TW202214703A

TW202214703A - 一種抗ＩｇＥ的工程化抗體及其應用

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Publication number: TW202214703A
Application number: TW110125327A
Authority: TW
Inventors: 鄧俗俊; 顧春銀; 劉小五; 曹曉丹; 劉培培; 張建建; 潘忠宗; 肖政; 王學萍; 郭海兵
Original assignee: 大陸商上海濟煜醫藥科技有限公司; 大陸商江西濟民可信集團有限公司
Priority date: 2020-07-10
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2022-04-16
Also published as: AU2021306786A1; WO2022007965A1; BR112023000400A2; KR20230042030A; EP4180454A9; CN116018352A; IL299747A; CA3185192A1; EP4180454A1; US20230250191A1; JP2023541217A

Abstract

本申請涉及一種抗原結合蛋白，其與omalizumab的輕重鏈可變區序列相比，包含胺基酸突變。本申請的抗原結合蛋白為抗IgE的工程化抗體。本申請還涉及包含該抗原結合蛋白的醫藥組成物，以及其用於緩解或治療與異常IgE水準相關的疾病的方法。

Description

一種抗IgE的工程化抗體及其應用

本申請涉及生物醫藥領域，具體的涉及一種抗IgE的工程化抗體，以及其在IgE水準異常疾病中的應用。

免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)是一種分子量為180KD的蛋白質，儘管IgE僅占血清總Ig的0.002%，但其與過敏性疾病的病變過程具有十分緊密的關係。在不同的組織和器官中，IgE升高均會引起炎症免疫反應，最常見的有過敏性哮喘、過敏性鼻炎和鼻竇炎、過敏性結膜炎、系統性過敏、皮膚過敏和蕁麻疹等疾病。

近年來，生物製劑如抗IgE單株抗體治療IgE水準異常有關疾病成為研究熱點。2003年抗IgE抗體omalizumab最先由FDA批准上市治療哮喘。2014年，美國食品藥品管理局(FDA)批准了omalizumab用於治療慢性特發性蕁麻疹。Omalizumab的應用存在以下問題：(1)其在藥學相關劑量下靶向游離IgE但不靶向(或不能有效靶向)IgE/Fc ε RI(IgE Fc受體)複合物的致病性種類；(2)其給藥濃度、週期與患者體重及游離的IgE濃度直接相關，在患者體重和游離的IgE濃度超出一定範圍後，其給藥濃度和頻率都要有所增加，給患者的病情控制管理增加了複雜性和不便性；(3)其對IgE的親和力並不是特別好。

因此，亟需提高的療效和依從性的工程優化的IgE新抗體。

本申請提供了一種抗原結合蛋白，其對omalizumab的抗體輕重鏈序列進行了工程優化改造，可包含一下至少一個特點：(1)在omalizumab的基礎上提高了人源化程度，降低抗藥抗體產生的概率，減少潛在藥效的損失；(2)突變了翻譯後修飾位元點，提高了化學穩定性，例如，提高了在高溫或pH環境下的穩定性；(3)經由酵母展示法提高了與人IgE的親和力，提高藥效，有望將該抗原結合蛋白應用於體重更高或游離的IgE濃度更高的患者中；(4)以高親和力結合猴的IgE，有助於臨床前動物模型的藥效研究；(5)有效阻斷IgE與IgE Fc受體(Fc ε RI)結合；(6)延長了血清半衰期，可以減少其注射頻次，便於患者的病情控制。

一方面，本申請提供了一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白包含抗體輕鏈可變區(VL)，其中與SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列相比，該VL包含選自下組的一個或多個位置處的胺基酸突變：E55和V104。

在某些實施方式中，該VL包含選自下組的一個或多個位置處的胺基酸突變：D30b、V29、D30、Y30a和G30c。

在某些實施方式中，該VL包含下組位置處的胺基酸突變：D30b、E55和V104。

在某些實施方式中，該VL包含選自以下任意一組位置處的胺基酸突變：(1)D30b、E55、V104、V29、D30和Y30a；(2)D30b、E55、V104、 D30、Y30a和G30c；(3)D30b、E55、V104和Y30a；(4)D30b、E55、V104、Y30a和G30c；(5)D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；和(6)D30b、E55、V104、D30和Y30a。

在某些實施方式中，該E55位置處的胺基酸突變包括E55Q。

在某些實施方式中，該V104位置處的胺基酸突變包括V104L。

在某些實施方式中，該D30b位置處的胺基酸突變包括D30bE。

在某些實施方式中，該V29位置處的胺基酸突變包括V29L。

在某些實施方式中，該Y30a位置處的胺基酸突變包括選自下組的任意一種：Y30A、Y30aS和Y30aD。

在某些實施方式中，該D30位置處的胺基酸突變包括選自下組的任意一種：D30Y、D30A、D30E、D30F、D30G和D30N。

在某些實施方式中，該G30c位置處的胺基酸突變包括選自下組的任意一種：G30cA、G30cY和G30cW。

在某些實施方式中，該VL包含下組的胺基酸突變：D30bE、E55Q和V104L。

在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該VL包含SEQ ID NO：23-34中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該抗原結合蛋白包括抗體重鏈可變區(VH)，其中與SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列相比，該VH包含選自下組的一個或多個位置處的胺基酸突變：I37、A49、S50和D54。

在某些實施方式中，該VH包含選自下組的一個或多個位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、T30、S31、S96和H97。

在某些實施方式中，該VH包含下組位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54。

在某些實施方式中，該I37位置處的胺基酸突變包括I37V。

在某些實施方式中，該A49位置處的胺基酸突變包括A49S。

在某些實施方式中，該S50位置處的胺基酸突變包括S50V。

在某些實施方式中，該D54位置處的胺基酸突變包括D54A。

在某些實施方式中，該N60位置處的胺基酸突變包括N60A。

在某些實施方式中，該P61位置處的胺基酸突變包括P61D。

在某些實施方式中，該I67位置處的胺基酸突變包括I67F。

在某些實施方式中，該T30位置處的胺基酸突變包括T30R。

在某些實施方式中，該S31位置處的胺基酸突變包括S31Q。

在某些實施方式中，該S96位置處的胺基酸突變包括S96T。

在某些實施方式中，該H97位置處的胺基酸突變包括H97N。

在某些實施方式中，該VH包含下組的胺基酸突變：N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V和D54A。

在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該VH包含SEQ ID NO：51-56中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55和V104；且VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54。

在某些實施方式中，該VL和該VH包括選自以下任意一組位置處的胺基酸突變：(1)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、V29、D30和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96和H97；(2)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和T30；(3)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S96；(4)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54；(5)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54；(6)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和H97；(7)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54；(8)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和H97；(9)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S96；和(10)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S31。

在某些實施方式中，該抗原結合蛋白包括抗體重鏈恆定區。

在某些實施方式中，該抗原結合蛋白的該抗體重鏈恆定區源自人IgG恆定區。

在某些實施方式中，該人IgG恆定區包括人IgG1恆定區。

在某些實施方式中，該人IgG1恆定區包括選自下組的一種或多種胺基酸突變：M252Y、S254T和T256E。

在某些實施方式中，該人IgG1恆定區包含SEQ ID NO：60-61中任一項所示的胺基酸序列。

在某些實施方式中，該抗原結合蛋白包括抗體輕鏈恆定區。

在某些實施方式中，該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。

另一方面，本申請提供了分離的一種或多種核酸分子，該核酸分子編碼本申請的抗原結合蛋白。

另一方面，本申請提供了載體，該載體包含本申請的核酸分子。

另一方面，本申請提供了細胞，該細胞包含本申請的核酸分子或本申請的載體。

另一方面，本申請提供了製備本申請的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得該抗原結合蛋白表達的條件下，培養該細胞。

另一方面，本申請提供了醫藥組成物，該醫藥組成物包含該抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體和/或該細胞，以及視需要地藥學上可接受的載體。

另一方面，本申請提供了該抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於緩解或治療與異常 IgE水平相關的疾病。

另一方面，本申請提供了緩解或治療與異常IgE水準相關的疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者施用該抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該醫藥組成物。

所屬技術領域具有通常知識者能夠從下文的詳細描述中容易地洞察到本申請的其它方面和優勢。下文的詳細描述中僅顯示和描述了本申請的示例性實施方式。如所屬技術領域具有通常知識者將認識到的，本申請的內容使得所屬技術領域具有通常知識者能夠對所公開的具體實施方式進行改動而不脫離本申請所涉及發明的精神和範圍。相應地，本申請的附圖和說明書中的描述僅僅是示例性的，而非為限制性的。

本申請所涉及的發明的具體特徵如所附申請專利範圍所顯示。經由參考下文中詳細描述的示例性實施方式和附圖能夠更好地理解本申請所涉及發明的特點和優勢。對附圖簡要說明書如下：

圖1顯示的是omalizumab、AB1904AM10和AB1904AM15對食蟹猴血清中游離IgE的抑制率-時間變化圖。

圖2顯示的是IgE抗體阻斷人全長IgE和Fc ε RI α受體蛋白的結合。

圖3顯示的是IgE抗體阻斷人全長IgE和細胞表面CD23受體蛋白的結合。

圖4A和图4B顯示的是IgE抗體抑制人全長IgE誘導Fc ε RI/RBL-2H3的組胺釋放。

圖5顯示的是人全血組胺釋放。

圖6顯示的是IgE抗體在hFcRn小鼠血清中的藥物-時間曲線圖。

圖7顯示的是IgE抗體在食蟹猴血清中的藥物-時間曲線圖。

以下由特定的具體實施例說明本申請發明的實施方式，熟悉此技術的人士可由本說明書所公開的內容容易地瞭解本申請發明的其他優點及效果。

術語定義

在本申請中，術語“IgE”通常是指哺乳動物體內的抗體。IgE是介導過敏反應諸如哮喘、食物過敏、1型超敏反應和基於眾多原因的常見鼻竇炎的免疫球蛋白質家族的成員。IgE由B細胞分泌並在B細胞的表面上表達。B細胞合成的IgE經由經短膜結合區連接至成熟IgE序列的跨膜結構域錨定於B細胞膜中。IgE還可以經由其Fc區連接至低親和力IgE受體(Fc ε RII)而結合至B細胞(以及單核細胞、嗜酸性細胞和血小板)。在哺乳動物暴露於過敏原後，B細胞無性擴增，其合成結合該過敏原的IgE。該IgE進而由B細胞釋放至迴圈中，在迴圈中其被B細胞結合(經由Fc ε RII)且經由在肥大細胞和嗜鹼性細胞表面上發現的所謂高親和力受體(Fc ε RI)而被肥大細胞和嗜鹼性細胞所結合。由此，此類肥大細胞和嗜鹼性細胞針對過敏原敏化。接下來暴露於過敏原將交聯這些細胞上的Fc ε RI且因此活化其組胺和負責臨床超敏反應和過敏反應的其他因數的釋放。

