウェルでELISAプレートに添加し、1時間37℃でインキュベートし;プレートを洗浄溶液で3回洗浄し、次いでTMB発色性溶液(Biopanda、製品番号: TMB-S-003)を100μl/ウェルで添加し、10分間暗室中の室温での反応後、50μl/ウェルで停止溶液(Solarbio、製品番号: C1058)を添加して、450nmの波長での吸光度値の決定の前に反応を停止させた。図2に示す結果は、本出願に記載の抗体が、ビオチン化IgEのFcεRIへの結合をブロックすることができ、EC50値がオマリズマブよりも低いことを示す。
［実施例9］
抗体は、IM-9細胞表面上のCD23へのビオチン化ヒト全長IgEの結合をブロックする
IM-9細胞を、RPMI1640+10% FBS(RPMI1640、FBS、Thermo Fisher)を使用して、37℃、5%二酸化炭素下で培養した。IM-9細胞を回収し、FACS緩衝液(PBS+2%FBS)で1回洗浄し、2.5×106個の細胞/mlの細胞密度でFACS緩衝溶液中に再懸濁した。細胞懸濁液(ウェルあたり100μl)をU底の96ウェル細胞培養プレートに添加し、次いで30分間4℃の冷蔵庫に置いた。ビオチン化ヒト全長IgE(hIgE、ABBIOTEC、カタログ番号250205、インハウスでビオチン化)を、20μg/mlの濃度にFACS緩衝溶液中で調製し;次いで抗IgE抗体を、FACS緩衝液を使用して、開始濃度60μg/ml、3倍段階希釈(7濃度点+1つの0濃度点に希釈)で調製し、次いで60μLの抗IgE抗体を60μL biotin-FL hIgEに添加し、その後1時間4℃でインキュベートした。同時に、2.5μlのFc Block(BD Pharmingen、カタログ番号564220)を各ウェルの細胞に添加し、1時間4℃でインキュベートし;96ウェル細胞培養プレートを4℃の冷蔵庫から取り出し、上清を捨てる前に、5分間2000rpmで遠心分離し、次いでプレインキュベートした抗IgE抗体及びビオチン化ヒト全長IgEタンパク質複合体溶液を100μl/ウェルで添加し、1時間4℃でインキュベートし、5分間2000rpmで遠心分離した後、上清を捨て、FACS緩衝溶液で3回洗浄した。FITC-結合ストレプトアビジン(Invitrogen、カタログ番号SA1001)を1：500に希釈した後、100μLを各ウェルに添加し、1時間4℃でインキュベートし、5分間2000rpmで遠心分離した後、FACS緩衝溶液によって3回洗浄する前に上清を捨てた;次いで、細胞を、FACS緩衝溶液によって1：2に希釈し、Guava easyCyte 6-2L Benchtop Flow Cytometerを使用して検出した。図3に示す結果は、本出願に記載の抗体が、IM-9細胞の表面上のCD23へのビオチン化ヒト全長IgEの結合をブロックすることができたことを示す。
［実施例10］
抗体は、FcεRI/RBL-2H3からのビオチン化ヒト全長IgE刺激によるヒスタミン放出をブロックする
FcεRI/RBL-2H3細胞(Genechem geneによって構築された)を、FcεRI/RBL-2H3培地(MEM + 15% FBS + 1 mM ピルビン酸ナトリウム+ 1 μg/ml Puromycin)を使用して、37℃、5%二酸化炭素の条件下で培養した。2.4μg/mlの濃度のヒト全長IgEタンパク質(ABBIOTEC、カタログ番号250205)を、細胞培養培地を使用して調製し;次いで抗IgE抗体を、細胞培養培地を使用して15μg/mlの濃度で開始し、2倍段階希釈(9濃度点+1つの0濃度)で調製した。50μLのヒト全長IgEタンパク質をまず96ウェル平底細胞培養プレートに添加し、次いで50μLの調製した抗IgE抗体を添加した。同時に、FcεRI/RBL-2H3細胞を回収し、2×106個の細胞/mlの細胞濃度で培地中に再懸濁し、対応する96ウェル平底細胞培養プレートに50μl/ウェルで添加し、次いで細胞培養プレートを37℃、5%二酸化炭素下で終夜、細胞インキュベーター内でインキュベートした。翌日、上清を吸引及び廃棄した後、細胞をアッセイ緩衝液(Tyrode's緩衝液(130mM NaCl、5mM KCl、10nM HEPES、1.4mM CaCl2、1mM MgCl2.6H2O、5.6mM Glucose、0.1%BSA)、pH7.4)を使用して2回洗浄した後、30分間、37℃、5%二酸化炭素の細胞インキュベーター内でのインキュベーションの前に、200μlの1μg/mlのポリクローナル抗IgE抗体(R&D、カタログ番号:G-107-C)を各ウェルに添加し;上清を吸引し、Histamine Dynamic kit (CISBIO、製品番号: 62HTMDPEG)を使用して、キットの説明書に基づく検出方法に従って検出した。結果を図4A及び図4Bに示し、抗体が、誘導されたFcεRI/RBL-2H3からのFL hIgE誘導ヒスタミン放出を阻害することができ、IC50値がオマリズマブよりも低いことを示し、阻害効果がオマリズマブよりも優れていることを示している。
［実施例11］
ヒト全血ヒスタミン放出アッセイ
ボランティアは、血液供与の24時間前に、アレルギー原因薬物、抗ヒスタミン剤、経口コルチコステロイド、及びH2受容体をブロックする任意の物質を服用してはならない。全血は、抗凝血剤としてのヘパリンと共に処置した。
