KR101690340B1

KR101690340B1 - 항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체

Info

Publication number: KR101690340B1
Application number: KR1020117015666A
Authority: KR
Inventors: 요시하루 히루마; 에이스케 츠다; 다케시 다키자와; 마키코 나카야마
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2010-04-07
Publication date: 2016-12-27
Also published as: SG10201401331TA; MX2011007342A; NZ605450A; CA2750836C; KR20120034587A; CN102272306A; IL213943A; IL213943A0; IL252561A0; US20140065146A1; IL252561B; RU2014147188A; US8575316B2; WO2010117011A1; US20150299318A1; US9751944B2; CN102272306B; AU2010235453B2; MY152033A; MX343049B

Abstract

파골 세포에서 강하게 발현되는 유전자에 의해 코드되는 단백질을 표적으로 한 골대사 이상 치료 및/또는 예방용 의약 조성물을 제공하는 것. 인간 Siglec-15 를 특이적으로 인식하여, 파골 세포의 형성을 억제하는 활성을 갖는 항체를 포함하는 의약 조성물의 제공 등.

Description

항 Ｓｉｇｌｅｃ-15 항체{ANTI-Siglec-15 ANTIBODY}

본 발명은 골대사 이상 (異常) 의 치료 및/또는 예방약으로서 유용한 물질, 및 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법에 관한 것이다.

뼈는, 스스로의 형태 변화나 혈중 칼슘 농도의 유지를 위해, 상시 형성과 흡수를 반복하여 재구축을 행하는 동적인 기관으로서 알려져 있다. 정상적인 뼈에서는 골아 세포에 의한 골형성과 파골 세포에 의한 골흡수가 평형 관계에 있어, 골량은 일정하게 유지되고 있다. 한편, 골형성과 골흡수의 평형 관계가 무너지면, 골다공증 등의 골대사 이상이 된다 (국제 공개 제WO07/093042호, 및 Endocrinological Review, (1992) 13, p66-80).

골대사를 조절하는 인자로는, 전신성 호르몬이나 국소성 사이토카인이 다수 보고되어 있으며, 그들 인자의 공동 작용에 의해 뼈의 형성과 유지가 운영되고 있다 (국제 공개 제WO07/093042호, 및 Endocrinological Review, (1996) 17, p308-332). 나이를 먹는 것에 의한 골조직의 변화로는 골다공증의 발증이 널리 알려져 있는데, 그 발증 기구는 성 호르몬의 분비 저하나 그 리셉터 이상, 뼈 국소에 있어서의 사이토카인 발현의 변동, 노화 유전자의 발현, 파골 세포나 골아 세포의 분화 혹은 기능부전 등 다방면에 걸쳐져 있어, 나이를 먹는 것에 의한 단순한 생리 현상으로서 이해하기는 곤란하다. 원발성 골다공증은 에스트로겐의 분비 저하에 의한 폐경후 골다공증과 나이를 먹는 것에 의한 노인성 골다공증으로 크게 나뉘어 있는데, 그 발증 기구의 해명과 치료약 개발을 위해서는, 골흡수와 골형성의 조절 기구에 관한 기초적 연구의 진전이 필수적이다.

파골 세포는 조혈 줄기 세포에서 유래하는 다핵의 세포로, 뼈와의 접착면에 염소 이온과 수소 이온을 방출함으로써, 세포와 뼈의 접착면의 간극을 산성화함과 함께 산성 프로테아제인 카텝신 K 등을 분비한다 (American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324). 그 결과, 인산칼슘의 분해, 산성 프로테아제의 활성화와 골기질 단백질의 분해가 야기되어, 골흡수가 진행된다.

파골 세포의 전구 세포는 골표면의 골아 세포/스트로마 세포의 세포막 상에 발현되는 RANKL (Receptor activator of NF-κB ligand) 의 자극을 받아, 파골 세포로 분화됨이 밝혀졌다 (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, p3597-3602, 및 Cell, (1998) 93, p165-176). RANKL 은 골아 세포/스트로마 세포가 생성하는 막 단백질로서, 그 발현은 골흡수 인자에 의해 조절되는 것, 및 RANKL 은 파골 세포 전구 세포에서 성숙 다핵 파골 세포로의 분화를 유도하는 것 등이 밝혀졌다 (Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America, (1998) 95, p3597-3602, 및 Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23, S222). 또한, RANKL 을 녹아웃시킨 마우스가 대리석골병과 유사한 병태를 발증하는 것을 알아내어, RANKL 이 생리적인 파골 세포 분화 유도 인자임이 증명되었다 (Nature, (1999) 397, p315-323).

골대사 질환의 치료나 치료 기간의 단축을 도모하는 의약품으로서, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (Selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), PTH 및 칼슘 제제 등이 사용되고 있다. 그러나, 이들 약제는 치료 결과에 있어서 반드시 만족할 수 있는 것이 아니어서, 보다 치료 효과가 높은 약제의 개발이 요망되었다.

면역계 세포의 세포막 상은 시알산 함유 당사슬 등의 다양한 당사슬에 의해 고도로 덮여져 있고, 다양한 당사슬 결합 단백질에 의해 인식되고 있다. 시알산 결합 면역 글로불린 유사 렉틴 (Sialic-acid-binding immunoglobulin-like lectins, 이하, 「Siglecs」라고 한다) 은 시알산 함유 당사슬을 인식하여 결합시키는 Ⅰ 형 막 단백질 패밀리이다. Siglecs 는 면역계 세포의 세포막 상에서 많이 발현되어 있으며, 마찬가지로 면역계 세포의 세포막 상에 존재하는 시알산을 인식하여 세포간 상호 작용이나 세포 기능을 조절하고, 면역 응답에 관여하고 있는 것으로 생각되지만 (Nature Reviews Immunology, (2007) 7, p255-266), 생리적 기능이 밝혀지지 않은 Siglecs 분자도 많다. Siglec-15 (Sialic-acid binding immunoglobulin-like lectin 15) 는, Siglecs 에 속하는 것이 새롭게 보고된 분자로 (예를 들어, 비특허문헌 10 을 참조), CD33L3 (CD33 molecule-like 3) 으로 불리는 분자와 동일하다. 이 분자는 어류에서 인간까지 진화적인 보존도가 높고, 인간 비장 및 림프절에 있어서, 수상 (樹狀) 세포/매크로파지계의 세포에 강하게 발현되는 것이 밝혀졌다. 또한 시알산 프로브를 사용한 결합 시험의 결과, 인간 Siglec-15 는 Neu5Acα2-6GalNAc 와, 마우스 Siglec-15 는 또한 Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc 와 결합되는 것 등도 밝혀졌다 (예를 들어, Glycobiology, (2007) 17, p838-846 을 참조). 최근까지 Siglec-15 의 생리적 역할은 명확하지는 않았지만, 파골 세포의 분화, 성숙에 수반되어 Siglec-15 의 발현이 항진되고, RNA 간섭에 의해 Siglec-15 의 발현을 저하시키면 파골 세포의 분화가 억제되는 것이 보고되었다 (예를 들어, 국제 공개 제WO07/093042호를 참조). 또한, 항 Siglec-15 항체가 파골 세포 분화에 미치는 작용에 대해서, 국제 공개 제WO09/48072호 (2009년 4월 16일 공개) 에 있어서 처음으로 밝혀졌지만, 인간에게 투여 가능한 항체 배열에 관해서는 지금까지 밝혀져 있지 않았다.

본 발명의 목적은 골다공증, 관절 류머티즘, 암의 골전이 등에서 보이는 각종 골대사 이상시에 특이적으로 발현되는 유전자, 파골 세포의 분화 성숙과 활성을 저해하는 물질, 및 골대사 이상의 치료 및/또는 예방제를 제공하는 것에 있다.

본 발명자들은, 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 효과를 갖는 물질을 탐색할 목적에서, 파골 세포의 분화, 성숙 및 활성화의 기구 (메카니즘) 의 해명을 목표로 연구한 결과, 파골 세포의 분화, 성숙에 수반하여 Siglec-15 유전자의 발현이 상승하는 것을 알아내었다. 또한, 본 발명자들은, Siglec-15 와 특이적으로 결합하는 항체에 의해, 파골 세포의 분화가 억제되는 것을 알아내었다. 그리고 발명자들은, 얻어진 래트 항마우스 Siglec-15 항체를 인간화하여, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 배열 번호 2 에 나타내는 아미노산 배열의 39 내지 165 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드에 결합하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(2) 중쇄 배열이 CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 44 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 45 또는 배열 번호 97 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은 배열 번호 46 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및

경쇄 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 47 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 48 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은 배열 번호 49 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것

을 특징으로 하는 (1) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(3) 배열 번호 41 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 가변 영역 배열 및 배열 번호 43 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 132 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 가변 영역 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (2) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(4) Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체의 기능성 단편.

(5) scFv 인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 항체.

(6) 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(7) 배열 번호 41 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 43 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 237 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 (6) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(8) 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (4) 또는 (6) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(9) 중쇄가 인간 면역 글로불린 G2 중쇄의 정상 영역을 포함하고, 경쇄가 인간 면역 글로불린 κ 경쇄의 정상 영역을 포함하는 (7) 또는 (8) 에 기재된 항체.

(10) 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서,

(a) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역 :

a1) 배열 번호 51 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a2) 배열 번호 53 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a3) 배열 번호 55 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a4) 배열 번호 57 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a5) 배열 번호 59 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a6) 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a7) 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

a8) a1) 내지 a7) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;

a9) a1) 내지 a7) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;

a10) a1) 내지 a7) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열 ; 및

(b) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역 :

b1) 배열 번호 61 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b2) 배열 번호 63 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b3) 배열 번호 65 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b4) 배열 번호 67 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 132 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b5) 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b6) 배열 번호 71 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b7) 배열 번호 103 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b8) 배열 번호 105 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;

b9) b1) 내지 b8) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 95 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;

b10) b1) 내지 b8) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열과 적어도 99 ％ 의 상동성을 갖는 아미노산 배열 ;

b11) b1) 내지 b8) 에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열

을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(11) 배열 번호 51 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 61 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(12) 배열 번호 53 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 63 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(13) 배열 번호 55 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 65 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(14) 배열 번호 55 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 67 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 132 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(15) 배열 번호 57 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(16) 배열 번호 59 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 71 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(17) 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(18) 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(19) 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 103 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(20) 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 105 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(21) 배열 번호 51 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 61 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(22) 배열 번호 53 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 63 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(23) 배열 번호 55 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 65 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(24) 배열 번호 55 의 아미노산 배열에 나타내는 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 67 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 237 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(25) 배열 번호 57 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(26) 배열 번호 59 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 71 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(27) 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(28) 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(29) 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 103 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(30) 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 105 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (10) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.

(31) (1) 내지 (30) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

(32) 골대사 이상의 치료 및/또는 예방제인 것을 특징으로 하는 (31) 에 기재된 의약 조성물.

(33) (1) 내지 (30) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 적어도 어느 하나, 그리고, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터, 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물.

(34) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거대세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골파제트병, 신성 (腎性) 골이영양증, 및 골형성 부전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 (32) 또는 (33) 에 기재된 의약 조성물.

(35) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 (34) 에 기재된 의약 조성물.

(36) 골대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는 (35) 에 기재된 의약 조성물.

(37) 골다공증이 폐경후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 (36) 에 기재된 의약 조성물.

(38) (1) 내지 (30) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 적어도 어느 하나를 투여하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법.

(39) (1) 내지 (30) 에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 적어도 어느 하나, 그리고, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터, 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 동시에 또는 연속하여 투여하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방 방법.

(40) 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 (38) 또는 (39) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.

(41) 골대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는 (40) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.

(42) 골다공증이 폐경후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 (41) 에 기재된 치료 및/또는 예방 방법.

(43) (3), (7) 또는 (10) 내지 (30) 중 어느 하나에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

(44) (43) 에 기재된 폴리뉴클레오티드로서, 배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.

(45) 배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 711 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 (44) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(46) (43) 에 기재된 폴리뉴클레오티드로서,

(a) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

a1) 배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a2) 배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a3) 배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a4) 배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a5) 배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a6) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a7) 배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

a8) a1) 내지 a7) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ;

a9) a1) 내지 a7) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열 ; 및

(b) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :

b1) 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b2) 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b3) 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b4) 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b5) 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b6) 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b7) 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b8) 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;

b9) b1) 내지 b8) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드가 보유하는 뉴클레오티드 배열 ;

b10) b1) 내지 b8) 에서 선택되는 어느 하나의 뉴클레오티드 배열에 1 내지 수 개의 뉴클레오티드가 치환, 결실 또는 부가된 뉴클레오티드 배열

을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.

(47) 배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(48) 배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(49) 배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(50) 배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(51) 배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(52) 배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(53) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(54) 배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(55) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(56) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(57) 배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(58) 배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(59) 배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(60) 배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 711 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(61) 배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(62) 배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(63) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(64) 배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(65) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(66) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 (46) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(67) (43) 내지 (66) 에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.

(68) (43) 내지 (66) 에 기재된 어느 하나의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.

(69) (67) 에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.

(70) (68) 또는 (69) 에 기재된 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는 (3), (7) 또는 (10) 내지 (30) 에 기재된 항체의 생산 방법.

본 발명에 의하면, 파골 세포의 분화 성숙, 및 골흡수 활성의 저해를 작용 기전으로 하는, 골대사 이상의 치료제 및/또는 예방제를 얻을 수 있다.

도 1 은 HisTrap HP 칼럼 크로마토그래피와 Resource Q 칼럼 크로마토그래피로 정제한 마우스 Siglec-15-His 의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색에 의해 평가한 결과이다.
도 2 는 HisTrap HP 칼럼 크로마토그래피와 Resource Q 칼럼 크로마토그래피로 정제한 마우스 Siglec-15-His 의 거동을, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 항 V5-HRP 항체를 사용한 웨스턴 블로팅으로 검출한 결과이다.
도 3 은 HiTrap protein A 칼럼 크로마토그래피로 정제한 마우스 Siglec-15-Fc 의 순도를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색에 의해 평가한 결과이다.
도 4 는 마우스 Siglec-15-Fc 고상화 플레이트에 대한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 결합을 ELISA 법으로 시험한 결과이다. 심볼 (◆) 은 #1A1 항체를, 심볼 (■) 은 #3A1 항체를, 심볼 (▲) 은 #8A1 항체를, 심볼 (×) 은 #24A1 항체를, 심볼 (●) 은 #32A1 항체를, 심볼 (○) 은 #34A1 항체를, 심볼 (＋) 은 #39A1 항체를, 심볼 () 은 #40A1 항체를, 심볼 (-) 은 #41B1 항체를, 심볼 (◇) 은 #61A1 항체를, 심볼 (□) 은 컨트롤 IgG 를 각각 나타내고 있다.
도 5 는 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#3A1, #8A1 또는 #32A1) 의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (RANKL 자극) 에 대한 영향을 시험한 결과이다. 또, 도면 중의 래트 컨트롤 IgG 는 도 5 및 6 에서 공통되는 음성 컨트롤이다.
도 6 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#34A1, #39A1 또는 #40A1) 의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화 (RANKL 자극) 에 대한 영향을 시험한 결과이다. 또, 도면 중의 토끼 항마우스 Siglec-15 폴리클로날 항체 No.3 은 도 5 및 6 에서 공통되는 양성 컨트롤이다.
도 7 은 HisTrap HP 칼럼 크로마토그래피와 Resource Q 칼럼 크로마토그래피로 정제한 인간 Siglec-15-His 의 순도를, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색에 의해 평가한 결과이다.
도 8 은 Protein A 칼럼 크로마토그래피로 정제한 인간 Siglec-15-Fc 의 순도를, SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 의해 평가한 결과이다.
도 9 는 인간 Siglec-15-Fc 고상화 플레이트에 대한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 결합을 ELISA 법으로 시험한 결과이다. 심볼 (◆) 은 #1A1 항체를, 심볼 (■) 은 #3A1 항체를, 심볼 (▲) 은 #8A1 항체를, 심볼 (×) 은 #24A1 항체를, 심볼 (●) 은 #32A1 항체를, 심볼 (○) 은 #34A1 항체를, 심볼 (＋) 은 #39A1 항체를, 심볼 () 은 #40A1 항체를, 심볼 (-) 은 #41B1 항체를, 심볼 (◇) 은 #61A1 항체를, 심볼 (□) 은 컨트롤 IgG 를 각각 나타내고 있다.
도 10 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 거대 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 염색에 의해 나타낸 현미경 사진이다.
도 11 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체) 의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 거대 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 염색에 의해 나타낸 현미경 사진이다.
도 12 는 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체) 의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 세포의 골흡수 활성의 억제를 나타낸 그래프이다 (N=6).
도 13 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체를 난소 적제 (摘除) 래트에 4 주간 투여했을 때의 요추 골밀도의 증가 작용 (A) 및 뇨중 데옥시피리디놀린 배설량의 저하 작용 (B) 을 나타낸 그래프이다.
도 14 는 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 이 인간 Siglec-15 의 V-set 도메인에 결합하는 것을 경합 ELISA 에 의해서 나타낸 도면이다.
도 15 는 래트 #32A1 항체와 이것의 인간 키메라 항체가 마우스 Siglec-15-Fc 에 대하여 거의 동등한 친화성을 갖는 것을 경합 ELISA 에 의해서 나타낸 도면이다.
도 16 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체) 및 그 키메라 항체의 첨가에 의한, 마우스 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 효소 활성에 의해 나타낸 그래프이다 (N=3).
도 17 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 거대 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 염색에 의해 나타낸 현미경 사진이다.
도 18 은 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 6 종이 항체의 농도에 의존하여 마우스 Siglec-15 단백질에 결합하는 것을, 마우스 Siglec-15-Fc 고상화 플레이트를 사용한 ELISA 법에 의해서 확인한 도면이다.
도 19 는 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 6 종이 항체의 농도에 의존하여 인간 Siglec-15 단백질에 결합하는 것을, 인간 Siglec-15-Fc 고상화 플레이트를 사용한 ELISA 법에 의해서 확인한 도면이다.
도 20 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체) 및 그 키메라 항체의 첨가에 의한, TNFα 자극하에서의 마우스 거대 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 염색에 의해 나타낸 현미경 사진이다.
도 21 은 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체) 및 그 키메라 항체의 첨가에 의한, TNFα 자극하에서의 마우스 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 효소 활성에 의해 나타낸 그래프이다 (N=3).
도 22 는 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#8A1 및 #32A1 항체) 의 첨가에 의한, 래트 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 효소 활성에 의해 나타낸 그래프이다 (N=3).
도 23 은 클로닝한 래트 #32A1 중쇄의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 24 는 클로닝한 래트 #32A1 경쇄의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 25 는 #32A1 인간 키메라 항체 중쇄의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 26 은 #32A1 인간 키메라 항체 경쇄의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 27 은 h#32A1-T1H 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 28 은 h#32A1-T2H 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 29 는 h#32A1-T3H 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 30 은 h#32A1-T5H 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 31 은 h#32A1-T6H 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 32 는 h#32A1-T1L 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 33 은 h#32A1-T2L 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 34 는 h#32A1-T3L 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 35 는 h#32A1-T4L 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 36 은 h#32A1-T5L 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 37 은 h#32A1-T6L 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 38 은 h#32A1-T7H, h#32A1-T8H, 및 h#32A1-T9H 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 39 는 h#32A1-T10H, h#32A1-T11H, 및 h#32A1-T12H 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 40 은 h#32A1-T7L, h#32A1-T8L, h#32A1-T9L, h#32A1-T10L, 및 h#32A1-T11L 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 41 은 h#32A1-T12L, h#32A1-T13L, h#32A1-T14L, h#32A1-T15L, 및 h#32A1-T16L 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 42 는 h#32A1-T17L, h#32A1-T18L, h#32A1-T19L, h#32A1-T20L, 및 h#32A1-T21L 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 43 은 h#32A1-T22L, h#32A1-T23L, h#32A1-T24L, 및 h#32A1-T25L 의 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 44 는 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3) 의 첨가에 의한, 마우스 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 효소 활성에 의해 나타낸 그래프이다. 또, 도면 중의 래트 #32A1 항체는 도 44 및 도 45 에서 공통되는 양성 컨트롤이다.
도 45 는 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 (h#32A1-T4, h#32A1-T5, h#32A1-T6) 의 첨가에 의한, 마우스 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 효소 활성에 의해 나타낸 그래프이다.
도 46 은 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 (h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5) 의 첨가에 의한, 마우스 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 효소 활성에 의해 나타낸 그래프이다. 또, 도면 중의 래트 #32A1 항체 및 #32A1 인간 키메라 항체는 도 46 및 도 47 에서 공통되는 양성 컨트롤이다.
도 47 은 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 (h#32A1-H1-1/L2-16, h#32A1-H-1/L2-15) 의 첨가에 의한, 마우스 파골 세포 형성의 억제를 TRAP 효소 활성에 의해 나타낸 그래프이다.
도 48 은 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5, h#32A1-T6) 의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 세포의 골흡수 활성의 억제를 나타낸 그래프이다. 또, 도면 중의 래트 #32A1 항체 및 #32A1 인간 키메라 항체는 도 48 및 도 49 에서 공통되는 양성 컨트롤이다.
도 49 는 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 (h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16, h#32A1-H1-1/L2-15) 의 첨가에 의한, 정상 인간 파골 세포의 골흡수 활성의 억제를 나타낸 그래프이다.
도 50 은 h#32A1-H5/L5 항체의 열 안정성을 측정한 서모그램 (thermogram) 이다.
도 51 은 h#32A1-H1-1/L5 항체의 열 안정성을 측정한 서모그램이다.
도 52 는 h#32A1-H1-1/L2-15 항체의 열 안정성을 측정한 서모그램이다.
도 53 은 h#32A1-H1-1/L2-16 항체의 열 안정성을 측정한 서모그램이다.
도 54 는 h#32A1-H1-1 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 55 는 h#32A1-H5 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 56 은 h#32A1-L2-15 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.
도 57 은 h#32A1-L2-16 의 뉴클레오티드 배열, 및 아미노산 배열을 나타낸 도면이다.

본 명세서 중에 있어서, 「유전자」라는 단어에는, DNA 뿐만 아니라 mRNA, cDNA 및 cRNA 도 포함되는 것으로 한다.

본 명세서 중에 있어서, 「폴리뉴클레오티드」라는 단어는 핵산과 동일한 의미로 사용되고 있고, DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드 및 프라이머도 포함되어 있다.

본 명세서 중에 있어서는, 「폴리펩티드」와 「단백질」은 구별하지 않고 사용되고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「RNA 획분」이란, RNA 를 함유하고 있는 획분을 말한다.

본 명세서 중에 있어서, 「세포」에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함되어 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「Siglec-15」는 Siglec-15 단백질과 동일한 의미로 사용되고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「파골 세포의 형성」은 「파골 세포의 분화」 또는 「파골 세포의 성숙」과 동일한 의미로 사용되고 있다.

본 명세서 중에 있어서의 「항체의 기능성 단편」이란, 항원과의 결합 활성을 갖는 항체의 부분 단편을 의미하고 있으며, Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diabody, 선형 항체, 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 포함한다. 또한, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 기능성 단편에 포함된다. 단, 항원과의 결합능을 갖고 있는 한 이들 분자에 한정되지 않는다. 또한, 이들 기능성 단편에는, 항체 단백질의 전장 (全長) 분자를 적당한 효소로 처리한 것뿐만 아니라, 유전자 공학적으로 개변된 항체 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 생성된 단백질도 포함된다.

본 명세서에 있어서의, 「에피토프」란, 특정한 항 Siglec-15 항체가 결합하는 Siglec-15 의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조를 의미한다. 상기한 Siglec-15 의 부분 펩티드인 에피토프는 면역 어세이법 등 당업자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 결정할 수 있는데, 예를 들어 이하의 방법에 의해 실시할 수 있다. Siglec-15 의 다양한 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조시에는, 공지된 올리고펩티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, Siglec-15 의 C 말단 또는 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차적으로 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지되어 있는 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조한 후, 그들에 대한 항체의 반응성을 검토하여, 대략적인 인식 부위를 결정한 후, 더욱 짧은 펩티드를 합성하고 그들 펩티드와의 반응성을 검토함으로써, 에피토프를 결정할 수 있다. 또, 특정한 Siglec-15 항체가 결합하는 Siglec-15 의 부분 입체 구조인 에피토프는 X 선 구조 해석에 의해서 상기한 항체와 인접하는 Siglec-15 의 아미노산 잔기를 특정함으로써 결정할 수 있다. 제 1 항 Siglec-15 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항 Siglec-15 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프를 갖는다고 판정할 수 있다. 또한, 제 1 항 Siglec-15 항체의 Siglec-15 에 대한 결합에 대하여 제 2 항 Siglec-15 항체가 경합하는 (즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 Siglec-15 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프를 갖는 것으로 판정할 수 있다. 또, 제 1 항체와 제 2 항체가 공통의 에피토프에 결합되고, 또한 제 1 항체가 항원의 중화 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 갖는 것을 기대할 수 있다.

항체 분자의 중쇄 및 경쇄에는 각각 3 군데의 상보성 결정 영역 (CDR : Complemetarity deterring region) 이 있음이 알려져 있다. 상보성 결정 영역은 초가변 영역 (hypervariable domain) 으로도 불리우고, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 내에 있으며, 일차 구조의 변이성이 특히 높은 부위로, 중쇄 및 경쇄의 폴리펩티드 사슬의 일차 구조 상에 있어서, 각각 3 군데로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 상보성 결정 영역에 관하여, 중쇄의 상보성 결정 영역을 중쇄 아미노산 배열의 아미노 말단측에서부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경쇄의 상보성 결정 영역을 경쇄 아미노산 배열의 아미노 말단측에서부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 위에서 서로 근접하고, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.

본 발명에 있어서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론테크사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정시킨 필터를 사용하여 0.7 - 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 - 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건에서 하이브리다이즈하는 것을 말한다.

1. Siglec-15

본 발명자들에 의해서, Siglec-15 유전자는 거대세포종에 있어서 특이적으로 발현되어 있는 것을 알아내었다. 또한, 본 발명자들에 의해서 Siglec-15 유전자는 단구 (單球) 유래 세포주가 파골 세포로 분화될 때에 발현량이 증가하는 것도 알아내었다.

본 발명에서 사용하는 Siglec-15 는 인간, 인간 이외의 포유 동물 (예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 또는 닭의 단구 세포 또는 골수 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 또는 상기 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또한 Siglec-15 를 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, Siglec-15 cDNA 를 발현시킬 수 있는 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 그밖의 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 Siglec-15 를 발현시키는 것에 의해, 그 단백질을 얻을 수 있다.

인간 Siglec-15 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열은 GenBank 에 액세션 번호 : NM_213602 로 등록되어, 배열표의 배열 번호 1 에도 나타나 있으며, 그 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 2 에 나타나 있다. 마우스 Siglec-15 의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열은 GenBank 에 액세션 번호 : XM_884636 으로 등록되어, 배열표의 배열 번호 3 에도 나타나 있고, 그 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 4 에 나타나 있다. 시그널 배열이 제거된 성숙 인간 Siglec-15 는 배열 번호 2 에 나타내는 아미노산 배열의 21 번째 내지 328 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열에 상당한다. 또한, 시그널 배열이 제거된 마우스 Siglec-15 는 배열 번호 4 에 나타내는 아미노산 배열의 21 번째 내지 341 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열에 상당한다. 또한, Siglec-15 는 CD33 antigen-like 3, CD33 molecule-like 3, CD33-like 3 또는 CD33L3 으로 불리는 경우가 있으며, 이들은 전부 동일한 분자를 나타내고 있다.

