KR20120035145A

KR20120035145A - 인간화 ａｘｌ 항체

Info

Publication number: KR20120035145A
Application number: KR1020117026757A
Authority: KR
Inventors: 페터 비르츠; 옌스 루헤; 다케시 다키자와; 도모코 다카야마
Original assignee: 우드라이 파마 게엠베하
Priority date: 2009-05-11
Filing date: 2010-05-11
Publication date: 2012-04-13
Also published as: IL216147A; EP2430050A1; TWI526223B; IL216147A0; CA2759836A1; BRPI1013428A2; RU2011150183A; AU2010247464A1; RU2571224C2; CN102421802B; TW201509431A; US20120117670A1; US20150037323A1; ZA201107529B; WO2010130751A1; TW201105348A; JP2016011306A; CN102421802A; RU2015147287A; US8841424B2

Abstract

본 발명은 AXL 수용체 티로신 키나아제의 세포외 도메인에 결합하고 적어도 부분적으로 AXL 활성을 억제하는, 단일클론 인간화 항체에 관한 것이다.

Description

인간화 ＡＸＬ 항체{Humanized AXL antibodies}

AXL (Ark, UFO, Tyro-7) 수용체 티로신 키나아제는 키나아제의 Tyro-3 패밀리의 일원이고, 나머지 일원들은 Mer (Eyk, Nyk, Tyro-12) 및 Sky (Rse, Tyro-3, Dtk, Etk, Brt, Tif)이다. AXL 수용체 티로신 키나아제는 항-응고 인자 단백질 S에 상동성인 70-kDa 단백질인 이호성 리간드 Gas6의 결합에 의해 활성화된다. 다른 수용체 티로신 키나아제와 대조적으로, AXL 티로신 인산화는 또한 동종 친화성(homophilic) 결합에 의해 유도될 수 있다. AXL 활성화는 PI-3-키나아제/Akt (Franke et al., Oncogene 22: 8983-8998, 2003), 및 Ras/Erk 및 β-카테닌/TCF와 같은, 기타 주요 경로(Goruppi et al., Mol. Cell Biol. 21: 902-915, 2001)를 통한 신호전달을 초래한다.

AXL은 뇌, 심장, 골격근, 여러 다른 기관의 기관 캡슐(organ capsules) 및 결합 조직을 포함한 다양한 정상 조직, 및 단핵구에서 약하게 발현되나, 림프구에서는 약하게 발현되지 않는다. AXL에 의해 유도된 Akt 인산화가 섬유모세포 (Goruppi et al., Mol Cell Biol 17: 4442-4453 1997), 내피 세포 (Hasanbasic et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004), 혈관 평활근 세포 (Melaragno et al., J. Mol. Cell Cardiol. 37: 881-887, 2004) 및 신경세포 (Allen et al., Mol. Endocrinol. 13: 191-201 1999)의 생존에서 기재되었다. 또한, AXL은 세포-부착(cell-adhesion) 및 화학주성(cheotaxis)에서 역할을 수행한다. AXL 넉아웃(knockout)은 혈소판 인테그린 IIb3의 감소된 활성화의 결과, 손상된 혈소판 응집체 안정화 및 혈전 형성을 보인다.

AXL 과다발현이 다양한 암 종류, 예를 들면, 유방암 (Meric et al., Clin. Cancer Res. 8: 361-367, 2002; Berclaz et al., Ann. Oncol. 12: 819-824, 2001), 결장암 (Chen et al., Int. J. Cancer 83: 579-584, 1999; Craven et al., Int. J. Cancer 60: 791-797, 1995), 전립선암 (Jacob et al., Cancer Detect. Prev. 23: 325-332, 1999), 폐암 (Wimmel et al., Eur J Cancer 37: 2264-2274, 2001), 위암 (Wu et al., Anticancer Res 22: 1071-1078, 2002), 난소암 (Sun et al., Oncology 66: 450-457, 2004), 자궁내막암 (Sun et al., Ann. Oncol. 14: 898-906, 2003), 신장암 (Chung et al., DNA Cell Biol. 22: 533-540, 2003), 간세포성(hepatocellular) 암 (Tsou et al., Genomics 50:331-340, 1998), 갑상선암 (Ito et al., Thyroid 12:971-975, 2002; Ito et al., Thyroid 9: 563-567, 1999), 및 식도암종 (Nemoto et al., 1997), 및 CML (Janssen et al., A novel putative tyrosine kinase receptor with oncogenic potential. Oncogene, 6: 2113-2120, 1991; Braunger et al., Oncogene 14:2619-2631 1997; O'Bryan et al., Mol Cell Biol 11:5016-5031,1991), AML (Rochlitz et al., Leukemia 13: 1352-1358, 1999), 골육종 (Nakano et al., J. Biol. Chem. 270:5702-5705, 2003), 흑색종 (van Ginkel et al.,. Cancer Res 64:128-134, 2004) 및 두경부 편평세포암종 (Green et al., Br J Cancer. 2006 94:1446-5, 2006)에서 확인되었다.

또한, AXL은 비-침윤성(non-invasive) 세포에 비해, 침윤성 유방암 세포주에서 상향조절되는 전이-연관 유전자로 확인되었다. 인 비트로에서, AXL 활성은 이동 및 침윤을 위해 요구되는 것으로 확인되었고, 이 활성은 항체 처리에 의해 억제될 수 있다 (WO04008147). 마찬가지로, 인 비보에서, AXL의 우성 음성 버전(dominant negative version)의 발현을 통한 (Vajkoczy, P., et al., Proc. Natl. Acad. Science U.S.A. 103: 5799-5804. 2005) 또는 AXL의 siRNA 매개 하향조절에 의한 (Holland et al., Cancer Res. 65: 9294-9303, 2005) AXL 활성의 제거(abrogation)는 마우스의 이종이식 실험에서 피하 및 동소(orthotopic) 세포 증식을 방지했다.

현재까지 AXL에 결합하고 생물학적 활성을 갖는 항체들이 개시되었다. 예를 들면, 하나의 공지된 항체는 AXL 매개 세포 침윤을 감소시킬 수 있고 (WO04008147), 또 다른 항체는 AXL/리간드 상호작용을 감소시키는 것으로 보고되었다. 그러나, 모든 공지된 항체는 다중클론 또는 비-인간화(non-humanized) 단일클론 항체이다. 다중클론 또는 단일클론 비-인간화 항체는 순환으로부터 신속하게 제거되고 일반적으로 전신성 염증 효과를 유발하여, 치료적 투여를 위해 부적합하다.

따라서, AXL의 치료적 효능을 고려할 때, AXL 매개 신호 전달(transduction)을 효과적으로 및 특이적으로 차단하고 치유적 처리를 위해 적합한 단일클론 인간화 AXL 항체, 그의 항체 단편 또는 그의 유도체에 대한 높은 요구가 있다.

따라서, 본 발명의 제1 양태는 AXL, 특히, 인간 AXL의 세포외 도메인에 결합하고, AXL 활성을 적어도 부분적으로 억제하는 단일클론 인간화 항체, 그의 단편 또는 유도체에 관한 것이다.

바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: AXL-매개 신호 전달을 저하시키거나 또는 차단하는 능력, AXL 인산화를 저하시키거나 또는 차단하는 능력, 세포 증식을 저하시키거나 또는 차단하는 능력, 혈관형성을 저하시키거나 또는 차단하는 능력, 세포 이동(cell migration)을 저하시키거나 또는 차단하는 능력, 종양 전이를 저하시키거나 또는 차단하는 능력, 및 AXL-매개 항-아폽토시스(anti-apoptosis)를 저하시키거나 또는 차단하여, 그에 의해, 예를 들면, 세포의 항종양제에 의한 치료에 대한 민감성을 증가시키는 능력.

본 발명의 특히 바람직한 구체예에 따르면, 본 명세서에 기재된 인간화 항체는 ERK1/2, AKT, GSK-3β, TSC2, mTOR 및/또는 S6K1과 같은 AXL 하류 신호전달 분자의 리간드 유도 인산화를 감소시키고 및/또는 차단하는 능력을 보인다.

또한, 본 발명의 인간화 항체는 AXL, 특히, 인간 AXL에 대한 높은 특이성을 보일 수 있고 다른 Tyro-3 패밀리 일원, 예를 들면, MER 및/또는 SKY 및/또는 포유동물 비-영장 AXL, 예를 들면, 마우스 AXL을 유의성 있게 인식하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "활성(activity)"은 세포의 표현형, 특히, 아폽토시스의 회피, 성장 신호의 자급자족(self sufficiency), 세포 증식, 조직 침습 및/또는 전이, 항-성장 신호에 대한 무감응(항-아폽토시스) 및/또는 지속적 혈관형성과 같은 암 표현형을 포함하나, 이에 한정되지 않는 세포의 표현형에 영향을 미치는, AXL의 생물학적 기능을 의미한다.

용어 "AXL 매개 신호 전달(AXL mediated signal transduction)"은 AXL와 제2 메신저 분자의 직접적 또는 간접적 상호작용에 의해 유발되는 제2 메신저 경로, 예를 들면, 하류 신호전달(downstream signallin)의 활성화를 의미한다.

용어 "AXL 인산화(AXL phosphorylation)"는 제2 AXL 단백질(트랜스인산화) 또는 단백질 키나아제 활성을 갖는 또 다른 단백질에 의한, 아미노산 잔기, 바람직하게는 티로신 잔기의 인산화를 의미한다.

용어 "세포 증식(cell proliferation)"은 인간 세포, 특히, 인간 암 세포이나, 이에 한정되지 않는 인간 세포의 증식(reproduction)에 기여하는 모든 AXL-관여 과정을 의미한다. 그들은 세포 DNA의 복제, 복제된 DNA의 두 개의 동일한 크기의 염색체 군으로의 분리, 및 전체 세포의 물리적 분리(세포질 분열이라 불림)에 기여하거나, 이를 초래하고, 바람직하게는 AXL 인산화 및/또는 AXL-매개 신호 전달을 포함한, AXL의 비-촉매(non-catalytic) 활성 또는 촉매 활성에 의해 촉진 또는 매개될 것이다.

용어 "혈관형성(angiogenesis)"은 기존의 혈관으로부터의 새로운 혈관의 성장, 특히, 새로운 종양 공급 혈관(tumor supplying vessel)을 포함하나, 이에 한정되지 않는 새로운 혈관의 성장에 기여하는 모든 AXL-관여 과정을 의미한다. 이 과정들은 혈관 내피 세포의 증식, 생존, 이동 및 발아(sprouting), 혈관주위 세포(pericyte)의 유인(attraction) 및 이동, 및 혈관 안정화를 위한 기저막(basal membrane) 형성, 혈관 관류, 또는 간질 세포 또는 종양 세포에 의한 혈관형성 인자의 분비와 같은 다수의 세포 사건(cellular event)을 포함하고, 바람직하게는 AXL 인산화 및/또는 AXL-매개 신호 전달을 포함한, AXL의 비-촉매 활성 또는 촉매 활성에 의해 촉진 또는 매개될 것이다.

용어 "전이(metastasis)"는 원발성 종양으로부터 분산되고, 림프관 및/또는 혈관으로 침투하고, 혈류를 통해 순환하며 신체 내의 다른 부위의 정상 조직에 있는 원위 포커스(distant focus)에서 증식하도록(전이) 암세포를 지원하는 모든 AXL-관여 과정을 의미한다. 특히, 전이는 전이를 뒷받침하고 바람직하게는 AXL 인산화 및/또는 AXL-매개 신호 전달을 포함한, AXL의 비-촉매 활성 또는 촉매 활성에 의해 촉진 또는 매개하는 증식, 이동, 고정 비의존성(anchorage independence), 아폽토시스의 회피, 또는 혈관형성 인자의 분비와 같은 종양 세포의 세포 사건을 의미한다.

용어 "AXL 매개 항-아폽토시스(AXL mediated anti-apoptosis)"는 인간 세포, 바람직하게는 인간 암세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 인간 세포를 세포 예정사(programmed cell death)(아폽토시스)로부터 보호하는 모든 AXL-관여 프로세스를 의미한다. 특히, AXL 매개 항-아폽토시스는 인간 세포, 바람직하게는 인간 암세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 인간 세포를 성장 인자 금단(withdrawl), 저산소증, 화학요법제 또는 방사선에 대한 노출, 또는 Fas/Apo-1 수용체-매개 신호전달의 개시를 통한 아폽토시스의 유도로부터 보호하고, 바람직하게는 AXL 인산화 및/또는 AXL-매개 신호 전달을 포함한, AXL의 비-촉매 활성 또는 촉매 활성에 의해 촉진 또는 매개하는 과정을 의미한다.

용어 "영역(region)" 및 "도메인(domain)"은 본 발명에서 상호 간에 호환될 수 있다.

"11B7" 및 "11D5"로 표기된 항체는 또한 본 발명에서 각각 "#11B7" 및 "#11D5"로 표기될 수 있다.

본 발명의 제2 양태에 따르면, 본 명세서에 기재된 인간화 항체는 키메라 (랫트/인간) 항-AXL 항체 11B7 (그의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 135 및 136으로 표시된다), 11D5 (그의 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 각각 서열번호 137 및 138으로 표시된다) 또는 10D12 또는 AXL의 세포외 도메인 상의 동일한 에피토프를 인식하는 항체 중 하나로부터 유래된다. 특히 바람직하게는, 상기 인간화 항체는 11B7 및 11D5로부터 유래된다. 바람직하게는, 상기 인간화 항체는 하나 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 그와 같은 돌연변이는 아미노산 서열을 변경하기 위해, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법에 의해 도입될 수 있다. 돌연변이는 바람직하게는 11B7 또는 11D5의 프레임워크 영역 중 아미노산을 인간 프레임워크 영역에서 보존된 아미노산에 의해 치환한다. 인간 프레임워크 영역에서 보존된 아미노산 또는 컨센서스(consensus) 아미노산을 결정하는 방법, 예를 IgBLAST와 같은 프로그램을 이용한 상동성 모델링(homology modelling)이 당해 기술 분야의 당업자에게 알려져 있다.

또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 인간화 항체는 항-AXL 항체, 바람직하게는 항-AXL 인간화 항체, 11B7 또는 11D5의 하나 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역이 인간 또는 인간화 프레임워크 영역에 의해 치환된 것인 항-AXL 항체, 바람직하게는 항-AXL 항체 11B7 또는 11D5로부터 유래된다.

AXL에 대한 본 발명의 항체의 결합 활성은 당해 분야에서 당업자에게 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 활성은 Biacore에 의한 표면 플라즈몬 공명, 및/또는 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assays), EIA (enzyme immunoassays), RIA (radioimmunoassays), 또는 형광 항체 기법, 예를 들면, FACS를 이용하여 결정될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 인간화 항체는 랫트 11B7 또는 11D5와 같은 다중클론 또는 단일클론 비-인간화(non-humanized) 항-AXL 항체에 비해, 면역원성이 더 낮다. 당해 기술 분야에서 당업자에게 공지된 기타 방법 외에, 감소된 면역원성은 ELISA 기반 HAHA 또는 HAMA 분석법 (IBL-America, Minnesota / LiSrarFish, Italy)에 의해 결정될 수 있다. 또한, 바람직하게는 본 발명의 항체는 환자에게 투여되는 경우, 혈액 순환으로부터 신속하게 제거되지 않고 전신 염증 효과를 유발하지 않는다.

본 발명의 항체는 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들면, 하나 또는 두 개의 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 또한, 상기 항체는 바람직하게는 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 사슬 및 하나 이상의 면역글로불린 경쇄를 포함한다. 면역글로불린 사슬은 가변 도메인 및 선택적으로 불변 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR), 예를 들면, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3 영역, 및 프레임워크 영역을 포함할 수 있다. 용어 "상보성 결정 영역(complementary determining region, CDR)"은 당해 분야에서 잘 정의되어 있고(예를 들면, Harlow and Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbour, 1988 참조) 항원과 주로 접촉하는 항체의 가변 영역 내에 아미노산의 영역(stretch)을 의미한다.

또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 인간화 항체는 항-AXL 항체 11B7로부터 유래되고, 서열번호 40 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 또는

서열번호 80 내지 서열번호 82로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 및/또는

서열번호 18 내지 서열번호 30으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 또는

서열번호 73 내지 서열번호 79로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 또는

상기 AXL의 세포외 도메인 상의 동일한 에피토프를 인식하는 그의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 서열의 설명은 하기에서 "서열의 설명(Descripton of the Sequences)" 및 서열 목록에 제시된다.

또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 인간화 항체는 항-AXL 항체 11B7로부터 유래되고, 서열번호 150 및 서열번호 151로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 및/또는

서열번호 146 및 서열번호 147로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

특히 바람직한 구체예에서, 인간화 h#11B7 항체는 h#11B7-T1, h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, h#11B7-T6, h#11B7-T7, h#11B7-T8, h#11B7-T9, h#11B7-T10, h#11B7-T11, h#11B7-T12, h#11B7-T13, h#11B7-T14, h#11B7-T15, h#11B7-T16, h#11B7-T17, h#11B7-T18, h#11B7-T19, h#11B7-T20, h#11B7-T21, h#11B7-T22, h#11B7-T23, h#11B7-T24, h#11B7-T25, h#11B7-T26, 및 h#11B7-T27 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 표 1(실시예 10)은 본 발명에서 인간화 h#11B7 항체를 특징짓는 특정한 인간화 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열의 조합, 각각 상응하는 발현 벡터의 조합을 요약한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 인간화 h#11B7 항체는 h#11B7-T28, h#11B7-T29, h#11B7-T30 및 h#11B7-T31 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 표 2 (실시예 22)는 상기 인간화 h#11B7 항체를 특징짓는 특정한 인간화 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열의 조합, 각각 상응하는 발현 벡터의 조합을 요약한다.

랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 #11B7로부터 유래된 인간화 항체는 상기 인간화 항체가 6개의 모든 CDR 및 Axl 항원에 대한 결합 활성을 보유하는 한, 전술된 문단에서 예시된 특정 항체에 한정되지 않는다. 상기 인간화 항체는 각각 그의 중쇄 중에 CDRH1 (SNYWG; 서열번호 124), CDRH2 (YITYSGSTSYNPSLKS; 서열번호 125)와 CDRH3 (TTFYY; 서열번호 126), 및, 그의 경쇄 중에 CDRL4 (RASQDIGNYLR; 서열번호 121), CDRL5 (GATNLAA; 서열번호 122)와 CDRL6 (LQSKESPWT; 서열번호 123)를 보유한다.

또 다른 구체예에 따르면, 본 발명의 인간화 항체는 11D5로부터 유래되고, 서열번호 67 내지 서열번호 72로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 또는

서열번호 114 내지 서열번호 120으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열의 가변 도메인 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 및/또는

서열번호 55 내지 서열번호 60으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 또는

서열번호 83 내지 서열번호 113으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열의 가변 도메인 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖고, 100%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열의 결합 활성과 동등한 Axl에 대한 결합 활성을 갖는 가변영역을 나타내는 것인 아미노산 서열, 또는

상기 AXL의 세포외 도메인 상의 동일한 에피토프를 인식하는 그의 단편을 포함한다.

특히 바람직한 구체예에서, 인간화 h#11D5 항체는 h#11D5-T1, h#11D5-T2, h#11D5-T3, h#11D5-T4, h#11D5-T5 또는 h#11D5-T6 항체로 구성된 군으로부터 선택된다. 실시예 11, 12 및 14는 상기 인간화 h#11D5 항체를 특징짓는, 특정한 인간화 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열의 조합, 각각 상응하는 발현 벡터의 조합을 보여준다.

본 발명의 바람직한 구체예 중 하나는 비교적 높은 열 변성 중심점(thermal denaturation midpoint) (Tm)을 갖는 인간화 항체이다. 본 발명에서, 인간화 항체는 70℃ 이상의 Tm, 바람직하게는, 75℃ 이상의 Tm, 보다 바람직하게는, 78℃ 이상의 Tm, 더 바람직하게는, 80℃ 이상의 Tm, 훨씬 더 바람직하게는 82℃ 이상의 Tm을 갖는다. 또한, 본 발명에서, 인간화 항체는 그의 선조(ancestor) 랫트 항체 또는 키메라 항체의 Tm과 동등한 Tm을 가지나, 바람직하게는, 그의 선조 랫트 항체 또는 키메라 항체의 Tm보다, 3℃ 이상 더 높은 Tm, 보다 바람직하게는 6℃ 이상 더 높은 Tm, 더 바람직하게는 8℃ 이상 더 높은 Tm, 훨씬 더 바람직하게는 10℃ 이상 더 높은 Tm을 갖는다. 그와 같은 바람직한, 보다 더 바람직한, 훨씬 더 바람직한, 또한, 매우 더 바람직한 인간화 항체는 변경(풀림(unfold)) 또는 불활성화되는 경향이 더 낮고, 장시간 동안 안정하게 보관될 수 있는 용액 제제로 제조되기에 적합하다.

랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 #11D5로부터 유래된 인간화 항체는 상기 인간화 항체가 6개의 모든 CDR 및 Axl 항원에 대한 결합 활성을 보유하는 한, 전술된 문단에서 예시된 특정 항체에 한정되지 않는다. 상기 인간화 항체는 각각, 그의 중쇄 중에 CDRH1 (SNYWG; 서열번호 130), CDRH2 (HITNSGNTTYNPSLKS; 서열번호 131)와 CDRH3 (GAFDY; 서열번호 132), 및 그의 단쇄 중에 CDRL4 (RASQDIGNYLS; 서열번호 127), CDRL5 (GAIKLAV; 서열번호 128)와 CDRL6 (LQYIQFPLT; 서열번호 129)을 보유한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예는 (특이적으로) 카르복시 말단에 보다 가까운 IG 도메인 중 하나(NCBI 단백질 데이터 베이스 등록 번호(ACCESSION No.) P_30530 중 129번 내지 220번 아미노산의 아미노산 잔기를 포함하는 도메인: 서열번호 139; 도 30A)를 결합하거나 또는 인식하는 항체이다. 그와 같은 바람직한 항체는 인간화 항체에 한정되지 않으나, 인간 항체 또는 그들 중 하나의 기능성 단편일 수 있다. 보다 바람직하게는, 그와 같은 바람직한 항체는 Axl이 갖는 생물학적 활성 중 하나 이상을 억제한다.

본 발명의 (완전한) 항체는 예를 들면, 실시예 9 내지 12에 예시된 바와 같이, 하기 단계를 수행하는 것에 의해 제조될 수 있다: 각각 가변 영역 및 불변 영역을 포함하는 삽입물(inset)을 갖는, 중쇄 발현 벡터 및 경쇄 발현 벡터를 작제하는 단계; 상기 벡터들을 숙주 세포에 도입하는 단계; 상기 세포를 배양하는 단계; 배양 상층액(조건화 배지)으로부터 항체 폴리펩티드를 회수하는 단계.

본 명세서에서 사용된, 두 개의 폴리펩티드 서열 간의 "서열 동일성(sequence identity)"은 상기 서열들 간에 동일한 아미노산의 비율을 나타낸다. 두 개의 주어진 폴리펩티드 서열 간에 "서열 동일성"을 결정하는 방법이 당해 분야에서 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 바람직한 폴리펩티드 서열은 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 98%의 서열 동일성을 갖는다. 서열 동일성은 예를 들면, Karlin 및 Altschul에 의한 알고리즘인 BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, pp5873(1993)) 또는 FASTA (Methods in Enzymol., 183, pp63(1990))에 의해 결정될 수 있다. BLASTN 또는 BLASTX로 표기되는 프로그램이 이용가능하다 (J. Mol. Biol., 215, pp403(1990)).

본 발명의 항체는 IgA-, IgD-, IgE-, IgG- 또는 IgM-타입일 수 있고, 바람직하게는, IgG1-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgM1- 및 IgM2-타입을 포함하나, 이에 한정되지 않는 IgG- 또는 IgM-타입일 수 있다.

본 발명의 항체는 바람직하게는 당해 분야에서 당업자에게 공지된 적합한 절차를 이용한 상동성 모델링에 의해 설계될 수 있다. 또한, 11B7 또는 11D5와 같은, 주어진 항체의 인간화 형태는 키메라화(chimerizatoin) 또는 CDR 그래프팅(CDR grafting)과 같은, 당해 분야에서 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다. 인간화 항체의 제조를 위한 대안적인 방법이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며 예를 들면, EP-A1 0 239 400 및 W090/07861에 기재된다. 일반적으로, 인간화 항체는 인간이 아닌 출처로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이와 같은, 인간이 아닌 출처로부터의 아미노산 잔기(non-human amino acid residue)는 종종 "도입(import)" 가변 도메인으로부터 취해진, "도입" 잔기로 지칭된다. 인간화(humanization)는 예를 들면, 비-인간 기원의 CDR 또는 CDR 서열로 인간 항체의 상응하는 서열을 대체하는 것에 의해, Winter 및 동료들의 방법(Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행될 수 있다. 따라서, 그와 같은 "인간화(humanized)" 항체는 실질적으로 완전한(intact) 인간 가변 도메인보다 작은 부분이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 것인 키메라 항체이다(미국특허 제4,816,567호). 실제로, 인간화 항체는 일반적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기가 비-인간 항체의 유사한 부위로부터 유래된 잔기에 의해 치환된 것인 인간 항체이다.

인간 항체는 인간 항체의 파아지 표시 라이브러리 (Wormstone, I.M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308; Carmen, S.et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203; Siriwardena, D. et.al., Opthalmology (2002) 109 (3), p.427-431)로부터 유래될 수 있고, 이는 당업자에게 잘 알려져 있다.

예를 들면, 인간 항체의 가변 영역을 파아지의 표면에 단쇄 항체, scFv로서 발현시키는 단계, 및 항원에 결합하는 파아지를 선택하는 단계를 포함하는 파아지 표시 방법이 이용될 수 있다 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116).

선택된 파아지의 유전자를 분석하는 것에 의해, 상기 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열이 결정될 수 있다.

scFv의 DNA 서열이 결정된 후, 상기 서열을 포함하는 발현 벡터를 작제하는 단계 및 상기 항체를 발현시키기 위해 적합한 숙주 세포에 상기 벡터를 도입하는 단계에 의해 인간 항체가 제조될 수 있다 (WO92001047, WO92020791, WO93006213, WO93011236, WO93019172, WO95001438, WO95015388 and Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455 and Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116).

인간 항체가 인간 Axl 항원에 대한 결합 활성을 가지고, 하기의 6개의 CDR: 각각 그의 중쇄 중 CDRH1 (SNYWG; 서열번호 130), CDRH2 (HITNSGNTTYNPSLKS; 서열번호 131)와 CDRH3 (GAFDY; 서열번호 132), 및, 그의 경쇄 중 CDRL4 (RASQDIGNYLS; 서열번호 127), CDRL5 (GAIKLAV; 서열번호 128)와 CDRL6 (LQYIQFPLT; 서열번호 129)을 모두 갖거나, 대안적으로 상기 인간 항체가 인간 Axl 항원에 대한 결합 활성을 가지며, 하기의 6개의 CDR: 그의 중쇄 중 CDRH1 (SNYWG; 서열번호 124), CDRH2 (YITYSGSTSYNPSLKS; 서열번호 125)와 CDRH3 (TTFYY; 서열번호 126), 및, 그의 경쇄 중 CDRL4 (RASQDIGNYLR; 서열번호 121), CDRL5 (GATNLAA; 서열번호 122)와 CDRL6 (LQSKESPWT; 서열번호 123)을 모두 포함하는 경우, 그의 제조 방법과 관계없이, 본 발명의 구체예일 수 있다.

치료적 목적을 위해, 항체가 치료적 효과기(effector), 예를 들면, 방사성활성 기 또는 세포독성 기에 접합될 수 있다.

진단적 목적을 위해, 항체가 표지될 수 있다. 적합한 표지는 방사성 표지, 형광 표지, 또는 효소 표지를 포함한다.

앞서 검토된 바와 같이, 본 발명의 항체는 완전한 항체 외에, 다양한 형태, 예를 들면, Fv, Fab, Fab' 및 F(ab')₂, 디아바디(diabody), 미니바디(minibody), 둘 이상의 항체의 단편을 포함하는 이가 또는 다가 항체, 및 단쇄 (scFV)를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다; 예를 들면, W08809344를 참조한다.

본 발명의 항체는 둘 이상의 항원 또는 에피토프에 특이적인 이특이성(bi-specific) 항체 또는 다중-특이성(multi-specific) 항체일 수 있다.

scFv는 폴리펩티드 링커를 통해 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 면역글로불린 경쇄의 가변 영역에 융합시키는 것에 의해 수득될 수 있다(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113, edited by Rosenburg and Moore, Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994) and Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). BiscFv는 폴리펩티드 링커를 통해 두 개의 상이한 scFV를 융합시키는 것에 의해 수득될 수 있다.

scFv를 제조하는 방법이 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다 (US4,946,778, US5,260,203, US5,091,513, US5,455,030 등). 바람직하게는, 두 개의 가변 영역 간의 링커는 접합체(conjugate)를 생성하지 않는다 (Huston, J.S.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, p.5879-5883). scFV 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 scFV 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 동일한 항체, 또는 두 개의 항체로서, 그 중 하나는 나머지 하나와 상이한 것인 항체로부터 유래될 수 있다. 폴리펩티드 링커는 예를 들면, 12개 내지 19개의 아미노산 잔기로 구성된 단쇄 펩티드일 수 있다.

scFV를 코딩하는 DNA는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 전장(full length) 또는 그의 일부를 코딩하는 DNA 및 양 말단 각각에 상응하는 두 개의 올리고뉴클레오티드를 각각 주형 및 한쌍의 프라이머로 이용하여, DNA 단편을 증폭시키고, 그 후, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역이 각각 폴리펩티드 링커의 일 말단 및 나머지 말단에 연결되도록 설계된 한쌍의 프라이머를 이용하여 증폭시키는 것을 포함하는 PCR에 의해 생성될 수 있다.

scFv를 포함한, 항체의 기능성 단편은 발명의 설명에 기재된 바와 같이, 상기 scFv를 코딩하는 DNA를 숙주 세포로 도입하고, 상기 세포를 배양하는 것에 의해 제조될 수 있다.