ヒスタミン放出は、以下のように、キット(Sigma、カタログ番号: IB89145)の操作工程に従って実施した:使用前に、試験する抗体は、PBSによって6000、600、60及び6nMに希釈し、キット中の陽性対照抗IgE血清は、ヒスタミン放出緩衝溶液によって1000倍に希釈した。ヒスタミン放出プロセスを実施するローディング試料及び操作は、以下の表16に示す。
Figure 2023541217000018
ヒスタミンELISAは、以下のように、キット(Sigma、カタログ番号: IB89128)の操作工程に従って実施した。50μlの上清又は標準及び対照物質を脱イオン水によって1倍希釈し、それぞれ対応するウェルに添加した。次いで、25μlのアセチル化緩衝溶液及び25μlのアセチル化溶液を各ウェルに添加し、室温で45分間、600rpmで震盪した。最後に、100μlの脱イオン水を添加し、室温で15分間、600rpmで震盪した。試料をアセチル化後、25μlをヒスタミンコートしたプレートに添加し、次いで100μlの抗ヒスタミン血清を添加した後、室温で3時間、600rpmでの震盪の前にシーリングフィルムでシーリングした。インキュベーション後、ウェルプレート中の液体を捨て、その後、100μlの酵素結合二次抗体を各ウェルに添加し、次いで室温で30分間、600rpmで震盪する前に、300μlの洗浄溶液を4回の洗浄のため各ウェルに添加した。ウェルプレート中の液体を捨て、その後、100μlの基質を各ウェルに添加し、次いで室温で30分間、600rpmで震盪する前に、300μlの洗浄溶液を4回の洗浄のために各ウェルに添加した。最後に、100μlの停止溶液を添加して反応を停止させ、Envisionマイクロプレートリーダー(PerkinElmer)を使用して、450nm及び570nmでの吸光度値を10分以内に収集した。
結果を図5に示し、抗IgE血清が、FcεRIに結合したIgEを架橋又は活性化することができ、ヒスタミン放出を誘導するが、オマリズマブ、AB1904A m10及びAB1904A m15はしなかったことを示している。
［実施例12］
抗体安定性試験
候補抗体の安定性を、高温、低pH、及び反復凍結融解の安定性実験条件により包括的に評価する。安定性試験の重要な試験項目は、SEC-HPLC、iCIEF、及び非還元CE-SDSを含む、製品の重要な純度指標に主に向けられる。
11.1 高温安定性試験
この試験は、高温条件下での候補抗体の安定性を調べることに焦点を当てる。試料を、40±2℃の実験条件下に置き、0日目、3日目、7日目、14日目、21日目及び28日目に、SEC-HPLC純度、電荷異性体純度、nrCE-SDS純度を検出した。実験結果は以下の通りである:
Figure 2023541217000019
11.2 低pH安定性試験
低pH条件下での候補抗体の安定性を主に調べ、試料のpHを塩酸によって5.0に調整し、40±2℃に置き、0時間、6時間、24時間、48時間、72時間で、SEC-HPLC純度、電荷異性体純度、nrCE-SDS純度をそれぞれ検出した。実験結果は以下の通りである:
Figure 2023541217000020
11.3 反復凍結融解安定性試験
反復凍結及び融解条件下での候補抗体の安定性を主に調べ、サイクルは、試料を-70±10℃で凍結したときから、室温で融解するまでであった。試料を、3サイクル及び6サイクルでそれぞれ試験した。実験結果は以下の通りである:
Figure 2023541217000021
AB1904Am10、AB1904Am15及びオマリズマブの高温安定性、低pH安定性及び反復凍結融解安定性を試験した。高温及び低pH安定性試験の結果は、候補抗体AB1904Am10及びAB1904Am15の安定性が、高温及び低pH条件下のオマリズマブよりも優れており、特にSEC-HPLC検出での凝集の量の減少、及びiCIEF検出での主要ピークの減少は、候補抗体AB1904Am10及びAB1904Am15が温度及び低pHに対してより耐性及びより安定であり、それにより生産、保存及び使用の間により安定であることを示している。反復凍結融解安定性試験の結果は、純度についてのAB1904Am10及びAB1904Am15の全ての重要な品質指標が、6回の反復凍結融解後に十分な安定性を有することを示した。
［実施例13］
ヒト化FcRnマウスモデルにおける薬物動態(PK)試験
ヒト化FcRnマウスを試験動物として使用し、3つの試験薬物、オマリズマブ、AB1904Am10及びAB1904Am15の単回皮下投与後の薬物動態指標を試験した。全ての動物実験プロトコールは、IACUCによって審査及び認可された。hFcRnマウスは、Beijing Biosituから購入し、雄、6～8週齢、体重23～26gであり、SPF動物室で、標準的なペレット食を与え、自由に飲食させ、室温18～24℃、相対湿度40%～50%、昼夜を1日12時間として飼育した。全部で12匹の実験動物を、各群に4匹で、3つの群に無作為に分け、10mg/kgの単回用量を皮下に投与し、投与容量は10mL/kgであった。血液採取時点は、投与前、投与後2時間、6時間、24時間(1日)、2日、3日、4日、7日、10日、14日、21日、28日、35日及び42日である。60μLの全血を頬穿刺によってEPチューブに採取し、30分間室温で立てておき、次いで遠心分離(2000g、4℃、5分)して血清を分離した。各試料を2部(試験チューブ及びバックアップチューブ)、10μL/チューブに分け、-80℃で保存した。