Siglec-15 의 cDNA 는 예를 들어, Siglec-15 의 cDNA 를 발현하고 있는 cDNA 라이브러리를 주형 (鑄型) 으로 하고, Siglec-15 의 cDNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」이라고 한다) (Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.

또한, 배열표의 배열 번호 1 및 3 에서 선택되는 적어도 어느 1 개에 나타내는 뉴클레오티드 배열과 상보적인 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하고, 또한 Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 Siglec-15 의 cDNA 에 포함된다. 또한, 인간 또는 마우스 Siglec-15 유전자좌 (座) 로부터 전사되는 스플라이싱 베리언트 또는 이것에 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드이면서, 또한 Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 Siglec-15 의 cDNA 에 포함된다.

또한, 배열표의 배열 번호 2 및 4 에서 선택되는 적어도 어느 1 개에 나타내는 아미노산 배열, 또는 이들 배열에서 시그널 배열이 제거된 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 Siglec-15 에 포함된다. 또한, 인간 또는 마우스 Siglec-15 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 베리언트에 의해 코드되는 아미노산 배열 또는 그 아미노산 배열에 있어서, 1 개 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 Siglec-15 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 Siglec-15 에 포함된다.

2. 골대사 이상의 검출

Siglec-15 유전자는, 인간 각종 골조직 검체군에 있어서의 유전자의 발현량을 해석하면, 파골 세포 유사의 다핵 거대세포가 다수 출현하는 골종양으로, 임상적 소견으로서 골용해성의 골파괴를 특징으로 하는 (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2nd edition, pp17.6-17.8, Lippincott Williams ＆ Wilkins Publishers (1992)) 거대세포종 (Giant cell tumor ; GCT) 에 있어서 유의하게 발현량이 증가하고 있는 것을 알아내었다.

또한, Siglec-15 유전자는 단구 유래 세포주가 파골 세포로 분화될 때에 발현량이 증가하는 것도 알아내었다.

따라서, Siglec-15 는 GCT 와 같은 골흡수가 항진되는 인간의 병태에 관여하고 있는 것으로 생각된다. 즉, Siglec-15 유전자 및/또는 Siglec-15 의 각 세포, 및/또는 각 조직에 있어서의 발현량을 측정함으로써 Siglec-15 의 과잉 발현을 수반하는 골대사 이상의 상태를 판정할 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서의 골대사 이상이란, 정미 (正味) 의 골상실에 의해서 특징지어지는 장애로, 구체적으로는 골다공증 (폐경후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증), 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거대세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골파제트병, 신성 골이영양증, 골형성 부전증 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지는 않는다.

본 발명에 있어서 Siglec-15 유전자 및/또는 Siglec-15 의 발현량을 조사하는 대상이 되는 「검체」란, 피험자나 임상 검체 등으로부터 얻어진, 골수, 뼈, 전립선, 정소 (精巢), 음경, 방광, 신장, 구강, 인두, 구순, 혀, 치육, 비인두, 식도, 위, 소장, 대장, 결장, 간장, 담낭, 췌장, 코, 폐, 연부 조직, 피부, 유방, 자궁, 난소, 뇌, 갑상선, 림프절, 근육, 지방 조직 등의 조직, 혈액, 체액 또는 배설물 등의 시료를 의미하는데, 본 발명에 있어서는 혈액 또는 골수가 보다 바람직하다.

파골 세포의 분화에 관련되는 것이 알려져 있는 RANKL 에 관해서는, 녹아웃 마우스가 제조되어 있어, RANKL 의 기능이 상실된 경우의 표현형에 관해서 해석이 이루어져 있다 (Young-Yun Kong, et. al., Nature (1999) 397, p.315-323). Siglec-15 에 관해서도 마찬가지로 녹아웃 마우스를 제조함으로써, Siglec-15 의 기능이 상실된 경우의 표현형의 해석을 실시할 수 있다.

3. 항 Siglec-15 항체의 제조

본 발명의 Siglec-15 에 대한 항체는, 통상적인 방법을 사용하여, Siglec-15 또는 Siglec-15 의 아미노산 배열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에게 면역시키고, 생체 내에 생성되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원이 되는 Siglec-15 의 생물종은 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 Siglec-15 를 동물에게 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 (異種) Siglec-15 에 결합되는 항체와 인간 Siglec-15 의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용할 수 있는 항체를 선별할 수 있다.

또한, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, Siglec-15 에 대한 항체를 생성하는 항체 생성 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.

또한, 항원이 되는 Siglec-15 는 Siglec-15 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다.

구체적으로는, Siglec-15 유전자를 발현 가능한 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현된 Siglec-15 를 정제하면 된다. 이하, 구체적으로 Siglec-15 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.

(1) 항원의 조제

항 Siglec-15 항체를 제조하기 위한 항원으로는, Siglec-15 또는 그 적어도 6 개의 연속된 부분 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드, 혹은 이들에 임의의 아미노산 배열이나 담체가 부가된 유도체를 들 수 있다.

Siglec-15 는 인간의 종양 조직 또는 종양 세포로부터 직접 정제하여 사용 할 수 있고, 또한 Siglec-15 를 in vitro 에서 합성하거나, 또는 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생성시킴으로써 얻을 수 있다.

유전자 조작에서는, 구체적으로는, Siglec-15 의 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 그밖의 원핵 생물 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 Siglec-15 를 발현시키는 것에 의해, 항원을 얻을 수 있다.

또한, 막 단백질인 Siglec-15 의 세포 외 영역과 항체의 정상 영역을 연결시킨 융합 단백질을 적절한 숙주·벡터계에 있어서 발현시킴으로써, 분비 단백질로서 항원을 얻을 수도 있다.

Siglec-15 의 cDNA 는 예를 들어, Siglec-15 의 cDNA 를 발현하고 있는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, Siglec-15 cDNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여 폴리머라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」이라고 한다) (Saiki, R. K., et al. Science (1988) 239, p.487-489 참조) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.

폴리펩티드의 인 비트로 (in vitro) 합성으로는, 예를 들어 로슈 다이아그노스틱스사 제조의 래빗 트랜스레이션 시스템 (RTS) 을 들 수 있는데, 이것에 한정되지는 않는다.

원핵 세포의 숙주로는, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli) 이나 고초균 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적으로 하는 유전자를 이들 숙주 세포 내에서 형질 전환시키려면, 숙주와 적합할 수 있는 종에서 유래하는 레플리콘 즉 복제 기점과, 조절 배열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터에 의해 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 또한, 벡터로는, 형질 전환 세포에 표현 형질 (표현형) 의 선택성을 부여할 수 있는 배열을 갖는 것이 바람직하다.

진핵 세포의 숙주 세포에는, 척추동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되고, 척추동물 세포로는, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 이나 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p.4126-4220) 등이 자주 사용되고 있으나, 이들에 한정되지 않는다.

상기와 같이 하여 얻어지는 형질 전환체는 통상적인 방법에 따라 배양할 수 있고, 그 배양에 의해 세포 내 또는 세포 외에 목적으로 하는 폴리펩티드가 생성된다.

그 배양에 사용되는 배지로는, 채용된 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절히 선택할 수 있고, 대장균이면, 예를 들어, LB 배지에 필요에 따라 암피실린 등의 항생 물질이나 IPMG 를 첨가하여 사용할 수 있다.

상기 배양에 의해, 형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외에 생성되는 재조합 단백질은 그 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 이용한 각종 공지된 분리 조작법에 의해 분리·정제할 수 있다.

그 방법으로는, 구체적으로는 예를 들어, 통상적인 단백질 침전제에 의한 처리, 한외 여과, 분자 체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다.

또한, 발현시키는 재조합 단백질에 6 잔기로 이루어지는 히스티딘 태그를 연결시킴으로써, 니켈 어피니티 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다. 혹은, 발현시키는 재조합 단백질에 IgG 의 Fc 영역을 연결시킴으로써, 프로테인 A 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다.

상기 방법을 조합함으로써 용이하게 고수율, 고순도로 목적으로 하는 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수 있다.

(2) 항 Siglec-15 모노클로날 항체의 제조

Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 항체의 예로서, Siglec-15 와 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체를 들 수 있는데, 그 취득 방법은 이하에 기재하는 바와 같다.

모노클로날 항체의 제조시에는, 일반적으로 하기와 같은 작업 공정이 필요하다.

즉,

(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제,

(b) 항원을 동물에게 주사함으로써 면역시킨 후, 혈액을 채취하여 그 항체가 (價) 를 검정하고 비장 적출의 시기를 결정한 다음, 항체 생성 세포를 조제하는 공정,

(c) 골수종 세포 (이하 「미엘로마」라고 한다) 의 조제,

(d) 항체 생성 세포와 미엘로마의 세포 융합,

(e) 목적으로 하는 항체를 생성하는 하이브리도마군의 선별,

(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝),

(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육,

(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성, 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정 등이다.

이하, 모노클로날 항체의 제조법을 상기 공정을 따라 상세히 서술하는데, 그 항체의 제조법은 이것에 제한되지 않고, 예를 들어 비장 세포 이외의 항체 생성 세포 및 미엘로마를 사용할 수도 있다.

(a) 항원의 정제

항원으로는, 상기한 것과 같은 방법으로 조제한 Siglec-15 또는 그 일부를 사용할 수 있다.

또한, Siglec-15 발현 재조합체 세포로부터 조제한 막 획분, 또는 Siglec-15 발현 재조합체 세포 자체, 그리고 당업자에게 주지된 방법을 사용하여, 화학 합성한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용할 수도 있다.

(b) 항체 생성 세포의 조제

공정 (a) 에서 얻어진 항원과, 프로인트의 완전 또는 불완전 아쥬반트, 또는 칼리명반과 같은 보조제를 혼합하고, 면역원으로서 실험 동물에게 면역시킨다. 실험 동물은 공지된 하이브리도마 제조법에 사용되는 동물을 지장없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 단, 적출된 항체 생성 세포와 융합시키는 미엘로마 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 마우스 또는 래트를 피면역 동물로 하는 것이 바람직하다.

또한, 실제로 사용하는 마우스 및 래트의 계통은 특별히 제한은 없고, 마우스의 경우에는, 예를 들어 각 계통 A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, 129 등을, 또한 래트의 경우에는, 예를 들어, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.

이들 마우스 및 래트는 예를 들어 일본 쿠레아, 일본 찰스 리버 등 실험 동물 사육 판매 업자로부터 입수할 수 있다.

이 중, 후술하는 미엘로마 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스에서는 BALB/c 계통이, 래트에서는 Wistar 및 Low 계통이 피면역 동물로서 특히 바람직하다.

또한, 항원인 인간과 마우스에서의 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생체 기구를 저하시킨 마우스, 즉 자기 면역 질환 마우스를 사용하는 것도 바람직하다.

또한, 이들 마우스 또는 래트의 면역시 주령은 바람직하게는 5 ∼ 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 ∼ 8 주령이다.

Siglec-15 또는 이 재조합체에 의해 동물을 면역시키기 위해서는, 예를 들어, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol.Ⅰ.Ⅱ.Ⅲ., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등에 상세하게 기재되어 있는 공지된 방법을 사용할 수 있다.

이들 면역법 중, 본 발명에 있어서 바람직한 방법을 구체적으로 나타내면, 예를 들어 이하와 같다.

즉, 먼저 항원인 막 단백질 획분, 또는 항원을 발현시킨 세포를 동물의 피내 (皮內) 또는 복강 내에 투여한다.

단, 면역 효율을 높이기 위해서는 투여 방법의 병용이 바람직하며, 전반에는 피내 투여를 실시하고, 후반 또는 최종회에만 복강 내 투여를 실시하면, 특히 면역 효율을 높일 수 있다.

항원의 투여 스케줄은 피면역 동물의 종류, 개체차 등에 따라 상이한데, 일반적으로는 항원 투여 횟수 3 ∼ 6 회, 투여 간격 2 ∼ 6 주가 바람직하고, 투여 횟수 3 ∼ 4 회, 투여 간격 2 ∼ 4 주가 더욱 바람직하다.

또한, 항원의 투여량은 동물의 종류, 개체차 등에 따라 상이한데, 일반적으로는 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎ 정도로 한다.

추가 면역은, 이상과 같은 항원 투여의 1 ∼ 6 주 후, 바람직하게는 2 ∼ 4 주 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 주 후에 실시한다.

또한, 추가 면역을 실시할 때의 항원 투여량은 동물의 종류, 크기 등에 따라 상이한데, 일반적으로 예를 들어 마우스의 경우에는 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 0.2 ㎎ 정도로 한다.

상기 추가 면역으로부터 1 ∼ 10 일 후, 바람직하게는 2 ∼ 5 일 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 일 후에 피면역 동물로부터 항체 생성 세포를 포함하는 비장 세포 또는 림프구를 무균적으로 취출한다.

또한, 그 때에 항체가를 측정하여, 항체가가 충분히 높아진 동물을 항체 생성 세포의 공급원으로서 사용하면, 이후의 조작 효율을 높일 수 있다.

여기서 사용되는 항체가의 측정법으로는, 예를 들어, RIA 법 또는 ELISA 법을 들 수 있는데 이들 방법에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서의 항체가의 측정은, 예를 들어 ELISA 법에 의하면, 이하에 기재하는 바와 같은 순서에 따라 실시할 수 있다.

먼저, 정제 또는 부분 정제한 항원을 ELISA 용 96 웰 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착되어 있지 않은 고상 표면을 항원과 무관계한 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민 (이하 「BSA」라고 한다) 에 의해 덮고, 그 표면을 세정한 후, 제 1 항체로서 단계 희석시킨 시료 (예를 들어 마우스 혈청) 에 접촉시켜, 상기 항원에 시료 중의 항체를 결합시킨다.

또한 제 2 항체로서 효소 표지된 마우스 항체에 대한 항체를 첨가하여 마우스 항체에 결합시키고, 세정 후 그 효소의 기질을 첨가하여, 기질 분해에 기초하는 발색에 따른 흡광도의 변화 등을 측정함으로써 항체가를 산출한다.

이들 비장 세포 또는 림프구로부터의 항체 생성 세포의 분리는 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495,; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977) 6, p.511,; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550,; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495,) 에 따라서 실시할 수 있다.

예를 들어, 비장 세포의 경우에는, 비장을 가늘게 절단하고 세포를 스테인리스 메시로 여과한 후, 이글 최소 필수 배지 (MEM) 에 부유시켜 항체 생성 세포를 분리하는 일반적 방법을 채용할 수 있다.

(c) 골수종 세포 (이하, 「미엘로마」라고 한다) 의 조제

세포 융합에 사용되는 미엘로마 세포에는 특별한 제한은 없고, 공지된 세포주로부터 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 단, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 그 선택 수속이 확립되어 있는 HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) 결손주를 사용하는 것이 바람직하다.

즉, 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) 등, 인간 유래의 U266AR (SKO-007), GM1500·GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41) 등이다.

이들 HGPRT 결손주는 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) 등으로부터 입수할 수 있다.

이들 세포주는, 적당한 배지, 예를 들어 8-아자구아닌 배지 [RPMI-1640 배지에 글루타민, 2-메르캅토에탄올, 겐타마이신 및 소 태아 혈청 (이하 「FCS」라고 한다) 을 첨가한 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코브 개변 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium ; 이하 「IMDM」이라고 한다), 또는 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium ; 이하 「DMEM」이라고 한다) 에서 계대 배양하는데, 세포 융합의 3 내지 4 일 전에 정상 배지 [예를 들어, 10 ％ FCS 를 함유하는 ASF104 배지 (아지노모토 (주) 사 제조)] 에서 계대 배양하여, 융합 당일에 2 × 10⁷ 이상의 세포수를 확보해 둔다.

(d) 세포 융합

항체 생성 세포와 미엘로마 세포의 융합은, 공지된 방법 (Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol.Ⅰ.Ⅱ.Ⅲ., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등) 에 따라서, 세포의 생존율을 극도로 저하시키지 않을 정도의 조건하에서 적절히 실시할 수 있다.

그러한 방법은, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도 폴리머 용액 중에서 항체 생성 세포와 미엘로마 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 이용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다.

이 중, 상기 화학적 방법의 구체예를 나타내면 이하와 같다.

즉, 고농도 폴리머 용액으로서 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 경우에는, 분자량 1500 ∼ 6000, 바람직하게는 2000 ∼ 4000 의 폴리에틸렌글리콜 용액 중에서, 30 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 35 ∼ 38 ℃ 의 온도에서 항체 생성 세포와 미엘로마 세포를 1 ∼ 10 분간, 바람직하게는 5 ∼ 8 분간 혼합한다.

(e) 하이브리도마군의 선택

상기 세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한은 없지만, 통상적으로 HAT (히포크산틴·아미노프테린·티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495 ; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550) 이 사용된다.

이 방법은, 아미노프테린에서 생존할 수 없는 HGPRT 결손주의 미엘로마 세포를 사용하여 하이브리도마를 얻는 경우에 유효하다.

즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양함으로써, 아미노프테린에 대한 내성을 겸비한 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고, 또한 증식시킬 수 있다.

(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝)

하이브리도마의 클로닝법으로는, 예를 들어 메틸셀룰로오스법, 연 (軟) 아가로오스법, 한계 희석법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어 Barbara, B. M. and Stanley, M. S. : Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조). 이들 방법 중, 특히 한계 희석법이 바람직하다.

이 방법에서는, 마이크로 플레이트에 래트 태아 유래 선유아 세포주, 또는 정상 마우스 비장 세포, 흉선 세포, 복수 (腹水) 세포 등의 피더 (feeder) 를 접종시켜 둔다.

한편, 미리 하이브리도마를 0.2 ∼ 0.5 개/0.2 ㎖ 가 되도록 배지 중에서 희석시키고, 이 희석된 하이브리도마의 부유액을 각 웰에 0.1 ㎖ 씩 넣고, 일정 기간마다 (예를 들어 3 일마다) 약 1/3 의 배지를 새로운 것으로 교환하면서 2 주 정도 배양을 계속함으로써 하이브리도마의 클론을 증식시킬 수 있다.

항체가가 확인된 웰에 대해, 예를 들어 한계 희석법에 의한 클로닝을 2 ∼ 4 회 반복하여, 안정적으로 항체가가 확인된 것을 항 Siglec-15 모노클로날 항체 생성 하이브리도마주로서 선택한다.

이와 같이 하여 클로닝된 하이브리도마주의 예로는, WO09/48072호에 기재된 하이브리도마 #32A1 을 들 수 있다. 하이브리도마 #32A1 은 일본 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (소재지 : 우편번호 305-8566 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반치 1 츄오우 다이 6) 에 2008년 8월 28일자로 기탁되고, anti-Siglec-15 Hybridoma #32A1 의 명칭으로 수탁 번호 FERM BP-10999 가 부여되어 있다. 또, 본 명세서 중에 있어서는, 하이브리도마 #32A1 이 생성하는 항체를, 「#32A1 항체」 또는 간단히 「#32A1」이라고 기재한다. 또한, 본 명세서의 실시예에 있어서 #32A1 항체 이외에 취득된 항체에 관해서도, 동일한 방법으로 항체명을 기재한다. #32A1 항체의 중쇄 가변 영역을 포함하는 부분 단편은 배열표의 배열 번호 28 의 20 내지 167 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는다. 또한, #32A1 항체의 경쇄 가변 영역 배열을 포함하는 부분 단편은 배열표의 배열 번호 30 의 21 내지 139 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는다.

(g) 하이브리도마의 배양에 의한 모노클로날 항체의 조제

이와 같이 하여 선택된 하이브리도마는 이것을 배양함으로써 모노클로날 항체를 효율적으로 얻을 수 있는데, 배양에 앞서, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것이 바람직하다.

이 스크리닝에는 그 자체가 이미 알려진 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 항체가의 측정은 예를 들어 상기 (b) 의 항목에서 설명한 ELISA 법에 의해 실시할 수 있다.

이상과 같은 방법에 의해 얻은 하이브리도마는 액체 질소 중 또는 -80 ℃ 이하의 냉동고 중에 동결 상태로 보존할 수 있다.

클로닝을 완료한 하이브리도마는 배지를 HT 배지에서 정상 배지로 바꾸어 배양된다.

대량 배양은 대형 배양병을 사용한 회전 배양, 또는 스피너 배양으로 실시된다.

이 대량 배양에 있어서의 상청으로부터, 겔 여과 등 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.

또한, 동일 계통의 마우스 (예를 들어, 상기의 BALB/c), 혹은 Nu/Nu 마우스의 복강 내에 하이브리도마를 주사하고, 그 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 대량으로 함유하는 복수를 얻을 수 있다.

복강 내에 투여하는 경우에는, 사전 (3 ∼ 7 일 전) 에 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸 (2,6,10,14-tetramethyl pentadecane) (프리스탄) 등의 광물유를 투여하면, 보다 다량의 복수가 얻어진다.

예를 들어, 하이브리도마와 동일한 계통의 마우스의 복강 내에 미리 면역 억제제를 주사하여, T 세포를 불활성화한 후, 20 일 후에 10⁶ ∼ 10⁷ 개의 하이브리도마·클론 세포를, 혈청을 함유하지 않는 배지 중에서 부유 (0.5 ㎖) 시켜 복강 내에 투여하고, 통상적으로 복부가 팽만하며, 복수가 고인 시점에서 마우스로부터 복수를 채취한다.

이 방법에 의해, 배양액 중에 비해 약 100 배 이상의 농도의 모노클로날 항체가 얻어진다.

상기 방법에 의해 얻은 모노클로날 항체는, 예를 들어 Weir, D. M. : Handbook of Experimental Immunology, Vol.Ⅰ.Ⅱ.Ⅲ, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) 에 기재되어 있는 방법으로 정제할 수 있다.

즉, 황산암모늄 염석법, 겔 여과법, 이온 교환 크로마토그래피법, 어피니티 크로마토그래피법 등이다.

정제의 간편한 방법으로는, 시판되는 모노클로날 항체 정제 키트 (예를 들어, MAbTrap GⅡ 키트 ; 파마시아사 제조) 등을 이용할 수도 있다.

이렇게 하여 얻어지는 모노클로날 항체는 Siglec-15 에 대하여 높은 항원 특이성을 갖는다.

(h) 모노클로날 항체의 검정

이렇게 하여 얻어진 모노클로날 항체의 아이소타입 및 서브클래스의 결정은 이하와 같이 실시할 수 있다.

먼저, 동정법으로는 옥터로니 (Ouchterlony) 법, ELISA 법 또는 RIA 법을 들 수 있다.

옥터로니법은 간편하기는 하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다.

한편, ELISA 법 또는 RIA 법을 사용한 경우에는, 배양 상청을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 추가로 제 2 차 항체로서 각종 이뮤노 글로불린 아이소타입, 서브클래스에 대응하는 항체를 사용함으로써, 모노클로날 항체의 아이소타입, 서브클래스를 동정할 수 있다.

또한, 더욱 간편한 방법으로서, 시판되는 동정용 키트 (예를 들어, 마우스 타이퍼 키트 ; 바이오래드사 제조) 등을 이용할 수도 있다.

또한, 단백질의 정량은 폴린로우리법, 및 280 ㎚ 에 있어서의 흡광도 [1.4 (OD280) ＝ 이뮤노 글로불린 1 ㎎/㎖] 로부터 산출하는 방법에 의해 실시할 수 있다.

(3) 그 밖의 항체

본 발명의 항체에는, 상기 Siglec-15 에 대한 모노클로날 항체에 추가하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합시킨 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조). 래트 항마우스 항체 #32A1 유래의 키메라 항체의 일례로서, 배열표의 배열 번호 41 의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄, 및 배열 번호 43 의 21 내지 237 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해 CDR 의 배열에 추가하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제공개 팜플렛 WO90/07861호) 를 들 수 있다. 래트 항체 #32A1 의 인간화 항체의 실례로는, 배열표의 배열 번호 51 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 53 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 55 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 57 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 59 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 99 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 101 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기, 또는 배열 번호 72 내지 77 에 기재된 어느 하나의 아미노산 배열의 1 내지 121 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄, 및 배열 번호 61 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 63 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 65 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 67 의 21 내지 132 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 69 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 71 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 103 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기, 배열 번호 105 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기, 또는 배열 번호 78 내지 96 중 어느 하나에 기재된 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄의 임의의 조합을 들 수 있다.

바람직한 조합으로는, 배열 번호 51 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 61 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 53 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 63 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 55 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 65 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 55 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 67 의 21 내지 132 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 57 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 69 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 59 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 71 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 99 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 69 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 101 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 69 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 99 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 103 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체, 또는 배열 번호 99 의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 배열 번호 105 의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

더욱 바람직한 조합으로는, 배열 번호 51 의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 61 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 53 의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 63 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 55 의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 65 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 55 의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 67 의 21 내지 237 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 57 의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 69 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 59 의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 71 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 99 의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 69 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 101 의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 69 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 배열 번호 99 의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 103 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체, 또는 배열 번호 99 의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중쇄 및 배열 번호 105 의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경쇄로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

단, #32A1 항체 유래의 인간화 항체로는, #32A1 의 6 종 전부의 CDR 배열을 유지하고, 파골 세포의 형성을 억제하는 활성을 갖는 한, 상기한 인간화 항체에 한정되지 않는다. 또, #32A1 항체의 중쇄 가변 영역은 배열 번호 44 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1 (DYFMN), 배열 번호 45 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (QIRNKIYTYATFYAESLEG) 또는 배열 번호 97 에 나타내는 CDRH2 (QIRNKIYTYATFYA) 중 어느 하나, 및 배열 번호 46 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (SLTGGDYFDY) 을 보유하고 있다. 배열 번호 45 에 나타내는 CDRH2 는 Kabat 의 정의 (SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL.I, FIFTH EDTION (1991)) 에 따른 것이다. 배열 번호 97 에 나타내는 CDRH2 에서는, C 말단이 Kabat 의 정의보다 5 잔기 단축되어 있다. 이 CDRH2 를 포함하는 중쇄 배열에 있어서는, 래트 유래의 CDR 배열을 저감하고 인간 프레임 워크 배열을 보다 많이 도입하고 있기 때문에, 인간에게 투여했을 때에 이종 항원으로서 한층 더 인식되기 어렵다. 또한, #32A1 항체의 경쇄 가변 영역은 배열 번호 47 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (RASQSVTISGYSFIH), 배열 번호 48 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (RASNLAS), 및 배열 번호 49 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 (QQSRKSPWT) 을 보유하고 있다.

본 발명의 항체로는, 추가로 인간 항체를 들 수 있다. 항 Siglec-15 인간 항체란, 인간 염색체 유래 항체의 유전자 배열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 Siglec-15 인간 항체는 인간 항체의 중쇄와 경쇄의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 생성 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143,; Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999.; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조) 에 의해 취득할 수 있다.

이러한 인간 항체 생성 마우스는, 구체적으로는, 내재성 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 개재하여 인간 면역 글로불린 중쇄 및 경쇄의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물을, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조, 및 이들 동물끼리를 교배시킴으로써 제조할 수 있다.

또한, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 그 cDNA 를 포함하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환시키고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 생성하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 이 항체를 배양 상청 중으로부터 얻을 수도 있다.

여기서, 숙주로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.

또한, 인간 항체 라이브러리로부터 선별된 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative 0phthalmology ＆ Visual Science. (2002) 43 (7), p.2301-2308 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p.189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p.427-431 등 참조) 도 알려져 있다.

예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 본쇄 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시키고, 항원에 결합되는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.

항원에 결합됨으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합되는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있다.

항원에 결합되는 scFv 의 DNA 배열이 밝혀지면, 당해 배열을 갖는 발현 벡터을 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (WO92/01047호, WO92/20791호, WO93/06213호, WO93/11236호, WO93/19172호, WO95/01438호, WO95/15388호, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p.1105-1116).