본 발명의 구체예 중 하나는 하나의 단량체 항체(monomeric antibody)보다 항원에 대한 보다 높은 결합 친화도를 갖는 다량체 항체(multimeric antibody)이다. 상기 다량체 항체의 유닛(unit)은 동일하거나, 또는 하나의 유닛이 항원의 하나의 에피토프에 결합하고 또 다른 유닛은 동일한 항원의 다른 에피토프에 결합하는 경우, 상호 간에 상이할 수 있다. IgG CH3 도메인과 두 개의 scFv의 결합, 스트렙타비딘(streptoavidiin)과의 결합, 헬릭스-턴-헬릭스(helix-turn-helix) 모티프의 도입이 다량체 항체의 제조에 적용될 수 있다.

필요한 경우, 본 발명의 항체는 항체의 결합 특성을 변화시키기 위해 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서 돌연변이될 수 있다. 예를 들면, AXL에 대한 항체의 Kd를 증가 또는 감소시키기 위해 또는 항체의 결합 특이성을 변화시키기 위해 하나 이상의 CDR 영역에서 돌연변이가 일어날 수 있다. 부위 특이적 돌연변이유발(site directed mutagenesis)의 기법이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 전술된 Sambrook 등 및 Ausubel 등을 참조한다. 또한, AXL 항체의 가변 영역에 생식 계통 대비 변화된 것으로 알려진 아미노산 잔기에서 돌연변이가 이루어질 수 있다.

또 다른 양태에서, 인간화와 관련된 돌연변이 외에, 프레임워크 영역 중 하나 이상에 돌연변이가 도입될 수 있다. AXL 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 도메인에서 돌연변이가 이루어질 수 있다. 예를 들면, WO0009560을 참조한다. 항체의 면역원성을 변화시키거나, 또 다른 분자로의 공유 결합 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하기 위해, 또는 보체 고정(complement fixation)과 같은 특성을 변화시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 도메인에 또한 돌연변이가 이루어질 수 있다. 하나의 돌연변이된 항체에서 각각의 프레임워크 영역, 불변 도메인 및 가변 영역에서 돌연변이가 이루어질 수 있다. 대안적으로, 하나의 돌연변이된 항체에서 프레임워크 영역, 가변 영역 또는 불변 영역 중 하나에서만 돌연변이가 이루어질 수 있다.

본 발명의 구체예 중 하나는 본 발명의 두 개의 이상의 항체를 포함하는 다중클론 항체이다.

본 발명의 구체예 중 하나는 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편의 화학적 변형이다. 중합체(폴리에틸렌 글리콜 등)와 같은 분자들이 변형된 항체 또는 변형된 기능성 단편을 생성하기 위해 이용될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명에 따른 인간화 항체는 효과기 기능을 갖는 불변 도메인을 가질 수 있고, 이에 의해 세포 표면에 결합된 상기 항체, 항체 단편 또는 그의 유도체를 갖는 AXL 발현 세포들은 면역계 기능에 의해 공격될 수 있다. 예를 들면, 상기 항체는 보체를 고정시키고 보체-의존적 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)에 참여할 수 있다. 또한, 상기 항체는 단핵구 및 NK(natural killer) 세포와 같은 효과기 세포 상의 Fc 수용체에 결합할 수 있고, 항체-의존적 세포성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity)에 참여할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 명세서에 기재된 항체는 치유적 치료, 바람직하게는 과다증식 질환, 심혈관 질환, 특히, 죽상동맥경화증 및 혈전증, 당뇨병 관련 질환, 특히, 사구체 비대증(glomerular hypertrophy) 또는 당뇨병성 신병증, 및 특히, AXL 발현, 과다발현 또는 과다활성과 연관되거나, 이를 동반하거나, 또는 이에 의해 유발된 질환의 치료에 적용될 수 있다. 상기 과다증식 질환은 바람직하게는, 암, 예를 들면, 유방암, 결장암, 폐암, 신장암, 여포성 림프종(follicular lymphoma), 골수성 백혈병, 피부암/흑색종, 교모세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 바렛 식도(Barrett's esophagus) 및 식도암, 위암, 방광암, 경부암, 간암, 갑상선암, 및 두경부암, 또는 증식성(hyperplastic) 및 종양성(neoplastic) 질환, 또는 기타 AXL 발현 또는 과다발현 과다증식 질환과 같은 AXL 발현, 과다발현, 과다활성과 연관되거나, 이를 동반하거나 또는 이에 의해 유발된 질환으로부터 선택된다.

과다증식성 질환과 같은 Axl-관련 질환의 치료를 위한 본 발명의 항체의 적용성은 리간드-유도 Akt 및 p42/44 MAP-키나아제 인산화와 같은 Axl-매개 하류 신호 전달, 암세포 이동 또는 증식, Axl을 발현하는 세포의 리간드-유도 이동 또는 증식, 조직 및 세포의 혈관형성, 및 이종이식(xenograft) 마우스와 같은 인간이 아닌 동물에 이식된 인간 암 또는 암세포의 증식 또는 전이, 및 기타 다른 전임상/비-임상 실험 및 임상 시험을 포함한, 인 비트로(in vitro), 인 비보(in vivo) 또는 엑스 비보(ex vivo) 실험에 의해 입증되거나, 표시되거나, 또는 암시될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 전술된 질환 중 하나의 치료를 위해 항종양제와의 병용 투여를 위해 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 병용-투여(co-administration)는 항종양제, 바람직하게는 아폽토시스 유도성 항종양제와 본 발명의 항체의 투여를 포함한다. 용어 병용-투여는 또한 단일 조성물의 형태 또는 둘 이상의 별개의 조성물의 형태로, 본 발명의 항체와 항종양제, 바람직하게는 아폽토시스 유도성 항종양제의 투여를 포함한다. 병용-투여는 본 발명의 항체와 항종양제, 바람직하게는 아폽토시스 유도성 항종양제를 동시에(즉, 같은 시간에) 또는 순차적으로(즉, 간격을 두고) 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 그의 항체 단편 또는 그의 유도체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 전술된 항체, 그의 항체 단편 또는 그의 유도체를 코딩하는 본 발명의 핵산 분자는 예를 들면, 단독이거나 또는 조합된 핵산 분자들을 포함하는 DNA, cDNA, RNA 또는 인공적으로 제조된 DNA 또는 RNA 또는 재조합에 의해 제조된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 본 발명의 핵산 분자는 또한 전체 유전자 또는 그의 상당한 부분, 또는 그의 단편 및 유도체에 상응하는 게놈 DNA일 수 있다. 상기 뉴클레오티드 서열은 천연 뉴클레오티드 서열과 일치할 수 있거나, 또는 하나 또는 복수 개의 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명의 특정한 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 cDNA 분자이다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 핵산 분자에 관한 것이다:

(a) 본 발명에 따른 단일클론 항체, 그의 항체 단편 또는 그의 유도체를 코딩하는 핵산 서열,

(b) 서열번호 5 내지 서열번호 17, 서열번호 31 내지 서열번호 39, 서열번호 49 내지 서열번호 54 및 서열번호 60 내지 서열번호 66으로 구성된 군으로부터 선택된 서열번호 중 하나로 표시된 핵산 서열,

(c) 서열번호 18 내지 서열번호 30, 서열번호 40 내지 서열번호 48, 서열번호 55 내지 서열번호 60, 서열번호 67 내지 서열번호 72, 서열번호 73 내지 서열번호 120 및 서열번호 121 내지 132으로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열,

(d) (a) 내지 (c)의 서열 중 하나에 상보적인 핵산 서열, 또는

(e) 엄격한(stringent) 조건 하에 (a), (b), (c) 또는 (d)에 혼성화할 수 있고, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편은 AXL의 세포외 도메인에 결합하는 것인 핵산 서열,

(f) 서열번호 144 및 서열번호 145 및 서열번호 148 및 서열번호 149로 구성된 군으로부터 선택된 서열번호 중 하나로 표시된 핵산 서열,

(g) 서열번호 146 및 서열번호 147 및 서열번호 150 및 서열번호 151로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열,

(h) (f) 또는 (g)의 서열 중 하나에 상보적인 핵산, 또는

(i) 엄격한 조건 하에 (f), (g), 또는 (h)에 혼성화할 수 있고, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편은 AXL의 세포외 도메인에 결합하는 것인 핵산 서열.

용어 "엄격한 조건 하에 혼성화하는(hybridizing under stringent conditions)"은 두 개의 핵산 단편이 예를 들면, Sambrook et al., "Expression of cloned genes in E. coli" in Molecular Cloning: A laboratory manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA에 기재된 바와 같은 표준화된 혼성화 조건 하에서 상호 간에 혼성화된다는 것을 의미한다. 그와 같은 조건은 예를 들면, 약 45℃에서 6.OxSSC에서의 혼성화 및 뒤이은, 50℃에서 2.OxSSC, 바람직하게는 65℃에서 2.OxSSC, 또는 50℃에서 0.2xSSC, 바람직하게는 65℃에서 0.2xSSC에 의한 세척이다.

본 발명은 또한, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 상기 벡터는 예를 들면, 파아지, 플라스미드, 바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 적격(replication competent)이거나 또는 복제 결함(replication defective)일 수 있다. 후자의 경우, 바이러스 증식은 일반적으로 보완성 숙주 세포(complementing host cell)에서만 일어날 것이다.

본 발명의 핵산 분자는 숙주에서 증식을 위해 선택 마커를 포함하는 벡터에 연결될 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터가 인산칼슘 침전물 또는 염화 루비듐 침전물과 같은 침전물, 또는 하전된 지질(charged lipid) 또는 탄소-기반 클러스터, 예를 들면, 플러렌(fulleren)과의 복합체로 도입된다. 벡터가 바이러스인 경우, 벡터는 숙주 세포로의 적용 전에 적합한 패키징 세포 계통(packaging cell line)을 이용하여 인 비트로에서 패키징될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 벡터는 핵산 분자가 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포에서 전사 및 선택적으로 발현될 수 있게 하는 하나 이상의 조절 서열에 작동가능하게 연결된 것인 발현 벡터이다. 상기 핵산 분자의 발현은 핵산 분자의 전사, 바람직하게는 번역가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 발현을 보장하는 조절성 요소들이 당해 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 그들은 일반적으로 전사의 개시를 보장하는 조절성 서열 및 선택적으로 전사의 종료 및 전사물의 안정화를 보장하는 폴리-A 신호 포함한다. 추가적인 조절성 요소들은 전사 인핸서 및 번역 인핸서를 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 가능한 조절성 요소들은 예를 들면, 대장균의 lac, trp 또는 tac 프로모터를 포함하고, 진핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절성 요소의 예는 효모의 AOXI 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유동물 및 기타 동물 세포의 CMV-, SV40-, RSV-프로모터 (Rous sarcoma virus), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다. 전사의 개시를 담당하는 요소 외에, 그와 같은 조절 요소들은 또한 폴리뉴클레오티드의 하류에 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위와 같은, 전사 종료 신호를 포함할 수 있다. 이 배경에서, Okayama-Berg cDNA 발현 벡터 pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) 또는 pSPORTI (GIBCO BRL)와 같은 적합한 발현 벡터가 당해 기술 분야에서 알려져 있다. 바람직하게는, 상기 벡터는 발현 벡터 및/또는 유전자 전달 또는 표적화 벡터이다. 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 보바인 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus)와 같은 바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 표적화된 세포 집단으로의 전달을 위해 이용될 수 있다. 당해 기술 분야에서 당업자에게 잘 알려진 방법이 재조합 바이러스 벡터를 제조하기 위해 이용될 수 있다; 예를 들면, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001, Third Edition) N.Y. 및 Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994)에 기재된 기법들을 참조한다. 대안적으로, 본 발명의 핵산 분자가 표적 세포로의 전달을 위해 리포좀으로 재구성될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주에 관한 것이다. 상기 숙주는 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 인간을 제외한 형질전환 동물일 수 있다. 숙주에 존재하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주의 게놈 내로 통합될 수 있거나, 또는 염색체 외의 상태로 유지될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 핵산 분자가 돌연변이 유전자를 복구하거나 또는 상동성 재조합을 통해 돌연변이 유전자를 생성하기 위해, "유전자 표적화(gene targeting)" 및/또는 "유전자 치환(gene replacement)"을 위해 이용될 수 있는 것으로 이해될 것이다; 예를 들면, Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press를 참조한다.

상기 숙주는 원핵 세포 또는 진핵 세포, 예를 들면, 박테리아 세포, 곤충 세포, 균류 세포, 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포, 또는 바람직하게는 인간 세포일 수 있다. 바람직한 균류 세포는 예를 들면, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속의 세포, 특히, 사카로마이세스 세레비시애(S. cerevisiae) 종의 세포이다. 용어 "원핵(prokaryotic)"은 본 발명의 변이체 폴리펩티드의 발현을 위해 폴리뉴클레오티드에 의해 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 모든 박테리아를 포함하도록 의도된다. 원핵 숙주는 그람 음성 박테리아 및 그람 양성 박테리아, 예를 들면, 대장균, 살모넬라 티피뮤리움(S. typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다. 본 발명의 변이체 폴리펩티드의 돌연변이 형태를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 당해 기술 분야의 당업자에게 일반적으로 알려진 기법을 이용하여 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키기 위해 이용될 수 있다. 융합되고, 작동가능하게 연결된 유전자를 제조하고 이들을 박테리아 또는 동물 세포에서 발현시키는 방법이 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있다(Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (2001, Third Edition). 본 명세서에 기재된 유전적 구조물 및 방법은 예를 들면, 원핵 숙주에서 본 발명의 변이체 항체, 항체 단편 또는 그의 유도체의 발현을 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 삽입된 핵산 분자의 효율적인 전사를 촉진하는 프로모터 서열을 포함하는 발현 벡터가 숙주와 함께 이용된다. 발현 벡터는 일반적으로, 복제 원점, 프로모터, 및 종료 서열(terminator), 및 형질전환된 세포의 표현형 선택을 제공할 수 있는 특정한 유전자를 포함한다. 형질전환된 원핵 숙주가 최적의 세포 성장을 달성하기 위해 당해 기술 분야에서 공지된 기법에 따라 발효기에서 증식되고 배양될 수 있다. 그 후, 본 발명의 항체, 그의 항체 단편, 또는 그의 유도체가 배양 배지, 세포 용해물 또는 세포막 분획으로부터 분리될 수 있다. 미생물에 의해 또는 다른 방식에 의해 발현된 본 발명의 항체, 항체 단편, 또는 그의 유도체의 분리 및 정제가 통상적인 수단, 예를 들면, 제조용 크로마토그래피 분리(preparative chromatographic separation) 및 단일클론 항체 또는 다중클론 항체의 이용을 포함하는 것과 같은 면역학적 분리에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 숙주는 박테리아, 균류, 식물, 양서류, 또는 동물 세포이다. 바람직한 동물 세포는 CHO(Chinese hamster ovary) 세포(CHO cell, ATCC CCL-61) 또한 그의 디히드로폴레이트 리덕타아제-결핍 균주 (Urlaub, G. and Chasin, L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220), BHK(baby hamster kidney) 세포, 원숭이 신장 세포(COS) (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182 and ATCC CRL-1650), 3T3 세포 또는 마우스 섬유모세포로부터 유래된 NIH3T3 세포 (ATCC No.CRL-1658), NS0 세포 및 인간 세포, 예를 들면, Per.C6을 포함한 다수의 다른 세포 계통을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 상기 동물 세포는 곤충 세포이다. 바람직한 곤충 세포는 SF9 세포 계통의 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 보다 바람직한 구체예에서, 상기 숙주는 인간 세포 또는 인간 세포 계통이다. 상기 인간 세포는 인간 배아 신장 세포(HEK293, 293T, 293 freestyle)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 인간 세포 계통은 HeLa 세포, 인간 간세포 육종 세포(human hepatocellular carcinoma cell)(예를 들면, Hep G2), A549 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체를 제조하기 위해 이용될 수 있는 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 형질전환 비-인간(non-human) 동물을 제공한다. 항체는 염소, 소, 말, 돼지, 랫트, 마우스, 토끼, 햄스터 또는 기타 포유류의 젖, 혈액 또는 소변과 같은 조직 또는 체액에서 제조되고 그로부터 회수될 수 있다. 예를 들면, 미국특허 제5,827,690호; 제5,756,687호; 제5,750,172호; 및 제5,741,957호를 참조한다. 전술된 바와 같이, 인간 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 비-인간 형질전환 동물이 AXL 또는 그의 일부에 의해 면역화시키는 것에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체의 합성을 가능하게 하는 조건 하에서 본 발명의 숙주를 배양하는 단계 및 상기 배양물로부터 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 항체의 제조 방법에 관한 것이다.

최적의 세포 성장을 달성하기 위해 당해 기술 분야에서 공지된 기법에 따라 형질전환된 세포가 발효기에서 증식되고 배양될 수 있다. 일단 발현되면, 본 발명의 전체 항체, 그들의 이량체(dimer), 개별적인 경쇄 및 중쇄, 또는 다른 면역글로불린 형태가 암모늄 술페이트 침전, 친화도 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한, 당해 기술 분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다; Scopes, "Protein Purification", Springer- Verlag, N.Y. (1982)를 참조한다. 본 발명의 항체 또는 그의 상응하는 면역글로불린 사슬(들)이 그 후 성장 배지, 세포 용해액 또는 세포막 분획으로부터 분리될 수 있다. 예를 들면, 미생물에 의해 발현된 본 발명의 항체 또는 면역글로불린 사슬의 분리 및 정제가 예를 들면, 제조용 크로마토그래피 분리 및 예를 들면, 본 발명의 항체의 불변 영역에 대한 단일클론 항체 또는 다중클론 항체의 이용을 포함하는 것과 같은 면역학적 분리와 같은 통상적인 수단에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 항체가 예를 들면, 약물 표적화 및 영상화(imaging) 적용을 위해 다른 모이어티에 더 결합될 수 있다는 것이 당해 기술 분야의 당업자에게 자명할 것이다. 그와 같은 결합은 항체 또는 항원의 발현 후에 결합 부위로 화학적으로 수행될 수 있거나, 또는 결합 생성물(coupling product)이 DNA 수준에서 본 발명의 항체 또는 항원 내로 도입되도록 조작될 수 있다. 그 후, DNA가 적합한 숙주 시스템에서 발현되고, 발현된 단백질이 회수되고, 필요한 경우, 재생된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 항체는 방사성 동위원소 또는 독성 화학요법제와 같은 효과기(effector)에 결합된다. 바람직하게는, 이 항체 접합물(conjugate)이 제거를 위해, AXL을 발현하는 세포, 예를 들면, 암세포의 표적화에 유용하다. 본 발명의 항체/항체 단편의 방사성 동위원소로의 연결은 예를 들면, 종양 치료에 장점을 제공한다. 화학요법 및 다른 형태의 암 치료와 달리, 방사성면역요법(radioimmunotherapy) 또는 방사성 동위원소-항체 조합의 투여는 암세포를 직접적으로 표적화하고, 주변의 정상, 건강 조직에 대해 손상을 최소화한다. 바람직한 방사성동위원소는 예를 들면, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I를 포함한다.

또한, 본 발명의 항체는 겔다나마이신(geldanamycin)(Mandler et al., J. Natl. Cancer Inst., 92(19), 1549-51 (2000) 및 마이탄신(maytansin), 예를 들면, 마이탄시노이드 약물(maytansinoid drug), DM1 (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:8618-8623 (1996) 및 오리스타틴(auristatin)-E 또는 모노메틸라우리스타틴-E (Doronina et al., Nat. Biotechnol. 21:778-784 (2003)) 또는 칼리케아미시트(calicheamicit)와 같은 독성 화학요법제와 접합된 경우, 암을 치료하기 위해 이용될 수 있다; 산성 또는 환원성 조건 하에서 또는 특정한 프로테아제에 노출되면 약물을 방출하는 상이한 링커가 이 기술과 함께 이용된다. 본 발명의 항체는 당해 기술 분야에서 기재된 바와 같이 접합될 수 있다.

본 발명의 구체예 중 하나는 본 발명의 항체 또는 그의 기능성 단편의 화학적 변형이다. 중합체(폴리에틸렌 글리콜 등)와 같은 분자가 변형된 항체 또는 변형된 기능성 단편을 생성하기 위해 이용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체, 핵산 분자, 벡터, 숙주 또는 본 발명의 방법에 의해 수득된 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "조성물(composition)"은 하나 이상의 본 발명의 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 그와 같은 조성물은 약제학적 조성물 또는 진단용 조성물이다.

상기 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 희석제를 포함하는 것이 바람직하다. 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 AXL 발현, 그의 과다발현 또는 과다활성과 연관되거나, 이를 동반하거나 또는 이에 의해 유발되는 질병, 예를 들면, 과다증식 질환, 심혈관 질환, 특히, 죽상동맥경화증 및 혈전증, 당뇨병 관련 질환, 특히, 사구체 비대증 또는 당뇨병성 신병증의 치료를 위해 부분적으로 유용할 수 있다. 상기 질환은 암, 예를 들면, 유방암, 결장암, 폐암, 신장암, 여포성 림프종, 골수성 백혈병, 피부암/흑색종, 교모세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 바렛 식도 및 식도암, 위암, 방광암, 경부암, 간암, 갑상선암, 및 두경부암, 또는 증식성(hyperplastic) 및 종양성(neoplastic) 질환, 또는 기타 AXL 발현 또는 과다발현 질환을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어 "과다활성(hyperactivity)"은 음성 조절(negative regulation)의 부족 및/또는 기능부전에 의해 유발될 수 있는 비제어 AXL 신호전달을 의미한다. 예로서, 음성 조절은 단백질 탈인산화, 분해 및/또는 엔도사이토시스(endocytosis)를 포함한다. 또한, 비제어 AXL 신호전달은 체세포 또는 생식계통의 유전적 변형의 결과일 수 있고, 이는 AXL 아미노산 서열의 변화를 초래한다.

적합한 약제학적 담체, 부형제, 및/또는 희석제의 예가 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있고 인산염 완충 염수 용액, 물, 유/수 에멀젼(oil/water emulsion)과 같은 에멀젼, 다양한 종류의 습윤제, 멸균 용액 등을 포함한다. 그와 같은 담체를 포함하는 조성물은 잘 알려진 통상적인 방법에 의해 제제화될 수 있다. 이 약제학적 조성물은 적합한 투여량으로 개체에게 투여될 수 있다. 적합한 조성물의 투여는 상이한 방법, 예를 들면, 정맥내 투여, 복막내 투여, 피하 투여, 근육내 투여, 국소 투여, 피내(intradermal) 투여, 비강내 투여 또는 기관지내 투여에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 예를 들면, 뇌와 같은 외부 또는 내부 표적 부위로의 바이올리스틱(biolistic) 전달에 의해, 표적 부위로 직접 투여될 수 있다. 투여 계획(dosage regimen)은 주치의 및 임상적 인자들에 의해 결정될 것이다. 의학 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 특정 환자에 대한 투여량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여대상 특정 화합물, 성별, 투여 시간 및 경로, 전반적 건강 및 동시에 투여되는 다른 약물을 포함한 다수의 인자들에 의존적이다. 단백질성 약제학적 활성 물질이 투여량 당 1 ㎍ 내지 100 mg/kg 체중의 양으로 존재할 수 있다; 그러나, 이 대표적인 범위 미만이거나 또는 이를 초과하는 투여량이 예상되며, 특히, 전술된 인자들을 고려할 때 그러하다. 투여 계획이 연속 주입인 경우, 분당 체중 킬로그램당 1 pg 내지 100 mg의 범위이어야 한다.

주기적 평가에 의해 진행이 모니터링될 수 있다. 본 발명의 조성물은 국소로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 비경구 투여용 제제는 멸균 수성 용액 또는 비-수성 용액, 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비-수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올리에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 물, 알코올/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들면, 염수 및 완충 배지를 포함한다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 링거 덱스트로오스(Ringer's dextrose), 덱스트로오스 및 염화나트륨, 락테이트화 링거(lactated Ringer's) 또는 고정유(fixing oil)를 포함한다. 정맥내 비히클은 유체 및 영양분 보충물(nutrient replenisher), 전해질 보충물(예를 들면, 링거 덱스트로오스에 기반한 보충물) 등을 포함한다. 또한 예를 들면, 항미생물제, 항산화제, 킬레이트제, 비활성 기체 등과 같은 보존제 및 기타 첨가제가 존재할 수 있다. 또한, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 조성물의 의도된 용도에 따라 작용제를 더 포함할 수 있다.

약제학적 조성물은 하나 이상의 추가적인 활성제, 예를 들면, 추가적인 항신생물제(antineoplastic agent), 소형 분자 억제제, 항-종양제, 화학요법제 또는 이들의 조합을 포함하는 것이 특히 바람직하다.

본 발명은 또한 하나 이상의 추가적인 항신생물제와 조합된 본 발명의 항-Axl 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 조합은 예를 들면, 비정상적 세포 증식을 억제하는데 효과적이다.

다수의 항신생물제가 현재 당해 기술 분야에서 알려져 있다. 일반적으로, 상기 용어는 과다증식 질환의 예방, 경감 및/또는 치료를 수행할 수 있는 모든 작용제를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 항신생물제는 항체 또는 면역조절성(immunomodulatory) 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는 치료 단백질의 군으로부터 선택된다. 또 다른 구체예에서, 상기 항신생물제는 유사분열 억제제(mitotic inhibitor), 키나아제 억제제, 알킬화제, 항-대사산물, 인터칼레이팅 항생제(intercalating antibiotic), 성장 인자 억제제, 세포 주기 억제제, 효소, 토포이소머라아제 억제제, 히스톤 탈아세틸라아제 억제제(histone deacelyase inhibitor), 항-생존제(anti-survival agent), 생물학적 반응 조절제(biological response modifier), 항-호르몬, 예를 들면, 항-안드로겐, 및 항혈관형성제(antiangiogenesis agent)로 구성된 소형 분자 억제제 또는 화학요법제의 군으로부터 선택된다.

본 명세서에서 제공된 항체와 조합되어 이용될 수 있는 항신생물제의 구체적 예는 예를 들면, 게피티니브(gefitinib), 라파티니브(lapatinib), 수니티니브(sunitinib), 페메트렉스드(pemetrexed), 베바시수마브(bevacisumab), 세툭시마브(cetuximab), 이마티니브(imatinib), 트라스투주마브(trastuzumab), 알렘투주마브(alemtuzumab), 리툭시마브(rituximab), 에를로티니브(erlotinib), 보르테조미브(bortezomib) 등을 포함한다. 본 명세서에 기재되고 본 명세서에서 청구된 조성물에서 사용되는 다른 특정한 항신생물제는 예를 들면, 카페시타빈(capecitabine), 다우노루비신(daunorubicin), 다우노마이신(daunomycin), 닥티노마이신(dactinomycin), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 이다루비신(idarubicin), 에소루비신(esorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 마포스파미드(mafosfamide), 이포스파미드(ifosfamide), 시토신 아라비노시드(cytosine arabinoside), 비스-클로로에틸니트로스우레아(bis-chloroethylnitrosurea), 부술판(busulfan), 미토마이신(mitomycin) C, 액티노마이신(actinomycin) D, 미트라마이신(mithramycin), 프레드니손, 히드록시프로게스테론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카르바진(dacarbazine), 프로카르바진, 헥사메틸멜라민(hexamethylmelamine), 펜타메틸멜라민, 미톡산트론(mitoxantrone), 암사크린(amsacrine), 클로람부실(chlorambucil), 메틸시클로헥실니트로스우레아(methylcyclohexylnitrosurea), 질소 머스터드(nitrogen mustard), 멜팔란(melphalan), 시클로포스파미드, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈(CA), 5-아자시티딘, 히드록시우레아, 데옥시코포르마이신(deoxycoformycin), 4-히드록시퍼옥시시클로포스포라미드(4-hydroxyperoxycyclophosphoramide), 5-플루오로우라실(5-FU), 5-플루오로데옥시우리딘(5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜치신, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 트리메트렉세이트(trimetrexate), 테니포시드(teniposide), 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)과 같은 화학요법제를 포함한다. 전반적으로, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1987, pp. 1206-1228, Berkow et al., eds., Rahway, N.J.를 참조한다. 특히, 아폽토시스를 유도하는 항신생물제가 바람직하다.

본 발명은 또한 두 개 이상의 본 발명의 항체를 포함하는 다중클론 항체에 관한 것이다.

기재된 AXL 항체와 함께 사용되는 경우, 그와 같은 항신생물제는 개별적으로(예를 들면, 5-FU와 항체), 순차적으로(예를 들면, 일정 기간 동안 5-FU 및 항체 사용 및 뒤이어 MTX와 항체), 또는 하나 이상의 그와 같은 항신생물제와 조합하여(예를 들면, 5-FU, MTX와 항체, 또는 5-FU, 방사선요법 및 항체) 이용될 수 있다.

용어 "항신생물제"는 또한 치료적 절차, 예를 들면, 방사선 조사 또는 방사선 요법을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 인간 의약에서 이용될 수 있고, 수의학 목적으로도 이용될 수 있다.

추가적으로, 본 발명은 과다증식 질환, 심혈관 질환, 특히, 죽상동맥경화증 및 혈전증, 당뇨병 관련 질환, 특히, 사구체 비대증 또는 당뇨병성 신병증, 및 특히, AXL 발현, 과다발현 또는 과다활성과 연관되거나, 이를 동반하거나, 또는 이에 의해 유발된 질환의 진단, 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에서 본 발명의 항체, 핵산 분자, 벡터, 또는 본 발명의 숙주 또는 본 발명의 방법에 의해 수득되는 항체의 용도에 관한 것이다.

전술된 과다증식 질환은 종양 형성(neoplasia), 즉, 조직의 비정상적 및/또는 제어되지 않는 새로운 증식을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "조직의 제어되지 않는 새로운 증식(uncontrolled new growth of tissue)"은 성장 조절의 기능부전 및/또는 상실에 의존적일 수 있다. 과다증식 질환은 종양 질환 및/또는 암, 예를 들면, 전이성 암 또는 침습성 암을 포함한다.

