JPWO2010117011A1 - 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体 - Google Patents

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Abstract

破骨細胞で強く発現する遺伝子にコードされる蛋白質を標的とした骨代謝異常治療及び／又は予防用医薬組成物を提供すること。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５を特異的に認識し、破骨細胞の形成を抑制する活性を有する抗体を含む医薬組成物の提供等

Description

本発明は、骨代謝異常の治療及び／又は予防薬として有用な物質、並びに骨代謝異常の治療及び／又は予防方法に関する。
骨は、自らの形態変化や血中カルシウム濃度の維持のために、常に形成と吸収を繰り返して再構築を行う動的な器官として知られている。正常な骨では骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収とは平衡関係にあり、骨量は一定に保たれている。一方、骨形成と骨吸収との平衡関係が崩れると、骨粗鬆症などの骨代謝異常になる（国際公開第ＷＯ０７／０９３０４２号、及びＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，（１９９２）１３，ｐ６６−８０）。
骨代謝を調節する因子としては、全身性のホルモンや局所性のサイトカインが数多く報告されており、それらの因子の共同作用により骨の形成と維持が営まれている（国際公開第ＷＯ０７／０９３０４２号、及びＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ，（１９９６）１７，ｐ３０８−３３２）。加齢による骨組織の変化としては、骨粗鬆症の発症が広く知られているが、その発症機構は性ホルモンの分泌低下やそのレセプター異常、骨局所におけるサイトカイン発現の変動、老化遺伝子の発現、破骨細胞や骨芽細胞の分化あるいは機能不全など多岐にわたっており、加齢による単純な生理現象として理解するのは困難である。原発性骨粗鬆症はエストロゲンの分泌低下による閉経後骨粗鬆症と加齢による老人性骨粗鬆症に大別されているが、その発症機構の解明と治療薬開発の為には、骨吸収と骨形成の調節機構についての基礎的研究の進展が必須である。
破骨細胞は、造血幹細胞に由来する多核の細胞であり、骨との接着面に塩素イオンと水素イオンを放出することによって、細胞と骨の接着面の間隙を酸性化すると共に酸性プロテアーゼであるカテプシンＫなどを分泌する（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，（１９９１）２６０，Ｃ１３１５−Ｃ１３２４）。この結果、リン酸カルシウムの分解、酸性プロテアーゼの活性化と骨基質蛋白質の分解が引き起こされ、骨吸収が進行する。
破骨細胞の前駆細胞は骨表面の骨芽細胞／ストローマ細胞の細胞膜上に発現するＲＡＮＫＬ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ ＮＦ−κＢ ｌｉｇａｎｄ）の刺激を受けて、破骨細胞へ分化することが明らかにされた（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，（１９９８）９５，ｐ３５９７−３６０２、及びＣｅｌｌ，（１９９８）９３，ｐ１６５−１７６）。ＲＡＮＫＬは骨芽細胞／ストローマ細胞が産生する膜蛋白質であり、その発現は骨吸収因子により調節されること、及びＲＡＮＫＬは破骨細胞前駆細胞から成熟多核破骨細胞への分化を誘導することなどが明らかにされた（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ，（１９９８）９５，ｐ３５９７−３６０２、及びＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（１９９８）２３，Ｓ２２２）。さらに、ＲＡＮＫＬをノックアウトしたマウスが、大理石骨病様の病態を発症することが見出され、ＲＡＮＫＬが生理的な破骨細胞分化誘導因子であることが証明された（Ｎａｔｕｒｅ，（１９９９）３９７，ｐ３１５−３２３）。
骨代謝疾患の治療や治療期間の短縮を図る医薬品として、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、ＰＴＨ及びカルシウム製剤等が使用されている。しかし、これらの薬剤は、治療結果において必ずしも満足できるものではなく、より治療効果の高い薬剤の開発が望まれていた。
免疫系細胞の細胞膜上はシアル酸含有糖鎖などの多様な糖鎖によって高度に覆われており、様々な糖鎖結合蛋白質によって認識されている。シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉａｌｉｃ−ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｌｅｃｔｉｎｓ、以下、「Ｓｉｇｌｅｃｓ」という。）は、シアル酸含有糖鎖を認識して結合するＩ型膜蛋白質ファミリーである。Ｓｉｇｌｅｃｓは免疫系細胞の細胞膜上で多く発現しており、同じく免疫系細胞の細胞膜上に存在するシアル酸を認識して細胞間相互作用や細胞機能を調節し、免疫応答に関与していると考えられている（Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，（２００７）７，ｐ２５５−２６６）が、生理的機能が明らかとなっていないＳｉｇｌｅｃｓ分子も多い。Ｓｉｇｌｅｃ−１５（Ｓｉａｌｉｃ−ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｌｅｃｔｉｎ １５）は、Ｓｉｇｌｅｃｓに属することが新たに報告された分子で（例えば、非特許文献１０を参照）、ＣＤ３３Ｌ３（ＣＤ３３ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｋｅ ３）と呼ばれる分子と同一である。この分子は魚類からヒトまで進化的な保存度が高く、ヒト脾臓及びリンパ節において、樹状細胞／マクロファージ系の細胞に強く発現することが明らかにされた。またシアル酸プローブを用いた結合試験の結果、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５はＮｅｕ５Ａｃα２−６ＧａｌＮＡｃと、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５はさらにＮｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃと結合することなども明らかにされた（例えば、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，（２００７）１７，ｐ８３８−８４６を参照）。最近まで、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の生理的役割は明らかではなかったが、破骨細胞の分化、成熟に伴ってＳｉｇｌｅｃ−１５の発現が亢進し、ＲＮＡ干渉によってＳｉｇｌｅｃ−１５の発現を低下させると破骨細胞の分化が抑制されることが報告された（例えば、国際公開第ＷＯ０７／０９３０４２号を参照）。さらに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が破骨細胞分化におよぼす作用について、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号（２００９年４月１６日公開）において初めて明らかにされたが、ヒトに投与可能な抗体配列については、これまで明らかにされていなかった。
本発明の目的は、骨粗鬆症、関節リウマチ、癌の骨転移等に見られる種々の骨代謝異常の際に特異的に発現する遺伝子、破骨細胞の分化成熟と活性を阻害する物質、及び骨代謝異常の治療及び／又は予防剤を提供することにある。
本発明者らは、骨代謝異常の治療及び／又は予防効果を有する物質を探索する目的で、破骨細胞の分化、成熟及び活性化の機構（メカニズム）の解明を目指した研究を行った結果、破骨細胞の分化、成熟に伴いＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子の発現が上昇することを見出した。また、本発明者らは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合する抗体により、破骨細胞の分化が抑制されることを見出した。さらに発明者らは、得られたラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５抗体をヒト化して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。
（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列の３９乃至１６５番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドに結合し、破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する抗体又は該抗体の機能性断片。
（２）重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号４５又は配列番号９７に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなること；及び
軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなること；
を特徴とする（１）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（３）配列番号４１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３２番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする（２）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（４）Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の抗体の機能性断片。
（５）ｓｃＦｖであることを特徴とする、（１）乃至（３）のいずれか一つに記載の抗体。
（６）キメラ抗体であることを特徴とする、（１）乃至（４）のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（７）配列番号４１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３７番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする（６）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（８）ヒト化されていることを特徴とする、（１）乃至（４）又は（６）のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（９）重鎖がヒト免疫グロブリンＧ２重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、（７）又は（８）に記載の抗体。
（１０）破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する抗体又は該抗体の機能性断片であって、
（ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域：
ａ１） 配列番号５１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ２） 配列番号５３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ３） 配列番号５５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ４） 配列番号５７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ５） 配列番号５９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ６） 配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ７） 配列番号１０１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ａ８） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ９） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ａ１０） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
（ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域：
ｂ１） 配列番号６１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ２） 配列番号６３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ３） 配列番号６５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ４） 配列番号６７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ５） 配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ６） 配列番号７１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ７） 配列番号１０３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ８） 配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
ｂ９） ｂ１）乃至ａ８）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ１０） ｂ１）乃至ｂ８）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
ｂ１１） ｂ１）乃至ｂ８）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。
（１１）配列番号５１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（１２）配列番号５３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（１３）配列番号５５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（１４）配列番号５５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（１５）配列番号５７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（１６）配列番号５９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号７１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（１７）配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（１８）配列番号１０１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（１９）配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号１０３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２０）配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２１）配列番号５１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６１に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２２）配列番号５３に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６３に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２３）配列番号５５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６５に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２４）配列番号５５のアミノ酸配列に示される２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６７に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３７番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２５）配列番号５７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２６）配列番号５９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号７１に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２７）配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２８）配列番号１０１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（２９）配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号１０３に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（３０）配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする（１０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
（３１）（１）乃至（３０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
（３２）骨代謝異常の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、（３１）に記載の医薬組成物。
（３３）（１）乃至（３０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
（３４）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、（３２）又は（３３）に記載の医薬組成物。
（３５）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、（３４）に記載の医薬組成物。
（３６）骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、（３５）に記載の医薬組成物。
（３７）骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする（３６）に記載の医薬組成物。
（３８）（１）乃至（３０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
（３９）（１）乃至（３０）に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は連続して投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
（４０）骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、（３８）又は（３９）に記載の治療及び／又は予防方法。
（４１）骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、（４０）に記載の治療及び／又は予防方法。
（４２）骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする（４１）に記載の治療及び／又は予防方法。
（４３）（３）、（７）又は（１０）乃至（３０）のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
（４４）（４３）に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号４２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
（４５）配列番号４０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号４２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする（４４）に記載のポリヌクレオチド。
（４６）（４３）に記載のポリヌクレオチドであって、
（ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ａ１） 配列番号５０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ２） 配列番号５２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ３） 配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ４） 配列番号５６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ５） 配列番号５８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ６） 配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ７） 配列番号１００に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ａ８） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ａ９） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び
（ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
ｂ１） 配列番号６０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ２） 配列番号６２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ３） 配列番号６４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ４） 配列番号６６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ５） 配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ６） 配列番号７０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ７） 配列番号１０２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ８） 配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
ｂ９） ｂ１）乃至ｂ８）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
ｂ１０） ｂ１）乃至ｂ８）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
（４７）配列番号５０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（４８）配列番号５２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（４９）配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５０）配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５１）配列番号５６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５２）配列番号５８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号７０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５３）配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５４）配列番号１００に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５５）配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号１０２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５６）配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５７）配列番号５０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５８）配列番号５２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（５９）配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（６０）配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（６１）配列番号５６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（６２）配列番号５８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号７０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（６３）配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（６４）配列番号１００に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（６５）配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号１０２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（６６）配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする（４６）に記載のポリヌクレオチド。
（６７）（４３）乃至（６６）に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
（６８）（４３）乃至（６６）に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
（６９）（６７）に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
（７０）（６８）又は（６９）に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む（３）、（７）又は（１０）乃至（３０）に記載の抗体の生産方法。
本発明によれば、破骨細胞の分化成熟、及び骨吸収活性の阻害を作用機序とする、骨代謝異常の治療剤及び／又は予防剤を得ることができる。
ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムクロマトとＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマトで精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と銀染色で評価した結果である。 ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムクロマトとＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマトで精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの挙動を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体を用いたウェスタンブロッティングで検出した結果である。 ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ カラムクロマトで精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と銀染色で評価した結果である。 マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ固相化プレートに対するラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の結合をＥＬＩＳＡ法で試験した結果である。シンボル（◆）は＃１Ａ１抗体を、シンボル（■）は＃３Ａ１抗体を、シンボル（▲）は＃８Ａ１抗体を、シンボル（×）は＃２４Ａ１抗体を、シンボル（●）は＃３２Ａ１抗体を、シンボル（○）は＃３４Ａ１抗体を、シンボル（＋）は＃３９Ａ１抗体を、シンボル（‐）は＃４０Ａ１抗体を、シンボル（−）は＃４１Ｂ１抗体を、シンボル（◇）は＃６１Ａ１抗体を、シンボル（□）はコントロールＩｇＧをそれぞれ表している。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３Ａ１、＃８Ａ１又は＃３２Ａ１）の添加による、マウス骨髄非付着細胞の破骨細胞分化（ＲＡＮＫＬ刺激）への影響を試験した結果である。なお、図中のラットコントロールＩｇＧは、図５及び６で共通の陰性コントロールである。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３４Ａ１、＃３９Ａ１又は＃４０Ａ１）の添加による、マウス骨髄非付着細胞の破骨細胞分化（ＲＡＮＫＬ刺激）への影響を試験した結果である。なお、図中のウサギ抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ポリクローナル抗体Ｎｏ．３は、図５及び６で共通の陽性コントロールである。 ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムクロマトとＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマトで精製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの純度を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と銀染色で評価した結果である。 Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムクロマトで精製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの純度を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で評価した結果である。 ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ固相化プレートに対するラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の結合をＥＬＩＳＡ法で試験した結果である。シンボル（◆）は＃１Ａ１抗体を、シンボル（■）は＃３Ａ１抗体を、シンボル（▲）は＃８Ａ１抗体を、シンボル（×）は＃２４Ａ１抗体を、シンボル（●）は＃３２Ａ１抗体を、シンボル（○）は＃３４Ａ１抗体を、シンボル（＋）は＃３９Ａ１抗体を、シンボル（‐）は＃４０Ａ１抗体を、シンボル（−）は＃４１Ｂ１抗体を、シンボル（◇）は＃６１Ａ１抗体を、シンボル（□）はコントロールＩｇＧをそれぞれ表している。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の添加による、正常ヒト破骨前駆細胞からの巨大破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ染色で示した顕微鏡写真である。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）の添加による、正常ヒト破骨前駆細胞からの巨大破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ染色で示した顕微鏡写真である。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）の添加による、正常ヒト破骨細胞の骨吸収活性の抑制を示したグラフである（Ｎ＝６）。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体を卵巣摘除ラットに4週間投与した際の腰椎骨密度の増加作用（Ａ）及び尿中デオキシピリジノリン排泄量の低下作用（Ｂ）を示したグラフである。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１がヒトＳｉｇｌｅｃ−１５のＶ−ｓｅｔドメインに結合することを競合ＥＬＩＳＡによって示した図である。 ラット＃３２Ａ１抗体とこれのヒトキメラ抗体が、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃに対してほぼ同等の親和性を持つことを競合ＥＬＩＳＡによって示した図である。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）及びそのキメラ抗体の添加による、マウス破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ酵素活性で示したグラフである（Ｎ＝３）。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体の添加による、正常ヒト破骨前駆細胞からの巨大破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ染色で示した顕微鏡写真である。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体６種が、抗体の濃度に依存してマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に結合することを、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法によって確認した図である。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体６種が、抗体の濃度に依存してヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に結合することを、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ固相化プレートを用いたＥＬＩＳＡ法によって確認した図である。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）及びそのキメラ抗体の添加による、ＴＮＦα刺激下でのマウス巨大破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ染色で示した顕微鏡写真である。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）及びそのキメラ抗体の添加による、ＴＮＦα刺激下でのマウス破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ酵素活性で示したグラフである（Ｎ＝３）。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃８Ａ１及び＃３２Ａ１抗体）の添加による、ラット破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ酵素活性で示したグラフである（Ｎ＝３）。 クローニングしたラット＃３２Ａ１重鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 クローニングしたラット＃３２Ａ１軽鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体重鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体軽鎖のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｈのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｈのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｈのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｌのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｌのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｌのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４Ｌのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｌのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｌのヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ７Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ８Ｈ、及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ９Ｈのアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１０Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１１Ｈ、及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ１２Ｈのアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ７Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ８Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ９Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１０Ｌ、及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ１１Ｌのアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１２Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１３Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１４Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１５Ｌ、及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ１６Ｌのアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１７Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１８Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１９Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２０Ｌ、及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ２１Ｌのアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２２Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２３Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２４Ｌ、及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ２５Ｌのアミノ酸配列を示した図である。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３）の添加による、マウス破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ酵素活性で示したグラフである。なお、図中のラット＃３２Ａ１抗体は、図４４及び図４５で共通の陽性コントロールである。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６）の添加による、マウス破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ酵素活性で示したグラフである。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５）の添加による、マウス破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ酵素活性で示したグラフである。なお、図中のラット＃３２Ａ１抗体及び＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体は、図４６及び図４７で共通の陽性コントロールである。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ−１／Ｌ２−１５）の添加による、マウス破骨細胞形成の抑制をＴＲＡＰ酵素活性で示したグラフである。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６）の添加による、正常ヒト破骨細胞の骨吸収活性の抑制を示したグラフである。なお、図中のラット＃３２Ａ１抗体及び＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体は、図４８及び図４９で共通の陽性コントロールである。 ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ１２−５）の添加による、正常ヒト破骨細胞の骨吸収活性の抑制を示したグラフである。 ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５抗体の熱安定性を測定したサーモグラムである。 ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５抗体の熱安定性を測定したサーモグラムである。 ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ１２−５抗体の熱安定性を測定したサーモグラムである。 ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６抗体の熱安定性を測定したサーモグラムである。 ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。 ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６のヌクレオチド配列、及びアミノ酸配列を示した図である。
本明細書中において、「遺伝子」という語には、ＤＮＡのみならずｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ及びｃＲＮＡも含まれるものとする。
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」という語は核酸と同じ意味で用いており、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、及びプライマーも含まれている。
本明細中においては、「ポリペプチド」と「蛋白質」は区別せずに用いている。
本明細書中において、「ＲＮＡ画分」とは、ＲＮＡを含んでいる画分をいう。