이상의 방법에 의해서 얻어진 항체는 실시예 25 에 나타낸 방법 등에 의해서 항원에 대한 결합성을 평가하여, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체의 성질을 비교할 때의 별도 지표의 일례로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 실시예 33 에서 나타낸 시차 주사 열량계 (DSC) 는 단백의 상대적 구조 안정성이 양호한 지표가 되는 열변성 중점 (Tm) 을 신속하고 또한 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC 를 사용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열 안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은 항체의 열 안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있어 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273), 열 안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량 (收量) 이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 반드시 가장 높은 열 안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에서 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하고, 인간에 대한 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.

또한, 항체의 중쇄 및 경쇄의 전장 배열을 적절한 링커를 사용하여 연결하고, 1 본쇄 이뮤노 글로불린 (single chain immunoglobulin) 을 취득하는 방법도 알려져 있다 (Lee, H-S, et. al., Molecular Immunology (1999) 36, p.61-71 ; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p.1-4). 이러한 1 본쇄 이뮤노 글로불린은 2 량체화함으로써, 본래에는 4 량체인 항체와 유사한 구조와 활성을 유지하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 항체는 단일의 중쇄 가변 영역을 갖고, 경쇄 배열을 갖지 않는 항체이어도 된다. 이러한 항체는 단일 도메인 항체 (single domain antibody : sdAb) 또는 나노바디 (nanobody) 라고 불리고 있고, 실제로 낙타 또는 라마에서 관찰되며, 항원 결합능이 유지되어 있는 것이 보고되어 있다 (Muyldemans S. et. al., Protein Eng. (1994) 7 (9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). 상기 항체는 본 발명에 있어서의 항체의 기능성 단편의 일종으로 해석하는 것도 가능하다.

또한, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당사슬 수식을 조절함으로써, 항체 의존성 세포 장애 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항체의 당사슬 수식의 조절 기술로는, WO99/54342호, WO00/61739호, WO02/31140호 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.

항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄 배열을 코드하는 유전자, 및 경쇄 배열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중쇄 배열 유전자와 경쇄 배열 유전자는 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 각각 별개의 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다. 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 동물 세포로는, (1) 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) 나 차이니즈 햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220) 를 들 수 있다. 또 원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다. 이들 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 이상의 배양법에 있어서는 항체의 배열에 따라서 수량이 상이한 경우가 있어, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체의 아이소타입으로서의 제한은 없고, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 또는 IgE 등을 들 수 있는데, 바람직하게는 IgG 또는 IgM, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 들 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 항체의 항원 결합부를 갖는 항체의 기능성 단편 또는 그 수식물이어도 된다. 항체를 파파인, 펩신 등의 단백질 분해 효소로 처리하거나, 또는 항체 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 개변시키고 적당한 배양 세포에 있어서 발현시킴으로써, 그 항체의 단편을 얻을 수 있다. 이와 같은 항체 단편 중에서, 항체 전장 분자가 갖는 기능의 전부 또는 일부를 유지하고 있는 단편을 항체의 기능성 단편이라고 부를 수 있다. 항체의 기능으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증강시키는 활성, 항체 의존성 세포 장해 활성, 보체 (補體) 의존성 세포 상해 활성 및 보체 의존성 세포성 세포 상해 활성을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체의 기능성 단편이 유지하는 기능은 Siglec-15 에 대한 결합 활성이고, 바람직하게는 파골 세포의 형성을 억제하는 활성이고, 보다 바람직하게는 파골 세포의 세포 융합의 과정을 억제하는 활성이다.

예를 들어, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 중쇄 및 경쇄의 Fv 를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv (scFv), diabody (diabodies), 선형 항체, 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 들 수 있다. 또한, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 단편에 포함된다.

또한, 본 발명의 항체는 적어도 2 종류의 상이한 항원에 대하여 특이성을 갖는 다특이성 항체이어도 된다. 통상적으로 이와 같은 분자는 2 개의 항원에 결합하는 것이지만 (즉, 2 중 특이성 항체 (bispecific antibody)), 본 발명에 있어서의 「다특이성 항체」는 그 이상 (예를 들어, 3 종류) 의 항원에 대하여 특이성을 갖는 항체를 포함하는 것이다.

본 발명의 다특이성 항체는 전장으로 이루어지는 항체, 또는 그러한 항체의 단편 (예를 들어, F(ab')2 2 중 특이성 항체) 이어도 된다. 2 중 특이성 항체는 2 종류의 항체의 중쇄와 경쇄 (HL 쌍) 를 결합시켜 제조할 수도 있고, 상이한 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 융합시켜, 2 중 특이성 항체 생성 융합 세포를 제조함으로써도 제조할 수 있다 (Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539).

본 발명의 항체는 1 본쇄 항체 (scFv 로도 기재한다) 이어도 된다. 1 본쇄 항체는 항체의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역을 폴리펩티드의 링커로 연결시킴으로써 얻어진다 (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg 및 Moore 편저, Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). 또한, 2 개의 scFv 를 폴리펩티드 링커로 결합시켜 제조되는 BiscFv 단편을 2 중 특이성 항체로서 사용할 수도 있다.

1 본쇄 항체를 제조하는 방법은 당기술 분야에 있어서 주지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,455,030호 등을 참조). 이 scFv 에 있어서, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 콘주게이트를 만들지 않는 링커, 바람직하게는 폴리펩티드 링커를 통해서 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p.5879-5883). scFv 에 있어서의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 동일한 항체에서 유래해도 되고, 별개의 항체에서 유래해도 된다.

가변 영역을 연결시키는 폴리펩티드 링커로는, 예를 들어 12 ∼ 19 잔기로 이루어지는 임의의 1 본쇄 펩티드가 사용된다.

scFv 를 코드하는 DNA 는 상기 항체의 중쇄 또는 중쇄 가변 영역을 코드하는 DNA, 및 경쇄 또는 경쇄 가변 영역을 코드하는 DNA 중, 그들의 배열 중 전부 또는 원하는 아미노산 배열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 PCR 법에 의해 증폭시키고, 이어서, 다시 폴리펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA, 및 그 양단이 각각 중쇄, 경쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머 쌍을 조합하여 증폭시킴으로써 얻어진다.

또한, 일단 scFv 를 코드하는 DNA 가 제조되면, 그것들을 함유하는 발현 벡터, 및 그 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또한 그 숙주를 사용함으로써, 통상적인 방법에 따라 scFv 를 얻을 수 있다. 이들 항체 단편은 상기와 동일하게 하여 유전자를 취득하고 발현시키며, 숙주에 의해 생성시킬 수 있다.

본 발명의 항체는 다량화되고 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화되는 항체로는, 1 종류의 항체이어도 되고, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체이어도 된다. 항체를 다량화하는 방법으로는, IgG CH3 도메인과 2 개의 scFv 의 결합, 스트렙트아비딘과의 결합, 헤릭스턴-헤릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체는 아미노산 배열이 상이한 복수 종류의 항 Siglec-15 항체의 혼합물인 폴리클로날 항체이어도 된다. 폴리클로날 항체의 일례로는, CDR 이 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로날 항체로는, 상이한 항체를 생성하는 세포의 혼합물을 배양하고, 그 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다 (WO2004/061104호 참조).

항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합된 항체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체는 또한 이들 항체와 그 밖의 약제가 콘주게이트를 형성하고 있는 것 (Immunoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합되어 있는 것을 들 수 있다 (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146).

얻어진 항체는 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있는데 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.

크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.

이들 크로마토그래피는 HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.

어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다.

예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (파르마시아) 등을 들 수 있다.

또한 항원을 고정화시킨 담체를 사용하고, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.

4. 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약

상기 서술한 「3. 항 Siglec-15 항체의 제조」의 항에 기재된 방법으로 얻어지는 항 Siglec-15 항체 중에서, Siglec-15 의 생물 활성을 중화시키는 항체를 얻을 수 있다. 이들 Siglec-15 의 생물 활성을 중화시키는 항체는 생체 내에서의 Siglec-15 의 생물 활성, 즉, 파골 세포의 분화 및/또는 성숙을 저해하는 점에서, 의약으로서, 파골 세포의 분화 및/또는 성숙 이상에서 기인하는 골대사 이상에 대한 치료 및/또는 예방제로서 사용할 수 있다. 골대사 이상은 정미의 골상실 (골감소증 또는 골용해증) 에 의해 특징지어지는 어떠한 장해이어도 된다. 일반적으로, 항 Siglec-15 항체에 의한 치료 및/또는 예방은 골흡수를 억제할 필요가 있는 경우에 적용된다. 항 Siglec-15 항체로 치료 및/또는 예방할 수 있는 골대사 이상으로는, 골다공증 (폐경후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증), 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거대세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골파제트병, 신성 골이영양증, 골형성 부전증 등을 들 수 있는데, 파골 세포에 의한 정미의 골상실을 수반하는 질환이면, 이들에 한정되지 않는다. 상기 의약으로서의 항 Siglec-15 항체의 예로서, #32A1 항체로부터 3. (3) 「그 밖의 항체」에 기재된 방법에 의해 제조된 키메라 항체 또는 인간화 항체를 들 수 있다. 또한, #32A1 항체와 동일한 에피토프를 갖는 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체도 의약으로서 사용 가능하다. 어느 항 Siglec-15 항체가 #32A1 항체와 동일한 에피토프를 갖는 것은, Siglec-15 의 특정 부분 펩티드에 대하여 이들 항체가 공통으로 결합되는지 아닌지를 관찰함으로써 확인할 수 있다. 또한, 어느 항 Siglec-15 항체가 Siglec-15 와의 결합에 있어서 #32A1 항체와 경합하는 것이면, 이들 항체가 공통의 에피토프를 갖는다고 판정할 수 있다.

in vitro 에서의 항 Siglec-15 항체에 의한 Siglec-15 의 생물 활성의 중화 활성은 예를 들어, Siglec-15 를 과잉 발현시키고 있는 세포의 파골 세포로의 분화 억제 활성에 의해 측정할 수 있다. 예를 들어, 마우스 단구 유래 세포주 RAW264.7 세포 또는 RAW264 세포에 여러 가지 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL 또는 TNF-α 자극에 의한, 파골 세포로의 분화 억제 활성을 측정할 수 있다. 또한, 골수 유래의 초대 배양 세포에 여러 가지 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL, TNF-α 또는 활성형 비타민 D₃ 자극에 의한, 파골 세포로의 분화 억제 활성을 측정할 수 있다. 또한, 정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입 가능, 카탈로그 번호 2T-110) 에 여러 가지 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고, RANKL 및 M-CSF 자극에 의한, 파골 세포로의 분화 억제 활성을 측정할 수 있다. 이와 같은 파골 세포의 분화 억제 효과는 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성의 억제를 지표로 하여 측정할 수 있다. 또한, TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성 억제, 즉 파골 세포의 세포 융합 억제를 지표로 하여도, 파골 세포의 분화 억제 효과를 측정할 수 있다. 그리고, 대퇴골 및/또는 경골 유래의 세포를 사용한 피트 어세이 (Takada et al., Bone and Mineral, (1992) 17, 347-359) 실험에 있어서, 대퇴골 및/또는 경골 유래의 세포에 여러 가지 농도로 항 Siglec-15 항체를 첨가하고 상아 절편 상의 피트의 형성을 관찰함으로써, in vitro 에 있어서의 파골 세포에 의한 골흡수의 억제 활성을 측정할 수 있다. in vitro 에 있어서의 파골 세포에 의한 골흡수의 억제 활성의 측정계로는, 유로퓸이 결합된 인간 콜라겐을 코팅한 플레이트를 사용할 수도 있다. in vivo 에서의 실험 동물을 이용한 항 Siglec-15 항체의 골대사 이상에 대한 치료 또는 예방 효과는, 예를 들어, 골다공증 모델 동물 또는 Siglec-15 를 과잉으로 발현하고 있는 트랜스제닉 동물에게 항 Siglec-15 항체를 투여하고, 파골 세포의 변화를 측정함으로써 확인할 수 있다.

이와 같이 하여 얻어진 Siglec-15 의 생물 활성을 중화시키는 항체는, 의약으로서, 특히 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암의 골전이에 수반되는 골파괴 등의 골대사 이상의 치료 또는 예방을 목적으로 한 의약 조성물로서, 또는 이와 같은 질환의 면역학적 진단을 위한 항체로서 유용하다.

관절 류머티즘 (RA) 의 치료에 있어서, 질환의 발증에 수반되어 발생하는 골상실이 큰 과제가 되고 있다. RA 에 수반되는 이 골상실에 있어서는, 파골 세포가 중심적인 역할을 하고 있다는 것이 보고되어 있다. RA 에 있어서의 파골 세포의 유도 (분화, 성숙), 활성화, 및 골파괴의 원인으로서 가장 중요한 것으로 생각되고 있는 사이토카인은 RANKL 과 TNF-α 이다 (Romas E et al., Bone 30, p340-346, 2002). RANKL 의 디코이 리셉터인 OCIF/OPG 에서는 RANKL 에 의해 유도되는 파골 세포 형성은 억제할 수 있지만, TNF-α 에 의해 유도되는 파골 세포 형성은 억제되지 않는다. 그 한편으로, 본 발명에 있어서의 항 Siglec-15 항체에 의해, RANKL 에 의해 유도되는 파골 세포 형성과 TNF-α 에 의해 유도되는 파골 세포 형성의 양방이 효과적으로 억제되었다. 따라서, 본 발명의 항 Siglec-15 항체에 의해, RA 등에 있어서의 TNF-α 에 의해 유도되는 골상실과 골파괴가 RANKL 블로커 (OCIF/OPG, 항 RANKL 항체 등) 이상으로 강력하게 억제할 수 있는 것이 기대된다.

항 Siglec-15 항체는, 하나의 예로는, 골대사 이상의 치료 또는 예방에 대해서는 그 항체 단독으로, 또는 적어도 하나의 다른 골질환 치료제와 병용하여 투여할 수 있다. 또 하나의 예로서, 항 Siglec-15 항체는 치료상 유효한 양의 항골대사 이상 치료 약제와 병용하여 투여할 수 있다. 항 Siglec-15 항체와 병용하여 투여할 수 있는 치료제로는, 비스포스포네이트 (예를 들어, alendronate, etidronate, ibandronate, incadronate, pamidronate, risedronate, 또는 zoledronate), 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (Selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제 (예를 들어, celecoxib 또는 rofecoxib), 가용성 TNF 리셉터 (예를 들어, etanercept), 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 (예를 들어, infliximab), 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트 (예를 들어 anakinra), 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 (예를 들어, tocilizumab), 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 (예를 들어, denosumab), 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 등을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다. 골대사 이상의 상태나 어느 정도의 치료 및/또는 예방을 목표로 하는지에 따라, 2, 3 혹은 그 이상의 종류의 약제를 투여할 수도 있고, 그들 약제는 동일한 제제 중에 봉입함으로써 동시에 공급할 수 있다. 그들 약제와 항 Siglec-15 항체는 동일한 제제 중에 봉입함으로써 동시에 공급할 수도 있다. 또한, 그들 약제는 치료 및/또는 예방용 키트로서 봉입함으로써 동시에 공급할 수도 있다. 또한, 그들 약제와 항 Siglec-15 항체는 따로 공급할 수도 있다. 유전자 치료에 있어서 투여하는 경우에는, 단백질성의 골질환 치료제의 유전자와 항 Siglec-15 항체의 유전자는 별개의 또는 동일한 프로모터 영역의 하류에 삽입할 수 있고, 별개의 혹은 동일한 벡터에 도입할 수 있다.

항 Siglec-15 항체, 혹은 그 프래그먼트에 대하여 골질환 치료제를 결합시킴으로써, M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates : principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216 에 기재된 표적형 약물 복합체를 제조할 수 있다. 이 목적으로는, 항체 분자 외에, 파골 세포의 인식성을 완전 소실하지 않는 한, 어느 항체 프래그먼트도 적용할 수 있지만, 예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 등의 프래그먼트를 예로서 들 수 있고, 본 발명에 있어서도 동일하게 항체 및 그 프래그먼트를 사용할 수 있다. 항 Siglec-15 항체 또는 그 항체의 프래그먼트와 골질환 치료제의 결합 양식은 M. C. Garnet 「Targeted drug conjugates : principles and progress」, Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 등에 기재되는 각종 형태가 있을 수 있다. 즉, 항 Siglec-15 항체와 골질환 치료제가 화학적으로 직접 또는 올리고펩티드 등의 스페이서가 개재되어 결합되는 양식이나, 적당한 약물 담체를 개재하여 결합되는 양식을 들 수 있다. 약물 담체의 예로는, 리포솜이나 수용성 고분자를 들 수 있다. 이들 약물 담체가 개재되는 양식으로는, 보다 구체적으로는, 항체와 골질환 치료제가 리포솜에 포함되고, 그 리포솜과 항체가 결합된 양식, 및 골질환 치료제가 수용성 고분자 (분자량 1000 내지 10 만 정도의 화합물) 에 화학적으로 직접 또는 올리고펩티드 등의 스페이서를 개재시켜 결합되고, 그 수용성 고분자에 항체가 결합된 양식을 예로서 들 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 골질환 치료제, 리포솜 및 수용성 고분자 등의 약물 담체의 결합은 G. T. Hermanson 「Bioconjugate Techniques」Academic Press, California (1996), Putnam and J. Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 에 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 골질환 치료제의 리포솜으로의 포함은 D. D. Lasic 「Liposomes : From Physics to Applications」, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993) 등에 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 골질환 치료제의 수용성 고분자에 대한 결합은 D. Putnam and J Kopecek 「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 에 기재된 방법 등의 당업자에게 주지된 방법에 의해 실시할 수 있다. 항체 (또는 그 프래그먼트) 와 단백질성의 골질환 치료제 (또는 그 프래그먼트) 의 복합체는, 상기한 방법 외에, 유전자 공학적으로, 당업자에게 주지된 방법에 의해 제조할 수 있다.

본 발명은 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 항 Siglec-15 항체와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유하는 의약 조성물도 제공한다.

본 발명은 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 항 Siglec-15 항체와 치료 및/또는 예방에 유효한 양의 적어도 1 개의 골질환 치료제와 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유하는 의약 조성물도 제공한다. 골질환 치료제로는, 비스포스포네이트 (예를 들어, alendronate, etidronate, ibandronate, incadronate, pamidronate, risedronate, 또는 zoledronate), 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌 및 그 유도체, 에스트라디올 등의 호르몬, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제 (예를 들어, celecoxib 또는 rofecoxib), 가용성 TNF 리셉터 (예를 들어, etanercept), 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 (예를 들어, infliximab), 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트 (예를 들어 anakinra), 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 (예를 들어, tocilizumab), 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편 (예를 들어, denosumab), 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 등을 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서 허용되는 제제에 사용하는 물질로는 바람직하게는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물이 투여되는 사람에 대하여 비독성인 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은 pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 안정성, 용해율, 서방률 (徐放率), 흡수율, 침투율을 변경하거나, 유지하거나 하기 위한 제제용 물질을 함유할 수 있다. 제제용 물질로서 이하의 것을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않는다 : 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-HCl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민 4아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 2 당류 등의 기타 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌·글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알코올, 현탁제, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20 이나 폴리소르베이트 80 등의 폴리소르베이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨·소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제. 이들 제제용 물질의 첨가량은 항 Siglec-15 항체의 중량에 대하여 0.01 ∼ 100 배, 특히 0.1 ∼ 10 배 첨가하는 것이 바람직하다. 제제 중의 바람직한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

의약 조성물 중의 부형제나 담체는 액체이어도 되고 고체이어도 된다. 적당한 부형제나 담체는 주사용의 물이나 생리 식염수, 인공 뇌 척수액이나 비경구 투여에 통상적으로 사용되고 있는 그 밖의 물질이어도 된다. 중성의 생리 식염수나 혈청 알부민을 함유하는 생리 식염수를 담체에 사용할 수도 있다. 의약 조성물에는 pH 7.0 - 8.5 의 Tris 버퍼나 pH 4.0 - 5.5 의 아세트산 버퍼, pH 3.0 - 6.2 의 시트르산 버퍼를 함유할 수 있다. 또한, 이들 버퍼에 소르비톨이나 그 밖의 화합물을 함유할 수도 있다. 본 발명의 의약 조성물에는 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약 조성물 그리고, 항 Siglec-15 항체 및 적어도 1 개의 골질환 치료제를 함유하는 의약 조성물을 들 수 있으며, 본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 약제로서, 동결 건조품 또는 액체로서 준비된다. 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약 조성물 그리고, 항 Siglec-15 항체 및 적어도 1 개의 골대사 이상 치료 약제를 함유하는 의약 조성물은 수크로오스와 같은 적당한 부형제를 사용한 동결 건조품으로서 성형될 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물은 비경구 투여용으로 조제할 수도 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다. 제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 결정할 수 있으며, 본 발명의 의약 조성물에 함유되는 항 Siglec-15 항체의 Siglec-15 에 대한 친화성, 즉, Siglec-15 에 대한 해리 상수 (Kd 값) 에 대하여, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 인간에 대한 투여량을 적게 하여도 약효를 발휘할 수 있으므로, 그 결과에 기초하여 본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여량을 결정할 수도 있다. 투여량은, 인간형 항 Siglec-15 항체를 인간에 대하여 투여할 때에는, 약 0.1 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 ∼ 180 일 동안에 1 회 투여하면 된다.

본 발명의 의약 조성물의 형태로는, 점적을 포함하는 주사제, 좌제, 경비제 (經鼻劑), 설하제 (舌下劑), 경피 흡수제 등을 들 수 있다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」(Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 로부터 1989 년에 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라서 사용하였다.

실시예 1

가용형 마우스 Siglec-15 단백질의 발현 컨스트럭트의 제조

마우스 Siglec-15 단백질의 세포외 영역을 코드하는 부분의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 5 이고, 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 6 이다. 이러한 부분 배열을 이용함으로써, 동물 세포 등의 배양 상청 중에 가용형 마우스 Siglec-15 단백질을 생성시킬 수 있다.

a) 가용형 마우스 Siglec-15 유전자의 PCR 에 의한 증폭

마우스 Siglec-15 의 세포외 영역 cDNA 를 PCR 에 의해 증폭시키기 위한 프라이머로서

5'-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAG GGGTCCCTCC AACTC-3' (mSiglec-15-ECD-F : 배열표의 배열 번호 7) 및

5'-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGC GGAAC-3' (mSiglec-15-ECD-R : 배열표의 배열 번호 8),

의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라서 합성하였다. 또한, 이들 프라이머는 Gateway 엔트리 클론 제조용 증폭용 프라이머로서, mSiglec-15-ECD-F 에는 attB1 배열이 mSiglec-15-ECD-R 에는 attB2 배열이 부가되도록 설계하였다. 이 프라이머의 조합과, 템플릿으로서 마우스 Siglec-15 의 오픈 리딩 프레임 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 통상적인 방법에 따라서 PCR 을 실시하였다. 서멀 사이클러의 설정 조건은, 94 ℃ 에서 5 분간 가열한 후, 「94 ℃ 에서 0.5 분, 55 ℃ 에서 0.5 분, 68 ℃ 에서 1.5 분」의 온도 사이클을 15 회 반복하고 나서, 68 ℃ 에서 5 분 가열하고, 4 ℃ 에서 보온으로 하였다.

b) Gateway BP 반응에 의한 엔트리 클론의 제조

λ 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 응용한 Gateway 테크놀로지 (인비트로젠사) 에 의해, 마우스 Siglec-15 세포외 영역의 cDNA 를 삽입한 엔트리 클론을 이하의 방법으로 제조하였다. 먼저 a) 에서 제조한, attB 배열을 양단에 갖는 PCR 산물과, attP 배열을 갖는 도너 벡터인 pDNOR221 (인비트로젠사 제조) 사이에서, BP 클로나아제를 사용한 BP 반응을 실시하였다. 이 반응액을 사용하여 대장균 DH10B 를 형질 전환시키고, 약제 내성 클론에 대하여 콜로니 PCR 을 실시하여, 인서트 사이즈를 확인하였다. 인서트의 사이즈가 올바르게 확인된 클론에 대해, 인서트의 전체 DNA 배열의 시퀀스 해석을 실시한 결과, 목적으로 하는 마우스 Siglec-15 단백질의 세포외 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열 (배열표의 배열 번호 5) 과 완전히 일치하는 엔트리 클론이 얻어졌다.

c) Gateway LR 반응에 의한 발현 클론의 제조

λ 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 응용한 Gateway 테크놀로지 (인비트로젠사) 에 의해, 마우스 Siglec-15 세포외 영역의 cDNA 를 삽입한 발현 클론을 이하의 방법으로 제조하였다. b) 에서 제조한 엔트리 클론은 인서트의 양단에 attL 배열을 갖고 있다. 이 엔트리 클론과 attR 배열을 갖는 2 종류의 데스티네이션 벡터와의 사이에서 LR 클로나아제를 사용한 LR 반응을 실시하였다. 또한 데스티네이션 벡터는, 인서트의 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가되도록 설계된 pDONM, 및 인서트의 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가되도록 설계된 phIgFc 의 2 종류를 사용하였다. LR 반응에 의해 얻어진 반응액을 사용하여 대장균 DH10B 를 형질 전환시키고, 얻어진 약제 내성 클론에 대하여 콜로니 PCR 을 실시하여, 인서트 사이즈를 확인하였다. 인서트의 사이즈가 올바르게 확인된 클론에 대해, 인서트측에서부터 벡터측으로의 양 말단의 시퀀스 해석을 실시하였다.

시퀀스용 프라이머 배열 :

5'-tgcgtgaagg tgcagggcag-3' (mSiglec-15-ECD-seq-upstm : 배열표의 배열 번호 9) 및

5'-cctcgcctgg tcgggtc-3' (mSiglec-15-ECD-seq-dnstm : 배열표의 배열 번호 10)

시퀀스 해석의 결과, pDONM 및 phIgFc 의 양방에서 올바르게 재조합된 발현 클론 (가용형 마우스 Siglec-15/pDONM 및 가용형 마우스 Siglec-15/phIgFc) 이 각각 얻어졌다. 가용형 마우스 Siglec-15/pDONM 을 동물 세포 등에 트랜스펙션함으로써, 배열표의 배열 번호 11 에 기재된 염기 배열을 갖는 mRNA 가 전사되고, 배열표의 배열 번호 12 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 이 번역된다. 가용형 마우스 Siglec-15/phIgFc 를 동물 세포 등에 트랜스펙션함으로써, 배열표의 배열 번호 13 에 기재된 염기 배열을 갖는 mRNA 가 전사되고, 배열표의 배열 번호 14 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질 (마우스 Siglec-15-Fc) 이 번역된다.

실시예 2

293-F 세포를 사용한 가용형 마우스 Siglec-15 단백질 함유 배양액의 대량 조제

실시예 1 에서 얻어진 2 종류의 발현 벡터 (가용형 마우스 Siglec-15/pDONM 및 가용형 마우스 Siglec-15/phIgFc) 를 각각 약 5 ㎎ 조제하였다. 또한, 대량 배양된 대장균으로부터의 플라스미드 정제에는, 인비트로젠 PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하였다. 조제한 플라스미드를 Opti-MEM (인비트로젠사 제조) 과 혼합하고, 필터 멸균시킨 후 트랜스펙션 시약인 293 fectin (인비트로젠사 제조) 을 10 ㎖ 첨가하여 실온에서 20 분간 인큐베이션하였다. 이 혼화액을, FreeStyle 293 Expression Medium (인비트로젠사 제조) 중에서 1.1 × 10⁶ 세포/㎖ × 5 ℓ (1 ℓ/플라스크를 5 개) 가 되도록 얼렌마이어 플라스크 중에서 배양한 FreeStyle 293-F 세포 (인비트로젠사 제조) 에 첨가하였다. 8.0 ％ CO₂ 농도, 37 ℃ 에서 96 시간 (4 일간) 회전 배양 (125 회전/분) 한 후 배양액을 회수하여, 원심 분리 후 배양 상청을 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 배양 상청 중에는, 마우스 Siglec-15 의 세포외 영역 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가된 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 및 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가된 단백질 (마우스 Siglec-15-Fc) 이 각각 발현되는 것으로 생각된다.