異なる時点での3つの薬物の薬物動態を、Elisa間接法によって解析した。コーティング抗原は抗ヒトIgG1抗体(Fc特異的)(Abeam、カタログ番号:ab1927)、2μg/ml、100μl/ウェル、37℃、2時間であった。プレートを洗浄後、200μl/ウェルのブロック溶液を使用して、4℃で終夜インキュベートした。血清試料を、50μl/ウェルで、37℃で1時間添加した。検出抗体は、マウス抗ヒトFab HRP(1:10000)(Abcam、カタログ番号:ab87422)、100μl/ウェル、37℃、0.5時間であった。TMB色素溶液(KPL、カタログ番号:52-00-03)を使用して発色させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices、SpectraMax M3)を使用して、OD450での値を収集した。薬物濃度は、標準曲線に従って得られ、PKパラメーターは、PK Solver非コンパートメントモデルを使用してデータを処理することにより得られた。
結果を図6に示す。オマリズマブの投与後、半減期(t1/2)=10.9日、最高濃度(Cmax)は53214.1ng/mlであった；AUCは900661ng/ml×dであった;AB1904AM10の投与後、半減期(t1/2)=13.5日、最高濃度(Cmax)は60441.4ng/mlであった；AUCは1220787ng/ml×dであった;AB1904AM15の投与後、半減期(t1/2)=26.6日、最高濃度(Cmax)は57355．7ng/mlであった。AUCは1284785ng/ml×dであった。
［実施例14］
カニクイザルモデルにおける薬物動態-薬力学(PK/PD)試験
カニクイザルを対象動物として使用し、3つの試験薬物、オマリズマブ、AB1904Am10及びAB1904Am15の単回皮下投与後の薬物動態及び薬力学を試験した。
全ての動物実験プロトコールは、IACUCによって審査及び認可された。実験に使用した9匹のSPFグレードの雄のカニクイザルは、4歳以上、体重4.1～5.7kgであり、SPFグレード動物室で飼育し、自由に飲食させた。投与量は10mg/kgであった;投与経路は皮下注射であった;投与体積は薬物の特定の濃度に従って算出した。カニクイザルを、TAあたり3匹のカニクイザルで、3つのTAに群分けし;投与については:投与体積は体重によって算出し、薬物を単回で皮下に注射し、投与時間を記録した;採取時点については:投与前、投与後2時間、6時間、24時間(1日)、2日、3日、4日、7日、10日、14日、21日、28日、35日、42日及び56日であり、それぞれにつき300μLの全血を橈側皮静脈及び伏在静脈からEPチューブに採取し、血液採取時間を記録した;試料のプロセシングについては:全血を1時間室温で立てておき、遠心分離:6000g、25℃、10分して血清を分離した後、各試料を5部(1つの試験チューブ及び4つのバックアップチューブ)、30μL/チューブに分け、次いで-80℃で保存した。
異なる時点での3つの薬物の薬物動態を、Elisa間接法によって解析した。コーティング抗原は抗ヒトIgG1抗体(Fc特異的)(Abeam、カタログ番号:ab1927)、2μg/ml、100μl/ウェル、37℃、2時間であった。プレートを洗浄後、200μl/ウェルのブロッキング溶液を使用して、4℃で終夜インキュベートした。血清試料を、50μl/ウェルで、37℃で1時間添加した。検出試薬は、ヒトIgE-Biotin(Abbiotec、カタログ番号: 250205、本発明者ら自身によるビオチン化標識) + SA-HRP (sigma、カタログ番号: S2438-250UG)であり、100μl/ウェルで、37℃で0.5時間添加した。TMB色素溶液(KPL、カタログ番号:52-00-03)を使用して発色させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices、SpectraMax M3)を使用して、OD450での値を収集した。薬物濃度は、標準曲線に従って得られ、PKパラメーターは、PK Solver非コンパートメントモデルを使用してデータを処理することにより得られた。
結果を図7に示す。オマリズマブの投与後、半減期(t1/2)=6.35日、最高濃度(Cmax)は112493ng/mlであり、AUCは1704601ng/ml×dであった;AB1904AM10の投与後、半減期(t1/2)=11.15日、最高濃度(Cmax)は83940ng/mlであり、AUCは1324493ng/ml×dであった;AB1904AM15の投与後、半減期(t1/2)=12.2日、最高濃度(Cmax)は142880ng/mlであり、AUCは3061056ng/ml×dであった。