在本申請中，術語“抗原結合蛋白”通常是指保留特異性結合抗原(例如IgE)的能力的抗體的一個或多個片段或部分，或保留與抗原的所需結合能力的抗體片段的合成變體。已展示抗體的抗原結合功能可經由全長抗體的片段或某些部分或其變體進行。實例包括可特異性結合兩種或更多種不同抗原或抗原的幾個表位或不連續表位元區域的雙特異性、雙重特異性及多特異性形式。抗原結合蛋白的實例可包括單鏈抗體(即全長重鏈和輕鏈)；Fab、修飾的Fab、Fab’、修飾的ab’、F(ab’)₂、Fv、Fab-Fv、Fab-dsFv、單結構域抗體(例如VH或VL或VHH)(例如如WO 2001090190中該)、scFv、二價、三價或四價抗體、雙-scFv、雙功能抗體、tribody、triabody、四功能抗體及以上任一個的表位-抗原結合劑(參見例如Holliger及Hudson,2005,Nature Biotech.23(9)：1126-1136；Adair及Lawson,2005,Drug Design Reviews-Online2(3),209-217)。用於產生和製造這些抗體片段的方法為本領域中所眾所周知(參見例如Verma等人，1998，Journal of Immunological Methods,216,165-181)。

在本申請中，術語“抗體”泛指由四條多肽鏈(兩條重鏈(H)鏈及兩條輕(L)鏈)構成的任何免疫球蛋白(Ig)分子或保留Ig分子的表位元結合特徵的至少一部分以允許特異性結合IgE的其任何功能片段、突變體、變體或衍生物。在全長抗體中，每一重鏈由重鏈可變區(本文中縮寫為VH)和重鏈恆定區(CH)構成。重鏈恆定區由四個結構域--CH1、鉸鏈、CH2和CH3(重鏈γ、α和δ)或CH1、CH2、CH3及CH4(重鏈μ和ε)構成。每個輕鏈由輕鏈可變區(本文中縮寫為VL)和輕鏈恆定區(CL)構成。輕鏈恆定區由一個結構域CL構成。VH和VL區可進一步再分成高變區，稱為互補決定區(CDR)，穿插有稱為構架區(FR)的更保守區。每個VH及VL由自胺基端至羧基端按以下順序排列的三個CDR及四個FR構成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋白分子可具有任何同種型/類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別 (例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或子類。

在本申請中，術語“單株抗體”通常是指相比於含有不同抗體的混合物的“多株”抗體製劑，共用通用重鏈及通用輕鏈胺基酸序列的抗體分子製劑，或至少保留Ig分子的輕鏈表位元結合特徵的其任何功能片段、突變體、變體或衍生物。單株抗體可經由幾種已知技術產生，該技術如噬菌體、細菌、酵母或核糖體展示以及經典方法，例如融合瘤來源的抗體，例如經由融合瘤技術，諸如標準Kohler及Milstein融合瘤方法((1975)Nature 256：495-497)製備的融合瘤所分泌的抗體。

在本申請中，術語“omalizumab”通常是指一種選擇性結合人類免疫球蛋白E(IgE)的重組DNA衍生的人源化IgG1 κ單株抗體，商品名為Xolair^®。Omalizumab具有約149kD的分子量。由中國倉鼠卵巢細胞懸浮液培養物在含有抗生素慶大黴素(gentamicin)的培養基中產生(參見EP602126(和基於其的SPC/GB06/005)；WO93/04173；US6267958(和基於該專利的PTE)；WO97/04807；WO97/04801；Presta等人(1993)J.Immunol.151：2623-2632)。在本申請中，提及omalizumab，是指包含如SEQ ID NO：22所示的輕鏈可變區和如SEQ ID NO：50所示的重鏈可變區的IgG全長抗體。Omalizumab目前適用於治療皮膚測試呈陽性或在體外對長期氣源性致敏原具有反應性且具有吸入性皮質類固醇不充分控制的症狀的患者中的中度至重度持久性哮喘。

在本申請中，在描述VH或VL序列的常見免疫球蛋白部分(CDR-互補決定區，或FR-構架區)時，其以標準順序連接(VH=HFR1.HCDR1.HFR2.HCDR2.HFR3.HCDR3.HFR4；VL=LFR1.LCDR1.LFR2.LCDR2.LFR3.LCDR3.LFR4)。

本申請的抗體或抗原結合蛋白的胺基酸編號可以將來自抗體或抗原結合蛋白的連續胺基酸序列按照Chothia編碼規則進行編號。在本申請中，術語“Chothia編碼”、“Chothia編號”或“Chothia定義”可互換地使用，通常是指一種胺基酸殘基的編號系統(Chothia等人，(1987)J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))。按照Chothia編碼規則，對於omalizumab，VL(SEQ ID NO：22)各部分的定義如下：LFR1(L1-L23)，LCDR1(L24-L34)，LFR2(L35-L49)，LCDR2(L50-L56)，LFR3(L57-L88)，LCDR3(L89-L97)和LFR4(L98-L107)，VH(SEQ ID NO：50)各部分的定義如下：HFR1(H1-H25)，HCDR1(H26-H32)，HFR2(H33-H51)，HCDR2(H52-H56)，HFR5(H57-H94)，HCDR3(H95-H102)和HFR4(H103-H113)，VH(SEQ ID NO：50)，其中，“Lx”或“Hx”(x為阿拉伯數字)表示輕鏈(L)可變區或重鏈(H)可變區的編號為x的胺基酸，對於VL，L24表示VL按照Chothia編碼規則的第24位元胺基酸。當在VL或VH內部時，位置Lx或Hx也可以使用第x位元的胺基酸的字母加上數位表示，如對於omalizumab的VL，位置L24上為精胺酸(R)，故也可以以R24表示VL的第24位胺基酸。在本文中，上述兩種表示位置的稱呼(例如，L24和R24)可互換的使用。omalizumab的互補決定區根據Chothia編碼規則的胺基酸位置如下表1-表6所示。

表1 Omalizumab LCDR1的胺基酸編號(Chothia)

表2 Omalizumab LCDR2的胺基酸編號(Chothia)

表3 Omalizumab LCDR3的胺基酸編號(Chothia)

表4 Omalizumab HCDR1的胺基酸編號(Chothia)

表5 Omalizumab HCDR2的胺基酸編號(Chothia)

表6 Omalizumab HCDR3的胺基酸編號(Chothia)

對於胺基酸突變，本申請採用“突變前胺基酸+位置+突變後胺基酸”的表示方式，例如，VL的胺基酸突變“E55Q”表示VL的第55位胺基酸由谷胺酸(E)突變為穀胺醯胺(Q)。

在本申請中，術語“Kd”、“KD”或“K_D”可互換地使用，通常是指如本領域中已知的特定抗體-抗原相互作用的解離常數。免疫結合相互作用的強度或親和力可根據相互作用的解離常數(kD或kd)表示，其中K_D越小，代表親和力越大或越高。所選多肽的免疫結合特性可使用本領域中眾所周知的方法定量。一種此類方法包括測量抗原結合位點/抗原複合物形成及解離的速率，其中這些速率視複合配偶體的濃度、相互作用的親和力及同等影響兩個方向上速率的幾何結構參數而定。因此，“締合速率常數”(“Kon”)及“解離速率常數”(“Koff”)可經由計算濃度及締合與解離的實際速率來確定。Koff/Kon的比率能夠抵消不與親和力相關的所有參數，且等於解離常數Kd。

本申請的抗體或抗原結合蛋白的親和力以及他們抑制結合的程度可經由所屬技術領域具有通常知識者，使用常規技術，例如Scatchard等人描述的技術(Ann.KY.Acad.Sci.51：660-672(1949))、生物膜層光學干涉(BLI)技術，使用ForteBio Octet^®，或經由表面等離子共振(SPR)，使用諸如Biacore的系統測定。對於生物膜層光學干涉，內部的生物感測器底端由生物膜層覆蓋，生物膜層可結合並固定生物分子。當具有一定頻寬的可見光垂直入射生物膜層時，光在生物膜層的兩個介面反射後形成一定波長的干涉波。當固定分子與溶液中分子發生相互作用時，生物膜層厚度增加，干涉光譜曲線向波長增加的方向移動，光波相位移動由工作站即時探測，對光波的相位移動進行分析便可定量得出感測器表面分子數量變化及相關濃度與動力學資料。對於表面等離子共振，標靶分子被固定於固相上和在沿流槽流動的移動相中暴露於配體。如果發生配體結合固定標靶，則局部折射率改變，導致SPR角變化，其可經由檢測反射光強度的變化而進行即時監測。可分析SPR信號的變化速率以針對結合反應的締合和解離相產生表觀速率常數。這些值的比率產生表觀平衡常數(親和力)。