실시예 3

마우스 Siglec-15-His 의 정제

a) HisTrap HP 칼럼 크로마토그래피

실시예 2 에서 조제한 마우스 Siglec-15-His 발현 293F 세포의 배양액 2 ℓ 에 225 ㎖ 의 10 x buffer (500 mM Tris, 1.5 M NaCl, 200 mM Imidazole, pH 8.0) 를 첨가하여 잘 교반한 후에 Sterivex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과하였다. 이 배양액을, 미리 파이로젠 제거제·PyroCLEAN (ALerCHEK 사 제조) 으로 처리하고 주사용 증류수로 세정해 둔 HisTrap HP 5 ㎖ 의 3 개 직렬 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 2 ㎖/min 으로 적용시켰다. 300 mM NaCl 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 60 ㎖ 를 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 50 ㎖ 를 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은 미리 10 ％ Tween 20 10 ㎕ 를 첨가해 둔 Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 1 ㎖/Fr. 로 분취하였다. 용출된 단백질을 함유하는 획분 약 20 ㎖ (Fr.14-20) 를 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.5 ㎖ 로 농축시킨 후, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (T-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 적용시키고, T-PBS 로 용출시켜, 용매를 T-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다.

b) Resource Q 칼럼 크로마토그래피

HisTrap HP 칼럼 크로마토그래피로 정제한 TBS-P 치환 샘플 3.5 ㎖ 에 0.1 ％ CHAPS 를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 22.5 ㎖ 를 첨가하여 교반한 후, 4 ℃, 3,000 r.p.m. 으로 30 분간 원심시켜 침전물을 제거하였다. 이 상청액을 Millex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 0.1 ％ CHAPS 를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 Resource Q 6 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 1 ㎖/min 으로 적용시키고, 계속해서 이 완충액을 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼을 세정하여, 칼럼에 흡착되지 않는 단백질 획분을 모았다. 칼럼에 흡착된 단백질은 0.1 ％ CHAPS, 1 M NaCl 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 을 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 용출시켰다. 칼럼에 흡착되지 않은 획분 26.5 ㎖ 를, 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.0 ㎖ 로 농축시킨 후, 4 ℃, 3,000 r.p.m. 으로 10 분간 원심시켜 침전물을 제거하였다. 원심 후의 상청액은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다. 이상의 정제 조작 (HisTrap HP 칼럼 크로마토그래피, Resource Q 칼럼 크로마토그래피) 을 2 회 반복 실시하였다.

c) 정제된 마우스 Siglec-15-His 의 검출과 순도 검정

상기한 정제 조작 (HisTrap HP 칼럼 크로마토그래피, Resource Q 칼럼 크로마토그래피) 에 의해 조제된 샘플을 사용하여 환원 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 열처리하였다. 열처리한 각 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동의 겔로서 8-25 ％ 폴리아크릴아미드 그래디언트 겔 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 을 사용하고, 전기 영동은 PhastSystem (아머샴 바이오사이언스사 제조) 을 사용하여 실시하였다. 또한 분자량 마커로서 레인보우 분자량 마커 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용하였다. 전기 영동 종료 후에 PhastGel Silver Kit (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 PhastSystem 을 사용하여 은 염색을 실시하고, 그 결과를 도 1 에 나타냈다. Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분에 분자량 약 35 kDa 의 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.

분자량 마커로서 ECL DualVue Western Blotting Markers (아머샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용한 것 이외에는 상기와 동일한 조건에서 전기 영동한 겔 중의 단백질을, PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 PhastSystem 을 사용하여 PVDF 막 (Hybond-P, 아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 전사 (블롯) 하였다. 이 PVDF 막을 0.1 ％ Tween 20 을 함유하는 블로킹제 (BlockAce, 유키지루시 유업사 제조) 10 ㎖ 중 실온에서 1 시간 천천히 진탕하였다. 이 블로킹 용액에 S-protein HRP (아머샴 바이오사이언스사) 10 ㎕ 와 항 V5-HRP 항체 (Monoclonal Antibody to Pk-TAG-HRP, Acris Antibodies 사 제조) 10 ㎕ 를 첨가하고, 추가로 실온에서 1 시간 천천히 진탕하였다. PVDF 막을 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 50 ㎖ 중에서 천천히 진탕하면서 5 분간 4 회 세정하였다. 세정 후 이 PVDF 막을 ECL detection kit (아머샴 바이오사이언스사) 의 프로토콜에 따라 처리하고, 단백질의 밴드의 발색을 ECL mini-camera (아머샴 바이오사이언스사) 폴라로이드 필름 (Polapan 3200B, 폴라로이드사) 으로 검출하였다. 결과를 도 2 에 나타냈다. 그 결과로부터도, 항 V5-HRP 항체에 반응하는 분자량 약 35 kDa 의 단백질 (마우스 Siglec-15-His) 이 Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분에 효율적으로 정제 농축되었음을 확인할 수 있었다.

d) 정제된 마우스 Siglec-15-His 의 단백질 농도의 측정

정제 마우스 Siglec-15-His (Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분) 에 대해, 소 혈청 알부민을 표준 샘플로서 사용하여, DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 표 1 에 나타낸 바와 같이, 2 회의 정제 조작으로 합계 1.66 ㎎ 의 정제 마우스 Siglec-15-His 단백질을 얻었다.

실시예 4

마우스 Siglec-15-Fc 의 정제

a) HiTrap protein A 칼럼 크로마토그래피

실시예 2 에서 조제한 마우스 Siglec-15-Fc 발현 293F 세포의 배양액 1.8 ℓ 를 Sterivex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 미리 둘베코 PBS (D-PBS, 인비트로젠사 제조) 로 평형화시켜 둔 HiTrap protein A 5 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 5 ㎖/min 으로 적용시켰다. D-PBS 를 사용하여 유속 5 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3.0) 50 ㎖ 를 사용하여 유속 5 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 5 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 1.3 ㎖ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 용출된 단백질이 검출된 획분 (Fr.1, 2) 을 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 2.5 ㎖ 로 농축시킨 후, 0.01 ％ Tween 20 을 함유하는 오오츠카 주사용 생리 식염수 (TO-SS, 오오츠카 제약사 제조) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 적용시키고 TO-SS 로 용출시켜, 용매를 TO-SS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 이 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다. 2.9 ℓ 의 293F 세포의 배양액을 사용하여, 동일한 정제 조작을 추가로 1 회 반복하여 실시하였다.

b) 정제된 마우스 Siglec-15-Fc 의 검출과 순도 검정

상기한 정제 조작에 의해 조제된 샘플을 사용하여 환원 조건하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 열처리한 각 샘플을 1/2 농도의 SDS-처리액으로 1/300 또는 1/900 배 희석시킨 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동과 은 염색은 실시예 3, c) 에 기재된 마우스 Siglec-15-His 의 순도 검정과 동일한 방법으로 실시하고, 그 결과를 작은 스케일에서의 예비 정제 조건 검토 결과 (어플라이한 배양액의 pH 가 8.9 또는 7.0) 와 함께 도 3 에 나타냈다. HiTrap protein A 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분에 분자량 약 55 kDa 의 단백질 (마우스 Siglec-15-Fc) 이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.

c) 정제된 마우스 Siglec-15-Fc 의 단백질 농도의 측정

정제 마우스 Siglec-15-Fc (PD-10 탈염 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분) 에 대해, 소 혈청 알부민을 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 표 2 에 나타낸 바와 같이, 2 회의 정제 조작으로 합계 92 ㎎ 의 정제 마우스 Siglec-15-Fc 단백질을 얻었다.

실시예 5

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 생성 하이브리도마의 수립

a) 항원의 조제

실시예 3 에서 제조한, 마우스 Siglec-15-His 단백질을 100 ㎍/0.5 ㎖ 가 되도록 조제하고, 아쥬반트를 동량 첨가하여 유리 시린지에서 에멀션을 제조하였다. 또한 아쥬반트는 첫 회 면역시에만 Freund's Complete Adjuvant (FCA, 디프코사 제조) 를 사용하고, 2 회째 이후에는 Freund's Incomplete Adjuvant (FICA, 디프코사 제조) 를 사용하였다.

b) 래트에 대한 면역

래트 (Wistar, 암컷, 6 주령, 일본 쿠레아사로부터 구입) 4 마리를 면역 동물로서 사용하였다. a) 에서 얻어진 에멀션을, 항원량이 50 ㎍/래트가 되도록 피하 및 피내에 27 G 주사 바늘을 사용하여 주사하였다. 이후 7 일마다 합계 4 회의 면역을 실시하였다. 4 회의 면역으로부터 7 일 후에 꼬리 정맥으로부터 소량 (200 ㎕) 채혈하여, 항혈청을 조제하였다. 항혈청의 항체 역가를 확인하기 위해, 항원으로서 사용한 마우스 Siglec-15-His 단백질, 실시예 4 에서 제조한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질, 또는 소 혈청 알부민 (BSA) 을 고상화시킨 ELISA 를 실시하였다. 그 결과, 4 마리의 래트 (래트 No.1 ∼ 4) 중 어느 것에 있어서도 마우스 Siglec-15-His 단백질 및 마우스 Siglec-15-Fc 단백질에 대한 반응성이 인정되었다. 한편, BSA 에 대한 반응성은 인정되지 않았다. 이상으로부터, 면역된 래트의 혈청 중 항체 역가가 상승한 것이 확인되었기 때문에, 항체가가 가장 높았던 No.2 래트에 대해 세포 융합 조작으로 진행시켰다.

c) 세포 융합

세포 융합은 일반적인 마우스 (래트) 비장 세포와 미엘로마 세포의 융합법에 따라 실시하였다. 래트를 에테르 마취하에서 심장으로부터 전체 채혈하여 안락사시키고, 그 후 비장을 적출하였다. 채취한 비장 세포와 마우스 미엘로마 세포인 P3X63Ag8.653 세포 (ATCC CRL 1580) 를, 폴리에틸렌글리콜 (PEC) 을 사용하여 세포 융합시켰다. 96 웰 플레이트에 세포를 파종하고, hypoxanthine (H), aminopterin (A), thymidine (T) 을 함유한 배지 (HAT 선택 배지) 를 첨가하여 7 ∼ 10 일간 배양하였다. 세포 융합된 하이브리도마의 생존이 확인된 61 웰의 배양 상청을 채취하고, 항원으로서 사용한 마우스 Siglec-15-His 단백질, 실시예 4 에서 제조한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질, 또는 BSA 를 고상화시킨 ELISA 로 항체가를 평가하고, 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 생성 하이브리도마를 스크리닝하였다. 스크리닝의 결과로부터, 항체가가 높은 12 웰을 선발하고, 그 중의 하이브리도마를 클로닝 조작으로 진행시켰다.

d) 하이브리도마의 클로닝

선발된 하이브리도마에 대해, 한계 희석법에 의해 1 차 클로닝하였다. 한계 희석 후의 배양은 2 주간 실시하고, 배양 상청 중의 항체가 확인을, 실시예 4 에서 제조한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질 또는 BSA 를 고상화시킨 ELISA 로 실시하였다. 양성 클론으로 확인된 11 클론에 대해, 추가로 2 차 클로닝을 실시 (1 차 클로닝과 동일한 작업) 함으로써, 최종적으로 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 생성 하이브리도마를 10 클론 (#1A1, #3A1, #8A1, #24A1, #32A1, #34A1, #39A1, #40A1, #41B1, #61A1) 수립하였다. 또한, 하이브리도마 #32A1 은 일본 독립행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터 (소재지 : 우편번호 305-8566 일본 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반찌 1 츄오우 다이 6) 에 2008년 8월 28일자로 기탁되어, anti-Siglec-15 Hybridoma #32A1 의 명칭으로 기탁 번호 FERM BP-10999 가 부여되어 있다.

실시예 6

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 조제

a) 누드 마우스 복수 (腹水) 의 조제

실시예 5 에서 수립한 하이브리도마를, 10 ％ FCS 함유 TIL Media Ⅰ ((주) 면역 생물 연구소 제조) 배지를 사용하여 배양하였다. 또한 세포의 계대는 5 × 10⁵ 세포/㎖ 정도로 증식된 시점을 기준으로 4 분의 1 정도로 희석시키는 작업을, 2 ∼ 3 일에 1 번 실시하였다. 프리스탄을 복강 내에 전 (前) 투여 (0.2 ㎖/마우스) 한 누드 마우스에, 배양한 하이브리도마를 1 × 10⁷ 세포/마우스가 되도록 복강 내에 이식하였다. 이식에는, 10 클론의 하이브리도마 각각에 대해 각 3 마리의 누드 마우스를 사용하였다. 이식 후, 복수의 축적이 충분히 관찰된 시점에서 복수를 채취하고, 각 하이브리도마 3 마리분을 1 개로 합쳐 채취량을 측정한 후, 항체의 정제까지 동결 보존하였다. 각 하이브리도마에 대해, 복수의 채취량을 표 3 에 정리하였다.

b) 항체의 정제

채취한 복수의 전체량을, 20 ㎖ 의 Protein G 칼럼 (GE Healthcare 사 제조) 을 사용한 IgG 의 정제에 제공하였다. 정제된 IgG 는 겔 여과 분석 (Superdex 200 칼럼 크로마토그래피) 에 의해 순도 검정을 실시하고, 일부를 원심 막 농축시켰다. 즉, 정제된 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 중, #24A1 항체를 제외한 9 종류의 항체를, 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 를 사용하여 3000 r.p.m., 4 ℃ 에서 30 ∼ 60 분간 원심시킴으로써 약 6 배 ∼ 8 배 농축시켰다. 계속해서, #24A1 항체 및 농축된 기타 9 종류의 항체에 대해, 소 혈청 알부민 (BSA) 을 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay Kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 이상의 조작에 의해, 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체를 조제하였다.

실시예 7

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합성 평가

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합성을 ELISA 법에 의해 평가하였다. 실시예 4 에서 제조한 마우스 Siglec-15-Fc 단백질을 5 ㎍/㎖ 가 되도록 0.1 M 탄산나트륨 버퍼 (pH 9.5) 로 희석시키고, 96 웰 플레이트 (날젠 눙크사 (Nalgene Nunc) 제조, 카탈로그 번호 : 430341) 에 100 ㎕/웰 첨가하였다. 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 용액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 함유 인산염 완충 생리 식염수) 를 첨가하여 제거하였다. 이 세정 작업을 추가로 1 회 실시한 후, 25 ％ 블록 에이스 (다이닛폰 스미토모 제약사 제조) 를 함유하는 인산염 완충 생리 식염수를 200 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 방치시킴으로써 블로킹을 실시하였다. 액을 제거하고 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 2 회 세정한 후, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 또는 래트 컨트롤 IgG (R＆D Systems 사 제조) 를, ELISA 버퍼 (12.5 ％ 블록 에이스, 0.05 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수) 를 사용하여 최종 농도가 1.28 ∼ 20,000 ng/㎖ (5 배 희석 계열) 가 되도록 희석시키고, 100 ㎕/웰 첨가하였다. 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. 계속해서 ELISA 버퍼를 사용하여 1,000 배 희석시킨 HRP (양고추냉이 페록시다아제) 표지 염소 항래트 IgG 항체 (베크맨 콜터사 제조) 를 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 방치시켰다. 액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 3 회 세정한 후, 페록시다아제용 발색 키트 (스미토모 베이크라이트사 제조) 를 사용하여, 키트에 첨부된 설명서에 따라 발색시켰다. 발색 후, 마이크로 플레이트 리더 (니혼 몰레큘러 디바이스사 제조) 를 사용하여 492 ㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 검토한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 10 검체 전부에 있어서, 항체의 농도에 의존한 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합이 확인되었다 (도 4). 한편 래트 컨트롤 IgG 에서는, 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합이 인정되지 않았다.

실시예 8

마우스 골수 비부착 세포의 조제

5 ∼ 8 주령의 수컷 ddY 마우스로부터 대퇴골과 경골을 적출하고, 연조직을 제거하였다. 이 대퇴골 또는 경골의 양단을 잘라내고, 25 게이지의 주사 바늘이 달린 시린지에 의해 D-PBS 를 주입하여 골수 세포를 압출시키고, 원심 튜브에 회수하였다. 실온에서 100 g, 5 분간 원심시켜 상청을 버린 후, 세포의 펠릿에 Hemolytic Buffer 1 ㎖ (RED BLOOD CELL LYSING BUFFER, 시그마사 제조) 를 첨가하여 현탁하고, 실온에서 5 분간 방치시켰다. 20 ㎖ 의 D-PBS 를 첨가하고 실온에서 100 g, 5 분간 원심시켜, 상청을 버린 후에 세포의 펠릿에 5 ng/㎖ M-CSF (R＆D Systems 사 제조), 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS) 을 함유하는 MEM-α 배지 (인비트로젠사 제조) 10 ㎖ 를 첨가하여 현탁하고, 셀 스트레이너 (40 ㎛ Nylon, BD 팔콘사 제조) 를 통과시켜 응집물을 제거하였다. 이 세포를 75 ㎠-T 플라스크 (부착 세포용) 로 옮기고, CO₂ 인큐베이터 중에서 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양 후, T-플라스크에 부착되어 있지 않은 세포를 회수하여, 마우스 골수 비부착 세포로서 사용하였다.

실시예 9

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 마우스 파골 세포 형성 시험에서의 생물 활성 평가

실시예 6 에 있어서 제조한 10 검체 전부의 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체를 사용하여 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향을 검토하였다. 실시예 8 의 방법으로 조제한 마우스 골수 비부착 세포를 10 ％ FBS 와 10 ng/㎖ M-CSF (R＆D Systems 사 제조) 를 함유하는 α-MEM 배지에서 1.5 × 10⁵ 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 파종하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 RANKL (RANKL, 페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-α 배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 실시예 6 에서 제조한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체, 시판되는 래트 컨트롤 IgG (Purified Rat IgG, R＆D Systems 사 제조) 로부터 아지화나트륨을 제거한 샘플, 및 별도 제조한 토끼 항마우스 Siglec-15 폴리클로날 항체 (No.3) 를 32 ∼ 1,000 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고, 추가로 3 일간 CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하였다. 또한, 폴리클로날 항체 (No.3) 는 본 실시예에 기재된 실험계에 있어서 파골 세포 형성을 저해하는 것이 이미 확인되어 있는 항체이다. 배양 종료 후에, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 이하의 조작에 의해 측정하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰의 배양액을 흡인 제거하고, 1 ％ Triton X-100 을 함유하는 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 6.1) 50 ㎕ 를 각 웰에 첨가하고, 플레이트 진탕기로 5 분간 진탕하여 세포를 가용화시켰다. 이들 각 웰에 기질 용액 (5 ㎎/㎖ p-nitrophenyl phosphate 및 0.46 ％ 타르타르산나트륨을 함유하는 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 6.1)) 50 ㎕ 를 첨가하고 실온에서 5 분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후에 96 웰 플레이트의 각 웰에 1 N 수산화나트륨 용액 50 ㎕ 를 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 효소 반응 정지 후에 각 웰의 405 ㎚ 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 하였다. 결과를 도 5 및 6 에 나타냈다. 시판되는 래트 컨트롤 IgG 에서는 현저한 TRAP 활성 억제는 인정되지 않았다. 그 한편으로, #32A1 항체에서는 32 ng/㎖ 에서 1000 ng/㎖ 의 범위에서, #8A1 항체와 어피니티 정제 토끼 폴리클로날 No.3 항체에는 63 ng/㎖ 에서 1000 ng/㎖ 의 범위에서, 현저한 TRAP 활성의 억제가 인정되었다. 또한 #3A1 항체, #34A1 항체, #39A1 항체에 있어서도, 500 ng/㎖ 이상의 비교적 고농도에 있어서 TRAP 활성의 용량 의존적인 억제가 인정되었다. 그 밖의 항체에 의한 마우스 파골 세포 형성의 억제는 인정되지 않았다. 이상의 결과로부터, 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 중에, 마우스의 파골 세포 형성 (파골 세포의 분화와 성숙) 을 강하게 억제하는 항체가 발견되었다. 또, #3A1 항체, #8A1 항체, #32A1 항체, #34A1 항체, #39A1 항체에 공통되는 성질로서, 1000 ng/㎖, 즉 1 ㎍/㎖ 이하의 농도에 있어서 파골 세포 형성을 저해하는 작용을 들 수 있다.

실시예 10

가용형 인간 Siglec-15 단백질의 발현 컨스트럭트의 제조

인간 Siglec-15 단백질의 세포외 영역을 코드하는 부분의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 15 이고, 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 16 이다. 이러한 부분 배열을 이용함으로써, 동물 세포 등의 배양 상청 중에 가용형 인간 Siglec-15 단백질을 생성시킬 수 있다.

a) 가용형 인간 Siglec-15 유전자의 PCR 에 의한 증폭

인간 Siglec-15 의 세포외 영역 cDNA 를 PCR 에 의해 증폭시키기 위한 프라이머로서

5'-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAA AAGTCCATCT GGCTGC-3' (hSiglec-15-ECD-F : 배열표의 배열 번호 17) 및

5'-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc CCCGCTGGCG CCATGGAAGC GG-3' (hSiglec-15-ECD-R : 배열표의 배열 번호 18),

의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라서 합성하였다. 또한, 이들 프라이머는 Gateway 엔트리 클론 제조용 증폭용 프라이머로서, hSiglec-15-ECD-F 에는 attB1 배열이, hSiglec-15-ECD-R 에는 attB2 배열이 부가되도록 설계하였다. 이 프라이머의 조합과, 템플릿으로서 인간 Siglec-15 의 오픈 리딩 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 통상적인 방법에 따라서 PCR 을 실시하였다. 얻어진 PCR 반응액은 PureLink PCR Purification Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 정제하였다.

b) Gateway BP 반응에 의한 엔트리 클론의 제조

λ 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 응용한 Gateway 테크놀로지 (인비트로젠사) 에 의해, 인간 Siglec-15 세포외 영역의 cDNA 를 삽입한 엔트리 클론을 이하의 방법으로 제조하였다. 먼저 a) 에서 제조한, attB 배열을 양단에 갖는 PCR 산물과, attP 배열을 갖는 도너 벡터인 pDNOR221 (인비트로젠사 제조) 사이에서, BP 클로나아제를 사용한 BP 반응을 실시하였다. 이 반응액을 사용하여 대장균 TOP10 을 형질 전환시키고, 약제 내성 클론에 대하여 콜로니 PCR 을 실시하여, 인서트 사이즈를 확인하였다. 인서트의 사이즈가 올바르게 확인된 클론에 대해, 인서트의 전체 DNA 배열의 시퀀스 해석을 실시한 결과, 목적으로 하는 인간 Siglec-15 단백질의 세포외 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열 (배열표의 배열 번호 15) 과 완전히 일치하는 엔트리 클론이 얻어졌다.

c) Gateway LR 반응에 의한 발현 클론의 제조

λ 파지의 부위 특이적 재조합 시스템을 응용한 Gateway 테크놀로지 (인비트로젠사) 에 의해, 인간 Siglec-15 세포외 영역의 cDNA 를 삽입한 발현 클론을 이하의 방법으로 제조하였다. b) 에서 제조한 엔트리 클론은 인서트의 양단에 attL 배열을 갖고 있다. 이 엔트리 클론과 attR 배열을 갖는 2 종류의 데스티네이션 벡터와의 사이에서 LR 클로나아제를 사용한 LR 반응을 실시하였다. 또한 데스티네이션 벡터는 인서트의 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가되도록 설계된 pDONM, 및 인서트의 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가되도록 설계된 phIgFc 의 2 종류를 사용하였다. LR 반응에 의해 얻어진 반응액을 사용하여 대장균 TOP10 을 형질 전환시키고, 얻어진 약제 내성 클론에 대하여 시퀀스 해석을 실시하여, 재조합이 올바르게 이루어졌는지를 확인하였다.

시퀀스 해석의 결과, pDONM 및 phIgFc 의 양방에서 올바르게 재조합된 발현 클론 (가용형 인간 Siglec-15/pDONM 및 가용형 인간 Siglec-15/phIgFc) 이 각각 얻어졌다. 가용형 인간 Siglec-15/pDONM 을 동물 세포 등에 트랜스펙션함으로써, 배열표의 배열 번호 19 에 기재된 염기 배열을 갖는 mRNA 가 전사되고, 배열표의 배열 번호 20 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질 (인간 Siglec-15-His) 이 번역된다. 가용형 인간 Siglec-15/phIgFc 를 동물 세포 등에 트랜스펙션함으로써, 배열표의 배열 번호 21 에 기재된 염기 배열을 갖는 mRNA 가 전사되고, 배열표의 배열 번호 22 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 단백질 (인간 Siglec-15-Fc) 이 번역된다.

실시예 11

293-F 세포를 사용한 가용형 인간 Siglec-15 단백질 함유 배양액의 대량 조제

a) 인간 Siglec-15-His 함유 배양액의 조제

실시예 10 에서 얻어진 가용형 인간 Siglec-15/pDONM 을 약 25 ㎎ 조제하였다. 또한, 대량 배양된 대장균으로부터의 플라스미드 정제에는, 인비트로젠 PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하였다. 조제한 플라스미드를 Opti-MEM (인비트로젠사 제조) 과 혼합하고, 트랜스펙션 시약인 293 fectin (인비트로젠사 제조) 을 50 ㎖ 첨가하여 실온에서 20 분간 인큐베이션하였다. 이 혼화액을, 1 ％ 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 FreeStyle 293 Expression Media (인비트로젠사 제조) 중에서 1.0 ∼ 3.4 × 10⁶ 세포/㎖ 가 되도록 25 L 바이오프로세스 배양 장치 (WAVE Bioreactor) 를 사용하여 배양시킨 FreeStyle 293-F 세포 (인비트로젠사 제조) 에 첨가하였다. 6 ∼ 12 ％ CO₂ 농도, 37 ℃ 에서 96 시간 (4 일간) 교반 배양 (30 회전/분) 한 후에 배양액을 회수하고, 원심 분리하여 배양 상청을 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 배양 상청 중에는, 인간 Siglec-15 의 세포외 영역 C 말단측에 V5 에피토프와 6 × His 태그가 부가된 단백질 (인간 Siglec-15-His) 이 발현되는 것으로 생각된다.

b) 인간 Siglec-15-Fc 함유 배양액의 조제

실시예 10 에서 얻어진 가용형 인간 Siglec-15/phIgFc 를 약 5 ㎎ 조제하였다. 또한, 대량 배양된 대장균으로부터의 플라스미드 정제에는, 인비트로젠 PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하였다. 조제한 플라스미드를 Opti-MEM (인비트로젠사 제조) 과 혼합하고, 필터 멸균한 후 트랜스펙션 시약인 293 fectin (인비트로젠사 제조) 을 10 ㎖ 첨가하여 실온에서 20 분간 인큐베이션하였다. 이 혼화액을, FreeStyle 293 Expression Media (인비트로젠사 제조) 중에서 1.0 ∼ 3.0 × 10⁶ 세포/㎖ × 5 ℓ (1 ℓ/플라스크를 5 개) 가 되도록 얼렌마이어 플라스크 중에서 배양한 FreeStyle 293-F 세포 (인비트로젠사 제조) 에 첨가하였다. 8.0 ％ CO₂ 농도, 37 ℃ 에서 96 시간 (4 일간) 회전 배양 (125 회전/분) 한 후 배양액을 회수하고, 원심 분리하여 배양 상청을 조제하였다. 이와 같이 하여 조제한 배양 상청 중에는, 인간 Siglec-15 의 세포외 영역 C 말단측에 인간 Fc 태그가 부가된 단백질 (인간 Siglec-15-Fc) 이 발현되는 것으로 생각된다.

