JP2012526530A - ヒト化axl抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
または配列番号80〜配列番号82からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列の可変ドメイン、それと少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、100%の配列同一性を有する可変領域と同等の、Axlに対する結合活性を有する可変領域を表すアミノ酸配列、
および/または配列番号18〜配列番号30からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、100%の配列同一性を有する可変領域と同等の、Axlに対する結合活性を有する可変領域を表すアミノ酸配列、
または配列番号73〜配列番号79からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列の可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、100%の配列同一性を有する可変領域と同等の、Axlに対する結合活性を有する可変領域を表すアミノ酸配列、
またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するその断片を含みうる。本明細書による配列の説明は、下記の「配列の説明」および「配列表」で示す。
および/または配列番号146および配列番号147からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、100%の配列同一性を有する可変領域と同等の、Axlに対する結合活性を有する可変領域を表すアミノ酸配列を含みうる。
または配列番号114〜配列番号120からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列の可変ドメイン、それと少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、100%の配列同一性を有する可変領域と同等の、Axlに対する結合活性を有する可変領域を表すアミノ酸配列、
および/または配列番号55〜配列番号60からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、100%の配列同一性を有する可変領域と同等の、Axlに対する結合活性を有する可変領域を表すアミノ酸配列、
または配列番号83〜配列番号113からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列の可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有し、かつ、100%の配列同一性を有する可変領域と同等の、Axlに対する結合活性を有する可変領域を表すアミノ酸配列、
またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するその断片
を含む。
(a)本発明によるモノクローナル抗体、その抗体断片もしくは派生物をコードする核酸配列、
(b)配列番号5〜配列番号17、配列番号31〜配列番号39、配列番号49〜配列番号54、および配列番号60〜配列番号66からなる群から選択される配列番号のうちの1つにおいて示される核酸配列、
(c)配列番号18〜配列番号30、配列番号40〜配列番号48、配列番号55〜配列番号60、配列番号67〜配列番号72、配列番号73〜配列番号120、および配列番号121〜132からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
(d) (a)〜(c)における配列のうちのいずれかと相補的な核酸、または
(e)ストリンジェントな条件下で(a)、(b)、(c)、または(d)にハイブリダイズすることが可能であり、かつ、それを含む抗体もしくはその機能断片がAXLの細胞外ドメインに結合するポリペプチドをコードする核酸配列、
(f)配列番号144および配列番号145、ならびに配列番号148および配列番号149からなる群から選択される配列番号のうちの1つにおいて示される核酸配列、
(g)配列番号146および配列番号147、ならびに配列番号150および配列番号151からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
(h) (f)もしくは(g)における配列のうちのいずれかと相補的な核酸、または
(i)ストリンジェントな条件下で(f)、(g)、または(h)にハイブリダイズすることが可能であり、かつ、それを含む抗体もしくはその機能断片がAXLの細胞外ドメインに結合するポリペプチドをコードする核酸配列
からなる群から選択される単離核酸分子に関する。
免疫原としてのAXL過剰発現Rat 1線維芽細胞の生成
全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)参照配列(NM_021913)に従うヒト受容体チロシンキナーゼAXL転写産物変異体1の完全長コード配列を、制限エンドヌクレアーゼEcoRIおよびSamHIの隣接認識エレメントを介してpLXSNにサブクローニングし、それによってレトロウイルス発現ベクターpLXSN-hAXLを生成した。
ラット抗AXLモノクローナル抗体の生成
モノクローナルラット抗AXL抗体を、Lou/CまたはLong Evansラットに腹膜内と皮下の両方にRat 1-AXLcl.2の約10×106個の凍結細胞を注射することによって産生した。8週間隔後、最終追加抗原刺激を融合前3日に腹膜内および皮下に与えた。ミエローマ細胞系P3X63-Ag8.653とラット免疫系脾臓細胞の融合は標準手順に従い実施し、105のハイブリドーマが生成した。2週間後、ハイブリドーマ由来の第一の上清を回収し、NIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞とNIH3T3-Mock対照細胞の結合の一次FACSスクリーニングにおいて試験した。AXL結合に関して陽性であったクローンをさらに培養した。これらのクローンの50ml上清から、抗体を精製し、NIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞とNIH3T3-Mock対照細胞上のAXLの特異的結合に関して再分析した。NIH3T3-Mock対照細胞ではなくNIH3T3-AXLcl.7線維芽細胞と特異的に結合する精製抗体をAkt-キナーゼリン酸化ELISAにおいてさらに試験して、かつアイソタイプを決定するためのELISAを実施した。ラット抗体の精製のために、上清を20分間5,00Ogで遠心分離にかけ、その後滅菌濾過した。500μlのプロテインGセファロースFFを加え、スピニングホイール上で少なくとも1時間4℃でインキュベートした。セファロースを遠心分離にかけ、上清を捨て、プロテインGマトリクスはクエン酸バッファー(10OmM)pH2.1を利用するタンパク質溶出の前にPBSで二回洗浄した。溶出分画は1MのトリスpH8.0を加えることによってすぐに中性pHに再度中和し、PBSで透析した。
抗AXL抗体の構造および特性
3.1.ラット抗体可変ドメインのヌクレオチド配列
ラット抗AXL抗体の可変ドメインをハイブリドーマ細胞からクローニングした。RNAはRNA抽出キットRNeasy(RNeasy midiキット、Qiagen)を利用して調製した。抗体遺伝子をコードするcDNAは、製造元の説明書に従い5' RACEキット(Invitrogen)を使用して調製した。
kappa_GSP1: GATGGATGCATTGGTGCAGC
新規_kappa_GSP1: atagatacagttggtgcagc
重鎖_GSP1: CAGGGTCACCATGGAGTTA
GSP2プライマー:
XhoI-hGSP2: CCGCTCGAGCGGGCCAGTGGATAGACAGATGG
XhoI-kGSP2: CCGCTCGAGCGGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG
11B7:kappaGSP1; XhoI-kGSP2
重鎖GSP1; XhoI-hGSP2
10D12:kappa_GSP1、新規_kappa_GSP1; XhoI-kGSP2
重鎖GSP1; XhoI-hGSP2
11D5:新規_kappa_GSP1; XhoI-kGSP2
重鎖GSP1; XhoI-hGSP2
ラット抗体可変ドメインの配列を、配列決定された遺伝子から翻訳して、pLXSN-ESKベクターへとクローニングした。所与のアミノ酸配列は、可変ドメインの1位で始まる。抗体とその標的との特異的結合に必要とされる相補性決定領域(CDR)は、Kabat(Kabatら、「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、第5版、NIH刊行物第91-3242号、1991)に従い定義される。Kabatの定義は、可変ドメインにおける配列のばらつきに基づく。抗体の抗AXL特異的CDR領域を、図14および配列番号121〜配列番号132に列挙する。個々のCDRは以下の位置を包含する:
CDR-L1: 24-34
CDR-L2: 50-56
CDR-L3: 89-97
CDR-H1: 31-35b
CDR-H2: 50-65
CDR-H3: 95-102
4.5g/Lのグルコース、1%のグルタミン、1%のピルビン酸塩、1%のPen/Strepを包含するDMEMを使用して、37℃、5〜7% CO2中のCelline CL 1000バイオリアクター(Integra Biosciences)内でハイブリドーマを培養した。FCSの補充は、栄養区画に1%のFCS、かつ、細胞区画に5%の低濃度IgG FCSとする。週に2回採取および培地交換を実施する。細胞増殖に応じて、1/1〜>1/3に細胞を分割する。SDS-PAGE分析によって、週に1回増殖率を調べる。精製するまで上清は-20℃で保存する。週に1回、実験培養物のマイコプラズマ試験を実施する。
rSDS-PAGEゲル分析;クーマシー染色または銀染色
BCA試験(Pierce #23227のBCAタンパク質アッセイキット; #31233のラットIgG標準)
分析用サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 200 Tricorn 10/300 GL、250μl中約250mg; 0.5ml/分、Aekta Explorer 100)
エンドトキシン試験(LAL; #US50-648UのCambrex QCL-1000 (登録商標) LALエンドポイント比色アッセイ)
細胞ベースの活性アッセイ(FACS結合アッセイ; pAkt; pAXL)
を包含する。
ヒトAXL過剰発現NIH3T3細胞をPBS中10mM EDTAとのインキュベーションによって採取し、FACSバッファー(PBS pH7.4、3%のFCS、0.1%のNaN3) 1ml当たりの細胞600万個で再懸濁させた。丸底マイクロタイタープレートにおいて、100μlの細胞懸濁液を、FACSバッファー中40μg/ml〜0.002μg/mlの濃度(266および0.01nM)で、抗体11B7、11D5、ch11B7-IgG1、ch11B7-IgG2、ch11B7-IgG1またはch11D5-IgG2を含有する100μlの抗体溶液に添加した。抗体の結合は、氷上において2時間にわたって進行させた。次いで、ウエル当たり250μlのFACSバッファーで2回細胞を洗浄し、FACSバッファー中で1:50に希釈した200μlの二次抗体(抗ラットPE; Jackson)に再懸濁させた。45分間のインキュベーション後、FACSバッファーでさらに2回細胞を洗浄し、FACS分析用の500ml PBSに再懸濁させた。分析はBeckman-Coulter FACS FC500で実施した。見かけの親和性定数KDappを決定するために、平均蛍光と、これに対応する抗体濃度([M])との比に対して、平均蛍光値をプロットした。直線の逆勾配から得られるKDappの計算値を以下に挙げる。
ラット抗AXL抗体のキメラ化:
ヒトkappa軽鎖遺伝子およびヒト重鎖IgG1/2遺伝子を、以下に記載するように、ヒトボランティアの末梢血単核細胞(PBMC)からクローニングした:
1) RT-ガンマ: GCG TGT AGT GGT TGT GCA GAG
2) RT-ガンマ2: ggg ctt gcc ggc cgt g
3) RT-kappa: TGG AAC TGA GGA GCA GGT GG
4) 5' Blp: AGA TAA GCT TTG CTC AGC GTC CAC CAA GGG CCC ATC GGT
5) 3' Bam (GAG): AGA TGG ATC CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G
6) 5' Bsi: AGA TAA GCT TCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT CTT CAT
7) 3' Bam (CTT): AGA TGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT
κ鎖の増幅:
94℃ 120秒間
94℃ 30秒間
55℃ 30秒間
72℃ 45秒間のサイクルを35回
72℃ 10分
γ鎖の増幅:
94℃ 120秒間
94℃ 30秒間
45℃ 30秒間
72℃ 60秒間のサイクルを5回
94℃ 30秒間
50℃ 30秒間
72℃ 60秒間のサイクルを35回
72℃ 10分間
94℃ 120秒間
94℃ 30秒間
55℃ 30秒間
72℃ 60秒間のサイクルを35回
72℃ 10分
VL-11B7-5': AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA GGC TCC
VL-11B7-3': AGA TCG TAC GTT TCA GCT CCA GCT TGG TGC CTC
VL-11D5-5': AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA GTC TCC ATC
VL-11D5-3': AGA TCG TAC GTT TCA GCT TGG TCC CAG
のプライマーにより増幅した。
VH-11B7/11D5-5': AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA GGT GCA GCT TCA GGA GTC AGG
VH-11B7/11D5-3': AGA TGC TGA GCT GAC AGT GAC CAT GAC TCC TTG GCC
のプライマーにより増幅した。
本発明のラット抗AXL抗体はヌードマウス中のヒト前立腺癌増殖を低減する
治療用抗体の抗腫瘍有効性は、ヒト異種移植腫瘍試験において評価されることが多い。これらのモデル系では、ヒト腫瘍を免疫不全マウス中で異種移植片として増殖させ、腫瘍増殖阻害の程度によって治療有効性を測定する。この試験の目的は、本発明のアンタゴニストラット抗AXL抗体11B7が、ヌードマウス中のヒト前立腺癌細胞の腫瘍増殖に干渉するかどうか評価することであった。簡潔には、第0日に、7〜8週齢のオスNMRI-nu/nuマウス(およその重量:順化後30g)に、2l/分の酸素流量において1.5〜2.0体積パーセントのイソフルランで麻酔をかけ、25μlのPBS中の1×106個のPC-3-LN細胞を前立腺中に同所に移植した。PC-3-LN細胞は、ルシフェラーゼ-ネオマイシン融合タンパク質をコードするレトロウイルスに感染したPC-3前立腺癌細胞系に由来する。したがって腫瘍増殖の発症および腫瘍増殖の進行は、in vivo生物発光イメージングによって測定可能であった。この目的のために、ルシフェリンをマウスに腹膜内(i.p.)注射して、NightOWLLB981生物発光イメージングシステム(Berthold Technologies、ドイツ)を使用して注射後10分で発光を測定した。初回治療の前に、動物を無作為に分け、統計的検定を実施して、各10匹の動物の治療群中の開始腫瘍体積(平均、中央および標準偏差)の均一性を保証した。第8日に全ての治療を開始し、第34日まで続け、次に第35日に解剖した。25mg/kgの25mg/kgのアイソタイプ対照抗体1D5およびアンタゴニストラット抗AXL抗体11B7を、週に3回(月曜日、水曜日、金曜日)それぞれ群1および2の動物に腹膜内(i.p.)投与した。群3の動物には一日一回40mg/kgのSutentを経口(p.o.)投与した。群4の動物には4日間隔でそれぞれ12.5mg/kgのTaxotereを3回静脈内(i.v.)注射した。治療群の概要は以下に与える。
本発明のラット抗AXL抗体はヒト前立腺癌の転移を阻害する
「Rat anti-AXL antibodies of the invention reduce human prostate carcinoma growth in nude mice」で記載されたのと同じ実験において、他の器官へのPC-3-LN腫瘍細胞の再局在化(転移)を解剖後に分析して、本発明のアンタゴニストラット抗AXL抗体11B7の抗転移効果を評価した。この目的のために、選択した器官(肝臓、脾臓、肺、大腿骨、および腰椎の一部)を解剖後に回収し、均質化し、ルシフェリンを補充した。その後、NightOWLLB981生物発光イメージングシステム(Berthold Technologies、ドイツ)を使用して発光を測定した。
ヒト化抗体の設計
7.1. #11B7のヒト化形の設計
7.1.1. #11B7可変ドメインの分子モデリング
当技術分野において相同性モデリングとして一般に知られる(Methods in Enzymology、203、121〜153頁(1991))方法に従い、#11B7可変ドメインの分子モデリングを実施した。タンパク質データバンクに登録されているヒト免疫グロブリン可変ドメインの一次配列(X線結晶構造に由来する三次元構造も入手可能である) (Nuc. Acid Res. 35、D301〜D303頁(2007))を、#11B7の可変ドメインと比較し、これにより該一次配列を決定した。結果として、1JPTを、#11B7軽鎖可変ドメインに対して最も高度な配列相同性を有する可変ドメインとして選択した。さらに、1F8Tを、#11B7重鎖可変ドメインに対して最も高度な配列相同性を有する可変ドメインとして選択した。「フレームワークモデル」に基づき、#11B7の軽鎖および重鎖に対応する1JPTおよび1F8Tの座標を組み合わせることにより、フレームワークドメインの三次元構造を作成した。#11B7 CDRの場合、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、およびCDRH2を、Thorntonら(J. Mol. Biol.、263、800〜815頁(1996))の分類によるクラスター11A、7A、9A、10A、および9Aにそれぞれ割り当てた。H3規則(FEBS letters 399、1〜8頁(1996))により、CDRH3は、k(3)に分類した。続いて、各CDRの典型的な立体構造を、フレームワークモデルに組み込んだ。
ヒト化#11B7抗体は、当技術分野においてCDR移植(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86、10029〜10033頁(1989))として一般に知られている方法により構築した。アクセプター抗体は、フレームワークドメインにおけるアミノ酸の相同性に基づき、2つの方法で選択した。
7.1.3.1. h#11B7-T1L型軽鎖:
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、65 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、73 (ロイシン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、ロイシン、トレオニン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、フェニルアラニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T1L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、65 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、73 (ロイシン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、トレオニン、グリシン、トレオニン、トレオニン、フェニルアラニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T2L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T3L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T4L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンで置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T5L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T6L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T7L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T8L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T9L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T10L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンで置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T11L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T12L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T13L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T14L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T15L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T16L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T17L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T18L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T19L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30B)の配列番号140により表される#11B7軽鎖可変領域のアミノ酸番号7 (アラニン)、12 (プロリン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (アスパラギン酸)、100 (グリシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、セリン、セリン、バリン、チロシン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7軽鎖可変領域を、「h#11B7-T20L」型軽鎖可変領域と名付けた。
7.1.4.1. h#11B7-T1H型重鎖:
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、2 (バリン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、48 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、68 (セリン)、70 (トレオニン)、71 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、イソロイシン、トレオニン、アラニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、セリン、バリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T1H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、2 (バリン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、70 (トレオニン)、71 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、イソロイシン、トレオニン、アラニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、セリン、バリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T2H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、40 (フェニルアラニン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、トレオニン、アラニン、セリン、プロリン、グリシン、ロイシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T3H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、6 (グルタミン酸)、7 (セリン)、9 (プロリン)、12 (バリン)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、48 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、68 (セリン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン、トリプトファン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T4H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、6 (グルタミン酸)、7 (セリン)、9 (プロリン)、12 (バリン)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン、トリプトファン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T5H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸1 (グルタミン酸)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T6H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ番号酸1 (グルタミン酸)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、48 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T7H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、68 (セリン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、トレオニン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T8H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、48 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、68 (セリン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T9H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、6 (グルタミン酸)、7 (セリン)、9 (プロリン)、12 (バリン)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、48 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン、トリプトファン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T10H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、6 (グルタミン酸)、7 (セリン)、9 (プロリン)、12 (バリン)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、68 (セリン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン、トリプトファン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、トレオニン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T11H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30C)の配列番号141により表される#11B7重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、6 (グルタミン酸)、7 (セリン)、9 (プロリン)、12 (バリン)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン酸)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、48 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、68 (セリン)、70 (トレオニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (セリン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン、トリプトファン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、セリン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11B7重鎖可変領域を、「h#11B7-T12H」型重鎖可変領域と名付けた。
7.2.1. #11D5可変ドメインの分子モデリング
当技術分野において相同性モデリングとして一般に知られる(Methods in Enzymology、203、121〜153頁(1991))方法に従い、#11D5可変ドメインの分子モデリングを実施した。タンパク質データバンクに登録されているヒト免疫グロブリン可変ドメインの一次配列(X線結晶構造に由来する三次元構造も入手可能である) (Nuc. Acid Res. 35、D301〜D303頁(2007))を、#11D5の可変ドメインと比較し、これにより該一次配列を決定した。結果として、1D5Iを、#11D5軽鎖可変ドメインに対して最も高度な配列相同性を有する可変ドメインとして選択した。さらに、1ORSを、#11D5重鎖可変ドメインに対して最も高度な配列相同性を有する可変ドメインとして選択した。「フレームワークモデル」に基づき、#11D5の軽鎖および重鎖に対応する1D5Iおよび1ORSの座標を組み合わせることにより、フレームワークドメインの三次元構造を作成した。#11D5 CDRの場合、CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、およびCDRH2を、Thorntonら(J. Mol. Biol.、263、800〜815頁(1996))の分類によるクラスター11A、7A、9A、10A、および9Aにそれぞれ割り当てた。H3規則(FEBS letters 399、1〜8頁(1996))により、CDRH3は、k(3)に分類した。続いて、各CDRの典型的な立体構造を、フレームワークモデルに組み込んだ。
ヒト化#11D5抗体は、当技術分野においてCDR移植(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86、10029〜10033頁(1989))として一般に知られている方法により構築した。アクセプター抗体は、フレームワークドメインにおけるアミノ酸の相同性に基づき、2つの方法で選択した。
7.2.3.1. h#11D5-T1L型軽鎖:
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号2 (イソロイシン)、11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、46 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、バリン、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T1L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、46 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T2L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T3L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47(メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グリシン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T4L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グリシン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T5L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T6L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T7L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T8L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T9L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T10L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T11L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T12L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T13L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T14L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T15L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T16L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T17L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T18L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T19L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T20L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T21L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T22L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T23L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T24L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T25L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T26L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T27L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、リシン、ロイシン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T28L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T29L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T30L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T31L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T32L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、71 (チロシン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T33L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、70 (アスパラギン酸)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T34L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、47 (メチオニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、ロイシン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T35L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、40 (バリン)、43 (セリン)、45 (アルギニン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、プロリン、アラニン、リシン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T36L」型軽鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30D)の配列番号142により表される#11D5軽鎖可変領域のアミノ酸番号11 (メチオニン)、13 (トレオニン)、15 (ロイシン)、36 (フェニルアラニン)、40 (バリン)、43 (セリン)、66 (アルギニン)、69 (セリン)、72 (セリン)、79 (グルタミン酸)、80 (セリン)、83 (メチオニン)、85 (イソロイシン)、100 (セリン)、104 (ロイシン)、106 (ロイシン)、および109 (プロリン)を、ロイシン、アラニン、バリン、チロシン、プロリン、アラニン、グリシン、トレオニン、トレオニン、グルタミン、プロリン、フェニルアラニン、トレオニン、グルタミン、バリン、イソロイシン、およびトレオニンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5軽鎖可変領域を、「h#11D5-T37L」型軽鎖可変領域と名付けた。