本明細書中において、「細胞」には、動物個体内の細胞、培養細胞も含んでいる。
本明細書中において、「Ｓｉｇｌｅｃ−１５」は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５蛋白質と同じ意味で用いている。
本明細書中において、「破骨細胞の形成」は、「破骨細胞の分化」又は「破骨細胞の成熟」と同じ意味で用いている。
本明細書中における「抗体の機能性断片」とは、抗原との結合活性を有する抗体の部分断片を意味しており、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体等を含む。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の機能性断片に含まれる。但し、抗原との結合能を有している限りこれらの分子に限定されない。また、これらの機能性断片には、抗体蛋白質の全長分子を適当な酵素で処理したもののみならず、遺伝子工学的に改変された抗体遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された蛋白質も含まれる。
本明細書における、「エピトープ」とは、特定の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合するＳｉｇｌｅｃ−１５の部分ペプチドまたは部分立体構造を意味する。前記のＳｉｇｌｅｃ−１５の部分ペプチドであるエピトープは、免疫アッセイ法等当業者によく知られている方法によって決定することができるが、例えば以下の方法によって行うことが出来る。Ｓｉｇｌｅｃ−１５の様々な部分構造を作製する。部分構造の作製にあたっては、公知のオリゴペプチド合成技術を用いることが出来る。例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のＣ末端あるいはＮ末端から適当な長さで順次短くした一連のポリペプチドを当業者に周知の遺伝子組み換え技術を用いて作製した後、それらに対する抗体の反応性を検討し、大まかな認識部位を決定した後に、さらに短いペプチドを合成してそれらのペプチドとの反応性を検討することによって、エピトープを決定することができる。又、特定のＳｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合するＳｉｇｌｅｃ−１５の部分立体構造であるエピトープは、Ｘ線構造解析によって前記の抗体と隣接するＳｉｇｌｅｃ−１５のアミノ酸残基を特定することによって決定することができる。第一の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。また、第一の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する結合に対して第二の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が競合する（すなわち、第二の抗体が第一の抗体とＳｉｇｌｅｃ−１５の結合を妨げる）ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープを有すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二の抗体が共通のエピトープに結合し、かつ第一の抗体が抗原の中和活性等の特殊な効果を有する場合、第二の抗体も同様な活性を有することが期待できる。
抗体分子の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｒｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、それぞれ３ヶ所に分離している。本明細書中においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。
本発明において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、市販のハイブリダイゼーション溶液ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（クロンテック社製）中、６８℃でハイブリダイズすること、又は、ＤＮＡを固定したフィルターを用いて０．７−１．０ＭのＮａＣｌ存在下６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１−２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度ＳＳＣとは１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、１５ ｍＭ クエン酸ナトリウムからなる）を用い、６８℃で洗浄することにより同定することができる条件又はそれと同等の条件でハイブリダイズすることをいう。
１．Ｓｉｇｌｅｃ−１５
本発明者らによって、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は巨細胞腫において特異的に発現していることが見出された。また、本発明者らによってＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することも見出された。
本発明で用いるＳｉｇｌｅｃ−１５は、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例えば、モルモット、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サルなど）あるいはニワトリの単球細胞あるいは骨髄細胞から直接精製して使用するか、あるいは上記の細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５をｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５ ｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＳｉｇｌｅｃ−１５を発現させることにより、該蛋白質を得ることが出来る。
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＮＭ＿２１３６０２で登録され、配列表の配列番号１にも示されており、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号２に示されている。マウスＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号：ＸＭ＿８８４６３６で登録され、配列表の配列番号３にも示されており、そのアミノ酸配列は配列表の配列番号４に示されている。シグナル配列が除かれた成熟ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５は、配列番号２に示されるアミノ酸配列の２１番目から３２８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。また、シグナル配列が除かれたマウスＳｉｇｌｅｃ−１５は、配列番号４に示されるアミノ酸配列の２１番目から３４１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列に相当する。なお、Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、ＣＤ３３ ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｉｋｅ ３、ＣＤ３３ ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｋｅ ３、ＣＤ３３−ｌｉｋｅ ３又はＣＤ３３Ｌ３と呼ばれることがあり、これらは全て同じ分子を示している。
Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡは例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ． Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８）２３９，４８７−４９）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
なお、配列表の配列番号１及び３から選択される少なくともいずれか一つに示されるヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡに含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子座から転写されるスプライシングバリアント又はこれにストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有する蛋白質をコードするポリヌクレオチドもＳｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡに含まれる。
また、配列表の配列番号２及び４から選択される少なくともいずれか一つに示されるアミノ酸配列、又はこれらの配列からシグナル配列が除かれたアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有する蛋白質もＳｉｇｌｅｃ−１５に含まれる。さらに、ヒト若しくはマウスＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子座から転写されるスプライシングバリアントにコードされるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と同等の生物活性を有する蛋白質もＳｉｇｌｅｃ−１５に含まれる。
２．骨代謝異常の検出
Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は、ヒト各種骨組織検体群における遺伝子の発現量の解析をすると、破骨細胞様の多核巨細胞が多数出現する骨腫瘍であり、臨床的所見として骨溶解性の骨破壊を特徴とする（Ｂｕｌｌｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ｐｐ１７．６−１７．８，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９２））巨細胞腫（Ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｔｕｍｏｒ； ＧＣＴ）において有意に発現量が増加していることが見出された。
また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子は単球由来細胞株が破骨細胞に分化する際に発現量が増加することも見出された。
したがって、Ｓｉｇｌｅｃ−１５はＧＣＴのような骨吸収が亢進するヒトの病態に関与していると考えられる。すなわち、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子及び／又はＳｉｇｌｅｃ−１５の各細胞、及び／又は各組織における発現量を測定することでＳｉｇｌｅｃ−１５の過剰発現を伴う骨代謝異常の状態を判定することができる。なお、本明細書における骨代謝異常とは、正味の骨喪失によって特徴付けられる障害であり、具体的には骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症等を挙げることができるが、これらに限定されない。
本発明においてＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子及び／又はＳｉｇｌｅｃ−１５の発現量を調べる対象となる「検体」とは、被験者や臨床検体等から得られた、骨髄、骨、前立腺、精巣、陰茎、膀胱、腎臓、口腔、咽頭、口唇、舌、歯肉、鼻咽頭、食道、胃、小腸、大腸、結腸、肝臓、胆嚢、膵臓、鼻、肺、軟部組織、皮膚、乳房、子宮、卵巣、脳、甲状腺、リンパ節、筋肉、脂肪組織等の組織、血液、体液又は排泄物等の試料を意味するが、本発明においては血液又は骨髄がより好ましい。
破骨細胞の分化に関連することが知られているＲＡＮＫＬについては、ノックアウトマウスが作製されており、ＲＡＮＫＬの機能が失われた場合の表現型について解析がなされている（Ｙｏｕｎｇ−Ｙｕｎ Ｋｏｎｇ，ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９９）３９７，ｐ．３１５−３２３）。Ｓｉｇｌｅｃ−１５についても同様にノックアウトマウスを作製することによって，Ｓｉｇｌｅｃ−１５の機能が失われた場合の表現型の解析を行うことができる。
３．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の製造
本発明のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体は、常法を用いて、Ｓｉｇｌｅｃ−１５又はＳｉｇｌｅｃ−１５のアミノ酸配列から選択される任意のポリペプチドを動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。抗原となるＳｉｇｌｅｃ−１５の生物種はヒトに限定されず、マウス、ラット等のヒト以外の動物に由来するＳｉｇｌｅｃ−１５を動物に免疫することもできる。この場合には、取得された異種Ｓｉｇｌｅｃ−１５に結合する抗体とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５との交差性を試験することによって、ヒトの疾患に適用可能な抗体を選別できる。
また、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ （１９７５）２５６，ｐ．４９５−４９７、Ｋｅｎｎｅｔ，Ｒ．ｅｄ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｐ．３６５−３６７，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０））に従って、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体を産生する抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることもできる。
なお、抗原となるＳｉｇｌｅｃ−１５はＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子を遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５遺伝子を発現可能なベクターを作製し、これを宿主細胞に導入して該遺伝子を発現させ、発現したＳｉｇｌｅｃ−１５を精製すればよい。以下、具体的にＳｉｇｌｅｃ−１５に対する抗体の取得方法を説明する
（１） 抗原の調製
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を作製するための抗原としては、Ｓｉｇｌｅｃ−１５又はその少なくとも６個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
Ｓｉｇｌｅｃ−１５は、ヒトの腫瘍組織あるいは腫瘍細胞から直接精製して使用することができ、また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５をｉｎ ｖｉｔｒｏにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。
遺伝子操作では、具体的には、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってＳｉｇｌｅｃ−１５を発現させることにより、抗原を得ることが出来る。
また、膜蛋白質であるＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域と抗体の定常領域とを連結した融合蛋白質を適切な宿主・ベクター系において発現させることによって、分泌蛋白質として抗原を得ることも可能である。
Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡは例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５のｃＤＮＡを発現しているｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、Ｓｉｇｌｅｃ−１５ ｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）（Ｓａｉｋｉ，Ｒ． Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９，ｐ．４８７−４８９ 参照）を行なう、いわゆるＰＣＲ法により取得することができる。
ポリペプチドのイン・ビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）合成としては、例えばロシュ・ダイアグノスティックス社製のラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）を挙げることができるが、これに限定されない。
原核細胞の宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）や枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などを挙げることができる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形質転換させるには、宿主と適合し得る種由来のレプリコンすなわち複製起点と、調節配列を含んでいるプラスミドベクターで宿主細胞を形質転換させる。また、ベクターとしては、形質転換細胞に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる配列を有するものが好ましい。
真核細胞の宿主細胞には、脊椎動物、昆虫、酵母などの細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ． ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）等がよく用いられているが、これらに限定されない。
上記のようにして得られる形質転換体は、常法に従い培養することができ、該培養により細胞内、又は細胞外に目的のポリペプチドが産生される。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、大腸菌であれば、例えば、ＬＢ培地に必要に応じて、アンピシリン等の抗生物質やＩＰＭＧを添加して用いることができる。
上記培養により、形質転換体の細胞内又は細胞外に産生される組換え蛋白質は、該蛋白質の物理的性質や化学的性質などを利用した各種の公知の分離操作法により分離・精製することができる。
該方法としては、具体的には例えば、通常の蛋白質沈殿剤による処理、限外濾過、分子ふるいクロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合せなどを例示できる。
また、発現させる組換え蛋白質に６残基からなるヒスチジンタグを繋げることにより、ニッケルアフィニティーカラムで効率的に精製することができる。あるいは、発現させる組換え蛋白質にＩｇＧのＦｃ領域を繋げることにより、プロテインＡカラムで効率的に精製することができる
上記方法を組合せることにより容易に高収率、高純度で目的とするポリペプチドを大量に製造できる。
（２） 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の製造
Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合する抗体の例として、Ｓｉｇｌｅｃ−１５と特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
モノクローナル抗体の製造にあたっては、一般に下記のような作業工程が必要である。
すなわち、
（ａ）抗原として使用する生体高分子の精製、
（ｂ）抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
（ｃ）骨髄腫細胞（以下「ミエローマ」という）の調製、
（ｄ）抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
（ｅ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）、
（ｇ）場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
（ｈ）このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
以下、モノクローナル抗体の作製法を上記工程に沿って詳述するが、該抗体の作製法はこれに制限されず、例えば脾細胞以外の抗体産生細胞及びミエローマを使用することもできる。
（ａ）抗原の精製
抗原としては、前記したような方法で調製したＳｉｇｌｅｃ−１５又はその一部を使用することができる。
また、Ｓｉｇｌｅｃ−１５発現組換え体細胞より調製した膜画分、又はＳｉｇｌｅｃ−１５発現組換え体細胞自身、さらに、当業者に周知の方法を用いて、化学合成した本発明の蛋白質の部分ペプチドを抗原として使用することもできる。
（ｂ）抗体産生細胞の調製
工程（ａ）で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
また、実際に使用するマウス及びラットの系統には特に制限はなく、マウスの場合には、たとえば各系統 Ａ、ＡＫＲ、ＢＡＬＢ／ｃ、ＢＤＰ、ＢＡ、ＣＥ、Ｃ３Ｈ、５７ＢＬ、Ｃ５７ＢＬ、Ｃ５７Ｌ、ＤＢＡ、ＦＬ、ＨＴＨ、ＨＴ１、ＬＰ、ＮＺＢ、ＮＺＷ、ＲＦ、Ｒ ＩＩＩ、ＳＪＬ、ＳＷＲ、ＷＢ、１２９等が、またラットの場合には、たとえば、Ｗｉｓｔａｒ、Ｌｏｗ、Ｌｅｗｉｓ、Ｓｐｒａｇｕｅ、Ｄａｗｌｅｙ、ＡＣＩ、ＢＮ、Ｆｉｓｃｈｅｒ等を用いることができる。
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ−ルスリバー、等実験動物飼育販売業者より入手することができる。
このうち、後述のミエローマ細胞との融合適合性を勘案すれば、マウスでは ＢＡＬＢ／ｃ 系統が、ラットではＷｉｓｔａｒ及びＬｏｗ系統が被免疫動物として特に好ましい。
また、抗原のヒトとマウスでの相同性を考慮し、自己抗体を除去する生体機構を低下させたマウス、すなわち自己免疫疾患マウスを用いることも好ましい。
なお、これらマウス又はラットの免疫時の週齢は、好ましくは５〜１２週齢、さらに好ましくは６〜８週齢である。
Ｓｉｇｌｅｃ−１５又はこの組換え体によって動物を免疫するには、例えば、Ｗｅｉｒ， Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４） 等に詳しく記載されている公知の方法を用いることができる。
これらの免疫法のうち、本発明において好適な方法を具体的に示せば、たとえば以下のとおりである。
すなわち、まず、抗原である膜蛋白質画分、もしくは抗原を発現させた細胞を動物の皮内又は腹腔内に投与する。
ただし、免疫効率を高めるためには投与方法の併用が好ましく、前半は皮内投与を行い、後半又は最終回のみ腹腔内投与を行うと、特に免疫効率を高めることができる。
抗原の投与スケジュールは、被免疫動物の種類、個体差等により異なるが、一般には、抗原投与回数３〜６回、投与間隔２〜６週間が好ましく、投与回数３〜４回、投与間隔２〜４週間がさらに好ましい。
また、抗原の投与量は、動物の種類、個体差等により異なるが、一般には０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ程度とする。
追加免疫は、以上の通りの抗原投与の１〜６週間後、好ましくは２〜４週間後、さらに好ましくは２〜３週間後に行う。
なお、追加免疫を行う際の抗原投与量は、動物の種類、大きさ等により異なるが、一般に、例えばマウスの場合には０．０５〜５ｍｇ、好ましくは０．１〜０．５ｍｇ、さらに好ましくは０．１〜０．２ｍｇ程度とする。
上記追加免疫から１〜１０日後、好ましくは２〜５日後、さらに好ましくは２〜３日後に被免疫動物から抗体産生細胞を含む脾臓細胞又はリンパ球を無菌的に取り出す。
なお、その際に抗体価を測定し、抗体価が十分高くなった動物を抗体産生細胞の供給源として用いれば、以後の操作の効率を高めることができる。
ここで用いられる抗体価の測定法としては、例えば、ＲＩＡ法又はＥＬＩＳＡ法を挙げることができるがこれらの方法に制限されない。
本発明における抗体価の測定は、例えばＥＬＩＳＡ法によれば、以下に記載するような手順により行うことができる。
まず、精製又は部分精製した抗原をＥＬＩＳＡ用９６穴プレート等の固相表面に吸着させ、さらに抗原が吸着していない固相表面を抗原と無関係な蛋白質、例えばウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」という）により覆い、該表面を洗浄後、第一抗体として段階希釈した試料（例えばマウス血清）に接触させ、上記抗原に試料中の抗体を結合させる。
さらに第二抗体として酵素標識されたマウス抗体に対する抗体を加えてマウス抗体に結合させ、洗浄後該酵素の基質を加え、基質分解に基づく発色による吸光度の変化等を測定することにより、抗体価を算出する。
これらの脾臓細胞又はリンパ球からの抗体産生細胞の分離は、公知の方法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５，；Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７７）６，ｐ．５１１，；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７），２６６，ｐ．５５０，；Ｗａｌｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，（１９７７）２６６，ｐ．４９５，）に従って行うことができる。
例えば、脾臓細胞の場合には、脾臓を細切して細胞をステンレスメッシュで濾過した後、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）に浮遊させて抗体産生細胞を分離する一般的方法を採用することができる。
（ｃ）骨髄腫細胞（以下、「ミエローマ」という）の調製
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているＨＧＰＲＴ（Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）欠損株を用いるのが好ましい。
すなわち、マウス由来のＸ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）、ＮＳ１−ＡＮＳ／１（ＮＳ１）、Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（Ｘ６３．６５３）、ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ２／０）、ＭＰＣ１１−４５．６ＴＧ１．７（４５．６ＴＧ）、ＦＯ、Ｓ１４９／５ＸＸＯ、ＢＵ．１等、ラット由来の２１０．ＲＳＹ３．Ａｇ．１．２．３（Ｙ３）等、ヒト由来のＵ２６６ＡＲ（ＳＫＯ−００７）、ＧＭ１５００・ＧＴＧ−Ａ１２（ＧＭ１５００）、ＵＣ７２９−６、ＬＩＣＲ−ＬＯＷ−ＨＭｙ２（ＨＭｙ２）、８２２６ＡＲ／ＮＩＰ４−１（ＮＰ４１）等である。
これらのＨＧＰＲＴ欠損株は例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ）等から入手することができる。
これらの細胞株は、適当な培地、例えば８−アザグアニン培地［ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン、２−メルカプトエタノール、ゲンタマイシン、及びウシ胎児血清（以下「ＦＣＳ」という）を加えた培地に８−アザグアニンを加えた培地］、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＩＭＤＭ」という）、又はダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ；以下「ＤＭＥＭ」という）で継代培養するが、細胞融合の３乃至４日前に正常培地［例えば、１０％ ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４培地（味の素（株）社製）］で継代培養し、融合当日に２×１０７以上の細胞数を確保しておく。
（ｄ）細胞融合
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法（Ｗｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．Ｉ．ＩＩ．ＩＩＩ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８７）、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ Ｍａｙｅｒ，Ｍ．Ｍ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｃｈａｒｌｅｓ Ｃ Ｔｈｏｍａｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ（１９６４）等）に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。
そのような方法は、例えば、ポリエチレングリコール等の高濃度ポリマー溶液中で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを混合する化学的方法、電気的刺激を利用する物理的方法等を用いることができる。
このうち、上記化学的方法の具体例を示せば以下のとおりである。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量１５００〜６０００、好ましくは２０００〜４０００のポリエチレングリコール溶液中で、３０〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを１〜１０分間、好ましくは５〜８分間混合する。
（ｅ）ハイブリドーマ群の選択
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常ＨＡＴ（ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン）選択法（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６，ｐ．４９５；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）２６６，ｐ．５５０）が用いられる。
この方法は、アミノプテリンで生存し得ないＨＧＰＲＴ欠損株のミエローマ細胞を用いてハイブリドーマを得る場合に有効である。
すなわち、未融合細胞及びハイブリドーマをＨＡＴ培地で培養することにより、アミノプテリンに対する耐性を持ち合わせたハイブリドーマのみを選択的に残存させ、かつ増殖させることができる。
（ｆ）単一細胞クローンへの分割（クローニング）
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる（例えばＢａｒｂａｒａ， Ｂ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ， Ｍ．Ｓ．：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８０）参照）。これらの方法のうち、特に限界希釈法が好適である。
この方法では、マイクロプレートにラット胎児由来線維芽細胞株、あるいは正常マウス脾臓細胞、胸腺細胞、腹水細胞などのフィーダー（ｆｅｅｄｅｒ）を接種しておく。
一方、あらかじめハイブリドーマを０．２〜０．５個／０．２ｍｌになるように培地中で希釈し、この希釈したハイブリドーマの浮遊液を各ウェルに０．１ｍｌずつ入れ、一定期間毎（例えば３日毎）に約１／３の培地を新しいものに交換しながら２週間程度培養を続けることによってハイブリドーマのクローンを増殖させることができる。
抗体価の認められたウェルについて、例えば限界希釈法によるクローニングを２〜４回繰返し、安定して抗体価の認められたものを抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
このようにしてクローニングされたハイブリドーマ株の例としては、ＷＯ０９／４８０７２に記載のハイブリドーマ＃３２Ａ１を挙げることができる。ハイブリドーマ＃３２Ａ１は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（所在地：郵便番号３０５−８５６６ 日本国 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００８年８月２８日付けで寄託され、ａｎｔｉ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＃３２Ａ１の名称で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９９が付与されている。なお、本明細書中においては、ハイブリドーマ＃３２Ａ１が産生する抗体を、「＃３２Ａ１抗体」又は単に「＃３２Ａ１」と記載する。また、本明細書の実施例において＃３２Ａ１抗体以外に取得された抗体についても、同様な方法で抗体名を記載する。＃３２Ａ１抗体の重鎖可変領域を含む部分断片は、配列表の配列番号２８の２０乃至１６７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する。また、＃３２Ａ１抗体の軽鎖可変領域配列を含む部分断片は、配列表の配列番号３０の２１乃至１３９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する。
（ｇ）ハイブリドーマの培養によるモノクローナル抗体の調製
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
このスクリーニングにはそれ自体既知の方法が採用できる。
本発明における抗体価の測定は、例えば上記（ｂ）の項目で説明したＥＬＩＳＡ法により行うことができる。
以上の方法によって得たハイブリドーマは、液体窒素中又は−８０℃以下の冷凍庫中に凍結状態で保存することができる。
クローニングを完了したハイブリドーマは、培地をＨＴ培地から正常培地に換えて培養される。
大量培養は、大型培養瓶を用いた回転培養、あるいはスピナー培養で行われる。
この大量培養における上清から、ゲル濾過等、当業者に周知の方法を用いて精製することにより、本発明の蛋白質に特異的に結合するモノクローナル抗体を得ることができる。
また、同系統のマウス（例えば、上記のＢＡＬＢ／ｃ）、あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内にハイブリドーマを注射し、該ハイブリド−マを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることができる。
腹腔内に投与する場合には、事前（３〜７日前）に２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ）（プリスタン）等の鉱物油を投与すると、より多量の腹水が得られる。
たとえば，ハイブリドーマと同系統のマウスの腹腔内に予め免疫抑制剤を注射し、Ｔ細胞を不活性化した後、２０日後に１０６〜１０７個のハイブリドーマ・クローン細胞を、血清を含まない培地中に浮遊（０．５ｍｌ）させて腹腔内に投与し、通常腹部が膨満し、腹水がたまったところでマウスより腹水を採取する。
この方法により、培養液中に比べて約１００倍以上の濃度のモノクローナル抗体が得られる。
上記方法により得たモノクローナル抗体は、例えばＷｅｉｒ，Ｄ．Ｍ．：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，ＩＩＩ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９７８）に記載されている方法で精製することができる。
すなわち、硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティークロマトグラフィー法等である。
精製の簡便な方法としては、市販のモノクローナル抗体精製キット（例えば、ＭＡｂＴｒａｐ ＧＩＩキット；ファルマシア社製）等を利用することもできる。
かくして得られるモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対して高い抗原特異性を有する。
（ｈ）モノクローナル抗体の検定
かくして得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。
まず、同定法としてはオクテルロニー（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ）法、ＥＬＩＳＡ法、又はＲＩＡ法を挙げることができる。
オクテルロニー法は簡便ではあるが、モノクローナル抗体の濃度が低い場合には濃縮操作が必要である。
一方、ＥＬＩＳＡ法又はＲＩＡ法を用いた場合は、培養上清をそのまま抗原吸着固相と反応させ、さらに第二次抗体として各種イムノグロブリンアイソタイプ、サブクラスに対応する抗体を用いることにより、モノクローナル抗体のアイソタイプ、サブクラスを同定することが可能である。
また、さらに簡便な方法として、市販の同定用のキット（例えば、マウスタイパーキット；バイオラッド社製）等を利用することもできる。
さらに、蛋白質の定量は、フォーリンロウリー法、及び２８０ｎｍにおける吸光度［１．４（ＯＤ２８０）＝イムノグロブリン１ｍｇ／ｍｌ］より算出する方法により行うことができる。
（３）その他の抗体
本発明の抗体には、上記Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ヒト抗体なども含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１，６８５１−６８５５， （１９８４）参照）。ラット抗マウス抗体＃３２Ａ１由来のキメラ抗体の一例として、配列表の配列番号４１の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号４３の２１乃至２３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１，ｐ．５２２−５２５参照）、ＣＤＲ移植法によって、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開パンフレットＷＯ９０／０７８６１）を挙げることができる。ラット抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体の実例としては、配列表の配列番号５１の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号５３の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号５５の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号５７の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号５９の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号９９の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、配列番号１０１の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基、又は配列番号７２乃至７７に記載のいずれか一つのアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号６１の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基、配列番号６３の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基、配列番号６５の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基、配列番号６７の２１乃至１３２番目のアミノ酸残基、配列番号６９の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基、配列番号７１の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基、配列番号１０３の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基、配列番号１０５の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基、又は配列番号７８乃至９６のいずれか一つに記載のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
好適な組合せとしては、配列番号５１の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号６１の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号５３の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号６３の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号５５の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号６５の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号５５の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号６７の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号５７の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号６９の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号５９の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号７１の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号９９の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号６９の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号１０１の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号６９の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、配列番号９９の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号１０３の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体、又は配列番号９９の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号１０５の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体を挙げることができる。
さらに好適な組合せとしては、配列番号５１の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号６１の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５３の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号６３の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５５の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号６５の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５５の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号６７の２１乃至２３７番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５７の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号６９の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号５９の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号７１の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号９９の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号６９の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号１０１の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号６９の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、配列番号９９の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１０３の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、又は配列番号９９の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１０５の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体、を挙げることができる。