실시예 12

가용형 인간 Siglec-15 단백질의 정제

a) 가용형 인간 Siglec-15-His 의 정제

a-ⅰ) HisTrap HP 칼럼 크로마토그래피

실시예 11, a) 에서 조제한 인간 Siglec-15-His 를 발현시킨 293F 세포의 배양액 12 ℓ 에 1350 ㎖ 의 10 x buffer (500 mM Tris, 1.5 M NaCl, 200 mM Imidazole, pH 8.0) 를 첨가하여 잘 교반한 후, MilliPak 60 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과하였다. 이 배양액을, 미리 순수 (Milli Q 수) 로 세정해 둔 Ni-Sepharose HP (아머샴 바이오사이언스사 제조) 100 ㎖ 칼럼에 유속 10 ㎖/min 으로 적용시켰다. 300 mM NaCl 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 400 ㎖ 를 사용하여 유속 8 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8.0) 200 ㎖ 를 사용하여 유속 2.5 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시키고, Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 분취하였다. 용출된 단백질을 함유하는 획분 약 40 ㎖ 에 단백질의 침전을 방지할 목적으로 5 M NaCl 용액 8 ㎖ 를 첨가하여 교반한 후, 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 약 20 ㎖ 로 농축시켰다. 농축시에 발생한 불용물을 3000 r.p.m., 4 ℃ 에서 30 분간 원심시켜 제거하고, 그 상청액 2.5 ㎖ 를 미리 1 M NaCl 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (N-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 적용시키고 N-PBS 로 용출시켜, 용매를 N-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 이 조작을 추가로 7 회 반복 실시하여, 인간 Siglec-15-His 미정제 용액 약 28 ㎖ 를 얻었다.

a-ⅱ) Resource Q 칼럼 크로마토그래피

Ni-Sepharose HP 칼럼 크로마토그래피로 정제한 N-PBS 치환 샘플 12 ㎖ 를 0.1 ％ CHAPS 를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 에 4 ℃ 에서 하룻밤 투석 (1 ℓ, 3 회) 한 후, 4 ℃, 3,000 r.p.m. 으로 30 분간 원심시켜 침전물을 제거하였다. 이 상청액을 Millex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 0.1 ％ CHAPS 를 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 으로 미리 평형화시켜 둔 Resource Q 6 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 1 ㎖/min 으로 적용시키고, 계속해서 이 완충액을 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 칼럼을 세정하여, 칼럼에 흡착되지 않는 단백질 획분을 모았다. 칼럼에 흡착된 단백질은 0.1 ％ CHAPS, 1 M NaCl 을 함유하는 50 mM Tris-HCl 완충액 (pH 7.5) 을 사용하여 유속 1 ㎖/min 으로 용출시켰다. 칼럼에 흡착되지 않은 획분 26.5 ㎖ 를, 원심 막 농축기 Amicon Ultra-15 (밀리포어사 제조) 에 의해 3.0 ㎖ 로 농축시킨 후, 4 ℃, 3,000 r.p.m. 으로 10 분간 원심시켜 침전물을 제거하였다. 그 상청액 2.5 ㎖ 를 미리 50 mM 아르기닌염산염을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (pH 7.0, A-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 적용시키고 A-PBS 로 용출시켜, 용매를 A-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 조제된 샘플의 용매 중의 아르기닌염산염은 가용형 인간 Siglec-15-His 가 침전되는 것을 방지하기 위해 첨가하였다. 원심 후의 상청액은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다. 이상의 정제 조작 (Resource Q 칼럼 크로마토그래피) 을 2 회 반복 실시하였다.

a-ⅲ) 정제된 인간 Siglec-15-His 의 검출과 순도 검정

상기한 정제 조작 (Ni-Sepharose HP 칼럼 크로마토그래피, Resource Q 칼럼 크로마토그래피) 으로 조제한 샘플을 사용하여 환원 조건하에서 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 열처리하였다. 열처리한 각 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동의 조작은 분자량 마커로서 레인보우 분자량 마커 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용한 것 이외에는, 실시예 3 과 동일한 방법으로 실시하였다. 전기 영동 종료 후에 PhastGel Silver Kit (아머샴 바이오사이언스사 제조) 와 PhastSystem 을 사용하여 은 염색을 실시하고, 그 결과를 도 7 에 나타냈다. Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분에 분자량 약 35 kDa 의 단백질 (인간 Siglec-15-His) 이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.

a-ⅳ) 정제된 인간 Siglec-15-His 의 단백질 농도의 측정

정제 인간 Siglec-15-His (Resource Q 칼럼에 흡착되지 않은 단백질 획분) 에 대해, 소 혈청 알부민을 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 2 회의 정제 조작으로 합계 1.66 ㎎ 의 정제 인간 Siglec-15-His 를 얻었다.

b) 가용형 인간 Siglec-15-Fc 의 정제

b-ⅰ) HiTrap protein A 칼럼 크로마토그래피

실시예 11, b) 에서 조제한 인간 Siglec-15-Fc 를 발현시킨 293F 세포의 배양액 1.5 ℓ 를 Sterivex GV 필터 (밀리포어사 제조) 로 여과한 후, 미리 둘베코 PBS (D-PBS, 인비트로젠사 제조) 로 평형화시켜 둔 HiTrap protein A 5 ㎖ 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 유속 5 ㎖/min 으로 적용시켰다. D-PBS 70 ㎖ 를 사용하여 유속 5 ㎖/min 으로 칼럼을 세정한 후, 0.1 M 시트르산나트륨 완충액 (pH 3.0) 24 ㎖ 를 사용하여 유속 1.2 ㎖/min 으로 칼럼에 흡착되어 있는 단백질을 용출시켰다. 용출된 액은 Mini-sorp tube (눙크사 제조) 에 1.2 ㎖/Fr. 로 분취한 후, 1 M Tris 0.31 ㎖ 를 바로 첨가하여 중화시켰다. 용출된 단백질의 획분 (Fr.5 ∼ 9) 약 7.5 ㎖ 중의 2.5 ㎖ 를, 50 mM 아르기닌염산염을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (pH 7.0, A-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 적용시키고 A-PBS 로 용출시켜, 용매를 A-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 이 작업을 2 회 반복 실시하였다. 용매 중의 아르기닌염산염은 가용형 인간 Siglec-15-Fc 가 침전되는 것을 방지하기 위해 첨가하였다. 용출된 단백질 획분 (Fr.5 ∼ 9) 중 나머지 2.5 ㎖ 는 1 M NaCl 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수 (pH 6.7, N-PBS) 로 평형화시켜 둔 PD-10 탈염 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 제조) 에 적용시키고 N-PBS 로 용출시켜, 용매를 N-PBS 로 치환시킨 샘플 3.5 ㎖ 를 얻었다. 조제된 샘플의 용매 중의 NaCl 은 아르기닌 등의 아미노기 함유 화합물을 첨가하지 않고, 가용형 인간 Siglec-15-Fc 의 침전을 방지할 목적으로 첨가하였다. 이상의 조작으로 조제된 샘플은 사용할 때까지 -80 ℃ 에서 동결 보존하였다.

b-ⅱ) 정제된 인간 Siglec-15-Fc 의 검출과 순도 검정

상기한 정제 조작에 의해 조제된 샘플을 사용하여 환원 조건하의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동과 은 염색을 실시하였다. 즉 각 정제 단계의 샘플 5 ㎕ 에 동량의 SDS-처리액을 첨가하고, 95 ℃ 에서 10 분간 가열하였다. 열처리한 각 샘플을 1/2 농도의 SDS-처리액으로 1/100 또는 1/300 배 희석시킨 샘플 0.3 ㎕ 를 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동에 사용하였다. 전기 영동과 은 염색은 a-ⅲ) 에 기재된 인간 Siglec-15-His 의 순도 검정과 동일한 방법으로 실시하고, 그 결과를 도 8 에 나타냈다. HiTrap protein A 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분에 분자량 약 55 kDa 의 단백질 (인간 Siglec-15-Fc) 이 효율적으로 정제 농축되었음이 나타났다.

b-ⅲ) 정제된 인간 Siglec-15-Fc 의 단백질 농도의 측정

정제 인간 Siglec-15-Fc (PD-10 탈염 칼럼으로부터 용출된 단백질 획분) 에 대해, 소 혈청 알부민을 표준 샘플로서 사용하여 DC-Protein Assay kit (BioRad 사 제조) 로 단백질 농도를 측정하였다. 표 4 에 나타낸 바와 같이, 2 회의 정제 조작으로 합계 25.2 ㎎ 의 정제 인간 Siglec-15-Fc 를 얻었다.

실시예 13

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합성 평가

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합성을 ELISA 법에 의해 평가하였다. 실시예 12, b) 에서 제조한 인간 Siglec-15-Fc 단백질 (A-PBS 치환한 것) 을 5 ㎍/㎖ 가 되도록 0.1 M 탄산나트륨 버퍼 (pH 9.5) 로 희석시키고, 96 웰 플레이트 (날젠 눙크사 제조, 카탈로그 번호 : 430341) 에 100 ㎕/웰 첨가하였다. 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 용액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼 (0.05 ％ Tween 20 함유 인산염 완충 생리 식염수) 를 첨가, 제거하였다. 이 세정 작업을 추가로 1 회 실시한 후, 25 ％ 블록 에이스 (다이닛폰 스미토모 제약사 제조) 를 함유하는 인산염 완충 생리 식염수를 200 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 방치시킴으로써 블로킹을 실시하였다. 액을 제거하고 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 2 회 세정한 후, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 또는 래트 컨트롤 IgG (R＆D Systems 사 제조) 를, ELISA 버퍼 (12.5 ％ 블록 에이스, 0.05 ％ Tween 20 을 함유하는 인산염 완충 생리 식염수) 를 사용하여 최종 농도가 1.28 ∼ 20,000 ng/㎖ (5 배 희석 계열) 가 되도록 희석시키고, 100 ㎕/웰 첨가하였다. 실온에서 1 시간 방치시킨 후에 액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 3 회 세정하였다. 계속해서 ELISA 버퍼를 사용하여 1,000 배 희석시킨 HRP (양고추냉이 페록시다아제) 표지 염소 항래트 IgG 항체 (베크맨 콜터사 제조) 를 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 1 시간 방치시켰다. 액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 세정 버퍼로 3 회 세정한 후, 페록시다아제용 발색 키트 (스미토모 베이크라이트사 제조) 를 사용하여, 키트에 첨부된 설명서에 따라 발색시켰다. 발색 후, 마이크로 플레이트 리더 (니혼 몰레큘러 디바이스사 제조) 를 사용하여 492 ㎚ 에서의 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 검토한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 10 검체 전부에 있어서, 항체의 농도에 의존한 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합이 확인되었다 (도 9). 특히 결합 활성이 강했던 것은 #1A1, #3A1, #24A1, #32A1, #61A1 의 5 검체였고, #8A1, #34A1, #39A1 의 3 검체는 비교적 결합 활성이 약했다. 한편 래트 컨트롤 IgG 는 인간 Siglec-15 단백질에 대한 결합이 관찰되지 않았다. 이상의 결과로부터, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체는 마우스 Siglec-15 뿐만 아니라 인간 Siglec-15 에도 결합됨이 나타났고, 게다가 일부의 항체는 인간 Siglec-15 에 강하게 결합됨이 판명되었다.

실시예 14

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 세포 융합, 및 골흡수 활성에 대한 영향 (in vitro 생물 활성 평가)

실시예 13 에 있어서, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체가 인간 Siglec-15 에도 결합되는 것이 확인되었으므로, 이들 항체의 인간 파골 세포 형성 및 골흡수 활성에 대한 효과를 검토하였다.

a) 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 파골 세포 융합에 대한 영향 (TRAP 염색)

정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96 웰 플레이트에 1 × 10⁴ 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는, 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 66 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 및 래트 컨트롤 IgG (R&D Systems 사 제조) 를 최종 농도 30 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 4 일간 배양하였다. 배양 후 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포 고정을 실시하였다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 염색액 (0.27 mM 나프톨 AS-MX 인산 (시그마사 제조), 1.6 mM Fast red violet LB salt (시그마사 제조), 1 ％ 디메틸포름아미드, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 5 분 반응시켰다. 증류수로 2 회 세정하고, 현미경하에서 세포를 관찰하였다 (도 10). 그 결과, #32A1 항체 첨가에 의해, 고도로 세포 융합된 거대 파골 세포의 형성이 거의 완전히 억제되었다. 또한, #41B1 항체에서도, 고도로 세포 융합된 거대 파골 세포의 형성이 현저하게 억제되었다. 한편, 그 이외의 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#1A1 항체 외) 및 래트 컨트롤 IgG 에서는, 이와 같은 파골 세포 융합의 현저한 억제는 인정되지 않았다. 이와 같이, 정상 인간 파골 전구 세포로부터의 TRAP 양성 파골 세포의 다핵화·세포 융합이 Siglec-15 단백질과 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체에 의해 억제됨이 밝혀졌다.

b) 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1) 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 파골 세포 융합에 대한 영향 (TRAP 염색)

정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96 웰 플레이트에 1 × 10⁴ 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는, 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 68.4 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체) 를 최종 농도 0.1, 0.3, 1, 3 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 3 일간 배양하였다. 배양 후 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포 고정을 실시하였다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 염색액 (0.27 mM 나프톨 AS-MX 인산 (시그마사 제조), 1.6 mM Fast red violet LB salt (시그마사 제조), 1 ％ 디메틸포름아미드, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 5 분 반응시켰다. 증류수로 2 회 세정하고, 현미경하에서 세포를 관찰하였다 (도 11). 그 결과, TRAP 양성 다핵 파골 세포 형성이 #32A1 항체 0.3 ㎍/㎖ 내지 3 ㎍/㎖ 의 범위에서 농도 의존적으로 억제되었다.

c) 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1) 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 골흡수 활성에 대한 영향 (콜라겐 코트 플레이트를 사용한 평가)

파골 세포는 카텝신 K 등의 프로테아제를 방출함으로써, 골조직의 구성 성분인 I 형 콜라겐을 분해하는 것이 알려져 있다. OsteoLyse Assay Kit (Lonza 사 제조, 카탈로그 번호 PA-1500) 는 유로퓸이 결합된 인간 콜라겐을 코팅한 96 웰 플레이트 (96-well OsteoLyse cell culture plate) 를 제공하고 있고, 동일 플레이트 상에서 파골 세포를 배양하였을 때에 상청에 유리되는 형광 콜라겐 단편량을 측정함으로써, 파골 세포의 골흡수 활성을 in vitro 에서 평가할 수 있다.

정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96-well OsteoLyse cell culture plate 에 1 × 10⁴ 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 68.4 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체) 를 최종 농도 0.1, 0.3, 1, 3 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 3 일간 배양하였다. 배양 상청 10 ㎕ 를 채취하고, OsteoLyse Assay Kit 에 부속된 Fluorophore Releasing Reagent 를 200 ㎕ 첨가하고, 형광 플레이트 리더 (ARVO MX, 퍼킨엘머사 제조) 를 사용하여 형광 강도를 측정 (Excitation : 340 ㎚, Emission : 615 ㎚) 함으로써, 배양 상청 중에 방출된 유리 형광 콜라겐 단편량을 정량하였다 (도 12). 그 결과, RANKL 첨가에 의해 증가한 형광 콜라겐 단편량이 #32A1 항체에 의해 0.3 ㎍/㎖ 내지 3 ㎍/㎖ 의 범위에서 농도 의존적으로 억제되었다. 이 점에서, 인간 파골 세포의 골흡수 활성이 Siglec-15 단백질과 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체에 의해 억제됨이 밝혀졌다.

실시예 15

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 난소 적출 래트를 사용한 생물 활성 평가

a) 동물 실험의 프로토콜

12 주령 암컷성 F344 래트 (일본 찰스 리버사로부터 입수) 에 양측 난소 적제를 시술하고, 용매 투여군, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #8A1 항체 투여군 및 #32A1 항체 투여군의 3 군으로 나눴다. 또한 샴 수술 (sham surgery) 군에 관해서도 1 군 설정하였다. 항체를 투여하는 군에 관해서는, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #8A1 항체 및 #32A1 항체를, 각 1 ㎎/㎏ 의 용량으로 복강 내에 주 3 회, 수술 다음날로부터 4 주간 반복 투여하였다. 용매 투여군 및 샴 수술군에는, 용매로서 0.01 ％ Tween 20 함유 PBS 를 복강 내에 투여하였다. 투여 개시 4 주 후에 절식하에서 24 시간 채뇨를 실시하고, 뇨 검체는 측정까지 -80 ℃ 에서 보존하였다. 채뇨 종료 후에 래트를 안락사시켜, 요추를 적출하였다.

b) 요추 골밀도의 측정

적출한 요추에 부착되어 있는 연조직 (軟組織) 을 제거하고, 제 4 ∼ 6 요추를 잘라내었다. 에탄올 중에서 진탕한 후에 바람에 쐬여 건조시킴으로써 탈지 및 탈수시키고, 골밀도 측정 장치 (DCS-600EX, 알로카사 제조) 를 사용하여 골밀도를 측정하였다. 결과를 도 13(A) 에 나타내었다. 샴 수술군에 대하여, 난소 적제군에서는 유의한 요추 골밀도의 감소가 인정되었지만, #8A1 및 #32A1 항체 투여군에서는 난소 적제에 의한 골밀도의 감소가 유의하게 억제되었다.

c) 뇨중 데옥시피리디놀린 배설량의 측정

I 형 콜라겐 가교의 각종 대사 산물은 뼈의 대사 회전, 특히 골흡수를 예민하게 반영하고, 그 중에서도 데옥시피리디놀린은 주로 뼈의 콜라겐에 국재하는 점에서 골흡수의 지표로서 신뢰성이 높은 것으로 여겨지고 있다.

동결 보존되고 있던 뇨 검체를 융해시키고, 원심 조작에 의해 불용 물질을 침전시켜 상청을 얻었다. 이 상청 중에 함유되는 데옥시피리디놀린량을, 오스테오링크스 「DPD」 (DS 파마 바이오메디칼사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 또한, 크레아티닌 테스트 와코 (와코 쥰야쿠 공업사 제조) 를 사용하여 상청 중의 크레아티닌 함량도 측정하고, 크레아티닌 보정을 실시한 데옥시피리디놀린량을 산출하였다. 결과를 도 13(B) 에 나타내었다. 샴 수술군에 대하여, 난소 적제군에서는 뇨중 데옥시피리디놀린 배설량이 유의하게 증가하였기 때문에, 난소 적제 래트에서는 파골 세포에 의한 골흡수가 항진되고 있음이 시사되었다. 한편, #8A1 및 #32A1 항체 투여군에서는, 난소 적제에 의한 데옥시피리디놀린 배설량의 증가가 샴 수술군과 같은 정도까지 억제되었다. 이러한 점에서, Siglec-15 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체가 파골 세포의 골흡수를 억제하는 것이 동물모델에서도 확인되어, 이 골흡수 억제 작용에 의해 난소 적제 래트의 요추 골밀도 감소를 억제한 것이 강하게 시사되었다.

실시예 16

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체의 결합 부위 (에피토프) 의 결정

a) 인간 Siglec-15 V-set 도메인의 발현 정제

인간 Siglec-15 V-set 도메인 (NCBI 의 단백질 데이터베이스의 ACCESSION 번호 NP_998767 의 아미노산 배열 또는 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열의 39 내지 165 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드) 의 N 말단측에 His 태그, 및, Thrombin 인식 배열을 연결시킨 단백질을 코드하는 DNA 를 벡터 pDEST14 (인비트로젠사, 카탈로그 번호 : 11801-016) 에 삽입하였다. 이 플라스미드를 사용하여, 대장균 Rosetta-gamiB (DE3) (노바젠사, 카탈로그 번호 : 71136-4) 를 형질 전환시키고, TB 배지 (인비트로젠사, 카탈로그 번호 : 22711-022) 에서 배양하였다. 배양 후, 초음파 파쇄한 균체를 원심 분리하여, 상청을 HisTrap HP 칼럼 (GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 : 17-5247-01) 에 의해 정제하였다. 그 후, Thrombin 으로 His 태그를 절단 후, Mono S5/50 GL 칼럼 (GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 : 17-5168-01), 추가로 Superdex 75 10/300 칼럼 (GE 헬스케어사, 카탈로그 번호 : 17-5174-01) 을 사용하여, 전기 영동에 의해 분자량 14 kDa 의 단일 밴드가 될 때까지 인간 Siglec-15 V-set 도메인을 정제하였다.

b) 가용형 인간 Siglec-15-Fc 의 정제

가용형 인간 Siglec-15-Fc 는 실시예 12 의 방법으로 정제하였다.

c) 인간 V-set 도메인과 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 경합 ELISA

96 웰 Maxi-sorp 플레이트 (눙크사 제조, 형번 : 442404) 에 1.25 ㎍/㎖ 의 염소항 인간 Fc 항체 (잭슨 이뮤노 리서치사, 형번 : 109-005-098) 를 100 ㎕ 첨가하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 고상화하였다. 96 웰 Maxi-sorp 플레이트를 PBS 로 2 회 세정 후, 1 ㎍/㎖ 의 가용형 인간 Siglec-15-Fc 를 100 ㎕ 첨가하여, 실온에서 1 시간 고상화하였다. 그 후, 5 ％ 스킴 밀크/PBS 용액을 300 ㎕ 첨가하여, 실온에서 3 시간, 웰의 블로킹을 실시하였다. 한편, 2 ㎍/㎖ 의 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 와 0, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20 ㎍/㎖ 의 인간 Siglec-15 V-set 도메인을 각각 등량 혼합하고, 실온에서 1.5 시간 반응시켰다. 96 웰 Maxi-sorp 플레이트를 PBS 로 2 회 세정 후, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 과 인간 Siglec-15 V-set 도메인의 혼합 용액을 100 ㎕ 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. 0.05 ％ Tween-20 (바이오래드사, 카탈로그 번호 : 170-6531)/PBS 용액 (이하, PBST 용액으로 한다) 으로 96 웰 Maxi-sorp 플레이트를 5 회 세정 후, HRP 표지 염소 항래트 IgG 항체 (베크맨 콜터사, 카탈로그 번호 : 732664, 2,000배 희석) 를 100 ㎕ 첨가하여, 실온에서 1 시간 반응시켰다. PBST 용액으로 5 회 세정 후, ELISA POD 기질 A.B.T.S. 키트 (나카라이 테스크사, 카탈로그 번호 : 14351-80) 의 발색액을 100 ㎕ 첨가하여 30 분간 반응시켰다. 반응 정지액을 100 ㎕ 첨가 후 405 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 경합 ELISA 의 결과, 인간 V-set 도메인의 농도 의존적으로 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 고상화된 인간 Siglec-15 에 대한 결합이 저해되는 것이 나타났다. 따라서, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 에피토프는 인간 Siglec-15 V-set 도메인 (NCBI 의 단백질 데이터베이스의 ACCESSION 번호 NP_998767 의 아미노산 배열 또는 배열표의 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열의 39 내지 165 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 도메인) 인 것이 나타났다 (도 14).

실시예 17

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭과 염기 배열의 해석

a) mRNA 의 조제

하이브리도마 #32A1 은 실시예 6, a) 에 따라서 배양하였다. 4 × 10⁷ 개의 하이브리도마 #32A1 로부터, QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare 사) 를 사용하여, 약 65 ㎍ 의 mRNA 를 조제하였다.

b) cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 의 합성

cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 의 합성은 a) 에서 합성한 mRNA 의 0.3 ㎍ 을 사용하고, PrimeScript Reverse Transcriptase (TAKARA 사) 와 SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다.

c) 5'-RACE PCR 에 의한 #32A1 유전자의 중쇄 가변 영역의 cDNA 의 증폭

#32A1 중쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 에 의해 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMART RACE cDNA Amplification Kit 에 부속) 및

5'-GGCCGGGTGGGCTACGTTGCAGGTGACGGTCTG-3' (RG2AR2 : 배열표의 배열 번호 23) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하였다. UPM 은 SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 에 부속된 것을 사용하고, RG2AR2 는 데이터베이스의 래트 중쇄 (IgG2a) 의 정상 영역의 배열로부터 설계한 후에 통상적인 방법에 따라서 합성하였다.

이 프라이머의 조합과, b) 에서 합성한 cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 를 주형으로 한, 5'-RACE PCR 에 의해 #32A1 중쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 증폭시켰다. PCR 은, Advantage 2 PCR Kit (Clontech 사) 를 사용하고, 서멀 사이클러의 설정 조건은, 94 ℃ 에서 1 분간 가열한 후, 「94 ℃ 에서 0.5 분, 72 ℃ 에서 3 분」의 온도 사이클을 5 회 반복하고, 다음으로 「94 ℃ 에서 0.5 분, 70 ℃ 에서 0.5 분, 72 ℃ 에서 3 분」의 온도 사이클을 5 회 반복하고, 추가로 「94 ℃ 에서 0.5 분, 68 ℃ 에서 0.5 분, 72 ℃ 에서 3 분」의 온도 사이클을 20 회 반복한 다음, 4 ℃ 에서 보온으로 하였다.

d) 5'-RACE PCR 에 의한 #32A1 경쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA 의 증폭

#32A1 경쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 에 의해 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMART RACE cDNA Amplification Kit 에 부속) 및

5'-CATGCTGTACGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAG-3' (RKR2 : 배열표의 배열 번호 24) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, UPM 은 SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 에 부속된 것을 사용하고, RKR2 는 데이터베이스의 래트 경쇄 (κ 사슬) 의 정상 영역의 배열로부터 설계한 후에 통상적인 방법에 따라서 합성하였다.

이 프라이머의 조합과, b) 에서 합성한 cDNA (5'-RACE-Ready cDNA) 를 주형으로 한, 5'-RACE PCR 에 의해 #32A1 경쇄 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 증폭시켰다. PCR 은 Advantage 2 PCR Kit (Clontech 사) 를 사용하고, 서멀 사이클러의 설정 조건은, 94 ℃ 에서 1 분간 가열한 후, 「94 ℃ 에서 0.5 분, 72 ℃ 에서 3 분」의 온도 사이클을 5 회 반복하고, 다음으로「94 ℃ 에서 0.5 분, 70 ℃ 에서 0.5 분, 72 ℃ 에서 3 분」의 온도 사이클을 5 회 반복하고, 또 다시 「94 ℃ 에서 0.5 분, 68 ℃ 에서 0.5 분, 72 ℃ 에서 3 분」의 온도 사이클을 20 회 반복한 다음, 4 ℃ 에서 보온으로 하였다.

e) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 cDNA 의 염기 배열의 결정

c) 에서 증폭시킨 중쇄의 가변 영역의 cDNA 를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제한 후에, DNA 배열의 시퀀스 해석을 실시하였다. 시퀀스 프라이머로서, 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3 : 배열표의 배열 번호 25) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 데이터베이스의 래트 중쇄 (IgG2a) 의 정상 영역의 배열로부터 설계한 후에 통상적인 방법에 따라서 합성하였다.

d) 에서 증폭시킨 경쇄의 가변 영역의 cDNA 를 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제를 실시한 후에, DNA 배열의 시퀀스 해석을 실시하였다. 시퀀스 프라이머로서,

5'-TCCAGTTGCTAACTGTTCCG-3' (sqRK : 배열표의 배열 번호 26) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 데이터베이스의 래트 경쇄 (κ 사슬) 의 정상 영역의 배열로부터 설계한 후에 통상적인 방법에 따라서 합성하였다.

