MX2011007342A

MX2011007342A - Anticuerpo anti-lectina similar a inmunoglobulina de union a acido sialico-15.

Info

Publication number: MX2011007342A
Application number: MX2011007342A
Authority: MX
Inventors: Eisuke Tsuda; Yoshiharu Hiruma; Takeshi Takizawa; Makiko Nakayama
Original assignee: Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2009-04-09
Filing date: 2010-04-07
Publication date: 2011-07-21
Also published as: CN106317224B; IL252561A0; JP5653909B2; US9079959B2; AU2010235453B2; BRPI1006134A2; TWI468177B; RU2539790C2; AU2013207589B2; IL252561B; IL213943A0; NZ593550A; ZA201104545B; ES2840923T3; TW201039852A; EP2377932B1; JP2015096510A; EP2377932A1; RU2014147188A3; CN102272306A

Abstract

Se provee una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir el metabolismo anormal de hueso que dirige una proteína codificada por un gen fuertemente expresado en osteoclastos; de manera específica, se prevé una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo que reconoce específicamente Siglec-15 humana y tiene una actividad de inhibir la formación de osteoclastos, y similares.

Description

ANTICUERPO ANTI-LECTINA SIMILAR A INMUNOGLOBULINA DE UNIÓN A ÁCIDO SIÁLICO-15 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una sustancia útil como un agente terapéutico y/o preventivo para metabolismo anormal de hueso, y un método de tratamiento y/o prevención del metabolismo anormal de hueso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se sabe que el hueso es un órgano dinámico que es continuamente remodelado por la formación y resorción repetidas para cambiar su propia morfología y mantener los niveles de calcio en la sangre. El hueso sano mantiene un equilibrio entre la formación de hueso por osteoblastos y resorción de hueso por osteoclastos, y la masa ósea se mantiene constante. Por el contrario, cuando el equilibrio entre la formación de hueso y la resorción de hueso se pierde, ocurre el metabolismo anormal de hueso tal como osteoporosis (WO 07/093042 y Endocrinological Review, (1992) 13, pp. 66-80).

Como factores que regulan el metabolismo de hueso, se han reportado muchas hormonas sistémicas y citocinas locales, y estos factores colaboran unos con otros para formar y mantener el hueso (WO 07/093042 y I Endocrinological Review, (1996) 17, pp. 308-332). Como un cambio en tejido óseo debido a envejecimiento, la ocurrencia de osteoporosis es ampliamente usada, pero el mecanismo de su ocurrencia abarca varios factores tales como una disminución en secreción de hormonas sexuales y una anormalidad en los receptores para las hormonas; variación en expresión de citocina localmente en hueso; expresión de genes de envejecimiento; y falla de diferenciación o disfunción de osteoclastos u osteoblastos, y por lo tanto es difícil considerarlo como un simple fenómeno fisiológico relacionado con la edad. La osteoporosis primaria es dividida en gran medida en osteoporosis postmenopáusica debido a una disminución en secreción de estrógeno y osteoporosis senil debido a envejecimiento, pero el avance de la investigación básica sobre los mecanismos de regulación de la formación de hueso y resorción de hueso es esencial para dilucidar el mecanismo de su ocurrencia y para desarrollar un agente terapéutico para el mismo.

Los osteoclastos son células multinucleadas derivadas de células madre hematopoyéticas, y por la liberación de iones de cloruro e iones de hidrógeno sobre una superficie de hueso a la cual se adhieren los osteoclastos, los osteoclastos acidifican un espacio entre la superficie del hueso y los osteoclastos y también secretan catepsina K que es una proteasa acida o similares (American Journal of Physiology, (1991) 260, C1315-C1324). Esto causa degradación de fosfato de calcio, activación de proteasas ácidas y degradación de proteínas de la matriz ósea, dando por resultado resorción de hueso.

Se ha encontrado que las células precursoras de osteoclastos se diferencian en osteoclastos por estimulación con RANKL (activador de receptor de ligando NF- ?) expresado en la membrana celular de osteoblastos/células estromáticas presentes en la superficie del hüeso (Proceedings de la National Academy of Science de la United States of America, (1998) 95, pp. 3597-3602, y Cell, (1998) 93, pp. 165-176). Se ha revelado que RANKL es una proteína de membrana producida por osteoblastos/células estromáticas, su expresión es regulada por un factor de resorción de hueso, RANKL induce diferenciación de células precursoras de osteoclastos en osteoclastos multinucleados maduros, y similares (Proceedings de la National Academy of Science de la United States of America, (1998) 95, pp. 3597-3602, y Journal of Bone and Mineral Research, (1998) 23, S222). Además, se ha encontrado que ratones knockout desprovistos de RANKL desarrollan una enfermedad similar a osteopetrosís, y por lo tanto, se ha probado que RANKL es un factor inductor de diferenciación de osteoclastos fisiológico (Nature, (1999) 397, pp. 315-323).

Como preparaciones farmacéuticas para tratar enfermedades del metabolismo de hueso o acortamiento de la duración del tratamiento, se usan bisbifosfonatos, vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de los mismos, hormonas tales como estradiol, SERMs (moduladores de receptor : de estrógeno selectivos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), PTH, preparaciones de calcio, y similares. Sin embargo, estos agentes medicinales no siempre son satisfactorios en términos de resultado trerapéutico y se ha j requerido el desarrollo de un agente medicinal con un efecto terapéutico' más potente.

Las membranas celulares de células inmunes son cubiertas con un revestimiento denso de varios glicanos tales como glicanos sialilatados que son reconocidos por varias proteínas de unión a glicano. Las lectinas similares a inmunoglobulina de unión a ácido siálico (de aquí en adelante referidas como "siglecs") son una familia de proteínas de membrana de tipo I que reconocen glicanos sialilatados y se unen a los mismos. Muchas siglecs1 son expresadas en las membranas celulares de células inmunes y reconocen i ácido siálico de manera similar presentes en las membranas celulares de células inmunes y regulan interacción celular o función celular y se considera que están implicadas en respuestas inmunológicas (Nature Reviews Immunology, (2007) 7, pp. 255-266). Sin embargo, también existen muchas moléculas de siglec cuyas funciones fisiológicas no han sido dilucidadas aún.

Siglec-15 (lectina similar a inmunoglobulina de unión a ácido siálico-15) es una molécula que se ha reportado recientemente que pertenece a las Siglecs (véase, por ejemplo, documento que no s patente 10) y es idéntica a una molécula llamada CD33L3 (similar a molécula CD33 3). Esta molécula es altamente conservada evolutivamente de pez a humanos y se ha encontrado que es fuertemente expresada en células dendríticas y/o macrófagos de bazo humano y nodos linfáticos. Además, como resultado de una prueba de unión usando una sonda de ácido siálico, también se ha encontrado que Siglec-15 i humana se une a Neu5Aca2-6GalNAc y que Siglec-15 de ratón se une además a Neu5Aca2-3Gaipi-4Glc, y similares (véase, por ejemplo, Glycobiology, (2007) 17, pp. 838-846). Hasta recientemente, el papel fisiológico de Siglec-15 no había sido revelado, sin embargo, se ha reportado que la expresión de Siglec-15 incrementa con la diferenciación y maduración de osteoclastos, y la diferenciación de osteoclastos es inhibida al disminuir la expresión de Siglec-15 por interferencia de ARN (véase, por ejemplo, WO 07/093042). Además, el efecto de un anticuerpo anti-Siglec-15 sobré la diferenciación de osteoclastos ha sido revelada por primera vez en el documento WO 09/48072 (publicado el 16 de abril de 2009), sin embargo, una secuencia de anticuerpo que se puede administrar a humanos aún no ha sido dilucidada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN i i Problemas que ha de resolver la invención Un objeto de la invención es proveer un gen que , es I específicamente expresado en varias formas de metabolismo anormal, de hueso que se ven en osteoporosis, artritis reumatoide, metástasis de cáncer a hueso o similar, una sustancia que inhibe la diferenciación y maduración, de osteoclastos y la actividad de los mismos, y un agente terapéutico ¡y/o preventivo para el metabolismo anormal de hueso. I i Medios para resolver los problemas Los inventores de la presente estudiaron para dilucidar el mecanismo de diferenciación, maduración y activación de osteoclastos a fin de encontrar una sustancia que tiene un efecto terapéutico y/o preventivo sobre el metabolismo anormal de hueso. Como resultado, los inventores de la presente encontraron que la expresión de gen de Siglec-15 incrementa con la diferenciación y maduración de osteoclastos, y también encontraron que la diferenciación de osteoclastos es inhibida por un anticuerpo que específicamente se une a Siglec-15. Además, los inventores de la presente humanizaron un anticuerpo anti-ratón Siglec-15 de rata obtenido, y por lo tanto completaron la invención.