次いで、血清中の遊離IgEを、Elisa間接法によって検出した。コーティング抗原はAB1904Am15、0.5μg/ml、100μl/ウェル、4℃で終夜であった。プレートを洗浄後、200μl/ウェルのブロッキング溶液を使用して、37℃で1時間インキュベートした。血清試料を、50μl/ウェルで、37℃で1.5時間添加した。500ng/mlのビオチン標識オマリズマブをウェル当たり100μLに1時間添加し;次いで、SA-HRP(1:10000、sigma、カタログ番号:S2438-250UG)を100μl/ウェルに37℃で1時間添加した。TMB色素溶液(KPL、カタログ番号:52-00-03)を使用して発色させ、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices、SpectraMax M3)を使用して、OD450を読み取った。遊離IgE濃度は、標準曲線に従って得られた。
結果を図1に示す。オマリズマブの投与後、遊離IgEの初期濃度への回復時間は約21日であり;AB1904Am10の投与後、遊離IgEの初期濃度への回復時間は約28日であり;AB1904Am15の投与後、遊離IgEの初期濃度への回復時間は約42～56日であった。

Claims (50)

  1. 抗体軽鎖可変領域(VL)を含む抗原結合タンパク質であって、VLが、配列番号22に示すアミノ酸配列と比較して、E55及びV104からなる群から選択される1つ以上の位置にアミノ酸変異を含む、抗原結合タンパク質。
  2. VLが、D30b、V29、D30、Y30a及びG30cからなる群から選択される1つ以上の位置にアミノ酸変異を含む、請求項1に記載の抗原結合タンパク質。
  3. VLが、以下の群:D30b、E55及びV104の位置にアミノ酸変異を含む、請求項1～2のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  4. VLが、
    (1)D30b、E55、V104、V29、D30、及びY30a;
    (2)D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30c;
    (3)D30b、E55、V104及びY30a;
    (4)D30b、E55、V104、Y30a及びG30c;
    (5)D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30c;並びに
    (6)D30b、E55、V104、D30及びY30a
    からなる任意の群から選択される位置にアミノ酸変異を含む、請求項1～3のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  5. E55位のアミノ酸変異がE55Qを含む、請求項1～4のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  6. V104位のアミノ酸変異がV104Lを含む、請求項1～5のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  7. D30b位のアミノ酸変異がD30bEを含む、請求項2～6のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  8. V29位のアミノ酸変異がV29Lを含む、請求項2～7のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  9. Y30a位のアミノ酸変異がY30A、Y30aS、及びY30aDからなる群から選択されるいずれか1つを含む、請求項2～8のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  10. D30位のアミノ酸変異がD30Y、D30A、D30E、D30F、D30G及びD30Nからなる群から選択されるいずれか1つを含む、請求項2～9のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  11. G30c位のアミノ酸変異がG30cA、G30cY及びG30cWからなる群から選択されるいずれか1つを含む、請求項2～10のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  12. VLが以下の群のアミノ酸変異:D30bE、E55Q及びV104Lを含む、請求項2～11のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  13. VLが配列番号57に示すアミノ酸配列を含む、請求項1～12のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  14. VLが配列番号23～34に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む、請求項1～13のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  15. 抗体重鎖可変領域(VH)を含み、VHが、配列番号50に示すアミノ酸配列と比較して、I37、A49、S50及びD54からなる群から選択される1つ以上の位置にアミノ酸変異を含む、請求項1～14のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  16. VHがN60、P61、I67、T30、S31、S96及びH97からなる群から選択される1つ以上の位置にアミノ酸変異を含む、請求項15に記載の抗原結合タンパク質。
