CN112159475B - Siglec-15单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Siglec-15单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及Siglec‑15单克隆抗体及其应用。本发明通过细胞融合和杂交瘤技术，获得的人Siglec‑15单克隆抗体能高特异性结合表达人Siglec‑15抗原的细胞，本发明的靶向人Siglec‑15的单克隆抗体制备方法步骤简单，获得的抗人Siglec‑15的单克隆抗体可以很好地检测肿瘤细胞上表达的Siglec‑15蛋白。本发明的靶向人Siglec‑15的单克隆抗体，抗体特异性高，在治疗和/或预防或诊断与Siglec‑15有关的疾病例如肿瘤的应用具有很好前景。

Description

Siglec-15单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于免疫治疗生物医药技术领域，涉及一种靶向人Siglec-15的单克隆抗体，及其制备方法和应用，特别是在治疗和/或预防或诊断与Siglec-15有关的疾病例如肿瘤的应用。
背景技术
众所周知，癌症被认为是死亡的主要原因之一。癌症，也称恶性肿瘤，指机体在各种致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控导致异常增生与分化而形成的新生物。免疫治疗已成为继手术、放疗、化疗等常规治疗之后的第四大癌症治疗方式。免疫治疗因其副作用小、抗肿瘤活性高、适应症广，而被认为是最有前途的治疗方式。免疫系统具有巨大潜力，不仅能特异性破坏肿瘤并且对正常组织没有毒性。同时，免疫系统检测及破坏异常细胞的天然能力可防止癌症的发展。此外，免疫系统的长期记忆可防止癌症复发。
然而，肿瘤细胞有时能够通过降低其表面的肿瘤抗原表达而避免被免疫系统检测及破坏，使得免疫系统对其的检测更为困难。肿瘤细胞会在其表面表达诱导免疫细胞失活的蛋白质，或诱导周围环境中的细胞释放抑制免疫反应并促进肿瘤细胞增殖和存活的物质。因此，具有吸引力的肿瘤免疫治疗靶点的开发与应用对于癌症的治疗至关重要(参见Mario Sznol和Chen Lieping，Clinical Cancer Research(2013))。
Siglec-15最初被鉴定为Siglec基因家族成员之一，具有特征性唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素结构。Siglec-15表达在具有高度免疫抑制性的M2巨噬细胞，可抑制T细胞复制，降低T细胞功能。TCGA数据库分析显示Siglec-15广泛的表达在多种肿瘤包括结肠癌，子宫内膜样癌，甲状腺癌，膀胱癌，肾癌，肺癌和肝癌。研究显示，Siglec-15是一个具有吸引力的肿瘤免疫治疗靶点：第一，Siglec-15在正常组织中的表达有限，Siglec-15敲除后对小鼠的正常生理影响极小，表明Siglec-15不是正常器官和组织生存和生长的必要分子，这是Siglec-15阻断疗法安全性的基础。第二，Siglec-15在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)和肿瘤细胞中上调，但在正常组织中不上调，表明Siglec-15的作用局限于肿瘤微环境(TME)，这为选择性靶向抗体治疗提供了条件。第三，使用Siglec-15缺陷小鼠进行的肿瘤模型研究表明，Siglec-15对肿瘤部位的T细胞反应具有强大的免疫抑制作用，这种作用由TAM相关的Siglec-15介导。在肿瘤中，Siglec-15和PD-L1的表达互不重叠，说明以Siglec-15为靶点，适用于治疗对PD-1/PD-L1疗法无应答的患者。最后，Siglec-15特异性单克隆抗体能够逆转T细胞抑制，促进肿瘤免疫，并在多种肿瘤模型中抑制肿瘤生长(参见Chen Lieping等人，Nature Medicine(2019))。
综上所述，Siglec-15在正常组织中的独特表达谱，以及在多种肿瘤中的异常表达情况使其成为了非常有吸引力的抗癌治疗靶标。开发靶向人Siglec-15的治疗性抗体作为一款全新的免疫药物，治疗应用潜力巨大，意义非凡。因此，开发靶向人Siglec-15的治疗性抗体具有更大的抗癌潜力、更低的毒性，有更大的最佳用药剂量空间。
发明内容
本发明的目的是提供一种人Siglec-15单克隆抗体及其应用。
本发明的另一目的在于提供上述人Siglec-15单克隆抗体的编码基因。
本发明的又一目的在于提供上述人Siglec-15单克隆抗体的制备方法。
本发明的又一目的在于提供一种抗肿瘤制剂。
本发明的又一目的在于提供一种诊断检测制剂。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种人Siglec-15单克隆抗体，该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区、轻链可变区、所述重链的互补决定区和所述轻链的互补决定区，该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区选自如下(1)～(7)中的任意一种：
(1)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
(2)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；
(3)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列；
(4)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列；
(5)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列；
(6)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO.12所示的氨基酸序列；
(7)所述的重链可变区具有如SEQ ID NO.13所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区具有如SEQ ID NO.14所示的氨基酸序列；
上述单克隆抗体的编码基因。该编码基因选自如下(8)～(14)中的任意一种：