Es decir, la invención incluye las siguientes invenciones. (1 ) Un anticuerpo que se une a un polipétido que comprende residuos de aminoácidos 39 a 165 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e inhibe la formación de osteoclastos y/o resorción osteoclástica de hueso, o un fragmento funcional del anticuerpo., (2) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (1 ), caracterizado porque: una secuencia de cadena pesada contiene una región variable que tiene CDRH1 , CDRH2 y CDRH3, y el CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44, el CDRH2 comprende i cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 97, y el CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos t representada por SEQ ID NO: 46; y una secuencia de cadena ligera contiene una región variable que tiene CDRL1 , CDRL2, y CDRL3, y el CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 47, el CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48, y el CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 49. (3) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (2), caracterizado porque contiene una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende residuos! de aminoácidos 21 a 132 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 43. (4) El fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con cualquiera de (1) a (3) que se selecciona del grupo que consiste de Fab, F(ab')2, Fab' y Fv. (5) El anticuerpo de conformidad con cualquiera de (1 ) a (3), caracterizado porque es scFv. (6) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo1 de conformidad con cualquiera de (1 ) a (4), caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico. (7) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (6), caracterizado porque comprende una secuencia , de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 237 de iuna secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 43. (8) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con cualquiera de (1) a (4), y (6), caracterizado porque el anticuerpo es humanizado. (9) El anticuerpo de conformidad con (7) o (8), en donde la cadena pesada tiene una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina G2 humana y la cadena ligera tiene una región constante de una cadena ligera de inmunoglobulina ? humana. 1 (10) Un anticuerpo que inhibe la formación de osteoclastos y/o resorción osteoclástica de hueso o un fragmento funcional del anticuerpo, en donde el anticuerpo contiene: (a) una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos: a1) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 ; a2) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 53; i a3) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos, de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55; ¡ a4) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada ' por SEQ ID NO: 57; 1 a5) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por I SEQ ID NO: 59; i a6) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada j por SEQ ID NO: 99; a7) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 101 ; a8) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 95% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de a1) a a7); ¦ a9) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de a1) a a7); y i a10) una secuencia de aminoácidos que incluye una sustitución, I deleción o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en cualquiera de I las secuencias de aminoácidos seleccionadas de a1) a a7); y ? (b) una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos: b1) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por i SEQ ID NO: 61; i b2) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 63; b3) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por i SEQ ID NO: 65; b4) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 132 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 67; b5) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69; b6) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada, por SEQ ID NO: 71; i b7) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 103; ' I b8) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 105; , b9) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 95% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de b1 ) a b8); b10) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de b1 ) a b8)¡ y 1 b11 ) una secuencia de aminoácidos que incluye una sustitución, deleción o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de b1) a b8). ¡ (11) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos' que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia1 de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 61. ¡ (12) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de I cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 53 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 63. (13) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos .21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 65. (14) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo' de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos ; de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 132 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 67. (15) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de i aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69. i (16) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de I aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 59 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia, de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 71. (17) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo^ de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia' de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de I aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por i SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69. (18) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos1 de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 101 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69. (19) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia1 de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos; de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos ¡que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia] de ? aminoácidos representada por SEQ ID NO: 103. (20) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada i que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidosique comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia! de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 105. (21) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 y una secuencia i de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 61. ¡ (22) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de I conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 53 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 63. ' (23) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 65. (24) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 237 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 67. (25) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de ,una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69. (26) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia' de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 59 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 71. (27) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69. (28) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuenciai de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 101 y una secuencia i de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69. (29) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 103. (30) El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con (10), caracterizado porque contiene una secuencia , de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 105. ' (31) Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende por lo menos uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos de conformidad con (1) a (30). ¡ (32) La composición farmacéutica de conformidad con (31), caracterizada por ser un agente terapéutico y/o preventivo para el metabolismo anormal de hueso. (33) Una composición farmacéutica para tratar y/o prevenir el metabolismo anormal de hueso, caracterizado porque comprende por lo menos uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos de conformidad con (1) a (30) y por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de bisbifosfonatos, vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de los mismos, hormonas tales como estradiol, SERMs (moduladores de receptor de estrógeno selectivos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos, receptores de TNF solubles, anticuerpos anti- TNF-a o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anti-PTHrP (proteina relacionada con hormona paratiroidea) anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas de receptor de IL-1 , anticuerpos anti-receptor de IL-1 o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anticuerpos anti-RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos, y OCIF (factor inhibidor de I osteoclastogénesis). (34) La composición farmacéutica de conformidad con (32) o I (33), en donde el metabolismo anormal de hueso se selecciona del grupo que consiste de osteoporosis, artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, hipercalcemia cancerosa, mieloma múltiple o metástasis de cáncer a hueso acompañante de destrucción de hueso, tumor de células gigantes, osteopenia, pérdida de dientes debido a periodontitis, osteólisis alrededor de una articulación prostética, destrucción de hueso en osteomielitis crónica, enfermedad de los huesos de Paget, osteodistrofia renal, y osteogénesis imperfecta. (35) La composición farmacéutica de conformidad con (34), caracterizada porque el metabolismo anormal de hueso es osteoporosis, artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, o metástasis de cáncer a hueso acompañante de destrucción de hueso. (36) La composición farmacéutica de conformidad con (35), caracterizado porque el metabolismo anormal de hueso es osteoporosis. (37) La composición farmacéutica de conformidad con (36), I caracterizado porque la osteoporosis es osteoporosis postmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debido al uso de un agente terapéutico tal como un esferoide o un inmunosupresor, o artritis reumatoide acompañante de osteoporosis. (38) Un método de tratamiento y/o prevención metabolismo anormal de hueso, caracterizado por la administración de por lo menos uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos de conformidad con (1) a (30). (39) Un método de tratamiento y/o prevención metabolismo anormal de hueso, caracterizado por la administración simultánea o sucesiva de por lo menos uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos de conformidad con (1) a (30) y por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de bisbifosfonatos, vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de los mismos, hormonas tales como estradiol, SERMs (moduladores de receptor de estrógeno selectivos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos, receptores de TNF solubles, anti- TNF-a anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anti-PTHrP (proteína relacionada con hormona paratiroidea) anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas de receptor de IL-1 , anticuerpos anti-receptor de IL-1 o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anticuerpos anti-RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos, y OCIF (factor inhibidor de osteoclastogénesis). ¦ i (40) El método de tratamiento y/o prevención de conformidad con (38) o (39), caracterizado porque el metabolismo anormal de hueso es osteoporosis, artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, o metástasis de cáncer a hueso acompañante de destrucción de hueso. (41) El método de tratamiento y/o prevención de conformidad con (40), caracterizado porque el metabolismo anormal de hueso es osteoporosis. (42) El método de tratamiento y/o prevención de conformidad i con (41 ), caracterizado porque la osteoporosis es osteoporosis postmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debido al uso de un agente terapéutico tal como un esteroide o un inmunosupresor, o artritis reumatoide acompañante de osteoporosis. (43) Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de conformidad con cualquiera de (3), (7), y ( 0) a (30). (44) El polinucleótido de conformidad con (43), caracterizado porque contiene una secuencia de nucleótido que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 40 y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 42.