  17. VHが以下の群:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54の位置にアミノ酸変異を含む、請求項15～16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  18. VHが、
    (1)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96及びH97;
    (2)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びT30;
    (3)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS96;
    (4)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS31;並びに
    (5)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びH97
    からなる任意の群から選択される位置にアミノ酸変異を含む、請求項15～17のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  19. I37位のアミノ酸変異がI37Vを含む、請求項15～18のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  20. A49位のアミノ酸変異がA49Sを含む、請求項15～19のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  21. S50位のアミノ酸変異がS50Vを含む、請求項15～20のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  22. D54位のアミノ酸変異がD54Aを含む、請求項15～21のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  23. N60位のアミノ酸変異がN60Aを含む、請求項16～22のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  24. P61位のアミノ酸変異がP61Dを含む、請求項16～23のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  25. I67位のアミノ酸変異がI67Fを含む、請求項16～24のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  26. T30位のアミノ酸変異がT30Rを含む、請求項16～25のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  27. S31位のアミノ酸変異がS31Qを含む、請求項16～26のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  28. S96位のアミノ酸変異がS96Tを含む、請求項16～27のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  29. H97位のアミノ酸変異がH97Nを含む、請求項16～28のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  30. VHが以下の群のアミノ酸変異:N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V及びD54Aを含む、請求項15～29のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  31. VHが配列番号58に示すアミノ酸配列を含む、請求項15～20のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  32. VHが配列番号51～56に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む、請求項15～31のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  33. VL及びVHが:
    (1)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104、V29、D30及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96及びH97にアミノ酸変異を含む;
    (2)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びT30にアミノ酸変異を含む;
    (3)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS96にアミノ酸変異を含む;
    (4)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54にアミノ酸変異を含む;