본 발명의 용도의 바람직한 구체예에서, 상기 과다증식 질환은 특히, 유방암, 결장암, 폐암, 신장암, 여포성 림프종, 골수성 백혈병, 피부암/흑색종, 교모세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 바렛 식도 및 식도암, 위암, 방광암, 경부암, 간암, 갑상선암, 및 두경부암, 또는 증식성(hyperplastic) 및 종양성(neoplastic) 질환, 또는 기타 AXL 발현 또는 과다발현 과다증식 질환이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 전술된 질병 중 하나의 치료를 위해 항신생물제와 병용-투여하기 위한 약제의 제조를 위한, 본 발명의 인간화 항-AXL 항체의 용도에 관한 것이다.

추가적인 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 약물 내성 암의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 본 발명의 인간화 항-AXL 항체의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체, 핵산 분자, 벡터, 본 발명의 숙주, 또는 본 발명의 방법에 의해 수득된 항체 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 진단용 조성물은 시료를 본 발명의 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 시료 중의 AXL의 존재 여부를 검출하는 단계를 포함하는, 상이한 세포, 조직 또는 다른 적합한 시료에서 포유동물 AXL의 바람직하지 않은 발현, 과다발현 또는 과다활성의 검출에서 유용하다. 따라서, 본 발명의 진단용 조성물은 과다증식 질환의 발병 또는 질병 상태를 평가하기 위해 이용될 수 있다.

또한, AXL을 발현하는 암세포와 같은 악성종양 세포가 본 발명의 항체에 의해 표적화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체를 결합한 세포들은 보체 시스템(complement system)과 같은 면역계 기능에 의해 또는 세포-매개 세포독성에 의해 공격받을 수 있고, 그에 의해 암세포의 수를 감소시키거나 또는 암세포를 제거할 수 있다. 이와 같은 고려는 전이 및 재발성 종양의 치료에 동일하게 적용된다.

본 발명의 또 다른 양태에서, 본 발명의 항체는 표지화 그룹에 결합된다. 앞서 요약된 바와 같이, 그와 같은 항체는 특히 진단 적용을 위해 적합하다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "표지화 그룹(labelling group)"은 검출가능한 마커, 예를 들면, 방사성표지 아미노산 또는 표지된(marked) 아비딘에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티를 의미한다. 항체와 같은, 폴리펩티드 및 당단백질을 표지화하는 다양한 방법들이 당해 분야에서 알려져 있고 본 발명의 실시에서 이용될 수 있다. 적합한 표지화 그룹의 예는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종 (예를 들면, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I), 형광 그룹(예를 들면, FITC, 로다민, 란타니드 포스포르(lanthanide phosphor)), 효소 그룹(예를 들면, 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), β-갈락토시다아제, 루시페라아제, 알칼리 포스파타아제), 화학발광 그룹, 비오티닐 그룹, 또는 이차 리포터에 의해 인식되는 소정의(predetermined) 폴리펩티드 에피토프(예를 들면, 루이신 지퍼 쌍(leucine zipper pair) 서열, 이차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 택(epitope tag)).

일부 양태에서, 잠재적인 입체 방해(steric hindrance)를 감소시키기 위해 표지화 기(labelling group)가 다양한 길이의 스페이서 암(spacer arm)에 의해 결합되는 것이 바람직할 수 있다

또 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 그들의 표면에 AXL을 갖는 것으로 의심되는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, AXL 발현 세포의 존재에 대해 평가하는 방법에 관한 것이다. 시료 중의 AXL 발현을 검출하는 적합한 방법은 ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 또는 IHC(lmmunohistochemistry)일 수 있다.

ELISA 분석법은 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate) 포맷에서 수행될 수 있고, 예를 들면, 상기 마이크로타이터 플레이트의 웰에 AXL 항체가 흡착되어 있다. 웰을 세정하고 분석물의 비특이적 결합을 막기 위해 우유 단백질 또는 알부민과 같은 블록킹제(blocking agent)로 처리한다. 뒤이어, 상기 웰을 테스트 시료로 처리한다. 테스트 시료 또는 표준을 세정에 의해 제거한 후, 웰을 표지된, 예를 들면, 비오틴과의 접합에 의해 표지된 제2 AXL 항체로 처리한다. 과량의 제2 항체를 세정에 의해 제거한 후, 표지를 예를 들면, 아비딘-접합 호스래디쉬 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP) 및 적합한 발색(chromogenic) 기질에 의해 검출한다. 테스트 시료 중의 AXL 항원의 농도는 표준 시료로부터 작성된 표준 곡선과의 비교에 의해 결정한다.

IHC의 경우, 파라핀-포매(paraffin-embedded) 조직이 이용될 수 있으며, 상기 조직을 예를 들면, 먼저 자일렌에서 파라핀을 제거시키고, 예를 들면, 에탄올로 탈수시키고, 증류수로 세정한다. 포르말린-고정 및 파라핀-포매에 의해 가려진 항원성 에피토프를 에피토프 탈마스킹(unmasking), 효소 처리 또는 사포닌에 의해 노출시킬 수 있다. 에피토프 탈마스킹을 위해, 파라핀 절편을 예를 들면, 2N HCl 용액(pH 1.0)과 같은 에피토프 복구 용액(epitope retrieval solution)에 넣고 스티머(steamer), 수조 또는 마이크로웨이브 오븐에서 20 내지 40분 동안 가열할 수 있다. 효소 처리의 경우, 조직 절편을 프로테이나아제 K, 트립신, 프로나아제(pronase), 펩신 등과 같은 상이한 효소 용액에서 37℃에서 10 내지 30분 동안 인큐베이션시킬 수 있다. 에피토프 복구 용액 또는 과량의 효소를 세정에 의해 제거한 후, 비특이적 상호작용을 막기 위해 조직 절편을 블록킹 완충액(blocking buffer)으로 처리한다. 일차 AXL 항체를 적합한 농도로 첨가한다. 과량의 일차 항체를 세정에 의해 제거하고 절편을 실온에서 10분 동안 퍼옥시다아제 블록킹 용액에서 인큐베이션시킨다. 또 다른 세척 단계 후에, 조직 절편을 제2 표지 항체, 예를 들면, 효소의 고정물(anchor)로 작용할 수 있는 작용기(group)로 표지된 항체와 인큐베이션시킨다. 따라서, 예는 스트렙타비딘 결합된 호스래디쉬 퍼옥시다아제에 의해 인식되는 비오틴 표지된 이차 항체이다. 항체/효소 복합체의 검출은 적합한 발색성 기질과의 인큐베이션에 의해 달성된다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 AXL 기능을 차단할 수 있는 본 발명의 항체를 조건 하에 그들의 표면상에 AXL을 갖는 것으로 의심되는 세포 또는 조직과 접촉시키는 단계를 포함하는, AXL 기능을 차단하는 방법에 관한 것이다. 상기 접촉은 인 비트로 또는 인 비보일 수 있다.

본 발명은 또한, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명의 항체 또는 항체 단편 또는 그의 유도체의 적당한 투여량을 투여하는 단계를 포함하는, 과다증식 질환, 심혈관 질환, 특히, 죽상동맥경화증 및 혈전증, 당뇨병 관련 질환, 특히, 사구체 비대증 또는 당뇨병성 신병증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 과다증식 질환은 바람직하게는, 암, 예를 들면, 유방암, 결장암, 폐암, 신장암, 여포성 림프종, 골수성 백혈병, 피부암/흑색종, 교모세포종, 난소암, 전립선암, 췌장암, 바렛 식도 및 식도암, 위암, 방광암, 경부암, 간암, 갑상선암, 및 두경부암, 또는 증식성(hyperplastic) 및 종양성(neoplastic) 질환, 또는 기타 AXL 발현 또는 과다발현 과다증식 질환과 같은 AXL 발현, 과다발현, 과다활성과 연관되거나, 이를 동반하거나 또는 이에 의해 유발된 질환으로부터 선택된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따라, 치료 대상 암은 약물 내성 암, 바람직하게는 전술된 암의 군으로부터 선택된 암이다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체가 포유동물에게 투여되고, 질병은 AXL의 발현 또는 활성의 비정상적 수준과 직접적으로 또는 간접적으로 상관되는 것인 질병의 치료 방법에 관한 것이다.

마지막으로, 본 발명은 항-AXL 항체, 바람직하게는 본 발명의 항체, 항체 단편 또는 그의 유도체, 상기 성분을 코딩하는 핵산 분자 및/또는 본 발명의 벡터를 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 모든 구체예가 약제의 제조를 위해 단일 화합물로 또는 조합되어 이용될 수 있다.

도 1: 이 도면은 h#11B7-T1L 내지 h#11B7-T7L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 2: 이 도면은 h#11B7-T8L 내지 h#11B7-T14L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 3: 이 도면은 h#11B7-T15L 내지 h#11B7-T20L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 4: 이 도면은 h#11B7-T1H 내지 h#11B7-T6H로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 중쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 5: 이 도면은 h#11B7-T7H 내지 h#11B7-T12H로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 중쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 6: 이 도면은 h#11D5-T1L 내지 h#11D5-T7L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 7: 이 도면은 h#11D5-T8L 내지 h#11D5-T14L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 8: 이 도면은 h#11D5-T15L 내지 h#11D5-T21L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 9: 이 도면은 h#11D5-T22L 내지 h#11D5-T28L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 10: 이 도면은 h#11D5-T29L 내지 h#11D5-T35L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 11: 이 도면은 h#11D5-T36L 및 h#11D5-T37L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 12: 이 도면은 h#11D5-T1H 내지 h#11D5-T7H로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 중쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 13: 이 도면은 h#11D5-T8H 내지 h#11D5-T13H로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 중쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 기재한다.
도 14: 이 도면은 프라이머 EFF1 및 EfsmR, 인간 카파 사슬의 분비 신호 및 불변 영역 및 폴리 (A) 첨가 서열을 포함하는 단편 B, 인간 IgG1 신호 및 불변 모메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 단편, 및 리더 서열의 뉴클레오티드 서열, 및 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11B7 및 11D5의 CDR, 키메라 #11B7 항체 중쇄 및 경쇄(IgG1/kappa), 키메라 #11D5 항체 중쇄 및 경쇄(IgG1/Kappa) 및 리더 서열의 아미노산 서열을 기재한다.
도 15: A. Rat1-Mock 및 Rat1-AXL cl.2 섬유모세포에서 세포 표면 AXL의 유세포 분석법(flow cytometry analysis). 각각 pLXSN 및 pLXSN-hAXL 이코트로픽 바이러스에 의한 Rat1 섬유모세포의 감염에 의해 생성된 다중클론 Rat1-Mock 및 클론성 Rat1-AXL cl.2 세포를 수집하고 3㎍/ml의 마우스 대조군 항체 72A1 (좌측 패널) 또는 마우스 항-AXL MAB154 일차 항체 (우측 패널) 및 PE-접합 항-마우스 이차 항체로 염색했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Rat1-AXL cl.2 세포의 염색은 1000배(three orders of magnitude)의 변화를 보여주고 이 세포의 표면에서 AXL 과다발현을 입증한다.
B. NIH3T3-Mock 및 NIH3T3-AXL cl.7 섬유모세포에서 세포 표면 AXL의 유세포 분석법. 각각 pLXSN 및 pLXSN-hAXL 이코트로픽 바이러스에 의한 NIH3T3 섬유모세포의 감염에 의해 생성된 다중클론 NIH3T3-Mock 및 클론성 NIH3T3-AXL cl.7 세포를 수집하고 3㎍/ml의 마우스 대조군 항체 72A1 (좌측 패널) 또는 마우스 항-AXL MAB154 일차 항체 (우측 패널) 및 PE-접합 항-마우스 이차 항체로 염색했다. 세부사항은 본문을 참조한다. NIH3T3-AXL cl.7 세포의 염색은 100배(two orders of magnitude)의 변화를 보여주고 이 세포의 표면에서 AXL 과다발현을 입증한다.
도 16: 누드 마우스에서 인간 전립선 육종 성장에 대한 랫트 항-AXL 항체의 효과를 조사하기 위한 동소 이종이식 모델. PC-3-LN 전립선 육종 세포를 NMR-nu/nu 마우스의 전립선에 동소로 이식하였다. 동물들을 무작위로 4개의 그룹으로 나누고 25 mg/kg의 이소형 대조군 항체 1D5 또는 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7, 및 40 mg/kg의 Sutent 또는 12.5 mg/kg Taxotere를 투여하였다. 처리기간 동안, 동소 증식 PC-3-LN 종양의 성장 및 주변 전이를 15일 차, 23일 차, 29일 차, 및 34일 차에 인 비보 생물발광 이미징을 통해 1주일에 1회 모니터링했다. 세부 사항은 본문을 참조한다. 이소형 대조군 항체 1D5 대비, 본 발명의 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7은 누드 마우스에서 PC-3-LN 전립선 종양의 전체 성장을 감소시켰다.
도 17: 누드 마우스에서 인간 전립선 육종 전이에 대한 랫트 항-AXL 항체의 효과를 조사하기 위한 동소 이종이식 모델. PC-3-LN 전립선 육종 세포를 NMR-nu/nu 마우스의 전립선에 동소로 이식하였다. 동물들을 무작위로 4개의 그룹으로 나누고 25 mg/kg의 이소형 대조군 항체 1D5 또는 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7, 및 40 mg/kg의 Sutent 또는 12.5 mg/kg Taxotere를 투여하였다. 부검 후에, 선택된 기관(간, 비장, 폐, 대퇴골, 및 요추의 일부)을 회수하고 생체발광 이미징을 통해 전이의 존재에 대해 분석하였다. 세부 사항은 본문을 참조한다. 이소형 대조군 항체 1D5 대비, 본 발명의 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7은 비장 전이의 발생을 감소시켰다. 주목할 만한 것은, 본 실험에서 11B7의 항-전이 효과가 Sutent의 효과보다 더 강했다는 것이다.
도 18: 이 도면은 벡터 pEF6KCL의 작제도를 도시한다.
도 19: 이 도면은 인간 AXL-Fc 코팅 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 결정된 랫트 항 인간화 항체 h#11B7-T1 내지 h#11B7-T6의 결합 활성을 도시한다.
도 20: 이 도면은 인간 AXL-Fc 코팅 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 결정된 랫트 항 인간화 항체 h#11B7-T7 내지 h#11B7-T13의 결합 활성을 도시한다.
도 21: 이 도면은 인간 AXL-Fc 코팅 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 결정된 랫트 항 인간화 항체 h#11B7-T14 내지 h#11B7-T20의 결합 활성을 도시한다.
도 22: 이 도면은 인간 AXL-Fc 코팅 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 결정된 랫트 항 인간화 항체 h#11B7-T21 내지 h#11B7-T27의 결합 활성을 도시한다.
도 23: 이 도면은 인간 AXL-Fc 코팅 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 결정된 랫트 항 인간화 항체 h#11D5-T1 내지 h#11D5-T6의 결합 활성을 도시한다.
도 24 (상단 패널 및 하단 패널): 이 도면은 직접적인 단백질 흡광도 분석에 의해 결정된 랫트 항-인간 AXL 인간화 항체 h#11B7-T1 내지 h#11B7-T27의 단백질 농도를 도시한다.
도 25: 이 도면은 직접적인 단백질 흡광도 분석에 의해 결정된 랫트 항-인간 AXL 인간화 항체 h#11D5-T1 내지 h#11D5-T6의 단백질 농도를 도시한다.
도 26: 이 도면은 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7이 인간 AXL 항원에 결합하는 도메인의 결정을 도시한다.
도 27. Axl 수용체 인산화에 대한 인간화 11B7 항- AXL 항체의 효과를 조사하기 위한 ELISA 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 본 발명의 키메라 항-Axl mAb chm11B7 (IgG1/Kappa) 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6과 예비-인큐베이션시키고, 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하에 처리하고, 용해시켰다. 용해물(lysate)을 항-포스포-티로신 항체 4G10-코팅 Maxi-Sorp 96 웰 플레이트로 옮기고, 그 후 세척하고, 0.125 ㎍/ml의 비오티닐화 랫트 항-Axl 항체 12B7, AP-접합 스트렙타비딘 및 AttoPhos 기질 용액과 인큐베이션시켜 형광 강도를 수집했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 상기 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 상응하는 Gas6-미처리(non-stimulated) 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 Axl 티로신 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, 두 세포주 모두에서 Gas6-매개 Axl 활성화를 차단하거나 또는 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.
도 28a. ERK1 /2 인산화에 대한 인간화 항- Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 웨스턴 블롯 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 본 발명의 키메라 항-Axl mAb chm11B7 (IgG1/Kappa) 또는 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6과 예비-인큐베이션시키고, 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하에 처리하고, 용해시켰다. 전세포 용해물(whole cell lysate)을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 항-포스포-p44/42 MAP 키나아제 (Thr202/Tyr204) 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. 뒤이어, 동일한 필터를 항-p44/42 MAP 키나아제 항체 항체로 재-탐색(re-probe)했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm 11B7 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 Hs578T 유방암 세포에서 ERK1/2 활성화의 약한, Gas6-유도 증가를 방해했다. 그러나, 이 세포주에서 ERK1/2의 높은 기본 활성(basal activity) 때문에, 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 ERK1/2 Thr202/Tyr204 인산화 수준에 의해 표시된 효과는 비교적 적절한(moderate) 것에 불과한 것으로 보인다. 대조적으로, ERK1/2 Thr202/Tyr204 인산화에 대한 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 또는 h#11B7-T6의 저해 효과는 NCI-H292 폐암 세포에서 보다 명백하게 반영된다.
도 28b. AKT 인산화에 대한 인간화 11B7 항- Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 웨스턴 블롯 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 키메라 항-Axl mAb chm11B7 (IgG1/Kappa) 또는 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6과 예비-인큐베이션시키고, 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하에 처리하고, 용해시켰다. 전세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 항-AKT1/2/3 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. 뒤이어, 동일한 필터를 항-포스포-AKT (Ser473) 항체로 재-탐색했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm 11B7 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)에서, 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 AKT Ser473 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이 Gas6-유도 AKT 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.
도 28c. GSK -3β 인산화에 대한 인간화 11B7 항- Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 웨스턴 블롯 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하의 처리 전에 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 키메라 항-Axl mAb chm11B7 (IgG1/Kappa) 또는 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6과 예비-인큐베이션시키고, 용해시켰다. 전세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 항-포스포-GSK-3β (Ser9) 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. 뒤이어, 동일한 필터를 항-GSK-3β 항체로 재-탐색했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm 11B7 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)에서, 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 GSK-3β Ser9 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이 Gas6-유도 GSK-3β 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.
도 28d. TCS2 인산화에 대한 인간화 11B7 항- Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 웨스턴 블롯 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하의 처리 전에 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 키메라 항-Axl mAb chm11B7 (IgG1/Kappa) 또는 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6과 예비-인큐베이션시키고, 용해시켰다. 전세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 항-TSC2 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. 뒤이어, 동일한 필터를 항-포스포-TSC2 (Thr1462)로 재-탐색했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm 11B7 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)에서, 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 이 아미노산 잔기의 감소된 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, Thr1462에서 TCS2의 Gas6-유도 인산화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.
도 28e. mTOR 인산화에 대한 인간화 11B7 항-Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 웨스턴 블롯 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하의 처리 전에 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 키메라 항-Axl mAb chm11B7 (IgG1/Kappa) 또는 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6과 예비-인큐베이션시키고, 용해시켰다. 전세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 항-포스포-mTOR (Ser2448) 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. 뒤이어, 동일한 필터를 항-mTOR 항체로 재-탐색했다. 세부사항은 본문을 참조한다. 상기 항-Axl 항체의 억제 효과는 Hs578T 유방암 세포 (상단)에서 비교적 약했다. 그러나, Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 상응하는 Gas6-미처리 세포(하단) 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 mTOR Ser2448 인산화에 의해 표시된 바와 같이, NCI-H292 폐암 세포 중 Gas6-유도 mTOR 활성화를 방해할 수 있었다.
도 28f. S6K1 인산화에 대한 인간화 11B7 항- Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 웨스턴 블롯 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하의 처리 전에 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 키메라 항-Axl mAb chm11B7 (IgG1/Kappa) 또는 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6과 예비-인큐베이션시키고, 용해시켰다. 전세포 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리시키고 항-포스포-p70 S6 키나아제 1 (Thr421/Ser424) 항체를 이용한 웨스턴 블롯팅에 의해 분석했다. 뒤이어, 동일한 필터를 항-β-액틴 항체로 재-탐색했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm 11B7 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 S6K1 Thr421/Ser424 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, Hs578T 유방암 세포에서, Gas6-유도 S6K1 활성화에 대한 어느 정도의 억제 효과를 보였다(상단). 그러나, NCI-H292 폐암 세포에서, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 또는 h#11B7-T6에 의한 예비-처리 후 활성화 후, Gas6-유도 S6K1 Thr421/Ser424 인산화의 훨씬 더 강한 감소 및 따라서, 활성화를 관찰할 수 있었다(하단).
도 29. Axl 수용체 인산화에 대한 인간화 11 D5 항- Axl 항체의 효과를 조사하 기 위한 ELISA 실험. Hs578T 유방암 세포를 굶기고 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 키메라 항-Axl mAb chm11D5 (IgG1/Kappa) 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11D5-T2, h#11D5-T3, h#11D5-T4, h#11D5-T5, 및 h#11D5-T6과 예비-인큐베이션시키고, 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하에 처리하고, 용해시켰다. 용해물을 항-포스포-티로신 항체 4G10-코팅 Maxi-Sorp 96 웰 플레이트로 옮기고, 세척하고, 0.125 ㎍/ml 비오티닐화 랫트 항-Axl 항체 12B7, AP-접합 스트렙타비딘 및 AttoPhos 기질 용액과 인큐베이션시켜 형광 강도를 수집했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 본 발명의 키메라 항-Axl mAb chm11D5 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11D5-T2, h#11D5-T3, h#11D5-T4, h#11D5-T5, 및 h#11D5-T6는 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 Axl 티로신 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이 Gas6-매개 Axl 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.
도 30A: 인간 Axl의 아미노산 서열, NCBI 단백질 데이터베이스의 등록 번호 P_30530
도 30B: 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11B7의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
도 30C: 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11B7의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
도 30D: 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11D5의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
도 30E: 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11D5의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
도 31. Axl 인산화에 대한 랫트 및 키메라 항- Axl 항체의 효과를 비교하기 위한 ELISA 실험. CaSki 자궁 경부암 세포를 굶기고, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 300 ng/ml, 750 ng/ml, 1 ㎍/ml, 및 10 ㎍/ml의 랫트 항-Axl 항체 11B7 (A) 또는 키메라 항 Axl 항체 ch11B7 (B)과 예비-인큐베이션시키고, 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하에 처리하고, 용해시켰다. 용해물을 항-포스포-티로신 항체 4G10-코팅 Maxi-Sorp 96 웰 플레이트로 옮겼다. 그 후, 플레이트를 세척하고, 0.5 ㎍/ml의 비오티닐화 랫트 항-Axl 항체 12B7, AP-접합 스트렙타비딘, 및 AttoPhos 기질 용액과 인큐베이션시켜 형광 강도를 수집했다. 세부사항은 본문을 참조한다. 자궁경부암 세포주 CaSki에서 상대적 Axl 인산화의 농도-의존적 감소에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명의 랫트 항-Axl 항체 11B7 (A) 및 키메라 항-Axl 항체 ch11B7 (B)는 유사한 정도까지 수용체 티로신 키나아제 Axl의 리간드-유도 활성화를 차단할 수 있었다.
도 32a: 이 도면은 각각 h#11B7-T15L 및 h#11B7-T18L로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 경쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
도 32b: 이 도면은 각각 h#11B7-T11H 및 h#11B7-T12H로 표시된, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 중쇄의 인간화 가변 영역의 아미노산 서열을 도시한다.
도 33: 이 도면은 인간 AXL-Fc 코팅 플레이트를 이용한 ELISA에 의해 결정된 랫트 항-인간 AXL 인간화 항체 h#11B7-T28 내지 h#11B7-T31의 결합 활성을 나타낸다(ELISA).
도 34: 이 도면은 HPLC 분석법에 의해 결정된 랫트 항-인간 AXL 인간화 항체 h#11B7-T28 내지 h#11B7-T31의 단백질 농도를 나타낸다 (실시예 24 참조).
도 35a 내지 35 ee : 이 도면은 시차주사열량법(differential scanning calorimetry, DSC)에 의해 결정된 랫트 항-인간 AXL 인간화 항체 h#11B7-T1 내지 h#11B7-T31 및 키메라 h#11B7 항체의 Tm의 결정을 도시한다.
도 36. Axl 수용체 인산화에 대한 인간화 11B7 항- AXL 항체의 효과를 조사하기 위한 ELISA 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고, 항체 없이, 또는 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25와 예비-인큐베이션시키고, 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하에 처리하고, 용해시켰다. 용해물을 항-포스포-티로신 항체 4G10-코팅 Maxi-Sorp 96 웰 플레이트로 옮기고, 세척하고, 0.125 ㎍/ml의 비오티닐화 랫트 항-Axl 항체 12B7, AP-접합 스트렙타비딘 및 AttoPhos 기질 용액과 인큐베이션시켜, 형광 강도를 수집했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25는 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 Axl 티로신 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이 두 세포주 모두에서 Gas6-매개 Axl 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.
도 37. Akt - 키나아제 인산화 대한 인간화 11B7 항- Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 ELISA 실험. Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)를 굶기고, 항체 없이, 또는 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25와 예비-인큐베이션시키고, 400 ng/ml mGas6의 존재 또는 부재 하에 처리하고, 포름알데히드로 고정시켰다. 세포들을 세척하고, 퀀칭(quench)시키고, 항-포스포-Akt (Ser473) 일차 항체, HRP-접합 항-토끼 이차 항체 및 테트라메틸벤지딘 용액과 인큐베이션시켜, 흡광 강도를 측정했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체 대비, 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25는 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 Akt (Ser473) 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이 두 세포주 모두에서 Gas6-매개 Akt 키나아제 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.
도 38. Axl 수용체 내재화( internalization )에 대한 인간화 11B7 항- Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 FACS 분석. Hs578T 유방암 세포를 굶기고, 항체 없이, 또는 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체, 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25와 표시된 시간 동안 인큐베이션시키고, 포름알데히드로 고정시켰다. 세포들을 랫트 항-Axl mAb 2A1 일차 항체 및 PE-접합 당나귀-항-랫트 IgG 이차 항체로 염색시키고, FACS 분석을 수행했다. 세부사항은 본문을 참조한다. Gammagard 대조군 항체와 대조적으로, 인간화 항-Axl 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25에 의한 Hs578 유방암 세포의 처리는 Axl 수용체의 내재화를 초래한다. 개별적인 처리 기간의 미처리 시료 대비 항-Axl mAb 처리 시료의 평균 형광 강도로 정의된 상대적 Axl 발현 수준(%)이 표시된다.
도 39a 및 39b . Gas6 -유도 내피 세포 발아( sprouting )에 대한 인간화 11B7 항- Axl 항체의 효과를 조사하기 위한 스페로이드 ( spheorid )-기반 세포 혈관형성 분석. VEGF-A 예비-처리 HUVEC 스페로이드를 3D 콜라겐 겔 내에 포매시키고, 1 ㎍/ml 인간 Gas6으로 자극하고, 표시된 농도의 Gammagard 대조군 항체 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25로 24시간 동안 처리했다. 데이터 포인트 당 10개의 무작위로 선택된 스페로이드의 누적 발아(sprout) 길이의 평균±SEM으로 분석하고(좌측 패널) 항체에 의한 상대적 억제를 결정했다(우측 패널). IC₅₀ 곡선의 맞춤(fitting)과 IC₅₀ 값의 계산을 GraphPad Prism 4.03을 이용하여 수행했다. 세부사항은 본문을 참조한다.
서열의 설명
[서열번호 1] 프라이머 EFF1로 표시된, 단편 A의 증폭용 프라이머의 뉴클레오티드 서열
[서열번호 2] 프라이머 EFsmaR로 표시된, 단편 A의 증폭용 프라이머의 뉴클레오티드 서열
[서열번호 3] 인간 카파 사슬의 분비 신호(secretion signal) 및 불변 영역, 및 폴리 (A)의 첨가를 위한 신호를 포함하는 단편 B의 뉴클레오티드 서열
[서열번호 4] 인간 IgG1의 신호 서열 및 불변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열
[서열번호 5] h#11B7-T1L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 6] h#11B7-T2L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 7] h#11B7-T3L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 8] h#11B7-T4L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 9] h#11B7-T5L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 10] h#11B7-T6L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 11] h#11B7-T7L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 12] h#11B7-T8L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 13] h#11B7-T9L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 14] h#11B7-T10L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 15] h#11B7-T11L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 16] h#11B7-T12L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 17] h#11B7-T13L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 18] h#11B7-T1L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 19] h#11B7-T2L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 20] h#11B7-T3L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 21] h#11B7-T4L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 22] h#11B7-T5L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 23] h#11B7-T6L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 24] h#11B7-T7L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 25] h#11B7-T8L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 26] h#11B7-T9L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 27] h#11B7-T10L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 28] h#11B7-T11L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 29] h#11B7-T12L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 30] h#11B7-T13L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 31] h#11B7-T1H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 32] h#11B7-T2H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 33] h#11B7-T3H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 34] h#11B7-T4H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 35] h#11B7-T5H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 36] h#11B7-T6H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 37] h#11B7-T7H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 38] h#11B7-T8H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 39] h#11B7-T9H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)
[서열번호 40] h#11B7-T1H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-19), 가변 영역(20-132), 불변 영역(133-462)
[서열번호 41] h#11B7-T2H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-19), 가변 영역(20-132), 불변 영역(133-462)
[서열번호 42] h#11B7-T3H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-19), 가변 영역(20-132), 불변 영역(133-462)
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[서열번호 44] h#11B7-T5H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-19), 가변 영역(20-132), 불변 영역(133-462)
[서열번호 45] h#11B7-T6H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-19), 가변 영역(20-132), 불변 영역(133-462)
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[서열번호 121] 11B7 경쇄 CDRL4의 아미노산 서열
[서열번호 122] 11B7 경쇄 CDRL5의 아미노산 서열
[서열번호 123] 11B7 경쇄 CDRL6의 아미노산 서열
[서열번호 124] 11B7 중쇄 CDRH1의 아미노산 서열
[서열번호 125] 11B7 중쇄 CDRH2의 아미노산 서열
[서열번호 126] 11B7 중쇄 CDRH3의 아미노산 서열
[서열번호 127] 11D5 경쇄 CDRL4의 아미노산 서열
[서열번호 128] 11D5 경쇄 CDRL5의 아미노산 서열
[서열번호 129] 11D5 경쇄 CDRL6의 아미노산 서열
[서열번호 130] 11D5 중쇄 CDRH1의 아미노산 서열
[서열번호 131] 11D5 중쇄 CDRH2의 아미노산 서열
[서열번호 132] 11D5 중쇄 CDRH3의 아미노산 서열
[서열번호 133] 리더(leader) 서열의 뉴클레오티드 서열
[서열번호 134] 리더 서열의 아미노산 서열
[서열번호 135] #11B7-키메라 경쇄의 아미노산 서열
[서열번호 136] #11B7-키메라 중쇄의 아미노산 서열
[서열번호 137] #11D5-키메라 경쇄의 아미노산 서열
[서열번호 138] #11D5-키메라 중쇄의 아미노산 서열
[서열번호 139] 인간 Axl의 아미노산 서열, 도 30A에도 도시된, NCBI 단백질 데이터베이스의 등록 번호(Accession No.) P_30530
[서열번호 140] 도 30B에도 도시되고, #11B7-키메라 경쇄 (서열번호 135)의 1번 내지 108번 아미노산으로 구성된 아미노산 서열과 동일한, 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11B7의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
[서열번호 141] 도 30C에도 도시되고, #11B7-키메라 중쇄 (서열번호 136)의 1번 내지 113번 아미노산으로 구성된 아미노산 서열과 동일한, 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11B7의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
[서열번호 142] 도 30D에도 도시되고, #11D5-키메라 경쇄 (서열번호 137)의 1번 내지 108번 아미노산으로 구성된 아미노산 서열과 동일한, 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11D5의 경쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
[서열번호 143] 도 30E에도 도시되고, #11D5-키메라 중쇄 (서열번호 138)의 1번 내지 113번 아미노산으로 구성된 아미노산 서열과 동일한, 랫트 항-인간 Axl 단일클론 항체 11D5의 중쇄의 가변 영역의 아미노산 서열
[서열번호 144] h#11B7-T15L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 145] h#11B7-T18L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-60), 가변 영역(61-387), 불변 영역(388-702)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 146] h#11B7-T15L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 147] h#11B7-T18L의 아미노산 서열, 신호 서열(1-20), 가변 영역(21-129), 불변 영역(130-234)
[서열번호 148] h#11B7-T11H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 149] h#11B7-T12H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-57), 가변 영역(58-396), 불변 영역(397-1386)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열
[서열번호 150] h#11B7-T11H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-19), 가변 영역(20-132), 불변 영역(133-462)
[서열번호 151] h#11B7-T12H의 아미노산 서열, 신호 서열(1-19), 가변 영역(20-132), 불변 영역(133-462)

실시예 1. 면역원인 AXL 과다발현 Rat1 섬유모세포의 생성

NCBI(the National Center for Biotechnology Information) 참조 번호(NM_021913)에 따른 인간 수용체 티로신 키나아제 AXL 전사물 변이체에 대한 전장 코딩 서열을 제한효소 EcoRI 및 BamHI에 대한 플랭킹 인식 요소(flanking recognition element)를 통해 pLXSN으로 서브클로닝시켜, 레트로바이러스 발현 벡터 pLXSN-hAXL를 제조했다.