I (45) El polinucleótido de conformidad con (44), caracterizado porque contiene una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 40 y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 71 1 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 42. (46) El polinucleótido de conformidad con (43), caracterizado porque contiene: ' (a) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las siguientes secuencias de nucleótidos: j a1) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 50; a2) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 52; a3) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54; a4) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 56; I a5) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 58; a6) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98; a7) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 100; a8) una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que híbrida a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementarios a cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas i de a1) a a7) bajo condiciones astringentes; y a9) una secuencia de nucleótidos que incluye una sustitución, deleción o adición de uno a varios nucleótidos en cualquiera de 1 las secuencias de nucleótidos seleccionadas de a1) a a7), y (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las siguientes secuencias de nucleótidos: b1 ) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 60; b2) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 62; b3) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 64; b4) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 66; b5) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68; I b6) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 70; b7) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 102; b8) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 104; b9) una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que híbrida a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementarios a cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de b1) a b8) bajo condiciones astringentes; y b10) una secuencia de nucleótidos que incluye una sustitución, deleción o adición de uno a varios nucleótidos en cualquiera de 1 las secuencias de nucleótidos seleccionadas de b1) a b8). ¡ (47) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia : de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de i nucleótidos representada por SEQ ID NO: 50, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 60. (48) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 52, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 62. (49) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia, de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 64. (50) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 66. (51) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado I porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 56, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. (52) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 58, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 70. ' (53) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido ique comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. (54) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 100, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. (55) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 102. (56) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 104. (57) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia ! de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 50, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 60. (58) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 52, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 62. (59) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 64. (60) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 711 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 66. (61) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 56, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 7 4 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. (62) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 58, y un polinucleótido que I I comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 71 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 70. ; (63) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1398 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. (64) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1398 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 100, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. (65) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia ; de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1398 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 102. (66) El polinucleótido de conformidad con (46), caracterizado porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1398 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 104. (67) Un vector, que comprende cualquiera de los polinucleótidos de conformidad con (43) a (66). (68) Una célula hospedera transformada, que comprende cualquiera de los polinucleótidos de conformidad con (43) a (66). (69) Una célula hospedera transformada, que comprende el vector de conformidad con (67). (70) Un método para producir el anticuerpo de conformidad con I cualquiera de (3), (7), y (10) a (30), que comprende cultivar la célula hospedera de conformidad con (68) o (69), y purificar un anticuerpo del producto de cultivo resultante. ! Ventaja de la invención '< De conformidad con la invención, se puede obtener un agente terapéutico y/o preventivo para el metabolismo anormal de hueso cuyo mecanismo de acción es inhibir la diferenciación y maduración de osteoclastos y la actividad de resorción de hueso de los mismos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra los resultados de la evaluación de la pureza de Siglec-15-His de ratón purificada por cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q a través de electroforesis de SDS-poliacrilamida y tinción con plata.

La figura 2 muestra los resultados de la detección de las características de Siglec-15-Hís de ratón purificada por cromatografía en i columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q a través de electroforesis de SDS-poliacrilamida y Western blotting usando un anticuerpo anti-V5-HRP.

La figura 3 muestra los resultados de la evaluación de la pureza de Siglec-15-Fc de ratón purificada por proteína en columna HiTrap Protein A a través de electroforesis de SDS-poliacrilamida y tinción con plata. ' La figura 4 muestra los resultados de la prueba de la unión dé un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata a una placa que tenía Siglec-15-Fc de ratón inmovilizado en el mismo por un método de ELISA. El símbolo (?) denota anticuerpo #1A1 , el símbolo (¦) denota anticuerpo #3A1 , el símbolo (A) denota anticuerpo #8A1 , el símbolo ( x) denota anticuerpo #24A1 , el símbolo (·) denota anticuerpo #32A1 , el símbolo (O) denota anticuerpo #34A1 , el símbolo (+) denota anticuerpo #39A1 , el símboloi (-) denota anticuerpo #40A1 , el símbolo (— ) denota anticuerpo #41 A1 , el símbolo (O) denota anticuerpo #61 A1 , and el símbolo (?) denota control IgG. ! Las figuras 5A-5D muestran los resultados de la prueba del | efecto de la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (#3A1 , #8A1 , o #32A1 ) sobre la diferenciación de osteoclastos (estimulación con RANKL) de células no adherentes de médula ósea de ratón.

I Incidentalmente, la IgG de control de rata en el dibujo es un control negativo común a las figuras 5A-5D y 6A-6D.

Las figuras 6A-6D muestran los resultados de la prueba del efecto de la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (#34A1 , #39A1 o #40A1 ) sobre diferenciación de osteoclastos (estimulación con RANKL) de células no adherentes de médula ósea de ratón.

Incidentalmente, el anticuerpo policlonal anti-ratón Siglec-15 de conejo No. 3 en el dibujo es un control positivo común a las figuras 5A-5D y 6A-6D.

La figura 7 muestra los resultados de la evaluación de la pureza de Siglec-15-His humana purificada por cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q a través de electroforesis de SDS- poliacrilamida y tinción con plata.

La figura 8 muestra los resultados de la evaluación de la pureza de Siglec-15-Fc humana purificada por cromatografía en columna Protein A a través de electroforesis de SDS-poliacrilamida. ! La figura 9 muestra los resultados de la prueba de la unión a un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata a una placa que tenía Siglec-15-Fc humana inmovilizada sobre la misma por un método de ELISA.

El símbolo (?) denota anticuerpo #1A1 , el símbolo (¦) denota anticuerpo I #3A1 , el símbolo (A) denota anticuerpo #8A1 , el símbolo ( x ) denota anticuerpo #24A1 , el símbolo (·) denota anticuerpo #32A1 , el símbolo ¡(O) denota anticuerpo #34A1 , el símbolo (+) denota anticuerpo #39A1 , el símbolo (-) denota anticuerpo #40A1 , el símbolo (— ) denota anticuerpo #41A1 , el símbolo ( ) denota anticuerpo #61 A1 , y el símbolo (?) denota control \gG.

Las figuras 10A-10E muestran fotomicrografías que ilustran, mediante tinción con TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata.

Las figuras 11A-11 E muestran fotomicrografías que ilustran, mediante tinción de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1).

La figura 12 es una gráfica que muestra la inhibición de la actividad de resorción de hueso osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1) (N=6).

La figura 13A es una gráfica que muestra el efecto de incrementar la densidad de minerales de hueso de la espina lumbar cuando un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata se administró a ratas ovariectomizadas durante 4 semanas; y la figura 13B es una gráfica que muestra el efecto de disminuir excreción urinaria de desoxipiridinolina cuando un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata se administró a ratas ovariectomizadas durante 4 semanas.

La figura 14 es una gráfica que muestra que un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 se une al dominio V-set; de Siglec-15 humana por ELISA competitiva.

La figura 15 es una gráfica que muestra que un anticuerpo I #32A1 de rata y un anticuerpo quimérico humano del mismo tiene sustancialmente la misma afinidad para Siglec-15-Fc de ratón por ELISA competitiva.

Las figuras 16A-16B muestran gráficas que ilustran, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1) y un anticuerpo quimérico del mismo (N=3). 1 Las figuras 17A-17E muestran fotomicrografías que ilustran, mediante tinción de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos gigantes a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo quimérico humano de un anticuerpo monoclonal anti¬ ratón Siglec-15 de rata #32A1.