7.2.4.1. h#11D5-T1H型重鎖:
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、68 (セリン)、71 (アルギニン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、メチオニン、グリシン、ロイシン、バリン、トレオニン、バリン、グルタミン酸、セリン、リシン、セリン、プロリン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T1H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、71 (アルギニン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、メチオニン、グリシン、ロイシン、バリン、グルタミン酸、セリン、リシン、セリン、プロリン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T2H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、トレオニン、トレオニン、セリン、リシン、セリン、リシン、セリン、プロリン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T3H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、6 (グルタミン酸)、7 (セリン)、9 (プロリン)、12 (バリン)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、68 (セリン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン、トリプトファン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、バリン、トレオニン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T4H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号6 (グルタミン酸)、7 (セリン)、9 (プロリン)、12 (バリン)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、トリプトファン、アラニン、ロイシン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T5H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T6H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、68 (セリン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、バリン、トレオニン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T7H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、68 (セリン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、バリン、トレオニン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T8H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、68 (セリン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、トレオニン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T9H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、バリン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T10H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、68 (セリン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、トレオニン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T11H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、67 (イソロイシン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、バリン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T12H」型重鎖可変領域と名付けた。
配列表(図30E)の配列番号143により表される#11D5重鎖可変領域のアミノ酸番号1 (グルタミン酸)、16 (グルタミン)、17 (セリン)、23 (セリン)、25 (トレオニン)、39 (リシン)、40 (フェニルアラニン)、43 (アスパラギン)、44 (リシン)、45 (メチオニン)、75 (アルギニン)、79 (フェニルアラニン)、81 (グルタミン)、83 (アスパラギン)、87 (トレオニン)、88 (グルタミン酸)、92 (トレオニン)、107 (バリン)、および108 (メチオニン)を、グルタミン、グルタミン酸、トレオニン、トレオニン、セリン、グルタミン、プロリン、リシン、グリシン、ロイシン、リシン、セリン、リシン、セリン、アラニン、アラニン、バリン、トレオニン、およびロイシンでそれぞれ置換することにより設計されるヒト化#11D5重鎖可変領域を、「h#11D5-T13H」型重鎖可変領域と名付けた。
ヒト化抗体を発現させるための汎用ベクターの構築
8.1.ヒト化抗体軽鎖を発現させるためのベクターpEF6KCLの構築
鋳型としてのプラスミドpEF6/V5-His B (Invitrogen Corp.)と、以下のプライマー:
5'-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3' (プライマーEFF1:配列番号1)、および
5'-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3' (プライマーEFsmaR:配列番号2)
とを使用してPCRを実施し、BGHpA (2174)の直後からSmaI (2958)までのDNA断片(f1の複製起点、ならびにSV40プロモーターおよびその起点を含有するDNA断片;以後、「断片A」と称する)を得た。
得られた断片Aを、オーバーラップPCRにより、ヒトκ鎖分泌シグナル配列、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトポリ(A)付加シグナル配列をコードするDNA配列を含むDNA断片(配列番号3;以後、「断片B」と称する)へと連結した。断片Aを断片Bへと連結して得られたDNA断片(以後、「断片A+B」と称する)を、制限酵素KpnIおよびSmaIで消化し、制限酵素KpnIおよびSamIであらかじめ消化したプラスミドpEF6/V5-His B (Invitrogen Corp.)へと連結し、シグナル配列、クローニング部位、ヒトκ鎖定常領域コード配列、ならびにEF1プロモーターの下流にヒトポリ(A)付加シグナル配列を有するヒトL鎖発現プラスミド「pEF6KCL」(図19)を構築した。
8.2.1. pEF1/KCLの構築
上記で説明した方法により得られたプラスミドpEF6KCLを、制限酵素KpnIおよびSmaIで消化した。結果として得られるDNA断片を、KpnIおよびSmaIであらかじめ消化したpEF1/myc-His B (Invitrogen Corp.)へと連結して、プラスミドpEF1/KCLを構築した。
ヒトIgG1 (配列番号4)のシグナル配列および定常領域のアミノ酸配列をコードするDNA配列を含むDNA断片を、制限酵素NheIおよびPmeIで消化し、NheIおよびPmeIであらかじめ消化したプラスミドpEF1/KCLへと連結し、シグナル配列、クローニング部位、ヒト重鎖定常領域コード配列、ならびにEF1プロモーターの下流にヒトポリ(A)付加シグナル配列を有するヒト重鎖発現プラスミドpEF1/FCCU-1を構築した。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のヒト化抗体遺伝子の作製
a) h#11B7-T1L、h#11B7-T2L、h#11B7-T3L、h#11B7-T4L、h#11B7-T5L、h#11B7-T6L、h#11B7-T7L、h#11B7-T8L、h#11B7-T9L、h#11B7-T10L、h#11B7-T11L、h#11B7-T12L、およびh#11B7-T13Lの軽鎖発現ベクターの構築
れぞれ表した。
配列表の配列番号40、41、42、43、44、45、46、47、または48それぞれのアミノ酸20〜132により表されるh#11B7-T1H、h#11B7-T2H、h#11 B7-T3H、h#11B7-T4H、h#11B7-T5H、h#11B7-T6H、h#11B7-T7H、h#11B7-T8H、またはh#11B7-T9Hの重鎖可変領域(図4および5)をコードする遺伝子を含有する各DNAを合成し(MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd、Artificial Gene Synthesis Service)、制限酵素BIpIで消化した。結果として得られるDNA断片を、制限酵素BIpIであらかじめ消化した、ヒト化抗体重鎖を発現させるための汎用ベクター(pEF1/FCCU-1)の部位へと個別に挿入し、これにより、h#11B7-T1H、h#11B7-T2H、h#11B7-T3H、h#11B7-T4H、h#11B7-T5H、h#11B7-T6H、h#11B7-T7H、h#11B7-T8H、およびh#11B7-T9Hの重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、「pEF1/FCCU/h#11B7-T1H」、「pEF1/FCCU/h#11B7-T2H」、「pEF1/FCCU/h#11B7-T3H」、「pEF1/FCCU/h#11B7-T4H」、「pEF1/FCCU/h#11B7-T5H」、「pEF1/FCCU/h#11B7-T6H」、「pEF1/FCCU/h#11B7-T7H」、「pEF1/FCCU/h#11B7-T8H」、または「pEF1/FCCU/h#11B7-T9H」と名付け、各発現ベクターの挿入配列を、配列表の配列番号31、32、33、34、35、36、37、38、または39のヌクレオチド配列によりそれぞれ表した。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のヒト化抗体の調製
a)ヒト化抗体の作製
対数増殖期にあるFreeStyle 293-F細胞1.5×108個を、100mLの新鮮なFreeStyle 293発現培地(Invitrogen Corp.)へと播種し、8% CO2中37℃のインキュベーターにおいて振とう(125rpm)培養した。1mgのポリエチレンイミン(Polyscience #24765)を、4mLのOpti-Pro SFM培地(Invitrogen Corp.)中で溶解させ、室温で5分間静置した。PureLink HiPure Plasmidキット(Invitrogen Corp.)を使用して調製した重鎖発現プラスミド(0.05mg)および軽鎖発現プラスミド(0.15mg)を、4mLのOpti-Pro SFM培地(Invitrogen Corp.)中に懸濁させた。4mLの発現プラスミド/Opti-Pro SFM混合溶液を、4mLのポリエチレンイミン/Opti-Pro SFM混合溶液へと添加し、これにより室温で5分間静置し、さらに室温で5分間静置した。次いで、8mLのポリエチレンイミン/発現プラスミド/Opti-Pro SFM混合溶液を、FreeStyle 293-F細胞懸濁液へと添加し、振とう培養を継続した。8% CO2中37℃で7日間にわたる培養の後、培養物上清を回収した。
前段a)で得られた培養物上清を、プロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。100mLの培養物上清を、キャップつきの500mLフラスコに入れ、これに、PBSで平衡化した1mLのMabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-science Ltd.)懸濁液(50%スラリー)を添加した。10℃のインキュベーターにおいて100rpmで一晩にわたり混合物を撹拌した。FreeStyle 293-F細胞培養物上清/MabSelect SuRe懸濁液を、空の5mLのZeba Spinカラム(PIERCE)へと適用した。全樹脂をカラムに入れ、次いで、10mLの1M NaClで洗浄した。次いで、1mLの1Mアルギニン溶液(pH 4.0)をこれに適用し、抗体含有画分を回収した。この画分をCentrifugal Filter Device (Amicon Ultra-4;分子量カットオフ: 50K; Millipore Corp.)へと添加した後、クエン酸バッファーで溶液を置換し、濃度を200μLへと調整し、精製サンプルを調製した。
pEF6KCL/h#11B7-T2LとpEF1/FCCU/h#11B7-T2Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T2」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T3LとpEF1/FCCU/h#11B7-T3Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T3」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T4LとpEF1/FCCU/h#11B7-T4Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T4」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T5LとpEF1/FCCU/h#11B7-T5Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T5」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T6LとpEF1/FCCU/h#11B7-T6Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T6」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T7LとpEF1/FCCU/h#11B7-T7Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T7」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T8LとpEF1/FCCU/h#11B7-T7Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T8」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T9LとpEF1/FCCU/h#11B7-T7Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T9」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T10LとpEF1/FCCU/h#11B7-T7Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T10」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T11LとpEF1/FCCU/h#11B7-T7Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T11」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T12LとpEF1/FCCU/h#11B7-T7Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T12」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T13LとpEF1/FCCU/h#11B7-T7Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T13」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T7LとpEF1/FCCU/h#11B7-T8Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T14」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T8LとpEF1/FCCU/h#11B7-T8Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T15」と名付けた。pEF6KCUh#11B7-T9LとpEF1/FCCU/h#11B7-T8Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T16」と名付けた。pEF6KCL7h#11B7-T10LとpEF1/FCCU/h#11B7-T8Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T17」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T11LとpEF1/FCCU/h#11B7-T8Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T18」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T12LとpEF1/FCCU/h#11B7-T8Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T19」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T13LとpEF1/FCCU/h#11B7-T8Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T20」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T7LとpEF1/FCCU/h#11B7-T9Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T21」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T8LとpEF1/FCCU/h#11B7-T9Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T22」と名付けた。pEF6KCI_/h#11B7-T9LとpEF1/FCCU/h#11B7-T9Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T23」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T1OLとpEF1/FCCU/h#11B7-T9Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T24」と名付けた。pEF6KCUh#11B7-T11LとpEF1/FCCU/h#11B7-T9Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T25」と名付けた。pEF6KCL/h#11B7-T12LとpEF1/FCCU/h#11B7-T9Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T26」と名付けた。