시퀀스 해석에 의해 얻어진 중쇄 가변 영역을 포함하는 cDNA 는 배열표의 배열 번호 27 에 기재된 염기 배열을 갖고 있고, 배열표의 배열 번호 28 에 기재된 아미노산 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 28 의 아미노산 번호 1 내지 19 에 나타내는 아미노산 배열이 분비 시그널, 아미노산 번호 20 내지 140 에 나타내는 아미노산 배열이 중쇄 가변 영역, 그리고 아미노산 번호 141 내지 167 로 나타내는 아미노산 배열이 중쇄 정상 영역 (부분) 에 상당한다. 상기한 중쇄 가변 영역은 배열 번호 44 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1 (DYFMN), 배열 번호 45 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (QIRNKIYTYATFYAESLEG), 및 배열 번호 46 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (SLTGGDYFDY) 을 보유하고 있다. 또한, 경쇄 가변 영역을 포함하는 cDNA 는 배열표의 배열 번호 29 에 기재된 염기 배열을 갖고 있고, 배열표의 배열 번호 30 에 기재된 아미노산 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 30 의 아미노산 번호 1 내지 20 에 나타내는 아미노산 배열이 분비 시그널, 아미노산 번호 21 내지 132 에 나타내는 아미노산 배열이 경쇄 가변 영역, 그리고 아미노산 번호 133 내지 139 로 나타내는 아미노산 배열이 경쇄 정상 영역 (부분) 에 상당한다. 상기한 경쇄 가변 영역은 배열 번호 47 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (RASQSVTISGYSFIH), 배열 번호 48 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (RASNLAS), 및 배열 번호 49 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 (QQSRKSPWT) 을 보유하고 있다.

실시예 18

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체 유전자 발현 컨스트럭트의 제조

a) 범용 발현 벡터 pEF1/FCCU-1 및 pEF6KCL 의 제조

a)-i) 인간 경쇄 발현 벡터 pEF6KCL 의 구축

플라스미드 pEF6/V5-HisB (Invitrogen) 를 주형으로 하고 하기 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시함으로써, BGHpA 의 직후 (2174) 로부터, Sma I (2958) 까지의 DNA 단편 (f1 origin of replication 및 SV40 promoter and origin 을 포함하는 DNA 프래그먼트, 이하, 「프래그먼트 A」라고 한다) 을 취득하였다.

5'-CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC-3' (프라이머 EFF1 : 배열표의 배열 번호 31)

5'-AAACCCGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3' (프라이머 EFsmaR : 배열 번호 32)

얻어진 프래그먼트 A 와, 인간 κ 사슬 분비 시그널, 인간 κ 사슬 정상 영역 및 인간 poly A 부가 시그널을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 DNA 프래그먼트 (배열 번호 33) (이하, 「프래그먼트 B」라고 한다) 를 오버랩 PCR 에 의해 결합하였다. 얻어진 프래그먼트 A 와 프래그먼트 B 가 결합된 DNA 단편 (이하, 「프래그먼트 A＋B」라고 한다) 을 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 소화시키고, 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 소화시킨 플라스미드 pEF6/V5-HisB (Invitrogen) 와 라이게이션하여, EF1 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 κ 사슬 정상 영역, 및 인간 poly A 부가 시그널 배열을 갖는, 인간 경쇄 발현 벡터 pEF6KCL 을 구축하였다.

a)-ii) pEF1/KCL 의 구축

상기한 방법으로 얻어진 pEF6KCL 로부터 제한 효소 KpnI 및 SmaI 로 잘라낸 DNA 단편을, KpnI 및 SmaI 로 소화시킨 pEF1/myc-HisB (Invitrogen 사) 와 라이게이션하여, 플라스미드 pEF1/KCL 을 구축하였다.

a)-iii) 인간 중쇄 발현 벡터 pEF1/FCCU-1 의 구축

인간 IgG1 시그널 배열 및 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 DNA 단편 (배열표의 배열 번호 34) 을 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 소화시키고, NheI 및 PmeI 로 소화시킨 플라스미드 pEF1/KCL 과 결합하여, EF1 프로모터의 하류에 시그널 배열, 클로닝 사이트, 인간 중쇄 정상 영역, 및 인간 poly A 부가 시그널 배열을 갖는 인간 중쇄 발현 벡터 pEF1/FCCU-1 을 구축하였다.

b) #32A1 인간 키메라 항체 중쇄 발현 컨스트럭트의 제조

#32A1 중쇄 가변 영역의 cDNA 를 PCR 에 의해 증폭시키기 위한 프라이머로서,

5'-aaagctgagcGAGGTGCAAATTTTGGAGACTGGAGGAGGC-3' (32A1HF : 배열표의 배열 번호 35) 및

5'-aaagctgagctGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3' (32A1HR : 배열표의 배열 번호 36) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라서 합성하였다.

또한, 이들 프라이머는 PCR 산물을 pEF1/FCCU-1 에 삽입하기 위해서, 제한 효소 BlpI 인식 배열이 부가되도록 설계하였다. 이 프라이머의 조합과 템플릿으로서, 실시예 17, e) 에서 정제한 중쇄 가변 영역의 cDNA 를 사용하여, 통상적인 방법에 따라서 PCR 을 실시하였다. PCR 산물을 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제한 후에, 제한 효소 BlpI (NEW ENGLAND BIOLABS 사) 로 소화시킨 DNA 단편을, pEF1/FCCU-1 을 제한 효소 BlpI (NEW ENGLAND BIOLABS 사) 로 절단한 지점에 삽입함으로써 #32A1 인간 키메라 항체 중쇄 발현 컨스트럭트를 구축하였다. 인서트의 배열은 시퀀스 해석에 의해 확인하였다. 시퀀스를 위한 프라이머로서,

5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3' (F11 : 배열표의 배열 번호 37) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라서 합성하였다. 올바르게 인서트를 삽입할 수 있었던 발현 벡터를 「32A1H/pEF1/FCCU」로 명명하였다.

c) #32A1 인간 키메라 항체 경쇄 발현 컨스트럭트의 제조

#32A1 경쇄 가변 영역의 cDNA 를 PCR 에 의해 증폭시키기 위한 프라이머로서,

5'-aaacatatggcGACATTGTCTTGACCCAGTCTCCTGCTTTGG-3' (32A1LF : 배열표의 배열 번호 38) 및

5'-aaacgtacgTCTCAATTCCAGCTTGGTGCCTCCAGCG-3' (32A1LR : 배열표의 배열 번호 39) 의 배열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 통상적인 방법에 따라서 합성하였다.

또, 이들 프라이머는 PCR 산물을 pEF6KCL 에 삽입하기 위해서, 32A1LF 에는 제한 효소 NdeI 인식 배열이, 32A1LR 에는 제한 효소 BsiWI 인식 배열이 부가되도록 설계하였다. 이 프라이머의 조합과 템플릿으로서, 실시예 17, e) 에서 정제한 경쇄 가변 영역의 cDNA 를 사용하여, 통상적인 방법에 따라서 PCR 을 실시하였다. PCR 산물을 MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제한 후에, 제한 효소 NdeI (TAKARA 사) 및, BsiWI (NEW ENGLAND BIOLABS 사) 로 소화시킨 DNA 단편을, pEF6KCL 을 제한 효소 NdeI (TAKARA 사) 및 BsiWI (NEW ENGLAND BIOLABS 사) 로 절단한 지점에 삽입함으로써 #32A1 인간 키메라 항체 경쇄 발현 컨스트럭트를 구축하였다. 인서트의 배열은 시퀀스 해석에 의해 확인하였다. 시퀀스를 위한 프라이머로는, 배열표의 배열 번호 37 에 기재된 프라이머 F11 을 사용하였다. 올바르게 인서트를 삽입할 수 있었던 발현 벡터를 「32A1L/pEF6KCL」로 명명하였다.

b) 에서 제조된 #32A1 인간 키메라 항체 중쇄 유전자는 배열표의 배열 번호 40 에 기재된 뉴클레오티드 배열을 갖고 있고, 배열표의 배열 번호 41 에 기재된 아미노산 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 41 의 아미노산 번호 1 내지 19 에 나타내는 아미노산 배열이 분비 시그널, 아미노산 번호 20 내지 140 에 나타내는 아미노산 배열이 중쇄 가변 영역, 그리고 아미노산 번호 141 내지 470 으로 나타내는 아미노산 배열이 중쇄 정상 영역에 상당한다. 또한, c) 에서 제조된 #32A1 인간 키메라 항체 경쇄 유전자는 배열표의 배열 번호 42 에 기재된 뉴클레오티드 배열을 갖고 있고, 배열표의 배열 번호 43 에 기재된 아미노산 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 43 의 아미노산 번호 1 내지 20 에 나타내는 아미노산 배열이 분비 시그널, 아미노산 번호 21 내지 132 에 나타내는 아미노산 배열이 경쇄 가변 영역, 그리고 아미노산 번호 133 내지 237 로 나타내는 아미노산 배열이 경쇄 정상 영역에 상당한다.

실시예 19

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체의 조제

a) 인간 키메라 항체의 생산

대수 증식기의 293 FreeStyle 세포 3 × 10⁷ 개를 신선한 30 ㎖ (30 ㎖ 배양을 1 로트로 하여 4 로트 제조) 의 FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen 사) 에 파종하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터에서 진탕 배양하였다 (125 rpm). Polyethyleneimine (Polyscience 사 제조 #24765) 300 ㎍ 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사 제조) 1 ㎖ 에 용해시켜, 실온에서 5 분간 방치하였다. 실시예 18 에서 제조된 #32A1 인간 키메라 항체 중쇄 발현 벡터 32A1H/pEF1/FCCU, 및 #32A1 인간 키메라 항체 경쇄 발현 벡터 32A1L/pEF6KCL 을, PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 사용하여 조제하였다. 32A1H/pEF1/FCCU (15 ㎍) 및 32A1L/pEF6KCL (45 ㎍) 을 1 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 현탁시키고, 실온에서 5 분간 방치한 Polyethyleneimine/OptiPro SFM 혼합액 1 ㎖ 에 첨가하여, 다시 실온에서 5 분간 방치하였다. 다음으로 Polyethyleneimine/발현 벡터/OptiPro SFM 혼합액 2 ㎖ 를 293 FreeStyle 세포 현탁액의 1 로트에 첨가하여, 진탕 배양을 계속하였다. 37 ℃, 8 ％ CO₂ 중에서 7 일간 배양한 후, 배양 상청을 로트마다 회수하였다.

b) 인간 키메라 항체의 정제

상기에서 얻어진 배양 상청 90 ㎖ (3 로트분) 를 필터 여과 (NALGENE 사 제조 #295-4545) 후, PBS 로 평형화시킨 MabSelectSuRe 0.5 ㎖ (GE Healthcare Bio-science 사 제조 #17-5438-01) 를 첨가하고, 80 rpm, 10 ℃ 에서 하룻밤 진탕시켰다. 다음날, 담체를 회수하고 PBS 로 세정 후, 1 M 아르기닌 용액 (pH 4.0) 으로 항체를 용출시켰다. 용출액을 PD10 칼럼 (GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조 #17-0851-01) 에 의해 PBS 로 치환 후, 아미콘 울트라 4 (밀리포어사 제조 #UFC805008) 에 의해 농축시켜 인간 키메라 항체 1.2 ㎖ (0.98 ㎎/㎖) 를 얻었다. 항체의 농도는 히타치 다이오드 어레이형 바이오 광도계 U-0080D 에 의해 280 ㎚ 를 측정하여 산출하였다.

실시예 20

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체의 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합성 평가

실시예 19 에 있어서 조제한 정제 인간 키메라 항체에 대한 래트 #32A1 항체의 경합 저해를 이하의 방법으로 측정하였다. 실시예 4 에서 정제한 마우스 Siglec-15-Fc 를 PBS 에 의해 1 ㎍/㎖ 로 희석 후, 이뮤노 플레이트 (Nunc 사 제조 #437111) 에 100 ㎕/웰로 분주하여, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시킴으로써 플레이트에 단백질을 흡착시켰다. 다음날, 웰을 PBS-T 액 (PBS, 0.05 ％ (v/v) Tween 20) 으로 2 회 세정 후, 스킴 밀크 (모리나가 유업사 제조) 를 PBS 에 의해 5 ％ 로 희석시킨 용액을 350 ㎕/웰로 분주하여, 실온에서 2 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 액을 제거하고 PBS-T 액으로 3 회 세정 후, 0.25 ㎍/㎖ 의 인간 키메라 항체와 각종 농도 (0 ㎍/㎖, 0.016 ㎍/㎖, 0.05 ㎍/㎖, 0.16 ㎍/㎖, 0.5 ㎍/㎖, 1.66 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖) 의 #32A1 항체 또는 래트 컨트롤 IgG 항체 (R&D systems 사 제조 #6-001-A) 의 혼합 용액 (최종 농도 0.5 ％ 의 스킴 밀크 함유 PBS 액) 을 각각 100 ㎕/웰로 분주하여, 2 시간 실온에서 가만히 정지시켰다. PBS-T 액으로 3 회 웰을 세정 후, TBS-T 액 (TBS, 0.05 ％ (v/v) Tween 20) 으로 2500 배로 희석시킨 Alkaline Phosphatase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG (Jackson Immuno Research 사 제조 #109-055-097) 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 액을 제거하여, TBS-T 액으로 5 회 웰을 세정한 후, 형광 기질액 (Roche 사 제조 #11681982001) 을 100 ㎕/웰로 첨가하여 형광 반응을 실시하였다. 형광 기질액 첨가 10 분 후, 플레이트 리더로 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, #32A1 항체는 인간 키메라 항체의 마우스 Siglec-15-Fc 에 대한 결합을 농도 의존적으로 저해하는 것이 나타났다. 또한 #32A1 항체와 인간 키메라 항체를 동일 농도 (1 : 1) 로 혼합한 경우, 약 40 ％ 의 경합 저해가 나타났다. 따라서, #32A1 항체와 인간 키메라 항체는 마우스 Siglec-15-Fc 에 대하여 거의 동등한 친화성을 갖는 것으로 생각된다. 한편 래트 컨트롤 IgG 는 경합 저해를 나타내지 않았다 (도 15).

실시예 21

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체의 마우스 파골 세포 형성 시험, 그리고 인간 파골 세포 형성 시험에서의 생물 활성 평가

a) 마우스 파골 세포 형성 시험

실시예 19 에 있어서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체를 사용하여, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향을 검토하였다. 실시예 8 의 방법으로 조제한 마우스 골수 비부착 세포를 10 ％ FBS 와 10 ng/㎖ M-CSF (R＆D Systems 사 제조) 를 함유하는 α-MEM 배지에서 1.5 × 10⁵ 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 파종하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 RANKL (RANKL, 페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-α 배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 실시예 6 에서 제조한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 과 실시예 19 에서 제조한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체를 3 ∼ 100 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고, 추가로 3 일간 CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하였다. 배양 종료 후, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 실시예 9 에 기재된 방법에 의해 측정하였다. 효소 반응 정지 후에 각 웰의 405 ㎚ 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 하였다. 결과를 도 16 에 나타냈다. #32A1 항체 및 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체에 있어서, 50 ng/㎖ 이상의 농도에서 용량 의존적인 TRAP 활성의 억제가 인정되었다. 이 결과로부터, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체는 래트 #32A1 항체와 거의 동등한 마우스의 파골 세포 형성 (파골 세포의 분화와 성숙) 억제 활성을 갖는 것이 나타났다.

b) 정상 인간 파골 전구 세포를 사용한 평가 (TRAP 염색)

정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96 웰 플레이트에 1 × 10⁴ 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 66 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 19 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간 키메라 항체를 최종 농도 0.3, 1, 3, 10 ㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 3 일간 배양하였다. 배양 후 상청을 제거하고, 10 ％ 중성 포르말린을 첨가하여 세포 고정을 실시하였다. 세포 고정 후, 증류수로 2 회 세정하고, TRAP 염색액 (0.27 mM 나프톨 AS-MX 인산 (시그마사 제조), 1.6 mM Fast red violet LB salt (시그마사 제조), 1 ％ 디메틸포름아미드, 50 mM 타르타르산나트륨, 0.1 M 아세트산나트륨 완충액 (pH 5.0)) 을 100 ㎕/웰 첨가하고, 실온에서 5 분 반응시켰다. 증류수로 2 회 세정하고, 현미경하에서 세포를 관찰하였다 (도 17). 그 결과, TRAP 양성 다핵 파골 세포 형성이 #32A1 의 인간 키메라 항체의 첨가에 의해 0.3 ㎍/㎖ 내지 10 ㎍/㎖ 의 범위에서 억제되었다.

실시예 22

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체의 설계 (1)

a) #32A1 의 인간화 버젼의 설계

a)-i) #32A1 의 가변 영역의 분자 모델링

#32A1 의 가변 영역의 분자 모델링은 상동성 모델링으로서 일반적으로 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 에 의해서 실행되었다. Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 (2007)) 에 등록되는 인간 면역 글로불린의 가변 영역의 1 차 배열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 3 차원 구조가 입수 가능하다) 을, 위에서 결정된 #32A1 의 가변 영역과 비교하였다. 결과적으로, 1LK3 이, #32A1 의 경쇄의 가변 영역에 대하여 동일하게 프레임 워크 중에 결손이 있는 항체 중에서, 가장 높은 배열 상동성을 갖는다고 해서 선택되었다. 또한, 1AD0 이 #32A1 의 중쇄의 가변 영역에 대하여 가장 높은 배열 상동성을 갖는다고 해서 선택되었다. 프레임 워크 영역의 3 차원 구조는, #32A1 의 경쇄 및 중쇄에 대응하는 1LK3 및 1AD0 의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」을 얻음으로써 제작되었다. #32A1 의 CDR 은, Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)) 의 분류에 따라서, CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1 및 CDRH2 는 각각 클러스터 15A, 7A, 9A, 10A, 12B 에 할당되었다. CDRH3 은, H3 룰 (FEBS letter 399, 1-8 (1996)) 을 사용하여, k(8)C 로 분류되었다. 이어서, 각각의 CDR 에 관한 대표적인 컨포메이션이 프레임 워크 모델에 도입되었다.

마지막으로, 에너지 면에서 #32A1 의 가변 영역의 가능성이 있는 분자 모델을 얻기 위해, 불리한 원자간 접촉을 제거하기 위한 에너지 계산을 실시하였다. 상기 순서를, 시판되는 단백질 입체 구조 예측 프로그램 Prime 및 배좌 (配座) 탐색 프로그램 Macro Model (Schrodinger, LLC) 을 사용하여 실시하였다.

a)-ii) 인간화 #32A1 에 대한 아미노산 배열의 설계

인간화 #32A1 항체의 구축을, CDR 그라프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시하였다. 억셉터 항체는 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 2 가지 선택되었다. #32A1 의 프레임 워크 영역의 배열을, 항체의 아미노산 배열의 Kabat 데이터베이스 (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) 의 모든 인간 프레임 워크와 비교하여, 결과적으로, M37GO37'CL 항체가 프레임 워크 영역에 관한 73 ％ 의 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. M37GO37'CL 에 관한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를 #32A1 에 관한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는 위에서 구축된 #32A1 의 3 차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그라프팅될 도너 잔기가 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해서 제공되는 기준에 의해서 선택되었다.

#32A1 의 프레임 워크 영역의 배열을, IgBLAST (Nuc. Acid Res.36, D 25-D30 (2007)) 의 모든 인간 프레임 워크와 비교하여, 결과적으로, L 쇄는 AAB34430 이 프레임 워크 영역에 관한 79 ％ 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. H 쇄는 CAF31288 이 프레임 워크 영역에 관한 78 ％ 의 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. L 쇄는 AAB34430 에 관한, H 쇄는 CAF31288 에 관한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를 #32A1 에 관한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는 위에서 구축된 #32A1 의 3 차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그라프팅될 도너 잔기가 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해서 제공되는 기준에 의해서 선택되었다. 어느 방법도, 선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 #32A1 배열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다.

b) #32A1 중쇄의 인간화

b)-i) h#32A1-T1H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 61 (글루탐산), 89 (발린), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 105 (세린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T1H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T1H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 51 에 기재되어 있다. 배열 번호 51 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 51 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 50 에 기재되어 있다. 배열 번호 50 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역 배열, 중쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 50 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 51 의 아미노산 배열은 도 27 에도 기재되어 있다.

b)-ii) h#32A1-T2H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T2H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T2H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 53 에 기재되어 있다. 배열 번호 53 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 53 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 52 에 기재되어 있다. 배열 번호 52 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역 배열, 중쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 52 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 53 의 아미노산 배열은 도 28 에도 기재되어 있다.

b)-iii) h#32A1-T3H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 104 (발린), 114 (이소류신), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 발린, 세린, 글루타민, 메티오닌, 발린, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T3H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T3H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 55 에 기재되어 있다. 배열 번호 55 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 55 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 54 에 기재되어 있다. 배열 번호 54 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역 배열, 중쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 54 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 55 의 아미노산 배열은 도 29 에도 기재되어 있다.

b)-iv) h#32A1-T5H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 61 (글루탐산), 89 (발린), 95 (아스파르트산), 97 (글루탐산), 99 (세린), 104 (발린), 105 (세린), 114 (이소류신), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 발린, 발린, 세린, 글루타민, 글리신, 페닐알라닌, 아스파라긴, 리신, 트레오닌, 메티오닌, 아스파라긴, 발린, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T5H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T5H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 57 에 기재되어 있다. 배열 번호 57 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 57 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 56 에 기재되어 있다. 배열 번호 56 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역 배열, 중쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 56 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 57 의 아미노산 배열은 도 30 에도 기재되어 있다.

b)-v) h#32A1-T6H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 95 (아스파르트산), 97 (글루탐산), 99 (세린), 104 (발린), 114 (이소류신), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 발린, 발린, 세린, 글루타민, 아스파라긴, 리신, 트레오닌, 메티오닌, 발린, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T6H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T6H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 59 에 기재되어 있다. 배열 번호 59 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 59 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 58 에 기재되어 있다. 배열 번호 58 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역 배열, 중쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 58 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 59 의 아미노산 배열은 도 31 에도 기재되어 있다.

b)-vi) h#32A1-T7H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 89 (발린), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 105 (세린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T7H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T7H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 72 에 기재되어 있다. 배열 번호 72 의 아미노산 배열의 1 내지 121 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 122 내지 451 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 72 의 아미노산 배열은 도 38 에도 기재되어 있다.

b)-vii) h#32A1-T8H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 61 (글루탐산), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 105 (세린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 글리신, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T8H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T8H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 73 에 기재되어 있다. 배열 번호 73 의 아미노산 배열의 1 내지 121 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 122 내지 451 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 73 의 아미노산 배열은 도 38 에도 기재되어 있다.

b-viii) h#32A1-T9H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 61 (글루탐산), 89 (발린), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 글리신, 페닐알라닌, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T9H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T9H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 74 에 기재되어 있다. 배열 번호 74 의 아미노산 배열의 1 내지 121 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 122 내지 451 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 74 의 아미노산 배열은 도 38 에도 기재되어 있다.

b)-ix) h#32A1-T10H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 105 (세린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T10H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T10H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 75 에 기재되어 있다. 배열 번호 75 의 아미노산 배열의 1 내지 121 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 122 내지 451 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 75 의 아미노산 배열은 도 39 에도 기재되어 있다.

b)-x) h#32A1-T11H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 89 (발린), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 페닐알라닌, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T11H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T11H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 76 에 기재되어 있다. 배열 번호 76 의 아미노산 배열의 1 내지 121 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 122 내지 451 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 76 의 아미노산 배열은 도 39 에도 기재되어 있다.

b)-xi) h#32A1-T12H 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 #32A1 중쇄의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 61 (글루탐산), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 글리신, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 중쇄를 「h#32A1-T12H 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T12H 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 77 에 기재되어 있다. 배열 번호 77 의 아미노산 배열의 1 내지 121 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 122 내지 451 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 77 의 아미노산 배열은 도 39 에도 기재되어 있다.

c) #32A1 경쇄의 인간화

c)-i) h#32A1-T1L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 122 (알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 리신, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 티로신, 글리신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T1L 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T1L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 61 에 기재되어 있다. 배열 번호 61 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 134 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 61 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 60 에 기재되어 있다. 배열 번호 60 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 400 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역 배열, 경쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 60 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 61 의 아미노산 배열은 도 32 에도 기재되어 있다.

c)-ii) h#32A1-T2L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T2L 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T2L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 63 에 기재되어 있다. 배열 번호 63 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 134 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 63 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 62 에 기재되어 있다. 배열 번호 62 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 400 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역 배열, 경쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 62 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 63 의 아미노산 배열은 도 33 에도 기재되어 있다.

c)-iii) h#32A1-T3L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T3L 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T3L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 65 에 기재되어 있다. 배열 번호 65 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 134 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 65 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 64 에 기재되어 있다. 배열 번호 64 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 400 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역 배열, 경쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 64 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 65 의 아미노산 배열은 도 34 에도 기재되어 있다.

c)-iv) h#32A1-T4L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 36 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 글루탐산, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T4L 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T4L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 67 에 기재되어 있다. 배열 번호 67 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 132 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 133 내지 237 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 67 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 66 에 기재되어 있다. 배열 번호 66 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 397 내지 711 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역 배열, 경쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 66 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 67 의 아미노산 배열은 도 35 에도 기재되어 있다.

c)-v) h#32A1-T5L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 110 (페닐알라닌), 122 (알라닌), 123 (글리신), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 리신, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 티로신, 글리신, 글루타민, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T5L 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T5L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 69 에 기재되어 있다. 배열 번호 69 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 134 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 69 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 68 에 기재되어 있다. 배열 번호 68 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 400 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역 배열, 경쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 68 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 69 의 아미노산 배열은 도 36 에도 기재되어 있다.

c)-vi) h#32A1-T6L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T6L 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T6L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 71 에 기재되어 있다. 배열 번호 71 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 134 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 71 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 70 에 기재되어 있다. 배열 번호 70 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 400 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역 배열, 경쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 70 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 71 의 아미노산 배열은 도 37 에도 기재되어 있다.

c)-vii) h#32A1-T7L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 122 (알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 리신, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 티로신, 글리신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T7L 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-T7L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 78 에 기재되어 있다. 배열 번호 78 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 78 의 아미노산 배열은 도 40 에도 기재되어 있다.

c)-viii) h#32A1-T8L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 122 (알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 티로신, 글리신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T8L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T8L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 79 에 기재되어 있다. 배열 번호 79 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 79 의 아미노산 배열은 도 40 에도 기재되어 있다.

c)-ix) h#32A1-T9L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 122 (알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 리신, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 글리신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T9L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T9L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 80 에 기재되어 있다. 배열 번호 80 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 80 의 아미노산 배열은 도 40 에도 기재되어 있다.

c)-x) h#32A1-T10L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 리신, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 티로신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T10L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T10L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 81 에 기재되어 있다. 배열 번호 81 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 81 의 아미노산 배열은 도 40 에도 기재되어 있다.

c)-xi) h#32A1-T11L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 122 (알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 티로신, 글리신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T11L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T11L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 82 에 기재되어 있다. 배열 번호 82 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 82 의 아미노산 배열은 도 40 에도 기재되어 있다.

c)-xii) h#32A1-T12L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 122 (알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 리신, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 글리신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T12L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T12L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 83 에 기재되어 있다. 배열 번호 83 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 83 의 아미노산 배열은 도 41 에도 기재되어 있다.

c)-xiii) h#32A1-T13L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 리신, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 티로신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T13L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T13L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 84 에 기재되어 있다. 배열 번호 84 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 84 의 아미노산 배열은 도 41 에도 기재되어 있다.