La figura 18 es una vista en la cual se ha confirmado que 6 tipos de anticuerpos anti-ratón Siglet-15 de rata se unen a proteína Siglec-151 de ratón de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo por un I método de ELISA usando una placa que tenía Siglec-15-Fc de ratón inmovilizada en la misma. , La figura 19 es una vista en la cual se ha confirmado que 6 tipos de anticuerpos anti-ratón Siglet-15 de rata se unen a proteina Siglec-15 humana de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo por un método de ELISA usando una placa que tiene Siglec-15-Fc humana inmovilizada en la misma.

Las figuras 20A-20D muestran fotomicrografías que ilustran, mediante tinción de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos de ratón gigantes bajo estimulación con TNFa mediante la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1) o un anticuerpo quimérico del mismo.

Las figuras 21A-21 B muestran gráficas que ilustran, mediante la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos de ratón bajo estimulación con TNFa mediante la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1) o un anticuerpo quimérico del mismo (N=3).

Las figuras 22A-22B muestran gráficas que ilustran, mediante la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos de rata mediante la adición de un anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (#8A1 o anticuerpo #32A1) (N=3).

La figura 23 muestra una secuencia de nucleótidos clonada de una cadena pesada de #32A1 de rata y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 24 muestra una secuencia de nucleótidos clonada una cadena ligera #32A1 de rata y una secuencia de aminoácidos de la misma: La figura 25 muestra una secuencia de nucleótidos de una cadena pesada de anticuerpo quimérico humano #32A1 y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 26 muestra una secuencia de nucleótidos de una cadena ligera de anticuerpo quimérico humano #32A1 y una secuencia de aminoácidos de la misma. ! La figura 27 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T1 H y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 28 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T2H y una secuencia de aminoácidos de la misma. ! La figura 29 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T3H y una secuencia de aminoácidos de la misma. ¡ La figura 30 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1- T5H y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 31 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T6H y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 32 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T1 L y una secuencia de aminoácidos de la misma. ¡ La figura 33 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T2L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 34 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T3L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 35 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1- T4L y una secuencia de aminoácidos de la misma. ' La figura 36 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T5L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 37 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-T6L y una secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 38 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1- T7H, h#32A1-T8H, y h#32A1-T9H. I i La figura 39 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1- T10H, h#32A1-T11 H, y h#32A1-T12H. , La figura 40 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T7L, h#32A1-T8L, h#32A1-T9L, h#32A1-T10L, y h#32A1-T11 L.

La figura 41 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T12L, h#32A1-T13L, h#32A1-T14L, h#32A1-T15L, y b#32A1-T16L La figura 42 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T17L, h#32A1-T18L, h#32A1-T19L, h#32A1-T20L, y h#32A1-T21 L.

La figura 43 muestra secuencias de aminoácidos de h#32A1-T22L, h#32A1 -T23L, h#32A1 -T24L, y h#32A1 -T25L.

Las figuras 44A-44D muestran gráficas que ilustran, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo anti-ratón Siglec-15 de rata humanizado (h#32A1-T1 , h#32A1-T2, o h#32A1-T3). Incidentalmente', el anticuerpo #32A1 de rata en el dibujo es un control positivo común a las figuras 44A-44D y 45A-45D. ¡ Las figuras 45A-45D muestran gráficas que ¡lustran, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastoó de ratón mediante la adición de un anticuerpo anti-ratón Siglec-15 de rata i humanizado (h#32A1-T4, h#32A1-T5, o h#32A1-T6).

Las figuras 46A-46D muestran gráficas que ilustran, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo anti-ratón Siglec-15 de rata humanizado (h#32A1-H1-1/L5 o h#32A1-H5/L5). Incidentalmente, el anticuerpo #32A1 de rata y anticuerpo qumérico humano #32A1 en el dibujo son controles positivos comunes a las figuras 46A-46D y 47A-47D.

Las figuras 47A-47D muestran gráficas que ilustran, por la actividad enzimática de TRAP, la inhibición de formación de osteoclastos de ratón mediante la adición de un anticuerpo anth-ratón Siglec-15 de rata humanizado (h#32A1-H1-1/L2-16 o h#32A1-H-1/L2-15).

Las figuras 48A-48D muestran gráficas que ilustran la inhibición de la actividad de resorción de hueso osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo anti-ratón Siglec-15 de rata humanizado (h#32A1-T1 , h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5, o h#32A1 -T6).

Incidentalmente, el anticuerpo #32A1 de rata y el anticuerpo qumérico humano #32A1 en el dibujo son controles positivos comunes a las figuras 48A-48D y 49A-49B.

Las figuras 49A-49B muestran gráficas que ilustran la inhibición de la actividad de resorción de hueso osteoclastos humanos normales mediante la adición de un anticuerpo anti-ratón Siglec-15 de rata humanizado (h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16, o h#32A1-H1 -1/L2-5). i La figura 50 es un termograma obtenido para determinar la i i í estabilidad térmica del anticuerpo h#32A1-H5/L5.

La figura 51 es un termograma obtenido para determinar la estabilidad térmica del anticuerpo h#32A1-H1-1/L5.

La figura 52 es un termograma obtenido para determinar la estabilidad térmica del anticuerpo h#32A1-H1-1/L2-15.

La figura 53 es un termograma obtenido para determinar la estabilidad térmica del anticuerpo h#32A1-H1-1/L2-16. ¡ La figura 54 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-H1-1 y la secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 55 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1- H5 y la secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 56 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-L2-15 y la secuencia de aminoácidos de la misma.

La figura 57 muestra una secuencia de nucleótidos de h#32A1-L2-16 y la secuencia de aminoácidos de la misma.

Modo para llevar a cabo la invención El término "gen", como se usa aquí, incluye no sólo ADN, sino también ARNm, ADNc y ARNc.

El término "polinucleótido", como se usa aquí, se usa con el mismo significado que un "ácido nucleico" y también incluye ADN, ARN, sondas, oligonucleótidos y iniciadores. ! Los términos "polipéptido" y "proteína", como se usa aquí,1 se usan sin distinción.

El término "fracción de ARN", como se usa aquí, se refiere a una fracción que contiene ARN.

El término "célula", como se usa aquí, también incluye células en un animal individual y células cultivadas. I El término "Siglec-15", como se usa aquí, se usa con el mismo significado que "proteína Siglec-15". ¡ El término "formación de osteoclastos", como se usa aquí, se usa con el mismo significado que "diferenciación de osteoclastos" o "maduración de osteoclastos".

El término "fragmento funcional de un anticuerpo", como se! usa aquí, se refiere a un fragmento parcial de un anticuerpo que tiene una actividad de unión a antígeno e incluye Fab, F(ab')2, Fv, scFv, diacuerpos, anticuerpos lineales, anticuerpos poliespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo, y similares. El término también abarca Fab' qu es un fragmento monovalente en una región variable de un anticuerpo obtenido mediante tratamiento de F(ab')2 bajo condiciones reductoras. Sin embargo, el término no se limita a estas moléculas siempre que el fragmento tenga una afinidad de unión para un antígeno. Además, estos fragmentos funcionales incluyen no sólo un fragmento obtenido por tratamiento de una molécula de longitud completa de una proteína de anticuerpo con una enzima apropiada, pero también una proteina producida en una célula hospedera apropiada ? usando un gen de anticuerpo genéticamente modificado.

El término "epitope", como se usa aquí, se refiere a un péptido parcial o una estructura terciaria parcial de Siglec-15 a la cual se une un anticuerpo anti-Siglec-15 específico. El epitope antes mencionado que es un péptido parcial de Siglec-15 se puede determinar por un método bien conocido por los expertos en la técnica tales como un inmunoensayo. ' Sin embargo, por ejemplo, se puede utilizar el siguiente método. Se producen varias estructuras parciales de Siglec-15. En la producción de las estructuras parciales, se puede usar una técnica de síntesis de oligopéptidos conocida.