應瞭解本申請提供的抗原結合蛋白的親和力可使用本領域中已知的任何合適方法改變。因此，本申請還設計本申請的抗原結合蛋白的變體，其具有改善的對IgE的親和力。此類變體可經由許多親和力成熟方案獲得，包括使CDR突變(Yang等人，J.Mol.Biol.,254，392-403，1995)、鏈置換(Marks等人，Bio/Technology，10,779-783，1992)、使用大腸桿菌的增變基因菌株(Low等人，J.Mol.Biol.，250，359-368，1996)、DNA改組(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.，8,724-733，1997)、噬菌體展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.，256,77-88,1996)和性PCR(Crameri等人，Nature，391，288-291，1998)。

在本申請中，術語“分離的核酸分子”通常包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，例如，可以是雙鏈DNA。這些核酸可以存在於完整細胞、細胞裂解物中，或以部分純化或基本上純的形式存在。當經由包括鹼/SDS處理、CsCl顯帶、管柱層析、瓊脂糖凝膠電泳在內的標準技術和本領域公知的其他方法與其他細胞成分或其他摻雜物(例如其他細胞核酸或蛋白質)分離純化時，核酸是“分離的”或“基本上純的”。

在本申請中，術語“載體”通常是指能夠運輸其已連接的另一種核酸的核酸分子。術語“載體”涵蓋(但不限於)質粒、病毒、黏粒和人工染色體。一種載體類型為“質粒”，其是指其中可連接其他DNA區段的環形雙鏈DNA環。另一類型的載體為病毒載體，其中其他DNA片段可連接至病毒基因組。一般而言，工程改造的載體可包含複製起點、多選殖位元點和可選擇標記。載體本身通常為核苷酸序列，一般為DNA序列，其包含插入序列(轉基因)和充當載體的“主鏈”或“骨架”的較大序列。現代載體可涵蓋除轉基因插入序列和主鏈以外的額外特徵：啟動子、遺傳標記、抗生素抗性、報告基因、靶向序列、蛋白質純化標籤。

在本申請中，術語“細胞”通常是指能夠或可以向其中引入例如編碼異源多肽或構成shRNA的核酸的細胞。宿主細胞可包括原核細胞，其可用於繁殖載體/質粒，和真核細胞，其可用於表達核酸。例如，真核細胞可以是哺乳動物細胞。又例如，該哺乳動物宿主細胞可以選自如下的哺乳動物細胞：CHO細胞(例如CHO K1或CHO DG44)、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK 293細胞、HEK 293EBNA細胞、PER.C6細胞和COS細胞。在某些情形中中，該哺乳動物細胞可選自融合瘤、骨髓瘤和齧齒動物細胞。骨髓瘤細胞可包含大鼠骨髓瘤細胞(例如YB2)，和小鼠骨髓瘤細胞(例如NS0、SP2/0)。用於藥學應用的多肽或蛋白質可以在哺乳動物細胞如CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、細胞等中產生。

在本申請中，術語“藥學上可接受的載體”通常是指不干擾活性成分的生物活性的有效性的一種或多種非毒性材料。這類製劑常規地可以含有鹽、緩衝劑、防腐劑、相容的載體、以及視需要地其他治療劑。這類藥學上可接受的載體還可以含有適合於給予人的相容的固體或液體填料、稀釋劑或包封物質。可以用於在此所描述的配製品中的其他設想的載體、賦形劑、和/或添加劑包括：例如，調味劑、抗微生物劑、增甜劑、抗氧化劑、抗靜電劑、脂質、蛋白質賦形劑(如血清白蛋白、明膠、酪蛋白)、成鹽平衡離子(如鈉)等等。適合用於在此所描述的配製品中的這些和另外已知的藥物載體、賦形劑和/或添加劑是本領域中已知的，例如，如“雷明頓藥物科學與實踐(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)”，第22版，藥學出版公司(Pharmaceutical Press)(2012)以及“醫師案頭參考(Physician’s Desk Reference)”，第66版，醫藥經濟出版社(Medical Economics)(2012)中所列出。可以常規地選擇對於所希望或所要求的給予方式、溶解度和/或穩定性來說合適的藥學上可接受的載體。

在本申請中，術語“與異常IgE水準相關的疾病”通常是指由血清IgE水準異常(例如，升高)相關的任何疾患或病症。示例性的與異常IgE水準相關的疾病可包括但不限於支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎、蕁麻疹、過敏反應或特應性皮炎。

在本申請中，術語“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白質”可互換地使用，通常是指具有任何長度的胺基酸的聚合物。該聚合物可以是直鏈或支鏈的，它可以包含修飾的胺基酸，並且可以被非胺基酸中斷。這些術語還涵蓋已經被修飾的胺基酸聚合物。這些修飾可以包含：二硫鍵形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙醯化、磷酸化、或任何其他操縱(如與標記組分結合)。術語“胺基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的胺基酸，包括甘胺酸以及D和L旋光異構體、以及胺基酸類似物和肽模擬物。

在本申請中，術語“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互換地使用，通常是指具有任何長度的核苷酸的聚合形式，如去氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其類似物。多核苷酸可具有任何三維結構，並且可以執行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例：基因或基因片段的編碼區或非編碼區、根據連接分析定義的多個座位(一個座位)、外顯子、內含子、信使RNA(mRNA)、轉運RNA、核糖體RNA、短干擾RNA(siRNA)、短髮夾RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針、和引子。多核苷酸可以包含一個或多個經修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，可以在聚合物組裝之前或之後進行核苷酸結構的修飾。核苷酸的序列可以被非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在聚合後，如經由與標記的組分綴合來進一步修飾。

除了本文提到的特定蛋白質和核苷酸之外，本申請還可包括其功能性變體、衍生物、類似物、同源物及其片段。

術語“功能性變體”指與天然存在序列具有基本上同一的胺基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列編碼並能夠具有天然存在序列的一種或多種活性的多肽。在本申請的上下文中，任何給定序列的變體是指其中殘基的特定序列(無論是胺基酸或核苷酸殘基)已經經過修飾而使得該多肽或多核苷酸基本上保留至少一種內源功能的序列。可以經由天然存在的蛋白質和/或多核苷酸中存在的至少一個胺基酸殘基和/或核苷酸殘基的添加、缺失、取代、修飾、替換和/或變異來獲得變體序列，只要保持原來的功能活性即可。

在本申請中，術語“衍生物”通常是指本申請的多肽或多核苷酸而言包括自/對序列的一個(或多個)胺基酸殘基的任何取代、變異、修飾、替換、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一種內源功能。

在本申請中，術語“類似物”通常對多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模擬物，即擁有該模擬物模擬的多肽或多核苷酸的至少一種內源功能的化學化合物。

通常，可以進行胺基酸取代，例如至少1個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20個以上)胺基酸取代，只要經修飾的序列基本上保持需要的活性或能力。胺基酸取代可包括使用非天然存在的類似物。

用於本申請的蛋白質或多肽也可以具有胺基酸殘基的缺失、插入或取代，該胺基酸殘基產生沉默的變化並導致功能上等同的蛋白質。可以根據殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩性性質的相似性進行有意的胺基酸取代，只要保留內源性功能即可。例如，帶負電荷的胺基酸包括天冬胺酸和谷胺酸；帶正電荷的胺基酸包括賴胺酸和精胺酸；並且含具有相似親水性值的不帶電極性頭基的胺基酸包括天冬醯胺、穀胺醯胺、絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸。

在本申請中，術語“同源物”通常是指與野生型胺基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的胺基酸序列或核苷酸序列。術語“同源性”可以等同於序列“同一性”。同源序列可以包括可以與主題序列是至少80%、85%、90%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%相同的胺基酸序列。通常，同源物將包含與主題胺基酸序列相同的活性位點等。同源性可以根據相似性(即具有相似化學性質/功能的胺基酸殘基)來考慮，也可以在序列同一性方面表達同源性。在本申請中，提及的胺基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一項具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整個長度上具有該百分比同一性的序列。

為了確定序列同一性，可進行序列比對，其可經由所屬技術領域具有通常知識者瞭解的各種方式進行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)軟體等。所屬技術領域具有通常知識者能夠確定用於比對的適當參數，包括在所比較的全長序列中實現最優比對所需要的任何演算法。

在本申請中，術語“和/或”應理解為意指可選項中的任一項或可選項的兩項。

在本申請中，術語“包含”通常是指包括明確指定的特徵，但不排除其他要素。

在本申請中，術語“約”通常是指在指定數值以上或以下0.5%-10%的範圍內變動，例如在指定數值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%、或10%的範圍內變動。

發明詳述

一方面，本申請提供一種抗原結合蛋白，該抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區(VL)，其中與omalizumab的輕鏈可變區，即SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列相比，本申請的抗原結合蛋白的該VL可包含選自下組的一個或兩個位置處的胺基酸突變：E55和V104。

在本申請中，該抗原結合蛋白的該VL可包含選自下組的一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個或5個)位置處的胺基酸突變：D30b、V29、D30、Y30a和G30c。

例如，該抗原結合蛋白的該VL可包含下組位置處的胺基酸突變：D30b、E55和V104。

例如，該VL可包含D30b、E55、V104、V29、D30和Y30a位置處的胺基酸突變。

例如，該VL可包含D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c位置處的胺基酸突變。

例如，該VL可包含D30b、E55、V104和Y30a位置處的胺基酸突變。

例如，該VL可包含D30b、E55、V104、Y30a和G30c位置處的胺基酸突變。

例如，該VL可包含D30b、E55、V104、D30和Y30a位置處的胺基酸突變。

在本申請中，該E55位置處的胺基酸突變可包括E55Q。

在本申請中，該V104位置處的胺基酸突變可包括V104L。

在本申請中，該D30b位置處的胺基酸突變可包括D30bE。

在本申請中，該V29位置處的胺基酸突變可包括V29L。

在本申請中，該Y30a位置處的胺基酸突變可包括選自下組的任意一種：Y30A、Y30aS和Y30aD。

在本申請中，該D30位置處的胺基酸突變包括選自下組的任意一種：D30Y、D30A、D30E、D30F、D30G和D30N。

在本申請中，該G30c位置處的胺基酸突變可包括選自下組的任意一種：G30cA、G30cY和G30cW。

在本申請中，該VL可包含下組的胺基酸突變：D30bE、E55Q和V104L。

在本申請中，該VL可包含如SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白的VL可包含SEQ ID NO：23-34中任一項所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白的該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L、V29L、D30Y和Y30aD。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L、D30A、Y30aD和G30cW。