但し、＃３２Ａ１抗体由来のヒト化抗体としては、＃３２Ａ１の６種全てのＣＤＲ配列を保持し、破骨細胞の形成を抑制する活性を持つ限り、上記のヒト化抗体に限定されない。なお、＃３２Ａ１抗体の重鎖可変領域は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＤＹＦＭＮ）、配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＱＩＲＮＫＩＹＴＹＡＴＦＹＡＥＳＬＥＧ）又は配列番号９７に示されるＣＤＲＨ２（ＱＩＲＮＫＩＹＴＹＡＴＦＹＡ）のいずれか一つ、及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＳＬＴＧＧＤＹＦＤＹ）を保有している。配列番号４５に示されるＣＤＲＨ２は、Ｋａｂａｔの定義（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ ＶＯＬ．Ｉ，ＦＩＦＴＨ ＥＤＴＩＯＮ（１９９１））によるものである。配列番号９７に示されるＣＤＲＨ２では、Ｃ末端がＫａｂａｔの定義より５残基短縮されている。このＣＤＲＨ２を含む重鎖配列においては、ラット由来のＣＤＲ配列を減らしてヒトフレームワーク配列をより多く取り入れているために、ヒトに投与した際に異種抗原としてより一層認識されにくい。また、＃３２Ａ１抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＲＡＳＱＳＶＴＩＳＧＹＳＦＩＨ）、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＡＳＮＬＡＳ）、及び配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＳＲＫＳＰＷＴ）を保有している。
本発明の抗体としては、さらに、ヒト抗体を挙げることができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５ヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１６，ｐ．１３３−１４３，； Ｋｕｒｏｉｗａ，Ｙ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９８）２６，ｐ．３４４７−３４４８；Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ａｓｐｅｃｔｓ ｖｏｌ．１０，ｐ．６９−７３（Ｋｉｔａｇａｗａ， Ｙ．，Ｍａｔｓｕｄａ，Ｔ．ａｎｄ Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｄｓ．），Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９９．；Ｔｏｍｉｚｕｋａ，Ｋ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７，ｐ．７２２−７２７等を参照。）によって取得することができる。
このようなヒト抗体産生マウスは、具体的には、内在性免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が破壊され、代わりに酵母人工染色体（Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＹＡＣ）ベクターなどを介してヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の遺伝子座が導入された遺伝子組み換え動物を、ノックアウト動物及びトランスジェニック動物の作製、及びこれらの動物同士を掛け合わせることにより作り出すことができる。
また、遺伝子組換え技術により、そのようなヒト抗体の重鎖及び軽鎖の各々をコードするｃＤＮＡ、好ましくは該ｃＤＮＡを含むベクターにより真核細胞を形質転換し、遺伝子組換えヒトモノクローナル抗体を産生する形質転換細胞を培養することにより、この抗体を培養上清中から得ることもできる。
ここで、宿主としては例えば真核細胞、好ましくはＣＨＯ細胞、リンパ球やミエローマ等の哺乳動物細胞を用いることができる。
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ，Ｉ．Ｍ．ｅｔ．ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ ＆ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ．（２００２）４３（７），ｐ．２３０１−２３０８；Ｃａｒｍｅｎ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（２００２），１（２），ｐ．１８９−２０３；Ｓｉｒｉｗａｒｄｅｎａ，Ｄ．ｅｔ．ａｌ．，Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ（２００２）１０９（３），ｐ．４２７−４３１等参照。）も知られている。
例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，（９），ｐ．１１０５−１１１６）を用いることができる。
抗原に結合することで選択されたファージの遺伝子を解析することによって、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。
抗原に結合するｓｃＦｖのＤＮＡ配列が明らかになれば、当該配列を有する発現ベクターを作製し、適当な宿主に導入して発現させることによりヒト抗体を取得することができる（ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／２０７９１、ＷＯ９３／０６２１３、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９３／１９１７２、ＷＯ９５／０１４３８、ＷＯ９５／１５３８８、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９４）１２，ｐ．４３３−４５５、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３（９），ｐ．１１０５−１１１６）。
以上の方法によって得られた抗体は、実施例２５に示された方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。実施例３３で示された示差走査カトリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる装置である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Ｌｏｒｉ Ｂｕｒｔｏｎ，ｅｔ． ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００７）１２，ｐ．２６５−２７３）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、ヒトへの投与に最も適した抗体を選抜する必要がある。
また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Ｌｅｅ，Ｈ−Ｓ，ｅｔ．ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）３６，ｐ．６１−７１；Ｓｈｉｒｒｍａｎｎ，Ｔ．ｅｔ．ａｌ．，ｍＡｂｓ（２０１０），２，（１）ｐ．１−４）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）またはナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Ｍｕｙｌｄｅｍａｎｓ Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（１９９４）７（９），１１２９−３５，Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６３（６４２８）４４６−８）。上記の抗体は、本発明における抗体の機能性断片の一種と解釈することも可能である。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節することによって、抗体依存性細胞障害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、ＷＯ９９／５４３４２、ＷＯ００／６１７３９、ＷＯ０２／３１１４０等が知られているが、これらに限定されるものではない。
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。 抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．Ｃｅｌｌ（１９８１）２３，ｐ．１７５−１８２、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Ｕｒｌａｕｂ，Ｇ．ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８０）７７，ｐ．４１２６−４２２０）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２を挙げることができる。
また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の機能性断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の機能性断片と呼ぶことができる。抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、抗体依存性細胞障害活性、補体依存性細胞傷害活性及び補体依存性細胞性細胞傷害活性を挙げることができる。本発明における抗体の機能性断片が保持する機能は、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する結合活性であり、好ましくは破骨細胞の形成を抑制する活性であり、より好ましくは破骨細胞の細胞融合の過程を抑制する活性である。
例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８３）３０５，ｐ．５３７−５３９）。
本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，１１３（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ及びＭｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．２６９−３１５（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５），２３，ｐ．１１２６−１１３６）。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８），８５，ｐ．５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。
可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン‐へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５）２３，ｐ．１１３７−１１４６）。
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ，Ｄａｎｉｅｌ Ｒ．Ｍａｒｓｈａｋ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８））が、これらに限定されるものではない。
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。
これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。
例えばプロテインＡカラムを用いたカラムとして、Ｈｙｐｅｒ Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
４．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含有する医薬
上述の「３．抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の中から、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和する抗体を得ることができる。これらＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和する抗体は、生体内でのＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性、即ち、破骨細胞の分化及び／又は成熟を阻害することから、医薬として、破骨細胞の分化及び／又は成熟異常に起因する骨代謝異常に対する治療及び／又は予防剤として用いることができる。骨代謝異常は正味の骨喪失（骨減少症又は骨溶解症）によって特徴付けられるいずれの障害であってもよい。一般に、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体による治療及び／又は予防は、骨吸収を抑制する必要がある場合に適用される。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体で治療及び／又は予防可能な骨代謝異常としては、骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨粗鬆症）、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、骨形成不全症などを挙げることができるが、破骨細胞による正味の骨喪失を伴う疾患であれば、これらに限定されない。上記の医薬としての抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の例として、＃３２Ａ１抗体から３．（３）「その他の抗体」に記載の方法によって作製されたキメラ抗体又はヒト化抗体を挙げることができる。また、＃３２Ａ１抗体と同じエピトープを有するキメラ抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体も医薬として使用可能である。ある抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、＃３２Ａ１抗体と同じエピトープを持つことは、Ｓｉｇｌｅｃ−１５の特定の部分ペプチドに対してこれらの抗体が共通に結合するか否かを観察することによって確認できる。また、ある抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体が、Ｓｉｇｌｅｃ−１５との結合において＃３２Ａ１抗体と競合するのであれば、これらの抗体が共通のエピトープを持つと判定することができる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によるＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性の中和活性は例えば、Ｓｉｇｌｅｃ−１５を過剰発現している細胞の破骨細胞への分化の抑制活性で測定することができる。例えば、マウス単球由来細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞又はＲＡＷ２６４細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬあるいはＴＮＦ−α刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。また、骨髄由来の初代培養細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ、ＴＮＦ−αあるいは活性型ビタミンＤ３刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。さらに、正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入可能、カタログ番号２Ｔ−１１０）に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加し、ＲＡＮＫＬ及びＭ−ＣＳＦ刺激による、破骨細胞への分化の抑制活性を測定することができる。このような破骨細胞の分化抑制効果は、破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性の抑制を指標として測定できる。また、ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞の形成の抑制、すなわち破骨細胞の細胞融合の抑制を指標としても、破骨細胞の分化抑制効果を測定することができる。さらに、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞を用いたピットアッセイ（Ｔａｋａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｏｎｅ ａｎｄ Ｍｉｎｅｒａｌ，（１９９２）１７，３４７−３５９）実験において、大腿骨及び／又は脛骨由来の細胞に種々の濃度で抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を添加して象牙切片上のピットの形成を観察することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性を測定することができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける破骨細胞による骨吸収の抑制活性の測定系としては、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングしたプレートを使用することも可能である。ｉｎ ｖｉｖｏでの実験動物を利用した抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の骨代謝異常に対する治療又は予防効果は、例えば、骨粗鬆症モデル動物又はＳｉｇｌｅｃ−１５を過剰に発現しているトランスジェニック動物に抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を投与し、破骨細胞の変化を測定することで確認することができる。
このようにして得られたＳｉｇｌｅｃ−１５の生物活性を中和する抗体は、医薬として、特に骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌の骨転移に伴う骨破壊等の骨代謝異常の治療又は予防を目的とした医薬組成物として、あるいはこのような疾患の免疫学的診断のための抗体として有用である。
関節リウマチ（ＲＡ）の治療において、疾患の発症に伴って発生する骨喪失が大きな課題になっている。ＲＡに伴うこの骨喪失においては、破骨細胞が中心的な役割を果たしていることが報告されている。ＲＡにおける破骨細胞の誘導（分化、成熟）、活性化、及び骨破壊の原因として最も重要と考えられているサイトカインはＲＡＮＫＬとＴＮＦ−αである（Ｒｏｍａｓ Ｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｏｎｅ ３０， ｐ３４０−３４６， ２００２）。ＲＡＮＫＬのデコイレセプターであるＯＣＩＦ／ＯＰＧではＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成は抑制できるが、ＴＮＦ−αで誘導される破骨細胞形成は抑制されない。その一方で、本発明における抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によって、ＲＡＮＫＬで誘導される破骨細胞形成とＴＮＦ−αで誘導される破骨細胞形成の両方が効果的に抑制された。したがって、本発明の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体によって、ＲＡなどにおけるＴＮＦ−αで誘導される骨喪失と骨破壊が、ＲＡＮＫＬブロッカー（ＯＣＩＦ／ＯＰＧ、抗ＲＡＮＫＬ抗体など）以上に強力に抑制できることが期待される。
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は、一つの例としては、骨代謝異常の治療又は予防に対しては該抗体単独で、あるいは少なくとも一つの他の骨疾患治療剤と併用して投与することができる。また一つの例として、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は治療上有効な量の抗骨代謝異常治療薬剤と併用して投与することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と併用して投与できる治療剤としては、ビスホスホネート（例えば、ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ、ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ、ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ、ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ、ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、又はｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ又はｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、可溶性ＴＮＦレセプター（例えば、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の機能性断片（例えば、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（例えばａｎａｋｉｎｒａ）、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片（例えば、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片（例えば、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。骨代謝異常の状態やどの程度の治療及び／又は予防を目指すかによって、２、３あるいはそれ以上の種類の薬剤を投与することもできるし、それらの薬剤は同じ製剤の中に封入することによって同時に供給することができる。それらの薬剤と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は同じ製剤の中に封入することによって同時に供給することもできる。また、それらの薬剤は治療及び／又は予防用キットとして封入することによって同時に供給することもできる。また、それらの薬剤と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は別々に供給することもできる。遺伝子治療において投与する場合には、蛋白質性の骨疾患治療剤の遺伝子と抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の遺伝子は、別々のあるいは同じプロモーター領域の下流に挿入することができ、別々のあるいは、同じベクターに導入することができる。
抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体、あるいはそのフラグメントに対し骨疾患治療剤を結合させることにより、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ： ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，（２００１）５３，１７１−２１６記載の標的型薬物複合体を製造することができる。この目的には、抗体分子のほか、破骨細胞の認識性を完全消失していない限り、いずれの抗体フラグメントも適用可能であるが、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ等のフラグメントを例として挙げることができ、本発明においても同様に、抗体及び該フラグメントを使用することができる。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体又は該抗体のフラグメントと骨疾患治療剤との結合様式は、Ｍ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｔ「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓ」，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， （２００１）５３，１７１−２１６、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ （１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ Ｊ．Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５−１２３等に記載される種々の形態があり得る。すなわち、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と骨疾患治療剤が化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在して結合される様式や、適当な薬物担体を介在して結合される様式を挙げることができる。薬物担体の例としては、リポソームや水溶性高分子を挙げることができる。これら薬物担体が介在される様式としては、より具体的には、抗体と骨疾患治療剤とがリポソームに包含され、該リポソームと抗体とが結合した様式、及び、骨疾患治療剤が水溶性高分子（分子量１０００乃至１０万程度の化合物）に化学的に直接あるいはオリゴペプチド等のスペーサーを介在させて結合され、該水溶性高分子に抗体が結合した様式、を例として挙げることができる。抗体（又は該フラグメント）と骨疾患治療剤、リポソーム及び水溶性高分子等の薬物担体との結合は、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９６）、Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ Ｊ． Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９５）１２２， ５５−１２３に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。骨疾患治療剤のリポソームへの包含は、Ｄ．Ｄ．Ｌａｓｉｃ「Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｔｏ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．， Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９９３）等に記載の方法等の当業者周知の方法により実施することができる。骨疾患治療剤の水溶性高分子への結合は、Ｄ．Ｐｕｔｎａｍ ａｎｄ Ｊ Ｋｏｐｅｃｅｋ「Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）１２２，５５−１２３記載の方法等の当業者周知の方法により、実施することができる。抗体（又は該フラグメント）と蛋白質性の骨疾患治療剤（又は該フラグメント）との複合体は、上記の方法のほか、遺伝子工学的に、当業者周知の方法により作製することができる。
本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。
本発明は、治療及び／又は予防に有効な量の抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体と治療及び／又は予防に有効な量の少なくとも一つの骨疾患治療剤と薬学上許容される希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤及び／又は補助剤を含む医薬組成物も提供する。骨疾患治療剤としては、ビスホスホネート（例えば、ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ｅｔｉｄｒｏｎａｔｅ、ｉｂａｎｄｒｏｎａｔｅ、ｉｎｃａｄｒｏｎａｔｅ、ｐａｍｉｄｒｏｎａｔｅ、ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、又はｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ又はｒｏｆｅｃｏｘｉｂ）、可溶性ＴＮＦレセプター（例えば、ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の機能性断片（例えば、ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト（例えばａｎａｋｉｎｒａ）、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片（例えば、ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片（例えば、ｄｅｎｏｓｕｍａｂ）、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）等を挙げることができるがこれらに限定されない。
本発明の医薬組成物において許容される製剤に用いる物質としては好ましくは投与量や投与濃度において、医薬組成物を投与される者に対して非毒性のものが好ましい。
本発明の医薬組成物は、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、無菌性、安定性、溶解率、徐放率、吸収率、浸透率を変えたり、保持したりするための製剤用の物質を含むことができる。製剤用の物質として以下のものを挙げることができるが、これらに制限されない：グリシン、アラニン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジン等のアミノ酸類、抗菌剤、アスコルビン酸、硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤、リン酸、、クエン酸、ホウ酸バッファー、炭酸水素ナトリウム、トリス−塩酸（Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ）溶液等の緩衝剤、マンニトールやグリシン等の充填剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤、カフェイン、ポリビニルピロリジン、β−シクロデキストリンやヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン等の錯化剤、グルコース、マンノース又はデキストリン等の増量剤、単糖類、二糖類等の他の炭水化物、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤やポリビニルピロリジン等の親水ポリマー、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン、塩化ベンズアルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロレキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素等の防腐剤、グリセリン、プロピレン・グリコール又はポリエチレングリコール等の溶媒、マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール、懸濁剤、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０やポリソルベート８０等のポリソルベート、トリトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン又はコレステロール等の界面活性剤、スクロースやソルビトール等の安定化増強剤、塩化ナトリウム、塩化カリウムやマンニトール・ソルビトール等の弾性増強剤、輸送剤、賦形剤、及び／又は薬学上の補助剤。これらの製剤用の物質の添加量は、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体の重量に対して０．０１〜１００倍、特に０．１〜１０倍添加するのが好ましい。製剤中の好適な医薬組成物の組成は当業者によって、適用疾患、適用投与経路などに応じて適宜決定することができる。
医薬組成物中の賦形剤や担体は液体でも固体でもよい。適当な賦形剤や担体は注射用の水や生理食塩水、人工脳脊髄液や非経口投与に通常用いられている他の物質でもよい。中性の生理食塩水や血清アルブミンを含む生理食塩水を担体に用いることもできる。医薬組成物にはｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓバッファー、ｐＨ４．０−５．５の酢酸バッファー、ｐＨ３．０−６．２のクエン酸バッファーを含むことができる。また、これらのバッファーにソルビトールや他の化合物を含むこともできる。本発明の医薬組成物には抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物並びに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体及び少なくとも一つの骨疾患治療剤を含む医薬組成物を挙げることができ、本発明の医薬組成物は選択された組成と必要な純度を持つ薬剤として、凍結乾燥品あるいは液体として準備される。抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物並びに、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体及び少なくとも一つの骨代謝異常治療薬剤を含む医薬組成物はスクロースのような適当な賦形剤を用いた凍結乾燥品として成型されることもできる。
本発明の医薬組成物は非経口投与用に調製することもできるし、経口による消化管吸収用に調製することもできる。製剤の組成及び濃度は投与方法によって決定することができるし、本発明の医薬組成物に含まれる、抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体のＳｉｇｌｅｃ−１５に対する親和性、即ち、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に対する解離定数（Ｋｄ値）に対し、親和性が高い（Ｋｄ値が低い）ほど、ヒトへの投与量を少なくしても薬効を発揮することができるので、この結果に基づいて本発明の医薬組成物の人に対する投与量を決定することもできる。投与量は、ヒト型抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体をヒトに対して投与する際には、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇを１〜１８０日間に１回投与すればよい。
本発明の医薬組成物の形態としては、点滴を含む注射剤、坐剤、経鼻剤、舌下剤、経皮吸収剤などを挙げることができる。
実施例
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の発現コンストラクトの作製
マウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の細胞外領域をコードする部分のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５であり、アミノ酸配列は、配列表の配列番号６である。このような部分配列を利用することにより、動物細胞などの培養上清中に可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質を産生させることができる。
ａ）可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子のＰＣＲによる増幅
マウスＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして
５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔ ｔｔｇｔａｃａａａａ ａａｇｃａｇｇｃｔｔ ｃａｃｃＡＴＧＧＡＧ ＧＧＧＴＣＣＣＴＣＣ ＡＡＣＴＣ−３’（ｍＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−Ｆ：配列表の配列番号７）
及び
５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔ ｔｔｇｔａｃａａｇａ ａａｇｃｔｇｇｇｔｃ ＴＣＣＧＧＧＧＧＣＧ ＣＣＧＴＧＧＡＡＧＣ ＧＧＡＡＣ−３’（ｍＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−Ｒ：配列表の配列番号８）、
の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。なお、これらのプライマーは、Ｇａｔｅｗａｙエントリークローン作製用増幅用プライマーとして、ｍＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−ＦにはａｔｔＢ１配列が、ｍＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−ＲにはａｔｔＢ２配列が付加されるように設計した。このプライマーの組み合わせと、テンプレートとしてマウスＳｉｇｌｅｃ−１５のオープンリーディングフレーム配列を含むポリヌクレオチドを用い、常法に従いＰＣＲを行った。サーマルサイクラーの設定条件は、９４℃で５分間加熱した後、「９４℃で０．５分、５５℃で０．５分、６８℃で１．５分」の温度サイクルを１５回繰り返してから、６８℃で５分加熱し、４℃で保温とした。
ｂ）Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ反応によるエントリークローンの作製
λファージの部位特異的組換えシステムを応用したＧａｔｅｗａｙテクノロジー（インビトロジェン社）により、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５細胞外領域のｃＤＮＡを組み込んだエントリークローンを以下の方法で作製した。まず、ａ）で作製した、ａｔｔＢ配列を両端に持つＰＣＲ産物と、ａｔｔＰ配列を有するドナーベクターであるｐＤＮＯＲ２２１（インビトロジェン社製）との間で、ＢＰクロナーゼを用いたＢＰ反応を行った。この反応液を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換し、薬剤耐性クローンに対してコロニーＰＣＲを行い、インサートサイズを確認した。インサートのサイズが正しく確認されたクローンについて、インサートの全ＤＮＡ配列のシークエンス解析を実施した結果、目的とするマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の細胞外領域をコードするヌクレオチド配列（配列表の配列番号５）と完全に一致するエントリークローンが得られた。
ｃ）Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ反応による発現クローンの作製
λファージの部位特異的組換えシステムを応用したＧａｔｅｗａｙテクノロジー（インビトロジェン社）により、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５細胞外領域のｃＤＮＡを組み込んだ発現クローンを以下の方法で作製した。ｂ）で作製したエントリークローンは、インサートの両端にａｔｔＬ配列を有している。このエントリークローンと、ａｔｔＲ配列を有する２種類のディストネーションベクターとの間でＬＲクロナーゼを用いたＬＲ反応を行った。なおディストネーションベクターは、インサートのＣ末側にＶ５エピトープと６×Ｈｉｓタグが付加される様に設計されたｐＤＯＮＭ、及びインサートのＣ末側にヒトＦｃタグが付加されるように設計されたｐｈＩｇＦｃの２種類を用いた。ＬＲ反応により得られた反応液を用いて大腸菌ＤＨ１０Ｂを形質転換し、得られた薬剤耐性クローンに対してコロニーＰＣＲを行い、インサートサイズを確認した。インサートのサイズが正しく確認されたクローンについて、インサート側からベクター側への両末端のシークエンス解析を行った。
シークエンス用プライマー配列：
５’−ｔｇｃｇｔｇａａｇｇ ｔｇｃａｇｇｇｃａｇ−３’（ｍＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−ｓｅｑ−ｕｐｓｔｍ：配列表の配列番号９）
及び
５’−ｃｃｔｃｇｃｃｔｇｇ ｔｃｇｇｇｔｃ−３’（ｍＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−ｓｅｑ−ｄｎｓｔｍ：配列表の配列番号１０）
シークエンス解析の結果、ｐＤＯＮＭ及びｐｈＩｇＦｃの両方で正しく組換わった発現クローン（可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭ及び可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃ）が、それぞれ得られた。可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭを動物細胞などにトランスフェクションすることにより、配列表の配列番号１１に記載した塩基配列を有するｍＲＮＡが転写され、配列表の配列番号１２に記載したアミノ酸配列を有する蛋白質（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ）が翻訳される。可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃを動物細胞などにトランスフェクションすることにより、配列表の配列番号１３に記載した塩基配列を有するｍＲＮＡが転写され、配列表の配列番号１４に記載したアミノ酸配列を有する蛋白質（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ）が翻訳される。
２９３−Ｆ細胞を用いた可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質含有培養液の大量調製
実施例１で得られた２種類の発現ベクター（可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭ及び可溶型マウスＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃ）をそれぞれ約５ｍｇ調製した。なお、大量培養した大腸菌からのプラスミド精製には、インビトロジェン ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用した。調製したプラスミドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）と混合し、フィルター滅菌した後トランスフェクション試薬である２９３ｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）を１０ ｍｌ添加して室温で２０分間インキュベーションした。この混和液を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（インビトロジェン社製）中で１．１×１０６細胞／ｍｌ×５Ｌ（１Ｌ／フラスコを５本）となるようにエルレンマイヤーフラスコ中で培養したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に添加した。８．０％ ＣＯ２濃度、３７℃で９６時間（４日間）回転培養（１２５回転／分）した後培養液を回収し、遠心分離後培養上清を調製した。このようにして調製した培養上清中には、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域Ｃ末側にＶ５エピトープと６×Ｈｉｓタグが付加された蛋白質（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ）及びＣ末側にヒトＦｃタグが付加された蛋白質（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ）が、それぞれ発現すると考えられる。
マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの精製
ａ）ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムクロマト
実施例２で調製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ 発現２９３Ｆ細胞の培養液２ Ｌに２２５ｍｌの１０ｘｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ，１．５Ｍ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）を加えて良く攪拌した後にＳｔｅｒｉｖｅｘ ＧＶフィルター（ミリポア社製）でろ過した。この培養液を、予めパイロジェン除去剤・ＰｙｒｏＣＬＥＡＮ（ＡＬｅｒＣＨＥＫ社製）で処理して注射用蒸留水で洗浄しておいたＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ ５ｍＬの３本直列カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速２ｍｌ／ｍｉｎでかけた。３００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）６０ ｍｌを用いて流速１ｍｌ／ｍｉｎでカラムを洗浄した後に、３００ｍＭ ＮａＣｌ，５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５０ ｍｌを用いて流速１ｍｌ／ｍｉｎでカラムに吸着している蛋白質を溶出した。溶出した液は、予め１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０ １０μｌを加えておいたＭｉｎｉ−ｓｏｒｐ ｔｕｂｅ（ヌンク社製）に１ｍｌ／Ｆｒ．にて分取した。溶出された蛋白質を含む画分約２０ｍｌ（Ｆｒ．１４−２０）を遠心膜濃縮器Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）で２．５ｍｌに濃縮した後に、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｔ−ＰＢＳ）で平衡化しておいたＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけ、Ｔ−ＰＢＳで溶出して、溶媒をＴ−ＰＢＳに置換したサンプル３．５ｍｌを得た。
ｂ）Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマト
ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムクロマトで精製したＴ−ＰＢＳ置換サンプル３．５ｍｌに０．１％ ＣＨＡＰＳを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）２２．５ｍｌを加えて攪拌した後に、４℃、３，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて３０分間遠心して沈殿物を除去した。この上清液をＭｉｌｌｅｘ ＧＶフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、０．１％ ＣＨＡＰＳを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいたＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ ６ｍＬカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍｌ／ｍｉｎでかけ、引き続きこの緩衝液を用いて流速１ｍｌ／ｍｉｎでカラムを洗浄して、カラムに吸着しない蛋白質画分を集めた。カラムに吸着した蛋白質は、０．１％ ＣＨＡＰＳ，１Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。カラムに吸着しなかった画分２６．５ｍｌを、遠心膜濃縮器Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）で２．０ｍｌに濃縮した後に、４℃、３，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間遠心して沈殿物を除去した。遠心後の上清液は使用するまで−８０℃で凍結保存した。以上の精製操作（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムクロマト、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマト）を２回繰り返して実施した。
ｃ）精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの検出と純度検定
上記の精製操作（ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムクロマト、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマト）で調製したサンプルを用いて還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と銀染色を行った。即ち各精製ステップのサンプル５μｌに同量のＳＤＳ−処理液を加えて、９５℃で１０分間熱処理した。熱処理した各サンプル０．３μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に使用した。電気泳動のゲルとして８−２５％ポリアクリルアミドグラジエントゲル（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、電気泳動はＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いて実施した。また分子量マーカーとしてレインボー分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた。電気泳動終了後にＰｈａｓｔＧｅｌ Ｓｉｌｖｅｒ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）とＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍを用いて銀染色を行い、その結果を図１に示した。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムに吸着しなかった蛋白質画分に分子量約３５ｋＤａの蛋白質（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ）が効率的に精製濃縮されたことが示された。
分子量マーカーとしてＥＣＬ ＤｕａｌＶｕｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｍａｒｋｅｒｓ、アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた以外は上記と同じ条件で電気泳動したゲル中の蛋白質を、ＰｈａｓｔＴｒａｎｓｆｅｒ Ｓｅｍｉ−ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）とＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍを用いてＰＶＤＦ膜（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ、アマシャムバイオサイエンス社製）に転写（ブロット）した。このＰＶＤＦ膜を０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むブロッキング剤（ＢｌｏｃｋＡｃｅ，雪印乳業社製）１０ｍｌ中室温で１時間緩やかに振とうした。このブロッキング溶液にＳ−ｐｒｏｔｅｉｎ ＨＲＰ（アマシャムバイオサイエンス社）１０μｌと抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｐｋ−ＴＡＧ−ＨＲＰ、Ａｃｒｉｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製）１０μｌを加えて、更に室温で１時間緩やかに振とうした。ＰＶＤＦ膜を０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）５０ｍｌ中で緩やかに振とうしながら５分間４回洗浄した。洗浄後このＰＶＤＦ膜をＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社）のプロトコールに従って処理して、蛋白質のバンドの発色をＥＣＬ ｍｉｎｉ−ｃａｍｅｒａ（アマシャムバイオサイエンス社）ポラロイドフィルム（Ｐｏｌａｐａｎ ３２００Ｂ、ポラロイド社）で検出した。結果を図２に示した。この結果からも、抗Ｖ５−ＨＲＰ抗体に反応する分子量約３５ｋＤａの蛋白質（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ）がＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムに吸着しなかった蛋白質画分に効率良く精製濃縮されたことが確認できた。
ｄ）精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの蛋白質濃度の測定
精製マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムに吸着しなかった蛋白質画分）について、ウシ血清アルブミンを標準サンプルとして用い、ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社製）で蛋白質濃度を測定した。表１に示したように、２回の精製操作で合計１．６６ｍｇの精製マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ蛋白質を得た。
マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの精製
ａ）ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムクロマト
実施例２で調製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ発現２９３Ｆ細胞の培養液１．８ ＬをＳｔｅｒｉｖｅｘ ＧＶフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、予めダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ、インビトロジェン社製）で平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ５ｍＬカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速５ｍｌ／ｍｉｎでかけた。Ｄ−ＰＢＳを用いて流速５ｍｌ／ｍｉｎでカラムを洗浄した後に、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）５０ｍｌを用いて流速５ｍｌ／ｍｉｎでカラムに吸着している蛋白質を溶出した。溶出した液は、Ｍｉｎｉ−ｓｏｒｐ ｔｕｂｅ（ヌンク社製）に５ｍｌ／Ｆｒ．にて分取した後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ １．３ｍｌを直ちに加えて中和した。溶出された蛋白質が検出された画分（Ｆｒ．１，２）を遠心膜濃縮器Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）で２．５ｍｌに濃縮した後に、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む大塚注射用生理食塩水（ＴＯ−ＳＳ、大塚製薬社製）で平衡化しておいたＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけてＴＯ−ＳＳで溶出して、溶媒をＴＯ−ＳＳに置換したサンプル３．５ｍｌを得た。このサンプルは、使用するまで−８０℃で凍結保存した。２．９Ｌの２９３Ｆ細胞の培養液を用いて、同様の精製操作を更に１回繰り返して実施した。
ｂ）精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの検出と純度検定
上記の精製操作で調製したサンプルを用いて還元条件下のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と銀染色を行った。即ち各精製ステップのサンプル５μｌに同量のＳＤＳ−処理液を加えて、９５℃で１０分間加熱した。熱処理した各サンプルを１／２濃度のＳＤＳ−処理液で１／３００又は１／９００倍希釈したサンプル０．３μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に使用した。電気泳動と銀染色は実施例３、ｃ）に記載のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの純度検定と同様の方法で実施して、その結果を小スケールでの予備精製条件検討の結果（アプライした培養液のｐＨが８．９又は７．０）と共に図３に示した。ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ カラムから溶出した蛋白質画分に分子量約５５ｋＤａの蛋白質（マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ）が効率的に精製濃縮されたことが示された。
ｃ）精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの蛋白質濃度の測定
精製マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ（ＰＤ−１０脱塩カラムから溶出された蛋白質画分）について、ウシ血清アルブミンを標準サンプルとして用い、ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社製）で蛋白質濃度を測定した。表２に示したように、２回の精製操作で合計９２ｍｇの精製マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ蛋白質を得た。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの樹立
ａ）抗原の調製
実施例３で作製した、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ蛋白質を１００μｇ／０．５ｍｌとなるように調製し、アジュバントを同量加えガラスシリンジにてエマルジョンを作製した。なおアジュバントは、初回免疫時のみＦｒｅｕｎｄ’ｓ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＣＡ、ディフコ社製）を使用し、２回目以降Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ａｄｊｕｖａｎｔ（ＦＩＣＡ、ディフコ社製）を使用した。
ｂ）ラットへの免疫
ラット（Ｗｉｓｔａｒ、雌、６週齢、日本クレア社より購入）４匹を免疫動物として使用した。ａ）で得られたエマルジョンを、抗原量が５０μｇ／ラットとなるよう皮下及び皮内に２７Ｇ注射針を用いて注射した。以降７日毎に合計４回の免疫を実施した。４回目の免疫から７日後に尾静脈より少量（２００μｌ）採血し、抗血清を調製した。抗血清の抗体力価を確認するため、抗原として用いたマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ蛋白質、実施例４で作製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ蛋白質、あるいはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を固相化したＥＬＩＳＡを実施した。その結果、４匹のラット（ラットＮｏ．１〜４）の何れにおいてもマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ蛋白質及びマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ蛋白質への反応性が認められた。一方、ＢＳＡへの反応性は認められなかった。以上より、免疫したラットの血清中抗体力価が上昇していることが確認されたため、抗体価が最も高かったＮｏ．２ラットについて細胞融合操作へ進めた。
ｃ）細胞融合
細胞融合は、一般的なマウス（ラット）脾臓細胞とミエローマ細胞との融合法に従って実施した。ラットをエーテル麻酔下で心臓より全採血して安楽死させ、その後脾臓を摘出した。採取した脾臓細胞と、マウスミエローマ細胞であるＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８０）を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いて細胞融合させた。９６穴プレートに細胞を播種し、ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ（Ｈ）、ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ（Ａ）、ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ｔ）を含有した培地（ＨＡＴ選択培地）を添加して７〜１０日間培養した。細胞融合したハイブリドーマの生存が確認された６１穴の培養上清を採取し、抗原として用いたマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ蛋白質、実施例４で作製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ蛋白質、あるいはＢＳＡを固相化したＥＬＩＳＡにて抗体価を評価し、抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングした。スクリーニングの結果から、抗体価の高い１２穴を選抜し、その中のハイブリドーマをクローニング操作へ進めた。
ｄ）ハイブリドーマのクローニング
選抜したハイブリドーマについて、限界希釈法により１次クローニングした。限界希釈後の培養は２週間行い、培養上清中の抗体価の確認を、実施例４で作製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ蛋白質あるいはＢＳＡを固相化したＥＬＩＳＡにて実施した。陽性クローンと認められた１１クローンについて、さらに２次クローニングを実施（１次クローニングと同様の作業）することにより、最終的に抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを１０クローン（＃１Ａ１、＃３Ａ１、＃８Ａ１、＃２４Ａ１、＃３２Ａ１、＃３４Ａ１、＃３９Ａ１、＃４０Ａ１、＃４１Ｂ１、＃６１Ａ１）樹立した。なお、ハイブリドーマ＃３２Ａ１は、日本国独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（所在地：郵便番号３０５−８５６６ 日本国 茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に２００８年８月２８日付けで寄託され、ａｎｔｉ−Ｓｉｇｌｅｃ−１５ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ＃３２Ａ１の名称で受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９９が付与されている。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の調製
ａ）ヌードマウス腹水の調製
実施例５で樹立したハイブリドーマを、１０％ ＦＣＳ含有ＴＩＬ Ｍｅｄｉａ Ｉ（（株）免疫生物研究所製）培地を用いて培養した。なお細胞の継代は５×１０５細胞／ｍｌ程度に増殖した時点を目安に４分の１程度に希釈する作業を、２〜３日に１度実施した。プリスタンを腹腔内に前投与（０．２ｍｌ／マウス）したヌードマウスに、培養したハイブリドーマを１×１０７細胞／マウスとなるように腹腔内に移植した。移植には、１０クローンのハイブリドーマそれぞれにつき各３匹のヌードマウスを使用した。移植後、腹水の蓄積が十分に見られた時点で腹水を採取し、各ハイブリドーマ３匹分を１つにまとめて採取量を測定後、抗体の精製まで凍結保存した。各ハイブリドーマについて、腹水の採取量を表３にまとめた。
ｂ）抗体の精製
採取した腹水の全量を、２０ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）を用いたＩｇＧの精製に供した。精製されたＩｇＧはゲルろ過分析（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムクロマト）により純度検定を行い、一部を遠心膜濃縮した。すなわち、精製した抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の内、＃２４Ａ１抗体を除く９種類の抗体を、遠心膜濃縮器Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）を用いて３０００ｒ．ｐ．ｍ．、４℃で３０〜６０分間遠心することによって約６倍〜８倍濃縮した。続いて、＃２４Ａ１抗体及び濃縮した他の９種類の抗体について、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準サンプルとして用い、ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社製）で蛋白質濃度を測定した。以上の操作により、抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体を調製した。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性評価
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性をＥＬＩＳＡ法により評価した。実施例４で作製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ蛋白質を５μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ ９．５）で希釈し、９６穴プレート（ナルジェヌンク社製、カタログ番号：４３０３４１）に１００μｌ／穴添加した。室温で１時間放置後に溶液を除去し、３００μｌ／穴の洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸塩緩衝生理食塩水）を添加して、除去した。この洗浄作業をさらに１回行った後、２５％ブロックエース（大日本住友製薬社製）を含むリン酸塩緩衝生理食塩水を２００μｌ／穴添加し、室温で１時間放置することによりブロッキングを行った。液を除き３００μｌ／穴の洗浄バッファーで２回洗浄した後、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体あるいはラットコントロールＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、ＥＬＩＳＡバッファー（１２．５％ブロックエース、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水）を用いて終濃度が１．２８〜２０，０００ｎｇ／ｍｌ（５倍希釈系列）となるように希釈し、１００μｌ／穴添加した。室温で１時間放置後に液を除き、３００μｌ／穴の洗浄バッファーで３回洗浄した。続いてＥＬＩＳＡバッファーを用いて１，０００倍希釈したＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社製）を１００μｌ／穴添加し、室温で１時間放置した。液を除き、３００μｌ／穴の洗浄バッファーで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社製）を用いて、キットに添付された説明書に従い発色させた。発色後、マイクロプレートリーダー（日本モレキュラーデバイス社製）を用いて４９２ｎｍでの吸光度を測定した。その結果、検討したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体１０検体全てにおいて、抗体の濃度に依存したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質への結合が確認された（図４）。一方ラットコントロールＩｇＧでは、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質への結合が認められなかった。
マウス骨髄非付着細胞の調製
５〜８週齢の雄ｄｄＹマウスより大腿骨と脛骨を摘出し、軟組織を除去した。この大腿骨あるいは脛骨の両端を切り落とし、２５ゲージの注射針付きシリンジによりＤ−ＰＢＳを注入して骨髄細胞を押し出して、遠心チューブに回収した。室温で１００ｇ、５分間遠心して上清を捨てた後に、細胞のペレットにＨｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌ（ＲＥＤ ＢＬＯＯＤ ＣＥＬＬ ＬＹＳＩＮＧ ＢＵＦＦＥＲ、シグマ社製）を加えて懸濁し、室温で５分間放置した。２０ｍｌのＤ−ＰＢＳを加えて室温で１００ｇ，５分間遠心し、上清を捨てた後に細胞のペレットに５ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＭＥＭ−α培地（インビトロジェン社製）１０ｍｌを加えて懸濁し、セルストレイナー（４０μｍ Ｎｙｌｏｎ、ＢＤファルコン社製）を通して凝集物を除いた。この細胞を７５ｃｍ２−Ｔ フラスコ（付着細胞用）に移して、ＣＯ２インキュベーター中で１晩培養した。１晩培養後、Ｔ−フラスコに付着していない細胞を回収して、マウス骨髄非付着細胞として使用した。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体のマウス破骨細胞形成試験での生物活性評価
実施例６において作製した１０検体全ての抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体を用い、マウス骨髄非付着細胞の破骨細胞分化への影響を検討した。実施例８の方法で調製したマウス骨髄非付着細胞を１０％ ＦＢＳと１０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むα−ＭＥＭ培地で１．５×１０５細胞／ｍｌに調製したものを９６穴プレートの各ウェルに２００μｌ播種して、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。９６穴プレート中の古い培養液を除去して、ヒトＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫＬ、ぺプロテック社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した１０％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ−α培地１００μｌを添加した。この細胞培養液に、実施例６で作製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体、市販のラットコントロールＩｇＧ（Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｒａｔ ＩｇＧ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）よりアジ化ナトリウムを除去したサンプル、及び別途作製したウサギ抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ポリクローナル抗体（Ｎｏ．３）を３２〜１，０００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、更に３日間ＣＯ２インキュベーター中で培養した。なお、ポリクローナル抗体（Ｎｏ．３）は、本実施例に記載の実験系において破骨細胞形成を阻害することが既に確認されている抗体である。培養終了後に、形成された破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を以下の操作で測定した。９６穴プレートの各ウェルの培養液を吸引除去して、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）５０μｌを各ウェルに加え、プレート振とう機で５分間振とうして細胞を可溶化した。これらの各ウェルに基質溶液（５ｍｇ／ｍｌ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び０．４６％ 酒石酸ナトリウムを含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１））５０μｌを加えて室温で５分間インキュベートした。インキュベート後に９６穴プレートの各ウェルに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０μｌを加えて酵素反応を停止した。酵素反応停止後に各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標にした。結果を図５及び６に示した。市販のラットコントロールＩｇＧでは顕著なＴＲＡＰ活性の抑制は認められなかった。その一方で、＃３２Ａ１抗体では３２ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で、＃８Ａ１抗体とアフィニティー精製ウサギポリクローナルＮｏ．３抗体では６３ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌの範囲で、顕著なＴＲＡＰ活性の抑制が認められた。また＃３Ａ１抗体、＃３４Ａ１抗体、＃３９Ａ１抗体においても、５００ｎｇ／ｍｌ以上の比較的高濃度においてＴＲＡＰ活性の用量依存的な抑制が認められた。その他の抗体によるマウス破骨細胞形成の抑制は認められなかった。以上の結果より、調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の中に、マウスの破骨細胞形成（破骨細胞の分化と成熟）を強く抑制する抗体が見出された。また、＃３Ａ１抗体、＃８Ａ１抗体、＃３２Ａ１抗体、＃３４Ａ１抗体、＃３９Ａ１抗体に共通な性質として、１０００ｎｇ／ｍｌ、すなわち１μｇ／ｍｌ以下の濃度において破骨細胞形成を阻害する作用を挙げることができる。
可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の発現コンストラクトの作製
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の細胞外領域をコードする部分のヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１５であり、アミノ酸配列は、配列表の配列番号１６である。このような部分配列を利用することにより、動物細胞などの培養上清中に可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質を産生させることができる。
ａ）可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５遺伝子のＰＣＲによる増幅
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして
５’−ｇｇｇｇａｃａａｇｔ ｔｔｇｔａｃａａａａ ａａｇｃａｇｇｃｔｔ ｃａｃｃＡＴＧＧＡＡ ＡＡＧＴＣＣＡＴＣＴ ＧＧＣＴＧＣ−３’（ｈＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−Ｆ：配列表の配列番号１７）
及び
５’−ｇｇｇｇａｃｃａｃｔ ｔｔｇｔａｃａａｇａ ａａｇｃｔｇｇｇｔｃ ＣＣＣＧＣＴＧＧＣＧ ＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣ ＧＧ−３’（ｈＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−Ｒ：配列表の配列番号１８）、
の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。なお、これらのプライマーは、Ｇａｔｅｗａｙエントリークローン作製用増幅用プライマーとして、ｈＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−ＦにはａｔｔＢ１配列が、ｈＳｉｇｌｅｃ−１５−ＥＣＤ−ＲにはａｔｔＢ２配列が付加されるように設計した。このプライマーの組み合わせと、テンプレートとしてヒトＳｉｇｌｅｃ−１５のオープンリーディング配列を含むポリヌクレオチドを用い、常法に従いＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ反応液は、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を用いて精製した。
ｂ）Ｇａｔｅｗａｙ ＢＰ反応によるエントリークローンの作製
λファージの部位特異的組換えシステムを応用したＧａｔｅｗａｙテクノロジー（インビトロジェン社）により、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５細胞外領域のｃＤＮＡを組み込んだエントリークローンを以下の方法で作製した。まず、ａ）で作製した、ａｔｔＢ配列を両端に持つＰＣＲ産物と、ａｔｔＰ配列を有するドナーベクターであるｐＤＮＯＲ２２１（インビトロジェン社製）との間で、ＢＰクロナーゼを用いたＢＰ反応を行った。この反応液を用いて大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換し、薬剤耐性クローンに対してコロニーＰＣＲを行い、インサートサイズを確認した。インサートのサイズが正しく確認されたクローンについて、インサートの全ＤＮＡ配列のシークエンス解析を実施した結果、目的とするヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の細胞外領域をコードするヌクレオチド配列（配列表の配列番号１５）と完全に一致するエントリークローンが得られた。
ｃ）Ｇａｔｅｗａｙ ＬＲ反応による発現クローンの作製
λファージの部位特異的組換えシステムを応用したＧａｔｅｗａｙテクノロジー（インビトロジェン社）により、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５細胞外領域のｃＤＮＡを組み込んだ発現クローンを以下の方法で作製した。ｂ）で作製したエントリークローンは、インサートの両端にａｔｔＬ配列を有している。このエントリークローンと、ａｔｔＲ配列を有する２種類のディストネーションベクターとの間でＬＲクロナーゼを用いたＬＲ反応を行った。なおディストネーションベクターは、インサートのＣ末側にＶ５エピトープと６×Ｈｉｓタグが付加される様に設計されたｐＤＯＮＭ、及びインサートのＣ末側にヒトＦｃタグが付加されるように設計されたｐｈＩｇＦｃの２種類を用いた。ＬＲ反応により得られた反応液を用いて大腸菌ＴＯＰ１０を形質転換し、得られた薬剤耐性クローンに対してシークエンス解析を行い、組換えが正しく行われたかを確認した。
シークエンス解析の結果、ｐＤＯＮＭ及びｐｈＩｇＦｃの両方で正しく組換わった発現クローン（可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭ及び可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃ）が、それぞれ得られた。可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭを動物細胞などにトランスフェクションすることにより、配列表の配列番号１９に記載した塩基配列を有するｍＲＮＡが転写され、配列表の配列番号２０に記載したアミノ酸配列を有する蛋白質（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ）が翻訳される。可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃを動物細胞などにトランスフェクションすることにより、配列表の配列番号２１に記載した塩基配列を有するｍＲＮＡが転写され、配列表の配列番号２２に記載したアミノ酸配列を有する蛋白質（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ）が翻訳される。
２９３−Ｆ細胞を用いた可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質含有培養液の大量調製
a) ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ含有培養液の調製
実施例１０で得られた可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐＤＯＮＭを約２５ｍｇ調製した。なお、大量培養した大腸菌からのプラスミド精製には、インビトロジェン ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用した。調製したプラスミドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）と混合し、トランスフェクション試薬である２９３ｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）を５０ ｍｌ添加して室温で２０分間インキュベーションした。この混和液を、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（インビトロジェン社製）中で１．０〜３．４×１０６細胞／ｍｌとなるように２５Ｌバイオプロセス培養装置（ＷＡＶＥ Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）を用いて培養したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に添加した。６〜１２％ ＣＯ２濃度、３７℃で９６時間（４日間）攪拌培養（３０回転／分）した後に培養液を回収し、遠心分離して培養上清を調製した。このようにして調製した培養上清中には、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域Ｃ末側にＶ５エピトープと６×Ｈｉｓタグが付加された蛋白質（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ）が発現すると考えられる。
ｂ） ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ含有培養液の調製
実施例１０で得られた可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５／ｐｈＩｇＦｃを約５ｍｇ調製した。なお、大量培養した大腸菌からのプラスミド精製には、インビトロジェン ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｇｉｇａｐｒｅｐ Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）を使用した。調製したプラスミドをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（インビトロジェン社製）と混合し、フィルター滅菌した後トランスフェクション試薬である２９３ｆｅｃｔｉｎ（インビトロジェン社製）を１０ ｍｌ添加して室温で２０分間インキュベーションした。この混和液を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉａ（インビトロジェン社製）中で１．０〜３．０×１０６細胞／ｍｌ×５Ｌ（１Ｌ／フラスコを５本）となるようにエルレンマイヤーフラスコ中で培養したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞（インビトロジェン社製）に添加した。８．０％ ＣＯ２濃度、３７℃で９６時間（４日間）回転培養（１２５回転／分）した後に培養液を回収し、遠心分離して培養上清を調製した。このようにして調製した培養上清中には、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５の細胞外領域Ｃ末側にヒトＦｃタグが付加された蛋白質（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ）が発現すると考えられる。
可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質の精製
ａ）可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの精製
ａ−ｉ）ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラムクロマト
実施例１１、ａ）で調製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓを発現させた２９３Ｆ細胞の培養液１２Ｌに１３５０ｍｌの１０ｘｂｕｆｆｅｒ（５００ｍＭ Ｔｒｉｓ，１．５Ｍ ＮａＣｌ，２００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ８．０）を加えて良く攪拌した後に、ＭｉｌｌｉＰａｋ ６０フィルター（ミリポア社製）でろ過した。この培養液を、予め純水（Ｍｉｌｌｉ Ｑ水）で洗浄しておいたＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）１００ｍｌカラムに流速１０ｍｌ／ｍｉｎでかけた。３００ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）４００ｍｌを用いて流速８ｍｌ／ｍｉｎでカラムを洗浄した後に、３００ｍＭ ＮａＣｌ，５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅを含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）２００ｍｌを用いて流速２．５ｍｌ／ｍｉｎでカラムに吸着している蛋白質を溶出して、Ｍｉｎｉ−ｓｏｒｐ ｔｕｂｅ（ヌンク社製）に分取した。溶出された蛋白質を含む画分約４０ｍｌに蛋白質の沈殿を防止する目的で５Ｍ ＮａＣｌ溶液８ｍｌを加えて攪拌した後に、遠心膜濃縮器Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）で約２０ｍｌに濃縮した。濃縮時に発生した不溶物を３０００ｒ．ｐ．ｍ．、４℃で３０分間遠心して除き、その上清液２．５ｍｌを予め１Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（Ｎ−ＰＢＳ）で平衡化しておいたＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけ、Ｎ−ＰＢＳで溶出して、溶媒をＮ−ＰＢＳに置換したサンプル３．５ｍｌを得た。この操作を更に７回繰り返して行い、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ粗精製溶液約２８ｍｌを得た。
ａ−ｉｉ）Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマト
Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムクロマトで精製したＮ−ＰＢＳ置換サンプル１２ｍｌを０．１％ ＣＨＡＰＳを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に４℃で一晩透析（１Ｌ、３回）した後に、４℃、３，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて３０分間遠心して沈殿物を除去した。この上清液をＭｉｌｌｅｘ ＧＶフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、０．１％ ＣＨＡＰＳを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で予め平衡化しておいたＲｅｓｏｕｒｃｅ Ｑ ６ｍＬカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速１ｍｌ／ｍｉｎでかけ、引き続きこの緩衝液を用いて流速１ｍｌ／ｍｉｎでカラムを洗浄して、カラムに吸着しない蛋白質画分を集めた。カラムに吸着した蛋白質は、０．１％ ＣＨＡＰＳ，１Ｍ ＮａＣｌを含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いて流速１ｍｌ／ｍｉｎで溶出した。カラムに吸着しなかった画分２６．５ｍｌを、遠心膜濃縮器Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−１５（ミリポア社製）で３．０ｍｌに濃縮した後に、４℃、３，０００ｒ．ｐ．ｍ．にて１０分間遠心して沈殿物を除去した。その上清液２．５ｍｌを予め５０ｍＭ アルギニン塩酸塩を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０、Ａ−ＰＢＳ）で平衡化しておいたＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけ、Ａ−ＰＢＳで溶出して、溶媒をＡ−ＰＢＳに置換したサンプル３．５ｍｌを得た。調製したサンプルの溶媒中のアルギニン塩酸塩は可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓが沈殿することを防止するために添加した。遠心後の上清液は使用するまで−８０℃で凍結保存した。以上の精製操作（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマト）を２回繰り返して実施した。