ならびにpEF6KCL/h#11B7-T13LとpEF1/FCCU/h#11B7-T9Hとを組み合わせることにより得られるヒト化抗体#11B7を、「h#11B7-T27」と名付けた。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11D5のヒト化抗体遺伝子の作製
a)h#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、h#11D5-T4L、h#11D5-T5L、およびh#11D5-T6Lの軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号55、56、57、58、59、または60それぞれのアミノ酸21〜129により表されるh#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、h#11D5-T4L、h#11D5-T5L、およびh#11D5-T6Lの軽鎖可変領域(図6)をコードする遺伝子を含有する各DNAを、分泌シグナル配列と融合させて合成し(MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd、Artificial Gene Synthesis Service)、制限酵素NheIおよびBsiWIで消化した。結果として得られるDNA断片を、制限酵素NheIおよびBsiWIであらかじめ消化した、ヒト化抗体軽鎖を発現させるための汎用ベクター(pEF6KCL)の部位へと個別に挿入し、これにより、h#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、h#11D5-T4L、h#11D5-T5L、およびh#11D5-T6Lの軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、「pEF6KCLh/h#11D5-T1L」、「pEF6KCLh/h#11D5-T2L」、「pEF6KCLh/h#11D5-T3L」、「pEF6KCLh/h#11D5-T4L」、「pEF6KCLh/h#11D5-T5L」、または「pEF6KCLh/h#11D5-T6L」と名付け、各発現ベクターの挿入配列を、配列表の配列番号49、50、51、52、53、または54のヌクレオチド配列によりそれぞれ表した。
配列表の配列番号67、68、69、70、71、または72それぞれのアミノ酸20〜132により表されるh#11D5-T1H、h#11D5-T2H、h#11D5-T3H、h#11D5-T4H、h#11D5-T5H、および#11D5-T6Hの重鎖可変領域(図12)をコードする遺伝子を含有する各DNAを合成し(MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd、Artificial Gene Synthesis Service)、制限酵素BIpIで消化した。結果として得られるDNA断片を、制限酵素BIpIであらかじめ消化した、ヒト化抗体重鎖を発現させるための汎用ベクター(pEF1/FCCU-1)の部位へと個別に挿入し、これにより、h#11D5-T1H、h#11D5-T2H、h#11D5-T3H、h#11D5-T4H、h#11D5-T5H、およびh#11D5-T6Hの重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、「pEF1/FCCU/h#11D5-T1H」、「pEF1/FCCU/h#11D5-T2H」、「pEF1/FCCU/h#11D5-T3H」、「pEF1/FCCU/h#11D5-T4H」、「pEF1/FCCU/h#11D5-T5H」、または「pEF1/FCCU/h#11D5-T6H」と名付け、各発現ベクターの挿入配列を、配列表の配列番号61、62、63、64、65、または66のヌクレオチド配列によりそれぞれ表した。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11D5のヒト化抗体の調製
a)ヒト化抗体の作製
対数増殖期にあるFreeStyle 293-F細胞1.5×108個を、100mLの新鮮なFreeStyle 293発現培地(Invitrogen Corp.)へと播種し、8% CO2中37℃のインキュベーターにおいて振とう(125rpm)培養した。1mgのポリエチレンイミン(Polyscience #24765)を、4mL のOpti-Pro SFM培地(Invitrogen Corp.)中で溶解させ、室温で5分間静置した。PureLink HiPure Plasmidキット(Invitrogen Corp.)を使用して調製した重鎖発現プラスミド(0.05mg)および軽鎖発現プラスミド(0.15mg)を、4mL のOpti-Pro SFM培地(Invitrogen Corp.)中に懸濁させた。4mLの発現プラスミド/Opti-Pro SFM混合溶液を、4mLのポリエチレンイミン/Opti-Pro SFM混合溶液へと添加し、これにより室温で5分間静置し、さらに室温で5分間静置した。次いで、8mLのポリエチレンイミン/発現プラスミド/Opti-Pro SFM混合溶液を、FreeStyle 293-F細胞懸濁液へと添加し、振とう培養を継続した。8% CO2中37℃で7日間にわたる培養の後、培養物上清を回収した。
前段a)で得られた培養物上清を、プロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。100mLの培養物上清を、キャップつきの500mLフラスコに入れ、これに、PBSで平衡化した1mLのMabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-science Ltd.)懸濁液(50%スラリー)を添加した。10℃のインキュベーターにおいて100rpmで一晩にわたり混合物を撹拌した。FreeStyle 293-F細胞培養物上清/MabSelect SuRe懸濁液を、空の5mLのZeba Spinカラム(PIERCE)へと適用した。全樹脂をカラムに入れ、次いで、10mLの1M NaClで洗浄した。次いで、1mLの1Mアルギニン溶液(pH 4.0)をこれに適用し、抗体含有画分を回収した。この画分をCentrifugal Filter Device (Amicon Ultra-4;分子量カットオフ: 50K; Millipore Corp.)へと添加した後、クエン酸バッファーで溶液を置換し、濃縮した。最終容量を200μLへと調整し、精製サンプルを調製した。
ヒトAXL-Fc融合タンパク質に対するラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のヒト化抗体の親和性の評価
以下に示す方法により、ヒトAXL-Fcに対するそれらの親和性について、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7に由来するヒト化抗体h#11B7-T1〜h#11B7-T27を評価した。ヒトAXL-Fc (R&D Systems製; #154-AL)を、PBSにより1μg/mlまで希釈した。次いで、溶液を、100μl/ウエルの量でImmuno Plate (Nalge Nunc International K.K.製; #437111)へと分注し、4℃で一晩にわたり静置し、タンパク質を該プレートへと吸着させた。翌日、ウエルを、PBS-T溶液(PBSおよび0.05% (v/v) Tween 20)で5回洗浄した。次いで、PBSで5%まで希釈したスキムミルク(森永乳業株式会社製)を含有する溶液を、100μl/ウエルの量で分注し、室温で2時間にわたり静置した。ウエル内の溶液を除去し、PBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、実施例10で調製したラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7の精製ヒト化抗体であるT1〜T27を、0.5%スキムミルクを含有するPBS溶液により、1μg/ml〜0.00256ng/ml(5倍希釈系列)の最終濃度で個別に希釈した。次いで、溶液を100μl/ウエルの量で分注し、室温で2時間にわたり静置した。この手順では、実施例15に従い各抗体濃度を決定した。PBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、TBS-T溶液(TBSおよび0.05% (v/v) Tween 20)で2500倍に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲートAffiniPureヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.製; #109-055-097)を、100μl/ウエルの量で添加し、室温で1時間にわたり静置した。ウエル内の溶液を除去し、TBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、蛍光基質溶液(Roche Diagnostics K.K.製; #11681982001)を100μl/ウエルの量で添加し、蛍光反応を起こさせた。蛍光基質溶液を添加した15分後に、SpectraMax M5 (Molecular Devices Corp.製)を使用して、ヒトAXL-Fcを吸着させたプレート上の蛍光強度を測定した。結果として、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のヒト化抗体で検討した27個のサンプルのうち、#11B7-T1およびh#11B7-T4の結合活性が、ヒトキメラ抗体の結合活性より低いことが確認された。しかし、ヒトAXL-Fcタンパク質に対する他の25個のサンプルの結合活性は、抗体濃度依存的な形で、ヒトキメラ抗体の結合活性とほぼ同等であることが確認された(図19、20、21、および22)。
ヒトAXL-Fc融合タンパク質に対するラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11D5のヒト化抗体の親和性の評価
以下に示す方法により、ヒトAXL-Fcに対するそれらの親和性について、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11D5のヒト化抗体h#11D5-T1〜h#11D5-T6を評価した。ヒトAXL-Fc (R&D Systems製; #154-AL)を、PBSにより1μg/mlまで希釈した。次いで、溶液を、100μl/ウエルの量でImmuno Plate (Nalge Nunc International K.K.製; #437111)へと分注し、4℃で一晩にわたり静置し、タンパク質を該プレートへと吸着させた。翌日、ウエルを、PBS-T溶液(PBSおよび0.05% (v/v) Tween 20)で5回洗浄した。次いで、PBSで5%まで希釈したスキムミルク(森永乳業株式会社製)を含有する溶液を、100μl/ウエルの量で分注し、室温で2時間にわたり静置した。ウエル内の溶液を除去し、PBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、実施例12で調製したラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11D5の精製ヒト化抗体であるT1〜T6を、0.5%スキムミルクを含有するPBS溶液により、1μg/ml〜0.00256ng/ml(5倍希釈系列)の最終濃度で個別に希釈した。次いで、溶液を100μl/ウエルの量で分注し、室温で2時間にわたり静置した。この手順では、実施例15に従い各抗体濃度を決定した。PBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、TBS-T溶液(TBSおよび0.05% (v/v) Tween 20)で2500倍に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲートAffiniPureヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.製; #109-055-097)を、100μl/ウエルの量で添加し、室温で1時間にわたり静置した。ウエル内の溶液を除去し、TBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、蛍光基質溶液(Roche Diagnostics K.K.製; #11681982001)を100μl/ウエルの量で添加し、蛍光反応を起こさせた。蛍光基質溶液を添加した15分後に、SpectraMax M5 (Molecular Devices Corp.製)を使用して、ヒトAXL-Fcを吸着させたプレート上の蛍光強度を測定した。結果として、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11D5のヒト化抗体で検討した6個のサンプルのうち、h#11D5-T4、h#11D5-T5、およびh#11D5-T6の結合活性が、抗体濃度依存的な形で、ヒトキメラ抗体の結合活性とほぼ同等であることが確認された(図23)。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7および#11D5のヒト化抗体についての吸収係数の計算および直接的タンパク質吸光度アッセイ
以下に示すプロトコルにより、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7に由来するヒト化抗体h#11B7-T1〜h#11B7-T27、ならびにラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11D5に由来するヒト化抗体h#11D5-T1〜h#11D5-T6のタンパク質濃度を決定した。MX5 Automated-S微量天秤(METTLER TOLEDO)を使用して、実施例10または12でそれぞれ調製したラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7または#11D5の各ヒト化抗体を、その質量に応じて希釈した。室温で、水晶セルを使用するDU-7400 UV-可視光分光光度計(Beckman Coulter, Inc.)により、各抗体の280nmにおける吸光度(Ab280)を測定した。吸収係数により、各抗体のタンパク質濃度を決定した。各抗体の吸収係数は、米国国立衛生研究所のウェブサイト(http://iphilo.mailway.com/download.htm)からダウンロードしうる、ソフトウェアSednterpを使用して決定した。結果を、図24 (h#11B7-T1〜h#11B7-T14については上パネル; h#11B7-T15〜h#11B7-T27については下パネル)および図25 (h#11D5-T1〜h#11D5-T6について)に示す。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7の結合部位(エピトープ)の決定
a)ヒトAXLタンデムIGドメインの発現および精製
N末端Hisタグおよびトロンビン認識配列へと連結された、ヒトAXL IGドメイン(NCBIタンパク質データベース受託番号第P_30530号:配列番号139のアミノ酸26〜220)を含むタンパク質をコードするDNAを、ベクターpDEST14 (Invitrogen Corp.;型番11801-016)に組み込んだ。このプラスミドにより、大腸菌Rosetta-gami B (DE3) (Novagen;型番71136-4)を形質転換し、TB培地(Invitrogen Corp.;型番22711-022)中で培養した。このようにして培養した細菌細胞を超音波により破壊し、遠心分離し、HisTrap HPカラム(GE Healthcare;型番17-5247-01)を使用して上清を精製した。溶出物をプールし、PD-10カラム(GE Healthcare;型番17-0851-01)により脱塩化し、次いで、トロンビン(Sigma-Aldrich;型番T-7009)によりHisタグを切断した。次いで、分子量21kDaの1つのバンドが得られるまで、切断されたタンパク質を、MONO Q 5/50 GL (GE Healthcare;型番17-5166-01)カラム、およびSuperdex 75 10/300カラム(GE Healthcare;型番17-5174-01)にかけた。
N末端Hisタグおよび因子Xa認識配列へと連結された、ヒトAXL IGドメイン(NCBIタンパク質データベース受託番号第P_30530号のアミノ酸26〜131および129〜220)を含むタンパク質をコードするDNAを、ベクターpDEST14 (Invitrogen Corp.;型番11801-016)に組み込んだ。このプラスミドにより、大腸菌Rosetta-gami B (DE3) (Novagen;型番71136-4)を形質転換し、TB培地(Invitrogen Corp.;型番22711-022)中で培養した。このようにして培養された細菌細胞を超音波により破壊し、遠心分離し、HisTrap HPカラム(GE Healthcare;型番17-5247-01)を使用して上清を精製した。次いで、分子量11kDaの1つのバンドが得られるまで、Superdex 75 10/300カラム(GE Healthcare;型番17-5174-01)を使用する電気泳動により、ヒトAXL IGドメインを精製した。