例如，該VL可包含胺基酸突變30bE、E55Q、V104L和Y30aA。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L和Y30aD。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L和Y30aS。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L、Y30aD和G30cY。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L、D30E、Y30aD和G30cW。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L、D30G、Y30aD和G30cA。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L、D30N、Y30aD和G30cA。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L、D30N、Y30aD和G30cW。

例如，該VL可包含胺基酸突變D30bE、E55Q、V104L、D30F和Y30aD。

在本申請中，該抗原結合蛋白還可包含輕鏈恆定區。例如，該輕鏈恆定區可以來自人kappa輕鏈。例如，該輕鏈恆定區可包含如SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白還可包括抗體輕鏈。該抗體輕鏈可包括該抗體輕鏈可變區和該抗體輕鏈恆定區。例如，本申請的抗原結合蛋白的該抗體輕鏈可包括SEQ ID NO：23-34中任一項所示的胺基酸序列。

本申請的抗原結合蛋白可包含抗體重鏈可變區(VH)，其中與omalizumab的重鏈可變區，即SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列相比，本申請的抗原結合蛋白的該VH可包含選自下組的一個或多個(例如，1個、2個、3個或4個)位置處的胺基酸突變：I37、A49、S50和D54。

在本申請中，該抗原結合蛋白的該VH還可包含選自下組的一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個或7個)位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、T30、S31、S96和H97。

例如，該抗原結合蛋白的該VH可包含下組位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54。

例如，該VH可包含N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96和H97位置處的胺基酸突變。

例如，該VH可包含N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和T30位置處的胺基酸突變。

例如，該VH可包含N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S96位置處的胺基酸突變。

例如，該VH可包含N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S31位置處的胺基酸突變。

例如，該VH可包含N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和H97位置處的胺基酸突變。

在本申請中，該I37位置處的胺基酸突變可包括I37V。

在本申請中，該A49位置處的胺基酸突變可包括A49S。

在本申請中，該S50位置處的胺基酸突變可包括S50V。

在本申請中，該D54位置處的胺基酸突變可包括D54A。

在本申請中，該N60位置處的胺基酸突變可包括N60A。

在本申請中，該P61位置處的胺基酸突變可包括P61D。

在本申請中，該I67位置處的胺基酸突變可包括I67F。

在本申請中，該T30位置處的胺基酸突變可包括T30R。

在本申請中，該S31位置處的胺基酸突變可包括S31Q。

在本申請中，該S96位置處的胺基酸突變可包括S96T。

在本申請中，該H97位置處的胺基酸突變可包括H97N。

在本申請中，該VH可包含下組的胺基酸突變：N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V和D54A。

在本申請中，該VH可包含如SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白的VH可包含SEQ ID NO：51-56中任一項所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白的該VH可包含胺基酸突變N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A、S96T和H97N。

例如，該VH可包含胺基酸突變N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A和T30R。

例如，該VH可包含胺基酸突變N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A和S96T。

例如，該VH可包含胺基酸突變N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A和S31Q。

例如，該VH可包含胺基酸突變N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V、D54A和H97N。

在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：62所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：63所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：36-37中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，且該HCDR3可包含SEQ ID NO：45-48中任一項所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：64所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含LCDR1、LCDR2和LCDR3，該LCDR1可包含SEQ ID NO：3-14中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：62、42、63、64、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1可包含SEQ ID NO：36-37中任一項所示的胺基酸序列，該HCDR2可包含SEQ ID NO：42所示的胺基酸序列，該HCDR3可包含SEQ ID NO：45-48中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR1可包含SEQ ID NO：3-14中任一項所示的胺基酸序列，該LCDR2可包含SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列，且該LCDR3可包含SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、45、3、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、46、4、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：37、42、45、5、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、47、6、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、45、7、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、 LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、45、8、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、48、9、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、45、10、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、48、11、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、45、12、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、47、12、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：36、42、47、13、17和19所示的胺基酸序列。

例如，該抗原結合蛋白可包含HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3，該HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3可分別依次包含SEQ ID NO：38、42、45、14、17和19所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白可包含框架區HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4，該HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR3和LFR4可分別包含SEQ ID NO：35、40、44、49、1、15、18和21所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白還可包含抗體重鏈恆定區。在某些情形中，該抗體重鏈恆定區可源自人IgG恆定區。例如，該人IgG恆定區可包括人IgG1恆定區。在某些情形中，該人IgG1恆定區可包含選自下組的一種或多種胺基酸突變：M252Y、S254T和T256E(Chothia編碼規則)。例如，該人IgG1恆定區可包含下組的胺基酸突變：M252Y、S254T和T256E(Chothia編碼規則)。在某些情形中，本申請的抗原結合蛋白的抗體重鏈恆定區可包含SEQ ID NO：60-61中任一項所示的胺基酸序列。

在本申請中，該抗原結合蛋白還可包括抗體重鏈。該抗體重鏈可包括該抗體重鏈可變區和該抗體重鏈恆定區。

在本申請中，該抗原結合蛋白可包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈恆定區(VH)，其中，與SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列相比，該VL可包含選自下組的一個或兩個位置處的胺基酸突變：E55和V104，且與SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列相比，該可VH包含選自下組的一個或多個(例如，1個、2個、3個、4個或5個)位置處的胺基酸突變：I37、A49、S50和D54。

在某些情形中，該抗原結合蛋白的該VL可包含下組位置處的胺基酸突變：D30b、E55和V104，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54。

例如，該抗原結合蛋白的該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104、V29、D30和Y30a，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96和H97。

例如，本申請的抗原結合蛋白的該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和T30。

例如，該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104和Y30a，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S96。

例如，該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104和Y30a，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54。

例如，該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104、Y30a和G30c，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54。

例如，該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104和Y30a，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和H97。

例如，該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54。

例如，該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104、 D30和Y30a，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和H97。

例如，該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S96。

例如，該VL可包含下組位置處的胺基酸突變D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c，且該VH可包含下組位置處的胺基酸突變N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S31。

在本申請中，該各位置處的胺基酸突變的種類可以是上文提到的那些。

在本申請中，該抗原結合蛋白的該VL可包含如SEQ ID NO：23-34中任一項所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：51-56中任一項所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：52所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：53所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列，且該VH 可包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：29所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：30所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：31所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：55所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：32所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：33所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：54所示的胺基酸序列。

例如，該VL可包含如SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列，且該VH可包含如SEQ ID NO：56所示的胺基酸序列。

本申請的抗原結合蛋白具有化學穩定性高。例如，在高溫、低pH和/或反復凍融環境下能夠穩定存在。例如，在40℃下放置0至28天，或在pH5.0和40℃下放置0-28天，本申請的抗原結合蛋白生成聚體的量比omalizumab低至少5%(例如，至少10%、15%、20%、25%、30%或更高)(例如，經由尺寸排阻高效液相層析SEC-HPLC檢測)，例如，在40℃下放置0至28天，或在pH5.0和40℃下放置0-28天，本申請的抗原結合蛋白的主峰含量比omalizumab高至少5%(例如，至少10%、15%、20%或更高)(例如，經由全管柱成像毛細管等電聚焦電泳iCIEF檢測的)。

本申請的抗原結合蛋白與人IgE或其片段具有高結合親和力。例如，以低於5×10^-10M(如，低於4×10^-10M、3×10^-10M、2×10^-10M、2.8×10^-10M、2.6×10^-10M、2.4×10^-10M、2.2×10^-10M、2.0×10^-10M、1.8×10^-10M、1.6×10^-10M、1.4×10^-10M、1.2×10^-10M、1.0×10^-10M或更低)的K _D值結合人IgE CH3-CH4(例如經由Octet Red檢測的)，又例如，以低於2×10^-9M(如，低於1.5×10^-9M、1.2×10^-9M、1×10^-9M或更低)的K _D值結合人全長IgE(例如經由Octet Red檢測的)，又例如，以低於5×10^-9M(如，低於4.8×10^-9M、4.6×10^-9M、4.4×10^-9M、4.2×10^-9M、4.0×10^-9M、3.8×10^-9M或更低)的K _D值結合人全長IgE(例如經由Biacore檢測)。

本申請的抗原結和蛋白能以高親和力結合猴的IgE，有助於臨床前動物模型的藥效研究，例如，以低於3.0×10^-10M(如，低於2.5×10^-10M、2.4×10^-10M、2.3×10^-10M、2.2×10^-10M、2.1×10^-10M、2.0×10^-10M、1.9×10^-10M、1.8×10^-10M或更低)的K _D值結合食蟹猴的IgE CH3-CH4(例如經由Octet Red檢測的)，又例如，以低於4.0×10^-9M(如，低於3.9×10^-9M、3.8×10^-9M、3.7×10^-9M、3.6×10^-9M、3.5×10^-9M或更低)的K _D值結合猴的IgE CH3-CH4(例如經由Biacore檢測)。

本申請的抗原結合蛋白能有效阻斷IgE與IgE Fc受體(Fc ε RI)結合，例如，以低於1.5nM(如，低於1.4nM、1.3nM、1.2nM、1.1nM、1.0nM、0.9nM或更低)的EC₅₀值阻斷人全長IgE與Fc ε RI的結合(例如經由ELISA檢測)，又例如，以低於4.0nM(如，低於3.9nM、3.8nM、3.7nM、3.6nM、3.5nM、3.4nM、3.3nM、3.2nM、3.1nM、3.0nM或更低)的IC₅₀值阻斷IgE刺激表達Fc ε RI的細胞釋放組胺。