(8)含有如SEQ ID NO.15所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO.16所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(9)含有如SEQ ID NO.17所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO.18所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(10)含有如SEQ ID NO.19所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO.20所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(11)含有如SEQ ID NO.21所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO.22所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(12)含有如SEQ ID NO.23所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO.24所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(13)含有如SEQ ID NO.25所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO.26所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；
(14)含有如SEQ ID NO.27所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQ IDNO.28所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；
含有上述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
上述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备人Siglec-15单克隆抗体中的应用。
一种制备人Siglec-15单克隆抗体的方法，将包含上述编码基因的重组表达载体转染感受态细胞，并进行培养得到人Siglec-15单克隆抗体。
本发明技术人员通过以下方法获得了克隆C9，C18，C30，C31，C40，C46，C52的独特V-区域核苷酸/蛋白序列：
1)用重组表达的人Siglec-15胞外区免疫小鼠，获得针对人Siglec-15的免疫反应；
2)取步骤1)中小鼠的脾脏细胞进行融合，并对获得的杂交瘤细胞进行筛选，获得特异性识别人Siglec-15的阳性母克隆；
3)对步骤2)中获得的阳性母克隆进行亚克隆，获得稳定的杂交瘤细胞株；
4)用步骤3)中获得的杂交瘤细胞株进行测序，获得抗体轻链和重链的可变区编码序列。
用步骤4)中获得的可变区编码序列进行重组抗体生产功能性人Siglec-15单克隆抗体。
本发明所述的单克隆抗体能够特异性结合人Siglec-15，并且能够解除Siglec-15的免疫负调节。
上述的功能性人Siglec-15单克隆抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
一种抗肿瘤制剂，其包含上述的功能性人Siglec-15单克隆抗体。
附图说明
图1：免疫之后的鼠血清效价检测
图2：纯化单克隆抗体能够特异性结合人Siglec-15重组蛋白
图3：纯化单克隆抗体能够检测不同肿瘤细胞上人Siglec-15抗原表达
具体实施方式
本发明涉及一种具有功能性的人Siglec-15鼠单克隆抗体，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义相同。除非另有说明，下文描述的实施例的方法和材料均为可以通过市场购买获得的常规产品。本发明所属领域技术员将会理解，下文描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1：人Siglec-15杂交瘤细胞株的获得以及单克隆抗体的制备
1)动物免疫
抗原采用融合至人IgG1 Fc段的人Siglec-15胞外结构域的重组蛋白Siglec-15-Fc。用含50μgSiglec-15-Fc融合蛋白的200μl弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1：1乳液皮下免疫雌性Balb/c和C57bl/6小鼠。随后，每二周腹腔/皮下交替注射含25μg Siglec-15-Fc的弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich)的1：1乳液最多达3次，从而对小鼠进行加强免疫。10只小鼠血清效价在三免之后均达到105以上。骨髓瘤融合前4天，表现出最高抗体滴度(图1)的两只小鼠(251号和260号)接受了25μg Siglec-15-Fc(不含佐剂)的腹腔加强免疫。
2)杂交瘤融合和筛选
提取脾脏并进行均质化以产生单细胞悬液，同时准备骨髓瘤细胞(SP2/0)单细胞悬液。使用电融合将8.9×107个脾细胞与4.1×107个SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合。将融合的细胞重悬于100ml含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶，次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10％FBS培养基中，并用移液管以100μl的体积移至50×96孔板中。将板在37℃下在5.0％CO2中孵育。7天的孵育之后，开始使用下文所述的ELISA结合来测试针对Siglec-15-Fc的抗体的存在情况。
ELISA结合检测方法：间接ELISA用于评估上清液中抗体对于Siglec-15-Fc的结合能力。将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组Siglec-15-Fc或人IgG1在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向每个板加入100μl杂交瘤细胞培养上清液，然后在室温下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Fab-特异性)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液并在避光室温下孵育15分钟。通过加入50μl的1MHCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。
3)杂交瘤亚克隆
使用有限稀释法进行亚克隆。使用血球细胞计数器并在含杂交瘤细胞选择剂胸腺核苷嘧啶，次黄嘌呤和氨基喋呤的DMEM/10％FBS培养基中对细胞进行系列稀释来确定细胞数量，直至细胞密度达到5～15个细胞/ml。对于每个杂交瘤，将200μl的细胞溶液用移液管移至96孔中，密度为1-3个细胞/孔。将培养物在37℃下在5.0％的CO2中培养1周后，对上清液进行上述ELISA结合测试，来评估针对Siglec-15-Fc的抗体的存在情况。