c)-xiv) h#32A1-T14L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 122 (알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 글리신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T14L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T14L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 85 에 기재되어 있다. 배열 번호 85 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 85 의 아미노산 배열은 도 41 에도 기재되어 있다.

c)-xv) h#32A1-T15L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 티로신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T15L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T15L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 86 에 기재되어 있다. 배열 번호 86 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 86 의 아미노산 배열은 도 41 에도 기재되어 있다.

c)-xvi) h#32A1-T16L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 리신, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T16L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T16L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 87 에 기재되어 있다. 배열 번호 87 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 87 의 아미노산 배열은 도 41 에도 기재되어 있다.

c)-xvii) h#32A1-T17L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 122 (알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 글리신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T17L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T17L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 88 에 기재되어 있다. 배열 번호 88 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 88 의 아미노산 배열은 도 42 에도 기재되어 있다.

c)-xviii) h#32A1-T18L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 티로신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T18L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T18L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 89 에 기재되어 있다. 배열 번호 89 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 89 의 아미노산 배열은 도 42 에도 기재되어 있다.

c)-xix) h#32A1-T19L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 66 (글루타민), 68 (아르기닌), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 프롤린, 리신, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T19L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T19L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 90 에 기재되어 있다. 배열 번호 90 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 90 의 아미노산 배열은 도 42 에도 기재되어 있다.

c)-xx) h#32A1-T20L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29 (알라닌), 29-30 사이 (결손 잔기), 36 (글루타민), 41 (세린), 66 (글루타민), 81 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 아스파르트산, 세린, 글루탐산, 아스파라긴, 프롤린, 발린, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 발린, 발린, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T20L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T20L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 91 에 기재되어 있다. 배열 번호 91 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 91 의 아미노산 배열은 도 42 에도 기재되어 있다.

c)-xxi) h#32A1-T21L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 21 (아스파르트산), 24 (류신), 29-30 사이 (결손 잔기), 31 (알라닌), 32 (발린), 34 (류신), 36 (글루타민), 40 (이소류신), 66 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 102 (글루타민), 103 (알라닌), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 122 (알라닌), 123 (글리신), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 글루탐산, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 류신, 프롤린, 글루탐산, 류신, 알라닌, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 페닐알라닌, 류신, 티로신, 글리신, 글루타민, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T21L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T21L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 92 에 기재되어 있다. 배열 번호 92 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 92 의 아미노산 배열은 도 42 에도 기재되어 있다.

c)-xxii) h#32A1-T22L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 21 (아스파르트산), 24 (류신), 29-30 사이 (결손 잔기), 31 (알라닌), 32 (발린), 34 (류신), 36 (글루타민), 40 (이소류신), 66 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 102 (글루타민), 103 (알라닌), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 123 (글리신), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 글루탐산, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 류신, 프롤린, 글루탐산, 류신, 알라닌, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 페닐알라닌, 류신, 글루타민, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T22L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T22L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 93 에 기재되어 있다. 배열 번호 93 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 93 의 아미노산 배열은 도 43 에도 기재되어 있다.

c)-xxiii) h#32A1-T23L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 24 (류신), 29-30 사이 (결손 잔기), 31 (알라닌), 32 (발린), 34 (류신), 36 (글루타민), 40 (이소류신), 66 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 102 (글루타민), 103 (알라닌), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 메티오닌, 트레오닌, 세린, 류신, 프롤린, 글루탐산, 류신, 알라닌, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 페닐알라닌, 류신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T23L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T23L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 94 에 기재되어 있다. 배열 번호 94 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 94 의 아미노산 배열은 도 43 에도 기재되어 있다.

c)-xxiv) h#32A1-T24L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 21 (아스파르트산), 29-30 사이 (결손 잔기), 31 (알라닌), 32 (발린), 34 (류신), 36 (글루타민), 40 (이소류신), 66 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 102 (글루타민), 103 (알라닌), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 122 (알라닌), 123 (글리신), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 글루탐산, 트레오닌, 세린, 류신, 프롤린, 글루탐산, 류신, 알라닌, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 페닐알라닌, 류신, 티로신, 글리신, 글루타민, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T24L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T24L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 95 에 기재되어 있다. 배열 번호 95 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 95 의 아미노산 배열은 도 43 에도 기재되어 있다.

c)-xxv) h#32A1-T25L 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 #32A1 경쇄의 아미노산 번호 29-30 사이 (결손 잔기), 31 (알라닌), 32 (발린), 34 (류신), 36 (글루타민), 40 (이소류신), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 102 (글루타민), 103 (알라닌), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 110 (페닐알라닌), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 트레오닌, 세린, 류신, 프롤린, 글루탐산, 류신, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 페닐알라닌, 티로신, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 #32A1 경쇄를 「h#32A1-T25L 타입 경쇄」로 명명하였다.

또한, h#32A1-T25L 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 96 에 기재되어 있다. 배열 번호 96 의 아미노산 배열의 1 내지 113 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 114 내지 218 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 96 의 아미노산 배열은 도 43 에도 기재되어 있다.

실시예 23

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체 유전자의 제조

a) h#32A1-T1L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L, h#32A1-T5L 및 h#32A1-T6L 타입 경쇄 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 61 의 아미노산 번호 1 내지 133, 배열 번호 63 의 아미노산 번호 1 내지 133, 배열 번호 65 의 아미노산 번호 1 내지 133, 배열 번호 67 의 아미노산 번호 1 내지 132, 배열 번호 69 의 아미노산 번호 1 내지 133 및 배열 번호 71 의 아미노산 번호 1 내지 133 에 각각 나타내는, 분비 시그널과 융합된 h#32A1-T1L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L, h#32A1-T5L 및 h#32A1-T6L 타입 경쇄 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하여 (MBL 사, 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 NheI 및 BsiWI 로 잘라낸 DNA 단편을, 인간화 항체 경쇄 발현 범용 벡터 (pEF6KCL) 를 제한 효소 NheI 및 BsiWI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, h#32A1-T1L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L, h#32A1-T5L 및 h#32A1-T6L 타입 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF6KCL/h#32A1-T1L」,「pEF6KCL/h#32A1-T2L」,「pEF6KCL/h#32A1-T3L」,「pEF6KCL/h#32A1-T4L」,「pEF6KCL/h#32A1-T5L」 및 「pEF6KCL/h#32A1-T6L」로 명명하였다.

b) h#32A1-T1H, h#32A1-T2H, h#32A1-T3H, h#32A1-T5H 및 h#32A1-T6H 중쇄 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 51, 53, 55, 57 및 59 의 아미노산 번호 1 내지 140 에 각각 나타내는, 분비 시그널과 융합된 h#32A1-T1H, h#32A1-T2H, h#32A1-T3H, h#32A1-T5H 및 h#32A1-T6H 중쇄 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하여 (MBL 사 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 BlpI 로 잘라낸 DNA 단편을, 인간화 항체 중쇄 발현 범용 벡터 (pEF1/FCCU-1) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, h#32A1-T1H, h#32A1-T2H, h#32A1-T3H, h#32A1-T5H 및 h#32A1-T6H 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF1/FCCU/h#32A1-T1H」,「pEF1/FCCU/h#32A1-T2H」,「pEF1/FCCU/h#32A1-T3H」,「pEF1/FCCU/h#32A1-T5H」 및 「pEF1/FCCU/h#32A1-T6H」로 명명하였다.

실시예 24

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체의 조제

a) 인간화 항체의 생산

대수 증식기의 293 FreeStyle 세포 1.5 × 10⁸ 개를 신선한 100 ㎖ 의 FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen 사) 에 파종하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터에서 진탕 배양하였다 (125 rpm). Polyethyleneimine (Polyscience 사 제조 #24765) 1 ㎎ 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사 제조) 4 ㎖ 에 용해시켜, 실온에서 5 분간 방치하였다. PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 사용하여 조제한 중쇄 발현 플라스미드 (0.05 ㎎) 및 경쇄 발현 플라스미드 (0.15 ㎎) 를 4 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 현탁시켰다. 실온에서 5 분간 방치한 Polyethyleneimine/OptiPro SFM 혼합액 4 ㎖ 에, 발현 플라스미드/OptiPro SFM 혼합액 4 ㎖ 를 첨가하고, 추가로 실온에서 5 분간 방치하였다. 다음으로 Polyethyleneimine/발현 플라스미드/OptiPro SFM 혼합액 8 ㎖ 를 293 FreeStyle 세포 현탁액에 첨가하여, 진탕 배양을 계속하였다. 37 ℃, 8 ％ CO₂중에서 7 일간 배양한 후, 배양 상청을 회수하였다.

b) 인간화 항체의 정제

상기 a) 에서 얻어진 배양 상청을, Protein A 어피니티 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 500 ㎖ 용 (容) 캡이 장착된 플라스크에 배양 상청 100 ㎖ 를 넣고, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bio-science 사 제조) 현탁액 (50 ％ 슬러리) 1 ㎖ 를 첨가하였다. 10 ℃ 의 인큐베이터 중, 100 rpm 으로 하룻밤 교반하였다. ZebaSpin Column, empty 5 ㎖ (PIERCE 사) 에 293F 배양 상청/MabSelectSuRe 현탁액을 어플라이하였다. 수지가 칼럼에 전부 들어간 후, 1 M NaCl 10 ㎖ 로 세정하였다. 다음으로 1 M 아르기닌 용액 (pH 4.0) 1 ㎖ 를 어플라이하여, 항체가 함유되는 획분을 모았다. 그 획분을 Centrifugal Filter Device (Amicon Ultra 4, 분획 분자량 50 K, 밀리포어사) 에 첨가하여, 시트르산 완충으로의 액 치환 및 농축을 실시하였다. 최종적인 용량을 200 ㎕ 로 하여, 정제 샘플로 하였다.

pEF6KCL/h#32A1-T1L 과 pEF1/FCCU/h#32A1-T1H 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-T1」, pEF6KCL/h#32A1-T2L 과 pEF1/FCCU/h#32A1-T2H 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-T2」, pEF6KCL/h#32A1-T3L 과 pEF1/FCCU/h#32A1-T3H 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-T3」, pEF6KCL/h#32A1-T4L 과 pEF1/FCCU/h#32A1-T3H 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-T4」, pEF6KCL/h#32A1-T5L 과 pEF1/FCCU/h#32A1-T5H 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-T5」, pEF6KCL/h#32A1-T6L 과 pEF1/FCCU/h#32A1-T6H 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-T6」으로 명명하였다.

실시예 25

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체의 마우스 Siglec-15 단백질에 대한 결합성 평가

래트 항마우스 Siglec-15 #32A1 인간화 항체 T1-T6 의 마우스 Siglec-15-Fc 및 인간 Siglec-15-Fc 에 대한 결합성을 이하의 방법으로 평가하였다. 실시예 4 에서 정제한 마우스 Siglec-15-Fc, 또는 실시예 12 에서 정제한 인간 Siglec-15-Fc 를 PBS 에 의해 1 ㎍/㎖ 로 희석 후, 이뮤노 플레이트 (Nunc 사 제조 #437111) 에 100 ㎕/웰로 분주하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시킴으로써 플레이트에 각 단백질을 흡착시켰다. 다음날, 웰을 PBS-T 액 (PBS, 0.05 ％ (v/v) Tween 20) 으로 5 회 세정 후, 스킴 밀크 (모리나가 유업사 제조) 를 PBS 에 의해 5 ％ 로 희석시킨 용액을 350 ㎕/웰로 분주하여, 실온에서 2 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 액을 제거하고 PBS-T 액으로 5 회 세정 후, 실시예 24 에서 조제한 정제 래트 항마우스 Siglec-15 #32A1 인간화 항체 T1-T6 또는 실시예 19 에서 조제한 인간 키메라 항체를, 0.5 ％ 스킴 밀크 함유 PBS 액을 사용하여 최종 농도가 1 ∼ 0.004 ㎍/㎖ (4 배 희석 계열) 가 되도록 희석 후 100 ㎕/웰로 분주하고, 2 시간 실온에서 가만히 정지시켰다. 그 때, 각 항체 농도는 스펙트로포토미터 DU7400 (벡크만사 제조) 으로 280 ㎚ 를 측정하고, 각 항체의 몰 분자 흡광 계수에 기초하여 결정하였다. PBS-T 액으로 5 회 웰을 세정 후, TBS-T 액 (TBS, 0.05 ％ (v/v) Tween 20) 으로 2500 배로 희석시킨 Alkaline Phosphatase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Human IgG (Jackson Immuno Research 사 제조 #109-055-097) 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 액을 제거하여, TBS-T 액으로 5 회 웰을 세정한 후, 형광 기질액 (Roche 사 제조 #11681982001) 을 100 ㎕/웰로 첨가하여 형광 반응을 실시하였다. 마우스 Siglec-15-Fc 흡착 플레이트는 형광 기질액 첨가 10 분 후, 인간 Siglec-15-Fc 플레이트는 15 분 후에, 각각 스펙트라맥스 M5 (몰레큘러 디바이스사 제조) 로 형광 강도를 측정하였다. 그 결과, 검토한 래트 항마우스 Siglec-15 인간화 항체 6 검체 전부에 있어서, 항체의 농도에 의존한 마우스 Siglec-15 단백질 (도 18) 및 인간 Siglec-15 단백질 (도 19) 에 대한 결합이 확인되었다.

실시예 26

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 키메라 항체의 첨가에 의한, 마우스 골수 비부착 세포의 파골 세포 분화에 대한 영향 (TNFα 자극)

실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 및 실시예 19 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 키메라 항체를 사용하여, 마우스 골수 비부착 세포의 TNFα 자극에 의한 파골 세포 분화에 대한 영향을 검토하였다. 실시예 8 의 방법으로 조제한 마우스 골수 비부착 세포를, 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS), 10 ng/㎖ M-CSF, 및 2 ng/㎖ TGF-β (R&D Systems 사 제조) 를 함유하는 α-MEM 배지에서 1.5 × 10⁵ 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 파종하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 유전자 재조합형 TNFα (R&D Systems 사 제조) 를 최종 농도 30 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-α 배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 실시예 6 에서 제조한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 및 실시예 19 에서 제조한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 키메라 항체를 0.125 ∼ 4 ㎍/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고 추가로 3 일간 CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하였다. 동시에 특허 WO96/26217호의 명세서에 기재된 방법으로 조제한 인간 유전자 재조합형 OCIF/OPG 를 100 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하여 배양한 웰도 준비하였다. 배양 종료 후, Leukocyte Acid Phosphatase kit (시그마사 제조) 를 사용하여, 키트에 첨부된 프로토콜에 따라서 TRAP 염색을 실시하고, TRAP 양성 다핵 파골 세포의 형성을 관찰하였다. 그 결과, 항마우스 Siglec-15 폴리클로날 항체의 첨가에 의해 TRAP 양성에서 거대한 다핵 파골 세포의 형성이 억제되었다 (도 20). 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 및 그 키메라 항체를 첨가한 경우에도 단핵이고 소형의 파골 세포는 형성되었지만, TNFα 로 유도되는 대형이면서 다핵의 파골 세포의 형성은 거의 완전히 억제되었다. 그 한편으론, RANKL 블로커인 OCIF/OPG 를 충분량 첨가하여도, 대형이면서 다핵의 파골 세포의 형성은 거의 억제되지 않았다. 또한 마찬가지로, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 실시예 9 에 기재된 조작으로 측정하였다. 효소 반응 정지 후에 각 웰의 405 ㎚ 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 하였다. 결과를 도 21 에 나타내었다. #32A1 항체 및 #32A1 의 키메라 항체에 있어서, 125 ng/㎖ 내지 4 ㎍/㎖ 의 범위에서, 현저한 TRAP 활성의 억제가 인정되었다. 이들 결과로부터, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 및 그 키메라 항체는 TNFα 로 유도되는 파골 세포의 분화 성숙에 있어서의 세포 융합의 과정을 강하게 억제하는 것이 나타났다.

실시예 27

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #8A1, #32A1 의 래트 파골 세포 형성 시험에서의 생물 활성 평가

실시예 6 에 있어서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #8A1, #32A1 을 사용하여, 래트 골수 비부착 세포의 파골 세포로의 분화의 영향을 검토하였다. 실시예 8 의 방법을 개변하여 래트 골수 비부착 세포를 조제하였다. 즉, 12 주령의 암컷 F344 래트의 양 다리로부터 대퇴골을 적출하고, 연조직을 제거하였다. 이 대퇴골의 양단을 잘라내고, 23 게이지의 주사 바늘이 달린 시린지에 의해 MEM-α 배지를 주입하여 골수 세포를 압출시키고, 원심 튜브에 회수하였다. 실온에서 100 g, 5 분간 원심하여 상청을 버린 후에, 세포의 펠릿에 Hemolytic Buffer 1 ㎖ (RED BLOOD CELL LYSING BUFFER, 시그마사 제조) 를 첨가하여 현탁시키고, 실온에서 5 분간 방치하였다. 20 ㎖ 의 D-PBS 를 첨가하여 실온에서 100 g, 5 분간 원심하고, 상청을 버린 후에 세포의 펠릿에 5 ng/㎖ M-CSF (R＆D Systems 사 제조), 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS) 을 함유하는 MEM-α 배지 (인비트로젠사 제조) 10 ㎖ 를 첨가하여 현탁시키고, 셀 스트레이너 (40 ㎛ Nylon, BD 팔콘사 제조) 를 통과시켜 응집물을 제거하였다. 이 세포를 75 ㎠-T 플라스크 (부착 세포용) 로 옮기고, CO₂ 인큐베이터 중에서 하룻밤 배양하였다. 하룻밤 배양 후, T-플라스크에 부착되어 있지 않은 세포를 회수하여, 래트 골수 비부착 세포로서 사용하였다.

이 방법으로 조제한 래트 골수 비부착 세포를 실시예 9 의 방법에 준하여 배양하여 래트 파골 세포 형성 시험을 실시하였다. 즉, 조제한 래트 골수 비부착 세포를 10 ％ FBS 와 10 ng/㎖ M-CSF (R＆D Systems 사 제조) 를 함유하는 α-MEM 배지에서 1.5 × 10⁵ 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 파종하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 RANKL (RANKL, 페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-α 배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 실시예 6 에서 제조한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #8A1, #32A1 을 31 ∼ 1000 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고, 추가로 3 일간 CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하였다. 배양 종료 후에, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 실시예 9 에 기재된 방법에 의해 측정하였다. 효소 반응 정지 후에 각 웰의 405 ㎚ 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 하였다. 결과를 도 22 에 나타냈다. #8A1 항체에서는, 63 ng/㎖ 이상의 농도에서 용량 의존적인 TRAP 활성의 억제가 인정되었다. 또한 #32A1 항체에서는, 31 ng/㎖ 이상의 농도에서 용량 의존적인 TRAP 활성의 억제가 인정되었다. 이들 결과로부터, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #8A1, #32A1 은 마우스의 파골 세포 형성과 동일하게 래트의 파골 세포 형성도 강하게 억제하는 것, 및 #32A1 항체의 in vitro 에서의 래트 파골 세포 형성 억제 활성은 #8A1 항체보다 강한 것이 나타났다.

실시예 28

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체의 설계 (2)

a) #32A1 의 인간화 버젼의 설계

a)-i) 인간화 #32A1 에 대한 아미노산 배열의 설계

인간화 #32A1 항체의 구축을, CDR 그라프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시하였다. CDR 영역의 정의는, CDRH2 이외에는 모두 Kabat 의 정의 (SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL.I, FIFTH EDITION (1991)) 를 사용하였다. CDRH2 에 관해서는, 독자적인 정의를 사용하여 C 말단을 Kabat 의 정의보다 5 잔기 단축시켰다. 이와 같이 정의된 CDRH2 를 포함하는 중쇄 배열에서는, 래트 유래의 CDR 배열이 단축되고, 인간 프레임 워크 배열이 보다 많이 도입되어 있어, 인간에게 투여되었을 때에 이종 항원으로서 한층 더 인식되기 어렵다. 억셉터 항체는 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 선택되었다. #32A1 의 프레임 워크 영역의 배열을 항체의 아미노산 배열의 Kabat 데이터베이스 (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 (2001)) 의 모든 인간 프레임 워크와 비교하여, 결과적으로, L 쇄는 GF4/1.1'CL 이 프레임 워크 영역에 관한 71 ％ 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. H 쇄는 M37GO37'CL 이 프레임 워크 영역에 관한 73 ％ 의 배열 상동성에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. L 쇄는 GF4/1.1'CL 에 관한, H 쇄는 M37GO37'CL 에 관한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를 #32A1 에 관한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는 실시예 22a)-i) 에서 구축된 #32A1 의 3 차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그라프팅될 도너 잔기가 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해서 제공되는 기준에 의해 선택되었다. 선택된 몇 개의도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 #32A1 배열을 이하의 실시예에 기재되는 바와 같이 구축하였다.

a)-ii) #32A1 중쇄의 인간화

a)-ii)-i) h#32A1-H1-1 타입 중쇄 :

배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 32A1 의 아미노산 번호 23 (이소류신), 24 (류신), 26 (트레오닌), 32 (리신), 43 (트레오닌), 61 (글루탐산), 83 (글루탐산), 85 (류신), 86 (글루탐산), 89 (발린), 95 (아스파르트산), 96 (세린), 97 (글루탐산), 98 (세린), 100 (발린), 104 (발린), 105 (세린), 114 (이소류신), 118 (트레오닌), 134 (발린), 135 (메티오닌), 140 (류신) 을 각각 류신, 발린, 세린, 글루타민, 알라닌, 글리신, 알라닌, 발린, 리신, 페닐알라닌, 아스파라긴, 알라닌, 리신, 아스파라긴, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 발린, 알라닌, 트레오닌, 류신, 세린으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 32A1 중쇄를 「h#32A1-H1-1 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-H1-1 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 99 에 기재되어 있다. 배열 번호 99 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 99 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 98 에 기재되어 있다. 배열 번호 98 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역 배열, 중쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 98 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 99 의 아미노산 배열은 도 54 에도 기재되어 있다.

a)-iii) #32A1 경쇄의 인간화

a)-iii)-i) h#32A1-L2-15 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 32A1 의 아미노산 번호 21 (아스파르트산), 23 (발린), 24 (류신), 29-30 사이 (결손 잔기), 31 (알라닌), 32 (발린), 34 (류신), 36 (글루타민), 40 (이소류신), 66 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 102 (글루타민), 103 (알라닌), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 110 (페닐알라닌), 122 (알라닌), 123 (글리신), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 글루탐산, 류신, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 류신, 프롤린, 글루탐산, 류신, 알라닌, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 페닐알라닌, 류신, 티로신, 글리신, 글루타민, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 32A1 경쇄를 「h#32A1-L2-15 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-L2-15 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 103 에 기재되어 있다. 배열 번호 103 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 134 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 103 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 102 에 기재되어 있다. 배열 번호 102 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 400 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역 배열, 경쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 102 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 103 의 아미노산 배열은 도 56 에도 기재되어 있다.

a)-iii)-ii) h#32A1-L2-16 타입 경쇄 :

배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 32A1 의 아미노산 번호 21 (아스파르트산), 23 (발린), 24 (류신), 29-30 사이 (결손 잔기), 31 (알라닌), 32 (발린), 34 (류신), 36 (글루타민), 40 (이소류신), 66 (글루타민), 99 (아스파라긴), 100 (프롤린), 101 (발린), 102 (글루타민), 103 (알라닌), 104 (아스파르트산), 106 (이소류신), 108 (트레오닌), 123 (글리신), 127 (류신), 129 (류신), 130 (아르기닌), 132 (알라닌) 을 각각 글루탐산, 류신, 메티오닌, 트레오닌, 세린, 류신, 프롤린, 글루탐산, 류신, 알라닌, 세린, 세린, 류신, 글루탐산, 프롤린, 글루탐산, 페닐알라닌, 류신, 글루타민, 발린, 이소류신, 리신, 트레오닌으로 치환하는 것을 따라 설계된 인간화 32A1 경쇄를 「h#32A1-L2-16 타입 경쇄」로 명명하였다.

h#32A1-L2-16 타입 경쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 105 에 기재되어 있다. 배열 번호 105 의 아미노산 배열의 1 내지 20 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 134 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역, 경쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 105 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 104 에 기재되어 있다. 배열 번호 104 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 400 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 경쇄 가변 영역 배열, 경쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 104 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 105 의 아미노산 배열은 도 57 에도 기재되어 있다.

b) 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체 유전자의 제조

b)-i) 인간 중쇄 발현 범용 벡터 pEG2 의 구축

배열 번호 106 에 나타내는 인간 IgG2 시그널 배열 및 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하여 (MBL 사, 인공 유전자 합성 서비스), 제한 효소 NheI 및 PmeI 로 소화시키고, 약 1100 bp 의 DNA 단편을 얻었다. 이 DNA 단편을, pEF1/FCCU-1 을 NheI 및 PmeI 로 소화시키고, 약 1100 bp 의 DNA 단편을 제거하여 얻어지는 약 6200 bp 의 DNA 단편과 결합시킴으로써, 인간화 항체 (hIgG2 형) 중쇄 발현 범용 벡터 pEG2 를 구축하였다.

b)-ii) h#32A1-H1-1 중쇄 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 99 의 아미노산 번호 1 내지 140 에 나타내는, 분비 시그널과 융합된 h#32A1-H1-1 중쇄 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하여 (Invitrogen), 제한 효소 BlpI 로 잘라낸 DNA 단편을, 인간화 항체 (hIgG2 형) 중쇄 발현 범용 벡터 (pEG2) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, h#32A1-H1-1 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEG2/h#32A1-H1-1」로 명명하였다.

b)-iii) h#32A1-H5 중쇄 발현 벡터의 구축

실시예 22, b)-iv) 에서 설계된 h#32A1-T5H 타입 중쇄의 시그널 배열 및 정상 영역을 IgG2 타입으로 변경한 인간화 32A1 중쇄를 「h#32A1-H5 타입 중쇄」로 명명하였다.

h#32A1-H5 타입 중쇄의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 101 에 기재되어 있다. 배열 번호 101 의 아미노산 배열의 1 내지 19 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열, 141 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역, 중쇄 정상 영역에 상당한다. 배열 번호 101 의 아미노산 배열을 코드하는 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 100 에 기재되어 있다. 배열 번호 100 의 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열, 421 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이 각각 시그널 배열, 중쇄 가변 영역 배열, 중쇄 정상 영역 배열을 코드하고 있다. 배열 번호 100 의 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 101 의 아미노산 배열은 도 55 에도 기재되어 있다.