本申請的抗原結合蛋白在血液中具有較長的半衰期，可以減少其注射頻次，便於患者的病情控制。例如，本申請的抗原結合蛋白的半衰期比omalizumab增加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高，如使用ELISA檢測，經由非房室模型分析或游離IgE濃度所計算得到的。

核酸分子、載體和細胞

本申請還提供了一種分離的核酸分子，其編碼本申請的抗原結合蛋白的重鏈和/或輕鏈。合適地，該核酸分子編碼本申請的抗原結合蛋白的重鏈或輕鏈。本申請的核酸分子可包含合成DNA，例如經由化學加工、cDNA、基因組DNA或其任何組合產生。

編碼本申請的抗原結合蛋白的核酸分子可經由所屬技術領域具有通常知識者眾所周知的方法獲得。例如，編碼抗體重鏈和輕鏈部分或所有的核酸分子可按需要從測定的核酸分子或基於對應胺基酸序列合成。可使用分子生物學的標準技術製備編碼本申請的抗原結合蛋白的核酸分子。所需核酸分子可使用寡核苷酸合成技術完全或部分合成。適當時可使用定點突變誘發及聚合酶鏈反應(PCR)技術。

本申請還涉及一種純株或表達載體，其包含本申請的一個或多個核酸分子。因此，提供了一種純株或表達載體，其包含編碼本申請的抗原結合蛋白的一個或多個核酸分子。或者，純株或表達載體可以包含分別編碼本申請的抗原結合蛋白的輕鏈及重鏈的兩個核酸分子，及合適的信號序列。

本申請還提供了一種宿主細胞，其包含一種或多種純株或表達載體，該純株或表達載體包含編碼本申請的抗原結合蛋白的一種或多種核酸分子。任何合適的宿主細胞/載體系統可用於表達編碼本申請的抗原結合蛋白的核酸分子。可使用細菌，例如大腸桿菌及其他微生物系統，或還可使用真核，例如哺乳動物、宿主細胞表達系統。合適哺乳動物宿主細胞包括CHO、骨髓瘤或融合瘤細胞。

製備方法

本申請還提供了一種用於產生本申請的抗原結合蛋白的方法，其包括在使得該抗原結合蛋白表達的條件下，培養該細胞。該抗原結合蛋白可僅僅包含重鏈或輕鏈多肽，在此情況下可以僅將重鏈或輕鏈的編碼序列轉染宿主細胞。為產生包含重鏈和輕鏈的產物，細胞系可用兩種載體轉染，第一載體編碼輕鏈多肽，且第二載體編碼重鏈多肽。或者，可使用單一載體，該載體包括編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。

本申請提供了一種培養宿主細胞和表達、分離、純化該抗原結合蛋白或其片段的方法。

在一個實施方案中，提供了一種用於純化抗原結合蛋白的方法，其包括以下步驟：以非結合模式進行陰離子交換層析法，使得雜質保留在管柱上和沖提抗體。

例如，該純化可以採用蛋白質A管柱上的親和力捕獲，然後滴定。例如，該純化可以採用蛋白質G管柱上的親和力捕獲，然後HPLC滴定。例如，該純化可以採用IgE管柱上的親和力捕獲，然後滴定。純化方法還可包括一個或多個過濾步驟，諸如透濾步驟或HPLC過濾步驟。

醫藥組成物、方法和用途

因為本申請的抗原結合蛋白適用於治療和/或預防病理性病況，所以本申請還提供了一種醫藥組成物或診斷組成物，其包含本申請的抗原結合蛋白，以及一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合。因此，本申請還提供了本申請的抗原結合蛋白在製備醫藥組成物中的用途。

本申請還提供了一種用於製備藥物或診斷組成物的方法，其包括添加和混合本申請的抗體或抗原結合劑連同一種或多種藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。該抗原結合蛋白可作為藥物或診斷組成物中的唯一活性成分，也可伴隨有其他活性成分，包括其他抗體成分或非抗體成分，諸如類固醇或其他藥物分子尤其半衰期與IgE結合無關的藥物分子。

該組成物可以個別施用於患者或可與其他藥劑、藥物或激素組合施用(例如同時、連續或分開)。

另一方面，本申請提供了該抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、所述的細胞和/或所述的組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於緩解或治療與異常IgE水平相關的疾病。

另一方面，本申請提供了緩解或治療與異常IgE水準相關的疾病的方法，該方法包括向有需要的受試者施用該抗原結合蛋白、該核酸分子、該載體、該細胞和/或該組成物。

醫藥組成物可以包含治療有效量的本申請的抗體或抗原結合蛋白。在本申請中，術語“治療有效量”是指治療、改善或預防靶向疾病或病況或展現可檢測的治療或預防效果所需要的治療劑的量。對於任何公開的抗體或抗原結合蛋白，可最初在細胞培養測定中或在動物模型中，通常在齧齒動物、兔、狗、豬或靈長類動物中估計治療有效量。動物模型還可用於確定施用的適當濃度範圍及途徑。該資訊可隨後用於確定適用於施用人的劑量及途徑。人受試者的精確治療有效量將視疾病病況的嚴重程度、受試者的整體健康、受試者的年齡、重量及性別、飲食、施用的時間及頻率、藥物組合、反應敏感性及對療法的耐受性/反應而定。

本申請的醫藥組成物可經由多種途徑施用，包括但不限於經口、靜脈內、肌肉內、動脈內、髓內、鞘內、室內、透皮、經皮、皮下、腹膜內、鼻內、經腸、局部、舌下、陰道內或直腸途徑。還可使用無針注射器施用本發明的醫藥組成物。通常，治療組成物可製備成作為液體溶液或懸浮液的可注射劑。還可製備適合於在注射前溶解或懸浮於液體媒介物中的固體形式。

包含本申請的抗原結合蛋白的治療劑量的醫藥組成物不顯示體內明顯毒理學作用。並且，經由施用連續劑量的本申請的抗原結合蛋白，受試者體內IgE活性的水準可維持在適當正常(例如，減少)的水準。

不欲被任何理論所限，下文中的實施例僅僅是為了闡釋本申請的融合蛋白、製備方法和用途等，而不用於限制本申請發明的範圍。

實施例

實施例1 設計並表達omalizumab工程優化抗體

以omalizumab的輕重鏈可變區為基礎(輕鏈可變區序列如SEQ ID NO：22所示，重鏈可變區序列如SEQ ID NO：50所示)，進行優化設計，對輕重鏈進行人源化突變和翻譯後修飾(PTM)位點去除，得到新的輕重鏈可變區。

然後將全長重組抗體輕重鏈蛋白質序列的分別進行密碼子優化，基因合成密碼子優化後DNA片段(Genscript)，選殖合成後基因片段以IgG1形式裝入表達載體pcDNA3.4(Life Technologies)。表達質粒擴增和質粒抽提後雙質粒共轉ExpiCHO細胞(ThermoFisher Scientific，A29133)，根據供應商ExpiCHO表達系統方法進行抗體瞬轉表達，過程如下：在培養總體積25ml培養基中，36.5℃，8%二氧化碳濃度下培養Expi CHO細胞到密度6×10⁶/mL，使用ExpiFectamine轉染試劑化轉各10μg抗體輕重鏈表達質粒到細胞；轉染一天後，各取150μL和4mL ExpiCHO增強劑和ExpiCHO輔料添加到培養細胞中，繼續培養至9天，4度，3500轉離心取上清。混合AmMagTM Protein A磁珠(Genscript，L00695)和抗體表達上清，室溫孵育2小時，PBS洗滌兩次棄上清，加入適量沖提緩衝液Protein G or A SefinoseTM Elution buffer(Sangon,C600481)，充分混勻後置於試管架上靜止孵育5分鐘，孵育期間重新懸浮磁珠2-3次，重複沖提2次，沖提後，立即加入適量中和液1M Tris-HCl，pH7.5(Sangon,B548124)中和備用，得到純化的抗體見表7，AB1904HzL0H0即omalizumab。

表7 人源化和PTM突變去除後的抗體

實施例2 人IgE親和力檢測

首先檢測抗體與生物素化的人IgE CH3-CH4(生物素-hIgE CH3-CH4，Sino Biological，貨號：29702-H08H，內部進行生物素標記)的親和力，利用解離速率進行排序，實驗方法如下：

(1)抗原及抗體稀釋：抗原及抗體均用1xKinetic Buffer(Kinetic Buffer，Fortébio,18-1105)稀釋，抗原使用濃度為1μg/ml，抗體使用濃度為100nM。

(2)樣品上機檢測(Octet Data Acquisition 11.1.0.11)：首先，按照下表將樣品加入96孔板(Greiner bio-one，655209)，體系為200μL/well。然後設置軟體參數，板溫設定為30℃，收集標準動力學信號的頻率為5.0HZ。接著，用1xPBST預濕CH1 sensor(Fortébio,18-0039)10分鐘，然後上機檢測。每個迴圈包含以下步驟：1)浸入緩衝液60s；2)檢測抗原是否與感測器有非特異性結合；3)10mM pH1.7的甘胺酸溶液再生；4)浸入緩衝液60s；5)抗體固化在感測器上，時間為30s；6)感測器浸入緩衝液180s；7)抗原與抗體結合，時間180s；8)抗原抗體的解離，時間10分鐘；9)感測器再生。

(3)資料分析：採用Fortebio的Data Analysis 11.1軟體，對抗原-抗體以1：1的結合方式，測定結合速率(K_a)和解離速率(K_d)，以此計算抗體的平衡解離常數(K_D)，結果如表2所示。