实施例2：杂交瘤测序和抗体的生产及纯化
使用快速ELISA小鼠抗体亚型鉴定试剂盒(Clono typing System-HRP，SouthernBiotech)对单克隆抗体进行亚型鉴定后，使用TRIzol(Ambion)从3×106～5×106个杂交瘤细胞提取总RNA，并利用抗体亚型特异性引物和通用引物(PrimeScriptTM 1stStrand cDNASynthesis Kit，Takara)将其逆转录为cDNA。随后通过RACEPCR扩增鼠免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，并将所得的PCR片段亚克隆至pMD18-T载体系统(Takara)中，并使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获得了克隆C9，C18，C30，C31，C40，C46，C52的重链和轻链蛋白序列。
表1为重链互补区序列信息：
Figure BDA0002717846150000061
表2为轻链互补区序列信息：
Figure BDA0002717846150000071
根据上述的6个单克隆杂交瘤抗体编码基因的可变区序列信息，构建鼠单克隆抗体表达载体(抗体亚型为mIgG2a，P01846.1)，分别合成包含轻链可变区+恒定区与重链可变区+恒定区的DNA片段，将其分别插入pTT5表达载体中，形成表达质粒。
将上述质粒共转染HEK293-6E细胞，并于37℃摇瓶中培养10天后，收取上清用于抗体纯化。纯化之前，将管道和蛋白A柱用0.2M NaOH去热原。将柱用含有0.05M Tris和1.5MNaCl(pH8.0)的缓冲液重新平衡。随后将收获的细胞培养物上清液，使用2×上述缓冲液1：1稀释并过滤除菌。将过滤的上清液和蛋白A柱室温孵育2小时，并用1×上述缓冲液洗涤柱后，使用无菌0.1M柠檬酸钠(pH3.5)洗脱IgG，收集了洗脱液并用九分之一体积的无菌1MTris-HCl(pH9)中和。在无菌条件下，将所述产品缓冲液交换为PBS(pH7.4)以除去任何的洗脱缓冲液并浓缩所述样品。浓缩之后，使用1.43的消光系数Ec(0.1％)通过OD280nm对抗体进行定量。
纯化的抗体通过BioRad电泳系统用10％预制胶通过SDS-PAGE来分析。将所述凝胶用Estain2.0染色并通过比较染色带与Protein Ladder来估计分子大小和纯度。
实施例3：单克隆抗体对人Siglec-15重组蛋白的结合
间接ELISA用于评估纯化抗体对于Siglec-15-Fc的结合能力。将ELISA板(Nunc)用100μl/孔的PBS中0.5μg/ml的重组Siglec-15-Fc或人IgG1在4℃下包被过夜。用PBS-T(0.05％吐温)洗涤板，并将其用200μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭0.5小时。随后弃去封闭液，向首孔加入10μg/ml的纯化抗体100μl，并按照2倍梯度稀释，共计8个测试浓度梯度。然后在室温下孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100μl/孔的缀合辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠IgG(Fab-特异性)37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液并在室温下在黑暗中孵育15分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(Sigma)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。如图2，各克隆的EC50如下：KD075-C9:EC50＝1.97ng/ml；KD075-C18:EC50＝2.30ng/ml；KD075-C30:EC50＝2.27ng/ml；KD075-C31:EC50＝2.40ng/ml；KD075-C40:EC50＝2.41ng/ml；KD075-C46:EC50＝2.29ng/ml；KD075-C52:EC50＝2.25ng/ml。与阳性对照5G12(参考AU2013241002专利)相比，这些测试的克隆均接近或超过到其抗原结合能力。
实施例4：纯化单克隆抗体能够检测不同肿瘤细胞上人Siglec-15抗原表达
收集用于检测的表达Siglec-15的人肾上皮细胞293T，人脑髓母细胞瘤细胞HTB-185、HTB-186、HTB-187，人肺癌细胞A549，人胶质瘤细胞U87、U251，人肝癌细胞SMMC-7721，人乳腺癌细胞MDA-MB-231，人胃癌细胞NUGC-4，人胰腺癌细胞Bxpc3，人淋巴瘤细胞U937和阴性对照细胞，用PBS清洗3次。计数调整细胞密度为2×105cells/100μL，分别取100ul作为对照组和实验组。实验组按1:50稀释比在细胞悬液中加入一抗(KD075-C9)，4℃避光孵育1小时。孵育结束后，实验组用PBS清洗细胞3次，对照组和实验组同时按照说明书中的稀释比添加二抗山羊抗小鼠IgG，4℃孵育1小时。最后用PBS清洗细胞3次，用FACS BD Calibur读取信号。如图3所示：HTB-185和HTB-187细胞上有90％以上Siglec-15抗原表达。
实施例5：单克隆抗体的亲和力测定
以10μl/min流速的HBS-EP缓冲液平衡芯片表面5min，随后以10μl/min的流速注射“NHS+EDC”的1：1混合液7mim来活化芯片，将稀释在10mM醋酸钠缓冲液中的捕获抗体(Goatanti-mouse IgG)以10μl/min流速注射约7min进行耦联，最后以10μl/min的流速注射乙醇胺7min进行表面封闭。以HBS-EP缓冲液作为样品进行三个预循环来平衡芯片使基线稳定，10μl/min流速注射稀释在HBS-EP缓冲液中的抗体0～5min(通过调整捕获时间来控制抗体和抗原结合信号在～100RU)，缓冲液平衡1min。以30μl/min流速注射低浓度抗原0.33nMSiglec-15-Fc 5min，抗原与抗体发生结合，之后30μl/min流速注射缓冲液15min进行解离，100μl/min流速注射50mM HCl共四次，每次10s进行再生，一次循环结束。改变抗原浓度(如1nM Siglec-15-Fc)进行下一个梯度浓度的循环测定直到所有梯度浓度(0.33nM、1nM、3nM、9nM、27nMS iglec-15-Fc)及重复浓度(如9nM Siglec-15-Fc)测定结束。