인간 수용체 티로신 키나아제 AXL에 특이적으로 결합하는 항체의 생성을 위해, 레트로바이러스 유전자 전달에 의해 인간 AXL을 안정적으로 과발현하는 Rat1 섬유모세포를 제조했다. 요약하면, 3x10⁵개의 Phoenix-E 세포를 60 mm 배양 접시에 접종하고 인산칼슘 방법을 이용하여 2 ㎍/ml pLXSN 벡터 또는 pLXSN-hAXL로 형질감염시켰다. 24시간 후에, 배지를 신선한 배지로 교체하고 상기 배지 중에 Phoenix-E 세포를 4시간 동안 인큐베이션시켰다. pLXSN 또는 pLXSN-hAXL 이코트로픽 바이러스(ecotrophic virus)를 방출하는 Phoenix-E 세포의 상층액을 수집하고 폴리브렌(Polybrene)(4 mg/ml; Aldrich)의 존재 하에 3시간 동안 합류점 도달 전(subconfluent) Rat1 세포(6 cm 디쉬당 2x10⁵개의 세포)의 인큐베이션을 위해 이용하였다. 동시에, Phoenix-E 세포를 신선한 배지와 함께 재-인큐베이션시키고, 추가적인 3시간 후에 Polybrene (4 mg/ml; Aldrich)의 존재 하에 Rat1 섬유모세포의 제2 감염을 위해 이용했다. 마찬가지로, 제3 감염 사이클을 수행했다. 배지를 교체한 후, G418에 의한 Rat1 세포의 선택을 개시하였다. 통상적으로, 21일 동안 선택 후 안정한 클론을 채취(pick)하였다.

일련의(a panel) 안정한 클론을 증식시키고, FACS 분석에 의해 막-국재화(membrane-localized) 인간 AXL 발현을 정량하였다. 상술하면, 1x10⁵개의 세포들을 PBS 중의 10 mM EDTA에 의해 회수하고, FACS 완충액(PBS, 3% FCS, 0.4% 아지드(azide))으로 1회 세척하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트 상에 접종하였다. 세포들을 1,000 rpm으로 3분 동안 스핀시켜서 상층액을 제거하고 마우스 항-AXL 일차 항체 MAB154 (R&D Systems, 3 ㎍/ml)와 함께 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, FACS 완충액으로 2회 세척하고, FACS 완충액 중에 1:50으로 희석시킨 PE-접합 당나귀 항-마우스 이차 항체(Jackson) 100 ㎕/웰에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 얼음 상에서 암기(dark)로 30분 동안 인큐베이션시키고, FACS 완충액으로 2회 세척하고, Epics XL-MCL 유세포측정기(Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다.

도 15의 A는 pLXSN 공 벡터(empty vector)에 의해 안정적으로 감염된 다중클론성 Rat1-Mock 집단 및 pLXSN-hAXL에 의해 안정적으로 감염된 Rat1-AXL c1.2의 FACS 분석을 나타내며, 이 대표적 클론의 세포 표면 상에서 AXL 과다발현을 보여준다.

추가적으로, 실험 목적을 위한 적합한 세포 모델 시스템을 생성하기 위해, AXL을 안정적으로 과발현하는 NIH3T3 섬유모세포를 Rat1에 대해 설명된 절차와 유사한 방법으로 생성하였다. 요약하면, 3x10⁵개의 Phoenix-E 세포를 60 mm 배양 접시에 접종하고, 인산칼슘 방법을 이용하여 2 ㎍/ml pLXSN 벡터 또는 pLXSN-AXL cDNA에 의해 형질감염시켰다. 24시간 후에, 배지를 신선한 배지로 교체하고, 상기 배지 중에 Phoenix-E 세포를 4시간 동안 인큐베이션시켰다. pLXSN 또는 pLXSN-hAXL 이코트로픽 바이러스를 방출하는 Phoenix-E 세포의 상층액을 회수하고, Polybrene (4 mg/ml; Aldrich)의 존재 하에 3시간 동안 합류점 도달 이전의(subconfluent) NIH3T3 세포 (6 cm 디쉬당 2x10⁵개의 세포)의 인큐베이션을 위해 이용하였다. 동시에, Phoenix-E 세포들을 신선한 배지와 함께 재-인큐베이션시키고, 추가적인 3시간 후에, Polybrene (4 mg/ml; Aldrich)의 존재 하에 NIH3T3 섬유모세포의 제2 감염을 위해 이용하였다. 마찬가지로, 제3 감염 사이클을 수행하였다. 배지의 교체 후에, G418에 의한 NIH3T3 세포의 선택을 개시하였다. 통상적으로, 21일 동안 선택 후 안정한 클론을 채취하였다.

일련의 안정한 클론을 증식시키고, FACS 분석에 의해 막-국재화 인간 AXL 발현을 정량하였다. 상술하면, 1x10⁵개의 세포들을 PBS 중의 10 mM EDTA에 의해 회수하고, FACS 완충액(PBS, 3% FCS, 0.4% 아지드)으로 1회 세척하고, 96-웰 둥근 바닥 플레이트 상에 접종하였다. 세포들을 1,000 rpm으로 3분 동안 스핀시켜서 상층액을 제거하고 마우스 항-AXL 일차 항체 MAB154 (R&D Systems, 3 ㎍/ml)와 함께 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 얼음 상에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, FACS 완충액으로 2회 세척하고, FACS 완충액 중에 1:50으로 희석시킨 PE-접합 당나귀 항-마우스 이차 항체(Jackson) 100 ㎕/웰에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 얼음 상에서 암기로 30분 동안 인큐베이션시키고, FACS 완충액으로 2회 세척하고, Epics XL-MCL 유세포측정기(Beckman Coulter)를 이용하여 분석하였다.

도 15의 B는 pLXSN 공 벡터에 의해 안정적으로 감염된 다중클론성 NIH3T3-Mock 집단 및 pLXSN-hAXL에 의해 안정적으로 감염된 NIH3T3-AXL cl.7의 FACS 분석을 나타내며, 이 대표적 클론의 세포 표면 상에서 AXL 과다발현을 보여준다.

실시예 2. 랫트 항- AXL 단일클론 항체의 생성

약 10x10⁶개의 동결된 Rat1-AXL cl.2 세포를 복막 내로(i.p.) 및 피하로 Lou/C 또는 Long Evans 랫트에 주사하는 것에 의해 단일클론성 랫트 항-AXL 항체를 생성시켰다. 8주 간격 후에, 최종 추가접종(boost)을 융합 3일 전에 복막 내로 및 피하로 적용하였다. 표준 절차에 따라 골수종 세포주 P3X63-Ag8.653과 랫트 면역 비장 세포의 융합을 수행하여 105개의 하이브리도마를 생성하였다. 2주 후에, 하이브리도마로부터의 제1 상층액을 수집하고 NIH3T3-Mock 대조군 세포 대비 NIH3T3-AXL cl.7 섬유모세포로의 결합에 대해 일차 FACS 스크린에서 테스트하였다. AXL 결합에 대해 양성인 클론들을 더 배양하였다. 이 클론들의 상층액 50 ml로부터, 항체를 정제하고 NIH3T3-Mock 대조군 세포 대비, NIH3T3-AXL cl.7 섬유모세포 상의 AXL로의 특이적 결합에 대해 재-분석하였다. NIH3T3-Mock 대조군 세포에 대해서는 아니나, NIH3T3-AXL cl.7 섬유모세포에 특이적으로 결합하는 정제된 항체를 Akt-키나아제 인산화 ELISA에서 더 테스트하고, 이소형을 결정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 랫트 항체의 정제를 위해, 상층액을 5,000g에서 20분 동안 스핀시키고, 뒤이어 멸균 여과시켰다. 500 ㎕의 단백질 G 세파로오스 FF를 첨가하고 4℃에서 스피닝 휠(spinning wheel) 상에서 1시간 이상 동안 인큐베이션시켰다. 세파로오스를 스핀-다운시키고, 상층액을 버리고, 단백질 G 매트릭스를 시트레이트 완충액(10OmM) pH 2.1을 이용한 단백질 용리 전에 PBS로 2회 세척하였다. 용리 분획에 1M Tris pH 8.0을 첨가하여 즉시 중성으로 재완충시키고, PBS에 대해 투석시켰다.

테스트된 올리고클론 항체(oligoclonal antibody) 중에서, 91개는 NIH3T3-AXL cl.7 섬유모세포에 특이적으로 결합하나, NIH3T3-Mock 대조군 세포에는 특이적으로 결합하지 않았고, 9개는 동일한 세포에서 Gas6-유도 Akt 인산화를 억제했으나, 71개는 Akt 인산화를 촉진했다. 4개의 길항성 항체(I11B7, I10D12, I6E7, 및 III11D5, 하기의 실시예에서 각각 11B7, 10D12, 6E7 및 11D5로 지칭됨), 2개의 효능적 항체(I11D7 및 III2A1; 하기의 실시예에서 각각 11D7 및 2A1으로 지칭됨) 및 1개의 대조군 항체(III1D5; 하기의 실시예에서 1D5로 지칭됨)를 동결보존하고 서브클로닝하였다.

실시예 3: 항- AXL 항체의 구조 및 특징

3.1. 랫트 항체 가변 도메인의 뉴클레오티드 서열

랫트 항-AXL 항체 가변 도메인을 하이브리도마 세포로부터 클로닝하였다. RNA-Extraction kit RNeasy (RNeasy midi-kit, Qiagen)를 이용하여 RNA를 제조하였다. 항체 유전자를 코딩하는 cDNA를 제조사의 설명서에 따라 5'RACE 키트 (Invitrogen)를 이용하여 제조하였다.

요약하면, 제1 가닥 cDNA를 유전자-특이적 GSP1-프라이머 및 Superscript™ Il Reverse Transcriptase를 이용하여 총 RNA로부터 합성하였다. 제1 가닥 cDNA 합성 후에, 본래의 mRNA 주형을 RNase Mix에 의한 처리에 의해 제거하였다. 그 후, cDNA의 3'-말단에 호모폴리머 테일을 결합시켰다. Taq DNA 중합효소, cDNA 분자 내에 위치한 부위에 어닐링하는 네스티드(nested), 유전자-특이적 프라이머(GSP2) 및 상기 키트에 제공된 고정 프라이머(anchor 프라이머)를 이용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 증폭 후에, 5' RACE 산물을 서열결정을 위해 pLXSN-ESK 벡터에 클로닝시켰다. 클로닝을 촉진하기 위해, 고정 프라이머(Anchor 프라이머, AP)는 SalI 에 대한 인식 서열을 포함했고, GSP2 프라이머는 XhoI 부위를 포함했다.

GSP1 프라이머:

kappa_GSP1: GATGGATGCATTGGTGCAGC

new_kappa_GSP1: atagatacagttggtgcagc

heavy_GSP1: CAGGGTCACCATGGAGTTA

GSP2 프라이머:

XhoI-hGSP2: CCGCTCGAGCGGGCCAGTGGATAGACAGATGG

XhoI-kGSP2: CCGCTCGAGCGGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG

랫트 항-AXL Mab 클로닝을 위한 GSP 프라이머의 이용:

11B7: kappa GSP1; XhoI-kGSP2

heavy GSP1; XhoI-hGSP2

10D12: kappa_GSP1, new_kappa_GSP1; XhoI-kGSP2

heavy GSP1; XhoI-hGSP2

11D5: new_kappa_GSP1; XhoI-kGSP2

heavy GSP1; XhoI-hGSP2

3.2. 랫트 항- AXL 항체 가변 도메인의 아미노산 서열

랫트 항체 가변 도메인 서열을 pLXSN-ESK 벡터에 클로닝된 서열결정된 유전자로부터 번역하였다. 주어진 아미노산 서열은 가변 도메인의 1번 위치부터 시작된다. 항체의 그의 표적으로의 특이적 결합을 위해 요구되는 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)은 Kabat (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition. NIH Publication No. 91-3242, 1991)에 따라 정의된다. Kabat 정의는 가변 도메인 내 서열 가변성(sequence variability)에 기초한다. 항체의 항-AXL 특이적 CDR 영역이 도 14 및 서열번호 121 내지 132로 열거된다. 개별적인 CDR은 하기 위치를 포함한다:

CDR-L1: 24-34

CDR-L2: 50-56

CDR-L3: 89-97

CDR-H1: 31-35b

CDR-H2: 50-65

CDR-H3: 95-102

랫트 11B7 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 각각 서열번호 140 및 141로 표시된다. 랫트 11B7 항체의 경쇄 및 중쇄의 서브클래스(subclass)는 각각 카파(kappa) 및 IgG1이다.

랫트 11D5 항체 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열이 각각 서열번호 142 및 143으로 표시된다. 랫트 11B7 항체의 경쇄 및 중쇄의 서브클래스는 각각 카파(kappa) 및 IgG2a이다.

3.3. 랫트 항체 발현 및 정제:

하이브리도마를 4.5g/L 글루코오스; 1% 글루타민, 1% 피루베이트(Pyrovate), 1% Pen/Strep을 함유한 DMEM을 이용하여 37℃, 5-7% CO₂에서 Celline CL 1000 생물반응기(bioreactor) (Integra Biosciences)에서 배양하였다. FCS 보충은 영양 구획(nutrient compartment)의 경우, 1 % FCS이고, 세포 구획의 경우, 5 % low IgG FCS이었다. 회수 및 배지 교환은 주당 2회 수행하였다. 세포 성장에 따라 세포 분리(cell splitting)를 1/1에서 1/3으로 수행하였다(1/1 ->1/3). 생산성을 SDS-PAGE 분석을 통해 주당 1회 테스트하였다. 상층액을 정제시까지 -20℃에서 보관하였다. 진행 중인 배양(running culture)의 마이코플라스마(mycoplasma) 테스트를 주당 1회 수행하였다.

Akta Explorer 100 System (GE-Healthcare)를 통해 단백질 A 또는 G 세파로오스 FF(GE-Healthcare)를 이용하여 항체를 정제하였다. 각 정제를 위해 컬럼을 개별적으로 충전시켰다. 컬럼 크기를 각 회분(batch)의 예상되는 생산성 및 규모(통상적으로 50 내지 500 mg)에 맞추었다. 단백질 함유 용액을 가능한 경우 얼음 또는 4℃에서 유지시켰다. 전 과정에서 멸균된 완충액 및 2차 증류수(double destilled water)를 이용하였다.

상층액을 해동시키고, 50 mM TRIS pH 8.5로 완충시키고, 원심분리시키고, 0.22 ㎛ 막을 통해 여과시키고 컬럼에 적재하였다. 8 컬럼 부피(column volume, CV)의 50 mM PO₄, pH8.5에 의해 세척한 후, 항체를 10 CV의 100 mM 글리신, pH 3.3 내에서 용리시켰다. 1/5 1M Tris pH 8.0 (4ml 용리물 분획 당 1 ml Tris)을 첨가하는 것에 의해 용리물 분획을 즉시 중성 pH까지 재완충시키고, 뒤이어 rSDS-PAGE에 의해 분석하였다. 순수한 항체를 함유한 분획을 모으고, 4℃에서 PBS에 대해 투석시키고, 멸균 여과시켰다.

완충 시스템 요건은 각 항체의 개별적인 특징에 따라 조정된다. 특히, 랫트 IgG2a 항체 11D5를 ProteinG 4 FF 매트릭스(GE-Healthcare)에 결합시키고, 고염 조건 (2M NaCl) 하에 세척하였다. 랫트 항체 IgG1 11B7을 11D5에 따른 고염 조건 하에 rProteinA (GE-Healthcare)를 통해 정제하였다. 항체 용리를 pH 5.5에서 수행하였다. 랫트 항체 정제를 위한 유속은 증가된 결합 효율을 위해 낮게 유지시켜야 한다.

제2 정제 단계로서, 이온교환 크로마토그래피(개별적인, 적합한 조건 하에) 또는 제조용 크기 배제 크로마토그래피(preparative size exclusion chromatography)(PBS, pH 7.4)가 이용될 수 있다.

정제된 항체의 품질 관리를 위한 표준 프로토콜은 하기를 포함한다:

- rSDS-PAGE 겔 분석; 쿠마시(Coommassie) 또는 은 염색

- BCA 테스트(Pierce #23227 BCA Protein Assay Kit; 랫트 IgG 표준 #31233)

- 분석용 크기 배제(Superdex 200 Tricorn 10/300 GL, ~250 mg in 250 ㎕; 0.5 ml/min, Akta Explorer 100)

- 내독소(endotoxin) 테스트(LAL, Cambrex QCL-1000？ Chromogenic LAL Endpoint Assay # US50-648U)

- 세포 기반 활성 분석법(FACS 결합; pAkt; pAXL)

정제된 항체는 무균 조건 하에 그들의 안정성에 따라 4℃ 또는 -20℃에서 PBS, pH 7.4 중에 보관한다.

수득된 랫트 항체 중 하나, 11B7을 실시예 5, 6, 및 16에 적용했다.

3.4. FACS 스캐차드(scatchard)에 의한 항체 친화도 결정

인간 AXL 과다발현 NIH3T3 세포를 PBS 중의 10 mM EDTA와의 인큐베이션에 의해 회수하고 FACS 완충액(PBS pH 7.4, 3% FCS, 0.1% NaN₃) ml 당 6백만개의 세포로 재현탁시켰다. 둥근-바닥 마이크로타이터 플레이트에, 100 ㎕의 세포 현탁액을 FACS 완충액 중 40 내지 0.002 ㎍/ml의 농도(266 내지 0.01 nM)의 항체 11B7, 11D5, ch11B7-IgG1, ch11B7-IgG2, ch11D5-IgG1 또는 ch11D5-lgG2를 함유한 100㎕의 항체 용액에 첨가하였다. 얼음 상에서 2시간 동안 항체 결합을 진행시켰다. 그 후, 세포들을 웰 당 250 ㎕ FACS 완충액으로 2회 세척하고, FACS 완충액에 1:50으로 희석된 200㎕의 이차 항체(항-랫트-PE; Jackson)에 재현탁시켰다. 45분의 인큐베이션 후에, 세포들을 다시 FACS 완충액에서 2회 세척하고, FACS 분석을 위해 500 ml PBS에 재현탁시켰다. Beckman-Coulter FACS FC500에서 분석을 수행하였다. 겉보기 친화도 상수(apparent affinity constant) KDapp를 결정하기 위해, 평균 형광 값을 평균 형광과 상응하는 항체 농도([M])의 비에 대해 플롯팅하였다. 직선의 기울기 역수로부터 수득된 계산된 KDapp가 하기에 열거된다:

클론	KD 값(nM)
11B7	0.38
ch11B7-IgG2	0.6
11D5	0.81
Ch11D5-IgG2	0.9

실시예 4. 랫트 항- AXL 항체의 키메라화 :

인간 카파 경쇄 및 중쇄 IgG1/2 유전자를 지원자의 말초혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 하기에 기재된 바와 같이 클로닝하였다:

전혈로부터 PBMC를 준비하였다. 혈액을 실온에서 10 U/ml 헤파린을 포함한 PBS/ 2 mM EDTA에, 1/2, 5 희석시키고, 정량 펌프(diaphragm)(35 ml/튜브)에 의해 15 ml Bicoll 용액[Biochrom # L6115의 Biocoll] 상에 적층시켰다. 시료를 실온에서 400xg로 30분 동안 원심분리시키고, 혈청(~ 15 ml)을 버렸다. PBMC를 포함하는 인터페이스를 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)을 이용하여 조심스럽게 회수했다. PBMC를 PBS/2 mM EDTA (1차 세척 100ml, 2차 세척 50 ml)로 2회 세척하고, 300xg에서 10분 동안 스핀 다운시켰다. 세포 펠렛을 RPMI/ 10% FCS (25 ml)에 재현탁시키고 5.5x10⁷개의 PBMC를 수득했다.

제조사의 설명서에 따라, Qiagen (# 75142)의 RNeasy kit를 이용하여 PBMC로부터 RNA를 준비하였다. 정제된 RNA (30 ㎍)를 분량씩 -80℃에 보관하였다.

항체 IgG 감마 1과 2 및 카파 사슬에 대한 cDNA를 분리된 RNA로부터 하기의 프라이머를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 Superskript III Reverse Transkriptase (invitrogen # 18080 - 93)를 이용한 RT-PCR에 의해 제조하였다:

1) RT-gamma: GCG TGT AGT GGT TGT GCA GAG

2) RT-gamma2: ggg ctt gcc ggc cgt g

3) RT-kappa: TGG AAC TGA GGA GCA GGT GG

4) 5'Blp: AGA TAA GCT TTG CTC AGC GTC CAC CAA GGG CCC ATC GGT

5) 3'Bam(GAG): AGA TGG ATC CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G

6) 5'Bsi: AGA TAA GCT TCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT CTT CAT

7) 3'Bam(CTT): AGA TGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT

프라이머를 100μM로 용해시켰다. 각각 2pmol 올리고 RTγ및 RTκ를 이용하고, 1 ㎍ RNA, 10 mM dNTP mix를 첨가하여 RT-PCR을 수행하고 65℃에서 5분 동안 가열하였다. 4㎕의 제1 가닥 완충액, 1 ㎕ 0.1 M DTT, 1 ㎕ RNase 억제제(40 U/㎕ Fermentas # EO0311) 및 2 ㎕ Superscript III RT를 첨가하고, 혼합하고, 50℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 뒤이어 70 ℃에서 15분 동안의 열 불활성화 단계를 수행했다.

2㎕의 제1 가닥 반응액을 항체 불변 도메인의 이중가닥 DNA를 생성하기 위해 Taq 중합효소(Eurochrom # EME010001)를 이용한 제2 단계 PCR을 위해 이용하였다. 하기의 PCR 조건을 이용하여, γ-사슬을 증폭하기 위해 프라이머 5'Blp 및 3'Bam(GAG)를 이용하고, κ-사슬 불변 영역을 증폭하기 위해 5'Bsi 및 3'Bam(CTT)를 이용하였다:.

κ-사슬 증폭:

94℃ 120 초;

94℃ 30 초,

55℃ 30 초, 및

72℃ 45 초의 사이클 35회;

72℃ 10 분.

γ-사슬 증폭:

94℃ 120 초;

94℃ 30 초,

45℃ 30 초, 및

72℃ 60 초의 사이클 5회;

94 ℃ 30 초,

50 ℃ 30 초, 및

72 ℃ 60 초의 사이클 35회;

72℃ 10 분.

PCR 산물을 TAE 완충된 2% 아가로오스 겔 상에서 분석하였다. 카파 경쇄에 대한 ~350 bp의 단일 밴드 및 중쇄 γ1 및 γ2에 대한 ~ 1000 bp의 단일 밴드를 확인했다. PCR 산물을 제조사의 설명서에 따라, Qiagen 겔 추출 키트 (QIAGEN, #28784)에 의해 정제하였다. PCR 단편을 pcDNA3 벡터 (Invitrogen)의 다중 클로닝 부위에 클로닝하기 위해, pcDNA3 벡터 및 PCR 단편을 HindIII (5') 및 BamHI (3') 제한효소로 처리하였다. 제한효소 인식 부위는 PCR 프라이머 내에 코딩되었다. 제한효소로 처리된(digested) 단편을 Qiagen PCR 정제 키트 (QIAGEN, 28104)를 이용하여 정제하고, γl, γ2 및 κ 사슬을 코딩하는 DNA를 16℃에서 밤새 T4 DNA 리가아제를 이용하여 pcDNA3 벡터에 라이게이션시켰다. 리가아제를 65℃에서 10분 동안 불활성화시켰다. 라이게이션된 DNA 플라스미드를 표준 프로토콜을 이용하여 직접 CaCl₂ 적격(competent) 대장균에 형질전환시키고, 암피실린-함유 LB-플레이트에 플레이팅하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 단일 콜로니를 채취하고, 10 ㎕ H₂O에 현탁시키고, (5 ㎕ 현탁된 세포, Taq 폴리머라아제, γl/γ2에 대한 프라이머 5Blp 및 3Bam(GAG) γl/γ2 and κ 콜로니에 대한 5Bsi and 3Bam(CTT) 프라이머)PCR에 의해 개별적인 항체 사슬을 포함한다는 것을 확인했다:

94℃ 120 초;

94℃ 30 초,

55℃ 30 초, 및

72℃ 60 초의 사이클 35회;

72℃ 10 분.

시료를 1.5% 아가로오스 겔 상에서 PCR 산물에 대해 분석하였다. 항체 유전자 함유 콜로니를 선택하여 5 ml LB/암피실린 배지에 접종하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 대장균을 회수하고, Qiagen 미니프렙(miniprep) 키트(QIAGEN, # 12123)를 이용하여, DNA를 준비하였다. 대조군 처리물(control digest) (HindIII, BamHI)은 예상되는 크기에서 모든 κ 및 γ 사슬 유전자 삽입물을 보였다; Medigenomix에서 DNA 서열결정에 의해 서열을 확인했다.

랫트 가변 도메인을 pLXSN-ESK 벡터로부터 PCR에 의해 증폭하고, g1/g2 및 κ pcDNA3 벡터에 클로닝하여 키메라 전장 항체를 생성했다. 가변 VL 도메인을 5' 말단에 HindIII 및 BsmI 부위를 포함하고, 3' 말단에 BsiWI 부위를 갖는, 하기의 프라이머를 이용하여 증폭시켰다:

VL-11B7-5': AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA GGC TCC

VL-11B7-3': AGA TCG TAC GTT TCA GCT CCA GCT TGG TGC CTC

VL-11D5-5': AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA GTC TCC ATC

VL-11D5-3': AGA TCG TAC GTT TCA GCT TGG TCC CAG

가변 VH 도메인을 5' 말단에 HindIII 및 BsmI 부위를 포함하고, 3' 말단에 BlpI 부위를 갖는, 하기의 프라이머를 이용하여 증폭시켰다:

VH-11B7/11D5-5': AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA GGT GCA GCT TCA GGA GTC AGG

VH-11B7/11D5-3': AGA TGC TGA GCT GAC AGT GAC CAT GAC TCC TTG GCC

경쇄를 위한 BsiWI 및 중쇄를 위한 BlpI은 가변 도메인 유전자의 3' 말단과 직접 융합을 가능하게 하기 위해, 불변 영역의 5' 말단에 단일 부위를 갖는다.

pLNOH2 벡터 (Norderhaug et. al. J. Immunol. Methods 204, 1997; Neuberger EMBO J. 1983; 2 (8): 1373-8,1983)로부터 유래된 리더 서열 서열번호 133에 융합된, 키메라 항체 사슬을 코딩하는 유전자를 재조합 발현을 위해 pCEP 벡터 시스템에 클로닝하였다. 경쇄 유전자를 Nhel (5') 및 XhoI (3')에서 pCEP4 (Invitrogen)에 클로닝하고, 중쇄 유전자를 Kpnl (5') 및 XhoI (3')에서 pCP-Pu (Kohfeld FEBS Vol 414; (3) 557ff, 1997)에 클로닝하였다.