ａ−ｉｉｉ）精製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの検出と純度検定
上記の精製操作（Ｎｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＨＰカラムクロマト、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムクロマト）で調製したサンプルを用いて還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と銀染色を行った。即ち各精製ステップのサンプル５μｌに同量のＳＤＳ−処理液を加えて、９５℃で１０分間熱処理した。熱処理した各サンプル０．３μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に使用した。電気泳動の操作は分子量マーカーとしてレインボー分子量マーカー（アマシャムバイオサイエンス社製）を用いた以外は、実施例３と同様の方法で実施した。電気泳動終了後にＰｈａｓｔＧｅｌ Ｓｉｌｖｅｒ Ｋｉｔ（アマシャムバイオサイエンス社製）とＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍを用いて銀染色を行い、その結果を図７に示した。Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムに吸着しなかった蛋白質画分に分子量約３５ｋＤａの蛋白質（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ）が効率的に精製濃縮されたことが示された。
ａ−ｉｖ）精製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの蛋白質濃度の測定
精製ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｑカラムに吸着しなかった蛋白質画分）について、ウシ血清アルブミンを標準サンプルとして用い、ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社製）で蛋白質濃度を測定した。２回の精製操作で合計１．６６ｍｇの精製ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓを得た。
ｂ）可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの精製
ｂ−ｉ）ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムクロマト
実施例１１、ｂ）で調製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃを発現させた２９３Ｆ細胞の培養液１．５ ＬをＳｔｅｒｉｖｅｘ ＧＶフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、予めダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ、インビトロジェン社製）で平衡化しておいたＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ５ｍＬカラム（アマシャムバイオサイエンス社製）に流速５ｍｌ／ｍｉｎでかけた。Ｄ−ＰＢＳ ７０ｍｌを用いて流速５ｍｌ／ｍｉｎでカラムを洗浄した後に、０．１Ｍ クエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）２４ｍｌを用いて流速１．２ｍｌ／ｍｉｎでカラムに吸着している蛋白質を溶出した。溶出した液は、Ｍｉｎｉ−ｓｏｒｐ ｔｕｂｅ（ヌンク社製）に１．２ｍｌ／Ｆｒ．にて分取した後に、１Ｍ Ｔｒｉｓ ０．３１ｍｌを直ちに加えて中和した。溶出された蛋白質の画分（Ｆｒ．５〜９）約７．５ｍｌ中の２．５ｍｌを、５０ｍＭ アルギニン塩酸塩を含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ７．０、Ａ−ＰＢＳ）で平衡化しておいたＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけてＡ−ＰＢＳで溶出して、溶媒をＡ−ＰＢＳに置換したサンプル３．５ｍｌを得た。この作業を２回繰り返して実施した。溶媒中のアルギニン塩酸塩は可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃが沈殿することを防止するために添加した。溶出された蛋白質画分（Ｆｒ．５〜９）の残り２．５ｍｌは、１Ｍ ＮａＣｌを含むリン酸塩緩衝生理食塩水（ｐＨ６．７、Ｎ−ＰＢＳ）で平衡化しておいたＰＤ−１０脱塩カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけてＮ−ＰＢＳで溶出して、溶媒をＮ−ＰＢＳに置換したサンプル３．５ｍｌを得た。調製したサンプルの溶媒中のＮａＣｌは、アルギニン等のアミノ基含有化合物を添加せずに、可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの沈殿を防止する目的で添加した。以上の操作で調製したサンプルは、使用するまで−８０℃で凍結保存した。
ｂ−ｉｉ）精製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの検出と純度検定
上記の精製操作で調製したサンプルを用いて還元条件下のＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動と銀染色を行った。即ち各精製ステップのサンプル５μｌに同量のＳＤＳ−処理液を加えて、９５℃で１０分間加熱した。熱処理した各サンプルを１／２濃度のＳＤＳ−処理液で１／１００又は１／３００倍希釈したサンプル０．３μｌをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に使用した。電気泳動と銀染色は、ａ−ｉｉｉ）に記載のヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｈｉｓの純度検定と同様の方法で実施して、その結果を図８に示した。ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ カラムから溶出した蛋白質画分に分子量約５５ｋＤａの蛋白質（ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ）が効率的に精製濃縮されたことが示された。
ｂ−ｉｉｉ）精製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの蛋白質濃度の測定
精製ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ（ＰＤ−１０脱塩カラムから溶出された蛋白質画分）について、ウシ血清アルブミンを標準サンプルとして用い、ＤＣ−Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＢｉｏＲａｄ社製）で蛋白質濃度を測定した。表４に示したように、２回の精製操作で合計２５．２ｍｇの精製ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃを得た。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体のヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性評価
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体のヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性をＥＬＩＳＡ法により評価した。実施例１２、ｂ）で作製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ蛋白質（Ａ−ＰＢＳ置換したもの）を５μｇ／ｍｌとなるように０．１Ｍ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）で希釈し、９６穴プレート（ナルジェヌンク社製、カタログ番号：４３０３４１）に１００μｌ／穴添加した。室温で１時間放置後に溶液を除去し、３００μｌ／穴の洗浄バッファー（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０含有リン酸塩緩衝生理食塩水）を添加、除去した。この洗浄作業をさらに１回行った後、２５％ブロックエース（大日本住友製薬社製）を含むリン酸塩緩衝生理食塩水を２００μｌ／穴添加し、室温で１時間放置することによりブロッキングを行った。液を除き３００μｌ／穴の洗浄バッファーで２回洗浄した後、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体あるいはラットコントロールＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を、ＥＬＩＳＡバッファー（１２．５％ブロックエース、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含むリン酸塩緩衝生理食塩水）を用いて終濃度が１．２８〜２０，０００ｎｇ／ｍｌ（５倍希釈系列）となるように希釈し、１００μｌ／穴添加した。室温で１時間放置後に液を除き、３００μｌ／穴の洗浄バッファーで３回洗浄した。続いてＥＬＩＳＡバッファーを用いて１，０００倍希釈したＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社製）を１００μｌ／穴添加し、室温で１時間放置した。液を除き、３００μｌ／穴の洗浄バッファーで３回洗浄後、ペルオキシダーゼ用発色キット（住友ベークライト社製）を用いて、キットに添付された説明書に従い発色させた。発色後、マイクロプレートリーダー（日本モレキュラーデバイス社製）を用いて４９２ｎｍでの吸光度を測定した。その結果、検討したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体１０検体全てにおいて、抗体の濃度に依存したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質への結合が確認された（図９）。特に結合活性が強かったのは、＃１Ａ１、＃３Ａ１、＃２４Ａ１、＃３２Ａ１、＃６１Ａ１の５検体であり、＃８Ａ１、＃３４Ａ１、＃３９Ａ１の３検体は比較的結合活性が弱かった。一方ラットコントロールＩｇＧは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質への結合が認められなかった。以上の結果から、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体は、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５だけでなくヒトＳｉｇｌｅｃ−１５にも結合することが示され、しかも一部の抗体はヒトＳｉｇｌｅｃ−１５に強く結合することが判明した。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体添加による正常ヒト破骨前駆細胞の細胞融合、及び骨吸収活性への影響（ｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性評価）
実施例１３において、ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体がヒトＳｉｇｌｅｃ−１５にも結合することが確認されたので、これらの抗体のヒト破骨細胞形成及び骨吸収活性に対する効果を検討した。
ａ）ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体添加による正常ヒト破骨前駆細胞の破骨細胞融合への影響（ＴＲＡＰ染色）
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６穴プレートに１×１０４細胞／穴となるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度６６ ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いた。この培養上清中に、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体及びラットコントロールＩｇＧ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を終濃度３０μｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で４日間培養した。培養後上清を除去し、１０％中性ホルマリンを添加して細胞固定を行った。細胞固定後、蒸留水で２回洗浄し、ＴＲＡＰ染色液（０．２７ｍＭナフトールＡＳ−ＭＸリン酸（シグマ社製）、１．６ｍＭ Ｆａｓｔ ｒｅｄ ｖｉｏｌｅｔ ＬＢ ｓａｌｔ（シグマ社製）、１％ジメチルホルムアミド、５０ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））を１００μｌ／穴添加し、室温で５分反応させた。蒸留水で２回洗浄し、顕微鏡下で細胞を観察した（図１０）。その結果、＃３２Ａ１抗体添加により、高度に細胞融合した巨大破骨細胞の形成がほぼ完全に抑制された。また、＃４１Ｂ１抗体でも、高度に細胞融合した巨大破骨細胞の形成が顕著に抑制された。一方、それ以外のラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃１Ａ１抗体他）及びラットコントロールＩｇＧでは、このような破骨細胞融合の顕著な抑制は認められなかった。このように、正常ヒト破骨前駆細胞からのＴＲＡＰ陽性破骨細胞の多核化・細胞融合が、Ｓｉｇｌｅｃ−１５蛋白質と特異的に結合するモノクローナル抗体により抑制されることが明らかとなった。
ｂ）ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１）添加による正常ヒト破骨前駆細胞の破骨細胞融合への影響（ＴＲＡＰ染色）
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６穴プレートに１×１０４細胞／穴となるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度６８．４ ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いた。この培養上清中に、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）を終濃度０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で３日間培養した。培養後上清を除去し、１０％中性ホルマリンを添加して細胞固定を行った。細胞固定後、蒸留水で２回洗浄し、ＴＲＡＰ染色液（０．２７ｍＭナフトールＡＳ−ＭＸリン酸（シグマ社製）、１．６ｍＭ Ｆａｓｔ ｒｅｄ ｖｉｏｌｅｔ ＬＢ ｓａｌｔ（シグマ社製）、１％ジメチルホルムアミド、５０ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））を１００μｌ／穴添加し、室温で５分反応させた。蒸留水で２回洗浄し、顕微鏡下で細胞を観察した（図１１）。その結果、ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞形成が、＃３２Ａ１抗体 ０．３μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に抑制された。
ｃ）ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１）添加による正常ヒト破骨前駆細胞の骨吸収活性への影響（コラーゲンコートプレートを用いた評価）
破骨細胞はカテプシンＫなどのプロテアーゼを放出することにより、骨組織の構成成分であるＩ型コラーゲンを分解することが知られている。ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社製、カタログ番号 ＰＡ−１５００）は、ユーロピウムが結合したヒトコラーゲンをコーティングした９６穴プレート（９６−ｗｅｌｌ ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）を提供しており、同プレート上で破骨細胞を培養した際に上清に遊離される蛍光コラーゲン断片量を測定することにより、破骨細胞の骨吸収活性をｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することが可能である。
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６−ｗｅｌｌ ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに１×１０４細胞／穴となるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度６８．４ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いた。この培養上清中に、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）を終濃度０．１、０．３、１、３μｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で３日間培養した。培養上清１０μｌを採取し、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを２００μｌ添加して、蛍光プレートリーダー（ＡＲＶＯ ＭＸ、パーキンエルマー社製）を用いて蛍光強度を測定（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：３４０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６１５ｎｍ）することにより、培養上清中に放出された遊離蛍光コラーゲン断片量を定量した（図１２）。その結果、ＲＡＮＫＬ添加により増加した蛍光コラーゲン断片量が、＃３２Ａ１抗体によって、０．３μｇ／ｍｌから３μｇ／ｍｌの範囲で濃度依存的に抑制された。このことから、ヒト破骨細胞の骨吸収活性が、Ｓｉｇｌｅｃ−１５蛋白質と特異的に結合するモノクローナル抗体により抑制されることが明らかとなった。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の卵巣摘出ラットを用いた生物活性評価
ａ）動物実験のプロトコール
１２週齢雌性Ｆ３４４ラット（日本チャールス・リバー社より入手）に両側卵巣摘除を施術し、溶媒投与群、ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃８Ａ１抗体投与群及び＃３２Ａ１抗体投与群の３群に分けた。また偽手術群についても１群設定した。抗体を投与する群については、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃８Ａ１抗体及び＃３２Ａ１抗体を、各１ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内に週３回、手術翌日から４週間反復投与した。溶媒投与群及び偽手術群には、溶媒として０．０１％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳを腹腔内に投与した。投与開始４週後に絶食下で２４時間採尿を行い、尿検体は測定まで−８０℃で保存した。採尿終了後にラットを安楽死させ、腰椎を摘出した。
ｂ）腰椎骨密度の測定
摘出した腰椎に付着している軟組織を除去し、第４〜６腰椎を切り出した。エタノール中で振とう後に風乾することにより脱脂及び脱水し、骨密度測定装置（ＤＣＳ−６００ＥＸ、アロカ社製）を用いて骨密度を測定した。結果を図１３（Ａ）に示した。偽手術群に対し、卵巣摘除群では有意な腰椎骨密度の減少が認められたが、＃８Ａ１及び＃３２Ａ１抗体投与群では卵巣摘除による骨密度の減少が有意に抑制された。
ｃ）尿中デオキシピリジノリン排泄量の測定
I型コラーゲン架橋の各種代謝産物は骨の代謝回転、特に骨吸収を鋭敏に反映し、なかでもデオキシピリジノリンは主として骨のコラーゲンに局在することから骨吸収の指標として信頼性が高いとされている。
凍結保存していた尿検体を融解し、遠心操作により不溶物質を沈殿させて上清を得た。この上清中に含まれるデオキシピリジノリン量を、オステオリンクス「ＤＰＤ」（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて測定した。また、クレアチニン−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて上清中のクレアチニン含量も測定し、クレアチニン補正を行ったデオキシピリジノリン量を算出した。結果を図１３（Ｂ）に示した。偽手術群に対し、卵巣摘除群では尿中デオキシピリジノリン排泄量が有意に増加したことから、卵巣摘除ラットでは破骨細胞による骨吸収が亢進していることが示唆された。一方＃８Ａ１及び＃３２Ａ１抗体投与群では、卵巣摘除によるデオキシピリジノリン排泄量の増加が偽手術群と同程度まで抑制された。このことから、Ｓｉｇｌｅｃ−１５に特異的に結合するモノクローナル抗体が破骨細胞の骨吸収を抑制することが動物モデルでも確認され、この骨吸収抑制作用により卵巣摘除ラットの腰椎骨密度減少を抑制したことが強く示唆された。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体の結合部位（エピトープ）の決定
ａ）ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインの発現精製
ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメイン（ＮＣＢＩの蛋白質データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿９９８７６７のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３９乃至１６５番目のアミノ酸残基からなるポリペプチド）のＮ末端側にＨｉｓタグ、及び、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ認識配列を連結させた蛋白質をコードするＤＮＡをベクターｐＤＥＳＴ１４（インビトロジェン社、カタログ番号：１１８０１−０１６）に組み込んだ。このプラスミドを用いて、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉＢ（ＤＥ３）（ノバジェン社、カタログ番号：７１１３６−４）を形質転換し、ＴＢ培地（インビトロジェン社、カタログ番号：２２７１１−０２２）で培養した。培養後、超音波破砕した菌体を遠心分離し、上清をＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７−５２４７−０１）で精製した。その後、ＴｈｒｏｍｂｉｎでＨｉｓタグを切断後、Ｍｏｎｏ Ｓ５／５０ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７−５１６８−０１）、さらに、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０/３００カラム（ＧＥヘルスケア社、カタログ番号：１７−５１７４−０１）を用いて、電気泳動で分子量１４ｋＤａの単一バンドになるまでヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインを精製した。
ｂ）可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃの精製
可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃは、実施例１２の方法で精製した。
ｃ）ヒトＶ−ｓｅｔドメインとラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１の競合ＥＬＩＳＡ
９６穴Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐプレート（ヌンク社製、型番：４４２４０４）に１．２５μｇ/ｍｌのヤギ抗ヒトＦｃ抗体（ジャクソンイムノリサーチ社、型番：１０９−００５−０９８）を１００μｌ添加し、４℃で一晩固相化した。９６穴Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐプレートをＰＢＳで２回洗浄後、１μg/ｍｌの可溶型ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃを１００μｌ添加し、室温で１時間固相化した。その後、５％スキムミルク/ＰＢＳ溶液を３００μｌ添加し、室温で３時間、ウェルのブロッキングを実施した。一方、2μｇ/ｍｌのラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１と０、０．０３２、０．１６、０．８、４、２０μｇ/ｍｌのヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインをそれぞれ等量混合し、室温で１．５時間反応させた。９６穴Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐプレートをＰＢＳで２回洗浄後、ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１とヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメインの混合溶液を１００μｌ添加し、室温で１時間反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（バイオラッド社、カタログ番号：１７０−６５３１）/ＰＢＳ溶液（以下、ＰＢＳＴ溶液とする）で９６穴Ｍａｘｉ−ｓｏｒｐプレートを５回洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（ベックマンコールター社、カタログ番号：７３２６６４、２，０００倍希釈）を１００μｌ添加し、室温で１時間反応させた。ＰＢＳＴ溶液で５回洗浄後、ＥＬＩＳＡ ＰＯＤ基質Ａ．Ｂ．Ｔ．Ｓ．キット（ナカライテスク社、カタログ番号：１４３５１−８０）の発色液を１００μｌ添加して３０分間反応させた。反応停止液を１００μｌ添加後４０５ｎｍの吸光度を測定した。競合ＥＬＩＳＡの結果、ヒトＶ−ｓｅｔドメインの濃度依存的にラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１の固相化したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５への結合が阻害されることが示された。よって、ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のエピトープは、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５ Ｖ−ｓｅｔドメイン（ＮＣＢＩの蛋白質データベースのＡＣＣＥＳＳＩＯＮ番号ＮＰ＿９９８７６７のアミノ酸配列又は配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列の３９乃至１６５番目のアミノ酸残基からなるドメイン）であることが示された（図１４）。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１の可変領域をコードするｃＤＮＡの増幅と塩基配列の解析
ａ）ｍＲＮＡの調製
ハイブリドーマ＃３２Ａ１は、実施例６、ａ）に従って培養した。４ｘ１０７個のハイブリドーマ＃３２Ａ１から、ＱｕｉｃｋＰｒｅｐ ｍＲＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、約６５μｇのｍＲＮＡを調製した。
ｂ）ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）の合成
ｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）の合成はａ）で合成したｍＲＮＡの０．３μｇを用い、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ社）とＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて実施した。
ｃ）５’-ＲＡＣＥ ＰＣＲによる＃３２Ａ１遺伝子の重鎖可変領域のｃＤＮＡの増幅
＃３２Ａ１重鎖遺伝子のの可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ (Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属)
及び
５’−ＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＧＧＴＣＴＧ−３’（ＲＧ２ＡＲ２：配列表の配列番号２３）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた。ＵＰＭはＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＧ２ＡＲ２はデータベースのラット重鎖（ＩｇＧ２ａ）の定常領域の配列から設計した後に常法に従って合成した。
このプライマーの組み合わせと、ｂ）で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）を鋳型とした、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲにより＃３２Ａ１重鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、サーマルサイクラーの設定条件は、９４℃で１分間加熱した後、「９４℃で０．５分、７２℃で３分」の温度サイクルを５回繰り返し、次に「９４℃で０．５分、７０℃で０．５分、７２℃で３分」の温度サイクルを５回繰り返し、さらに「９４℃で０．５分、６８℃で０．５分、７２℃で３分」の温度サイクルを２０回繰り返してから、４℃で保温とした。
ｄ）５’-ＲＡＣＥ ＰＣＲによる＃３２Ａ１軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡの増幅
＃３２Ａ１軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、ＵＰＭ (Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ａ Ｍｉｘ：ＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔに付属)
及び
５’−ＣＡＴＧＣＴＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧ−３’（ＲＫＲ２：配列表の配列番号２４）の配列を有するオリゴヌクレオチドを用い、ＵＰＭはＳＭＡＲＴ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に付属のものを使用し、ＲＫＲ２はデータベースのラット軽鎖（κ鎖）の定常領域の配列から設計した後に常法に従って合成した。
このプライマーの組み合わせと、ｂ）で合成したｃＤＮＡ（５’−ＲＡＣＥ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ）を鋳型とした、５’−ＲＡＣＥ ＰＣＲにより＃３２Ａ１軽鎖遺伝子の可変領域のｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ ２ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用い、サーマルサイクラーの設定条件は、９４℃で１分間加熱した後、「９４℃で０．５分、７２℃で３分」の温度サイクルを５回繰り返し、次に「９４℃で０．５分、７０℃で０．５分、７２℃で３分」の温度サイクルを５回繰り返し、さらに「９４℃で０．５分、６８℃で０．５分、７２℃で３分」の温度サイクルを２０回繰り返してから、４℃で保温とした。
ｅ）重鎖及び軽鎖可変領域のｃＤＮＡの塩基配列の決定
ｃ）で増幅した重鎖の可変領域のｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した後に、ＤＮＡ配列のシークエンス解析を実施した。シークエンスプライマーとして、
５’−ＣＴＣＣＡＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＣＴＧＧＣ−３’（ＲＧ２ＡＲ３：配列表の配列番号２５）の配列を有するオリゴヌクレオチドをデータベースのラット重鎖（ＩｇＧ２ａ）の定常領域の配列から設計した後に常法に従って合成した。
ｄ）で増幅した軽鎖の可変領域のｃＤＮＡをＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製を行った後に、ＤＮＡ配列のシークエンス解析を実施した。シークエンスプライマーとして、
５’−ＴＣＣＡＧＴＴＧＣＴＡＡＣＴＧＴＴＣＣＧ−３’（ｓｑＲＫ：配列表の配列番号２６）の配列を有するオリゴヌクレオチドをデータベースのラット軽鎖（κ鎖）の定常領域の配列から設計した後に常法に従って合成した。
シークエンス解析により得られた重鎖可変領域を含むｃＤＮＡは、配列表の配列番号２７に記載の塩基配列を有しており、配列表の配列番号２８に記載のアミノ酸配列をコードしている。配列番号２８のアミノ酸番号１乃至１９に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル、アミノ酸番号２０乃至１４０に示されるアミノ酸配列が重鎖可変領域、そしてアミノ酸番号１４１乃至１６７で示されるアミノ酸配列が重鎖定常領域（部分）に相当する。上記の重鎖可変領域は、配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＤＹＦＭＮ）、配列番号４５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＱＩＲＮＫＩＹＴＹＡＴＦＹＡＥＳＬＥＧ）、及び配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＳＬＴＧＧＤＹＦＤＹ）を保有している。また、軽鎖可変領域を含むｃＤＮＡは、配列表の配列番号の２９に記載の塩基配列を有しており、配列表の配列番号３０に記載のアミノ酸配列をコードしている。配列番号３０のアミノ酸番号１乃至２０に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル、アミノ酸番号２１乃至１３２に示されるアミノ酸配列が軽鎖可変領域、そしてアミノ酸番号１３３乃至１３９で示されるアミノ酸配列が軽鎖定常領域（部分）に相当する。上記の軽鎖可変領域は、配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＲＡＳＱＳＶＴＩＳＧＹＳＦＩＨ）、配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＲＡＳＮＬＡＳ）、及び配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＳＲＫＳＰＷＴ）を保有している。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体遺伝子発現コンストラクトの作製
ａ）汎用発現ベクターｐＥＦ１/ＦＣＣＵ−１及びｐＥＦ６ＫＣＬの作製
ａ）−ｉ）ヒト軽鎖発現ベクターｐＥＦ６ＫＣＬの構築
プラスミドｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を鋳型として下記プライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、ＢＧＨｐＡの直後（２１７４）から、Ｓｍａ Ｉ（２９５８）までのＤＮＡ断片（ｆ１ ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ及びＳＶ４０ ｐｒｏｍｏｔｏｒ ａｎｄ ｏｒｉｇｉｎを含むＤＮＡフラグメント、以下、「フラグメントＡ」とする。）を取得した。
５’−ＣＣＡＣＧＣＧＣＣＣＴＧＴＡＧＣＧＧＣＧＣＡＴＴＡＡＧＣ−３’（プライマーＥＦＦ１：配列表の配列番号３１）
５’−ＡＡＡＣＣＣＧＧＧＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧ−３’（プライマーＥＦｓｍａＲ：配列番号３２）
得られたフラグメントＡと、ヒトκ鎖分泌シグナル、ヒトκ鎖定常領域及びヒトｐｏｌｙＡ付加シグナルをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡフラグメント（配列番号３３）以下、「フラグメントＢ」とする。）をオーバーラップＰＣＲにより結合した。得られたフラグメントＡとフラグメントＢとが結合したＤＮＡ断片（以下、「フラグメントＡ＋Ｂ」とする。）を制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化し、制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化したプラスミドｐＥＦ６／Ｖ５−ＨｉｓＢ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とライゲーションし、ＥＦ１プロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒトκ鎖定常領域、及びヒトｐｏｌｙＡ付加シグナル配列をもつ、ヒト軽鎖発現ベクターｐＥＦ６ＫＣＬを構築した。
ａ）−ｉｉ）ｐＥＦ１／ＫＣＬの構築
上記の方法で得られたｐＥＦ６ＫＣＬから制限酵素ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで切り出されたＤＮＡ断片を、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化したｐＥＦ１／ｍｙｃ−ＨｉｓＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）とライゲーションし、プラスミドｐＥＦ１／ＫＣＬを構築した。
ａ）−ｉｉｉ）ヒト重鎖発現ベクターｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１の構築
ヒトＩｇＧ１シグナル配列及び定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片（配列表の配列番号３４）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＰｍｅＩで消化し、ＮｈｅＩ及びＰｍｅＩで消化したプラスミドｐＥＦ１／ＫＣＬと結合し、ＥＦ１プロモーターの下流にシグナル配列、クローニングサイト、ヒト重鎖定常領域、及びヒトｐｏｌｙＡ付加シグナル配列をもつヒト重鎖発現ベクターｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１を構築した。
ｂ）＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体重鎖発現コンストラクトの作製
＃３２Ａ１重鎖可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、
５’−ａａａｇｃｔｇａｇｃＧＡＧＧＴＧＣＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣ−３’（３２Ａ１ＨＦ：配列表の配列番号３５）
及び
５’−ａａａｇｃｔｇａｇｃｔＧＡＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧ−３’（３２Ａ１ＨＲ：配列表の配列番号３６）の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。
なお、これらのプライマーはＰＣＲ産物をｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１に組み込むために、制限酵素ＢｌｐＩ認識配列が付加されるように設計した。このプライマーの組み合わせとテンプレートとして、実施例１７、ｅ）で精製した重鎖可変領域のｃＤＮＡを用い、常法に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した後に、制限酵素ＢｌｐＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社）で消化したＤＮＡ断片を、ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１を制限酵素ＢｌｐＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社）で切断した箇所に挿入することにより＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体重鎖発現コンストラクトを構築した。インサートの配列はシークエンス解析により確認した。シークエンスのためのプライマーとして、
５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（Ｆ１１：配列表の配列番号３７）の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。正しくインサートが挿入できた発現ベクターを「３２Ａ１Ｈ／ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ」と命名した。
ｃ）＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体軽鎖発現コンストラクトの作製
＃３２Ａ１軽鎖可変領域のｃＤＮＡをＰＣＲで増幅するためのプライマーとして、
５’−ａａａｃａｔａｔｇｇｃＧＡＣＡＴＴＧＴＣＴＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＴＧＧ−３’（３２Ａ１ＬＦ：配列表の配列番号３８）
及び
５’−ａａａｃｇｔａｃｇＴＣＴＣＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＡＧＣＧ−３’（３２Ａ１ＬＲ：配列表の配列番号３９）の配列を有するオリゴヌクレオチドを常法に従って合成した。
なお、これらのプライマーはＰＣＲ産物をｐＥＦ６ＫＣＬに組み込むために、３２Ａ１ＬＦには制限酵素ＮｄｅＩ認識配列が、３２Ａ１ＬＲには制限酵素ＢｓｉＷＩ認識配列が付加されるように設計した。このプライマーの組み合わせとテンプレートとして、実施例１７、ｅ）で精製した軽鎖可変領域のｃＤＮＡを用い、常法に従いＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製した後に、制限酵素ＮｄｅＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）及び、ＢｓｉＷＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社）で消化したＤＮＡ断片を、ｐＥＦ６ＫＣＬを制限酵素ＮｄｅＩ（ＴＡＫＡＲＡ社）及び、ＢｓｉＷＩ（ＮＥＷ ＥＮＧＬＡＮＤ ＢＩＯＬＡＢＳ社）で切断した箇所に挿入することにより＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体軽鎖発現コンストラクトを構築した。インサートの配列はシークエンス解析により確認した。シークエンスのためのプライマーとしては、配列表の配列番号３７に記載のプライマーＦ１１を使用した。正しくインサートが挿入できた発現ベクターを「３２Ａ１Ｌ／ｐＥＦ６ＫＣＬ」と命名した。
ｂ）で作製された＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体重鎖遺伝子は、配列表の配列番号４０に記載のヌクレオチド配列を有しており、配列表の配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードしている。配列番号４１のアミノ酸番号１乃至１９に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル、アミノ酸番号２０乃至１４０に示されるアミノ酸配列が重鎖可変領域、そしてアミノ酸番号１４１乃至４７０で示されるアミノ酸配列が重鎖定常領域に相当する。また、ｃ）で作製された＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体軽鎖遺伝子は、配列表の配列番号４２に記載のヌクレオチド配列を有しており、配列表の配列番号４３に記載のアミノ酸配列をコードしている。配列番号４３のアミノ酸番号１乃至２０に示されるアミノ酸配列が分泌シグナル、アミノ酸番号２１乃至１３２に示されるアミノ酸配列が軽鎖可変領域、そしてアミノ酸番号１３３乃至２３７で示されるアミノ酸配列が軽鎖定常領域に相当する。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体の調製