以下の方法により、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7に対するヒトAXL-IGドメインにおける結合部位(エピトープ)を評価した。ヒトAXLにおける2つのIGドメイン(NHis-hAXL26〜131およびNHis-hAXL129〜220)のうちのいずれかを含有するペプチドと、ヒトAXLにおける2つのIGドメインの両方(hAXL26〜220)を含有するペプチドとを、PBSにより個別に1μg/mlまで希釈した。次いで、溶液を、100μl/ウエルの量でImmuno Plate (Nalge Nunc International K.K.製; #437111)へと分注し、4℃で一晩にわたり静置し、タンパク質を該プレートへと吸着させた。翌日、ウエルを、PBS-T溶液(PBSおよび0.05% (v/v) Tween 20)で5回洗浄した。次いで、PBSで5%まで希釈したスキムミルク(森永乳業株式会社製)を含有する溶液を、100μl/ウエルの量で分注し、室温で2時間にわたり静置した。ウエル内の溶液を除去し、PBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7を、0.5%スキムミルクを含有するPBS溶液により、0.04μg/mlまで希釈した。次いで、溶液を100μl/ウエルの量で分注し、室温で2時間にわたり静置した。PBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、TBS-T溶液(TBSおよび0.05% (v/v) Tween 20)で2500倍に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲートAffiniPureヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.製; #109-055-097)を、100μl/ウエルの量で添加し、室温で1時間にわたり静置した。ウエル内の溶液を除去し、TBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、蛍光基質溶液(Roche Diagnostics K.K.製; #11681982001)を100μl/ウエルの量で添加し、蛍光反応を起こさせた。蛍光基質溶液を添加した15分後に、SpectraMax M5 (Molecular Devices Corp.製)を使用して、ヒトAXL-IGドメインを吸着させたプレート上の蛍光強度を測定した。ELISAの結果として、hAXL26〜220およびNHis-hAXL129〜220だけが、結合活性を有することが確認された。したがって、ヒトAXLにおける2つのIGドメインのうちで、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のエピトープは、カルボキシ末端により近接するドメイン(NCBIタンパク質データベース受託番号第P_30530号:配列番号139(図30A)のアミノ酸番号129〜220のアミノ酸残基を含むドメイン)であることが実証された(図26)。
本発明のヒト化抗AXL抗体はin vitroでリガンド誘導性AXLリン酸化を阻害する
増殖停止特異的遺伝子6 (Gas6)によりコードされるタンパク質は、受容体チロシンキナーゼAXLの天然リガンドを表す。Gas6がAXLに結合すると、結果として受容体が活性化され、これは、受容体チロシンキナーゼリン酸化レベルの上昇により反映される。実施例17で説明する実験は、本発明のヒト化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6が、受容体チロシンキナーゼAXLのGas6介在性活性化を妨げる可能性を対象とするように設定した。
ELISAにより決定される通り、本発明のヒト化抗AXL抗体はin vitroでリガンド誘導性AXLリン酸化を阻害する
ELISA実験を実施して、本発明のヒト化抗AXL抗体がリガンドGas6誘導性AXLリン酸化を阻害することができるかどうか調べた。簡潔には、第1日に、平底96ウエルプレートの通常増殖培地中にウエル当たり3×104個の細胞を播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。さらに一晩にわたり、2μg/mlのPBSおよび4℃で、マウス抗ホスホチロシン抗体4G10により、黒色Maxi-Sorp 96ウエルプレート(Nunc)をコーティングした。第3日に、4G10抗体溶液を除去し、室温において少なくとも4時間にわたり、PBS、0.5% BSAでMaxi-Sorpウエルをブロッキングした。平行して、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Sigma)、キメラ抗AXL mAb #11B7、ならびにヒト化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。次いで、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させた。一方、ブロッキングバッファーを除去し、Maxi-Sorpプレートを洗浄バッファー(PBS、0.05%のTween 20)で6回洗浄した後に、溶解物を移動させて4℃で一晩インキュベートした。第4日にプレートを洗浄バッファーで6回洗浄した後、室温中0.5μg/mlのPBSで2時間、ウエルをビオチニル化ラット抗AXL抗体12B7と共にインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで6回洗浄し、PBS中で1:4,000に希釈したAPコンジュゲートストレプトアビジン(Chemicon #SA110)を各ウエルに添加し、室温で30分間インキュベートした。その後、ウエルを洗浄バッファーで6回洗浄し、AttoPhos基質溶液(Roche #11681982)を添加した。Victorプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、430nmの励起波長および580nmの発光波長において各ウエルの蛍光を捕集した。
ウェスタンブロット分析により決定される通り、本発明のヒト化抗AXL抗体はin vitroでリガンド誘導性AXLリン酸化を阻害する
さらに、ウェスタンブロット分析を実施して、ヒト化抗体が、リガンドGas6誘導性AXL活性化を妨げる能力を確認した。この目的で、第1日に、1.5×106個のHs578T乳癌細胞を10cm培養皿上に播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。第3日に、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Sigma)、キメラ抗AXL mAb #11B7、ならびにヒト化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。その後、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した1mlの溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させ、10,000×gおよび4℃で10分間の遠心分離により細胞破砕物を除去した。免疫沈降のため、上清のタンパク質濃度を決定し、500μgの全細胞溶解物を、回転ホイール上4℃で3時間、30μlのプロテインA-セファロース懸濁液、ならびに1μgのラット抗AXLモノクローナル抗体12B7と共にインキュベートした。0.7mlの冷却HNTGバッファー(20mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、0.1%のTriton X-100、10%のグリセロール、および10mMのNa4P2O7)で3回沈殿物を洗浄し、40μlの3倍濃度SDS Laemmliサンプルバッファー中に懸濁させ、これを煮沸し、SDS PAGEにかけた。ウェスタンブロット分析のため、タンパク質をニトロセルロース膜へと移した。その後、NET-ゼラチンで膜をブロッキングし、マウスモノクローナル抗ホスホチロシン一次抗体4G10 (Upstate)と共に一晩インキュベートした。翌日、NET-ゼラチンで3回洗浄した後、膜をHRPコンジュゲート抗マウス二次抗体と共に室温で1時間インキュベートし、次いで、NET-ゼラチンによりさらに3回洗浄した。製造元の指示書(GE Healthecare)に従って化学発光検出キットを適用し、最後にフィルターをフィルム(Kodak)へと曝露した。その後、同じフィルターを、抗AXL抗体により再プローブした。
本発明のヒト化抗AXL抗体はin vitroでAXL下流のシグナル伝達分子のリガンド誘導性リン酸化を阻害する
受容体チロシンキナーゼAxlのGas6誘導性活性化は、Axl自体のチロシンリン酸化レベルの上昇により反映されるだけでなく、ERK1/2経路およびPKB/AKT経路を含め、下流のシグナル伝達カスケードの誘導とも関連する。したがって、本発明者らは、本発明のヒト化抗Axl抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6が、ERK1およびERK2ならびにAKTのGas6介在性活性化を妨げる可能性を対象とする実験を継続した。さらに、本発明者らは、Gas6により刺激されると、シグナル伝達分子GSK-3β、TSC2、mTOR、およびS6K1のリン酸化状態が調節されることも見出し、このため、これらの分子に対する本発明のヒト化抗Axl抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6の阻害効果も調べた。
本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性ERK1/2リン酸化を阻害する
ウェスタンブロット分析を実施して、本発明のヒト化抗体が、Gas6誘導性ERK1/2活性化を妨げる可能性を有するかどうか調べた。Gas6介在性ERK1/2活性化は、その位置Thr202およびTyr204におけるリン酸化レベルの上昇により反映される。この目的で、第1日に、5×106個のHs578T乳癌細胞または3×106個のNCI-H292肺癌細胞を10cm培養皿上に播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。第3日に、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Baxter)、キメラ抗Axl mAb chm11B7、ならびにヒト化抗Axl抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。その後、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した800μlの溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させ、10,000×gおよび4℃で10分間の遠心分離により細胞破砕物を除去した。上清のタンパク質濃度を決定し、50μgの全細胞溶解物を、3倍濃度SDS Laemmliサンプルバッファー中に懸濁させ、これを煮沸し、SDS PAGEにかけた。タンパク質を、ニトロセルロース膜へと移したら、NET-ゼラチンにより膜をブロッキングし、ウサギポリクローナル抗ホスホp44/42 MAPキナーゼ(Thr202/Tyr204)一次抗体(Cell Signaling Technologies; #9101)と共に一晩インキュベートした。翌日、NET-ゼラチンにより3回洗浄した後、膜をHRPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(Dianova; #111-036-045)と共に室温で1時間インキュベートし、次いで、NET-ゼラチンによりさらに3回洗浄した。製造元の指示書(GE Healthecare)に従って化学発光検出キットを適用し、最後にフィルターをフィルム(Kodak)へと曝露した。その後、同じフィルターを、抗p44/42 MAPキナーゼ抗体(Santa Cruz; K-23、#sc-153)により再プローブした。
本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性AKTリン酸化を阻害する
ウェスタンブロット分析を実施して、本発明のヒト化抗体が、Gas6誘導性AKT活性化を妨げる可能性を有するかどうか調べた。それにより、Gas6介在性AKT活性化は、その位置Ser473位におけるリン酸化レベルの上昇により反映される。この目的で、第1日に、5×106個のHs578T乳癌細胞または3×106個のNCI-H292肺癌細胞を10cm培養皿上に播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。第3日に、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Baxter)、キメラ抗Axl mAb chm11B7、ならびにヒト化抗Axl抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。その後、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した800μlの溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させ、10,000×gおよび4℃で10分間の遠心分離により細胞破砕物を除去した。上清のタンパク質濃度を決定し、50μgの全細胞溶解物を、3倍濃度SDS Laemmliサンプルバッファー中に懸濁させ、これを煮沸し、SDS PAGEにかけた。タンパク質を、ニトロセルロース膜へと移したら、NET-ゼラチンにより膜をブロッキングし、ウサギポリクローナル抗AKT1/2/3一次抗体(Cell Signaling Technologies; #9272)と共に一晩インキュベートした。翌日、NET-ゼラチンにより3回洗浄した後、膜をHRPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(Dianova; #111-036-045)と共に室温で1時間インキュベートし、次いで、NET-ゼラチンによりさらに3回洗浄した。製造元の指示書(GE Healthecare)に従って化学発光検出キットを適用し、最後にフィルターをフィルム(Kodak)へと曝露した。その後、同じフィルターを、抗ホスホAKT(Ser473)抗体(Cell Signaling Technologies; #9271)により再プローブした。
本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性GSK-3βリン酸化を阻害する
ウェスタンブロット分析を実施して、本発明のヒト化抗体が、Gas6誘導性GSK-3β活性化を妨げる可能性を有するかどうか調べた。Gas6誘導性GSK-3β活性化は、その位置Ser9位におけるリン酸化レベルの上昇により反映される。この目的で、第1日に、5×106個のHs578T乳癌細胞または3×106個のNCI-H292肺癌細胞を10cm培養皿上に播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。第3日に、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Baxter)、キメラ抗Axl mAb chm11B7、ならびにヒト化抗Axl抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。その後、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した800μlの溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させ、10,000×gおよび4℃で10分間の遠心分離により細胞破砕物を除去した。上清のタンパク質濃度を決定し、50μgの全細胞溶解物を、3倍濃度SDS Laemmliサンプルバッファー中に懸濁させ、これを煮沸し、SDS PAGEにかけた。タンパク質を、ニトロセルロース膜へと移したら、NET-ゼラチンにより膜をブロッキングし、ウサギポリクローナル抗ホスホ-GSK-3β(Ser9)一次抗体(Cell Signaling Technologies; #9336)と共に一晩インキュベートした。翌日、NET-ゼラチンにより3回洗浄した後、膜をHRPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(Dianova; #111-036-045)と共に室温で1時間インキュベートし、次いで、NET-ゼラチンによりさらに3回洗浄した。製造元の指示書(GE Healthecare)に従って化学発光検出キットを適用し、最後にフィルターをフィルム(Kodak)へと曝露した。その後、同じフィルターを、抗GSK-3β抗体(Becton Dickinson; #610201)およびHRPコンジュゲート抗マウス二次抗体(Dianova; #315-036-045)により再プローブした。
本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性TSC2リン酸化を阻害する
ウェスタンブロット分析を実施して、本発明のヒト化抗体が、そのアミノ酸残基Thr1462におけるGas6誘導性TSC2リン酸化およびPI3K/AKT介在性TSC2リン酸化を妨げる可能性を有するかどうか調べた。Thr1462におけるTSC2リン酸化は一般に、TSC複合体の腫瘍抑制機能の阻害と関連し、結果として、下流のmTOR経路の活性化の阻害と関連する。簡潔には、第1日に、5×106個のHs578T乳癌細胞または3×106個のNCI-H292肺癌細胞を10cm培養皿上に播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。第3日に、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Baxter)、キメラ抗Axl mAb chm11B7、ならびにヒト化抗Axl抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。その後、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した800μlの溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させ、10,000×gおよび4℃で10分間の遠心分離により細胞破砕物を除去した。上清のタンパク質濃度を決定し、50μgの全細胞溶解物を、3倍濃度SDS Laemmliサンプルバッファー中に懸濁させ、これを煮沸し、SDS PAGEにかけた。タンパク質を、ニトロセルロース膜へと移したら、NET-ゼラチンにより膜をブロッキングし、ウサギポリクローナル抗TSC2一次抗体(Cell Signaling Technologies; #3612)と共に一晩インキュベートした。翌日、NET-ゼラチンにより3回洗浄した後、膜をHRPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(Dianova; #111-036-045)と共に室温で1時間インキュベートし、次いで、NET-ゼラチンによりさらに3回洗浄した。製造元の指示書(GE Healthecare)に従って化学発光検出キットを適用し、最後にフィルターをフィルム(Kodak)へと曝露した。その後、同じフィルターを、抗ホスホTSC2(Thr1462)抗体(Cell Signaling Technologies; #3617)により再プローブした。
本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性mTORリン酸化を阻害する