20x20 cm 플레이트에 접종된 HEK 293 세포를 일시적 발현을 위한 표준 CaPO₄ 형질감염 방법을 이용하여 경쇄 및 중쇄 유전자를 코딩하는 각각의 플라스미드 1 ㎍/ml로 동시에 형질전환시켰다. 배양 조건은 5% low IgG FCS, 1% 피로베이트, 1% 글루타민, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 DMEM/F12 고 글루코오스 배지에서 37℃, 5% CO₂였다. 24시간 후에, 형질감염 배지를 신선한 배지로 교체하였다. 약 3주 동안 2 내지 3일 간격으로 상층액을 수집하였다. 1 ml Hitrap rProtein A 컬럼(GE-Healthcare)을 이용하여 랫트 항체 정제에 대해 기재된 표준 완충액 조건(적재(loading): 50 mM Tris; pH=8.5, 세척: 5OmM PO₄; pH= 8.5, 용리: 10OmM 글리신; pH 3,3)에서 약 600 ml의 상층액으로부터 키메라 항체를 정제하였다.

랫트 11B7 항체로부터 유래된, 수득된 키메라 분자 중 하나는 서열번호 136 (도 14)의 아미노산 서열로 표시된 인간 IgG1 중쇄 및 서열번호 135(도 14)의 아미노산 서열로 표시된 인간 카파 경쇄로 구성된다.

랫트 11D5 항체로부터 유래된, 수득된 키메라 분자 중 하나는 서열번호 138 (도 14)의 아미노산 서열로 표시된 인간 IgG1 중쇄 및 서열번호 137(도 14)의 아미노산 서열로 표시된 인간 카파 경쇄로 구성된다.

각각 ch11B7-IgG1 및 ch11D5-IgG1으로 표시된 이 키메라 11B7 및 11D5 항체를 실시예 3, 13, 14 및 17 내지 20에 적용했다.

실시예 5. 본 발명의 랫트 항- AXL 항체는 누드 마우스에서 인간 전립선 암종 증식을 감소시킨다

치료 항체의 항-종양 효능은 종종 인간 이종이식 종양 연구에서 평가된다. 이 모델 시스템에서, 인간 종양은 면역약화된 마우스에서 이종이식편으로 증식되고, 치료 효능은 종양 증식 억제의 정도에 의해 측정된다. 이 연구의 목적은 본 발명의 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7이 누드 마우스에서 인간 전립선암 세포의 종양 증식을 방해하는지 여부를 평가하는 것이었다. 요약하면, 0일 차에, 7-8일령의 수컷 NMRI^- ^nu ^/ ^nu 마우스(개략적인 체중: 순응(acclimiaton) 후 30 g)를 2 l/분의 산소 유속으로 1.5-2.0 부피 퍼센트의 이소플루란으로 마취시키고, 25 ㎕ PBS 중 1x10⁶ PC-3-LN 세포를 전립선에 동소로(orthotopically) 이식했다. PC-3-LN 세포는 루시페라아제-네오마이신 융합 단백질을 코딩하는 레트로바이러스로 감염시킨 PC-3 전립선암종 세포로부터 유래된다. 따라서, 종양 증식의 발생 및 종양 증식 진행은 인 비보 생물발광(bioluminescence) 이미징을 통해 측정가능했다. 이 목적을 위해, 루시페린을 상기 마우스에 복막내로(intraperitoneally, i.p.) 주사하고, 주사 후 10분 경과시 NightOWL LB 981 생물발광 이미징 시스템 (Berthold Technologies, Germany)을 이용하여 발광을 측정했다. 제1 처리 전에, 마우스를 랜덤화하고 각각 10마리로 이루어진 치료군 전체에 걸쳐 출발 종양 부피(평균, 중앙값 및 표준편차)의 균일성을 보장하기 위해 통계적 검정을 수행했다. 8일 차에, 모든 처리를 개시하고, 34일 차까지 지속하고, 35일 차에 부검을 수행했다. 25 mg/kg의 이소형(isotypic) 대조군 항체 1D5 및 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7를 각각 치료군 1 및 2의 동물에 복막내로(i.p.) 주당 3회(월, 수, 금) 투여했다. 처리군 3의 동물에는 1일 1회 경구로(p.o.) 40 mg/kg의 Sutent를 투여했다. 처리군 4의 동물에는 4일 간격으로 12.5 mg/kg의 Taxotere를 정맥내(i.v.) 주사로 투여했다. 처리군의 개요가 하기에 제시된다.

도 16은 이 실험의 결과를 보여준다. 이소형 대조군 항체 1D5에 비해, 본 발명의 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7은 누드 마우스에서 PC-3-LN 전립선 종양의 전체 증식을 감소시켰다.

실시예 6. 본 발명의 랫트 항- AXL 항체는 인간 전립선 암종의 전이를 억제한다

"본 발명의 랫트 항-AXL 항체가 누드 마우스에서 인간 전립선 암종의 증식을 감소시킨다"는 제목 하에 전술된 것과 동일한 실험에서, 본 발명의 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7의 항-전이 효과를 평가하기 위해, 부검 후, PC-3-LN 종양 세포의 다른 기관으로의 재국재화(전이)를 분석했다. 이 목적을 위해, 선택된 기관(간, 비장, 폐, 대퇴부, 요추골의 부분)을 부검 후에 수집하고, 균질화시키고, 루시페린을 보충했다. 뒤이어, NightOWL LB 981 생체발광 이미징 시스템 (Berthold Technologies, Germany)을 이용하여 발광을 측정했다.

도 17은 비장의 분석에 대한 이 실험의 결과를 보여준다. 이소형 대조군 항체 1D5에 비해, 본 발명의 길항성 랫트 항-AXL 항체 11B7은 비장 전이의 발생을 감소시켰다. 주목할 만한 것은 이 실험에서 11B7의 항-전이 효과는 Sutent보다 더 강했다는 것이다. 유사한 관찰결과를 간, 폐, 대퇴부, 요추골 전이에 대해 수득했다.

실시예 7: 인간화 항체의 설계

7.1 #11B7의 인간화 버전의 설계

7.1.1 #11B7 가변 도메인의 분자 모델링

#11B7 가변 도메인의 분자 모델링(molecular modelling)을 상동성 모델링(homology modelling)으로 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법에 따라 수행했다 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank)에 등록된 인간 면역글로불린 가변 도메인의 일차 서열(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))(X-선 결정 구조로부터 유래된 삼차원 구조가 입수가능함)을 그에 의해 결정된 #11B7 가변 도메인과 비교했다. 결과로서, 1JPT를 #11B7 경쇄 가변 도메인에 대한 가장 높은 서열 상동성을 갖는 것으로 선택했다. 또한, 1F8T를 #11B7 중쇄 가변 도메인에 대한 가장 높은 서열 상동성을 갖는 것으로 선택했다. 프레임워크(framewok) 도메인의 삼차원 구조를 #11B7의 경쇄 및 중쇄에 상응하는 1JPT 및 1F8T의 좌표를 조합하는 것에 의해 수득된 "프레임워크 모델"에 기반하여 준비하였다. #11B7 CDR에 대해, CDRL₁, CDRL₂, CDRL₃, CDRH₁, 및 CDRH₂를 Thornton 등 (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996))의 분류에 따라, 각각 클러스터 11A, 7A, 9A, 10A, 및 9A에 지정했다. CDRH₃를 H3-규칙 (FEBS letters 399, 1-8 (1996))에 따라, k (3)로 분류했다. 뒤이어, 각 CDR의 통상적인 구조(conformation)를 프레임워크 모델에 포함시켰다.

마지막으로, 에너지의 측면에서, #11B7 가변 도메인의 가능한 분자 모델을 수득하기 위해, 불리한 원자간 접촉(interatomic contact)을 배제시키기 위해 에너지 계산을 수행했다. 상업적으로 구매가능한 삼차원 단백질 구조 예측 프로그램 Prime과 좌표 검색 프로그램(coordinate search program) MacroModel (Schrodinger, LLC)을 이용하여 이 절차들을 수행했다.

7.1.2 인간화 #11B7의 아미노산 서열의 설계

당해 기술 분야에서 일반적으로 CDR 그래프팅으로 알려진 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 따라 인간화 #11B7 항체를 구축하였다. 프레임워크 도메인 내의 아미노산 상동성에 근거한 2가지 방법으로 수령체 항체(acceptor antibody)를 선택했다.

#11B7 프레임워크 도메인의 서열을 항체 아미노산 서열을 포함하는 Kabat Database (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001))에 등록된 모든 인간 프레임워크의 서열들과 비교했다. 그 결과, 그들의 프레임워크 도메인 간의 72% 서열 상동성 때문에, GM4672'CL 항체를 수령체로 선택했다. GM4672'CL 중의 프레임워크 도메인의 아미노산 잔기들을 #11B7 중의 상응하는 아미노산 잔기들과 정렬시켜 상이한 아미노산들이 사용된 위치들을 식별했다. 이 잔기들의 위치를 그에 의해 구축된 #11B7의 삼차원 모델을 이용하여 분석했다. 그 후, 수령체에 이식될 공여체(donor) 잔기들을 Queen 등에 의해 제공된 기준(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 따라 선택했다.

#11B7 프레임워크 도메인의 서열을 IgBLAST (Nuc. Acid Res. 36, D25-D30 (2007))에 등록된 모든 인간 프레임워크의 서열과 비교했다. 그 결과, BAC01582를 그들의 프레임워크 도메인 간의 76% 서열 상동성 때문에 L 사슬 수령체로 선택했다. AAF80028을 그들의 프레임워크 도메인 간의 66% 서열 상동성 때문에 H 사슬 수령체로 선택했다. BAC01582 L 사슬 및 AAF80028 H 사슬 중의 프레임워크 도메인의 아미노산 잔기들을 #11B7 중의 상응하는 아미노산 잔기들과 정렬시켜 상이한 아미노산들이 사용된 위치들을 식별했다. 이 잔기들의 위치를 그에 의해 구축된 #11B7의 삼차원 모델을 이용하여 분석했다. 그 후, 수령체(acceptor)에 이식될 공여체(donor) 잔기들을 Queen 등에 의해 제공된 기준(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 따라 선택했다.

모든 방법에서, 일부 선택된 공여체 잔기를 수령체 항체로 옮기는 것에 의해 인간화 #11B7 서열을 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 구축했다.

7.1.3 #11B7 경쇄의 인간화 (도 1, 2 및 3)

7.1.3.1 h#11B7-T1L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 65 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 73 (루이신), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 루이신, 쓰레오닌, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T1L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.2 h#11B7-T2L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 65 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 73 (루이신), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 쓰레오닌, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T2L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.3 h#11B7-T3L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T3L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.4 h#11B7-T4L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T4L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.5 h#11B7-T5L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T5L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.6 h#11B7-T6L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T6L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.7 h#11B7-T7L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T7L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.8 h#11B7-T8L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T8L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.9 h#11B7-T9L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T9L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.10 h#11B7-T10L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T10L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.11 h#11B7-T11L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T11L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.12 h#11B7-T12L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T12L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.13 h#11B7-T13L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T13L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.14 h#11B7-T14L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T14L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.15 h#11B7-T15L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T15L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.16 h#11B7-T16L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T16L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.17 h#11B7-T17L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T17L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.18 h#11B7-T18L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T18L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.19 h#11B7-T19L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T19L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.3.20 h#11B7-T20L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 140(도 30B)에 의해 표시된 #11B7 경쇄 가변 영역의 7 (알라닌), 12 (프롤린), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (아스파르트산), 100 (글리신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 세린, 세린, 발린, 티로신, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 경쇄 가변 영역을 "h#11B7-T20L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4 #11B7 중쇄의 인간화 (도 4 및 5)

7.1.4.1 h#11B7-T1H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 2 (발린), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 48 (메티오닌), 67 (이소루이신), 68 (세린), 70 (쓰레오닌), 71 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 이소루이신, 쓰레오닌, 알라닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 이소루이신, 발린, 쓰레오닌, 세린, 발린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T1H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4.2 h#11B7-T2H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 2 (발린), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 70 (쓰레오닌), 71 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 이소루이신, 쓰레오닌, 알라닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 세린, 발린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T2H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

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서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 40 (페닐알라닌), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 쓰레오닌, 알라닌, 세린, 프롤린, 글리신, 루이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T3H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4.4 h#11B7-T4H-타입 중쇄:

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7.1.4.5 h#11B7-T5H-타입 중쇄:

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7.1.4.6 h#11B7-T6H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 70 (쓰레오닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 세린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T6H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4.7 h#11B7-T7H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 48 (메티오닌), 67 (이소루이신), 70 (쓰레오닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 이소루이신, 발린, 세린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T7H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4.8 h#11B7-T8H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 68 (세린), 70 (쓰레오닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 쓰레오닌, 세린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T8H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4.9 h#11B7-T9H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 48 (메티오닌), 67 (이소루이신), 68 (세린), 70 (쓰레오닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 이소루이신, 발린, 쓰레오닌, 세린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T9H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4.10 h#11B7-T10H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 6 (글루탐산), 7 (세린), 9 (프롤린), 12 (발린), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 48 (메티오닌), 67 (이소루이신), 70 (쓰레오닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루타민, 트립토판, 알라닌, 루이신, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 이소루이신, 발린, 세린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T10H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4.11 h#11B7-T11H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 6 (글루탐산), 7 (세린), 9 (프롤린), 12 (발린), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 68 (세린), 70 (쓰레오닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루타민, 트립토판, 알라닌, 루이신, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 쓰레오닌, 세린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T11H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.1.4.12 h#11B7-T12H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 141(도 30C)에 의해 표시된 #11B7 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 6 (글루탐산), 7 (세린), 9 (프롤린), 12 (발린), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파르트산), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 48 (메티오닌), 67 (이소루이신), 68 (세린), 70 (쓰레오닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (세린), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루타민, 트립토판, 알라닌, 루이신, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 이소루이신, 발린, 쓰레오닌, 세린, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11B7 중쇄 가변 영역을 "h#11B7-T12H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2 11D5의 인간화 버전의 설계

7.2.1 #11 D5 가변 도메인의 분자 모델링

#11D5 가변 도메인의 분자 모델링을 상동성 모델링(homology modelling)으로 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 방법에 따라 수행했다 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). 프로테인 데이터 뱅크(Protein Data Bank)에 등록된 인간 면역글로불린 가변 도메인의 일차 서열(Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007))(X-선 결정 구조로부터 유래된 삼차원 구조가 입수가능함)을 그에 의해 결정된 #11D5 가변 도메인과 비교했다. 결과로서, 1D5I를 #11D5 경쇄 가변 도메인에 대한 가장 높은 서열 상동성을 갖는 것으로 선택했다. 또한, 1ORS를 #11D5 중쇄 가변 도메인에 대한 가장 높은 서열 상동성을 갖는 것으로 선택했다. 프레임워크 도메인의 삼차원 구조를 #11D5의 경쇄 및 중쇄에 상응하는 1D5I 및 1ORS의 좌표를 조합하는 것에 의해 수득된 "프레임워크 모델"에 기반하여 준비하였다. #11D5 CDR에 대해, CDRL₁, CDRL₂, CDRL₃, CDRH₁, 및 CDRH₂를 Thornton 등 (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996))의 분류에 따라, 각각 클러스터 11A, 7A, 9A, 10A, 및 9A에 지정했다. CDRH₃를 H3-규칙 (FEBS letters 399, 1-8 (1996))에 따라, k (3)로 분류했다. 뒤이어, 각 CDR의 통상적인 구조를 프레임워크 모델에 포함시켰다.

마지막으로, 에너지의 측면에서, #11D5 가변 도메인의 가능한 분자 모델을 수득하기 위해, 불리한 원자간 접촉을 배제시키기 위해 에너지 계산을 수행했다. 상업적으로 구매가능한 삼차원 단백질 구조 예측 프로그램 Prime과 좌표 검색 프로그램(coordinate search program) MacroModel (Schrodinger, LLC)을 이용하여 이 절차들을 수행했다.

7.2.2 인간화 #11 D5 의 아미노산 서열의 설계

당해 기술 분야에서 일반적으로 CDR 그래프팅으로 알려진 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 따라 인간화 #11D5 항체를 구축하였다. 프레임워크 도메인 내의 아미노산 상동성에 근거한 2가지 방법으로 수령체 항체(acceptor antibody)를 선택했다.

#11D5 프레임워크 도메인의 서열을 항체 아미노산 서열을 포함하는 Kabat Database (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001))에 등록된 모든 인간 프레임워크의 서열들과 비교했다. 그 결과, 그들의 프레임워크 도메인 간의 70% 서열 상동성 때문에, T33-4'CL 항체를 수령체로 선택했다. T33-4'CL 중의 프레임워크 도메인의 아미노산 잔기들을 #11D5 중의 상응하는 아미노산 잔기들과 정렬시켜 상이한 아미노산들이 사용된 위치들을 식별했다. 이 잔기들의 위치를 그에 의해 구축된 #11D5의 삼차원 모델을 이용하여 분석했다. 그 후, 수령체에 이식될 공여체(donor) 잔기들을 Queen 등에 의해 제공된 기준(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 따라 선택했다.

#11D5 프레임워크 도메인의 서열을 IgBLAST (Nuc. Acid Res. 36, D25-D30 (2007))에 등록된 모든 인간 프레임워크의 서열과 비교했다. 그 결과, 1603260B를 그들의 프레임워크 도메인 간의 74% 서열 상동성 때문에 L 사슬 수령체로 선택했다. AAF80028을 그들의 프레임워크 도메인 간의 66% 서열 상동성 때문에 H 사슬 수령체로 선택했다. 1603260B L 사슬 및 AAF80028 H 사슬 중의 프레임워크 도메인의 아미노산 서열을 #11D5 중의 상응하는 아미노산 잔기들과 정렬시켜 상이한 아미노산들이 사용된 위치들을 식별했다. 이 잔기들의 위치를 그에 의해 구축된 #11D5의 삼차원 모델을 이용하여 분석했다. 그 후, 수령체에 이식될 공여체 잔기들을 Queen 등에 의해 제공된 기준(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989))에 따라 선택했다.

모든 방법에서, 일부 선택된 공여체 잔기를 수령체로 옮기는 것에 의해 인간화 #11D5 서열을 하기의 실시예에 기재된 바와 같이 구축했다.

7.2.3 #11D5 경쇄의 인간화 (도 6, 7, 8, 9, 10 및 11)

7.2.3.1 h#11D5-T1L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 2 (이소루이신), 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 46 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 발린, 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T1L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.2 h#11D5-T2L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 46 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T2L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.3 h#11D5-T3L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T3L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.4 h#11D5-T4L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글리신, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T4L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.5 h#11D5-T5L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글리신, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T5L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.6 h#11D5-T6L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T6L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.7 h#11D5-T7L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T7L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.8 h#11D5-T8L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T8L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.9 h#11D5-T9L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T9L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.10 h#11D5-T10L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T10L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.11 h#11D5-T11L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T11L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.12 h#11D5-T12L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T12L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.13 h#11D5-T13L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T13L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.14 h#11D5-T14L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T14L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.15 h#11D5-T15L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T15L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.16 h#11D5-T16L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T16L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.17 h#11D5-T17L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T17L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.18 h#11D5-T18L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T18L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.19 h#11D5-T19L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T19L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.20 h#11D5-T20L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#1120D5-T20L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.21 h#11D5-T21L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T21L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.22 h#11D5-T22L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T22L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.23 h#11D5-T23L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T23L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.24 h#11D5-T24L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T24L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.25 h#11D5-T25L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T25L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.26 h#11D5-T26L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T26L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.27 h#11D5-T27L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T27L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.28 h#11D5-T28L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 라이신, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T28L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.29 h#11D5-T29L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T29L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.30 h#11D5-T30L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T30L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.31 h#11D5-T31L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T31L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.32 h#11D5-T32L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T32L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.33 h#11D5-T33L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 71 (티로신), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T33L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.34 h#11D5-T34L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 70 (아스파르트산), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 글루탐산, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T34L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.35 h#11D5-T35L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 47 (메티오닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 루이신, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T35L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.36 h#11D5-T36L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 40 (발린), 43 (세린), 45 (아르기닌), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 프롤린, 알라닌, 라이신, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T36L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.3.37 h#11D5-T37L-타입 경쇄:

서열목록의 서열번호 142(도 30D)에 의해 표시된 #11D5 경쇄 가변 영역의 11 (메티오닌), 13 (쓰레오닌), 15 (루이신), 36 (페닐알라닌), 40 (발린), 43 (세린), 66 (아르기닌), 69 (세린), 72 (세린), 79 (글루탐산), 80 (세린), 83 (메티오닌), 85 (이소루이신), 100 (세린), 104 (루이신), 106 (루이신), 및 109 (프롤린)번 아미노산을 각각 루이신, 알라닌, 발린, 티로신, 프롤린, 알라닌, 글리신, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 글루타민, 프롤린, 페닐알라닌, 쓰레오닌, 글루타민, 발린, 이소루이신, 및 쓰레오닌으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 경쇄 가변 영역을 "h#11D5-T37L"-타입 경쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4 #11 D5 중쇄의 인간화 (도 12 및 13)

7.2.4.1 h#11D5-T1H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 67 (이소루이신), 68 (세린), 71 (아르기닌), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 메티오닌, 글리신, 루이신, 발린, 쓰레오닌, 발린, 글루탐산, 세린, 라이신, 세린, 프롤린, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T1H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.2 h#11D5-T2H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 71 (아르기닌), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 메티오닌, 글리신, 루이신, 발린, 글루탐산, 세린, 라이신, 세린, 프롤린, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T2H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.3 h#11D5-T3H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 프롤린, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T3H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.4 h#11D5-T4H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 6 (글루탐산), 7 (세린), 9 (프롤린), 12 (발린), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 67 (이소루이신), 68 (세린), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루타민, 트립토판, 알라닌, 루이신, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 발린, 쓰레오닌, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T4H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.5 h#11D5-T5H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 6 (글루탐산), 7 (세린), 9 (프롤린), 12 (발린), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 트립토판, 알라닌, 루이신, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T5H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.6 h#11D5-T6H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T6H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.7 h#11D5-T7H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 67 (이소루이신), 68 (세린), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 발린, 쓰레오닌, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T7H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.8 h#11D5-T8H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 67 (이소루이신), 68 (세린), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 발린, 쓰레오닌, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T8H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.9 h#11D5-T9H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 68 (세린), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 쓰레오닌, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T9H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.10 h#11D5-T10H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 67 (이소루이신), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 발린, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T10H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.11 h#11D5-T11H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 68 (세린), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 쓰레오닌, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T11H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.12 h#11D5-T12H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 67 (이소루이신), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 발린, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T12H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

7.2.4.13 h#11D5-T13H-타입 중쇄:

서열목록의 서열번호 143(도 30E)에 의해 표시된 #11D5 중쇄 가변 영역의 1 (글루탐산), 16 (글루타민), 17 (세린), 23 (세린), 25 (쓰레오닌), 39 (라이신), 40 (페닐알라닌), 43 (아스파라긴), 44 (라이신), 45 (메티오닌), 75 (아르기닌), 79 (페닐알라닌), 81 (글루타민), 83 (아스파라긴), 87 (쓰레오닌), 88 (글루탐산), 92 (쓰레오닌), 107 (발린), 및 108 (메티오닌)번 아미노산을 각각 글루타민, 글루탐산, 쓰레오닌, 쓰레오닌, 세린, 글루타민, 프롤린, 라이신, 글리신, 루이신, 라이신, 세린, 라이신, 세린, 알라닌, 알라닌, 발린, 쓰레오닌, 및 루이신으로 치환하는 것에 의해 설계된 인간화 #11D5 중쇄 가변 영역을 "h#11D5-T13H"-타입 중쇄 가변 영역으로 표기했다.

실시예 8: 인간화 항체 발현을 위한 범용 벡터의 작제

8.1 인간화 항체 경쇄 발현을 위한 벡터, pEF6KCL의 작제.

플라스미드 pEF6/V5-His B (Invitrogen Corp.)를 주형으로 이용하고 하기의 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여 BGHpA (2174) 직후부터 SmaI (2958)까지의 DNA 단편(f1 복제원점 및 SV40 프로모터 및 원점(origin)을 포함하는 DNA 단편; 하기에서, "단편 A"로 지칭됨)을 수득했다:

5'-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3' (프라이머 EFF1: 서열번호 1), 및

5'-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3' (프라이머 EFsmaR: 서열번호 2).

수득된 단편 A를 중첩 PCR(overlap PCR)에 의해 인간 κ-사슬 분비 신호, 인간 κ-사슬 불변 영역, 및 인간 폴리(A) 첨가 서열을 코딩하는 DNA 단편 (서열번호 3; 하기에서, "단편 B"로 지칭됨)에 라이게이션시켰다. 단편 A를 단편 B에 라이게이션시켜 수득된 DNA 단편(하기에서, "단편 A+B"로 지칭됨)을 제한효소 KpnI 및 SmaI으로 처리하고, 미리 제한효소 KpnI 및 SmaI로 처리한 플라스미드 pEF6/V5-His B (Invitrogen Corp.)에 라이게이션시켜, 신호 서열, 클로닝 부위, 인간 κ-사슬 불변 영역-코딩 서열, 및 EF1 프로모터 하류의 인간 폴리(A) 첨가 서열을 갖는 인간 L 사슬 발현 플라스미드 "pEF6KCL" (도 19)을 작제했다.

8.2 인간화 항체 중쇄 발현을 위한 벡터, pEF1/FCCU-1의 작제.

8.2.1 pEF1 / KCL 의 작제

전술된 방법에 의해 수득된 플라스미드 pEF6KCL을 제한효소 KpnI 및 SmaI으로 처리했다. 결과적으로 수득된 DNA 단편을 미리 KpnI 및 SmaI으로 처리한 pEF1/myc-His B (Invitrogen Corp.)에 라이게이션시켜, 플라스미드 pEF1/KCL을 작제했다.

8.2.2 pEF1 / FCCU -1의 작제

인간 IgG1의 신호 서열 및 불변 영역의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열 (서열번호 4)을 포함하는 DNA 단편을 제한효소 NheI 및 PmeI으로 처리하고, 미리 NheI 및 PmeI으로 처리한 플라스미드 pEF1/KCL에 라이게이션시켜, 신호 서열, 클로닝 부위, 인간 중쇄 불변 영역-코딩 서열, 및 EE1 프로모터의 하류에 있는 인간 폴리(A) 첨가 신호를 갖는 인간 중쇄 발현 플라스미드 pEF1/FCCU-1을 작제했다.

실시예 9: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간화 항체 유전자의 제조

a) h#11B7-T1L, h#11B7-T2L, h#11B7-T3L, h#11B7-T4L, h#11B7-T5L, h#11B7-T6L, h#11B7-T7L, h#11B7-T8L, h#11B7-T9L, h#11B7-T10L, h#11B7-T11L, h#11B7-T12L, 및 h#11B7-T13L, 경쇄 발현 벡터의 작제

분비 서열과 융합된, 각각 서열목록의 서열번호 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30의 21번 내지 129번 아미노산으로 표시되는 h#11B7-T1L, h#11B7-T2L, h#11B7-T3L, h#11B7-T4L, h#11B7-T5L, h#11B7-T6L, h#11B7-T7L, h#11B7-T8L, h#11B7-T9L, h#11B7-T10L, h#11B7-T11L, h#11B7-T12L, 또는 h#11B7-T13L 경쇄 가변 영역 (도 1 및 2)을 코딩하는 유전자를 포함하는 각 DNA를 합성하고 (MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Artificial Gene Synthesis Service) 제한효소 NheI 및 BsiWI로 처리했다. 결과적으로 수득된 DNA 단편을 별개로, 제한효소 NheI 및 BsiWI로 미리 처리한 인간화 항체 경쇄 발현을 위한 범용(general-purpose) 벡터(pEF6KCL)의 부위에 삽입하여 h#11B7-T1L, h#11B7-T2L, h#11B7-T3L, h#11B7-T4L, h#11B7-T5L, h#11B7-T6L, h#11B7-T7L, h#11B7-T8L, h#11B7-T9L, h#11B7-T10L, h#11B7-T11L, h#11B7-T12L, 및 h#11B7-T13L 경쇄 발현 벡터를 작제했다. 수득된 발현 벡터를 "pEF6KCL/h#11B7-T1L", "pEF6KCL/h#11B7-T2L", "pEF6KCL/h#11B7-T3L", "pEF6KCL/h#11B7-T4L", "pEF6KCL/h#11B7-T5L", "pEF6KCL/h#11B7-T6L", "pEF6KCL/h#11B7-T7L", "pEF6KCL/h#11B7-T8L", "pEF6KCL/h#11B7-T9L", "pEF6KCL/h#11B7-T10L", "pEF6KCL/h#11B7-T11L", "pEF6KCL/h#11B7-T12L", 또는 "pEF6KCL/h#11B7-T13L"로 표기하고, 각 발현 벡터의 삽입물은 각각 서열목록의 서열번호 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 또는 17의 뉴클레오티드 서열로 표시된다.

b) h#11B7-T1H, h#11B7-T2H, h#11B7-T3H, h#11B7-T4H, h#11B7-T5H, h#11B7-T6H, h#11B7-T7H, h#11B7-T8H, 및 h#11B7-T9H 중쇄 발현 벡터의 작제

각각 서열목록의 서열번호 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 또는 48의 20번 내지 132번 아미노산에 의해 표시된 h#11B7-T1H, h#11B7-T2H, h#11B7-T3H, h#11B7-T4H, h#11B7-T5H, h#11B7-T6H, h#11B7-T7H, h#11B7-T8H, 또는 h#11B7-T9H 중쇄 가변 영역 (도 4 및 5)을 코딩하는 유전자를 포함하는 각 DNA를 합성하고 (MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Artificial Gene Synthesis Service) 제한효소 BlpI으로 처리했다. 결과적으로 수득된 DNA 단편을 미리 제한효소 BlpI으로 처리한 인간화 항체 중쇄 발현을 위한 범용 벡터(pEF1/FCCU-1)의 부위에 각각 삽입하여, 그에 의해 h#11B7-T1H, h#11B7-T2H, h#11B7-T3H, h#11B7-T4H, h#11B7-T5H, h#11B7-T6H, h#11B7-T7H, h#11B7-T8H, 및 h#11B7-T9H 중쇄 발현 벡터를 작제했다. 수득된 발현 벡터를 "pEF1/FCCU/h#11B7-T1H", "pEF1/FCCU/h#11B7-T2H", "pEF1/FCCU/h#11B7-T3H", "pEF1/FCCU/h#11B7-T4H", "pEF1/FCCU/h#11B7-T5H", "pEF1/FCCU/h#11B7-T6H", "pEF1/FCCU/h#11B7-T7H", "pEF1/FCCU/h#11B7-T8H", 또는 "pEF1/FCCU/h#11B7-T9H"로 표기하고, 각 발현 벡터의 삽입물은 각각 서열목록의 서열번호 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39의 뉴클레오티드 서열로 표시된다.