Por ejemplo, una serie de polipéptidos que han reducido apropiadamente longitudes obtenidas por acortamiento secuencial de Siglec-15 del C-terminal o N-terminal son producidas usando una técnica de recombinación genética conocida por los expertos en la técnica. Por lo tanto, la reactividad de un anticuerpo contra estos polipéptidos es examinada y un sitio de reconocimiento es determinado aproximadamente. Después, péptidos que tienen longitudes más cortas son sintetizados y la reactividad con eétos péptidos es examinada, por lo que se puede determinar el epitope. Además, el epitope que es una estructura terciaria parcial de Siglec-15 que se une á un anticuerpo para Siglec-15 especifico se puede determinar al especificar los residuos de aminoácidos de Siglec-15 adyacentes al anticuerpo por un análisis de ratyos X. Si un segundo anticuerpo anti-Siglec-15 se une a un péptido parcial o una estructura terciaria parcial a la cual se une un primer anticuerpo anti-Siglec-15, se puede determinar que el primer anticuerpo y el i segundo anticuerpo comparten el mismo epitope. Además, al confirmar que el I segundo anticuerpo anti-Siglec-15 compite con el primer anticuerpo anti- Siglec-15 por la unión a Siglec-15 (es decir, el segundo anticuerpo inhibe la unión entre Siglec-15 y el primer anticuerpo), se puede determinar qúe el i primer anticuerpo y el segundo anticuerpo comparten el mismo epitope aun cuando la secuencia o estructura de un epitope específico no ha sido determinada. Además, cuando el primer anticuerpo y el segundo anticuprpo se unen al mismo epitope y también el primer anticuerpo tiene un efecto especial tal como una actividad neutralizante de antígeno, el segundo anticuerpo se puede esperar que tenga la misma actividad. ¡ Se sabe que cada cadena pesada y ligera de una molécula de anticuerpo tiene tres regiones determinantes de complementariedad (CDRs).

La región determinante de complementariedad también se denomina el dominio hipervariable, y está presente en una región variable de cada cadena pesada y ligera de un anticuerpo. Es un sitio que tiene variabilidad inusualmente alta en su estructura primaria, y hay tres CDRs separadas en la estructura primaria de cada cadena de polípéptido pesada y ligera. En esta descripción, en cuanto a las regiones determinantes de complementariedad de un anticuerpo, las regiones determinantes de complementariedad de la cadena pesada están representadas por CDRH1 , CDRH2 y CDRH3 del lado amino-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada, y las i regiones determinantes de complementariedad de la cadena ligera están representadas por CDRL1 , CDRL2 y CDRL3 del lado amino-terminal de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera. Estos sitios son próximos unos a otros en la estructura terciaria y determinan la especificidad para; un antigeno al cual se une el anticuerpo.

La frase "hibridación se realiza bajo condiciones astringentes", como se usa aquí, se refiere a hibridación que se realiza bajo condiciones I bajo las cuales la identificación se puede lograr al realizar hibridación a 68°C en una solución de hibridación comercialmente disponible, ExpressHyb Hibridization Solution (fabricada por Clontech, Inc.) o al realizar hibridación a 68°C en presencia de 0.7 a 1.0 M de NaCI usando un filtro que tiene ÁDN inmovilizado en la misma, seguido por realizar el lavado a 68°C usando 0.1 a 2 x SSC de solución (1 x SSC de solución está compuesta de 150 mM de NaCI y 15 mM de citrato de sodio) o bajo condiciones equivalentes a la misma. 1. Siglec-15 Los inventores de la presente han encontrado que el gen de Siglec-15 es específicamente expresado en tumores de células gigantes y también han encontrado que el nivel de expresión del gen de Siglec-15 incrementa cuando una linea de células derivadas de monocitos se diferencia en osteoclastos.

En cuanto a Siglec-15 que ha de ser usado en la invención, Siglec-15 es directamente purificado a partir de monocitos o células de médula ósea de un humano, mamífero no humano (tal como cobayo, rata, ratón, conejo, cerdo, oveja, ganado vacuno o mono) o pollo y se usa, o una fracción de membrana celular de las células antes mencionadas se prepara y se puede usar. Además, Siglec-15 se puede obtener por síntesis in vitro de la misma o producción de la misma en una célula hospedera a través de i ingeniería genética. En la producción por ingeniería genética, específicamente, el ADNc de Siglec-15 es integrado en un vector capaz de expresar ADNc de Siglec-15, y Siglec-15 es sintetizada en una solución que contiene una enzima, un sustrato, y una sustancia de energía requerida para transcripción y traducción, u otra célula hospedera procariótica o eucariótica es transformada para expresar Siglec-15, por lo que se puede obtener la proteína.

La secuencia de nucleótidos de ADNc de Siglec-15 humana ha sido registrada en GenBank con un número de acceso de NM_213602 y está representada por SEQ ID NO: 1 en el listado de secuencias, y su secuencia de aminoácidos está representada por SEQ ID NO: 2 en el listado! de secuencias. La secuencia de nucleótidos de ADNc de Siglec-15 de ratón ha sido registrada en GenBank con un número de acceso de XM 884636 y está representada por SEQ ID NO: 3 en el listado de secuencias, y su secuencia de aminoácidos está representada por SEQ ID NO: 4 en el listado de secuencias. La Siglec-15 humana madura de la cual ha sido removida la secuencia de señal corresponde a una secuencia de aminoácidos ,que comprende residuos de aminoácidos 21 a 328 de la secuencia de i aminoácidos representada by SEQ ID NO: 2. Además, Siglec-15 de ratón de la cual ha sido removida la secuencia de señal corresponde a una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 341 de la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 4. Incidentalmente, Siglec-15 algunas veces se denomina 3 similar a antigeno CD33, 3 similar a molécula de CD33, 3 simlar a CD33, o CD33L3, y todos estos representan la misma molécula. ¡ El ADNc de Siglec-15 se puede obtener, por ejemplo, por un denominado método de PCR en el cual una reacción en cadena de polimerasa (de aquí en adelante referida como "PCR") se realiza usando una genoteca de ADNc que expresa ADNc de Siglec-15 como una plantilla y iniciadores que específicamente amplifica ADNc de Siglec-15 (Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49).

Además, un polinucleótido que híbrida a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementarios a por lo menos una secuencia de nucleótidos seleccionada de las secuencias de nucleótidos representadas por SEQ ID NOS: 1 y 3 en el listado de secuencias bajo condiciones astringentes y codifica una proteína que tiene una actividad biológica comparable con la de Siglec-15 es también considerada como ADNc de Siglec-15. Además, un polinucleótido que es una variante de empalme transcrita del locus de Siglec-15 de humano o ratón o un polinucleótido que híbrida a una secuencia complementaria al mismo bajo condiciones astringentes y codifica una proteína que tiene una actividad biológica comparable con la de Siglec-15 es también considerada como ADNc de Siglec-15.

Además, una proteina que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye substitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en por lo menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de i las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 2 y 4 en el listado de secuencias o una secuencia de aminoácidos obtenida al remover la secuencia de señal de cualquiera de estas secuencias y tiene una actividad biológica comparable con la de Siglec-15 es también considerada como Siglec-15. Además, una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una variante de empalme transcrita del locus de Siglec-15 de humano o ratón o una secuencia de aminoácidos que incluye una substitución, deleción o adición de uno o varios aminoácidos en la misma y tiene una actividad biológica comparable con la de Siglec-15 es también considerada como Siglec-15. ' i 2. Detección del metabolismo anormal de hueso ¡ Un análisis del nivel de expresión del gen de Siglec-15 en un grupo de muestras de prueba de varios tejidos óseos humanos mostró que el nivel de expresión del gene significativamente incrementa en tumor de células gigantes (GCT) que es un tumor de hueso con un gran número de células gigantes multinucleadas similares a osteoclastos que se producen y se caracteriza por hallazgos clínicos de destrucción osteolitica de hueso (Bullough et al., Atlas of Orthopedic Pathology 2a. edición, pp. 17.6-17.8, i Lippincott Williams & Wilkins Publishers (1992)).