TSC2リン酸化に対する効果を踏まえ、ウェスタンブロット分析を実施して、本発明のヒト化抗体がまた、Gas6誘導性mTOR活性化も妨げる可能性を有するかどうか調べた。Gas6介在性mTOR活性化は、その位置Ser2448位におけるリン酸化レベルの上昇により反映される。この目的で、第1日に、5×106個のHs578T乳癌細胞または3×106個のNCI-H292肺癌細胞を10cm培養皿上に播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。第3日に、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Baxter)、キメラ抗Axl mAb chm11B7、ならびにヒト化抗Axl抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。その後、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した800μlの溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させ、10,000×gおよび4℃で10分間の遠心分離により細胞破砕物を除去した。上清のタンパク質濃度を決定し、50μgの全細胞溶解物を、3倍濃度SDS Laemmliサンプルバッファー中に懸濁させ、これを煮沸し、SDS PAGEにかけた。タンパク質を、ニトロセルロース膜へと移したら、NET-ゼラチンにより膜をブロッキングし、ウサギポリクローナル抗ホスホmTOR(Ser2448)一次抗体(Cell Signaling Technologies; #2971)と共に一晩インキュベートした。翌日、NET-ゼラチンにより3回洗浄した後、膜をHRPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(Dianova; #111-036-045)と共に室温で1時間インキュベートし、次いで、NET-ゼラチンによりさらに3回洗浄した。製造元の指示書(GE Healthecare)に従って化学発光検出キットを適用し、最後にフィルターをフィルム(Kodak)へと曝露した。その後、同じフィルターを、抗mTORキナーゼ抗体(Cell Signaling Technologies; #2972)により再プローブした。
本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性S6K1リン酸化を阻害する
最後に、ウェスタンブロット分析を実施して、本発明のヒト化抗体が、Gas6誘導性S6K1活性化を妨げる可能性を有するかどうか調べた。Gas6介在性S6K1活性化は、その位置Thr421およびSer424におけるリン酸化レベルの上昇により反映される。この目的で、第1日に、5×106個のHs578T乳癌細胞または3×106個のNCI-H292肺癌細胞を10cm培養皿上に播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。第3日に、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Baxter)、キメラ抗Axl mAb chm11B7、ならびにヒト化抗Axl抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。その後、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した800μlの溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させ、10,000×gおよび4℃で10分間の遠心分離により細胞破砕物を除去した。上清のタンパク質濃度を決定し、50μgの全細胞溶解物を、3倍濃度SDS Laemmliサンプルバッファー中に懸濁させ、これを煮沸し、SDS PAGEにかけた。タンパク質を、ニトロセルロース膜へと移したら、NET-ゼラチンにより膜をブロッキングし、ウサギポリクローナル抗ホスホp70 S6キナーゼ1(Thr421/Ser424)一次抗体(Cell Signaling Technologies; #9204)と共に一晩インキュベートした。翌日、NET-ゼラチンにより3回洗浄した後、膜をHRPコンジュゲート抗ウサギ二次抗体(Dianova; #111-036-045)と共に室温で1時間インキュベートし、次いで、NET-ゼラチンによりさらに3回洗浄した。製造元の指示書(GE Healthecare)に従って化学発光検出キットを適用し、最後にフィルターをフィルム(Kodak)へと曝露した。その後、同じフィルターを、抗β-アクチン抗体(Cell Signaling Technologies; #4967)により再プローブした。
ELISAにより決定される通り、本発明のヒト化11D5抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性Axlリン酸化を阻害する
ヒト化抗Axl mAbシリーズであるh#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、およびh#11B7-T6の特徴づけに加え、ELISA実験を実施して、本発明のヒト化抗Axl抗体h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5、およびh#11D5-T6が、受容体チロシンキナーゼAxlのGas6誘導性リン酸化を妨げ、したがって、受容体チロシンキナーゼAxlのGas6誘導性活性化を妨げる可能性を調べた。簡潔には、第1日に、平底96ウエルプレートの通常増殖培地中にウエル当たり3×104個のHs578T乳癌細胞を接種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。さらに一晩にわたり、2μg/mlのPBSおよび4℃で、マウス抗ホスホチロシン抗体4G10により、黒色Maxi-Sorp 96ウエルプレート(Nunc)をコーティングした。第3日に、4G10抗体溶液を除去し、室温において少なくとも4時間にわたり、ブロッキングバッファー(PBS、0.5% BSA)でMaxi-Sorpウエルをブロッキングした。平行して、細胞を、37℃で3時間、10μg/mlのGammagard対照抗体(Baxter)、キメラ抗Axl mAb chm11D5、ならびにヒト化抗Axl抗体h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5、およびh#11D5-T6と共にプレインキュベートし、次いで、37℃で15分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。次いで、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した、ウエル当たり110μlの溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させた。一方、ブロッキングバッファーを除去し、Maxi-Sorpプレートを洗浄バッファー(PBS、0.05%のTween 20)で6回洗浄した後に、各ウエル100μlずつの溶解物を移動させて4℃で一晩インキュベートした。第4日にプレートを洗浄バッファーで6回洗浄した後、ウエルを、室温で2時間、0.125μg/mlの希釈バッファー(20mMのトリス、50mMのNaCl、pH7.3、0.05% Tween 20、0.1% BSA)中のビオチニル化ラット抗Axl抗体12B7と共にインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで6回洗浄し、希釈バッファー中で1:20000に希釈したAPコンジュゲートストレプトアビジン(Chemicon #SA110)を各ウエルに添加し、室温で30分間インキュベートした。その後、ウエルを洗浄バッファーで6回洗浄し、AttoPhos基質溶液(Roche #11681982)を添加した。SpectraMax-GeminiEMプレートリーダー(Molecular Devices)を使用して、430nmの励起波長および580nmの発光波長において各ウエルの蛍光を捕集した。
本発明のラット抗Axl抗体およびキメラ抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性Axlリン酸化を同程度に阻害する
ラット抗Axl抗体11B7および11D5のキメラ派生物を本発明の一部として生成させた(上記参照)。本発明のラット抗Axl抗体、ならびに本発明の対応するキメラ抗Axl抗体が、in vitroにおいてリガンドGas6介在性Axl活性化を同程度に阻害することができるかどうか調べるために、CaSki子宮頸癌細胞においてELISA実験を実施した。これにより、増大した受容体チロシンのリン酸化を介してGas6介在性Axl活性化を検出した。簡潔には、第1日に、平底96ウエルプレートの通常増殖培地中にウエル当たり3×104個の細胞を播種した。翌日、増殖培地を無血清培地で置換して、一晩24時間にわたり細胞を飢餓状態にした。さらに一晩にわたり、2μg/mlのPBSおよび4℃で、マウス抗ホスホチロシン抗体4G10により、黒色Maxi-Sorp 96ウエルプレート(Nunc)をコーティングした。第3日に、4G10抗体溶液を除去し、室温において少なくとも4時間にわたり、PBS、0.5% BSAでMaxi-Sorpウエルをブロッキングした。平行して、細胞を、37℃で1時間、50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml、および10μg/mlのラット抗Axl抗体11B7またはキメラ抗Axl抗体ch11B7と共にプレインキュベートし、後に37℃で10分間、400ng/mlのGas6 (R&D Systems)を伴うかまたは伴わずに処理した。次いで、培地を除去し、氷上で30分間、ホスファターゼ阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤(10mMのNa4P2O7、1mMのフェニルメチルスルホニルフロリド、1mMのオルトバナジウム酸、1mMのNaF、および0.5%のアプロチニン)を補充した溶解バッファー(50mMのHEPES、pH7.5、150mMのNaCl、1mMのEDTA、10%のグリセリン、および1%のTriton X-100)中で細胞を溶解させた。一方、ブロッキングバッファーを除去し、Maxi-Sorpプレートを洗浄バッファー(PBS、0.05%のTween 20)で6回洗浄した後に、溶解物を移動させて4℃で一晩インキュベートした。第4日にプレートを洗浄バッファーで6回洗浄した後、室温中0.5μg/mlのPBSで2時間、ウエルをビオチニル化ラット抗Axl抗体12B7と共にインキュベートした。プレートを洗浄バッファーで6回洗浄し、PBS中で1:4,000に希釈したAPコンジュゲートストレプトアビジン(Chemicon #SA110)を各ウエルに添加し、室温で30分間インキュベートした。その後、ウエルを洗浄バッファーで6回洗浄し、AttoPhos基質溶液(Roche #11681982)を添加した。Victorプレートリーダー(Perkin Elmer)を使用して、430nmの励起波長および580nmの発光波長において各ウエルの蛍光を捕集した。図31は、子宮頸癌細胞系CaSkiについての、この実験の代表的な結果を示す。相対的Axlリン酸化の濃度依存的な低減によって実証されるように、本発明のラット抗Axl抗体11B7 (A)、ならびに本発明のキメラ抗Axl抗体ch11B7 (B)は、受容体チロシンキナーゼAxlのリガンド誘導性活性化を同程度に阻害することができた。メラノーマ細胞系C-8161でも、同じ実験設定を適用して同等の効果を観察した。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のヒト化抗体遺伝子の作製
a)h#11B7-T15Lおよびh#11B7-T18Lの軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号146または147それぞれのアミノ酸21〜129により表される#11B7-T15Lまたはh#11B7-T18Lの軽鎖可変領域(図32A)をコードする遺伝子を含有する各DNAを、分泌シグナル配列と融合させて合成し(MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd、Artificial Gene Synthesis Service)、制限酵素NheIおよびBsiWIで消化した。結果として得られるDNA断片を、制限酵素NheIおよびBsiWIであらかじめ消化した、ヒト化抗体軽鎖を発現させるための汎用ベクター(pEF6KCL)の部位へと個別に挿入し、これにより、h#11B7-T15Lおよびh#11B7-T18Lの軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、「pEF6KCL/h#11B7-T15L」または「pEF6KCL/h#11B7-T18L」と名付け、各発現ベクターの挿入配列を、配列表の配列番号144または145のヌクレオチド配列によりそれぞれ表した。
配列表の配列番号150または151それぞれのアミノ酸20〜132により表されるh#11B7-T11Hおよびh#11B7-T12Hの重鎖可変領域(図32B)をコードする遺伝子を含有する各DNAを合成し(MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd、Artificial Gene Synthesis Service)、制限酵素BIpIで消化した。結果として得られるDNA断片を、制限酵素BIpIであらかじめ消化した、ヒト化抗体重鎖を発現させるための汎用ベクター(pEF1/FCCU-1)の部位へと個別に挿入し、これによりh#11B7-T11Hおよびh#11B7-T12Hの重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを、「pEF1/FCCU/h#11B7-T11H」または「pEF1/FCCU/h#11B7-T12H」と名付け、各発現ベクターの挿入配列を、配列表の配列番号148または149のヌクレオチド配列によりそれぞれ表した。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のヒト化抗体の調製
a)ヒト化抗体の作製
実施例10のa)参照。
前段a)で得られた培養物上清を、プロテインAアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製した。100mLの培養物上清を、キャップつきの500mLフラスコに入れ、これに、PBSで平衡化した1mLのMabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-science Ltd.)懸濁液(50%スラリー)を添加した。10℃のインキュベーターにおいて100rpmで一晩にわたり混合物を撹拌した。FreeStyle 293-F細胞培養物上清/MabSelect SuRe懸濁液を、空の5mLのZeba Spinカラム(PIERCE)へと適用した。全樹脂をカラムに入れ、次いで、10mLの1M NaClで洗浄した。次いで、1mLの1Mアルギニン溶液(pH 4.0)をこれに適用し、抗体含有画分を回収した。この画分をCentrifugal Filter Device (Amicon Ultra-4;分子量カットオフ: 50K; Millipore Corp.)へと添加した後、クエン酸バッファーで溶液を置換し、濃度を200μLへと調整し、精製サンプルを調製した。
ヒトAXL-Fc融合タンパク質に対するラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のヒト化抗体の親和性の評価
以下に示す方法により、ヒトAXL-Fcに対するそれらの親和性について、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7に由来するヒト化抗体h#11B7-T28〜h#11B7-T31を評価した。ヒトAXL-Fc (R&D Systems製; #154-AL)を、PBSにより1μg/mlまで希釈した。次いで、溶液を、100μl/ウエルの量でImmuno Plate (Nalge Nunc International K.K.製; #437111)へと分注し、4℃で一晩にわたり静置し、タンパク質を該プレートへと吸着させた。翌日、ウエルを、PBS-T溶液(PBSおよび0.05% (v/v) Tween 20)で5回洗浄した。次いで、PBSで5%まで希釈したスキムミルク(森永乳業株式会社製)を含有する溶液を、100μl/ウエルの量で分注し、室温で2時間にわたり静置した。ウエル内の溶液を除去し、PBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、実施例10で調製したラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7の精製ヒト化抗体であるT28〜T31を、0.5%スキムミルクを含有するPBS溶液により、1μg/ml〜0.00256ng/ml(5倍希釈系列)の最終濃度で個別に希釈した。次いで、溶液を100μl/ウエルの量で分注し、室温で2時間にわたり静置した。この手順では、実施例15に従い各抗体濃度を決定した。PBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、TBS-T溶液(TBSおよび0.05% (v/v) Tween 20)で2500倍に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲートAffiniPureヤギ抗ヒトIgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.製; #109-055-097)を、100μl/ウエルの量で添加し、室温で1時間にわたり静置した。ウエル内の溶液を除去し、TBS-T溶液で5回ウエルを洗浄した。次いで、蛍光基質溶液(Roche Diagnostics K.K.製; #11681982001)を100μl/ウエルの量で添加し、蛍光反応を起こさせた。蛍光基質溶液を添加した15分後に、SpectraMax M5 (Molecular Devices Corp.製)を使用して、ヒトAXL-Fcを吸着させたプレート上の蛍光強度を測定した。結果として、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体h#11B7-T28〜#11B7-T31のヒト化抗体の結合活性が、抗体濃度依存的な形で、ヒトキメラ抗体の結合活性とほぼ同等であることが確認された(図19および33)。
ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7のヒト化抗体についてのHPLCアッセイ
以下に示すプロトコルにより、ラット抗ヒトAXLモノクローナル抗体#11B7に由来するヒト化抗体h#11B7-T28〜h#11B7-T31のタンパク質濃度を決定した。各ヒト化抗体サンプルをサイズ排除カラム(Tosoh SW3000XL)へと注入し、IgG1型ヒト化抗ヒトDR5モノクローナル抗体であるチガツズマブのサンプルを基準物質として使用して、結果として得られる各抗体のHPLC (Agilent 1200 SL)ピーク面積および吸収係数により、タンパク質濃度を決定した。チガツズマブ抗体の基準サンプル濃度は、実施例15で説明した直接的吸収プロトコルにより決定した。結果を、図34にまとめる。
示差走査熱量測定(DSC)を使用するヒト化抗体の熱安定性の測定
抗体の特性を比較するための指標の一例には、抗体の安定性が含まれうる。抗体の安定性の指標の例には、熱安定性が含まれうる。