ａ）ヒトキメラ抗体の生産
対数増殖期の２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞 ３×１０7個を新鮮な３０ｍｌ（３０ｍｌ培養を１ロットとして４ロット作製）のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に播種し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで振とう培養した（１２５ｒｐｍ）。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社製 ＃２４７６５）３００μｇをＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）1ｍｌに溶解し、室温で５分間放置した。実施例１８において作製された＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体重鎖発現ベクター ３２Ａ１Ｈ／ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ、及び＃３２Ａ１ヒトキメラ抗体軽鎖発現ベクター ３２Ａ１Ｌ／ｐＥＦ６ＫＣＬを、ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製した。３２Ａ１Ｈ／ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ（１５μｇ）及び３２Ａ１Ｌ／ｐＥＦ６ＫＣＬ（４５μｇ）を1ｍｌのＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁し、室温で５分間放置したＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ混合液1ｍｌに加え、さらに室温５分間放置した。次にＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／発現ベクター／ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ混合液２ｍｌを２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞懸濁液の１ロットに添加し、振とう培養を続けた。３７℃、８％ＣＯ２中で７日間培養した後、培養上清をロットごとに回収した。
ｂ）ヒトキメラ抗体の精製
上記で得られた培養上清９０ｍｌ (３ロット分)をフィルターろ過(ＮＡＬＧＥＮＥ社製 ＃２９５−４５４５)後、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ ０．５ｍｌ （ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ社製 ＃１７−５４３８−０１）を加え、８０ｒｐｍ、１０℃で一晩振とうさせた。翌日、担体を回収しＰＢＳで洗浄後、1Ｍアルギニン溶液（ｐＨ４．０）にて抗体を溶出した。溶出液をＰＤ１０カラム(ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製 ＃１７−０８５１−０１)にてＰＢＳに置換後、アミコンウルトラー４(ミリポア社製 ＃ＵＦＣ８０５００８)にて濃縮しヒトキメラ抗体 １．２ｍｌ（０．９８ｍｇ／ｍｌ）を得た。抗体の濃度は日立ダイオードアレー型バイオ光度計 Ｕ−００８０Ｄにて２８０ｎｍを測定し算出した。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性評価
実施例１９において調製した精製ヒトキメラ抗体に対するラット＃３２Ａ１抗体の競合阻害を以下の方法で測定した。実施例４にて精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−ＦｃをＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈後、イムノプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４３７１１１）に１００μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置することでプレートに蛋白質を吸着させた。翌日、ウェルをＰＢＳ−Ｔ液（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄後、スキムミルク（森永乳業社製）をＰＢＳで５％に希釈した溶液を３５０μｌ／ウェルで分注し、室温で２時間静置した。ウェル中の液を除去しＰＢＳ−Ｔ液にて３回洗浄後、０．２５μｇ／ｍｌのヒトキメラ抗体と各種濃度（０μｇ／ｍｌ、０．０１６μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１６μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１．６６μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ）の＃３２Ａ１抗体又はラットコントロールＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社製 ＃６−００１−Ａ）の混合溶液（最終濃度０．５％のスキムミルク含有ＰＢＳ液）をそれぞれ１００μｌ／ウェルで分注し、２時間室温で静置した。ＰＢＳ−Ｔ液で３回ウェルを洗浄後、ＴＢＳ−Ｔ液（ＴＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で２５００倍に希釈したＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製 ＃１０９−０５５−０９７）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ウェル中の液を除去し、ＴＢＳ−Ｔ液で５回ウェルを洗浄した後、蛍光基質液（Ｒｏｃｈｅ社製 ＃１１６８１９８２００１）を１００μｌ／ウェルで添加し蛍光反応を行った。蛍光基質液添加１０分後、プレートリーダーにて蛍光強度を測定した。その結果、＃３２Ａ１抗体は、ヒトキメラ抗体のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃに対する結合を濃度依存的に阻害することが示された。また＃３２Ａ１抗体とヒトキメラ抗体を同濃度(１：１)にて混合した場合、約４０％の競合阻害が示された。従って、＃３２Ａ１抗体とヒトキメラ抗体は、マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃに対してほぼ同等の親和性を持つと考えられる。一方ラットコントロールＩｇＧは、競合阻害を示さなかった（図１５）。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体のマウス破骨細胞形成試験、並びにヒト破骨細胞形成試験での生物活性評価
ａ）マウス破骨細胞形成試験
実施例１９において調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体を用い、マウス骨髄非付着細胞の破骨細胞分化への影響を検討した。実施例８の方法で調製したマウス骨髄非付着細胞を１０％ ＦＢＳと１０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むα−ＭＥＭ培地で１．５×１０５細胞／ｍｌに調製したものを９６穴プレートの各ウェルに２００μｌ播種して、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。９６穴プレート中の古い培養液を除去して、ヒトＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫＬ、ぺプロテック社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した１０％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ−α培地１００μｌを添加した。この細胞培養液に、実施例６において作製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１と実施例１９において作製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体を３〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、更に３日間ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養終了後に、形成された破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を実施例９に記載の方法で測定した。酵素反応停止後に各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標にした。結果を図１６に示した。＃３２Ａ１抗体及びラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体において、５０ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で用量依存的なＴＲＡＰ活性の抑制が認められた。この結果より、ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体はラット＃３２Ａ１抗体とほぼ同等のマウスの破骨細胞形成（破骨細胞の分化と成熟）抑制活性を有することが示された。
ｂ）正常ヒト破骨前駆細胞を用いた評価（ＴＲＡＰ染色）
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６穴プレートに１×１０４細胞／穴となるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度６６ ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いた。この培養上清中に、実施例１９で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体を終濃度０．３、１、３、１０μｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で３日間培養した。培養後上清を除去し、１０％中性ホルマリンを添加して細胞固定を行った。細胞固定後、蒸留水で２回洗浄し、ＴＲＡＰ染色液（０．２７ｍＭナフトールＡＳ−ＭＸリン酸（シグマ社製）、１．６ｍＭ Ｆａｓｔ ｒｅｄ ｖｉｏｌｅｔ ＬＢ ｓａｌｔ（シグマ社製）、１％ジメチルホルムアミド、５０ｍＭ酒石酸ナトリウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０））を１００μｌ／穴添加し、室温で５分反応させた。蒸留水で２回洗浄し、顕微鏡下で細胞を観察した（図１７）。その結果、ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞形成が、＃３２Ａ１のヒトキメラ抗体の添加により０．３μｇ／ｍｌから１０μｇ／ｍｌの範囲で抑制された。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体の設計（１）
ａ）＃３２Ａ１のヒト化バージョンの設計
ａ）−ｉ） ＃３２Ａ１の可変領域の分子モデリング
＃３２Ａ１の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０３，１２１−１５３，（１９９１））によって実行された。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３５，D３０１−D３０３（２００７））に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の１次配列（Ｘ線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である）を、上で決定された＃３２Ａ１の可変領域と比較した。結果として、１ＬＫ３が、＃３２Ａ１の軽鎖の可変領域に対して同様にフレームワーク中に欠損がある抗体の中で、最も高い配列相同性を有するとして選択された。また、１ＡＤ０が、＃３２Ａ１の重鎖の可変領域に対して最も高い配列相同性を有するとして選択された。フレームワーク領域の三次元構造は、＃３２Ａ１の軽鎖及び重鎖に対応する１ＬＫ３及び１AＤ０の座標を組み合わせて、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。＃３２Ａ１のＣＤＲは、Ｔｈｏｒｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３，８００−８１５，（１９９６））の分類に従って、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１及びＣＤＲＨ２は、それぞれクラスター１５A、７A、９A、１０Ａ、１２Ｂに割り当てられた。ＣＤＲＨ３は、Ｈ３ルール（ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒ ３９９，１−８（１９９６））を使用して、ｋ（８）Ｃに分類された。次いで、それぞれのＣＤＲについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
最後に、エネルギーの点で＃３２Ａ１の可変領域の可能性のある分子モデルを得るために、不利な原子間接触を除くためのエネルギー計算を行った。上記手順を、市販の蛋白質立体構造予測プログラムＰｒｉｍｅ及び配座探索プログラムＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ， ＬＬＣ）を用いて行った。
ａ）−ｉｉ） ヒト化＃３２Ａ１に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化＃３２Ａ１抗体の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて２通り選択された。＃３２Ａ１のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔデータベース（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，２０５−２０６（２００１））の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、Ｍ３７ＧＯ３７‘ＣＬ抗体がフレームワーク領域についての７３％の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。Ｍ３７ＧＯ３７‘ＣＬについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、＃３２Ａ１についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された＃３２Ａ１の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。
＃３２Ａ１のフレームワーク領域の配列を、ＩｇＢＬＡＳＴ（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３６，Ｄ２５−Ｄ３０（２００７））の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、Ｌ鎖はＡＡＢ３４４３０がフレームワーク領域についての７９％配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。H鎖はＣＡＦ３１２８８がフレームワーク領域についての７８％の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。Ｌ鎖はＡＡＢ３４４３０について、Ｈ鎖はＣＡＦ３１２８８についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、＃３２Ａ１についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上で構築された＃３２Ａ１の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。いずれの方法も、選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化＃３２Ａ１配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
ｂ） ＃３２Ａ１重鎖のヒト化
ｂ）−ｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、６１（グルタミン酸）、８９（バリン）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１０５（セリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５１に記載されている。配列番号５１のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号５１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５０に記載されている。配列番号５０のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５０のヌクレオチド配列及び配列番号５１のアミノ酸配列は、図２７にも記載されている。
ｂ）−ｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５３に記載されている。配列番号５３のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号５３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５２に記載されている。配列番号５２のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５２のヌクレオチド配列及び配列番号５３のアミノ酸配列は、図２８にも記載されている。
ｂ）−ｉｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、１０４（バリン）、１１４（イソロイシン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれバリン、セリン、グルタミン、メチオニン、バリン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５５に記載されている。配列番号５５のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号５５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５４に記載されている。配列番号５４のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５４のヌクレオチド配列及び配列番号５５のアミノ酸配列は、図２９にも記載されている。
ｂ）−ｉｖ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、６１（グルタミン酸）、８９（バリン）、９５（アスパラギン酸）、９７（グルタミン酸）、９９（セリン）、１０４（バリン）、１０５（セリン）、１１４（イソロイシン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれバリン、バリン、セリン、グルタミン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン、リジン、スレオニン、メチオニン、アスパラギン、バリン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５７に記載されている。配列番号５７のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号５７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５６に記載されている。配列番号５６のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５６のヌクレオチド配列及び配列番号５７のアミノ酸配列は、図３０にも記載されている。
ｂ）−ｖ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、９５（アスパラギン酸）、９７（グルタミン酸）、９９（セリン）、１０４（バリン）、１１４（イソロイシン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれバリン、バリン、セリン、グルタミン、アスパラギン、リジン、スレオニン、メチオニン、バリン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号５９に記載されている。配列番号５９のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号５９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号５８に記載されている。配列番号５８のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１４１０番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号５８のヌクレオチド配列及び配列番号５９のアミノ酸配列は、図３１にも記載されている。
ｂ）−ｖｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ７Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、８９（バリン）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１０５（セリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、フェニルアラニン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ７Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ７Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７２に記載されている。配列番号７２のアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ残基からなる配列、１２２乃至４５１番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号７２のアミノ酸配列は、図３８にも記載されている。
ｂ）−ｖｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ８Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、６１（グルタミン酸）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１０５（セリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、グリシン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ８Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ８Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７３に記載されている。配列番号７３のアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ残基からなる配列、１２２乃至４５１番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号７３のアミノ酸配列は、図３８にも記載されている。
ｂ−ｖｉｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ９Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、６１（グルタミン酸）、８９（バリン）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、グリシン、フェニルアラニン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ９Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ９Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７４に記載されている。配列番号７４のアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ残基からなる配列、１２２乃至４５１番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号７４のアミノ酸配列は、図３８にも記載されている。
ｂ）−ｉｘ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１０Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１０５（セリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１０Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１０Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７５に記載されている。配列番号７５のアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ残基からなる配列、１２２乃至４５１番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号７５のアミノ酸配列は、図３９にも記載されている。
ｂ）−ｘ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１１Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、８９（バリン）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、フェニルアラニン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１１Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１１Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７６に記載されている。配列番号７６のアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ残基からなる配列、１２２乃至４５１番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号７６のアミノ酸配列は、図３９にも記載されている。
ｂ）−ｘｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１２Hタイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される＃３２Ａ１重鎖のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、６１（グルタミン酸）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、グリシン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１２Ｈタイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１２Ｈタイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７７に記載されている。配列番号７７のアミノ酸配列の１乃至１２１番目のアミノ残基からなる配列、１２２乃至４５１番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号７７のアミノ酸配列は、図３９にも記載されている。
ｃ） ＃３２Ａ１軽鎖のヒト化
ｃ）−ｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２２（アラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、リジン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、チロシン、グリシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６１に記載されている。配列番号６１のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号６１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６０に記載されている。配列番号６０のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号６０のヌクレオチド配列及び配列番号６１のアミノ酸配列は、図３２にも記載されている。
ｃ）−ｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６３に記載されている。配列番号６３のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号６３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６２に記載されている。配列番号６２のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号６２のヌクレオチド配列及び配列番号６３のアミノ酸配列は、図３３にも記載されている。
ｃ）−ｉｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれアスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６５に記載されている。配列番号６５のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号６５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６４に記載されている。配列番号６４のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号６４のヌクレオチド配列及び配列番号６５のアミノ酸配列は、図３４にも記載されている。
ｃ）−ｉｖ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号３６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれグルタミン酸、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６７に記載されている。配列番号６７のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３２番目のアミノ酸残基からなる配列、１３３乃至２３７番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号６７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６６に記載されている。配列番号６６のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９６番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１１番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号６６のヌクレオチド配列及び配列番号６７のアミノ酸配列は、図３５にも記載されている。
ｃ）−ｖ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１１０（フェニルアラニン）、１２２（アラニン）、１２３（グリシン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれアスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、リジン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、チロシン、グリシン、グルタミン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号６９に記載されている。配列番号６９のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号６９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号６８に記載されている。配列番号６８のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号６８のヌクレオチド配列及び配列番号６９のアミノ酸配列は、図３６にも記載されている。
ｃ）−ｖｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれアスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７１に記載されている。配列番号７１のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号７１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号７０に記載されている。配列番号７０のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号７０のヌクレオチド配列及び配列番号７１のアミノ酸配列は、図３７にも記載されている。
ｃ）−ｖｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ７Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２２（アラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、リジン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、チロシン、グリシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ７Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｔ７Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７８に記載されている。配列番号７８のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号７８のアミノ酸配列は、図４０にも記載されている。
ｃ）−ｖｉｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ８Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２２（アラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、チロシン、グリシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ８Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ８Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号７９に記載されている。配列番号７９のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号７９のアミノ酸配列は、図４０にも記載されている。
ｃ）−ｉｘ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ９Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２２（アラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、リジン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、グリシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ９Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ９Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８０に記載されている。配列番号８０のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８０のアミノ酸配列は、図４０にも記載されている。
ｃ）−ｘ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１０Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、リジン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、チロシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１０Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１０Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８１に記載されている。配列番号８１のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８１のアミノ酸配列は、図４０にも記載されている。
ｃ）−ｘｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１１Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２２（アラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、チロシン、グリシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１１Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１１Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８２に記載されている。配列番号８２のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８２のアミノ酸配列は、図４０にも記載されている。
ｃ）−ｘｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１２Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２２（アラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、リジン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、グリシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１２Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１２Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８３に記載されている。配列番号８３のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８３のアミノ酸配列は、図４１にも記載されている。
ｃ）−ｘｉｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１３Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、リジン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、チロシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１３Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１３Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８４に記載されている。配列番号８４のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８４のアミノ酸配列は、図４１にも記載されている。
ｃ）−ｘｉｖ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１４Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２２（アラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、グリシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１４Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１４Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８５に記載されている。配列番号８５のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８５のアミノ酸配列は、図４１にも記載されている。
ｃ）−ｘｖ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１５Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、チロシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１５Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１５Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８６に記載されている。配列番号８６のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８６のアミノ酸配列は、図４１にも記載されている。
ｃ）−ｘｖｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１６Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、リジン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１６Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１６Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８７に記載されている。配列番号８７のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８７のアミノ酸配列は、図４１にも記載されている。
ｃ）−ｘｖｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１７Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２２（アラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、グリシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１７Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１７Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８８に記載されている。配列番号８８のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８８のアミノ酸配列は、図４２にも記載されている。