실시예 10: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간화 항체의 제조

a) 인간화 항체의 제조

지수 성장기(log phase)에 있는 1.5x10⁸ FreeStyle 293-F 세포를 100 mL의 신선한 FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.)에 접종하고 37℃에서 8% CO₂의 존재 하에 인큐베이터에서 진탕-배양했다(125 rpm). 1 mg의 폴리에틸렌이민(Polyscience #24765)을 4 mL의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen Corp.)에 용해시키고 실온에서 5분 동안 방치했다. PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen Corp.)를 이용하여 제조된, 중쇄 발현 플라스미드 (0.05 mg) 및 경쇄 발현 플라스미드 (0.15 mg)를 4 mL의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen Corp.)에 현탁시켰다. 4 mL의 발현 플라스미드/Opti-Pro SFM 혼합 용액을 4 mL의 폴리에틸렌이민/Opti-Pro SFM 혼합 용액에 첨가하고, 5분 동안 실온에서 방치하고, 5분 동안 실온에서 더 방치했다. 그 후, 8 mL의 폴리에틸렌이민/발현 플라스미드/ Opti-Pro SFM 혼합 용액을 FreeStyle 293-F 세포 현탁액에 첨가하고, 진탕-배양을 지속했다. 37℃ 및 8% CO₂에서의 7일 배양 후, 배양 상층액을 수집했다.

b) 인간화 항체의 정제

전술된 문단 a)에서 수득된 배양 상층액을 단백질 A 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 100 mL의 배양 상층액을 캡(cap)이 있는 500-mL 플라스크에 넣고, 뒤이어 PBS로 평형화시킨 MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-science Ltd.) 현탁액 (50% 슬러리) 1 mL를 첨가했다. 수득된 혼합물을 10℃에서 인큐베이터에서 100 rpm으로 밤새 교반시켰다. FreeStyle 293-F 세포 배양액 상층액/MabSelect SuRe 현탁액을 5 mL의 Zeba Spin Column, empty (PIERCE)에 적용했다. 전체 수지를 상기 컬럼에 넣고 10 mL의 1M NaCl로 세척했다. 그 후, 1 mL의 1 M 아르기닌 용액 (pH 4.0)을 적용하여, 항체-함유 분획을 수집했다. 수집된 분획을 Centrifugal Filter Device (Amicon Ultra-4, molecular weight cut off: 50 K, Millipore Corp.)에 첨가하고, 뒤이어 시트레이트 완충액에 의한 용액 대체(solution replacement) 및 농축을 수행하여, 200 ㎕로 조정하여, 정제된 시료를 제조했다.

pEF6KCL/h#11B7-T1L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T1H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T1"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T2L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T2H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T2"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T3L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T3H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T3"으로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T4L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T4H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T4"로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T5L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T5H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T5"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T6L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T6H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T6"으로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T7L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T7H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T7"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T8L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T7H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T8"로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T9L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T7H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T9"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T10L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T7H 의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T10"으로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T11L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T7H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T11"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T12L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T7H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T12"로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T13L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T7H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T13"으로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T7L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T8H 의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T14"로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T8L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T8H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T15"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T9L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T8H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T16"으로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T10L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T8H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T17"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T11L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T8H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T18"로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T12L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T8H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T19"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T13L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T8H 의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T20"으로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T7L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T9H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T21"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T8L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T9H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T22"로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T9L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T9H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T23"으로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T10L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T9H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T24"로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T11L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T9H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T25"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T12L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T9H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T26"으로 표기하며; 및 pEF6KCL/h#11B7-T13L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T9H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T27"로 표기한다.

h#11B7	H 플라스미드	L 플라스미드
h#11B7-T1	pEF1/FCCU/h#11B7-T1H	pEF6KCL/h#11B7-T1L
h#11B7-T2	pEF1/FCCU/h#11B7-T2H	pEF6KCL/h#11B7-T2L
h#11B7-T3	pEF1/FCCU/h#11B7-T3H	pEF6KCL/h#11B7-T3L
h#11B7-T4	pEF1/FCCU/h#11B7-T4H	pEF6KCL/h#11B7-T4L
h#11B7-T5	pEF1/FCCU/h#11B7-T5H	pEF6KCL/h#11B7-T5L
h#11B7-T6	pEF1/FCCU/h#11B7-T6H	pEF6KCL/h#11B7-T6L
h#11B7-T7	pEF1/FCCU/h#11B7-T7H	pEF6KCL/h#11B7-T7L
h#11B7-T8	pEF1/FCCU/h#11B7-T7H	pEF6KCL/h#11B7-T8L
h#11B7-T9	pEF1/FCCU/h#11B7-T7H	pEF6KCL/h#11B7-T9L
h#11B7-T10	pEF1/FCCU/h#11B7-T7H	pEF6KCL/h#11B7-T10L
h#11B7-T11	pEF1/FCCU/h#11B7-T7H	pEF6KCL/h#11B7-T11L
h#11B7-T12	pEF1/FCCU/h#11B7-T7H	pEF6KCL/h#11B7-T12L
h#11B7-T13	pEF1/FCCU/h#11B7-T7H	pEF6KCL/h#11B7-T13L
h#11B7-T14	pEF1/FCCU/h#11B7-T8H	pEF6KCL/h#11B7-T7L
h#11B7-T15	pEF1/FCCU/h#11B7-T8H	pEF6KCL/h#11B7-T8L
h#11B7-T16	pEF1/FCCU/h#11B7-T8H	pEF6KCL/h#11B7-T9L
h#11B7-T17	pEF1/FCCU/h#11B7-T8H	pEF6KCL/h#11B7-T10L
h#11B7-T18	pEF1/FCCU/h#11B7-T8H	pEF6KCL/h#11B7-T11L
h#11B7-T19	pEF1/FCCU/h#11B7-T8H	pEF6KCL/h#11B7-T12L
h#11B7-T20	pEF1/FCCU/h#11B7-T8H	pEF6KCL/h#11B7-T13L
h#11B7-T21	pEF1/FCCU/h#11B7-T9H	pEF6KCL/h#11B7-T7L
h#11B7-T22	pEF1/FCCU/h#11B7-T9H	pEF6KCL/h#11B7-T8L
h#11B7-T23	pEF1/FCCU/h#11B7-T9H	pEF6KCL/h#11B7-T9L
h#11B7-T24	pEF1/FCCU/h#11B7-T9H	pEF6KCL/h#11B7-T10L
h#11B7-T25	pEF1/FCCU/h#11B7-T9H	pEF6KCL/h#11B7-T11L
h#11B7-T26	pEF1/FCCU/h#11B7-T9H	pEF6KCL/h#11B7-T12L
h#11B7-T27	pEF1/FCCU/h#11B7-T9H	pEF6KCL/h#11B7-T13L

실시예 11: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11 D5 의 인간화 항체 유전자의 제조

a) h#11D5-T1L, h#11D5-T2L, h#11D5-T3L, h#11D5-T4L, h#11D5-T5L, 및 h#11D5-T6L 경쇄 발현 벡터의 작제

각각, 분비 신호와 융합된, 서열목록의 서열번호 55, 56, 57, 58, 59, 또는 60의 21번 내지 129번 아미노산에 의해 표시된 h#11D5-T1L, h#11D5-T2L, h#11D5-T3L, h#11D5-T4L, h#11D5-T5L, 및 h#11D5-T6L 경쇄 가변 영역 (도 6)을 코딩하는 유전자를 포함하는 각 DNA를 합성하고 (MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Artificial Gene Synthesis Service) 제한효소 NheI 및 BsiWI로 처리했다. 결과적으로 수득된 DNA 단편을 각각 미리 제한효소 NheI 및 BsiWI으로 처리된 인간화 항체 경쇄 발현을 위한 범용 벡터(pEF6KCL)의 부위에 삽입하여, h#11D5-T1L, h#11D5-T2L, h#11D5-T3L, h#11D5-T4L, h#11D5-T5L, 및 h#11D5-T6L 경쇄 발현 벡터를 작제했다. 수득된 발현 벡터를 "pEF6KCL/h#11D5-T1L", "pEF6KCL/h#11D5-T2L", "pEF6KCL/h#11D5-T3L", "pEF6KCL/h#11D5-T4L", "pEF6KCL/h#11D5-T5L", 또는 "pEF6KCL/h#11B7-T6L"로 표기하고, 각 발현 벡터의 삽입물은 각각 서열목록의 서열번호 49, 50, 51, 52, 53, 또는 54의 뉴클레오티드 서열에 의해 표시된다.

b) h#11D5-T1H, h#11D5-T2H, h#11D5-T3H, h#11D5-T4H, h#11D5-T5H, 및 h#11D5-T6H 중쇄 발현 벡터의 작제

각각, 서열목록의 서열번호 67, 68, 69, 70, 71, 또는 72의 20번 내지 132번 아미노산에 의해 표시된 h#11D5-T1H, h#11D5-T2H, h#11D5-T3H, h#11D5-T4H, h#11D5-T5H, 또는 h#11D5-T6H 중쇄 가변 영역을 코딩하는 유전자(도 12)를 포함하는 각 DNA를 합성하고(MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Artificial Gene Synthesis Service), 제한효소 BlpI으로 처리했다. 결과적으로 수득된 DNA 단편을 미리 제한효소 BlpI으로 처리한 인간화 항체 중쇄 발현을 위한 범용 벡터 (pEF1/FCCU-1)의 부위에 각각 삽입하여, h#11D5-T1H, h#11D5-T2H, h#11D5-T3H, h#11D5-T4H, h#11D5-T5H, 및 h#11D5-T6H 중쇄 발현 벡터를 작제했다. 수득된 발현 벡터를 "pEF1/FCCU/h#11D5-T1H", "pEF1/FCCU/h#11D5-T2H", "pEF1/FCCU/h#11D5-T3H", "pEF1/FCCU/h#11D5-T4H", "pEF1/FCCU/h#11D5-T5H", 또는 "pEF1/FCCU/h#11D5-T6H"로 표기하고, 각각의 발현 벡터의 삽입물은 각각 서열목록의 서열번호 61, 62, 63, 64, 65, 또는 66의 뉴클레오티드 서열로 표시된다.

실시예 12: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11 D5 의 인간화 항체의 제조

a) 인간화 항체의 제조

지수 성장기에 있는 1.5x10⁸ FreeStyle 293-F 세포를 100 mL의 신선한 FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen Corp.)에 접종하고 37℃에서 8% CO₂의 존재 하에 인큐베이터에서 진탕-배양했다(125 rpm). 1 mg의 폴리에틸렌이민(Polyscience #24765)을 4 mL의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen Corp.)에 용해시키고 실온에서 5분 동안 방치했다. PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen Corp.)를 이용하여 제조된, 중쇄 발현 플라스미드 (0.05 mg) 및 경쇄 발현 플라스미드 (0.15 mg)를 4 mL의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen Corp.)에 현탁시켰다. 4 mL의 발현 플라스미드/Opti-Pro SFM 혼합 용액을 4 mL의 폴리에틸렌이민/Opti-Pro SFM 혼합 용액에 첨가하고, 5분 동안 실온에서 방치하고, 5분 동안 실온에서 더 방치했다. 그 후, 8 mL의 폴리에틸렌이민/발현 플라스미드/Opti-Pro SFM 혼합 용액을 FreeStyle 293-F 세포 현탁액에 첨가하고, 진탕-배양을 지속했다. 37℃ 및 8% CO₂에서의 7일 배양 후, 배양 상층액을 수집했다.

b) 인간화 항체의 정제

전술된 문단 a)에서 수득된 배양 상층액을 단백질 A 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 100 mL의 배양 상층액을 캡이 있는 500-mL 플라스크에 넣고, 뒤이어 PBS로 평형화시킨 MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-science Ltd.) 현탁액 (50% 슬러리) 1 mL를 첨가했다. 수득된 혼합물을 10℃에서 인큐베이터에서 100 rpm으로 밤새 교반시켰다. FreeStyle 293-F 세포 배양액 상층액/MabSelect SuRe 현탁액을 5 mL의 Zeba Spin Column, empty (PIERCE)에 적용했다. 전체 수지를 상기 컬럼에 넣고 10 mL의 1M NaCl로 세척했다. 그 후, 1 mL의 1 M 아르기닌 용액 (pH 4.0)을 적용하여, 항체-함유 분획을 수집했다. 수집된 분획을 Centrifugal Filter Device (Amicon Ultra-4, molecular weight cut off: 50 K, Millipore Corp.)에 첨가하고, 뒤이어 시트레이트 완충액에 의한 용액 대체 및 농축을 수행했다. 최종 용량(capacity)을 200 ㎕로 조정하여, 정제된 시료를 제조했다.

pEF6KCL/h#11D5-T1L과 pEF1/FCCU/h#11D5-T1H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11D5를 "h#11D5-T1"로 표기하고; pEF6KCL/h#11D5-T2L과 pEF1/FCCU/h#11D5-T2H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11D5를 "h#11D5-T2"로 표기하며; pEF6KCL/h#11D5-T3L과 pEF1/FCCU/h#11D5-T3H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11D5를 "h#11D5-T3"으로 표기하며; pEF6KCL/h#11D5-T4L과 pEF1/FCCU/h#11D5-T4H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11D5를 "h#11D5-T4"로 표기하고; pEF6KCL/h#11D5-T5L과 pEF1/FCCU/h#11D5-T5H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11D5를 "h#11D5-T5"로 표기하며; 및 pEF6KCL/h#11D5-T6L과 pEF1/FCCU/h#11D5-T6H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11D5를 "h#11D5-T6"으로 표기했다.

실시예 13: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간화 항체의 인간 AXL-Fc 융합 단백질에 대한 친화도의 평가

랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7로부터 유래된 인간화 항체 h#11B7-T1 내지 h#11B7-T27을 하기에 기재된 방법에 의해 인간 AXL-Fc에 대한 친화도에 대해 평가했다. 인간 AXL-Fc (R&D Systems에 의해 제조됨, #154-AL)를 PBS로 1㎍/ml까지 희석시켰다. 그 후, 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 Immuno Plate (Nalge Nunc International K.K.에 의해 제조됨, #437111)에 분배하고 4℃에서 밤새 방치하여 단백질을 플레이트에 흡착시켰다. 다음 날, 웰을 PBS-T 용액 (PBS 및 0.05% (v/v) Tween 20)으로 5회 세척했다. 그 후, PBS로 5% 까지 희석시킨, 탈지 우유(Morinaga Milk Industry Co.에 의해 제조됨, Ltd.)를 포함하는 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 분배하고 실온에서 2시간 동안 방치했다. 웰 중의 용액을 제거하고, 웰을 PBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후, 실시예 10에서 제조된 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 정제된 인간화 항체 T1 내지 T27을 각각 0.5% 탈지 우유를 포함하는 PBS 용액으로 1 ㎍/ml 내지 0.00256 ng/ml (5-배 희석 시리즈)의 최종 농도로 희석했다. 그 후, 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 분배하고 실온에서 2시간 동안 방치했다. 이 절차에서, 각 항체 농도를 실시예 15에 따라 결정했다. 웰을 PBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후, TBS-T 용액 (TBS 및 0.05% (v/v) Tween 20)으로 2500배 희석시킨 알칼리 포스파타아제-접합 AffiniPure Goat Anti-Human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.에 의해 제조됨, #109-055-097)를 100 ㎕/웰의 양으로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 방치했다. 웰 중의 용액을 제거하고, 상기 웰을 TBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후 형광 기질 용액(manufactured by Roche Diagnostics K.K., #11681982001)을 100 ㎕/웰의 양으로 첨가하여, 형광 반응을 수행했다. 인간 AXL-Fc-흡착 플레이트 상에서 형광 강도를 SpectraMax M5 (Molecular Devices Corp.에 의해 제조됨)를 이용하여 형광 기질 용액의 첨가 15분 후 측정했다. 그 결과, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간화 항체의 조사된 27개의 시료에서, #11B7-T1 및 h#11B7-T4는 인간 키메라 항체보다 더 낮은 결합 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 그러나, 나머지 25개의 시료는 항체 농도-의존적 방식으로 인간 AXL-Fc 단백질에 대해 인간 키메라 항체와 거의 동일한 결합 활성을 갖는 것으로 확인하였다(도 19, 20, 21 및 22).

실시예 14: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11 D5 의 인간화 항체의 인간 AXL-Fc 융합 단백질에 대한 친화도의 평가

랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 인간화 항체 h#11D5-T1 내지 h#11D5-T6을 하기에 기재된 방법에 의해 인간 AXL-Fc에 대한 친화도에 대해 평가했다. 인간 AXL-Fc (R&D Systems에 의해 제조됨, #154-AL)를 PBS로 1 ㎍/ml까지 희석시켰다. 그 후, 수득된 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 Immuno Plate (Nalge Nunc International K.K. 제조, #437111)에 분배하고 4℃에서 밤새 방치하여 단백질을 플레이트에 흡착시켰다. 다음 날, 웰을 PBS-T 용액 (PBS 및 0.05% (v/v) Tween 20)으로 5회 세척했다. 그 후, PBS로 5% 까지 희석시킨, 탈지 우유(Morinaga Milk Industry Co.에 의해 제조됨, Ltd.)를 포함하는 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 분배하고 실온에서 2시간 동안 방치했다. 웰 중의 용액을 제거하고, 웰을 PBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후, 실시예 12에서 제조된 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체의 정제된 인간화 항체 T1 내지 T6을 각각 0.5% 탈지 우유를 포함하는 PBS 용액으로 1 ㎍/ml 내지 0.00256 ng/ml (5-배 희석 시리즈)의 최종 농도로 희석했다. 그 후, 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 분배하고 실온에서 2시간 동안 방치했다. 이 절차에서, 각 항체 농도를 실시예 15에 따라 결정했다. 웰을 PBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후, TBS-T 용액 (TBS 및 0.05% (v/v) Tween 20)으로 2500배 희석시킨 알칼리 포스파타아제-접합 AffiniPure Goat Anti-Human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.에 의해 제조됨, #109-055-097)를 100 ㎕/웰의 양으로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 방치했다. 웰 중의 용액을 제거하고, 상기 웰을 TBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후 형광 기질 용액(Roche Diagnostics K.K. 제조, #11681982001)을 100 ㎕/웰의 양으로 첨가하여, 형광 반응을 수행했다. 인간 AXL-Fc-흡착 플레이트 상에서 형광 강도를 SpectraMax M5 (Molecular Devices Corp.에 의해 제조됨)을 이용하여 형광 기질 용액의 첨가 15분 후 측정했다. 그 결과, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5의 인간화 항체의 조사된 6개의 시료 중에서, #11D5-T4, #11D5-T5, 및 h#11D5-T6 항체 농도-의존적 방식으로 인간 AXL-Fc 단백질에 대해 인간 키메라 항체와 거의 동일한 결합 활성을 갖는 것으로 확인하였다(도 23).

실시예 15: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7 및 #11 D5 의 인간화 항체의 흡광 계수 계산 및 직접적인 단백질 흡광도 분석법

랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7로부터 유래된 인간화 항체 h#11B7-T1 내지 h#11B7-T27 및 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11D5로부터 유래된 h#11D5-T1 내지 h#11D5-T6의 단백질 농도를 하기에 기재된 프로토콜에 의해 결정했다. 각각 실시예 10 또는 12에서 제조된 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7 또는 #11D5의 각 인간화 항체를 MX5 Automated-S 미량천칭(microbalance) (METTLER TOLEDO)를 이용하여 그의 질량만큼 희석시켰다. 각 항체에 대해, 280 nm에서의 흡광도 (A280)를 실온에서 석영 셀을 이용하여 DU -7400 UV - vis Spectrophotometer ( Beckman Coulter , Inc .)로 측정했다. 각 항체의 단백질 농도를 흡광 계수( absorption coefficient )에 의해 결정했다. 각 항체의 흡광 계수를 국립보건원( National Institute of Health )의 웹사이트 ( http://jphilo.mailway.com/download.htm )에서 다운로딩할 수 있는 소프트웨어 Sednterp를 이용하여 결정했다. 결과가 도 24(h#11B7- T1 내지 h#11B7- T14 에 대한 상부 패널; h#11B7- T15 내지 h#11B7- T27 에 대한 하부 패널) 및 도 25 (h#11 D5 - T1 내지 h#11 D5 - T6 )에 도시된다.

실시예 16: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 결합 부위( 에피토프 )의 결정

a) 인간 AXL 탠덤(tandem) IG 도메인의 발현 및 정제

N-말단 His-tag 및 트롬빈(Thrombin) 인식 서열에 연결된 인간 AXL IG 도메인 (NCBI 단백질 데이터베이스 등록번호 P_30530의 26번 내지 220번 아미노산: 서열번호 139)을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA를 벡터 pDEST14 (Invitrogen Corp., catalog No.: 11801-016)에 내포시켰다. 대장균 Rosetta-gami B(DE3) (Novagen, catalog No.: 71136-4)을 이 플라스미드로 형질전환시키고 TB 배지 (Invitrogen Corp., catalog No.: 22711-022)에서 배양했다. 배양된 박테리아 세포를 초음파처리에 의해 파쇄시키고 원심분리하고, HisTrap HP 컬럼 (GE Healthcare, catalog No.: 17-5247-01)을 이용하여 상층액을 정제했다. 용리액을 모으고 PD-10 컬럼(GE Healthcare, catalog No.: 17-0851-01)에 의해 탈염시키고, His-tag을 트롬빈(Sigma-Aldrich, catalog No.: T-7009)에 의해 절단했다. 21 kDa의 분자량을 갖는 단일 밴드를 수득할 때까지 절단된 단백질을 MONO Q 5/50 GL(GE Healthcare, catalog No.: 17-5166-01) 및 Superdex 75 10/300 컬럼 (GE Healthcare, catalog No.: 17-5174-01) 에 적용했다.

b) 인간 AXL 단일 IG 도메인의 발현 및 정제

N-말단 His-tag 및 Factor Xa 인식 서열에 연결된 인간 AXL IG 도메인 (NCBI 단백질 데이터베이스 등록번호 P_30530의 26번 내지 131번 및 129번 내지 220번 아미노산)을 포함하는 단백질을 코딩하는 DNA를 벡터 pDEST14 (Invitrogen Corp., catalog No.: 11801-016)에 내포시켰다. 대장균 Rosetta-gami B(DE3) (Novagen, catalog No.: 71136-4)을 이 플라스미드로 형질전환시키고 TB 배지 (Invitrogen Corp., catalog No.: 22711-022)에서 배양했다. 배양된 박테리아 세포를 초음파처리에 의해 파쇄시키고 원심분리하고, HisTrap HP 컬럼 (GE Healthcare, catalog No.: 17-5247-01)을 이용하여 상층액을 정제했다. 그 후, 11 kDa의 분자량을 갖는 단일 밴드를 수득할 때까지, 인간 AXL IG 도메인을 Superdex 75 10/300 컬럼 (GE Healthcare, catalog No.: 17-5174-01)을 이용한 전기영동에 의해 정제했다.

c) 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간 AXL-IG 도메인 상의 결합 부위(에피토프)의 결정

랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간 AXL-IG 도메인 상의 결합 부위(에피토프)를 하기 방법에 의해 평가했다:인간 AXL의 두 개의 IG 도메인 중 하나를 포함하는 펩티드(NHis-hAXL26-131 및 NHis-hAXL129-220), 및 인간 AXL의 상기 두 개의 IG 도메인 모두를 포함하는 펩티드(hAXL26-220)를 각각 PBS로 1 mg/ml까지 희석시켰다. 그 후, 각 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 Immuno Plate (Nalge Nunc International K.K.에 의해 제조됨, #437111)에 분배하고 상기 플레이트에 펩티드를 흡착시키기 위해 4℃에서 밤새 방치했다. 다음 날, 웰을 PBS-T 용액 (PBS 및 0.05% (v/v) Tween 20)으로 5회 세척했다. 그 후, PBS로 5%까지 희석시킨, 탈지 우유(Morinaga Milk Industry Co.에 의해 제조됨, Ltd.)를 포함하는 용액을 100 ml/웰의 양으로 분배하고, 실온에서 2시간 동안 방치했다. 웰의 용액을 제거하고, 웰을 PBS-T 용액으로 5회 세척했다. 랫트 항-인간 AXL 항체 #11B7을 0.5% 탈지 우유를 포함하는 PBS 용액으로 0.04 ㎍/ml까지 희석시켰다. 그 후, 수득된 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 분배하고 2시간 동안 실온에서 방치했다. 웰을 PBS-T 용액으로 5회 세척했다. TBS-T 용액 (TBS 및 0.05% (v/v) Tween 20)으로 2500배 희석시킨 알칼리 포스파타아제-접합 AffiniPure Goat Anti-Human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.에 의해 제조됨, #109-055-097)를 100 ml/웰의 양으로 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치했다. 웰의 용액을 제거하고, TBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후, 형광 기질 용액 (Roche Diagnostics K.K.에 의해 제조됨, #11681982001)을 100 ml/웰의 양으로 첨가하여 형광 반응을 수행했다. 형광 기질 용액의 첨가 15분 후 SpectraMax M5 (Molecular Devices Corp. 제조)를 이용하여, 인간 AXL-IG 도메인-흡착 플레이트 상에서 형광 강도를 측정했다. ELISA의 결과, hAXL26-220 및 NHis-hAXL129-220만 결합 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 따라서, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 에피토프는 인간 AXL의 두 개의 IG 도메인 중 카르복시 말단에 더 가까운 도메인(NCBI 단백질 데이터베이스 등록번호 P_30530 중 129번 내지 220번의 아미노산의 아미노산 잔기들을 포함하는 도메인: 서열번호 139; 도 30A)이라는 것이 입증되었다 (도 26).

실시예 17: 본 발명의 인간화 항- AXL 항체는 인 비트로에서 리간드 -유도 AXL 인산화를 억제한다.

증식 정지 특이적 유전자(growth arrest specific gene) 6, Gas6에 의해 코딩된 단백질은 수용체 티로신 키나아제 AXL의 천연 리간드이다. Gas6의 AXL로의 결합은 증가된 티로신 키나아제 인산화 수준으로 반영되는, 수용체 활성화를 초래한다. 실시예 17에 기재된 실험은 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6이 수용체 티로신 키나아제 AXL의 Gas6-매개 활성화를 방해하는 능력을 다루도록 설정하였다.

실시예 17.1: 본 발명의 인간화 항- AXL 항체는 ELISA 에 의해 결정된 바와 같이 인 비트로에서 리간드 -유도 AXL 인산화를 억제한다.

본 발명의 인간화 항-AXL 항체가 AXL의 리간드 Gas6-유도 인산화를 차단할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 ELISA 실험을 수행했다. 요약하면, 1일 차에, 웰당 3x10⁴ 세포를 편평-바닥(flat-bottom) 96 웰 플레이트 중의 정상 성장 배지에 접종했다. 다음 날, 세포를 24시간 동안 밤새 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 또한, 밤새, 블랙 Maxi-Sorp 96 웰 플레이트 (Nunc)를 4℃에서 2 ㎍/ml의 PBS 중 마우스 항-포스포-티로신 항체 4G10으로 코팅시켰다. 3일 차에, 4G10 항체 용액을 제거하고, Maxi-Sorp 웰을 실온에서 4시간 이상 동안 PBS, 0.5% BSA로 블록킹(block)시켰다. 동시에, 세포들을 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Sigma), 키메라 항-AXL mAb #11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6와 함께 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션하고, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 신속히 제거하고(flick), 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100)에서 용해시켰다. 한편, 블록킹 완충액을 제거하고, Maxi-Sorp 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.05% Tween 20)으로 6회 세척하고, 용해물을 옮기고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 4일 차에 상기 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척한 후, 웰을 실온에서 2시간 동안 0.5 ㎍/ml PBS 중 비오티닐화 랫트 항-AXL 항체 12B7과 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고, PBS 중에 1:4.000으로 희석된 AP-접합 스트렙타비딘 (Chemicon #SA110)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 웰을 세척 완충액으로 6회 세척하고, AttoPhos 기질 용액 (Roche #11681982)을 첨가했다. Victor 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 이용하여, 각 웰의 형광을 430 nm의 여기 파장 및 580 nm의 발광 파장(emission wavelength)에서 수집했다.

도 27은 Hs578T 유방암 세포에 대한 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 #11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 감소된 AXL 티로신 인산화 수준에 의해 나타난 바와 같이, Hs578T 유방암 세포에서 Gas6-매개 AXL 활성화를 차단하거나 또는 유의성 있게 감소시킬 수 있었다. 동일한 패널의 항체들(same panel of antibodies)에 의한 유사한 효과를 AXL 과다-발현 NIH3T3-AXL cl.7 섬유모세포, 폐암 세포주 NCI-H292, 흑색종 세포주 C-8161, 및 전립선암 세포주 PC-3 및 DU-145에서 관찰했다.

실시예 17.2: 본 발명의 인간화 항- AXL 항체는 웨스턴 - 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같이 리간드 -유도 AXL 인산화를 억제한다.