實施例3 抗體物理化學性質檢測

3.1 SEC-HPLC純度分析

(1)將樣品稀釋至1mg/mL，混勻，12000rpm離心5min，取上清轉至樣品瓶，放入HPLC樣品盤。設置層析條件如下：

(2)層析管柱用流動相(200mM磷酸鹽緩衝液，pH6.8)平衡後，進樣分析，用層析軟體進行資料分析，峰面積歸一化法計算各個峰的峰面積百分比。

3.2 HIC-HPLC分析

(1)將樣品稀釋至1mg/ml，混勻，12000rpm離心5分鐘，取上清轉移至樣品瓶內，放入HPLC樣品盤。設置層析條件如下：

(3)用流動相A(50mM磷酸鹽緩衝液/1M硫酸銨，pH 7.0)和流動相B(50mM磷酸鹽緩衝液，pH 7.0)進行梯度沖提分析，層析軟體進行資料分析，根據出峰保留時間，計算各樣品親水係數。

3.3 熔解溫度(Tm)值分析

將供試品用樣品緩衝液稀釋至1mg/mL，然後按照Protein Thermal Shift^TM Starter Kit(貨號4461146)說明書，取供試品溶液13μL加入至PCR管內，加入5μL Protein Thermal shift TM Buffer，加入2μL 10×染色液，使反應體積為20μL，混勻後，12000rpm離心5min以去除氣泡。將檢測樣品置於PCR儀內，進行樣品分析，記錄樣品的Tm值。

3.4 ICIEF分析

取樣品溶液加入到已經充分混勻的以下體系中：1%的甲基纖維素(貨號：101876))70μl，尿素(貨號：U6504)4M，兩性電解質Pharmalyte pH 3-10(貨號17-0456-01)8μl，pI marker 5.5(貨號：A58325)和9.5(貨號：A358357)各2μl。補加適當體積超純水至200μl，混勻。所有樣品6000rpm離心3min除氣泡，然後轉移上清到樣品瓶中，置於樣品盤上，記錄樣品位置。開機運行，分析結束後，將結果檔導入Chrom Perfect軟體進行圖譜積分處理並計算各峰的等電點以及各峰百分比。抗體理化檢測結果見表8。

表8 人源化和PTM突變後抗體的理化特性檢測結果

結果顯示，AB1904L1p1H3p2(輕鏈可變區SEQ ID NO：23，重鏈可變區SEQ ID NO：51)親和力較高，同時，也去除了潛在翻譯後修飾位點，進一步提高了化學穩定性。

實施例4 酵母親和力成熟得到新的抗體

選擇AB1904L1P1H3P2進行酵母親和力成熟，得到表9的抗體AB1904Am1至AB1904Am15，其中，在Fc片段進行YTE(M252Y/S254T/T256E)工程突變，分別命名為AB1904Am13、AB1904Am14、AB1904Am15。

表9親和力成熟和YTE工程突變後的抗體

使用實施例3的方法檢測表9中的抗體的物理化學特性，結果見表10所示。

表10親和力成熟和YTE工程突變後的抗體抗體的理化特性檢測結果

實施例5 該抗體與人IgE CH3-CH4、人全長IgE及食蟹猴IgE CH3-CH4結合(Octet Red檢測)

5.1 本申請的抗體能夠結合人IgE CH3-CH4

採用Octet RED96e(Fortebio)測定抗體AB1904Am1-AB1904Am12與人IgE CH3-CH4(hIgE CH3-CH4,Sino Biological，貨號：29702-H08H)的親和力，抗原及抗體均用1xPBST(1xPBS：生工，B548117-0500；0.02%吐溫20：sigma-alorich，P1379)稀釋，抗原使用濃度為50nM，抗體使用濃度為33.3nM。按照實施例2的方法進行上機檢測。結果如表11所示，該抗體與人IgE CH3-CH4親和力高，K_D值與omalizumab接近或更低。

表11 抗體與人IgE CH3-CH4的結合親和力結果

5.2 本申請的抗體能夠結合人全長IgE

按照實施例2的方法測定該抗體與人全長IgE(FL hIgE,ABBIOTEC，貨號：250205)的親和力。結果如表12所示。該抗體均能與人全長IgE以高親和力結合。

表12 抗體與人全長IgE的結合親和力結果

5.3 本申請的抗體能夠結合食蟹猴IgE CH3-CH4

按照實施例2的方法檢測該抗體與生物素化的食蟹猴IgE CH3-CH4(Biotin-cyno IgE CH3-CH4，愷佧生物)的親和力，結果如表13所示。該抗體均能與生物素化的食蟹猴IgE CH3-CH4以高親和力結合。

表13 抗體與生物素化的食蟹猴IgE CH3-CH4的結合親和力結果

實施例6 該抗體與人全長IgE及食蟹猴IgE CH3-CH4結合(Biacore檢測)

首先以2μL/min的流速，將Biotin CAPture reagent捕獲到CAP晶片(GE Healthcare，貨號：28-9202-34)上，捕獲時間300s。使用HBS-EP+作為實驗緩衝液。每個進樣迴圈測定一種濃度的抗體與被捕獲抗原間的結合，每個迴圈包括捕獲抗原、不同濃度抗體的進樣及再生。以10μL/min的流速，將2μg/ml的生物素化的人全長IgE(Biotin-FL hIgE，Abbiotec，貨號：250205，自己生物素標記)或者0.25μg/ml的生物素化的食蟹猴IgE CH3-CH4(Biotin-cyno IgE，愷佧生物定制)捕獲在2通道上，捕獲時間60s,1通道作為空白參考通道。以30μL/min的流速，將逐級稀釋的抗體(100nM，50nM，25nM，12.5nM，6.25nM，3.125nM，1.5625nM，0nM)依次進樣於1，2通道，測定結合及解離。以10μL/min的流速，用再生緩衝液(6M鹽酸胍，0.25M氫氧化鈉)進行晶片再生以去除被捕獲的抗原及抗體。使用Biacore 8K分析軟體對資料進行分析。軟體分析所用的模型為1：1 binding。

結果如表14所示，本申請的抗體均能與生物素化的人全長IgE和食蟹猴IgE CH3-CH4結合，K_D值與omalizumab沒有顯著差別或更低。

表14 抗體與生物素化的人全長IgE和食蟹猴IgE CH3-CH4的結合親和力結果

實施例7 該抗體與人及食蟹猴FcRn結合(Octet Red檢測)

按照實施例2的方法採用Octet RED96e(Fortebio)分別測定該抗體與人FcRn(Acro，FCN-H52W7)和食蟹猴FcRn(Acro,FCM-C52W9)的親和力。其中，使用1xPBS(10mM Na2HPO4.12H2O，2mM KH2PO4，137mM NaCl，2.7mM KCl，pH6.0)分別稀釋人FcRn和食蟹猴FcRn到5μg/mL，稀釋生物素偶聯的THETM His標籤的小鼠單株抗體到2μg/mL；使用1x PBST(1xPBS，0.02%吐溫20，PH6.0)分別稀釋待測抗體，抗體稀釋濃度範圍均為1000nM-31.3nM。結果如表15所示。該抗體均能與食蟹猴及人FcRn結合。

表15 抗體與食蟹猴及人FcRn的親和力結果

實施例8 抗體阻斷生物素化的人全長IgE與Fc ε RI的結合

用PBS將Fc ε RI α(R&D，6678-Fc)稀釋到0.5μg/ml的包被酶標板，100μl/孔，貼封板膜，置於37℃孵育1小時，然後用洗滌液(PBS+0.05% TWEEN-20)洗板3次。繼而用洗滌液配製封閉液(PBS+0.05% TWEEN-20+2%BSA)，每孔加入300μl封閉液，37℃封閉1小時。用封閉液配製生物素化的人全長IgE(Biotin-FL hIgE，Abbiotec，貨號：250205，自己進行生物素化標記)，濃度為160ng/ml；隨後用封閉液配製anti-IgE抗體，抗體的起始濃度為4μg/ml，3倍梯度稀釋(稀釋7個濃度點+1個0濃度點)；然後將60μL的anti-IgE抗體加入60μL Biotin-FL hIgE中，37℃共孵育2小時。繼而取出封閉好的酶標板，用洗滌液洗板3次，以100μl/孔加入37度預先孵育的anti-IgE抗體和生物素化的人全長蛋白複合物溶液，37℃孵育1小時。用洗滌液洗板3次，封閉液1/5000稀釋SA-HRP(sigma，S2438-250UG)，以100μl/孔加至酶標板內，37℃孵育1小時；用洗滌液洗板3次，以100μl/孔加入TMB顯色液(Biopanda，貨號：TMB-S-003)，室溫避光反應10分鐘，然後以50μl/孔加入終止液(Solarbio，貨號：C1058)終止反應，在450nm波長處測定吸光值。結果如圖2所示，結果顯示，本申請的抗體能夠阻斷生物素化的IgE與Fc ε RI的結合，且EC₅₀值低於omalizumab。

實施例9 抗體阻斷生物素化的人全長IgE與IM-9細胞表面CD23的結合

使用RPMI1640+10%FBS(RPMI1640、FBS，Thermo Fisher)於37℃、5%二氧化碳條件下培養IM-9細胞。收集IM-9細胞，繼而用FACS緩衝液(PBS+2%FBS)洗滌1次，重新懸浮於FACS緩衝液中，細胞密度為2.5*106個/ml。使用U型底96孔細胞培養板，加入細胞懸液(每孔100μl)，然後置於4度冰箱預冷30min。用FACS緩衝液配製生物素化的人全長IgE(hIgE，ABBIOTEC，貨號：250205，內部生物素標記)，濃度為20μg/ml；隨後用FACS buffer配製anti-IgE抗體，起始濃度為60μg/ml，3倍梯度稀釋(稀釋7個濃度點+1個0濃度點)，然後將60μL的anti-IgE抗體加入60μL生物素-FL hIgE中，4℃孵育1小時。同時在每孔細胞中加入2.5μL的Fc Block(BD Pharmingen，貨號：564220)，4℃孵育1小時；將96孔細胞培養板從4℃冰箱取出，2000rpm離心5分鐘，棄上清，然後以100μl/孔加入預先孵育的anti-IgE抗體和生物素化的人全長IgE蛋白複合物溶液，4℃孵育1小時後，2000rpm離心5min，棄上清，用FACS緩衝液洗3次。將FITC偶聯的鏈親和素(Invitrogen，貨號：SA1001)1：500稀釋後，每孔加入100μL，4度孵育1小時後，2000rpm離心5min，棄上清，用FACS緩衝液洗3次；隨後細胞用FACS緩衝液1：2稀釋後，用Guava easyCyte 6-2L Benchtop Flow Cytometer上機檢測。結果如圖3所示，本申請的抗體能夠阻斷生物素化的人全長IgE與IM-9細胞表面CD23的結合。