h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、h#11B7-T6、h#11B7-T7、h#11B7-T8、h#11B7-T9、h#11B7-T10、h#11B7-T11、h#11B7-T12、h#11B7-T13、h#11B7-T14、h#11B7-T15、h#11B7-T16、h#11B7-T17、h#11B7-T18、#11B7-T19、h#11B7-T20、h#11B7-T21、h#11B7-T22、h#11B7-T23、h#11B7-T24、h#11B7-T25、h#11B7-T26、h#11B7-T27、h#11B7-T28、h#11B7-T29、h#11B7-T30、h#11B7-T31、およびキメラ11B7を、それらの熱安定性について測定した。これらのサンプルを0.5mg/mLの濃度(CBS溶液)へと個別に調整し、それらの400μLのアリコートを、DSC測定におけるサンプル溶液として使用した。DSCの測定条件は、以下:初期温度: 20℃、最終温度: 100℃、および温度上昇速度: 60℃/1時間、および濾過時間: 10秒間の通りに設定した。CBSを基準溶液として使用した。MicroCal Inc.、US製のVP-Capillary DSC Platformを、DSC測定装置として使用した。サンプル溶液から得られる走査曲線から、ベースライン(基準溶液をサンプルセルにチャージすることにより得られる走査曲線)を差し引くことにより、ベースライン補正を行った。
h#11B7-T2のTmは77.2℃であり;h#11B7-T3のTmは73.0℃であり;h#11B7-T4のTmは70.2℃であり;h#11B7-T5のTmは73.1℃であり;h#11B7-T6のTmは79.O℃であり;h#11B7-T7のTmは76.5℃であり;h#11B7-T8のTmは83.5℃であり;h#11B7-T9のTmは82.5℃であり;h#11B7-T10のTmは77.4℃であり;h#11B7-T11のTmは83.5℃であり;h#11B7-T12のTmは76.6℃であり;h#11B7-T13のTmは77.6℃であり;h#11B7-T14のTmは75.8℃であり;h#11B7-T15のTmは83.1℃であり;h#11B7-T16のTmは82.2℃であり;h#11B7-T17のTmは76.6℃であり;h#11B7-T18のTmは83.O℃であり;h#11B7-T19のTmは75.9℃であり;h#11 B7-T20のTmは76.9℃であり;h#11B7-T21のTmは76.6℃であり;h#11B7-T22のTmは83.6℃であり;h#11B7-T23のTmは83.0℃であり;h#11B7-T24のTmは77.6℃であり;h#11B7-T25のTmは83.9℃であり;h#11B7-T26のTmは76.9℃であり;h#11B7-T27のTmは77.9℃であり;h#11B7-T28のTmは77.4℃であり;h#11B7-T29のTmは77.4℃であり;h#11B7-T30のTmは77.8℃であり;h#11B7-T31のTmは77.9℃であり;
キメラh#11B7のTmは73.1℃である。
ELISAにより決定される通り、本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性Axlリン酸化を阻害する
増殖停止特異的遺伝子6 (Gas6)によりコードされるタンパク質は、受容体チロシンキナーゼAxlの天然リガンドを表す。Gas6がAxlに結合すると、結果として受容体が活性化され、これは、受容体チロシンキナーゼリン酸化レベルの上昇により反映される。ELISA実験を実施して、本発明のヒト化抗Axl抗体11B7-T5および11B7-T6、ならびに11B7-T6の派生物11B7-T11、11B7-T23、および11B7-T25が、Gas6誘導性リン酸化を阻害し、したがって、受容体チロシンキナーゼAxlの活性化を阻害する可能性を調べた。
ELISAにより決定される通り、本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はin vitroでリガンド誘導性Aktリン酸化を阻害する
さらに、ELISA実験を実施して、本発明のヒト化抗Axl抗体11B7-T5および11B7-T6、ならびに11B7-T6の派生物11B7-T11、11B7-T23、および11B7-T25が、リガンドGas6介在性Aktキナーゼ活性化を阻害することができるかどうか調べた。増大したタンパク質(Ser473)のリン酸化を介してGas6介在性Aktキナーゼ活性化を検出した。
本発明のヒト化11B7抗Axl抗体はAxl受容体の内部化を誘導する
Axlは、上記で対象としたAkt経路を含めたAxl介在性シグナル伝達経路を介して、腫瘍細胞の移動および生存に影響を与えうる因子として同定された。したがって、受容体を内部化することによりAxlが細胞表面/細胞膜から効果的に除去されれば、細胞のシグナル伝達を軽減または抑制することができ、したがって、細胞の維持のほか、最終的には、腫瘍の増殖および転移も軽減または抑制することができる。
本発明のヒト化抗Axl抗体はin vitroでスフェロイドベースの細胞による血管新生を阻害する
Axlは、in vitroでの内皮細胞の移動、増殖、および管形成を含めた多数の血管新生挙動の重要なレギュレーターである(Hollandら、Cancer Res:65、9294〜9303頁、2005)。したがって、本発明のヒト化抗Axl抗体11B7-T5および11B7-T6、ならびに11B7-T6の派生物である11B7-T11、11B7-T23、および11B7-T25を、HUVECスフェロイドによるGas6誘導性血管発芽に対する阻害効果について調べた。これらの実験は、公開されている元のプロトコル(KorffおよびAugustin、J Cell Sci 112:3249〜58頁、1999)を改変して進めた。
配列番号2は、プライマーEFsmaRと称する、断片Aを増幅するプライマーのヌクレオチド配列である。
配列番号3は、ヒトkappa鎖の分泌シグナル配列および定常領域、ならびにポリ(A)を付加するためのシグナル配列を含む、断片Bのヌクレオチド配列である。
配列番号4は、ヒトIgG1のシグナル配列および定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列である。
配列番号5は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T1Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号6は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T2Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号7は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T3Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号8は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T4Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号9は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T5Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号10は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T6Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号11は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T7Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号12は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T8Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号13は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T9Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号14は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T10Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号15は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T11Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号16は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T12Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号17は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T13Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号18は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T1Lのアミノ酸配列である。
配列番号19は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T2Lのアミノ酸配列である。
配列番号20は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T3Lのアミノ酸配列である。
配列番号21は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T4Lのアミノ酸配列である。
配列番号22は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T5Lのアミノ酸配列である。
配列番号23は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T6Lのアミノ酸配列である。
配列番号24は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T7Lのアミノ酸配列である。
配列番号25は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T8Lのアミノ酸配列である。
配列番号26は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T9Lのアミノ酸配列である。
配列番号27は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T10Lのアミノ酸配列である。
配列番号28は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T11Lのアミノ酸配列である。
配列番号29は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T12Lのアミノ酸配列である。
配列番号30は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T13Lのアミノ酸配列である。
配列番号31は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T1Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号32は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T2Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号33は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T3Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号34は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T4Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号35は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T5Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号36は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T6Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号37は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T7Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号38は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T8Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号39は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T9Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号40は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T1Hのアミノ酸配列である。
配列番号41は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T2Hのアミノ酸配列である。
配列番号42は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T3Hのアミノ酸配列である。
配列番号43は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T4Hのアミノ酸配列である。
配列番号44は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T5Hのアミノ酸配列である。
配列番号45は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T6Hのアミノ酸配列である。
配列番号46は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T7Hのアミノ酸配列である。
配列番号47は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T8Hのアミノ酸配列である。
配列番号48は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T9Hのアミノ酸配列である。
配列番号49は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11D5-T1Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号50は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11D5-T2Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号51は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11D5-T3Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号52は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11D5-T4Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号53は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11D5-T5Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号54は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11D5-T6Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号55は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11D5-T1Lのアミノ酸配列である。
配列番号56は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11D5-T2Lのアミノ酸配列である。
配列番号57は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11D5-T3Lのアミノ酸配列である。
配列番号58は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11D5-T4Lのアミノ酸配列である。
配列番号59は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11D5-T5Lのアミノ酸配列である。
配列番号60は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11D5-T6Lのアミノ酸配列である。
配列番号61は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(297〜1386)である、h#11D5-T1Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号62は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(297〜1386)である、h#11D5-T2Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号63は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(297〜1386)である、h#11D5-T3Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号64は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(297〜1386)である、h#11D5-T4Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号65は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(297〜1386)である、h#11D5-T5Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号66は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(297〜1386)である、h#11D5-T6Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号67は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11D5-T1Hのアミノ酸配列である。