또한, 인간화 항체가 AXL의 리간드 Gas6-유도 활성화를 방해하는 능력을 확인하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. 이 목적을 위해, 1일 차에, 1.5　x　10⁶ Hs578T 유방암 세포를 10cm 배양 디쉬에 접종했다. 다음 날, 세포들을 밤새 24시간 동안 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 3일 차에, 세포를 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Sigma), 키메라 항-AXL mAb #11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6와 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션시키고, 그 후, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 1 ml에서 용해시키고, 세포 파편을 10,000　x　g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거했다. 면역 침전을 위해, 상층액의 단백질 농도를 결정하고, 500 ㎍의 전세포 용해물을 회전 휠(rotation wheel) 상에서 30　㎕의 단백질 A-세파로오스 현탁액 및 1　㎍의 랫트 항-AXL 단일클론 항체 12B7과 4℃에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 침전물을 0.7 ml의 차가운 HNTG 완충액 (20　mM HEPES pH 7.5, 150　mM NaCl, 0.1% Triton-X-100, 10% 글리세롤, 및 10 mM Na₄P₂O₇)으로 3회 세척하고, 40㎕의 3xSDS Laemmli 시료 완충액에 현탁시키고 가열하고, SDS PAGE에 적용했다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 그 후, 상기 막을 NET-Gelatine으로 블록킹시키고, 마우스 단일클론 항-포스포-티로신 일차 항체 4G10 (Upstate)와 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, NET-Gelatine에 의한 3회 세척 후에, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-접합 항-마우스 이차 항체와 인큐베이션시키고, 다시 NET-Gelatine으로 3회 세척했다. 제조사의 설명서(GE Healthcare)에 따라 화학발광 검출 키트를 적용하여, 필터를 최종적으로 필름(Kodak)에 노출시켰다. 그 후, 동일한 필터를 항-AXL 항체로 재-탐색(re-probe)했다.

도 27은 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 #11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 감소된 AXL 티로신 인산화 수준에 의해 나타난 바와 같이, Hs578T 유방암 세포에서 Gas6-유도 AXL 활성화를 차단하거나 또는 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.

실시예 18: 본 발명의 인간화 항- AXL 항체는 인 비트로에서 AXL 하류 신호전달 분자의 리간드 -유도 인산화를 억제한다.

수용체 티로신 키나아제 Axl의 Gas6-유도 활성화는 Axl 자체의 증가된 티로신 인산화 수준에 의해 반영될 뿐 아니라, ERK1/2 및 PKB/AKT 경로를 포함한, 하류 신호전달 캐스캐이드(downstream signaling cascade)의 유도와 연관된다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6이 ERK1과 ERK2 및 AKT의 Gas6-매개 활성화를 방해할 가능성을 확인하기 위한 실험을 지속했다. 또한, 본 발명자들은 신호전달 분자, GSK-3β, TSC2, mTOR, 및 S6K1의 인산화 상태가 Gas6에 의한 자극시 조절되며, 따라서, 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6의 상기 분자들에 대한 억제 효과도 조사했다.

실시예 18.1: 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 인 비트로에서 ERK1 /2의 리간드-유도 인산화를 억제한다.

본 발명의 인간화 항체가 ERK1/2의 Gas6-유도 활성화를 방해할 가능성을 갖는지 여부를 조사하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. ERK1/2의 Gas6-매개 활성화는 Thr202 및 Tyr204 위치에서 증가된 인산화 수준에 의해 반영된다. 이 목적을 위해, 5　x　10⁶ Hs578T 유방암 세포 또는 3　x　10⁶ NCI-H292 폐암 세포를 1일 차에 10cm 배양 디쉬에 접종했다. 다음 날, 세포들을 밤새 24시간 동안 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 3일 차에, 세포를 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter), 키메라 항-Axl mAb chm11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6와 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션시키고, 그 후, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 800 ㎕로 용해시키고, 세포 파편을 10,000　x　g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거했다. 상층액의 단백질 농도를 결정하고, 50 ㎍의 전세포 용해물을 3 x SDS Laemmli 시료 완충액에 현탁시키고, 가열하고, SDS PAGE를 수행했다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 상기 막을 NET-Gelatine으로 블록킹시키고, 토끼 다중클론 항-포스포-p44/42 MAP 키나아제 (Thr202/Tyr204) 일차 항체 (Cell Signaling Technologies, #9101)와 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, NET-Gelatine에 의한 3회 세척 후에, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-접합 항-토끼 이차 항체(Dianova, #111-036-045)와 인큐베이션시키고, 다시 NET-Gelatine으로 3회 세척했다. 제조사의 설명서(GE Healthcare)에 따라 화학발광 검출 키트를 적용하여, 필터를 최종적으로 필름(Kodak)에 노출시켰다. 그 후, 동일한 필터를 항-p44/42 MAP 키나아제 항체 (Santa Cruz K-23, #sc-153)로 재-탐색했다.

도 28a는 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 Hs578T 유방암 세포에서 약한, Gas6-유도 ERK1/2 활성화의 증가를 방해했다. 그러나, 이 세포주에서 ERK1/2의 높은 기본 활성 때문에, 상응하는 Gas6-미처리(non-stimulated) 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 ERK1/2 Thr202/Tyr204 인산화 수준에 의해 표시된 효과는 비교적 보통 정도(moderate)에 불과한 것으로 보인다(상단). 대조적으로, ERK1/2 Thr202/Tyr204 인산화에 대한 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 인간화 항-Axl 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 또는 h#11B7-T6의 저해 효과는 NCI-H292 폐암 세포에서 보다 명백하게 반영된다(하단).

실시예 18.2: 본 발명의 인간화 11B7 항- Axl 은 인 비트로에서 AKT 의 리간드 -유도 인산화를 억제한다

본 발명의 인간화 항체가 AKT의 Gas6-유도 활성화를 방해할 가능성을 갖는지 여부를 조사하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. Gas6-매개 AKT 활성화는 Ser473 위치에서 증가된 인산화 수준에 의해 반영된다. 이 목적을 위해, 5　x　10⁶ Hs578T 유방암 세포 또는 3　x　10⁶ NCI-H292 폐암 세포를 1일 차에 10cm 배양 디쉬에 접종했다. 다음 날, 세포들을 밤새 24시간 동안 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 3일 차에, 세포를 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter), 키메라 항-Axl mAb chm11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6와 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션시키고, 그 후, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 800 ㎕로 용해시키고, 세포 파편을 10,000　x　g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거했다. 상층액의 단백질 농도를 결정하고, 50 ㎍의 전세포 용해물을 3 x SDS Laemmli 시료 완충액에 현탁시키고, 가열하고, SDS PAGE를 수행했다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 상기 막을 NET-Gelatine으로 블록킹시키고, 토끼 다중클론 항-AKT1/2/3 일차 항체 (Cell Signaling Technologies, #9272)와 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, NET-Gelatine에 의한 3회 세척 후에, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-접합 항-토끼 이차 항체(Dianova, #111-036-045)와 인큐베이션시키고, 다시 NET-Gelatine으로 3회 세척했다. 제조사의 설명서(GE Healthcare)에 따라 화학발광 검출 키트를 적용하여, 필터를 최종적으로 필름(Kodak)에 노출시켰다. 그 후, 동일한 필터를 항-포스포-AKT (Ser473) 항체 (Cell Signaling Technologies, #9271)로 재-탐색했다.

도 28b는 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 AKT Ser473 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)에서 Gas6-유도 AKT 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.

실시예 18.3: 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 인 비트로에서 GSK -3β의 리간드 -유도 인산화를 억제한다

본 발명의 인간화 항체가 Ser9 위치에서 증가된 인산화 수준에 의해 반영된, GSK-3β의 Gas6-유도 활성화를 방해할 가능성을 갖는지 여부를 조사하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. 이 목적을 위해, 5　x　10⁶ Hs578T 유방암 세포 또는 3　x　10⁶ NCI-H292 폐암 세포를 1일 차에 10cm 배양 디쉬에 접종했다. 다음 날, 세포들을 밤새 24시간 동안 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 3일 차에, 세포를 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter), 키메라 항-Axl mAb chm11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6와 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션시키고, 그 후, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 800 ㎕로 용해시키고, 세포 파편을 10,000　x　g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거했다. 상층액의 단백질 농도를 결정하고, 50 ㎍의 전세포 용해물을 3 x SDS Laemmli 시료 완충액에 현탁시키고, 가열하고, SDS PAGE를 수행했다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 상기 막을 NET-Gelatine으로 블록킹시키고, 토끼 다중클론 항-포스포-GSK-3β (Ser9) 일차 항체 (Cell Signaling Technologies, #9336)와 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, NET-Gelatine에 의한 3회 세척 후에, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-접합 항-토끼 이차 항체(Dianova, #111-036-045)와 인큐베이션시키고, 다시 NET-Gelatine으로 3회 세척했다. 제조사의 설명서(GE Healthcare)에 따라 화학발광 검출 키트를 적용하여, 필터를 최종적으로 필름(Kodak)에 노출시켰다. 그 후, 동일한 필터를 항-GSK-3β 항체 (Becton Dickinson, #610201) 및 HRP-접합 항-마우스 이차 항체(Dianova, #315-036-045)로 재-탐색했다.

도 28c는 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 GSK-3β Ser9 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)에서 Gas6-유도 GSK-3β 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.

실시예 18.4: 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 인 비트로에서 TSC2 의 리간드-유도 인산화를 억제한다

본 발명의 인간화 항체가 아미노산 잔기 Thr1462에서 TSC2의 Gas6-유도 및 PI3K/AKT-매개 인산화를 방해하는 능력을 갖는지 여부를 조사하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. Thr1462에서 TSC2의 인산화는 일반적으로 TSC 복합체의 종양 억제자 기능의 억제, 및 그 결과, 하류 mTOR 경로의 활성화와 연관된다. 요약하면, 5　x　10⁶ Hs578T 유방암 세포 또는 3　x　10⁶ NCI-H292 폐암 세포를 1일 차에 10cm 배양 디쉬에 접종했다. 다음 날, 세포들을 밤새 24시간 동안 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 3일 차에, 세포를 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter), 키메라 항-Axl mAb chm11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6와 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션시키고, 그 후, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 800 ㎕로 용해시키고, 세포 파편을 10,000　x　g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거했다. 상층액의 단백질 농도를 결정하고, 50 ㎍의 전세포 용해물을 3 x SDS Laemmli 시료 완충액에 현탁시키고, 가열하고, SDS PAGE를 수행했다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 상기 막을 NET-Gelatine으로 블록킹시키고, 토끼 다중클론 항-TSC2 일차 항체 (Cell Signaling Technologies, #3612)와 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, NET-Gelatine에 의한 3회 세척 후에, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-접합 항-토끼 이차 항체(Dianova, #111-036-045)와 인큐베이션시키고, 다시 NET-Gelatine으로 3회 세척했다. 제조사의 설명서(GE Healthcare)에 따라 화학발광 검출 키트를 적용하여, 필터를 최종적으로 필름(Kodak)에 노출시켰다. 그 후, 동일한 필터를 항-포스포-TSC2 (Thr1462) 항체 (Cell Signaling Technologies, #3617)로 재-탐색했다.

도 28d는 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 Thr1462 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)에서 Thr1462에서 TCS2의 Gas6-유도 AKT 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.

실시예 18.5: 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 인 비트로에서 mTOR 의 리간드-유도 인산화를 억제한다.

TSC2 인산화에 대한 효과를 고려하여, 본 발명의 인간화 항체가 또한 mTOR의 Gas6-유도 활성화를 방해하는 능력을 갖는지 여부를 조사하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. Gas6-매개 mTOR 활성화는 Ser2448 위치에서의 증가된 인산화 수준에 의해 반영된다. 이 목적을 위해, 5　x　10⁶ Hs578T 유방암 세포 또는 3　x　10⁶ NCI-H292 폐암 세포를 1일 차에 10cm 배양 디쉬에 접종했다. 다음 날, 세포들을 밤새 24시간 동안 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 3일 차에, 세포를 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter), 키메라 항-Axl mAb chm11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6와 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션시키고, 그 후, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 800 ㎕로 용해시키고, 세포 파편을 10,000　x　g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거했다. 상층액의 단백질 농도를 결정하고, 50 ㎍의 전세포 용해물을 3 x SDS Laemmli 시료 완충액에 현탁시키고, 가열하고, SDS PAGE를 수행했다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 상기 막을 NET-Gelatine으로 블록킹시키고, 토끼 다중클론 항-포스포-mTOR (Ser2448) 일차 항체 (Cell Signaling Technologies, #2971)와 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, NET-Gelatine에 의한 3회 세척 후에, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-접합 항-토끼 이차 항체(Dianova, #111-036-045)와 인큐베이션시키고, 다시 NET-Gelatine으로 3회 세척했다. 제조사의 설명서(GE Healthcare)에 따라 화학발광 검출 키트를 적용하여, 필터를 최종적으로 필름(Kodak)에 노출시켰다. 그 후, 동일한 필터를 항-mTOR 키나아제 항체 (Cell Signaling Technologies, #2972)로 재-탐색했다.

도 28e는 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. 항-Axl 항체의 억제 효과는 Hs578T 유방암 세포에서 상대적으로 약했다(상단). 그러나, Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 mTOR Ser2448 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, NCI-H292 폐암 세포에서 Gas6-유도 mTOR 활성화를 방해할 수 있었다(하단).

실시예 18.6: 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 인 비트로에서 S6K1 의 리간드-유도 인산화를 억제한다

마지막으로, 본 발명의 인간화 항체가 S6K1의 Gas6-유도 인산화를 방해하는 능력을 갖는지 여부를 조사하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행했다. Gas6-매개 S6K1 활성화는 Thr421 및 Ser424 위치에서 증가된 인산화 수준에 의해 반영된다. 이 목적을 위해, 5　x　10⁶ Hs578T 유방암 세포 또는 3　x　10⁶ NCI-H292 폐암 세포를 1일 차에 10cm 배양 디쉬에 접종했다. 다음 날, 세포들을 밤새 24시간 동안 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 3일 차에, 세포를 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter), 키메라 항-Axl mAb chm11B7 및 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6와 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션시키고, 그 후, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 800 ㎕로 용해시키고, 세포 파편을 10,000　x　g 및 4℃에서 10분 동안 원심분리에 의해 제거했다. 상층액의 단백질 농도를 결정하고, 50 ㎍의 전세포 용해물을 3 x SDS Laemmli 시료 완충액에 현탁시키고, 가열하고, SDS PAGE를 수행했다. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮긴 후, 상기 막을 NET-Gelatine으로 블록킹시키고, 토끼 다중클론 항-포스포-p70 S6 키나아제 1 (Thr421/Ser424) 일차 항체(Cell Signaling Technologies, #9204)와 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 날, NET-Gelatine에 의한 3회 세척 후에, 상기 막을 실온에서 1시간 동안 HRP-접합 항-토끼 이차 항체(Dianova, #111-036-045)와 인큐베이션시키고, 다시 NET-Gelatine으로 3회 세척했다. 제조사의 설명서(GE Healthcare)에 따라 화학발광 검출 키트를 적용하여, 필터를 최종적으로 필름(Kodak)에 노출시켰다. 그 후, 동일한 필터를 항-β-액틴 항체 (Cell Signaling Technologies, #4967)로 재-탐색했다.

도 28f는 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 및 h#11B7-T6은 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 S6K1 Thr421/Ser424 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, Hs578T 유방암 세포에서 Gas6-유도 S6K1 활성화에 대한 어느 정도의 억제 효과를 보였다 (상단). 그러나, 키메라 항-Axl 항체 chm11B7 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, 또는 h#11B7-T6에 의한 예비-처리시 Gas6-유도 S6K1 Thr421/Ser424 인산화의 훨씬 더 강한 감소 및 따라서, 활성화를 NCI-H292 폐암 세포에서 관찰할 수 있었다 (하단).

실시예 19: 본 발명의 인간화 11 D5 항- AXL 항체는 ELISA 에 의해 결정된 바와 같이 인 비트로에서 리간드 -유도 Axl 인산화를 억제한다

인간화 h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5 및 h#11B7-T6 항-Axl mAb 시리즈의 특성 규명 외에, 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11D5-T2, h#11D5-T3, h#11D5-T4, h#11D5-T5, 및 h#11D5-T6가 수용체 티로신 키나아제 Axl의 Gas6-유도 인산화 및 따라서 활성화를 방해하는 능력을 조사하기 위해 ELISA 실험을 수행했다.

요약하면, 1일 차에, 웰 당 3 x 10⁴ Hs578T 유방암 세포를 편평-바닥 96 웰 플레이트 중의 정상 성장 배지에 접종했다. 다음 날, 세포를 24시간 동안 밤새 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 또한, 밤새, 블랙 Maxi-Sorp 96 웰 플레이트 (Nunc)를 4℃에서 2 ㎍/ml의 PBS 중 마우스 항-포스포-티로신 항체 4G10으로 코팅시켰다. 3일 차에, 4G10 항체 용액을 제거하고, Maxi-Sorp 웰을 실온에서 4시간 이상 동안 블록킹 완충액(PBS, 0.5% BSA)으로 블록킹시켰다. 동시에, 세포들을 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter), 키메라 항-AXL mAb #11D5 및 인간화 항-AXL 항체 h#11D5-T2, h#11D5-T3, h#11D5-T4, h#11D5-T5, 및 h#11D5-T6와 함께 37℃에서 3시간 동안 예비-인큐베이션하고, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 신속히 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 110 ㎕/웰에서 용해시켰다. 한편, 블록킹 완충액을 제거하고, Maxi-Sorp 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.05% Tween 20)으로 6회 세척하고, 각 웰의 용해물 100 ㎕를 옮기고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 4일 차에 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고, 웰을 실온에서 2시간 동안 희석 완충액 (20mM Tris, 50mM NaCl, pH7.3, 0.05% Tween 20, 0.1% BSA) 중 0.125 ㎍/ml의 비오티닐화 랫트 항-Axl 항체 12B7과 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고, 세척 완충액 중에 1:20000으로 희석시킨 AP-접합 스트렙타비딘 (Chemicon #SA110)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 웰을 세척 완충액으로 6회 세척하고, AttoPhos 기질 용액 (Roche #11681982)을 첨가했다. SpetraMax-GeminiEM 플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 이용하여, 각 웰의 형광을 430 nm의 여기 파장 및 580 nm의 발광 파장에서 수집했다.

도 29는 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 키메라 항-Axl 항체 chm11D5 및 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 h#11D5-T2, h#11D5-T3, h#11D5-T4, h#11D5-T5, 및 h#11D5-T6은 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 Axl 티로신 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, Gas6-매개 Axl 활성화를 차단하거나 또는 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.

실시예 20: 본 발명의 랫트 및 키메라 항- AXL 항체는 인 비트로에서 유사한 정도까지 리간드 -유도 Axl 인산화를 억제한다

본 발명의 일부로서, 랫트 항-AXL 항체 11B7 및 11D5의 키메라 유도체(derivative)를 제조했다(전술 참조). 본 발명의 랫트 항-AXL 항체 및 그의 상응하는 키메라 항-AXL 항체가 인 비트로에서 유사한 정도까지 리간드 Gas6 매개 Axl 활성화를 억제할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, CaSki 자궁경부암 세포에 대한 ELISA 실험을 수행했다. Gas6-매개 Axl 활성화는 증가된 수용체 티로신 인산화에 의해 검출하였다. 요약하면, 1일 차에, 웰당 3x10⁴ 세포를 편평-바닥 96 웰 플레이트 중의 정상 성장 배지에 접종했다. 다음 날, 세포를 24시간 동안 밤새 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 또한, 밤새, 블랙 Maxi-Sorp 96 웰 플레이트 (Nunc)를 4℃에서 2 ㎍(IJg)/ml의 PBS 중 마우스 항-포스포-티로신 항체 4G10으로 코팅시켰다. 3일 차에, 4G10 항체 용액을 제거하고, Maxi-Sorp 웰을 실온에서 4시간 이상 동안 PBS, 0.5% BSA로 블록킹시켰다. 동시에, 세포들을 50 ng/ml, 100 ng/ml, 300 ng/ml, 750 ng/ml, 1 ㎍/ml, 및 10 ㎍/ml의 랫트 항-Axl 항체 11B7 또는 키메라 항-Axl 항체 ch11B과 함께 37℃에서 1시간 동안 예비-인큐베이션하고, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 10분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 신속히 제거하고, 세포들을 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100)에서 용해시켰다. 한편, 블록킹 완충액을 제거하고, Maxi-Sorp 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.05% Tween 20)으로 6회 세척하고, 용해물을 옮기고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 4일 차에 상기 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척한 후, 웰을 실온에서 2시간 동안 0.5 ㎍/ml PBS 중 비오티닐화 랫트 항-AXL 항체 12B7과 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고, PBS 중에 1:4.000으로 희석한 AP-접합 스트렙타비딘 (Chemicon #SA110)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 웰을 세척 완충액으로 6회 세척하고, AttoPhos 기질 용액 (Roche #11681982)을 첨가했다. Victor 플레이트 판독기 (Perkin Elmer)를 이용하여, 각 웰의 형광을 430 nm의 여기 파장 및 580 nm의 발광 파장에서 수집했다.

도 31은 자궁경부암 세포주 CaSki에 대한 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. 상대적 Axl 인산화의 농도-의존적 감소에 의해 입증된 바와 같이, 본 발명의 랫트 항-Axl 항체 11B7 (A) 및 키메라 항-Axl 항체 ch11 B7 (B)는 유사한 정도까지 수용체 티로신 키나아제 Axl의 리간드-유도 활성화를 차단시킬 수 있었다. 동일한 실험 조건을 적용하여 유사한 효과를 흑색종 세포주 C-8161에서 관찰했다.

실시예 21: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간화 항체 유전자의 제조

a) h#11B7-T15L 및 h#11B7-T18L, 경쇄 발현 벡터의 작제

분비 신호가 융합된, 각각 서열목록의 서열번호 146 또는 147의 21번 내지 129번 아미노산에 의해 표시된 #11B7-T15L 또는 h#11B7-T18L 경쇄 가변 영역(도 32a)을 코딩하는 유전자를 포함하는 각 DNA를 합성하고 (MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Artificial Gene Synthesis Service) 제한효소 NheI 및 BsiWI으로 처리했다. 결과적으로 수득된 DNA 단편을 미리 제한효소 NheI 및 BsiWI로 처리한 인간화 항체 경쇄 발현을 위한 범용 벡터(pEF6KCL)의 부위에 각각 삽입하여, 그에 의해 h#11B7-T15L 및 h#11B7-T18L 경쇄 발현 벡터를 작제했다. 수득된 발현 벡터를 "pEF6KCL/h#11B7-T15L" 또는 "pEF6KCL/h#11B7-T18L"로 표기하고, 각 발현 벡터의 삽입물은 각각 서열목록의 서열번호 144 또는 145의 뉴클레오티드 서열로 표시된다.

b) h#11B7-T11H 및 h#11B7-T12H 중쇄 발현 벡터의 작제

분비 신호가 융합된, 각각 서열목록의 서열번호 150 또는 151의 20번 내지 132번 아미노산에 의해 표시된 h#11B7-T11H 또는 h#11B7-T12H 중쇄 가변 영역 (도 32b)을 코딩하는 유전자를 포함하는 각 DNA를 합성하고 (MBL Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Artificial Gene Synthesis Service) 제한효소 BlpI으로 처리했다. 결과적으로 수득된 DNA 단편을 미리 제한효소 BlpI으로 처리한 인간화 항체 중쇄 발현을 위한 범용 벡터(pEF1/FCCU-1)의 부위에 각각 삽입하여, 그에 의해 h#11B7-T11H 및 h#11B7-T12H 중쇄 발현 벡터를 작제했다. 수득된 발현 벡터를 "pEF1/FCCU/h#11B7-T11H" 또는 "pEF1/FCCU/h#11B7-T12H"로 표기하고, 각 발현 벡터의 삽입물은 각각 서열목록의 서열번호 148 또는 149의 뉴클레오티드 서열로 표시된다.

실시예 22: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 제조

a) 인간화 항체의 제조

실시예 10의 a)를 참조한다.

b) 인간화 항체의 정제

전술된 문단 a)에서 수득된 배양 상층액을 단백질 A 친화도 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제했다. 100 mL의 배양 상층액을 캡이 있는 500-mL 플라스크에 넣고, 뒤이어 PBS로 평형화시킨 MabSelect SuRe (GE Healthcare Bio-science Ltd.) 현탁액 (50% 슬러리) 1 mL를 첨가했다. 수득된 혼합물을 10℃에서 인큐베이터에서 100 rpm으로 밤새 교반시켰다. FreeStyle 293-F 세포 배양액 상층액/MabSelect SuRe 현탁액을 5 mL의 Zeba Spin Column, empty (PIERCE)에 적용했다. 전체 수지를 상기 컬럼에 넣고 10 mL의 1M NaCl로 세척했다. 그 후, 1 mL의 1 M 아르기닌 용액 (pH 4.0)을 적용하여, 항체-함유 분획을 수집했다. 수집된 분획을 Centrifugal Filter Device (Amicon Ultra-4, molecular weight cut off: 50 K, Millipore Corp.)에 첨가하고, 뒤이어 시트레이트 완충액에 의한 용액 대체 및 농축을 수행하여, 200 ㎕로 조정하여, 정제된 시료를 제조했다.

pEF6KCL/h#11B7-T15L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T11H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T28"로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T18L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T11H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T29"로 표기하며; pEF6KCL/h#11B7-T15L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T12H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T30"으로 표기하고; pEF6KCL/h#11B7-T18L과 pEF1/FCCU/h#11B7-T12H의 조합에 의해 수득된 인간화 항체 #11B7을 "h#11B7-T31"로 표기한다.

h#11B7	H 플라스미드	L 플라스미드
h#11B7-T28	pEF1/FCCU/h#11B7-T11H	pEF6KCL/h#11B7-T15L
h#11B7-T29	pEF1/FCCU/h#11B7-T11H	pEF6KCL/h#11B7-T18L
h#11B7-T30	pEF1/FCCU/h#11B7-T12H	pEF6KCL/h#11B7-T15L
h#11B7-T31	pEF1/FCCU/h#11B7-T12H	pEF6KCL/h#11B7-T18L

실시예 23: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간화 항체의 인간 AXL-Fc 융합 단백질에 대한 친화도의 평가

랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7로부터 유래된 인간화 항체 h#11B7-T28 내지 h#11B7-T31을 하기에 기재된 방법에 의해 인간 AXL-Fc에 대한 친화도에 대해 평가했다. 인간 AXL-Fc (R&D Systems에 의해 제조됨, #154-AL)를 PBS로 1㎍/ml까지 희석시켰다. 그 후, 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 Immuno Plate (Nalge Nunc International K.K.에 의해 제조됨, #437111)에 분배하고 4℃에서 밤새 방치하여 단백질을 플레이트에 흡착시켰다. 다음 날, 웰을 PBS-T 용액 (PBS 및 0.05% (v/v) Tween 20)으로 5회 세척했다. 그 후, PBS로 5% 까지 희석시킨, 탈지 우유(Morinaga Milk Industry Co.에 의해 제조됨, Ltd.)를 포함하는 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 분배하고 실온에서 2시간 동안 방치했다. 웰 중의 용액을 제거하고, 웰을 PBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후, 실시예 10에서 제조된 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 정제된 인간화 항체 T28 내지 T31을 각각 0.5% 탈지 우유를 포함하는 PBS 용액으로 1 ㎍/ml 내지 0.00256 ng/ml (5-배 희석 시리즈)의 최종 농도로 희석했다. 그 후, 용액을 100 ㎕/웰의 양으로 분배하고 실온에서 2시간 동안 방치했다. 이 절차에서, 각 항체 농도를 실시예 15에 따라 결정했다. 웰을 PBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후, TBS-T 용액 (TBS 및 0.05% (v/v) Tween 20)으로 2500배 희석시킨 알칼리 포스파타아제-접합 AffiniPure Goat Anti-Human IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.에 의해 제조됨, #109-055-097)를 100 ㎕/웰의 양으로 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 방치했다. 웰 중의 용액을 제거하고, 상기 웰을 TBS-T 용액으로 5회 세척했다. 그 후 형광 기질 용액(Roche Diagnostics K.K. 제조, #11681982001)을 100 ㎕/웰의 양으로 첨가하여, 형광 반응을 수행했다. 인간 AXL-Fc-흡착 플레이트 상에서 형광 강도를 SpectraMax M5 (Molecular Devices Corp.에 의해 제조됨)를 이용하여 형광 기질 용액의 첨가 15분 후 측정했다. 그 결과, 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7-T28 내지 h#11B7-T31의 인간화 항체는 항체 농도-의존적 방식으로 인간 AXL-Fc 단백질에 대해 인간 키메라 항체와 거의 동일한 결합 활성을 갖는 것으로 확인하였다(도 19 및 33).

실시예 24: 랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7의 인간화 항체의 HPLC 분석법

랫트 항-인간 AXL 단일클론 항체 #11B7로부터 유래된 인간화 항체 h#11B7-T28 내지 h#11B7-T31의 단백질 농도를 하기에 기재된 프로토콜에 의해 결정했다. 각각의 인간화 항체 시료를 크기 배제 컬럼 (Tosoh SW3000XL)에 주입하고, 단백질 농도를 IgG1-타입 인간화 항-인간 DR5 단일클론 항체, 티가투주마브(tigatuzumab)의 시료를 표준으로 이용하여, 각 항체의 결과적으로 수득된 HPLC (Agilent 1200 SL) 피크 면적 및 흡광 계수(absorption coefficient)에 의해 결정했다. 티가투주마브 항체 표준 시료의 농도는 실시예 15에 기재된 직접적인 흡광 프로토콜에 의해 결정했다. 결과가 도 34에 요약된다.

실시예 25: 시차주사열량계( DSC )를 이용한 인간화 항체의 열 안정성의 측정

항체 특성을 비교하는 지표의 일 예는 항체 안정성을 포함할 수 있다. 항체 안정성에 대한 지표의 예는 열 안정성을 포함할 수 있다.

낮은 열 변성 중심점(thermal denaturation midpoint, Tm)을 갖는 항체는 변성될 가능성이 높다. 변성된 항체는 응집되는 경향이 있고 또한 증가된 항원성(antigenicity)을 갖는 것으로 사료된다. 대조적으로, 높은 Tm을 갖는 항체는 변성(풀림(unfold))되거나 또는 불활성화되는 성향이 더 낮고 장시간 동안 안정적으로 보관될 수 있는 용액 제제로 제조될 수 있다.