实验数据经过双扣减(对照通道及零浓度)后，在Biacore T200 evaluationsoftware中进行“1：1Binding”模型的拟合。使用Biacore T200测定抗体针对Siglec-15-Fc重组蛋白的亲和力。如表2所示，Siglec-15抗体克隆的对Siglec-15的亲和力由Biacore测得均达到subnM级至pM级。
表2纯化单克隆抗体的亲和力测定
Figure BDA0002717846150000091
序列表
<110> 南京凯地生物科技有限公司
<120> Siglec-15单克隆抗体及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 120
<212> PRT
<213> KD075-C9 重链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Ser Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Ala Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Asn Asp Tyr Asp Val Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> KD075-C9 轻链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Asp Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 120
<212> PRT
<213> KD075-C18 重链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Pro Met Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Asn Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Ser Asp Tyr Asp Val Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> KD075-C18 轻链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 115
<212> PRT
<213> KD075-C30 重链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 5
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Phe Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 109
<212> PRT
<213> KD075-C30轻链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 6
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Tyr Asn Arg Ser Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 7
<211> 115
<212> PRT
<213> KD075-C31 重链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 7
Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Arg Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Pro Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Phe Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 109
<212> PRT
<213> KD075-C31轻链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 8
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Tyr Asn Arg Ser Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 9
<211> 118
<212> PRT
<213> KD075-C40 重链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 9
Glu Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Ile His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Ser Phe Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Val Tyr Gly Asn Tyr Glu Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 10
<211> 106
<212> PRT
<213> KD075-C40轻链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 10
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ser Ser Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> KD075-C46 重链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 11
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Glu Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Val Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Lys Ile Asn Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Tyr Asp Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> KD075-C46轻链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile Ile
20 25 30