También se encontró que el nivel de expresión del gen de Siglec-15 incrementa cuando una línea de células derivadas de monocitos es diferenciada en osteoclastos.

Por consiguiente, se considera que Siglec-15 está asociada con patologías humanas tales como GCT en las cuales la resorción de hueso es incrementada. En otras palabras, la medición del nivel de expresión del gen de Siglec-15 y/o Siglec-15 en cada célula y/o cada tejido permite la determinación del estado de metabolismo anormal de hueso acompañado por la sobreexpresión de Siglec-15. El metabolismo anormal de hueso como se usa aquí se refiere a un trastorno caracterizado por pérdida neta de hueso, y ejemplos específicos del mismo incluyen, pero no se limitan a, osteoporosis (osteoporosis postmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debido al uso de un agente terapéutico tales como un esferoide o un inmunosupresor, o artritis reumatoide acompañante de osteoporosis), artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, hipercalcemia cancerosa, mieloma múltiple acompañante de destrucción de hueso o metástasis de cáncer a hueso, tumor de células gigantes, osteopenia, pérdida de dientes debido a periodontitis, osteólisis alrededor de una articulación prostética, destrucción de hueso en osteomielitis crónica, enfermedad de los huesos de Paget, osteodistrofia renal y osteogénesis imperfecta.

En la invención, la "muestra de prueba" que ha de ser usada para examinar el nivel de expresión del gen de Siglec-15 y/o Siglec-15 se refiere a una muestra de un tejido de médula ósea, hueso, próstata, testícülos, pene, vejiga, riñon, cavidad oral, faringe, labios, lengua, encías, nasofaringe, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso, colon, hígado, vesícula biliar, páncreas, nariz, pulmón, tejido blando, piel, mama, útero, ovario, cerebro, tiroides, nodo linfático, músculo, tejido graso o similar, o sangre, un fluido corporal, una excreción, o similar obtenido de un sujeto de prueba, un espécimen clínico, etc., sin embargo, en la invención, la sangre o médula ósea es más preferida.

En cuanto a RANKL que se sabe que está asociado con diferenciación de osteoclastos, se ha producido un ratón knockout, y sé ha i analizado el fenotipo cuando se ha perdido la función de RANKL (Young-Yun Kong, et. al., Nature (1999) 397, pp. 315-323). Al producir un ratón knockout desprovisto de Siglec-15 de la misma manera que antes, se puede analizar el fenotipo cuando se ha perdido la función de Siglec-15. 3. Producción de anticuerpo anti-Siqlec-15 El anticuerpo de la invención, que es contra Siglec- 5, se puede obtener inmunizando a un animal con Siglec-15 o un polipéptido arbitrario seleccionado de la secuencia de aminoácidos de Siglec-15, y recolectando y purificando el anticuerpo producido in vivo de conformidad con un procedimiento común. La especie biológica de Siglec-15 que se ha de usar como un antígeno no se limita al ser humano, y un animal puede ser inmunizado con Siglec-15 derivado de un animal distinto de los humanos tales como un ratón o una rata. En este caso, al examinar la reactividad cruzada entre un anticuerpo que se une al Siglec-15 heterólogo obtenido y Siglec-15 humano, un anticuerpo aplicable a una enfermedad humana se puede seleccionar. ; Además, un anticuerpo monoclonal se puede obtener fusionando células productoras de anticuerpo que producen un anticuerpo contra Siglec- 15 con células de mieloma para establecer un hibridoma de conformidad con un método conocido (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Anticuerpos, pp. 365-367, Plenum Pr ss, N.Y. (1980)). ! Incidentalmente, Siglec-15 que se ha de usar como un antígéno se puede obtener por ingeniería genética para causar que una célula hospedera produzca el gen de Siglec-15.

I De manera específica, un vector capaz de expresar gen de i Siglec-15 es producido, y el vector resultante es transfectado en una célula hospedera para expresar el gen, y después el Siglec-15 expresado es I purificado. De aquí en adelante, un método para obtener un anticuerpo contra Siglec-15 se describirá de manera especifica. (1 ) Preparación de antigeno I Ejemplos del antígeno que se ha de usar para producir el anticuerpo anti-Siglec-15 incluyen Siglec-15, un polipétido que comprende una secuencia de aminoácidos parcial que contiene por lo menos 6 aminoácidos consecutivos de Siglec-15, y un derivado obtenido al añadir una secuencia i dada de aminoácidos o vehículo para el mismo.

Siglec-15 puede ser purificado directamente de tejidos tumorales o células tumorales humanos y puede ser usado. Además, Siglec- 5 se puede obtener sintetizándolo in vitro o haciendo que una célula hospedera lo produzca mediante ingeniería genética. ¡ Con respecto a la ingeniería genética, específicamente, el ADNc de Siglec-15 es integrado a un vector capaz de expresar ADNc de Siglec-15 y el Siglec-15 es sintetizado en una solución que contiene una enzima, un sustrato, y una sustancia de energía requerida para transcripción y traducción, u otra célula hospedera procariótica o eucariótica es transformada para expresar Siglec-15, por lo que se puede obtener el antigeno. ; Además, el antígeno también se puede obtener como una proteína secretora al expresar una proteina de fusión obtenida ligando el dominio extracelular de Siglec-15, que es una proteína de membrana, a la región constante de un anticuerpo en un sistema hospedero-vector apropiado.

El ADNc de Siglec-15 se puede obtener, por ejemplo, por un denominado método de PCR en el cual una reacción en cadena de polimerasa (de aquí en adelante referida como "PCR") se realiza usando una j genoteca de ADNc que expresa ADNc de Siglec-15 como una plantilla y iniciadores que específicamente amplifican ADNc de Siglec-15 (véase Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489). :' Como la síntesis in vitro del polipéptido, por ejemplo, Rapid Translation System (RTS) fabricado por Roche Diagnostics, Inc. Se puede ejemplificar, pero no se limita al mismo. , Ejemplos del hospedero procariótico incluyen Escherichia coli y Bacillus subtilis. Para transformar la célula hospedera con un gen objetivo, la célula hospedera es transformada usando un vector de plásmido que contiene un replicón, es decir, un origen de replicación derivado de una especie compatible con el hospedero, y una secuencia reguladora. Además, el vector preferiblemente tiene una secuencia capaz de imponer selectividad fenotipica sobre la célula transformada.

Ejemplos de la célula hospedera eucariótica include células de vertebrados, células de insectos y células de levadura. Como las células e vertebrados, por ejemplo, cepas deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981 ) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), los fibroblastos de murino NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), y células de ovario de hámster chino (CHO células; ATCC: CCL-61); y similares a menudo se usan, sin embargo, no se limitan a las mismas.

El transformante así obtenido puede ser cultivado de conformidad con un procedimiento común, y cultivando el transformante, un polipéptido objetivo es producido intracelularmente o extracelularmente.

Un medio adecuado que se ha de usar para el cultivo se puede seleccionar de varios medios de cultivo comúnmente usados dependiendo de la célula hospedera utilizada. Si se utiliza Escherichia coli, por ejemplo, un medio LB complementado con un antibiótico tal como ampicilina o IPMG un método para obtener el anticuerpo como se describe más adelante.