實施例10 抗體阻斷生物素化的人全長IgE刺激Fc ε RI/RBL-2H3釋放組胺

使用Fc ε RI/RBL-2H3培養基(MEM+15%FBS+1mM丙酮酸鈉+1μg/ml Puromycin)於37℃、5%二氧化碳條件下培養Fc ε RI/RBL-2H3細胞(吉凱基因構建)。使用細胞培養基配製人全長IgE蛋白(ABBIOTEC，貨號：250205)濃度為2.4μg/ml；隨後用細胞培養基配製anti-IgE抗體，濃度起始為15μg/ml，2倍梯度稀釋(9個濃度點+1個0濃度)。先將50μL人全長IgE蛋白加入96孔平底細胞培養板中，再加入50μL配製好anti-IgE抗體。同時，收集Fc ε RI/RBL-2H3細胞，重新懸浮於培養基中，細胞濃度為2*10⁶個/ml，以50μl/孔加入相應96孔平底細胞培養板中，將細胞培養板置於37℃、5%二氧化碳細胞培養箱孵育過夜。第二天，吸棄上清，細胞用Assay Buffer(Tyrode's buffer(130mM NaCl,5mM KCl,10nM HEPES,1.4mM CaCl2,1mM MgCl2.6H2O,5.6mM Glucose,0.1%BSA)，pH7.4)洗2次，然後每孔加入200μl 1μg/ml的多株anti-IgE抗體(R&D，貨號：G-107-C)，37℃、5%二氧化碳細胞培養箱孵育30分鐘；最後吸取上清，用Histamine Dynamic試劑盒(CISBIO，貨號：62HTMDPEG)進行檢測，檢測方法按照試劑盒說明書進行。結果如圖4A和圖4B所示，結果顯示，該抗體能夠抑制FL hIgE誘導Fc ε RI/RBL-2H3的組胺釋放，且IC₅₀值低於omalizumab，說明抑制效果比omalizumab好。

實施例11 人全血組胺釋放實驗

志願者在捐獻血液的24小時前不應服用引起過敏的藥物、抗組胺藥、口服糖皮質激素以及任何阻斷H2受體的物質。全血採用肝素作為抗凝劑。

組胺釋放根據試劑盒(Sigma，貨號：IB89145)的操作步驟進行，具體如下：待測抗體用PBS稀釋成6000、600、60及6nM，試劑盒中的陽性對照抗IgE血清用組胺釋放緩衝液稀釋1000倍後使用。組胺釋放過程按照下表16進行加樣並操作。

表16 組胺釋放加樣說明

組胺ELISA根據試劑盒(Sigma，貨號：IB89128)的操作步驟進行，具體如下：取50μl上清或用去離子水稀釋1倍的標準品及對照品，分別加到對應的孔中。然後每孔加入25μl的乙醯化緩衝液和25μl乙醯化溶液，600rpm搖床室溫下振盪45分鐘。最後再加入100μl去離子水，600rpm搖床室溫下振盪15分鐘。樣品乙醯化好之後，取25μl加入已經包被好組胺的孔板中，再加入100μl的抗組胺血清並用封板膜封好，600rpm搖床室溫下振盪3個小時。孵育好之後，棄掉孔板中的液體，每孔加入300μl清洗液清洗4遍，每孔再加入100μl酶聯二抗，600rpm搖床室溫下振盪30分鐘。棄掉孔板中的液體，每孔加入300μl清洗液清洗4遍，每孔加入100μl受質，600rpm搖床室溫下振盪30分鐘。最後再加入100μl的終止液終止反應，Envision酶標儀(PerkinElmer)10分鐘內讀取450nm和570nm下的吸光值。

結果如圖5所示，結果顯示，Anti-IgE血清會交聯或者啟動已經與Fc ε RI結合的IgE，誘導組胺釋放，而omalizumab、AB1904Am10及AB1904Am15則不會。

實施例12 抗體穩定性研究

經由高溫、低pH、反復凍融穩定性實驗條件綜合評價候選抗體穩定性，穩定性研究的重點測試專案主要針對產品關鍵純度指征，包括SEC-HPLC、iCIEF、非還原性CE-SDS。

11.1高溫穩定性試驗

本研究重點考察候選抗體在高溫條件下的穩定性，將樣品置於40±2℃實驗條件下，分別在第0、3、7、14、21、28天取樣檢測SEC-HPLC純度、電荷異構體純度、nrCE-SDS純度，實驗結果如下：

表17 高溫下的抗體穩定性結果

11.2 低pH值穩定性試驗

重點考察候選抗體在低pH條件下的穩定性，用鹽酸調節樣品pH值至5.0，將樣品置於40±2℃條件下，分別於第0h、6h、24h、48h、72h取樣檢測SEC-HPLC純度、電荷異構體純度、NRCE-SDS純度，實驗結果如下：

表18 低pH值下的抗體穩定性結果

11.3反復凍融穩定性試驗

重點考察候選抗體在反復凍融條件下的穩定性，將樣品置於-70±10℃凍結至室溫融解為一個迴圈，分別於第三個迴圈和第6個迴圈，取樣檢測，實驗結果如下：

表19 反復凍融下的抗體穩定性結果

經由對AB1904Am10、AB1904Am15、omalizumab進行高溫穩定性、低pH穩定性、反復凍融穩定性研究，高溫和低pH穩定性研究結果表明：在高溫和低pH條件下，候選抗體AB1904Am10和AB1904Am15穩定性優於omalizumab，特別是在SEC-HPLC檢測中聚體生成量減少，在iCIEF檢測中主峰下降減少，說明候選抗體AB1904Am10和AB1904Am15對於溫度和低pH更耐受，穩定性更好，對於生產、貯存和使用過程中更好的穩定性。反復凍融穩定性研究結果表明：AB1904Am10和AB1904Am15反復凍融6次後，所有關鍵純度品質指標穩定性良好。

實施例13 在人源化FcRn小鼠模型中藥物代謝動力學(PK)研究

以人源化FcRn小鼠為受試動物，分別研究三個待試藥物omalizumab、AB1904Am10和AB1904Am15單次皮下給藥後的藥物代謝動力學指標。所有動物實驗方案獲得了IACUC審閱和批准。hFcRn小鼠採購自北京百奧賽圖，雄性，6-8週齡，體重23-26g，飼養於SPF級動物房，標準顆粒飼料餵養，自由進食及飲水，室溫18~24℃，相對濕度40%~50%，每日12h晝夜交替。實驗動物共12隻，隨機分為三組，每組四隻動物，皮下單次給藥，給藥劑量為10mg/kg，給藥體積為10mL/kg。採血時間點為給藥前，給藥後2h、6h、24h(第1天)、第2天、第3天、第4天、第7天、第10天、第14天、第21天、第28天、第35天和第42天。經由臉頰穿刺採集全血60μL/隻至EP管中，室溫靜置30min，然後離心(2000g，4℃，5min)分離血清，每個樣品分裝為2份(檢測管和備份管)，10μL/管，置於-80℃保存。

利用Elisa間接法檢測，分析三種藥下不同時間點藥物代謝動力學。包被抗原為抗人IgG1抗體(Fc specific)(Abcam，貨號：ab1927)，2μg/ml，100ul/孔，37℃，2h。洗板後用200ul/孔封閉液4℃過夜。血清樣本加樣，50μl/孔，37℃，1h。檢測抗體為鼠抗人Fab HRP(1：10000)(Abcam，貨號：ab87422)，100μl/孔，37℃，0.5h。TMB顯色液(KPL，貨號：52-00-03)顯色，酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax M3)讀值OD450。根據標曲獲得藥物濃度，PK Solver非房室進行資料處理獲得PK參數。

結果如圖6所示。給藥omalizumab後，半衰期(t1/2)=10.9天，最高濃度(Cmax)為53214.1ng/ml；AUC為900661ng/ml*d；給藥AB1904AM10後，半衰期(t1/2)=13.5天，最高濃度(Cmax)為60441.4ng/ml；AUC為1220787ng/ml*d；給藥AB1904AM15後半衰期(t1/2)=26.6天，最高濃度(Cmax)為57355.7ng/ml。AUC 1284785ng/ml*d。

實施例14 在食蟹猴模型中藥物代謝動力學-藥效動力學(PK/PD)研究

以食蟹猴(Cynomolgus monkey)為受試動物，分別研究三個待試藥物omalizumab、AB1904Am10和AB1904Am15單次皮下給藥後的藥物代謝動力學和藥效指標。

所有動物實驗方案獲得了IACUC審閱和批准。SPF級雄性Cynomolgus monkey，實驗用9隻，4週歲齡以上，體重4.1~5.7kg，飼養於SPF級動物房，自由進食及飲水等。給藥劑量：10mg/kg；給藥途徑與給藥體積：皮下注射給藥；給藥體積：根據具體藥物濃度計算。分組：3個TA，每個TA 3隻食蟹猴；給藥：根據體重計算給藥體積，單次皮下注射藥物，並記錄給藥時間；採點：於給藥前，給藥後2h、6h、24h(第1天)、第2天、第3天、第4天、第7天、第10天、第14天、第21天、第28天、第35天、第42天和第56天，頭靜脈和隱靜脈採集全血300μL/隻至EP管中，並記錄採血時間；處理樣品：全血室溫靜置1h，離心：6,000g，25℃，10min，分離血清，每個樣品分裝5份(1份檢測管和4份備份管)，30μL/管。置於-80℃保存。