    (5)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54にアミノ酸変異を含む;
    (6)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びH97にアミノ酸変異を含む;
    (7)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50及びD54にアミノ酸変異を含む;
    (8)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104、D30及びY30aにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びH97にアミノ酸変異を含む;
    (9)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS96にアミノ酸変異を含む;並びに
    (10)VLが、以下の位置:D30b、E55、V104、D30、Y30a及びG30cにアミノ酸変異を含み;VHが、以下の位置:N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54及びS31にアミノ酸変異を含む
    からなる任意の群から選択される位置にアミノ酸変異を含む、請求項15～32のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  34. 抗体重鎖定常領域を含む、請求項1～33のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  35. 抗体重鎖定常領域がヒトIgG定常領域由来である、請求項34に記載の抗原結合タンパク質。
  36. ヒトIgG定常領域がヒトIgG1定常領域を含む、請求項35に記載の抗原結合タンパク質。
  37. ヒトIgG1定常領域がM252Y、S254T及びT256Eからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸変異を含む、請求項36に記載の抗原結合タンパク質。
  38. ヒトIgG1定常領域が配列番号60～61に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む、請求項37に記載の抗原結合タンパク質。
  39. 抗体軽鎖定常領域を含む、請求項1～38のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質。
  40. 抗体軽鎖定常領域が配列番号59に示すアミノ酸配列を含む、請求項39に記載の抗原結合タンパク質。
  41. 請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードする1つ以上の単離された核酸分子。
  42. 請求項41に記載の核酸分子を含むベクター。
  43. 請求項41に記載の核酸分子又は請求項42に記載のベクターを含む細胞。
  44. 請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を調製する方法であって、請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項43に記載の細胞を培養するステップを含む方法。
  45. 請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項41に記載の核酸分子、請求項42に記載のベクター及び/又は請求項43に記載の細胞、並びに場合により薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
  46. 異常レベルのIgEと関連する疾患を軽減又は処置する医薬の調製における、請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項41に記載の核酸分子、請求項42に記載のベクター、請求項43に記載の細胞及び/又は請求項45に記載の医薬組成物の使用。
  47. 異常レベルのIgEと関連する疾患を緩和又は処置する方法であって、請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項41に記載の核酸分子、請求項42に記載のベクター、請求項43に記載の細胞及び/又は請求項45に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法。
  48. 請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含むポリペプチド。
  49. 請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質を含む免疫コンジュゲート。
  50. 請求項1～40のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項41に記載の核酸分子、請求項42に記載のベクター、請求項43に記載の細胞及び/又は請求項45に記載の医薬組成物を含むキット。
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