La producción de un anticuerpo monoclonal generalmente requiere los siguientes pasos operacionales de: (a) purificar un biopolímero que se ha de usar como un antígeno; (b) preparar células productoras de anticuerpo al inmunizar un animal mediante inyección del antigeno, recolectar la sangre, probar su titulo de anticuerpo para determinar cuando el bazo ha de ser extirpado; (c) preparar células de mieloma (de aquí en adelante referidas como "mieloma"); i I (d) fusionar las células productoras de anticuerpo con el mieloma; ; (e) determinar selectivamente un grupo de hibridomas que producen un anticuerpo objetivo; ' (f) dividir los hibridomas en clones de células individuales I (clonación); (g) opcionalmente, cultivar el hibridoma o criar un animal al que se ha implantado el hibridoma para producir una gran cantidad de un anticuerpo monoclonal; (h) examinar el anticuerpo monoclonal así producido para actividad biológica y especificidad de unión, o probar el mismo para I propiedades como un reactivo marcado; y similares. 1 De aquí en adelante, el método para producir un anticuerpo monoclonal se describirá en detalle siguiendo los pasos anteriores, sin según sea necesario se puede usar.

Una proteina recombinante producida intracelularmente o extracelularmente por el transformante a través de dicho cultivo puede ser separada y purificada por cualquiera de varios métodos de separación conocidos utilizando la propiedad física y química de la proteina.

Ejemplos específicos de los métodos incluyen el tratamiento con un precipitante de proteína común, ultrafiltración, varios tipos de cromatografía de líquidos tales como cromatografía de tamiz molecular (filtración de gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio de iones, y cromatografía de afinidad, diálisis, y una combinación de los mismos.

Además, al unir una etiqueta de seis residuos de histidina a' una proteina recombinante que ha de ser expresada, la proteína puede ser eficientemente purificada con una columna de afinidad de níquel. Alternativamente, al unir una región de Fe de IgG a una proteína recombinante que ha de ser expresada, la proteína puede ser eficientemente purificada con una columna de proteína A.

Al combinar los métodos antes mencionados, una gran cantidad de un polipéptido especifico puede ser fácilmente producido en rendimiento alto y pureza alta. (2) Producción de anticuerpo monoclonal anti-Siqlec-15 Ejemplos del anticuerpo que se une específicamente a Siglec-15 incluyen un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a Siglec-15, y i embargo, el método no se limita a los mismos y, por ejemplo, las células productoras de anticuerpo y mieloma se pueden usar distintas de las células del bazo. (a) Purificación de antigeno ¡ i Como el antígeno, Siglec-15 preparado por el método como se describió antes o un péptido parcial del mismo se puede usar.

Además, una fracción de membrana preparada de células recombinantes que expresan Siglec-15 o las células recombinantes j que expresan Siglec-15 mismas, y también un péptido parcial de la proteína de la invención químicamente sintetizado por un método conocido por los expertos en la técnica también se puede usar como el antígeno. (b) Preparación de células productoras de anticuerpo El antigeno obtenido en el paso (a) se mezcla con un adyuvante tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o sulfato de aluminio potasio y la mezcla resultante se usa como un inmunógeno para inmunizar un animal experimental. Como el animal experimental, cualquier animal usado en un método de producción de hibridoma conocido se puede usar sin ningún problema. De manera específica, por ejemplo, un ratón, una rata, una cabra, i oveja, ganado vacuno, un caballo, o similar se pueden usar. Sin embargo, desde el punto de vista de facilidad de disponibilidad de células de mieloma para ser fusionadas con las células productoras de anticuerpo extraídas, un I i ratón o una rata es preferiblemente usado como el animal que ha de ser inmunizado.

Además, la cepa de ratón o rata que se ha de usar no está i particularmente limitada, y en el caso de un ratón, por ejemplo, se pueden usar varias cepas tales como A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, i C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1 , LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR. WB, y 129, y en el caso de una rata se pueden usar, por ejemplo, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer, y similares.

Estos ratones y ratas están comercialmente disponibles de reproductores/distribudores de animales experimentales, por ejemplo, ¿LEA Japan, Inc. y Charles River Laboratories Japan, Inc.

Entre éstos, en consideración de compatibilidad de fusión con células de mieloma como se describe más adelante, en el caso de un ratón, cepa BALB/c, y en el caso de una rata, cepas Wistar y Low son particularmente preferidas como el animal que ha de ser inmunizado. i Además, en consideración de homología antigénica entre humanos y ratones, también se prefiere usar un ratón que tiene función biológica disminuida para remover autoanticuerpos, es decir, un ratón con una enfermedad autoinmune. ^ La edad del ratón o rata en el tiempo de inmunización es preferiblemente 5 a 12 semanas de edad, muy preferiblemente 6 a 8 seminas de edad.

A fin de inmunizar un animal con Siglec-15 o un recombinante del mismo, por ejemplo, un método conocido descrito en detalle en, por ejemplo, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M., I Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964), o similar se puede usar. ¡ Entre estos métodos de inmunización, un método específico preferido en la invención es, por ejemplo, como sigue. ¡ Es decir, primero, una fracción de proteina de membrana que sirve como el antígeno o células causadas para expresar el antígeno es/son intradérmicamente o intraperitonealmente administrada a un animal.

Sin embargo, la combinación de ambas vías de administración es preferida para incrementar la eficiencia de inmunización, y cuando la administración intradérmica se realiza en la primera mitad y administración intraperitoneal se realiza en la última mitad o sólo en la última dosificación, la eficiencia de inmunización puede ser particularmente incrementada.

El programa de administración del antígeno varía dependiendo del tipo de animal que ha de ser inmunizado, diferencias individuales, o similares. Sin embargo, en general, un programa de administración en el cual la frecuencia de administración del antígeno es 3 a 6 veces y el intervalo de dosificación es 2 a 6 semanas es preferido, y un programa de administración en el cual la frecuencia de administración del antígeno es 3 a 4 veces y el intervalo de dosificación es 2 a 4 semanas es más preferido. i ! Además, la dosis del antígeno varía dependiendo del tipo de animal que ha de ser inmunizado, diferencias individuales, o similar, sin embargo, la dosis generalmente se fija a 0.05 a 5 mg, preferiblemente aproximadamente 0.1 a 0.5 mg.

Una inmunización de refuerzo se realiza 1 a 6 semanas, preferiblemente 2 a 4 semanas, muy preferiblemente 2 a 3 semanas después de la administración del antígeno como se describió antes.

La dosis del antigeno en el tiempo de realizar la inmunización de refuerzo varía dependiendo del tipo o tamaño del animal o similar, sin embargo, en el caso de un ratón, la dosis es generalmente fijada a 0.05 ja 5 mg, preferiblemente 0.1 a 0.5 mg, muy preferiblemente aproximadamente 0.1 a 0.2 mg.

Las células del bazo o línfocitos que incluyen células productoras de anticuerpo son asépticamente removidas del animal inmunizado 1 a 10 días, preferiblemente 2 a 5 días, muy preferiblemente 2 a 3 días después de la inmunización de refuerzo.

En este tiempo, el titulo de anticuerpo se mide, y si un animal que tiene un título de anticuerpo suficientemente incrementado se usa como una fuente de suministro de células productoras de anticuerpo, el procedimiento subsecuente se puede llevar a cabo de manera más eficiente.

Ejemplos del método de medir el titulo de anticuerpo para usarse aquí incluyen un método de RlUn y un método de ELISA, pero el método no está limitado al mismo.

Por ejemplo, si se utiliza un método de ELISA, la medición del título de anticuerpo en la invención se puede llevar a cabo de conformidad! con los procedimientos como se describe más adelante.