ｃ）−ｘｖｉｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１８Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、チロシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１８Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１８Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号８９に記載されている。配列番号８９のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号８９のアミノ酸配列は、図４２にも記載されている。
ｃ）−ｘｉｘ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１９Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、６６（グルタミン）、６８（アルギニン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、プロリン、リジン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１９Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１９Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９０に記載されている。配列番号９０のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号９０のアミノ酸配列は、図４２にも記載されている。
ｃ）−ｘｘ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２０Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９（アラニン）、２９−３０の間（欠損残基）、３６（グルタミン）、４１（セリン）、６６（グルタミン）、８１（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、アスパラギン、プロリン、バリン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、バリン、バリン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２０Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２０Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９１に記載されている。配列番号９１のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号９１のアミノ酸配列は、図４２にも記載されている。
ｃ）−ｘｘｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２１Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２１（アスパラギン酸）、２４（ロイシン）、２９−３０の間（欠損残基）、３１（アラニン）、３２（バリン）、３４（ロイシン）、３６（グルタミン）、４０（イソロイシン）、６６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０２（グルタミン）、１０３（アラニン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２２（アラニン）、１２３（グリシン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれグルタミン酸、メチオニン、スレオニン、セリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、ロイシン、アラニン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、グルタミン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２１Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２１Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９２に記載されている。配列番号９２のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号９２のアミノ酸配列は、図４２にも記載されている。
ｃ）−ｘｘｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２２Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２１（アスパラギン酸）、２４（ロイシン）、２９−３０の間（欠損残基）、３１（アラニン）、３２（バリン）、３４（ロイシン）、３６（グルタミン）、４０（イソロイシン）、６６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０２（グルタミン）、１０３（アラニン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２３（グリシン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれグルタミン酸、メチオニン、スレオニン、セリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、ロイシン、アラニン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２２Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２２Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９３に記載されている。配列番号９３のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号９３のアミノ酸配列は、図４３にも記載されている。
ｃ）−ｘｘｉｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２３Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２４（ロイシン）、２９−３０の間（欠損残基）、３１（アラニン）、３２（バリン）、３４（ロイシン）、３６（グルタミン）、４０（イソロイシン）、６６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０２（グルタミン）、１０３（アラニン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれメチオニン、スレオニン、セリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、ロイシン、アラニン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２３Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２３Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９４に記載されている。配列番号９４のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号９４のアミノ酸配列は、図４３にも記載されている。
ｃ）−ｘｘｉｖ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２４Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２１（アスパラギン酸）、２９−３０の間（欠損残基）、３１（アラニン）、３２（バリン）、３４（ロイシン）、３６（グルタミン）、４０（イソロイシン）、６６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０２（グルタミン）、１０３（アラニン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２２（アラニン）、１２３（グリシン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれグルタミン酸、スレオニン、セリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、ロイシン、アラニン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、グルタミン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２４Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２４Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９５に記載されている。配列番号９５のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号９５のアミノ酸配列は、図４３にも記載されている。
ｃ）−ｘｘｖ） ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２５Ｌタイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される＃３２Ａ１軽鎖のアミノ酸番号２９−３０の間（欠損残基）、３１（アラニン）、３２（バリン）、３４（ロイシン）、３６（グルタミン）、４０（イソロイシン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０２（グルタミン）、１０３（アラニン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１１０（フェニルアラニン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれスレオニン、セリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、ロイシン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、チロシン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化＃３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２５Ｌタイプ軽鎖」と命名した。
また、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２５Ｌタイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９６に記載されている。配列番号９６のアミノ酸配列の１乃至１１３番目のアミノ残基からなる配列、１１４乃至２１８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれ軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号９６のアミノ酸配列は、図４３にも記載されている。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体遺伝子の作製
ａ）ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｌ及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｌタイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号６１のアミノ酸番号１乃至１３３、配列番号６３のアミノ酸番号１乃至１３３、配列番号６５のアミノ酸番号１乃至１３３、配列番号６７のアミノ酸番号１乃至１３２、配列番号６９のアミノ酸番号１乃至１３３及び配列番号７１のアミノ酸番号１乃至１３３にそれぞれ示される、分泌シグナルと融合したｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｌ及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｌタイプ軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（ＭＢＬ社、人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｓｉＷＩで切り出されたＤＮＡ断片を、ヒト化抗体軽鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ６ＫＣＬ）を制限酵素ＮｈｅＩ及びＢｓｉＷＩで切断した箇所に挿入することにより、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４Ｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｌ及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｌタイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｌ」、「ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｌ」、「ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｌ」、「ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４Ｌ」、「ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｌ」及び「ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｌ」と命名した。
ｂ）ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈ及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｈ重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号５１、５３、５５、５７及び５９のアミノ酸番号１乃至１４０にそれぞれ示される、分泌シグナルと融合したｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈ及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｈ重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（ＭＢＬ社 人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＢｌｐＩで切り出されるＤＮＡ断片を、ヒト化抗体重鎖発現汎用ベクター（ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１）を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に挿入することにより、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈ、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈ及びｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｈ重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｈ」、「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｈ」「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈ」「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈ」及び「ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｈ」と命名した。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体の調製
ａ）ヒト化抗体の生産
対数増殖期の２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞１．５×１０８を新鮮な１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に播種し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで振とう培養した（１２５ｒｐｍ）。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）１ｍｇをＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）４ｍｌに溶解し、室温で５分間放置した。ＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製した重鎖発現プラスミド（０．０５ｍｇ）及び軽鎖発現プラスミド（０．１５ｍｇ）を４ｍｌのＯｐｔｉ−ＰｒｏＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に懸濁した。室温で５分間放置したＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ混合液４ｍｌに、発現プラスミド／ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ混合液４ｍｌを加え、さらに室温５分間放置した。次にＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／発現プラスミド／ＯｐｔｉＰｒｏＳＦＭ混合液８ｍｌを２９３ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ細胞懸濁液に添加し、振とう培養を続けた。３７℃、８％ＣＯ２中で７日間培養したのち、培養上清を回収した。
ｂ）ヒト化抗体の精製
上記ａ）で得られた培養上清を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。５００ｍｌ容キャップつきフラスコに培養上清１００ｍｌを入れ、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−ｓｃｉｅｎｃｅ社製）懸濁液（５０％スラリー）１ｍｌを添加した。１０℃のインキュベーター中、１００ｒｐｍで一晩攪拌した。ＺｅｂａＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ，ｅｍｐｔｙ５ｍＬ（ＰＩＥＲＣＥ社）に２９３Ｆ培養上清／ＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ懸濁液をアプライした。樹脂がカラムに全て入ったのち、１Ｍ ＮａＣｌ１０ｍｌで洗浄した。次に１Ｍアルギニン溶液（ｐＨ４．０）１ｍｌをアプライし、抗体の含まれる画分を集めた。その画分をＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ（ＡｍｉｃｏｎＵｌｔｒａ４，分画分子量５０Ｋ、ミリポア社）に添加し、クエン酸緩衝への液置換及び濃縮をおこなった。最終的な容量を２００μｌとし、精製サンプルとした。
ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１Ｈとの組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１」、ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２Ｈとの組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２」、ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈとの組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３」、ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３Ｈとの組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４」、ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈとの組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５」、ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６ＬとｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６Ｈとの組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６」と命名した。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質に対する結合性評価
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５＃３２Ａ１ヒト化抗体Ｔ１−Ｔ６のマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ及びヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃに対する結合性を以下の方法で評価した。実施例４にて精製したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ、あるいは実施例１２にて精製したヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−ＦｃをＰＢＳで１μｇ／ｍｌに希釈後、イムノプレート（Ｎｕｎｃ社製 ＃４３７１１１）に１００μｌ／ウェルで分注し、４℃で一晩静置することでプレートに各蛋白質を吸着させた。翌日、ウェルをＰＢＳ−Ｔ液（ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で５回洗浄後、スキムミルク（森永乳業社製）をＰＢＳで５％に希釈した溶液を３５０μｌ／ウェルで分注し、室温で２時間静置した。ウェル中の液を除去しＰＢＳ−Ｔ液にて５回洗浄後、実施例２４で調製した精製ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５＃３２Ａ１ヒト化抗体Ｔ１−Ｔ６あるいは実施例１９にて調製したヒトキメラ抗体を、０．５％スキムミルク含有ＰＢＳ液を用いて終濃度が１〜０．００４μｇ／ｍｌ（４倍希釈系列）となるように希釈後１００μｌ／ウェルで分注し、２時間室温で静置した。その際、各抗体濃度はスペクトロホトメーターＤＵ７４００（ベックマン社製）にて２８０ｎｍを測定し、各抗体のモル分子吸光係数に基づき決定した。ＰＢＳ−Ｔ液で５回ウェルを洗浄後、ＴＢＳ−Ｔ液（ＴＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０）で２５００倍に希釈したＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社製 ＃１０９−０５５−０９７）を１００μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間静置した。ウェル中の液を除去し、ＴＢＳ−Ｔ液で５回ウェルを洗浄した後、蛍光基質液（Ｒｏｃｈｅ社製 ＃１１６８１９８２００１）を１００μｌ／ウェルで添加し蛍光反応を行った。マウスＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃ吸着プレートは蛍光基質液添加１０分後、ヒトＳｉｇｌｅｃ−１５−Ｆｃプレートは１５分後に、各々スペクトラマックスＭ５（モレキュラーデバイス社製）にて蛍光強度を測定した。その結果、検討したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ヒト化抗体６検体全てにおいて、抗体の濃度に依存したマウスＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質（図１８）及びヒトＳｉｇｌｅｃ−１５蛋白質（図１９）への結合が確認された。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のキメラ抗体の添加による、マウス骨髄付着細胞の破骨細胞分化への影響（ＴＮＦα刺激）
実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１及び実施例１９で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のキメラ抗体を用い、マウス骨髄非付着細胞のＴＮＦα刺激による破骨細胞分化への影響を検討した。実施例８の方法で調製したマウス骨髄非付着細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ、及び２ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦ−β（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むα−ＭＥＭ培地で１．５×１０５細胞／ｍｌに調製したものを９６穴プレートの各ウェルに２００μｌ播種して、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。９６穴プレート中の古い培養液を除去して、ヒト遺伝子組換え型ＴＮＦα（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を終濃度３０ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した１０％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ−α培地１００μｌを添加した。この細胞培養液に、実施例９で作製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１及び実施例１９で作製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のキメラ抗体を０．１２５〜４μｇ／ｍｌの濃度になるように添加して更に３日間 ＣＯ２インキュベーター中で培養した。同時に特許ＷＯ９６／２６２１７の明細書に記載の方法で調製したヒト遺伝子組換え型ＯＣＩＦ／ＯＰＧを１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加して培養したウェルも準備した。培養終了後に、Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｃｉｄ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｋｉｔ（シグマ社製）を用いて、キットに添付のプロトコールに従いＴＲＡＰ染色を行い、ＴＲＡＰ陽性多核破骨細胞の形成を観察した。その結果、抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５ポリクローナル抗体の添加によってＴＲＡＰ陽性で巨大な多核破骨細胞の形成が抑制された（図２０）。ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１及びそのキメラ抗体を添加した場合でも単核で小型の破骨細胞は形成されたが、ＴＮＦαで誘導される大型で多核の破骨細胞の形成はほぼ完全に抑制された。その一方で、ＲＡＮＫＬブロッカーであるＯＣＩＦ／ＯＰＧを十分量添加しても、大型で多核の破骨細胞の形成は殆ど抑制されなかった。また同様に、形成された破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を実施例９に記載の操作で測定した。酵素反応停止後に各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標にした。結果を図２１に示した。＃３２Ａ１抗体及び＃３２Ａ１のキメラ抗体において、１２５ｎｇ／ｍｌから４μｇ／ｍｌの範囲で、顕著なＴＲＡＰ活性の抑制が認められた。これらの結果から、ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体及びそのキメラ抗体はＴＮＦαで誘導される破骨細胞の分化成熟における細胞融合の過程を強く抑制することが示された。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃８Ａ１、＃３２Ａ１のラット破骨細胞形成試験での生物活性評価
実施例６において調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃８Ａ１、＃３２Ａ１を用い、ラット骨髄非付着細胞の破骨細胞への分化の影響を検討した。実施例８の方法を改変してラット骨髄非付着細胞を調製した。即ち、１２週齢の雌Ｆ３４４ラットの両足より大腿骨を摘出し、軟組織を除去した。この大腿骨の両端を切り落とし、２３ゲージの注射針付きシリンジによりＭＥＭ−α培地を注入して骨髄細胞を押し出して、遠心チューブに回収した。室温で１００ｇ、５分間遠心して上清を捨てた後に、細胞のペレットにＨｅｍｏｌｙｔｉｃ Ｂｕｆｆｅｒ １ｍｌ（ＲＥＤ ＢＬＯＯＤ ＣＥＬＬ ＬＹＳＩＮＧ ＢＵＦＦＥＲ、シグマ社製）を加えて懸濁し、室温で５分間放置した。２０ｍｌのＤ−ＰＢＳを加えて室温で１００ｇ，５分間遠心し、上清を捨てた後に細胞のペレットに５ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）、１０％ ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＭＥＭ−α培地（インビトロジェン社製）１０ｍｌを加えて懸濁し、セルストレイナー（４０μｍ Ｎｙｌｏｎ、ＢＤファルコン社製）を通して凝集物を除いた。この細胞を７５ｃｍ２−Ｔ フラスコ（付着細胞用）に移して、ＣＯ２インキュベーター中で１晩培養した。１晩培養後、Ｔ−フラスコに付着していない細胞を回収して、ラット骨髄非付着細胞として使用した。
この方法で調製したラット骨髄非付着細胞を実施例９の方法に準じて培養してラット破骨細胞形成試験を実施した。即ち、調製したラット骨髄非付着細胞を１０％ ＦＢＳと１０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むα−ＭＥＭ培地で１．５×１０５細胞／ｍｌに調製したものを９６穴プレートの各ウェルに２００μｌ播種して、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。９６穴プレート中の古い培養液を除去して、ヒトＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫＬ、ぺプロテック社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した１０％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ−α培地１００μｌを添加した。この細胞培養液に、実施例６において作製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃８Ａ１、＃３２Ａ１を３１〜１０００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、更に３日間ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養終了後に、形成された破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を実施例９に記載の方法で測定した。酵素反応停止後に各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標にした。結果を図２２に示した。＃８Ａ１抗体では、６３ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で用量依存的なＴＲＡＰ活性の抑制が認められた。また＃３２Ａ１抗体では、３１ｎｇ／ｍｌ以上の濃度で用量依存的なＴＲＡＰ活性の抑制が認められた。これらの結果より、ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃８Ａ１、＃３２Ａ１はマウスの破骨細胞形成と同様にラットの破骨細胞形成も強く抑制すること、及び＃３２Ａ１抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのラット破骨細胞形成抑制活性は＃８Ａ１抗体よりも強いことが示された。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体の設計（２）
ａ）＃３２Ａ１のヒト化バージョンの設計
ａ）−ｉ） ヒト化＃３２Ａ１に対するアミノ酸配列の設計
ヒト化＃３２Ａ１抗体の構築を、ＣＤＲグラフティング（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））として一般的に公知の方法によって行った。ＣＤＲ領域の定義は、ＣＤＲＨ２以外は全てＫａｂａｔの定義（ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ ＯＦ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ ＩＮＴＥＲＥＳＴ ＶＯＬ．Ｉ，ＦＩＦＴＨ ＥＤＴＩＯＮ（１９９１））を用いた。ＣＤＲＨ２については、独自の定義を用いてＣ末端をＫａｂａｔの定義より５残基短縮した。このように定義されたＣＤＲＨ２を含む重鎖配列では、ラット由来のＣＤＲ配列が短縮され、ヒトフレームワーク配列がより多く取り入れられており、ヒトに投与された際に異種抗原としてより一層認識されにくい。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。＃３２Ａ１のフレームワーク領域の配列を、抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔデータベース（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２９，２０５−２０６（２００１））の全てのヒトフレームワークと比較し、結果として、Ｌ鎖はＧＦ４／１．１‘ＣＬがフレームワーク領域についての７１％配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。H鎖はＭ３７ＧＯ３７’ＣＬがフレームワーク領域についての７３％の配列相同性に起因して、アクセプターとして選択された。Ｌ鎖はＧＦ４／１．１‘ＣＬについて、Ｈ鎖はＭ３７ＧＯ３７’ＣＬについてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、＃３２Ａ１についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。
これらの残基の位置は、実施例２２ａ）−ｉ）で構築された＃３２Ａ１の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６，１００２９−１００３３（１９８９））によって与えられる基準によって選択された。選択されたいくつかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化＃３２Ａ１配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
ａ）−ｉｉ） ＃３２Ａ１重鎖のヒト化
ａ）−ｉｉ）−ｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１タイプ重鎖：
配列表の配列番号２８に示される３２Ａ１のアミノ酸番号２３（イソロイシン）、２４（ロイシン）、２６（スレオニン）、３２（リジン）、４３（スレオニン）、６１（グルタミン酸）、８３（グルタミン酸）、８５（ロイシン）、８６（グルタミン酸）、８９（バリン）、９５（アスパラギン酸）、９６（セリン）、９７（グルタミン酸）、９８（セリン）、１００（バリン）、１０４（バリン）、１０５（セリン）、１１４（イソロイシン）、１１８（スレオニン）、１３４（バリン）、１３５（メチオニン）、１４０（ロイシン）をそれぞれロイシン、バリン、セリン、グルタミン、アラニン、グリシン、アラニン、バリン、リジン、フェニルアラニン、アスパラギン、アラニン、リジン、アスパラギン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、バリン、アラニン、スレオニン、ロイシン、セリンに置き換えることを伴い設計されたヒト化３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１タイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号９９に記載されている。配列番号９９のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号９９のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号９８に記載されている。配列番号９８のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号９８のヌクレオチド配列及び配列番号９９のアミノ酸配列は、図５４にも記載されている。
ａ）−ｉｉｉ） ＃３２Ａ１軽鎖のヒト化
ａ）−ｉｉｉ）−ｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５タイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される３２Ａ１のアミノ酸番号２１（アスパラギン酸）、２３（バリン）、２４（ロイシン）、２９−３０の間（欠損残基）、３１（アラニン）、３２（バリン）、３４（ロイシン）、３６（グルタミン）、４０（イソロイシン）、６６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０２（グルタミン）、１０３（アラニン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１１０（フェニルアラニン）、１２２（アラニン）、１２３（グリシン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれグルタミン酸、ロイシン、メチオニン、スレオニン、セリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、ロイシン、アラニン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ロイシン、チロシン、グリシン、グルタミン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５タイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０３に記載されている。配列番号１０３のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１０３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０２に記載されている。配列番号１０２のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１０２のヌクレオチド配列及び配列番号１０３のアミノ酸配列は、図５６にも記載されている。
ａ）−ｉｉｉ）−ｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６タイプ軽鎖：
配列表の配列番号３０に示される３２Ａ１のアミノ酸番号２１（アスパラギン酸）、２３（バリン）、２４（ロイシン）、２９−３０の間（欠損残基）、３１（アラニン）、３２（バリン）、３４（ロイシン）、３６（グルタミン）、４０（イソロイシン）、６６（グルタミン）、９９（アスパラギン）、１００（プロリン）、１０１（バリン）、１０２（グルタミン）、１０３（アラニン）、１０４（アスパラギン酸）、１０６（イソロイシン）、１０８（スレオニン）、１２３（グリシン）、１２７（ロイシン）、１２９（ロイシン）、１３０（アルギニン）、１３２（アラニン）をそれぞれグルタミン酸、ロイシン、メチオニン、スレオニン、セリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、ロイシン、アラニン、セリン、セリン、ロイシン、グルタミン酸、プロリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、バリン、イソロイシン、リジン、スレオニンに置き換えることを伴い設計されたヒト化３２Ａ１軽鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６タイプ軽鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６タイプ軽鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０５に記載されている。配列番号１０５のアミノ酸配列の１乃至２０番目のアミノ残基からなる配列、２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなる配列、１３４乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域に相当する。配列番号１０５のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１０４に記載されている。配列番号１０４のヌクレオチド配列の１乃至６０番目のヌクレオチドからなる配列、６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなる配列、４００乃至７１４番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、軽鎖可変領域配列、軽鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１０４のヌクレオチド配列及び配列番号１０５のアミノ酸配列は、図５７にも記載されている。
ｂ）ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体遺伝子の作製
ｂ）−ｉ） ヒト重鎖発現汎用ベクターｐＥＧ２の構築
配列番号１０６に示すヒトＩｇＧ２シグナル配列及び定常領域のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ断片を合成し（ＭＢＬ社、人工遺伝子合成サービス）、制限酵素ＮｈｅＩ及びＰｍｅＩで消化し、約１１００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、ｐＥＦ１／ＦＣＣＵ−１をＮｈｅＩおよびＰｍｅＩで消化し、約１１００ｂｐのＤＮＡ断片を取り除いて得られる約６２００ｂｐのＤＮＡ断片と結合させることにより、ヒト化抗体（ｈＩｇＧ２型）重鎖発現汎用ベクターｐＥＧ２を構築した。
ｂ）−ｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１重鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号９９のアミノ酸番号１乃至１４０に示される、分泌シグナルと融合したｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１重鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、制限酵素ＢｌｐＩで切り出されるＤＮＡ断片を、ヒト化抗体（ｈＩｇＧ２型）重鎖発現汎用ベクター（ｐＥＧ２）を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に挿入することにより、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＥＧ２／ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１」と命名した。
ｂ）−ｉｉｉ） ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５重鎖発現ベクターの構築
実施例２２、ｂ）−ｉｖ）で設計されたｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈタイプ重鎖のシグナル配列及び定常領域をＩｇＧ２タイプに変更したヒト化３２Ａ１重鎖を「ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５タイプ重鎖」と命名した。
ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５タイプ重鎖のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１０１に記載されている。配列番号１０１のアミノ酸配列の１乃至１９番目のアミノ残基からなる配列、２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる配列、１４１乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域、重鎖定常領域に相当する。配列番号１０１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、配列表の配列番号１００に記載されている。配列番号１００のヌクレオチド配列の１乃至５７番目のヌクレオチドからなる配列、５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなる配列、４２１乃至１３９８番目のヌクレオチドからなる配列が、それぞれシグナル配列、重鎖可変領域配列、重鎖定常領域配列をコードしている。配列番号１００のヌクレオチド配列及び配列番号１０１のアミノ酸配列は、図５５にも記載されている。
実施例２３で作製したｐＥＦ１／ＦＣＣＵ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５Ｈから制限酵素ＢｌｐＩで切り出されるＤＮＡ断片を、ヒト化抗体（ｈＩｇＧ２型）重鎖発現汎用ベクター（ｐＥＧ２）を制限酵素ＢｌｐＩで切断した箇所に挿入することにより、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５重鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「ｐＥＧ２／ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５」と命名した。
ｂ）−ｉｖ）ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５及びｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６タイプ軽鎖発現ベクターの構築
配列表の配列番号１０３のアミノ酸番号１乃至１３３及び配列番号１０５のアミノ酸番号１乃至１３３にそれぞれ示される、分泌シグナルと融合したｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５及びｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６タイプ軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むＤＮＡを合成し（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、実施例２３と同様の方法によって、ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５及びｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６タイプ軽鎖発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターをそれぞれ「ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５」及び「ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６」と命名した。
ｃ）ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体の調製
ｃ）−ｉ）ヒト化抗体の生産
１．２×１０９個の対数増殖期のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を新鮮な１．２ＬのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に播種し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーター内で９０ｒｐｍで一時間振とう培養した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ ＃２４７６５）３．６ｍｇをＯｐｔｉ−Ｐｒｏ ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２０ｍｌに溶解し、次にＰｕｒｅＬｉｎｋ ＨｉＰｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて調製したＨ鎖発現プラスミド（０．４ｍｇ）及びＬ鎖発現プラスミド（０．８ｍｇ）を２０ｍｌのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ ＳＦＭ培地に懸濁した。Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ ＳＦＭ混合液２０ｍｌに、発現プラスミド／Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ ＳＦＭ混合液２０ｍｌを加え穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ Ｃａｐｓｕｌｅ Ｆｉｌｔｅｒ （Ａｄｖａｎｔｅｃ ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過した。
ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５ＬとｐＥＧ２／ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５との組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５」、ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５ＬとｐＥＧ２／ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１との組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５」、ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１５とｐＥＧ２／ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１との組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１５」、ｐＥＦ６ＫＣＬ／ｈ＃３２Ａ１−Ｌ２−１６とｐＥＧ２／ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１との組合せによって取得された＃３２Ａ１のヒト化抗体を「ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６」と命名した。
ｃ）−ｉｉ）ヒト化抗体の精製
上記ｃ）−ｉ）で得られた培養上清を、ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー（４−６℃下）とセラミックヒドロキシルアパタイト（室温下）の２段階工程で精製した。ｒＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィー精製後とセラミックヒドロキシルアパタイト精製後のバッファー置換工程は室温下で実施した。最初に、培養上清１１００−１２００ｍｌを、ＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐカラム：容積１ｍｌ×２連結）にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、ＰＢＳ１５−３０ｍｌでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム：容積５ｍｌ×２連結）で５ｍＭ りん酸ナトリウム／５０ｍＭ ＭＥＳ／２０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ６．５のバッファーへ置換を行った。さらにその置換した抗体溶液を、５ｍＭ ＮａＰｉ／５０ｍＭ ＭＥＳ／２０ｍＭ ＮａＣｌ／ｐＨ６．５のバッファーで平衡化されたセラミックハイドロキシルアパタイトカラム（日本バイオラッド、Ｂｉｏ−Ｓｃａｌｅ ＣＨＴ２−１ Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ Ｃｏｌｕｍｎ：容積２ｍｌ）にアプライした。塩化ナトリウムによる直線的濃度勾配溶出を実施し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を脱塩カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、ＨｉＴｒａｐ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇカラム：容積５ｍｌｘ２連結）でＣＢＳ（１０ｍＭクエン酸緩衝液／１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０）への液置換を行った。最後にＣｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＵＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量３０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，４℃下）にて濃縮し、ＩｇＧ濃度を１．０ｍｇ／ｍｌ以上に調製し精製サンプルとした。各精製サンプルの容量は、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５：２．２ｍｌ，ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５：１．８ｍｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６：６．０ｍｌ、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１５：２．２ｍｌであった。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体のマウス破骨細胞形成試験での生物活性評価
実施例２４及び２８によって取得されたヒト化抗体の示すマウス破骨細胞形成抑制効果を、実施例９に記載の方法を一部改変して評価した。実施例８の方法で調製したマウス骨髄非付着細胞を１０％ ＦＢＳと１０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を含むα−ＭＥＭ培地で１．５×１０５細胞／ｍｌに調製したものを９６穴プレートの各ウェルに２００μｌ播種して、ＣＯ２インキュベーター中で２日間培養した。９６穴プレート中の古い培養液を除去して、ヒトＲＡＮＫＬ（ＲＡＮＫＬ、ぺプロテック社製）を終濃度２０ｎｇ／ｍｌ、Ｍ−ＣＳＦを１０ｎｇ／ｍｌになるように添加した１０％ ＦＢＳ含有ＭＥＭ−α培地１００μｌを添加した。この細胞培養液に、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）及び実施例２４で調製した６種類のヒト化＃３２Ａ１抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６）を３〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度になるように添加して、更に３日間ＣＯ２インキュベーター中で培養した。培養終了後に、形成された破骨細胞の酒石酸耐性酸性フォスファターゼ（ＴＲＡＰ）活性を以下の操作で測定した。９６穴プレートの各ウェルの培養液を吸引除去して、１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１）５０μｌを各ウェルに加え、プレート振とう機で５分間振とうして細胞を可溶化した。これらの各ウェルに基質溶液（５ｍｇ／ｍｌ ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ及び０．４６％ 酒石酸ナトリウムを含有する５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．１））５０μｌを加えて室温で１０分間インキュベートした。インキュベート後に９６穴プレートの各ウェルに１Ｎ水酸化ナトリウム溶液５０μｌを加えて酵素反応を停止した。酵素反応停止後に各ウェルの４０５ｎｍの吸光度を測定してＴＲＡＰ活性の指標にした。結果を図４４及び４５に示した。またこの試験と同じ方法で、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）、実施例１９で調製した＃３２Ａ１抗体のヒトキメラ抗体、及び実施例２８で調製した４種類のヒト化＃３２Ａ１抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１５）についてその生物活性を評価して、その結果を図４６及び４７に示した。活性を評価した１０種類のヒト化＃３２Ａ１抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１５）の全てにおいて、ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）、又は＃３２Ａ１抗体のヒトキメラ抗体とほぼ同等の強い破骨細胞形成抑制活性が認められた。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体添加による正常ヒト破骨前駆細胞の骨吸収活性への影響（コラーゲンコートプレートを用いた評価）
正常ヒト破骨前駆細胞（Ｎｏｒｍａｌ Ｈｕｍａｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｃｅｌｌｓ、三光純薬より購入、カタログ番号２Ｔ−１１０）を、細胞に添付のプロトコールに従い９６−ｗｅｌｌ ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＡ−１５００）に１×１０４細胞／穴となるように播種した。なお培地は、ウシ胎児血清（終濃度１０％）、ヒトＲＡＮＫＬ（終濃度６３．８ｎｇ／ｍｌ）及びヒトＭ−ＣＳＦ（終濃度３３ｎｇ／ｍｌ）等を含むＯＰＧＭ添加因子セット（三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−９５０１）を添加した破骨前駆細胞用基礎培地（ＯＰＢＭ、三光純薬より購入、カタログ番号ＰＴ−８２０１）を用いた。この培養上清中に、実施例６で調製したラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体（＃３２Ａ１抗体）、実施例１９で調製した＃３２Ａ１抗体のヒトキメラ抗体、および実施例２４及び２８で調製した１０種類のヒト化＃３２Ａ１抗体（ｈ＃３２Ａ１−Ｔ１、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ２、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ３、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ４、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｔ６、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１５）を終濃度４、２０、１００、５００ｎｇ／ｍｌとなるように添加して、ＣＯ２インキュベーター中で５日間培養した。培養上清１０μｌを採取し、ＯｓｔｅｏＬｙｓｅ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔに付属のＦｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ Ｒｅａｇｅｎｔを２００μｌ添加して、蛍光プレートリーダー（ＡＲＶＯ ＭＸ、パーキンエルマー社製）を用いて、ユーロピウムによる蛍光測定に適した時間分解蛍光測定（Ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｃｅ ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ：３４０ｎｍ、Ｅｍｉｓｓｉｏｎ：６１５ｎｍ）することにより、培養上清中に放出された遊離蛍光コラーゲン断片量を定量した（図４８及び４９）。その結果、ＲＡＮＫＬ添加により増加した蛍光コラーゲン断片量が、ラット＃３２Ａ１抗体やヒトキメラ＃３２Ａ１抗体添加により濃度依存的に抑制された。同様に、検討した１０種類全てのヒト化＃３２Ａ１抗体によっても、濃度依存的な抑制が認められた。このことから、ヒト破骨細胞の骨吸収活性が、Ｓｉｇｌｅｃ−１５蛋白質と特異的に結合するヒト化＃３２Ａ１抗体により抑制されることが明らかとなった。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体の卵巣摘出ラットを用いた生物学的評価
実施例２４及び２８によって取得されたヒト化抗体の示す、卵巣摘出ラットにおける骨密度減少に対する抑制効果は、実施例１５に記載の方法で評価することが可能である。
ラット抗マウスＳｉｇｌｅｃ−１５モノクローナル抗体＃３２Ａ１のヒト化抗体のＴＮＦα刺激によるマウス破骨細胞形成試験での生物活性評価
実施例２４及び２８によって取得されたヒト化抗体の示すＴＮＦα刺激によるマウス破骨細胞形成抑制効果は、実施例２６に記載の方法で評価することが可能である。
示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）を用いたヒト化抗体の熱安定性測定
ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１５、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６について、熱安定性の測定を行なった。これらのサンプルを０．５ｍｇ／ｍｌの濃度（ＣＢＳ溶液）に調製し、４００μｌずつ試料溶液としてＤＳＣ測定に使用した。ＤＳＣ測定条件は、以下のように設定した。即ち、初期温度は２０℃、最終温度を１００℃とし、昇温速度を６０℃／１時間、フィルター時間１０秒とした。参照液はＣＢＳを使用した。ＤＳＣ測定装置としては、米国ＭｉｃｒｏＣａｌ社製ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ ＤＳＣ Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用した。試料溶液から得られたスキャン曲線からベースライン（試料セルにも参照溶液を充填して得られたスキャン曲線）を差し引いてベースライン補正を行なった。図５０がｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５のサーモグラム、図５１がｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５のサーモグラム、図５２がｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１５のサーモグラム、図５３がｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１６のサーモグラムを示す。それぞれのピークトップ値をＦａｂ領域の熱変性中点Ｔｍとすると、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ５／Ｌ５のＴｍ値が８１．２℃、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ５のＴｍ値が８４．１℃、ｈ＃３２Ａ１−Ｈ１−１／Ｌ２−１５のＴｍ値が８０．０℃、ｈ＃３２Ａ１−１−１／Ｌ２−１６（ＩｇＧ２）のＴｍ値が７７．９℃、であった。
本発明のキメラ又はヒト化抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体は破骨細胞の分化又は骨吸収活性の抑制能を有し、該抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体を含む医薬組成物は骨代謝異常疾患の治療又は予防剤となり得る。
ＦＥＲＭ ＢＰ−１０９９９

Claims (70)

  1. 配列番号２に示されるアミノ酸配列の３９乃至１６５番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドに結合し、破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する抗体又は該抗体の機能性断片。
  2. 重鎖配列が、CDRH1、CDRH2、CDRH3を有する可変領域を含み、前記CDRH1は配列番号４４に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRH2は配列番号４５又は配列番号９７に示されるいずれか一つのアミノ酸配列からなり、前記CDRH3は、配列番号４６に示されるアミノ酸配列からなること；及び
    軽鎖配列がCDRL1、CDRL2、CDRL3を有する可変領域を含み、前記CDRL1は配列番号４７に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL2は配列番号４８に示されるアミノ酸配列からなり、前記CDRL3は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列からなること；
    を特徴とする請求項１に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  3. 配列番号４１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなる重鎖可変領域配列及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３２番目のアミノ酸残基からなる軽鎖可変領域配列を含むことを特徴とする請求項２に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  4. Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’及びＦｖからなる群から選択される、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の抗体の機能性断片。
  5. ｓｃＦｖであることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一つに記載の抗体。
  6. キメラ抗体であることを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  7. 配列番号４１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号４３に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３７番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列からなることを特徴とする請求項６に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  8. ヒト化されていることを特徴とする、請求項１乃至４又は６のいずれか一つに記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  9. 重鎖がヒト免疫グロブリンＧ２重鎖の定常領域を含み、軽鎖がヒト免疫グロブリンκ軽鎖の定常領域を含む、請求項７又は８に記載の抗体。
  10. 破骨細胞の形成及び／又は破骨細胞による骨吸収を抑制する抗体又は該抗体の機能性断片であって、
    （ａ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される重鎖可変領域：
    ａ１） 配列番号５１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ２） 配列番号５３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ３） 配列番号５５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ４） 配列番号５７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ５） 配列番号５９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ６） 配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ７） 配列番号１０１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ａ８） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
    ａ９） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
    ａ１０） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；及び
    （ｂ）以下のアミノ酸配列からなる群から選択される軽鎖可変領域：
    ｂ１） 配列番号６１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ２） 配列番号６３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ３） 配列番号６５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ４） 配列番号６７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ５） 配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ６） 配列番号７１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ７） 配列番号１０３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ８） 配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列；
    ｂ９） ｂ１）乃至ａ８）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９５％の相同性を持つアミノ酸配列；
    ｂ１０） ｂ１）乃至ｂ８）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列と少なくとも９９％の相同性を持つアミノ酸配列；
    ｂ１１） ｂ１）乃至ｂ８）から選択されるいずれか一つのアミノ酸配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列；
    を含むことを特徴とする抗体又は該抗体の機能性断片。
  11. 配列番号５１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  12. 配列番号５３に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  13. 配列番号５５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  14. 配列番号５５に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６７に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  15. 配列番号５７に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  16. 配列番号５９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号７１に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  17. 配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  18. 配列番号１０１に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  19. 配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号１０３に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  20. 配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至１４０番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖配列及び配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２１乃至１３３番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  21. 配列番号５１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６１に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  22. 配列番号５３に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６３に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  23. 配列番号５５に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６５に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  24. 配列番号５５のアミノ酸配列に示される２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６７に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３７番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  25. 配列番号５７に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  26. 配列番号５９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４７０番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号７１に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  27. 配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  28. 配列番号１０１に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号６９に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  29. 配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号１０３に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  30. 配列番号９９に示されるアミノ酸配列の２０乃至４６６番目のアミノ酸残基からなる重鎖配列及び配列番号１０５に示されるアミノ酸配列の２１乃至２３８番目のアミノ酸残基からなる軽鎖配列を含むことを特徴とする請求項１０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片。
  31. 請求項１乃至３０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、医薬組成物。
  32. 骨代謝異常の治療及び／又は予防剤であることを特徴とする、請求項３１に記載の医薬組成物。
  33. 請求項１乃至３０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを含有することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防用医薬組成物。
  34. 骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、癌性高カルシウム血症、多発性骨髄腫や癌の骨転移に伴う骨破壊、巨細胞腫、骨減少症、歯根膜炎による歯の喪失、人工関節周囲の骨融解、慢性骨髄炎における骨破壊、骨ページェット病、腎性骨異栄養症、及び骨形成不全症からなる群から選択される、請求項３２又は３３に記載の医薬組成物。
  35. 骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、請求項３４に記載の医薬組成物。
  36. 骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、請求項３５に記載の医薬組成物。
  37. 骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする請求項３６に記載の医薬組成物。
  38. 請求項１乃至３０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つを投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
  39. 請求項１乃至３０に記載の抗体又は該抗体の機能性断片の少なくともいずれか一つ、並びに、ビスホスホネート、活性型ビタミンＤ３、カルシトニン及びその誘導体、エストラジオール等のホルモン、ＳＥＲＭｓ（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）、イプリフラボン、ビタミンＫ２（メナテトレノン）、カルシウム製剤、ＰＴＨ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）、非ステロイド性抗炎症剤、可溶性ＴＮＦレセプター、抗ＴＮＦα抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＰＴＨｒＰ（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）抗体又は該抗体の機能性断片、ＩＬ−１レセプターアンタゴニスト、抗ＩＬ−６レセプター抗体又は該抗体の機能性断片、抗ＲＡＮＫＬ抗体又は該抗体の機能性断片、及びＯＣＩＦ（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）からなる群から選択される少なくともいずれか一つを同時又は連続して投与することを特徴とする、骨代謝異常の治療及び／又は予防方法。
  40. 骨代謝異常が、骨粗鬆症、関節リウマチに伴う骨破壊、又は癌の骨転移に伴う骨破壊であることを特徴とする、請求項３８又は３９に記載の治療及び／又は予防方法。
  41. 骨代謝異常が、骨粗鬆症であることを特徴とする、請求項４０に記載の治療及び／又は予防方法。
  42. 骨粗鬆症が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、ステロイドや免疫抑制剤等の治療用薬剤の使用による続発性骨粗鬆症、又は関節リウマチに伴う骨粗鬆症であることを特徴とする請求項４１に記載の治療及び／又は予防方法。
  43. 請求項３、７又は１０乃至３０のいずれか一つに記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
  44. 請求項４３に記載のポリヌクレオチドであって、配列番号４０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号４２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
  45. 配列番号４０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列及び配列番号４２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含むことを特徴とする請求項４４に記載のポリヌクレオチド。
  46. 請求項４３に記載のポリヌクレオチドであって、
    （ａ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ａ１） 配列番号５０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ２） 配列番号５２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ３） 配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ４） 配列番号５６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ５） 配列番号５８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ６） 配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ７） 配列番号１００に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ａ８） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ａ９） ａ１）乃至ａ７）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；及び
    （ｂ）以下のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
    ｂ１） 配列番号６０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ２） 配列番号６２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ３） 配列番号６４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ４） 配列番号６６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９６番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ５） 配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ６） 配列番号７０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ７） 配列番号１０２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ８） 配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列；
    ｂ９） ｂ１）乃至ｂ８）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチドが保有するヌクレオチド配列；
    ｂ１０） ｂ１）乃至ｂ８）から選択されるいずれか一つのヌクレオチド配列に１乃至数個のヌクレオチドが置換、欠失又は付加されたヌクレオチド配列；
    を含むことを特徴とするポリヌクレオチド。
  47. 配列番号５０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  48. 配列番号５２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  49. 配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  50. 配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  51. 配列番号５６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  52. 配列番号５８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号７０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  53. 配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  54. 配列番号１００に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  55. 配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号１０２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  56. 配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至４２０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至３９９番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  57. 配列番号５０に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  58. 配列番号５２に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  59. 配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  60. 配列番号５４に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６６に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１１番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  61. 配列番号５６に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  62. 配列番号５８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１４１０番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号７０に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  63. 配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  64. 配列番号１００に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号６８に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  65. 配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号１０２に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  66. 配列番号９８に示されるヌクレオチド配列の５８乃至１３９８番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド及び配列番号１０４に示されるヌクレオチド配列の６１乃至７１４番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項４６に記載のポリヌクレオチド。
  67. 請求項４３乃至６６に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含むベクター。
  68. 請求項４３乃至６６に記載のいずれか一つのポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
  69. 請求項６７に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
  70. 請求項６８又は６９に記載の宿主細胞を培養し、培養産物から抗体を精製する工程を含む請求項３、７又は１０乃至３０に記載の抗体の生産方法。
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