실시예 23 에서 제조한 pEF1/FCCU/h#32A1-T5H 로부터 제한 효소 BlpI 로 잘라낸 DNA 단편을, 인간화 항체 (hIgG2 형) 중쇄 발현 범용 벡터 (pEG2) 를 제한 효소 BlpI 로 절단한 지점에 삽입함으로써, h#32A1-H5 중쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「pEG2/h#32A1-H5」로 명명하였다.

b)-iv) h#32A1-L2-15 및 h#32A1-L2-16 타입 경쇄 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 103 의 아미노산 번호 1 내지 133 및 배열 번호 105 의 아미노산 번호 1 내지 133 에 각각 나타내는, 분비 시그널과 융합된 h#32A1-L2-15 및 h#32A1-L2-16 타입 경쇄 가변 영역을 코드하는 유전자를 포함하는 DNA 를 합성하여 (Invitrogen), 실시예 23 과 동일한 방법에 의해, h#32A1-L2-15 및 h#32A1-L2-16 타입 경쇄 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 각각 「pEF6KCL/h#32A1-L2-15」 및 「pEF6KCL/h#32A1-L2-16」으로 명명하였다.

c) 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체의 조제

c)-i) 인간화 항체의 생산

1.2 × 10⁹ 개의 대수 증식기의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen) 를 신선한 1.2 ℓ 의 FreeStyle 293 Expression Medium (Invitrogen 사) 에 파종하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터 안에서 90 rpm 으로 1 시간 진탕 배양하였다. Polyethyleneimine (Polyscience #24765) 3.6 ㎎ 을 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen) 20 ㎖ 에 용해시키고, 다음으로 PureLink HiPure Plasmid 키트 (Invitrogen 사) 를 사용하여 조제한 H 쇄 발현 플라스미드 (0.4 ㎎) 및 L 쇄 발현 플라스미드 (0.8 ㎎) 를 20 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지에 현탁시켰다. Polyethyleneimine/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 에, 발현 플라스미드/Opti-Pro SFM 혼합액 20 ㎖ 를 첨가하여 천천히 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO₂인큐베이터에서 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 Disposable Capsule Filter (Advantec #CCS-045-E1H) 로 여과하였다.

pEF6KCL/h#32A1-T5L 과 pEG2/h#32A1-H5 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-H5/L5」, pEF6KCL/h#32A1-T5L 과 pEG2/h#32A1-H1-1 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-H1-1/L5」, pEF6KCL/h#32A1-L2-15 와 pEG2/h#32A1-H1-1 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-H1-1/L2-15」, pEF6KCL/h#32A1-L2-16 과 pEG2/h#32A1-H1-1 의 조합에 의해서 취득된 #32A1 의 인간화 항체를 「h#32A1-H1-1/L2-16」으로 명명하였다.

c)-ii) 인간화 항체의 정제

상기 c)-i) 에서 얻어진 배양 상청을, rProtein A 어피니티 크로마토그래피 (4-6 ℃ 하) 와 세라믹하이드록실 아파타이트 (실온하) 의 2 단계 공정으로 정제하였다. rProtein A 어피니티 크로마토그래피 정제 후와 세라믹하이드록실 아파타이트 정제 후의 버퍼 치환 공정은 실온하에서 실시하였다. 처음에, 배양 상청 1100-1200 ㎖ 를, PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap 칼럼 : 용적 1 ㎖ × 2 연결) 에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS 15-30 ㎖ 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌염산염 용액 (pH 4.0) 으로 용출시켜, 항체가 함유되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖ × 2 연결) 에 의해 5 mM 인산나트륨/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 치환을 실시하였다. 그리고 그 치환한 항체 용액을, 5 mM NaPi/50 mM MES/20 mM NaCl/pH 6.5 의 버퍼로 평형화된 세라믹하이드록실 아파타이트 칼럼 (일본 바이오래드, Bio-Scale CHT2-1 Hydroxyapatite Column : 용적 2 ㎖) 에 어플라이하였다. 염화나트륨에 의한 직선적 농도 구배 용출을 실시하여, 항체가 함유되는 획분을 모았다. 그 획분을 탈염 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조, HiTrap Desalting 칼럼 : 용적 5 ㎖ × 2 연결) 에 의해 CBS (10 mM 시트르산 완충액/140 mM 염화나트륨, pH 6.0) 으로의 액 치환을 실시하였다. 마지막으로 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 30 K, Sartorius 사, 4 ℃ 하) 에 의해 농축시키고, IgG 농도를 1.0 ㎎/㎖ 이상으로 조제하여 정제 샘플로 하였다. 각 정제 샘플의 용량은 h#32A1-H1-1/L5 : 2.2 ㎖, h#32A1-H5/L5 : 1.8 ㎖, h#32A1-H1-1/L2-16 : 6.0 ㎖, h#32A1-H1-1/L2-15 : 2.2 ㎖ 였다.

실시예 29

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체의 마우스 파골 세포 형성 시험에서의 생물 활성 평가

실시예 24 및 28 에 의해서 취득된 인간화 항체가 나타내는 마우스 파골 세포 형성 억제 효과를, 실시예 9 에 기재된 방법을 일부 개변하여 평가하였다. 실시예 8 의 방법으로 조제한 마우스 골수 비부착 세포를 10 ％ FBS 와 10 ng/㎖ M-CSF (R＆D Systems 사 제조) 를 함유하는 α-MEM 배지에서 1.5 × 10⁵ 세포/㎖ 로 조제한 것을 96 웰 플레이트의 각 웰에 200 ㎕ 파종하고, CO₂ 인큐베이터 중에서 2 일간 배양하였다. 96 웰 플레이트 중의 오래된 배양액을 제거하고, 인간 RANKL (RANKL, 페프로테크사 제조) 을 최종 농도 20 ng/㎖, M-CSF 를 10 ng/㎖ 가 되도록 첨가한 10 ％ FBS 함유 MEM-α 배지 100 ㎕ 를 첨가하였다. 이 세포 배양액에, 실시예 6 에서 제조한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1) 및 실시예 24 에서 조제한 6 종류의 인간화 #32A1 항체 (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5, h#32A1-T6) 를 3 ∼ 100 ng/㎖ 의 농도가 되도록 첨가하고, 추가로 3 일간 CO₂ 인큐베이터 중에서 배양하였다. 배양 종료 후에, 형성된 파골 세포의 타르타르산 내성 산성 포스파타아제 (TRAP) 활성을 이하의 조작으로 측정하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰의 배양액을 흡인 제거하고, 1 ％ Triton X-100 을 함유하는 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 6.1) 50 ㎕ 를 각 웰에 첨가하여, 플레이트 진탕기로 5 분간 진탕하여 세포를 가용화시켰다. 이들 각 웰에 기질 용액 (5 ㎎/㎖ p-nitrophenyl phosphate 및 0.46 ％ 타르타르산나트륨을 함유하는 50 mM 시트르산나트륨 완충액 (pH 6.1)) 50 ㎕ 를 첨가하여 실온에서 10 분간 인큐베이트하였다. 인큐베이트 후에 96 웰 플레이트의 각 웰에 1 N 수산화나트륨 용액 50 ㎕ 를 첨가하여 효소 반응을 정지시켰다. 효소 반응 정지 후에 각 웰의 405 ㎚ 의 흡광도를 측정하여 TRAP 활성의 지표로 하였다. 결과를 도 44 및 45 에 나타냈다. 또한 이 시험과 동일한 방법으로, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체), 실시예 19 에서 조제한 #32A1 항체의 인간 키메라 항체, 및 실시예 28 에서 조제한 4 종류의 인간화 #32A1 항체 (h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16, h#32A1-H1-1/L2-15) 에 관해서 그 생물 활성을 평가하고, 그 결과를 도 46 및 47 에 나타내었다. 활성을 평가한 10 종류의 인간화 #32A1 항체 (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5, h#32A1-T6, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16, h#32A1-H1-1/L2-15) 모두에 있어서, 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체), 또는 #32A1 항체의 인간 키메라 항체와 거의 동등한 강한 파골 세포 형성 억제 활성이 인정되었다.

실시예 30

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체 첨가에 의한 정상 인간 파골 전구 세포의 골흡수 활성에 대한 영향 (콜라겐 코트 플레이트를 사용한 평가)

정상 인간 파골 전구 세포 (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 2T-110) 를, 세포에 첨부된 프로토콜에 따라 96-well OsteoLyse cell culture plate (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PA-1500) 에 1 × 10⁴ 세포/웰이 되도록 파종하였다. 또한 배지는 소 태아 혈청 (최종 농도 10 ％), 인간 RANKL (최종 농도 63.8 ng/㎖) 및 인간 M-CSF (최종 농도 33 ng/㎖) 등을 함유하는 OPGM 첨가 인자 세트 (산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-9501) 를 첨가한 파골 전구 세포용 기초 배지 (OPBM, 산코 쥰야쿠로부터 구입, 카탈로그 번호 PT-8201) 를 사용하였다. 이 배양 상청 중에, 실시예 6 에서 조제한 래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 (#32A1 항체), 실시예 19 에서 조제한 #32A1 항체의 인간 키메라 항체, 및 실시예 24 및 28 에서 조제한 10 종류의 인간화 #32A1 항체 (h#32A1-T1, h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5, h#32A1-T6, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16, h#32A1-H1-1/L2-15) 를 최종 농도 4, 20, 100, 500 ng/㎖ 가 되도록 첨가하여, CO₂ 인큐베이터 중에서 5 일간 배양하였다. 배양 상청 10 ㎕ 를 채취하고, OsteoLyse Assay Kit 에 부속된 Fluorophore Releasing Reagent 를 200 ㎕ 첨가하여, 형광 플레이트 리더 (ARVO MX, 퍼킨엘머사 제조) 를 사용해서 유로퓸에 의한 형광 측정에 적합한 시간 분해 형광 측정 (Time-resolved fluorecence fluorimeter) (Excitation : 340 ㎚, Emission : 615 ㎚) 함으로써, 배양 상청 중에 방출된 유리 (遊離) 형광 콜라겐 단편량을 정량하였다 (도 48 및 49). 그 결과, RANKL 첨가에 의해 증가한 형광 콜라겐 단편량이, 래트 #32A1 항체나 인간 키메라 #32A1 항체 첨가에 의해 농도 의존적으로 억제되었다. 마찬가지로, 검토한 10 종류 모든 인간화 #32A1 항체에 의해서도, 농도 의존적인 억제가 인정되었다. 이 사실로부터, 인간 파골 세포의 골흡수 활성이 Siglec-15 단백질과 특이적으로 결합하는 인간화 #32A1 항체에 의해 억제되는 것이 밝혀졌다.

실시예 31

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체의 난소 적출 래트를 사용한 생물학적 평가

실시예 24 및 28 에 의해서 취득된 인간화 항체가 나타내는, 난소 적출 래트에 있어서의 골밀도 감소에 대한 억제 효과는 실시예 15 에 기재된 방법으로 평가할 수 있다.

실시예 32

래트 항마우스 Siglec-15 모노클로날 항체 #32A1 의 인간화 항체의 TNFα 자극에 의한 마우스 파골 세포 형성 시험에서의 생물 활성 평가

실시예 24 및 28 에 의해서 취득된 인간화 항체가 나타내는 TNFα 자극에 의한 마우스 파골 세포 형성 억제 효과는 실시예 26 에 기재된 방법으로 평가할 수 있다.

실시예 33

시차 주사 열량계 (DSC) 를 사용한 인간화 항체의 열 안정성 측정

h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H1-1/L2-15, h#32A1-H1-1/L2-16 에 관해서, 열 안정성의 측정을 실시하였다. 이들 샘플을 0.5 ㎎/㎖ 의 농도 (CBS 용액) 로 조제하여, 400 ㎕ 씩 시료 용액으로서 DSC 측정에 사용하였다. DSC 측정 조건은 다음과 같이 설정하였다. 즉, 초기 온도는 20 ℃, 최종 온도를 100 ℃ 로 하고, 승온 속도를 60 ℃/1 시간, 필터 시간 10 초로 하였다. 참조액은 CBS 를 사용하였다. DSC 측정 장치로는, 미국 MicroCal 사 제조의 VP-Capillary DSC Platform 을 사용하였다. 시료 용액에서 얻어진 스캔 곡선으로부터 베이스라인 (시료 셀에도 참조 용액을 충전하여 얻어진 스캔 곡선) 을 공제하여 베이스라인 보정을 실시하였다. 도 50 이 h#32A1-H5/L5 의 서모그램, 도 51 이 h#32A1-H1-1/L5 의 서모그램, 도 52 가 h#32A1-H1-1/L2-15 의 서모그램, 도 53 이 h#32A1-H1-1/L2-16 의 서모그램을 나타낸다. 각각의 피크톱값을 Fab 영역의 열변성 중점 Tm 으로 하면, h#32A1-H5/L5 의 Tm 값이 81.2 ℃, h#32A1-H1-1/L5 의 Tm 값이 84.1 ℃, h#32A1-H1-1/L2-15 의 Tm 값이 80.0 ℃, h#32A1-H1-1/L2-16 (IgG2) 의 Tm 값이 77.9 ℃ 였다.

산업상 이용가능성

본 발명의 키메라 또는 인간화 항 Siglec-15 항체는 파골 세포의 분화 또는 골흡수 활성의 억제능을 갖고, 그 항 Siglec-15 항체를 함유하는 의약 조성물은 골대사 이상 질환의 치료 또는 예방제가 될 수 있다.

독립 행정법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터

FERMBP-10999

20080828

SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Anti-Siglec-15 antibodies <130> DSPCT-FP1021 <150> JP 2009-94613 <151> 2009-04-09 <160> 106 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 987 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(987) <223> Inventor: Hiruma, Yoshiharu; Tsuda, Eisuke <223> Inventor: Takizawa, Takeshi; Nakayama, Makiko <400> 1 atg gaa aag tcc atc tgg ctg ctg gcc tgc ttg gcg tgg gtt ctc ccg 48 Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro 1 5 10 15 aca ggc tca ttt gtg aga act aaa ata gat act acg gag aac ttg ctc 96 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 aac aca gag gtg cac agc tcg cca gcg cag cgc tgg tcc atg cag gtg 144 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 cca ccc gag gtg agc gcg gag gca ggc gac gcg gca gtg ctg ccc tgc 192 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 acc ttc acg cac ccg cac cgc cac tac gac ggg ccg ctg acg gcc atc 240 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cca cgg tcc cag 912 Arg Arg Pro Glu His Leu Asp Thr Pro Asp Thr Pro Pro Arg Ser Gln 290 295 300 gcc cag gag tcc aat tat gaa aat ttg agc cag atg aac ccc cgg agc 960 Ala Gln Glu Ser Asn Tyr Glu Asn Leu Ser Gln Met Asn Pro Arg Ser 305 310 315 320 cca cca gcc acc atg tgc tca ccg tga 987 Pro Pro Ala Thr Met Cys Ser Pro 325 <210> 2 <211> 328 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro 1 5 10 15 Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu 20 25 30 Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val 35 40 45 Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys 50 55 60 Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile 65 70 75 80 Trp Arg Ala Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Ala 85 90 95 Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly 100 105 110 Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg 115 120 125 Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp 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aatcgggggc 1080 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 1140 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 1200 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 1260 cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 1320 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1380 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1440 agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1500 tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 1560 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1620 cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1680 aggcttttgc aaaaagctcc cggg 1704 <210> 34 <211> 1120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> human IgG1 signal + human IgG1 constant <400> 34 tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg 60 ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg gttagctcag cctccaccaa 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cct gcc cct cct gtg gcc gga 768 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 245 250 255 cct tcc gtg ttc ctt ttc cct cct aag cct aag gac acc ctg atg atc 816 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 agc cgt acc cct gag gtg acc tgt gtg gtg gtg gac gtg tcc cac gag 864 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 gac cct gag gtg cag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cac 912 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 aac gcc aag acc aag cct cgt gag gag caa ttc aac agc acc ttc cgt 960 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 305 310 315 320 gtg gtg tcc gtg ctt acc gtg gtg cac caa gac tgg ctg aac ggc aag 1008 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 gag tac aag tgt aag gtg agc aac aag gga ctt cct gcc cct atc gag 1056 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 aag acc atc tcc aag acc aag ggc caa cct cgt gag cct caa gtg tac 1104 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 acc ctt cct cct agc cgt gag gag atg acc aag aac caa gtg tcc ctt 1152 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 acc tgt ctg gtg aag ggc ttc tac cct agc gac atc gcc gtg gag tgg 1200 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 gag tcc aac gga caa cct gag aac aac tac aag acc acc cct cct atg 1248 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 405 410 415 ctt gac agc gac ggc tcc ttc ttc ctg tac agc aag ctg acc gtg gac 1296 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 aag tcc cgt tgg caa caa ggc aac gtg ttc agc tgt tcc gtg atg cac 1344 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 gag gcc ctg cac aac cac tac acc caa aag agc ctt tcc ctg agc cct 1392 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 gga aag 1398 Gly Lys 465 <210> 101 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 101 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Phe 35 40 45 Asn Asp Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Ile Tyr Thr Tyr Ala Thr Phe 65 70 75 80 Tyr Ala Glu Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 85 90 95 Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Leu Thr Gly Gly Asp Tyr Phe Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu 145 150 155 160 Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 180 185 190 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 195 200 205 Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn 210 215 220 Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg 225 230 235 240 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 102 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h#32A1-L2-15 <220> <221> CDS <222> (1)..(714) <400> 102 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gaa att ctg atg acg cag agt cct gca act ctt agt 96 Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 ctg tca cct ggc gag aga gcc aca ctc agc tgc cga gcg tcc cag tcc 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 gtg acc att agc ggc tat tct ttt att cat tgg tat cag caa aag cct 192 Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 gga cag gcg cca agg ctg ctc att tac aga gca agc aac ctt gcc tct 240 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser 65 70 75 80 ggc att cca gca aga ttc agc ggg agc gga tca ggg aca gat ttc acc 288 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ttg acc atc tcc tcc ctg gag ccg gag gat ttc gcg ttg tat tat tgt 336 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys 100 105 110 cag caa tct agg aag agt cca tgg aca ttt ggc cag ggc acc aaa gtg 384 Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 115 120 125 gag atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc 432 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg 480 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc 576 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc 624 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc 672 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 714 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 103 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 103 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser 65 70 75 80 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys 100 105 110 Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 104 <211> 714 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> h#32A1-L2-16 <220> <221> CDS <222> (1)..(714) <400> 104 atg gtg ctg cag acc cag gtg ttc atc tcc ctg ctg ctg tgg atc tcc 48 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 ggc gca tat ggc gaa atc ctg atg aca cag agt cct gcg acc ctc tcc 96 Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 ctc tca cca ggc gag agg gcc acc ctg tct tgt aga gcc agc cag tca 144 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 gtc act att agt gga tac tca ttt atc cat tgg tat caa cag aaa cca 192 Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 gga cag gcg cct cgg ctt ctg atc tac cgc gcc tca aac ctt gcc tct 240 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser 65 70 75 80 ggc atc ccc gcg agg ttc tct ggc tct ggc agc ggt acc gat ttt aca 288 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 ctg act atc tca agc ctc gaa cct gaa gac ttc gca ctg tac ttt tgc 336 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Phe Cys 100 105 110 cag cag agc agg aag tcc ccc tgg act ttt gca cag gga acc aaa gtc 384 Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Ala Gln Gly Thr Lys Val 115 120 125 gaa atc aag cgt acg gtg gcc gcc ccc tcc gtg ttc atc ttc ccc ccc 432 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 tcc gac gag cag ctg aag tcc ggc acc gcc tcc gtg gtg tgc ctg ctg 480 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 aat aac ttc tac ccc aga gag gcc aag gtg cag tgg aag gtg gac aac 528 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 gcc ctg cag tcc ggg aac tcc cag gag agc gtg acc gag cag gac agc 576 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 aag gac agc acc tac agc ctg agc agc acc ctg acc ctg agc aaa gcc 624 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 gac tac gag aag cac aag gtg tac gcc tgc gag gtg acc cac cag ggc 672 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 ctg agc tcc ccc gtc acc aag agc ttc aac agg ggg gag tgt 714 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 105 <211> 238 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 105 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser 35 40 45 Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser 65 70 75 80 Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Phe Cys 100 105 110 Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Ala Gln Gly Thr Lys Val 115 120 125 Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 130 135 140 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 145 150 155 160 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 165 170 175 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 180 185 190 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 195 200 205 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 210 215 220 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 <210> 106 <211> 1111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nuleic acid sequence coding signal peptide and constant region of human IgG2 heavy chain <400> 106 aagcttgcta gcgccaccat gaaacacctg tggttcttcc tcctgctggt ggcagctccc 60 agatgggtgc tgagccaggt gcaattgtgc aggcggttag ctcagccagc accaagggcc 120 cttccgtgtt ccctctggcc ccttgtagcc gttccaccag cgagtccacc gccgcccttg 180 gctgtctggt gaaggactac ttccctgagc ctgtgaccgt gagctggaac tccggagccc 240 ttaccagcgg cgtgcacacc ttccctgccg tgctgcagtc cagcggcctt tactccctga 300 gctccgtggt gaccgtgcct agctccaact tcggcaccca aacctacacc tgtaacgtgg 360 accacaagcc tagcaacacc aaggtggaca agaccgtgga gcgtaagtgt tgtgtggagt 420 gtcctccttg tcctgcccct cctgtggccg gaccttccgt gttccttttc cctcctaagc 480 ctaaggacac cctgatgatc agccgtaccc ctgaggtgac ctgtgtggtg gtggacgtgt 540 cccacgagga ccctgaggtg cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcacaacg 600 ccaagaccaa gcctcgtgag gagcaattca acagcacctt ccgtgtggtg tccgtgctta 660 ccgtggtgca ccaagactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgtaaggtg agcaacaagg 720 gacttcctgc ccctatcgag aagaccatct ccaagaccaa gggccaacct cgtgagcctc 780 aagtgtacac ccttcctcct agccgtgagg agatgaccaa gaaccaagtg tcccttacct 840 gtctggtgaa gggcttctac cctagcgaca tcgccgtgga gtgggagtcc aacggacaac 900 ctgagaacaa ctacaagacc acccctccta tgcttgacag cgacggctcc ttcttcctgt 960 acagcaagct gaccgtggac aagtcccgtt ggcaacaagg caacgtgttc agctgttccg 1020 tgatgcacga ggccctgcac aaccactaca cccaaaagag cctttccctg agccctggaa 1080 agtgatatcg ggcccgttta aacgggtggc a 1111

Claims

배열 번호 2 에 나타내는 아미노산 배열의 39 내지 165 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 폴리펩티드에 결합하여, 파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서,
중쇄 배열이 CDRH1, CDRH2, CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRH1 은 배열 번호 44 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH2 는 배열 번호 45 또는 배열 번호 97 에 나타내는 어느 하나의 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRH3 은 배열 번호 46 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것 ; 및
경쇄 배열이 CDRL1, CDRL2, CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하고, 상기 CDRL1 은 배열 번호 47 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL2 는 배열 번호 48 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지고, 상기 CDRL3 은 배열 번호 49 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하며,
하이브리도마 #32A1 (FERM BP-10999) 에 의해 생성되는 것이 아닌, 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
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제 1 항에 있어서,
Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는 항체의 기능성 단편.
제 1 항에 있어서,
scFv 인 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항에 있어서,
키메라 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 6 항에 있어서,
배열 번호 41 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 43 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 237 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열로 이루어지는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 1 항에 있어서,
인간화되어 있는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 7 항에 있어서,
중쇄가 인간 면역 글로불린 G2 중쇄의 정상 영역을 포함하고, 경쇄가 인간 면역 글로불린 κ 경쇄의 정상 영역을 포함하는 항체.
파골 세포의 형성 및/또는 파골 세포에 의한 골흡수를 억제하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편으로서,
(a) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 중쇄 가변 영역 :
a1) 배열 번호 51 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
a2) 배열 번호 53 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
a3) 배열 번호 55 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
a4) 배열 번호 57 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
a5) 배열 번호 59 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
a6) 배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ; 및
a7) 배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ; 및
(b) 이하의 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 경쇄 가변 영역 :
b1) 배열 번호 61 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b2) 배열 번호 63 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b3) 배열 번호 65 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b4) 배열 번호 67 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 132 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b5) 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b6) 배열 번호 71 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
b7) 배열 번호 103 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ; 및
b8) 배열 번호 105 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열 ;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 51 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 61 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 53 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 63 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 55 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 65 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 55 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 67 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 132 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 57 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 59 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 71 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 103 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 140 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 배열 및 배열 번호 105 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 133 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 51 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 61 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 53 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 63 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 55 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 65 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 55 의 아미노산 배열에 나타내는 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 67 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 237 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 57 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 59 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 470 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 71 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 101 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 69 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 103 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 10 항에 있어서,
배열 번호 99 에 나타내는 아미노산 배열의 20 내지 466 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 중쇄 배열 및 배열 번호 105 에 나타내는 아미노산 배열의 21 내지 238 번째 아미노산 잔기로 이루어지는 경쇄 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 그 항체의 기능성 단편.
제 1 항 및 제 4 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 적어도 어느 하나를 함유하는, 골대사 이상의 치료 및/또는 예방제인 것을 특징으로 하는 의약 조성물으로서,
상기 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거대세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골파제트병, 신성 골이영양증, 및 골형성 부전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 의약 조성물.
삭제
제 1 항 및 제 4 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 기능성 단편의 적어도 어느 하나, 그리고, 비스포스포네이트, 활성형 비타민 D₃, 칼시토닌, 에스트라디올, SERMs (selective estrogen receptor modulators), 이프리플라본, 비타민 K₂ (메나테트레논), 칼슘 제제, PTH (parathyroid hormone), 비스테로이드성 항염증제, 가용성 TNF 리셉터, 항 TNFα 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 PTHrP (parathyroid hormone-related protein) 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, IL-1 리셉터 안타고니스트, 항 IL-6 리셉터 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 항 RANKL 항체 또는 그 항체의 기능성 단편, 및 OCIF (osteoclastogenesis inhibitory factor) 로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 골대사 이상의 치료 및/또는 예방용 의약 조성물로서,
상기 골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 암성 고칼슘혈증, 다발성 골수종이나 암의 골전이에 수반되는 골파괴, 거대세포종, 골감소증, 치근막염에 의한 치아의 상실, 인공 관절 주위의 골융해, 만성 골수염에 있어서의 골파괴, 골파제트병, 신성 골이영양증, 및 골형성 부전증으로 이루어지는 군에서 선택되는 의약 조성물.
삭제
제 31 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 35 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 36 항에 있어서,
골다공증이 폐경후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제로 부터 선택되는 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
삭제
제 33 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증, 관절 류머티즘에 수반되는 골파괴, 또는 암의 골전이에 수반되는 골파괴인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 39 항에 있어서,
골대사 이상이 골다공증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 40 항에 있어서,
골다공증이 폐경후 골다공증, 노인성 골다공증, 스테로이드나 면역 억제제 등의 치료용 약제의 사용에 의한 속발성 골다공증, 또는 관절 류머티즘에 수반되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제 42 항에 있어서,
배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 43 항에 있어서,
배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 711 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 42 항에 있어서,
(a) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
a1) 배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a2) 배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a3) 배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a4) 배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a5) 배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a6) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
a7) 배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
(b) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
b1) 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b2) 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b3) 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b4) 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b5) 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b6) 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b7) 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
b8) 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
을 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 42 항에 있어서,
배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 711 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
제 42 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 43 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 44 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 45 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 46 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 42 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 43 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 44 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 45 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 46 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 47 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 48 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 49 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 50 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 51 항에 기재된 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는 배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는,
배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 711 번째 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는,
상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는
(a) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
a1) 배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a2) 배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a3) 배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a4) 배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a5) 배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a6) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
a7) 배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
(b) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
b1) 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b2) 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b3) 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b4) 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b5) 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b6) 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b7) 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
b8) 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는,
배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레 오티드 및 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 711 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는,
배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는,
배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 711 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는,
(a) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
a1) 배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a2) 배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a3) 배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a4) 배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a5) 배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
a6) 배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
a7) 배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
(b) 이하의 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 폴리뉴클레오티드 :
b1) 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b2) 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b3) 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b4) 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b5) 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b6) 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
b7) 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ; 및
b8) 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 ;
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 항체의 생산 방법.
제 1 항, 제 7 항 및 제 10 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 형질 전환 숙주 세포를 배양하고, 배양 산물로부터 항체를 정제하는 공정을 포함하는, 상기 항체의 생산 방법으로서,
상기 폴리뉴클레오티드는,
배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레 오티드 및 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 396 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 420 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 399 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 50 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 60 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 52 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 62 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 64 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 54 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 66 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 711 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 56 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 58 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1410 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 70 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 100 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 68 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 102 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드; 또는
배열 번호 98 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 58 내지 1398 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 104 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 61 내지 714 번째 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드
를 포함하는 것을 특징으로 하는, 상기 항체의 생산 방법.