시차주사열량계 (DSC)는 단백질의 상대적 구조 안정성에 대한 우수한 지표로 작용하는, Tm을 신속하고 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. Tm 값은 DSC를 이용하여 측정될 수 있고, 이 측정값들을 비교하여 그들 간의 열안정성의 차이를 결정할 수 있다.

h#11B7-T1, h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, h#11B7-T6, h#11B7-T7, h#11B7-T8, h#11B7-T9, h#11B7-T10, h#11B7-T11, h#11B7-T12, h#11B7-T13, h#11B7-T14, h#11B7-T15, h#11B7-T16, h#11B7-T17, h#11B7-T18, #11B7-T19, h#11B7-T20, h#11B7-T21, h#11B7-T22, h#11B7-T23, h#11B7-T24, h#11B7-T25, h#11B7-T26, h#11B7-T27, h#11B7-T28, h#11B7-T29, h#11B7-T30, h#11B7-T31, 및 키메라 11B7의 열 안정성을 측정했다. 이 시료들을 각각 0.5 mg/mL (CBS 용액)의 농도까지 조정하고, 그의 400 ㎕ 분량을 DSC 측정에서 시료 용액으로 이용했다. DSC 측정 조건을 하기와 같이 설정했다: 초기 온도: 20℃, 최종 온도: 100℃, 및 온도 상승의 속도: 60℃/1 시간, 및 여과 시간: 10 초. CBS를 기준 용액(reference solution)으로 이용했다. MicroCal Inc., US에 의해 제조된 VP-Capillary DSC Platform을 DSC 측정 장치로 이용했다. 시료 용액으로부터 수득된 스캔 곡선으로부터 기준선(기준 용액을 시료 셀에 충진하는 것에 의해 수득된 스캔 곡선)을 차감하는 것에 의해 기준선 보정(baseline correction)을 수행했다.

도 35a는 h#11B7-T1의 온도기록도(thermogram)를 보여주고; 도 35b는 h#11B7-T2의 온도기록도를 보여주며; 도 35c는 h#11B7-T3의 온도기록도를 보여주고; 도 35d는 h#11B7-T4의 온도기록도를 보여주며; 도 35e는 h#11B7-T5의 온도기록도를 보여주고; 도 35f는은 h#11B7-T6의 온도기록도를 보여주며; 도 35g는 h#11B7-T7의 온도기록도를 보여주고; 도 35h는 h#11B7-T8의 온도기록도를 보여주며; 도 35i는 h#11B7-T9의 온도기록도를 보여주고; 도 35j는 h#11B7-T10의 온도기록도를 보여주며; 도 35k는 h#11B7-T11의 온도기록도를 보여주고; 도 35l은 h#11B7-T12의 온도기록도를 보여주며; 도 35m은 h#11B7-T13의 온도기록도를 보여주고; 도 35n은 h#11B7-T14의 온도기록도를 보여주며; 도 35o는 h#11B7-T15의 온도기록도를 보여주고; 도 35p는 h#11B7-T16의 온도기록도를 보여주며; 도 35q는 h#11B7-T17의 온도기록도를 보여주고; 도 35r은 h#11B7-T18의 온도기록도를 보여주며; 도 35s는 h#11B7-T19의 온도기록도를 보여주고; 도 35t는 h#11B7-T20의 온도기록도를 보여주며; 도 35u는 h#11B7-T21의 온도기록도를 보여주고; 도 35v는 h#11B7-T22의 온도기록도를 보여주며; 도 35w는 h#11B7-T23의 온도기록도를 보여주고; 도 35x는 h#11B7-T24의 온도기록도를 보여주며; 도 35y는 h#11B7-T25의 온도기록도를 보여주고; 도 35z는 h#11B7-T26의 온도기록도를 보여주며; 도 35aa는 h#11B7-T27의 온도기록도를 보여주고; 도 35bb는 h#11B7-T28의 온도기록도를 보여주며; 도 35cc는 h#11B7-T29의 온도기록도를 보여주고; 도 35dd는 h#11B7-T30의 온도기록도를 보여주며; 도 35ee는 h#11B7-T31의 온도기록도를 보여주고; 및 도 35ff는 키메라 h#11B7의 온도기록도를 보여준다.

이 상황에서, 전체 온도기록도(thermogram)에서 피크 정상(peak top)의 값은 Fab 영역의 열변성 중심점(midpoint) Tm으로 정의된다. 측정 결과, h#11B7-T1은 71.6℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T2은 77.2℃℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T3은 73.0℃℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T4는 70.2℃℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T5는 73.1℃℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T6은 79.0℃℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T7은 76.5℃℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T8은 83.5℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T9는 82.5℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T10은 77.4℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T11은 83.5℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T12는 76.6℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T13은 77.6℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T14는 75.8℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T15는 83.1℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T16은 82.2℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T17은 76.6℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T18은 83.0℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T19는 75.9℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T20은 76.9℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T21은 76.6℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T22는 83.6℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T23은 83.0℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T24는 77.6℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T25는 83.9℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T26은 76.9℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T27은 77.9℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T28은 77.4℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T29는 77.4℃의 Tm을 가지며; h#11B7-T30은 77.8℃의 Tm을 갖고; h#11B7-T31은 77.9℃℃의 Tm을 가지며; 및 키메라 h#11B7은 73.1℃의 Tm을 가졌다.

실시예 26. 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 ELISA 에 의해 결정된 바와 같이 리간드 -유도 Axl 인산화를 억제한다

증식 정지 특이적 유전자(growth arrest specific gene) 6, Gas6에 의해 코딩된 단백질은 수용체 티로신 키나아제 AXL의 천연 리간드이다. Gas6의 AXL로의 결합은 증가된 수용체 티로신 키나아제 인산화 수준으로 반영되는, 수용체 활성화를 초래한다. 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5와 11B7-T6, 및 11B7-T6 유도체 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25가 수용체 티로신 키나아제 AXL의 Gas6-유도 인산화 및 따라서 활성화를 방해하는 능력을 조사하기 위해 ELISA 실험을 수행했다.

요약하면, 1일 차에, 웰 당 3 x 10⁴ 세포를 편평-바닥 96 웰 플레이트 중의 정상 성장 배지에 접종했다. 다음 날, 세포를 24시간 동안 밤새 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 또한, 밤새, 블랙 Maxi-Sorp 96 웰 플레이트 (Nunc)를 4℃에서 2 ㎍/ml의 PBS 중 마우스 항-포스포-티로신 항체 4G10으로 코팅시켰다. 3일 차에, 4G10 항체 용액을 제거하고, Maxi-Sorp 웰을 실온에서 4시간 이상 동안 블록킹 완충액(PBS, 0.5% BSA)으로 블록킹시켰다. 동시에, 세포들을 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter) 및 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25와 함께 37℃에서 1시간 동안 예비-인큐베이션하고, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 그 후, 배지를 신속히 제거하고, 얼음 상에서 30분 동안, 포스파타아제 및 프로테아제 억제제 (10 mM Na₄P₂O₇, 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드, 1 mM 오르토바나데이트, 1 mM NaF, 및 0,5% 아프로티닌)가 보충된 용해 완충액 (50 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10% 글리세린, 및 1% Triton X-100) 110 ㎕/웰 에서 용해시켰다. 한편, 블록킹 완충액을 제거하고, Maxi-Sorp 플레이트를 세척 완충액(PBS, 0.05% Tween 20)으로 6회 세척하고, 100 ㎕ 용해물을 옮기고 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 4일 차에 상기 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척한 후, 웰을 실온에서 2시간 동안 0.125 ㎍/ml 희석 완충액(20mM Tris, 50mM NaCl, pH7.3, 0.05% Tween 20, 0.1% BSA) 중 비오티닐화 랫트 항-AXL 항체 12B7과 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 6회 세척하고, 세척 완충액 중에 1:20000으로 희석된 AP-접합 스트렙타비딘 (Chemicon #SA110)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 웰을 세척 완충액으로 6회 세척하고, AttoPhos 기질 용액 (Roche #11681982)을 첨가했다. SpetraMax-GeminiEM 플레이트 판독기 (Molecular Devices)를 이용하여, 각 웰의 형광을 430 nm의 여기 파장 및 580 nm의 발광 파장에서 수집했다.

도 37은 Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)에 대한 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25는 상응하는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 Axl 티로신 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, 두 세포주 모두에서 Gas6-매개 Axl 활성화를 유의성 있게 감소시킬 수 있었다.

실시예 27. 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 ELISA 에 의해 결정된 바와 같이 인 비트로에서 리간드 -유도 Akt 인산화를 억제한다

또한, 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5와 11B7-T6, 및 11B7-T6 유도체 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25가 Akt-키나아제의 Gas6-매개 활성화를 차단할 수 있는지 여부를 조사하기 위해 ELISA 실험을 수행했다. Gas6-매개 Akt-키나아제 활성화는 증가된 단백질(Ser473) 인산화에 의해 검출했다.

요약하면, 1일 차에, 웰 당 2x10⁴ 세포를 편평-바닥 96 웰 플레이트 중의 정상 성장 배지에 접종했다. 다음 날, 세포를 36시간 동안 밤새 굶기기 위해, 성장 배지를 무혈청 배지로 교체했다. 그 후, 세포들을 미처리 상태로 유지하거나, 또는 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter) 및 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25와 37℃에서 1시간 동안 예비-인큐베이션시키고, 400 ng/ml Gas6 (R&D Systems)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15분 동안 처리했다. 배지를 신속히 제거하고, 세포들을 실온에서 30분 동안 PBS(pH 7.5) 중 4% 포름알데히드로 고정시켰다. 포름알데히드 용액을 제거하고 세포들을 세척 완충액 (PBS, 0.1% Tween 20)으로 2회 세척했다. 세포들을 세척 완충액 중 1% H₂O₂, 0.1% NaN₃로 퀀칭시키고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 그 후, 퀀칭(quenching) 용액을 제거하고, 세포들을 세척 완충액으로 2회 세척하고, 실온에서 4시간 동안 PBS, 0.5% BSA로 블록킹시켰다. PBS, 0.5% BSA, 5 mM EDTA 중에 1:500으로 희석시킨 항-포스포-Akt (Ser473) 일차 항체 (다중클론 토끼; Cell Signaling #9271)를 밤새 4℃에서 첨가했다. 4일 차에, 항체 용액을 제거하고, 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척했다. PBS, 0.5% BSA 중에 1:2500으로 희석시킨 HRP-접합 항-토끼 이차 항체(Dianova #111-036-045)를 각 웰에 첨가하고 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션시켰다. 상기 플레이트를 세척 완충액으로 5분씩 3회 및 PBS로 5분씩 2회 세척했다. 테트라메틸벤지딘 (TMB, Calbiochem)을 첨가하고 620 nm에서 모니터링했다. 100 ㎕의 250 nM HCl의 첨가에 의해 반응을 중단시키고 Vmax 플레이트 판독기 (Thermo Lab Systems)를 이용하여, 620 nm의 기준 파장(reference wavelength)으로 450 nm에서 흡광도를 판독했다.

도 38은 Hs578T 유방암 세포 (상단) 및 NCI-H292 폐암 세포 (하단)에 대한 이 실험의 대표적 결과를 보여준다. Gammagard 대조군 항체 대비, 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25는 Gas6-미처리 세포 대비 Gas6-처리 세포에서 감소된 Akt (Ser473) 인산화 수준에 의해 표시된 바와 같이, 두 세포주 모두에서 Gas6-매개 Akt-키나아제 활성화를 차단하거나 또는 감소시킬 수 있었다.

실시예 28: 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 Axl 수용체 내재화를 억제한다

Axl은 전술된 Akt 경로를 포함한, Axl-매개 신호 전달 경로를 통해 종양 세포의 이동 및 생존에 영향을 미칠 수 있는 인자로 확인되었다. 따라서, Axl이 수용체 내재화(receptor internalization)에 의해 세포 표면/막으로부터 효과적으로 제거되는 경우, 세포 신호전달 및 따라서, 세포의 유지 및 종양 증식 및 전이가 궁극적으로 경감되거나 또는 억제될 수 있다.

본 발명의 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5와 11B7-T6 및 11B7-T6 유도체 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25가 Axl의 가속화된 엔도사이토시스(endocytosis)를 유도하는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명의 인간화 항-AXL 항체와 세포의 2시간, 4시간, 6시간 및 20시간 인큐베이션 후, 세포 표면 상의 Axl 분자의 상대적 양을 비교했다.

요약하면, 1일 차에, 2x10⁵ 세포들을 6-웰 디쉬 중의 정상 성장 배지에 접종하고, 밤새 증식시켰다. 다음 날, 배지를 제거하고, 세포들을 무혈청 배지로 세척했다. 그 후, 세포들을 미처리 상태로 유지하거나, 또는 10 mM HEPES가 보충된 무혈청 배지에서 10 ㎍/ml의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter) 및 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25와 4℃에서 40분 동안 인큐베이션시켰다. 뒤이어, 세포들을 내재화가 일어날 수 있게 하기 위해 표시된 시간 동안 37℃로 옮겼다. 그 후, 세포들을 10 mM EDTA로 탈착(detach)시키고, 100 ㎕의 세척 완충액 (PBS, 3% FCS)에 재-현탁시켰다. 후속 고정을 위해, 세포들을 강하게 진탕시키면서, PBS 중의 2% 파라포름알데히드 100 ㎕를 점적하였다. 실온에서 20분간 인큐베이션시킨 후에, 세포들을 세척하고, 모든 시료가 수집될 때까지 냉장고에서 보관하기 위해 100 ㎕의 세척 완충액에 재-현탁시켰다. 최종적으로 세포를 Axl 발현 수준에 대해 염색시키기 위해, 시료를 둥근-바닥(round-bottom) 96-웰 플레이트로 옮기고 세척 완충액 중 3 ㎍/ml 랫트 항-Axl mAb 2A1와 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포들을 세척 완충액으로 2회 세척하고, 1:100으로 희석시킨 당나귀-항-랫트 IgG-PE 이차 항체(Dianova)와 4℃에서 60분 동안 인큐베이션시키고, 다시 세척 완충액으로 2회 세척하고, FACS (Beckman Coulter EPICS, EXPO32)에 의해 분석했다.

도 38의 대표적 결과는 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25에 의한 Hs578T 유방암 세포의 처리는 Axl 수용체의 내재화를 초래하나, Gammagard 대조군 항체는 어떠한 효과도 갖지 않았다는 것을 보여준다. 개별적인 처리 기간의 미처리 시료 대비 항-Axl mAb 처리 시료의 평균 형광 강도로 정의된 상대적 Axl 발현 수준(%)이 도시된다.

실시예 29. 본 발명의 인간화 11B7 항- AXL 항체는 인 비트로에서 스페로이드 -기반 세포 혈관형성을 억제한다

Axl은 인 비트로에서 내피 세포 이동, 증식 및 관 형성(tube formation)을 포함한, 다수의 혈관형성 거동의 핵심 조절자이다 (Holland et al., Cancer Res: 65, 9294-9303, 2005). 따라서, 본 발명의 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5 및 11B7-T6 및 11B7-T6 유도체, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25를 HUVEC-스페로이드의 Gas6-유도 혈관 발아(sprouting)에 대한 억제 효과에 대해 테스트했다. 상기 실험을 최초에 공개된 프로토콜의 변형으로 수행했다 (Korff and Augustin: J Cell Sci 112: 3249-58, 1999).

요약하면, 플라스틱 디쉬 상에서 밤새 스페로이드 응집이 일어날 수 있도록 현적(hanging drop) 중 VEGF-A [25 ng/ml]와 조합된 500개의 인간 제대 정맥 내피 세포(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)를 피펫팅하여 앞서 개시된 바와 같이 (Korff and Augustin: J Cell Biol 143: 1341-52, 1998) 스페로이드를 제조했다. 그 후, 50개의 HUVEC 스페로이드를 0.9 ml의 콜라겐 용액 (2 mg/ml)에 현탁시키고, 24 웰 프레이트의 개별적인 웰에 피펫팅하여 중합이 진행될 수 있게 했다. 30분 후에, 인간 GAS6 (R&D Systems)와 함께, 감소하는 농도의 Gammagard 대조군 항체 (Baxter) 또는 인간화 항-AXL 항체 11B7-T5, 11B7-T6, 11B7-T11, 11B7-T23, 및 11B7-T25 (1x10^-6 M, 3x10^-7 M, 1x10^-7 M, 3x10^-8 M, 1x10^-8 M, 3x10^-9 M, 1x10^-10 M)를 폴리아크릴아미드 겔의 상단에 피펫팅에 10-배 농도 희석액(10-fold concentrated working dilution) 100 ㎕를 의해 첨가했다(최종 인간 GAS6 농도 1 ㎍/ml). 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션시키고, 4% Roti-Histofix (Roth, Karlsruhe, Germany)를 첨가하여 고정시켰다. HUVEC 스페로이드의 발아 강도(sprouting intensity)를 도립 현미경 및 디지탈 이미징 소프트웨어Analysis 3.2 (Soft imaging system, Munster, Germany)를 이용하여 스페로이드당 누적 발아 길이를 결정하는 이미지 분석 시스템에 의해 정량했다. 10개의 랜덤하게 선택된 스페로이드의 누적 발아 길이의 평균을 개별 데이터 포인트로 분석하였다.

도 39는 이 실험의 대표적인 결과를 보여준다.

SEQUENCE LISTING <110> U3 Pharma GmbH <120> Humanized AXL antibodies <130> 45430P WO <160> 169 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer EFF1 <400> 1 ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagc 28 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer EFsmaR <400> 2 aaacccggga gctttttgca aaagcctagg 30 <210> 3 <211> 1704 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ggtaccaccc aagctggcta ggtaagcttg ctagcgccac catggtgctg cagacccagg 60 tgttcatctc cctgctgctg tggatctccg gcgcatatgg cgatatcgtg atgattaaac 120 gtacggtggc cgccccctcc gtgttcatct tccccccctc cgacgagcag ctgaagtccg 180 gcaccgcctc cgtggtgtgc ctgctgaata acttctaccc cagagaggcc aaggtgcagt 240 ggaaggtgga caacgccctg cagtccggga actcccagga gagcgtgacc gagcaggaca 300 gcaaggacag cacctacagc ctgagcagca ccctgaccct gagcaaagcc gactacgaga 360 agcacaaggt gtacgcctgc gaggtgaccc accagggcct gagctccccc gtcaccaaga 420 gcttcaacag gggggagtgt taggggcccg tttaaacggg tggcatccct gtgacccctc 480 cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat 540 aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag 600 gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta 660 ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg 720 ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac 780 caggctcacc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct 840 ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt 900 acaggcgtga accactgctc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 960 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 1020 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 1080 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 1140 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 1200 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 1260 cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 1320 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1380 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1440 agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1500 tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 1560 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1620 cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1680 aggcttttgc aaaaagctcc cggg 1704 <210> 4 <211> 1120 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg 60 ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg gttagctcag cctccaccaa gggcccaagc 120 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctggcg gcacagccgc cctgggctgc 180 ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg accgtgagct ggaactcagg cgccctgacc 240 agcggcgtgc acaccttccc cgctgtcctg cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 300 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 360 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 420 acatgcccac cctgcccagc acctgaactc ctggggggac cctcagtctt cctcttcccc 480 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 540 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 600 cataatgcca agacaaagcc ccgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 660 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 720 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg ccagccccgg 780 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 840 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 900 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 960 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcagggcaa cgtcttctca 1020 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacaccc agaagagcct ctccctgtct 1080 cccggcaaat gagatatcgg gcccgtttaa acgggtggca 1120 <210> 5 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T1L light chain (DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> signal sequence <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 5 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggtacca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgct gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaaccggatc tggcaccgac ttcaccttca ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggcgga 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 6 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T2L light chain (DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> signal sequence 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gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 9 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T5L light chain (DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> signal sequence <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 9 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 10 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T6L light chain (DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> signal sequence <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 10 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 11 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T7L light chain (DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> signal sequence <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 11 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggtacca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 12 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T8L light chain (DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> signal sequence <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 12 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgct gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 13 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T9L light chain (DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> signal sequence <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 13 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac ttcaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 14 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T10L light chain (DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) <223> signal sequence <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 14 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggtacca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgct gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg 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tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc 1200 cagcccgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacccaga agagcctctc cctgtctccc 1380 ggcaaa 1386 <210> 150 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T11H heavy chain <220> <221> SIGNAL <222> 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Ala Val Leu Gln Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 151 <211> 462 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> h#11B7-T12H heavy chain <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <220> <221> SITE <222> (20)..(132) <223> variable region <220> <221> SITE <222> (133)..(462) <223> constant region <400> 151 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30 Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile 35 40 45 Thr Ser Asn Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Ile Thr Thr Phe Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 115 120 125 Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220 Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 260 265 270 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 340 345 350 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer kappa_GSP1 <400> 152 gatggatgca ttggtgcagc 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer new_kappa_GSP1 <400> 153 atagatacag ttggtgcagc 20 <210> 154 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer heavy_GSP1 <400> 154 cagggtcacc atggagtta 19 <210> 155 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer Xhol-hGSP2 <400> 155 ccgctcgagc gggccagtgg atagacagat gg 32 <210> 156 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer Xhol-kGSP2 <400> 156 ccgctcgagc ggccgtttca gctccagctt gg 32 <210> 157 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer RT-gamma <400> 157 gcgtgtagtg gttgtgcaga g 21 <210> 158 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer RT-gamma2 <400> 158 gggcttgccg gccgtg 16 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer RT-kappa <400> 159 tggaactgag gagcaggtgg 20 <210> 160 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 5'Blp <400> 160 agataagctt tgctcagcgt ccaccaaggg cccatcggt 39 <210> 161 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 3'Bam(GAG) <400> 161 agatggatcc tcatttaccc ggagacaggg agag 34 <210> 162 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 5'Bsi <400> 162 agataagctt cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcat 39 <210> 163 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer 3'Bam (CTT) <400> 163 agatggatcc ctaacactct cccctgttga agctct 36 <210> 164 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VL-11B7-5' <400> 164 agataagctt gtgcattccg acatccagat gacccaggct cc 42 <210> 165 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VL-11B7-3' <400> 165 agatcgtacg tttcagctcc agcttggtgc ctc 33 <210> 166 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VL-11D5-5' <400> 166 agataagctt gtgcattccg acatccagat gacccagtct ccatc 45 <210> 167 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VL-11D5-3' <400> 167 agatcgtacg tttcagcttg gtcccag 27 <210> 168 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VH-11b7/11D5-5' <400> 168 agataagctt gtgcattccg aggtgcagct tcaggagtca gg 42 <210> 169 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Primer VH-11B7/11D5-3' <400> 169 agatgctgag ctgacagtga ccatgactcc ttggcc 36

Claims

AXL의 세포외 도메인에 결합하고, 적어도 부분적으로 AXL 활성을 억제하는 단일클론 인간화 항체.
제1항에 있어서, AXL-매개 신호 전달(signal transduction), AXL 인산화, 세포 증식, 혈관형성, 세포 이동, 종양 전이 및/또는 AXL 매개 항-아폽토시스를 감소시키고 및/또는 차단하는 것인 단일클론 인간화 항체.
제1항 또는 제2항에 있어서, ERK1/2, AKT, GSK-3β, TSC2, mTOR 및/또는 S6K1과 같은 AXL 하류 신호전달(downstream signaling) 분자의 리간드 유도 인산화를 감소시키고 및/또는 차단하는 것인 단일클론 인간화 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항-AXL 항체 11B7 (서열번호 135, 136) 또는 11D5 (서열번호 137, 138) 중 하나로부터 유래되고, 11B7 또는 11D5의 하나 이상의 가변 도메인의 프레임워크 영역 중에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 것인 단일클론 인간화 항체.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
서열번호 40 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
서열번호 80 내지 서열번호 82로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는
서열번호 18 내지 서열번호 30으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
서열번호 73 내지 서열번호 79로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
상기 AXL의 세포외 도메인 상의 동일한 에피토프를 인식하는 그의 단편을 포함하는 것인 단일클론 인간화 항체.
제5항에 있어서, h#11B7-T1, h#11B7-T2, h#11B7-T3, h#11B7-T4, h#11B7-T5, h#11B7-T6, h#11B7-T7, h#11B7-T8, h#11B7-T9, h#11B7-T10, h#11B7-T11, h#11B7-T12, h#11B7-T13, h#11B7-T14, h#11B7-T15, h#11B7-T16, h#11B7-T17, h#11B7-T18, h#11B7-T19, h#11B7-T20, h#11B7-T21, h#11B7-T22, h#11B7-T23, h#11B7-T24, h#11B7-T25, h#11B7-T26, h#11B7-T27 또는 h#11B7-T28로 구성된 군으로부터 선택된 인간화 h#11B7 항체의 군으로부터 선택되는 것인 단일클론 인간화 항체.
제1항 내지 제4항에 있어서,
서열번호 67 내지 서열번호 72로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
서열번호 114 내지 서열번호 120으로 구성된 군으로부터 선택된 중쇄 아미노산 서열의 가변 도메인 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 및/또는
서열번호 55 내지 서열번호 60으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열, 또는 적어도 그의 가변 도메인, 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
서열번호 83 내지 서열번호 113으로 구성된 군으로부터 선택된 경쇄 아미노산 서열의 가변 도메인 또는 그에 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열, 또는
상기 AXL의 세포외 도메인 상의 동일한 에피토프를 인식하는 그의 단편을 포함하는 것인 단일클론 인간화 항체.
제7항에 있어서, h#11D5-T1, h#11D5-T2, h#11D5-T3, h#11D5-T4, h#11D5-T5 또는 h#11D5-T6으로 구성된 군으로부터 선택된 인간화 h#11D5 항체의 군으로부터 선택되는 것인 단일클론 인간화 항체.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 표지화 기(labelling group)에 결합된 것인 단일클론 인간화 항체.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 효과인자-기(effector-group)에 결합된 것인 단일클론 인간화 항체.
하기로 구성된 군으로부터 선택된 단리된 핵산 분자:
(a) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단일클론 항체, 그의 항체 단편, 또는 그의 유도체를 코딩하는 핵산 서열,
(b) 서열번호 5 내지 서열번호 17, 서열번호 31 내지 서열번호 39, 서열번호 49 내지 서열번호 54 및 서열번호 61 내지 서열번호 66으로 구성된 군으로부터 선택된 서열번호 중 하나로 표시된 핵산 서열,
(c) 서열번호 18 내지 서열번호 30, 서열번호 40 내지 서열번호 48, 서열번호 55 내지 서열번호 60, 서열번호 66 내지 서열번호 73, 서열번호 73 내지 서열번호 120 및 서열번호 121 내지 서열번호 132로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열,
(d) (a) 내지 (c)의 서열 중 하나에 상보적인 핵산, 또는
(e) 엄격한(stringent) 조건 하에 (a), (b), (c) 또는 (d)에 혼성화할 수 있고, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열로서, 상기 폴리펩티드를 포함하는 항체 또는 그의 기능성 단편은 AXL의 세포외 도메인에 결합하는 것인 핵산 서열.
제11항의 핵산 서열을 포함하는 벡터.
제12항에 있어서, 상기 벡터는 발현 벡터이고, 상기 핵산 서열은 제어 서열(control sequence)에 작동가능하게 연결된 것인 벡터.
제12항 또는 제13항의 벡터를 포함하는 숙주.
제14항에 있어서, 상기 숙주는 인간, 박테리아, 동물, 진균, 양서류 또는 식물 세포인 것인 숙주.
제14항에 있어서, 인간을 제외한 형질전환 동물인 것인 숙주.
제14항, 제15항, 또는 제16항의 숙주로부터 폴리펩티드를 수득하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 인간화 항체를 제조하는 방법.
인간화 항-AXL 항체, 바람직하게는 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단일클론 인간화 항체, 제11항의 핵산 분자, 제12항 또는 제13항의 벡터, 제14항, 제15항, 또는 제16항의 숙주, 또는 제17항의 방법에 의해 생성된 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물.
제18항에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 및/또는 아쥬반트를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제18항 또는 제19항에 있어서, 추가적인 활성제를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 질환의 진단, 예방, 또는 치료를 위한 것인 약제학적 조성물.
제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 과다증식성 질환은 AXL 발현, 과다발현 및/또는 과다활성과 연관된 것인 약제학적 조성물.
제22항에 있어서, 상기 과다증식성 질환은 유방암, 폐암, 및 기타 AXL을 발현하거나 또는 과다발현하는 암, 및 종양 전이의 형성으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 과다증식성 질환의 진단, 예방, 또는 치료를 위한 것인 단일클론 인간화 항체.
과다증식성 질환의 진단, 예방, 또는 치료용 약제학적 조성물의 제조에서, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 단일클론 인간화 항체의 용도.
제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 과다증식성 질환은 제22항 또는 제23항에 정의된 바와 같은 과다증식성 질환인 것인 용도.
시료를 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 인간화 항체와 접촉시키는 단계, 및 AXL의 존재를 검출하는 단계를 포함하는, AXL의 발현과 연관된 상태를 진단하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 상태는 제22항 또는 제23항에 정의된 바와 같은 과다증식성 질환인 것인 방법.
적어도 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 인간화 항체의 유효량을 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한, 환자에서 AXL의 발현과 연관된 상태를 예방 또는 치료하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 상태는 제27항 또는 제29항에 정의된 바와 같은 과다증식성 질환인 것인 방법.
제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 환자는 포유동물 환자, 특히, 인간 환자인 것인 방법.
항-AXL 항체, 바람직하게는, 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 단일클론 항체, 제11항에 따른 핵산 서열, 또는 제12항 또는 제13항에 따른 벡터를 포함하는 키트.
제32항에 있어서, 추가적인 항종양제를 더 포함하는 것인 키트.
약물 내성 암의 치료용 약제학적 조성물의 제조에서 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-AXL 항체의 용도.
과다 증식성 질환의 치료를 위해 항종양제와의 병용-투여를 위한 약제의 제조에서 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 인간화 항-AXL 항체의 용도.