Gly Thr Asn Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Lys Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> KD075-C52 重链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Asp Val Asp Asp Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Asn Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Asn Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Arg His Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Gly Ser Tyr Gly Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 113
<212> PRT
<213> KD075-C52轻链可变区氨基酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Thr Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 15
<211> 360
<212> DNA
<213> KD075-C9重链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 15
caagtaacgc tcaaggaatc aggtccaggg atacttcaat cctcccaaac cttgtccctc 60
gcctgtagct ttagtgggtt tagccttagt acttctggta tgggtgttaa ttggataaga 120
cagcccagtg gaaaaggact ggagtggctc gcgcatattt attgggatga tgacaagcgg 180
tataatccgt cactgaagag caggctcacg atctccaaag acaccagccg caatcaagtc 240
ttccttaaaa ttacgagtgt ggacactgcc gatacagcta catactattg cgccaggggg 300
aacgattatg atgtgggttt cgcttactgg ggccagggga ccctggtgac cgtctcagcc 360
<210> 16
<211> 321
<212> DNA
<213> KD075-C9轻链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 16
gacattgtta tgacacaaag ccataagttt atgtccacga gtgtcggcga ccgagtctcc 60
attacgtgta aggcttctca ggacgtttcc acagccgtcg tgtggtatca acagaaaccc 120
ggacaatccc caaaacttct gatagattct gcgtcctacc gctatactgg ggttccggat 180
cggtttacag gctctgggag cggtacagat ttcacattca caatatcatc tgtgcaggca 240
gaggacctcg ccgtctacta ctgtcagcaa cactacagca cgccacgcac attcggcggc 300
ggtacaaagc tcgagattaa g 321
<210> 17
<211> 360
<212> DNA
<213> KD075-C18 重链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 17
caagtcacac tgaaggaatc agggccagga atccttcaac cgtcccaaac tcttagtctt 60
acgtgcagct tcagtgggtt cagcctctcc acgagtccaa tgggtgtgaa ttggattcgg 120
caacccagtg gcaaaggatt ggagtggctg gcccacatat actgggacga cgacaagcga 180
tataatccta gcttgaagag ccggctgacc atatccaagg ataccagttc caatcaagtt 240
tttctgaaca tcacatcagt agatacagca gatacggcca cttattactg tgcgcggtcc 300
tccgactacg atgtcggttt tgcttattgg ggtcagggaa ctctggtcac agtgagtgcg 360
<210> 18
<211> 321
<212> DNA
<213> KD075-C18 轻链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 18
gacattgtga tgacacagtc acacaaattt atgtctacgt ctgtgggaga ccgagttagt 60
atcacatgca aggcatctca ggatgtatct acggcggttg cgtggtacca acagaagttg 120
gggcagagtc ccaagctgct cattagttct gcgagttacc gctacaccgg cgtgccagat 180
aggttcacag gcagtggtag tggcactgat tttactttta cgatctcatc tgtccaggct 240
gaggatcttg ctgtctacta ttgtcaacaa cactattcaa cacctcgcac gtttggcgga 300
ggcaccaaac tcgaaatcaa g 321
<210> 19
<211> 345
<212> DNA
<213> KD075-C30 重链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 19
gatgtccagt tggtggaaag cggaggaggt cttgtgcaac cgggggggtc tcgaaaactg 60
tcatgtgccg catccgggtt tactttttcc agctttggta tgcactgggt ccggcaggcc 120
cctgagaagg gcctggagtg ggtagcatac atcagtagcg ggtcatctag catttactat 180
gccgacacgg tgaaaggtag attcacgatt agccgagata atccaaagaa caccttgttt 240