配列番号68は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11D5-T2Hのアミノ酸配列である。
配列番号69は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11D5-T3Hのアミノ酸配列である。
配列番号70は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11D5-T4Hのアミノ酸配列である。
配列番号71は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11D5-T5Hのアミノ酸配列である。
配列番号72は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11D5-T6Hのアミノ酸配列である。
配列番号73は、可変領域である、h#11B7-T14Lのアミノ酸配列である。
配列番号74は、可変領域である、h#11B7-T15Lのアミノ酸配列である。
配列番号75は、可変領域である、h#11B7-T16Lのアミノ酸配列である。
配列番号76は、可変領域である、h#11B7-T17Lのアミノ酸配列である。
配列番号77は、可変領域である、h#11B7-T18Lのアミノ酸配列である。
配列番号78は、可変領域である、h#11B7-T19Lのアミノ酸配列である。
配列番号79は、可変領域である、h#11B7-T20Lのアミノ酸配列である。
配列番号80は、可変領域である、h#11B7-T10Hのアミノ酸配列である。
配列番号81は、可変領域である、h#11B7-T11Hのアミノ酸配列である。
配列番号82は、可変領域である、h#11B7-T12Hのアミノ酸配列である。
配列番号83は、可変領域である、h#11D5-T7Lのアミノ酸配列である。
配列番号84は、可変領域である、h#11D5-T8Lのアミノ酸配列である。
配列番号85は、可変領域である、h#11D5-T9Lのアミノ酸配列である。
配列番号86は、可変領域である、h#11D5-T10Lのアミノ酸配列である。
配列番号87は、可変領域である、h#11D5-T11Lのアミノ酸配列である。
配列番号88は、可変領域である、h#11D5-T12Lのアミノ酸配列である。
配列番号89は、可変領域である、h#11D5-T13Lのアミノ酸配列である。
配列番号90は、可変領域である、h#11D5-T14Lのアミノ酸配列である。
配列番号91は、可変領域である、h#11D5-T15Lのアミノ酸配列である。
配列番号92は、可変領域である、h#11D5-T16Lのアミノ酸配列である。
配列番号93は、可変領域である、h#11D5-T17Lのアミノ酸配列である。
配列番号94は、可変領域である、h#11D5-T18Lのアミノ酸配列である。
配列番号95は、可変領域である、h#11D5-T19Lのアミノ酸配列である。
配列番号96は、可変領域である、h#11D5-T20Lのアミノ酸配列である。
配列番号97は、可変領域である、h#11D5-T21Lのアミノ酸配列である。
配列番号98は、可変領域である、h#11D5-T22Lのアミノ酸配列である。
配列番号99は、可変領域である、h#11D5-T23Lのアミノ酸配列である。
配列番号100は、可変領域である、h#11D5-T24Lのアミノ酸配列である。
配列番号101は、可変領域である、h#11D5-T25Lのアミノ酸配列である。
配列番号102は、可変領域である、h#11D5-T26Lのアミノ酸配列である。
配列番号103は、可変領域である、h#11D5-T27Lのアミノ酸配列である。
配列番号104は、可変領域である、h#11D5-T28Lのアミノ酸配列である。
配列番号105は、可変領域である、h#11D5-T29Lのアミノ酸配列である。
配列番号106は、可変領域である、h#11D5-T30Lのアミノ酸配列である。
配列番号107は、可変領域である、h#11D5-T31Lのアミノ酸配列である。
配列番号108は、可変領域である、h#11D5-T32Lのアミノ酸配列である。
配列番号109は、可変領域である、h#11D5-T33Lのアミノ酸配列である。
配列番号110は、可変領域である、h#11D5-T34Lのアミノ酸配列である。
配列番号111は、可変領域である、h#11D5-T35Lのアミノ酸配列である。
配列番号112は、可変領域である、h#11D5-T36Lのアミノ酸配列である。
配列番号113は、可変領域である、h#11D5-T37Lのアミノ酸配列である。
配列番号114は、可変領域である、h#11D5-T7Hのアミノ酸配列である。
配列番号115は、可変領域である、h#11D5-T8Hのアミノ酸配列である。
配列番号116は、可変領域である、h#11D5-T9Hのアミノ酸配列である。
配列番号117は、可変領域である、h#11D5-T10Hのアミノ酸配列である。
配列番号118は、可変領域である、h#11D5-T11Hのアミノ酸配列である。
配列番号119は、可変領域である、h#11D5-T12Hのアミノ酸配列である。
配列番号120は、可変領域である、h#11D5-T13Hのアミノ酸配列である。
配列番号121は、11B7軽鎖CDRL4のアミノ酸配列である。
配列番号122は、11B7軽鎖CDRL5のアミノ酸配列である。
配列番号123は、11B7軽鎖CDRL6のアミノ酸配列である。
配列番号124は、11B7重鎖CDRH1のアミノ酸配列である。
配列番号125は、11B7重鎖CDRH2のアミノ酸配列である。
配列番号126は、11B7重鎖CDRH3のアミノ酸配列である。
配列番号127は、11D5軽鎖CDRL4のアミノ酸配列である。
配列番号128は、11D5軽鎖CDRL5のアミノ酸配列である。
配列番号129は、11D5軽鎖CDRL6のアミノ酸配列である。
配列番号130は、11D5重鎖CDRH1のアミノ酸配列である。
配列番号131は、11D5重鎖CDRH2のアミノ酸配列である。
配列番号132は、11D5重鎖CDRH3のアミノ酸配列である。
配列番号133は、リーダー配列のヌクレオチド配列である。
配列番号134は、リーダー配列のアミノ酸配列である。
配列番号135は、#11B7キメラ軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号136は、#11B7キメラ重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号137は、#11D5キメラ軽鎖のアミノ酸配列である。
配列番号138は、#11D5キメラ重鎖のアミノ酸配列である。
配列番号139は、図30Aでも説明される、NCBIタンパク質データベース受託番号第P_30530号である、ヒトAxlのアミノ酸配列である。
配列番号140は、図30Bでも説明され、#11B7キメラ軽鎖(配列番号135)のアミノ酸1〜108からなるアミノ酸配列と同一である、ラット抗ヒトAxlモノクローナル抗体である11B7の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号141は、図30Cでも説明され、#11B7キメラ重鎖(配列番号136)のアミノ酸1〜113からなるアミノ酸配列と同一である、ラット抗ヒトAxlモノクローナル抗体である11B7の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号142は、図30Dでも説明され、#11D5キメラ軽鎖(配列番号137)のアミノ酸1〜108からなるアミノ酸配列と同一である、ラット抗ヒトAxlモノクローナル抗体である11D5の軽鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号143は、図30Eでも説明され、#11D5キメラ重鎖(配列番号138)のアミノ酸1〜113からなるアミノ酸配列と同一である、ラット抗ヒトAxlモノクローナル抗体である11D5の重鎖可変領域のアミノ酸配列である。
配列番号144は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T15Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号145は、シグナル配列(1〜60)、可変領域(61〜387)、定常領域(388〜702)である、h#11B7-T18Lのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号146は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T15Lのアミノ酸配列である。
配列番号147は、シグナル配列(1〜20)、可変領域(21〜129)、定常領域(130〜234)である、h#11B7-T18Lのアミノ酸配列である。
配列番号148は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T11Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号149は、シグナル配列(1〜57)、可変領域(58〜396)、定常領域(397〜1386)である、h#11B7-T12Hのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列である。
配列番号150は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T11Hのアミノ酸配列である。
配列番号151は、シグナル配列(1〜19)、可変領域(20〜132)、定常領域(133〜462)である、h#11B7-T12Hのアミノ酸配列である。
Claims (35)
- AXLの細胞外ドメインと結合し、AXL活性を少なくとも部分的に阻害するヒト化モノクローナル抗体。
- AXL介在シグナル伝達、AXLリン酸化、細胞増殖、血管新生、細胞移動、腫瘍転移、および/またはAXL介在抗アポトーシスを低減および/または妨害する、請求項1に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- ERK1/2、AKT、GSK-3β、TSC2、mTORおよび/またはS6K1などのAXL下流のシグナル伝達分子のリガンド誘導性リン酸化を低減および/または妨害する、請求項1または2に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- キメラ抗AXL抗体11B7 (配列番号135、136)または11D5 (配列番号137、138)のうちの1つに由来し、11B7または11D5の少なくとも1つの可変ドメインのフレームワーク領域において少なくとも1つの突然変異を含有する、請求項1から3のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- 配列番号40〜配列番号48からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
または配列番号80〜配列番号82からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列の可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
および/または配列番号18〜配列番号30からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
または配列番号73〜配列番号79からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列の可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するその断片
を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。 - h#11B7-T1、h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、h#11B7-T6、h#11B7-T7、h#11B7-T8、h#11B7-T9、h#11B7-T10、h#11B7-T11、h#11B7-T12、h#11B7-T13、h#11B7-T14、h#11B7-T15、h#11B7-T16、h#11B7-T17、h#11B7-T18、h#11B7-T19、h#11B7-T20、h#11B7-T21、h#11B7-T22、h#11B7-T23、h#11B7-T24、h#11B7-T25、h#11B7-T26、h#11B7-T27またはh#11B7-T28からなる群から選択されるヒト化h#11B7抗体の群から選択される、請求項5に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- 配列番号67〜配列番号72からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
または配列番号114〜配列番号120からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列の可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
および/または配列番号55〜配列番号60からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列、もしくは少なくともその可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
または配列番号83〜配列番号113からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列の可変ドメイン、もしくはそれと少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列、
またはAXLの細胞外ドメイン上の同じエピトープを認識するその断片
を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。 - h#11D5-T1、h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5またはh#11D5-T6からなる群から選択されるヒト化h#11D5抗体の群から選択される、請求項7に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- 標識基に結合する、請求項1から8のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- エフェクター基に結合する、請求項1から9のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- (a)請求項1から10のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、その抗体断片または派生物をコードする核酸配列、
(b)配列番号5〜17、31〜39、49〜54、及び61〜66からなる群から選択される配列番号の1つに示す核酸配列、
(c)配列番号18〜30、40〜48、55〜60、66〜73、73〜120、及び121〜132からなる群から選択されるポリペプチドをコードする核酸配列、
(d)(a)〜(c)中の配列のいずれかと相補的な核酸、または
(e)ストリンジェントな条件下で(a)、(b)、(c)または(d)とハイブリダイズし、ポリペプチドをコードすることができる核酸配列であって、前記ポリペプチドを含むその抗体または機能断片はAXLの細胞外ドメインに結合する核酸配列
からなる群から選択される単離核酸分子。 - 請求項11に記載の核酸配列を含むベクター。
- 発現ベクターであり、核酸配列が制御配列と作動可能に連結した、請求項12に記載のベクター。
- 請求項12または13に記載のベクターを含む宿主。
- ヒト、細菌、動物、真菌、両生類または植物細胞である、請求項14に記載の宿主。
- 非ヒトトランスジェニック動物である、請求項14に記載の宿主。
- 請求項1から12のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体を製造する方法であって、請求項14、15または16に記載の宿主から前記ポリペプチドを得るステップを含む方法。
- ヒト化抗AXL抗体、好ましくは請求項1から10のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体、請求項11に記載の核酸分子、請求項12または13に記載のベクター、請求項14、15または16に記載の宿主、または請求項17に記載の方法によって生成するポリペプチドを含む医薬組成物。
- 薬剤として許容される担体、希釈剤および/またはアジュバントを含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- さらなる活性作用物質を含む、請求項18または19に記載の医薬組成物。
- 過剰増殖性疾患を診断、予防または治療するための、請求項18から20のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記過剰増殖性疾患がAXLの発現、過剰発現および/または活動亢進と関係がある、請求項18から21のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記過剰増殖性疾患が乳癌、肺癌および他のAXL発現または過剰発現癌、および腫瘍転移の形成からなる群から選択される、請求項22に記載の医薬組成物。
- 過剰増殖性疾患を診断、予防または治療するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体。
- 過剰増殖性疾患の診断、予防または治療用の医薬組成物を製造するための、請求項1から10のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体の使用。
- 前記過剰増殖性疾患が請求項22または23のいずれか一項で定義した過剰増殖性疾患である、請求項24または25に記載の使用。
- AXLの発現と関係がある状態を診断するための方法であって、サンプルを請求項1から10のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体と接触させるステップ、およびAXLの存在を検出するステップを含む方法。
- 状態が請求項22または23のいずれか一項に記載の過剰増殖性疾患である、請求項27に記載の方法。
- 患者中のAXLの発現と関係がある状態を予防または治療するための方法であって、有効量の少なくとも請求項1から10のいずれか一項に記載のヒト化モノクローナル抗体をそれを必要とする患者に投与するステップを含む方法。
- 状態が請求項27または29のいずれか一項に記載の過剰増殖性疾患である、請求項29に記載の方法。
- 患者が哺乳動物患者、特にヒト患者である、請求項29または30に記載の方法。
- 抗AXL抗体、好ましくは請求項1から10のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、請求項11に記載の核酸分子、または請求項12もしくは13に記載のベクターを含むキット。
- さらなる抗腫瘍薬をさらに含む、請求項32に記載のキット。
- 薬剤耐性癌の治療用の医薬組成物を製造するための請求項1から10のいずれか一項に記載のヒト化抗AXL抗体の使用。
- 過剰増殖性疾患の治療用の抗腫瘍薬との同時投与用の医薬品を製造するための請求項1から9のいずれか一項に記載のヒト化抗AXL抗体の使用。
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