利用Elisa間接法檢測，分析三種藥下不同時間點藥物代謝動力學。包被抗原為抗人IgG1抗體(Fc specific)(Abcam，貨號：ab1927)，2μg/ml，100ul/孔，37℃，2h。洗板後用200ul/孔封閉液4℃過夜。血清樣本加樣，50ul/孔，37℃，1h。檢測試劑為人IgE-Biotin(Abbiotec，貨號：250205，自己進行生物素化標記)+SA-HRP(sigma，貨號：S2438-250UG)。100ul/孔，37℃，0.5h。TMB顯色液(KPL，貨號：52-00-03)顯色，酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax M3)讀值OD450。根據標準曲線獲得藥物濃度，PK Solver非房室進行資料處理獲得PK參數。

結果如圖7所示，給藥omalizumab後，半衰期(t1/2)=6.35天，最高濃度(Cmax)為112493ng/ml，AUC為1704601ng/ml*d；給藥AB1904AM10後，半衰期(t1/2)=11.15天，最高濃度(Cmax)為83940ng/ml，AUC為1324493ng/ml*d；給藥AB1904AM15後，半衰期(t1/2)=12.2天，最高濃度(Cmax)為142880ng/ml, AUC為3061056ng/ml*d。

然後利用Elisa間接法檢測，檢測血清中游離IgE。包被抗原為AB1904Am15，0.5μg/ml，100ul/孔，4℃過夜。洗板後用200ul/孔封閉液37℃，1h。血清樣本加樣，50ul/孔，37℃，1.5h。加入生物素標記的奧馬珠抗體500ng/ml，每孔100uL，1h；然後加入SA-HRP(1：10000,sigma，貨號：S2438-250UG)，100ul/孔，37℃，1h。TMB顯色液(KPL，貨號：52-00-03)顯色，酶標儀(Molecular Devices，SpectraMax M3)讀值OD450。根據標準曲線得游離IgE濃度。

結果如圖1所示，給藥omalizumab後，游離IgE恢復到起始濃度的時間在21天左右；給藥AB1904Am10後，游離IgE恢復到起始濃度的時間在28天左右；給藥AB1904Am15後，游離IgE恢復到起始濃度的時間在42~56天左右。

<110> 上海濟煜醫藥科技有限公司(SHANGHAI JEMINCARE PHARM CO.,LTD.) 江西濟民可信集團有限公司(JIANGXI JEMINCARE GROUP CO.,LTD.)

<120> 一種抗IgE的工程化抗體及其應用

<130> 0134-PA-015TW

<160> 64

<170> PatentIn version 3.5

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<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HFR4

<400> 49

<210> 50

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH

<400> 50

<210> 51

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH

<400> 51

<210> 52

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH

<400> 52

<210> 53

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH

<400> 53

<210> 54

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH

<400> 54

<210> 55

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH

<400> 55

<210> 56

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH

<400> 56

<210> 57

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VL

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> Xaa=Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Asn或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa=Ala、Asp、Ser或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (33)..(33)

<223> Xaa=Ala、Gly、Trp或Tyr

<400> 57

<210> 58

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> VH

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> Xaa=Arg或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> Xaa=Gln或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (100)..(100)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (101)..(101)

<223> Xaa=His或Asn

<400> 58

<210> 59

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 輕鏈恆定區

<400> 59

<210> 60

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG1恆定區(無突變)

<400> 60

<210> 61

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> IgG1恆定區(YTE突變)

<400> 61

<210> 62

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HCDR1通式

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa=Arg或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa=Gln或Ser

<400> 62

<210> 63

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> HCDR3通式

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa=Ser或Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa=His或Asn

<400> 63

<210> 64

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LCDR1通式

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa=Leu或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> Xaa=Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、Asn或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa=Ala、Asp、Ser或Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa=Ala、Gly、Trp或Tyr

<400> 64

Claims

一種抗原結合蛋白，其包含抗體輕鏈可變區(VL)，其中與SEQ ID NO：22所示的胺基酸序列相比，該VL包含選自下組的一個或多個位置處的胺基酸突變：E55和V104。
如請求項1所述的抗原結合蛋白，其中該VL包含選自下組的一個或多個位置處的胺基酸突變：D30b、V29、D30、Y30a和G30c。
如請求項1或2所述的抗原結合蛋白，其中該VL包含下組位置處的胺基酸突變：D30b、E55和V104。
如請求項1至3中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VL包含選自以下任意一組位置處的胺基酸突變：

1)D30b、E55、V104、V29、D30和Y30a；

2)D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；

3)D30b、E55、V104和Y30a；

4)D30b、E55、V104、Y30a和G30c；

5)D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；和

6)D30b、E55、V104、D30和Y30a。
如請求項1至4中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該E55位置處的胺基酸突變包括E55Q。
如請求項1至5中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該V104位置處的胺基酸突變包括V104L。
如請求項2至6中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該D30b位置處的胺基酸突變包括D30bE。
如請求項2至7中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該V29位置處的胺基酸突變包括V29L。
如請求項2至8中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該Y30a位置處的胺基酸突變包括選自下組的任意一種：Y30A、Y30aS和Y30aD。
如請求項2至9中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該D30位置處的胺基酸突變包括選自下組的任意一種：D30Y、D30A、D30E、D30F、D30G和D30N。
如請求項2至10中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該G30c位置處的胺基酸突變包括選自下組的任意一種：G30cA、G30cY和G30cW。
如請求項2至11中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VL包含下組的胺基酸突變：D30bE、E55Q和V104L。
如請求項1至12中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO：57所示的胺基酸序列。
如請求項1至13中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VL包含SEQ ID NO：23-34中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項1至14所述的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈可變區(VH)，其中與SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列相比，該VH包含選自下組的一個或多個位置處的胺基酸突變：I37、A49、S50和D54。
如請求項15所述的抗原結合蛋白，其中該VH包含選自下組的一個或多個位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、T30、S31、S96和H97。
如請求項15或16所述的抗原結合蛋白，其中該VH包含下組位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54。
如請求項15至17中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VH包含選自以下任意一組位置處的胺基酸突變：

1)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96和H97；

2)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和T30；

3)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S96；

4)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S31；和

5)N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和H97。
如請求項15至18中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該I37位置處的胺基酸突變包括I37V。
如請求項15至19中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該A49位置處的胺基酸突變包括A49S。
如請求項15至20中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該S50位置處的胺基酸突變包括S50V。
如請求項15至21中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該D54位置處的胺基酸突變包括D54A。
如請求項16至22中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該N60位置處的胺基酸突變包括N60A。
如請求項16至23中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該P61位置處的胺基酸突變包括P61D。
如請求項16至24中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該I67位置處的胺基酸突變包括I67F。
如請求項16至25中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該T30位置處的胺基酸突變包括T30R。
如請求項16至26中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該S31位置處的胺基酸突變包括S31Q。
如請求項16至27中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該S96位置處的胺基酸突變包括S96T。
如請求項16至28中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該H97位置處的胺基酸突變包括H97N。
如請求項15至29中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VH包含下組的胺基酸突變：N60A、P61D、I67F、I37V、A49S、S50V和D54A。
如請求項15至20中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：58所示的胺基酸序列。
如請求項15至31中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VH包含SEQ ID NO：51-56中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項15至32中任一項所述的抗原結合蛋白，其中該VL和該VH包括選自以下任意一組位置處的胺基酸突變：

1)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、V29、D30和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54、S96和H97；

2)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和T30；

3)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S96；

4)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54；

5)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54；

6)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和H97；

7)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50和D54；

8)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30和Y30a；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和H97；

9)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S96；和

10)VL包括以下位置處的胺基酸突變：D30b、E55、V104、D30、Y30a和G30c；VH包括以下位置處的胺基酸突變：N60、P61、I67、I37、A49、S50、D54和S31。
如請求項1至33中任一項所述的抗原結合蛋白，其包括抗體重鏈恆定區。
如請求項34所述的抗原結合蛋白，其中該抗體重鏈恆定區源自人IgG恆定區。
如請求項35所述的抗原結合蛋白，其中該人IgG恆定區包括人IgG1恆定區。
如請求項36所述的抗原結合蛋白，其中該人IgG1恆定區包括選自下組的一種或多種胺基酸突變：M252Y、S254T和T256E。
如請求項37所述的抗原結合蛋白，其中該人IgG1恆定區包含SEQ ID NO：60-61中任一項所示的胺基酸序列。
如請求項1至38中任一項所述的抗原結合蛋白，其包括抗體輕鏈恆定區。
如請求項39所述的抗原結合蛋白，其中該抗體輕鏈恆定區包含SEQ ID NO：59所示的胺基酸序列。
一種分離的核酸分子，其編碼如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白。
一種載體，其包含如請求項41所述的核酸分子。
一種細胞，其包含如請求項41所述的核酸分子或如請求項42所述的載體。
一種製備如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白的方法，該方法包括在使得如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白表達的條件下，培養如請求項43所述的細胞。
一種醫藥組成物，其包含如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項41所述的核酸分子、如請求項42所述的載體和/或如請求項43所述的細胞，以及視需要地藥學上可接受的載體。
一種如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項41所述的核酸分子、如請求項42所述的載體、如請求項43所述的細胞和/或如請求項45所述的醫藥組成物在製備藥物中的用途，該藥物用於緩解或治療與異常IgE水平相關的疾病。
一種緩解或治療與異常IgE水準相關的疾病的方法，其包括向有需要的受試者施用如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項41所述的核酸分子、如請求項42所述的載體、如請求項43所述的細胞和/或如請求項45所述的醫藥組成物。
一種多肽，其包含如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白。
一種免疫綴合物，其包含如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白。
一種試劑盒，其包含如請求項1至40中任一項所述的抗原結合蛋白、如請求項41所述的核酸分子、如請求項42所述的載體、如請求項43所述的細胞和/或如請求項45所述的醫藥組成物。