ctccaaatga caagcctccg atccgaggat accgcgatgt attattgtgc aaggacattc 300
cctatggact actggggaca gggaacgtcc gtcacggtat catcc 345
<210> 20
<211> 327
<212> DNA
<213> KD075-C30轻链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 20
caagctgtgg ttacacagga atcagctctg accacctccc ctggagagac cgtaacactc 60
acctgtcgga gctctactgg cgcagttacg ataagtaact atgcgaattg ggtccaggaa 120
aagcccgatc atcttttcac tggcctgatc ggtggcacgt acaaccgatc acccggcgtt 180
cccgctagat ttagcggaag cctcataggg gataaagcag cactcacgat cactggcgcc 240
cagacggagg acgaagcgat atacttttgt gccctctggt attctaatca ctgggttttt 300
ggaggcggaa caaagctcac tgtgttg 327
<210> 21
<211> 345
<212> DNA
<213> KD075-C31 重链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 21
gatgtccagt tggtcgaaag cggcggcggc ttggtccagc cagggacctc acgaaaactc 60
tcctgcaccg catcagggtt tacctttagc tcattcggta tgcactgggt gcgacaagcg 120
ccagagaagg ggttggagtg ggtagcctac atcagctctg ggtctagcag catttattat 180
gccgatacag tgaaggggcg gtttacaata agccgcgaca acccaaaaaa cactcttttc 240
ttgcaaatga cttcattgcg gtccgaagac acggctatct actattgtgc caggaccttc 300
ccaatggact actgggggca gggaacgtct gtaacagttt ccagc 345
<210> 22
<211> 327
<212> DNA
<213> KD075-C31轻链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 22
caagctgtgg ttacccaaga aagcgctctg actacttctc cgggagagac cgtgacactt 60
acttgcaggt catccacagg ggcggtcacg atcagtaatt acgcgaactg ggtgcaggaa 120
aaacccgatc acctttttac gggacttatc gggggaacgt acaatcggag tcctggagta 180
cctgcccggt ttagcgggag tcttataggc gataaagcag ctctcactat taccggggct 240
caaaccgagg acgaggcaat ctacttttgc gctctctggt attctaacca ctgggtgttc 300
ggtggtggaa cgaagttgac tgtcctg 327
<210> 23
<211> 354
<212> DNA
<213> KD075-C40 重链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 23
gaagttagac ttcaacaaag cggcccggaa ctcgttaaac ccggagcgag tgtaaagatt 60
agttgtaagg ccagcggtta cacttttacg gactacaaca tccactggat gaaacagagt 120
cacggtaaaa gtctcgaatg gatagggtat atttaccctt ctttcggcgg aacggcgtat 180
aatcaaaagt tcaagagcaa ggcaacgctt accgtcgata actccagctc aaccgcatac 240
atggagttcc gctccctgac gtcagaggac agcgcggttt acttctgtgc agtatatgga 300
aactatgagg ggtttgccta ttggggccag gggaccctgg tcaccgtttc tgct 354
<210> 24
<211> 318
<212> DNA
<213> KD075-C40轻链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 24
gaaaacgtat tgacgcagag tccggcgatt atgagcgcat ccctcggtga gaaagtcacg 60
atgagttgta gagcatctag ctctgtgaac tatatgtact ggtatcaaca gaaatcagac 120
gcttcaccaa aactctggat ttactatact agtaacctgg cacccggtgt cccggccagg 180
ttctctgggt caggctcagg taattcttac tatctgacca tctcttcaat ggaaggtgaa 240
gatgcggcaa catactactg tcagcagttt acatccagtc cttggacgtt cggtggtggg 300
acgaaattgg agataaaa 318
<210> 25
<211> 360
<212> DNA
<213> KD075-C46 重链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 25
gaggtcaagc tcgtcgagag cgaggggggt ctcgtgcagc ctggtagctc catgaagctg 60
tcttgcaccg cgtcaggttt tacgttctct gactactaca tggcgtgggt gaggcaagta 120
ccagaaaagg gtctggaatg ggttgcaaaa ataaattacg atggtagtag cacatattac 180
ctcgacagtc tgaagagccg ctttatcatc agtagagaca acgcaaaaaa tatcctttat 240
ttgcagatgt cttcattgaa atcagaggat actgcgactt actactgcgc gagatcctat 300
gattatgacg ggtactattt cgactactgg ggccaaggga cgacgctcac cgtttctagt 360
<210> 26
<211> 333
<212> DNA
<213> KD075-C46轻链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 26
gacattgtcc tgacgcaaag tcccgcctcc ctcgccatga gcctgggtaa gcgggccaca 60
attagttgtc gagcgagtga gagtgttagt attataggaa ccaatctgat acattggtat 120
caacaaaaac caggccaacc gccaaagctc ctcatatatc acgcgagcaa tctcgagacc 180
ggggtgccag ctcgcttttc aggatctggc agcaggaccg actttacgct gaccatagac 240
ccggttgagg aggacgatgt ggcgatctat tactgtctcc agagccgcaa aattccgtgg 300
acgtttggcg gaggaaccaa actggaaatc aaa 333
<210> 27
<211> 357
<212> DNA
<213> KD075-C52 重链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 27
gaggtgcaac ttgtggaatc cggcggcggt ttggttaagc cggggggatc tctgaaactc 60
tcctgcgcgg caagtggttt tacgttttcc tattacgcga tgagttgggt ccggcaaaca 120
cctgagaaaa gactcgaatg ggttgccact gtctctgacg ttgatgatta cacgtattac 180
ccggacaacg taaagggacg ctttaacatt agccgagaca acgccaagaa taatctctac 240
ctccagatga gacatctgaa atccgaagac actgctatgt attactgtgt acgagatggt 300
tcctacgggt ggtacttcga cgtatggggt acaggtacta cggtaactgt ctctagc 357
<210> 28
<211> 339
<212> DNA
<213> KD075-C52轻链可变区核苷酸序列(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 28
gacatagtaa tgacacagag cccgtcttcc cttacggtta ccgccgggga aaaggttacg 60
atgagttgta aatccagcca gagcctcctc aacagtggaa atcagaagaa ttatcttacg 120
tggtatcagc agaaacctgg gcaaactcct aaattgctga tatactgggc gtccactagg 180
gaaagcggag tgcccgatag gtttacgggt tcaggctctg ggacggactt tacattgacc 240
atttcttccg tacaagcaga agatttggcg gtttattatt gtcagaatga ctactcctac 300
ccgttgacct ttgggactgg cacaaagttg gaattgaaa 339

Claims (8)

1.一种人Siglec-15单克隆抗体，其特征在于：该单克隆抗体的蛋白序列含有重链可变区和轻链可变区；该单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列为如下（1）或（2）：
（1）所述的重链可变区为如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区为如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；
（2）所述的重链可变区为如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，所述的轻链可变区为如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述一种人Siglec-15单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的编码基因，其特征在于该编码基因为如下（8）或（9）：
（8）如SEQ ID NO.15所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQIDNO.16所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列；
（9）如SEQ ID NO.17所示的编码所述单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列，以及如SEQIDNO.18所示的编码所述单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列。
3.一种含有权利要求2所述编码基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
4.一种药物组合物，所述的药物组合物包括权利要求1所述的单克隆抗体和药学上可接受的辅料。
5.一种包含如权利要求1所述的单克隆抗体的检测试剂或试剂盒。
6.根据权利要求1所述的单克隆抗体或权利要求3所述的重组载体、转基因细胞系或重组菌在制备治疗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求5所述的检测试剂或试剂盒在制备检测肿瘤的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述的癌症为髓母细胞瘤、肠癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、脑癌、前列腺癌、淋巴癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、膀胱癌、食道癌、肾癌或乳腺癌。
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