Primero, un antigeno purificado o parcialmente purificado es adsorbido sobre la superficie de una fase sólida tal como una placa de 96 I pozos para ELISA, y la superficie de la fase sólida que no tiene antígeno adsorbido a la misma es cubierta con una proteina no relacionada con el antigeno tal como albúmina de suero de bovino (de aquí en adelante referida como "BSA"). Después de lavar la superficie, la superficie se lleva a contacto con una muestra serialmente diluida (por ejemplo, suero de ratón) como un anticuerpo primario para permitir que el anticuerpo en la muestra se una al antígeno. ' Además, como un anticuerpo secundario, un anticuerpo marcado con una enzima contra un anticuerpo de ratón se añade y se deja unir al anticuerpo de ratón. Después del lavado, un sustrato para la enzima se añade y un cambio en absorbancia que ocurre debido a desarrollo de color inducido por degradación del sustrato o similar se mide y el titulo de anticuerpo se calcula con base en la medición.

La separación de células productoras de anticuerpo de las células del bazo o linfocitos se puede llevar a cabo de conformidad con un método conocido (por ejemplo, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 51 1 ; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495).

Por ejemplo, en el caso de células del bazo, un método general en el cual las células productoras de anticuerpo son separadas! a' homogeneizar el bazo para obtener células a través de filtración con una rejilla de acero inoxidable y suspendiendo las células en un medio esencial mínimo de Eagle ( E ) se puede utilizar. (c) Preparación de células de mieloma (de aquí en adelante referida como "mieloma") Las células de mieloma que se han de usar para fusión de células no son particularmente limitadas y células adecuadas se pueden seleccionar de lineas de células conocidas. Sin embargo, en consideración de conveniencia cuando un hibridoma se selecciona de células fusionadas, se prefiere usar una cepa deficiente en HGPRT (hipoxantina-guanina fosforibosilo transferasa) cuyo procedimiento de selección se ha establecido.

Muy específicamente, ejemplos de la cepa deficiente en HGPRT incluyen X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC1 -45.6TG1.7(45.6TG), : F0, S149/5XXO, y BU.1 derivada de ratones; 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3) derivada de ratas; y U266AR(SKO-007), GM1500 GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) y 8226AR/NIP4-1 (NP41 ) derivada de humanos.

Estas cepas deficientes en HGPRT están disponibles de, por ejemplo, el American Type Culture Colleccion (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo; ATCC) o similar.

Estas cepas de células son subcultivadas en un medio apropiado tal como un medio de 8-azaguanina [un medio obtenido al añadir 8- I azaguanina a un medio RPMI-1640 complementado con glutamina, 2-mercaptoetanol, gentamicina y suero de ternera fetal (de aquí en adelante referida como "FCS")]; medio de modificado por Iscove (de aquí en adelante referido como "IMDM"), o medio de Tagle modificado por Dulbecco (de aquí en adelante referido como "DMEM"). En este caso, 3 a 4 días antes de realizar fusión de células, las células son subcultivadas en un medio normal [por ejemplo, un medio ASF104 (fabricado por Ajinomoto Co., Ltd.) ¡que contiene 10% de FCS] para obtener no menos de 2 x 107 células en el día de fusión de células. (d) Fusión de células La fusión entre las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma se puede realizar apropiadamente de conformidad con un método conocido (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientífic Publicaciones, Oxford (1987), Kabat, E. A. y Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.), bajo condiciones tales que la tasa de supervivencia de células no es excesivamente reducida.

Como tal, un método, un método químico en el cual las células productoras de anticuerpo y las células de mieloma se mezclan en una solución que contiene un polímero tal como polietilenglicol a una concentración alta, un método físico que usa estimulación eléctrica, o similar i se puede usar.

Entre estos métodos, un ejemplo específico del método químico es como se describe más adelante.

Es decir, en el caso en donde polietilenglicol se usa en la solución que contiene un polímero a una concentración alta, las células I i productoras de anticuerpo y las células de mieloma se mezclan en una solución de polietilenglicol que tiene un peso molecular de 1500 a 6000, muy preferiblemente 2000 a 4000 a una temperatura de 30 a 40°C, preferiblemente de 35 a 38°C durante 1 a 10 minutos, preferiblemente 5 a 8 minutos. 1 I (e) Selección de un grupo de hibridomas ' El método de seleccionar hibridomas obtenidos por la fusión de células antes mencionada no es particularmente limitado. Usualmente, un método de selección de HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (Kohier et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) se usa.

Este método es efectivo cuando se obtienen hibridomas usando las células de mieloma de una cepa deficiente en HGPRT que no pueden sobrevivir en presencia de aminopterina.

I Es decir, cultivando células no fusionadas e hibridomas en un medio HAT, sólo se deja que hibridomas resistentes a aminoptérina selectivamente sobrevivan y proliferen. (f) División en clon de células individuales (clonación) | Como un método de clonación para hibridomas, un método conocido tal como un método de metilcelulosa, un método de agarosa blanda, o un método de dilución limitante se pueden usar (véase, por ejemplo, Barbara, B. M. y Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)). Entre estos métodos, particularmente, se prefiere un método de dilución limitante.

En este método, una cepa de células de fibroblasto derivadas de un feto de ratón o células alimentadoras tales como células de bazo de ratón normales, células de glándula del timo, o células de ascitos se siembran en una microplaca.

Mientras tanto, los hibridomas se diluyen en un medio para dar una densidad de células de 0.2 a 0.5 células por 0.2 mi. Una alícuota de 0.1 mi de la suspensión de hibridoma diluido se añade a cada pozo y el cultivo se continúa durante aproximadamente 2 semanas mientras se reemplaza aproximadamente 1/3 de la solución de cultivo con medio fresco a intervalos de tiempo predeterminados (por ejemplo, cada 3 días), por lo que los clones del hibridoma puede ser proliferados.

Los hibridomas en pozos para los cuales el título de anticuerpo ha sido confirmado son sometidos a, por ejemplo, clonación por el método de dilución limitante repetidamente 2 a 4 veces. Un hibridoma que ha sido confirmado para tener un título de anticuerpo estable se selecciona comojuna cepa de hibridoma productora de anticuerpo monoclonal anti-Siglec-15.

Ejemplos de la cepa de hibridoma asi clonada incluye hibridoma #32A1 descrita en WO 09/48072. El hibridoma #32A1 se depositó en el International Patent Organism Depositan/ de la National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Depósito Internacional de Organismos de i Patente del Intituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, localizado en Central 6, 1-1 -1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 28 de agosto de 2008, y se ha dado un número de acceso de FÉRM BP-10999 bajo el nombre de Hibridoma #32A1 anti-Siglec-15.

Incidentalmente, en esta descripción, el anticuerpo producido por el hibridbma #32A1 se refiere como "anticuerpo #32A1 " o simplemente "#32A1 ". Además, los anticuerpos obtenidos en los ejemplos de esta descripción distintos del anticuerpo #32A1 también están representados por los nombres de anticuerpo de la misma manera. Un fragmento parcial que contiene la región variable de cadena pesada del anticuerpo #32A1 tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 167 de SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias. Además, un fragmento parcial que contiene la secuencia de región variable de cadena ligera del anticuerpo #32A1 tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 139 de SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias. (q) Preparación de anticuerpo monoclonal cultivando hibridoma Al cultivar el hibridoma así seleccionado, un anticuerpo monoclonal se puede obtener eficientemente. Sin embargo, antes del cultivo, se prefiere realizar determinación selectiva de un hibridoma que producé un anticuerpo monoclonal objetivo.

En esa determinación selectiva, se puede utilizar un método conocido.

La medición del titulo de anticuerpo en la invención se puede llevar a cabo, por ejemplo, por un método de ELISA explicado en el punto (b) descrito anteriormente.

El hibridoma obtenido por el método descrito anteriormente se puede almacenar en un estado congelado en nitrógeno líquido o en un congelador a -80°C o inferior.

Después de completarse la clonación, el medio es cambiado de un medio HT a un medio normal, y el hibridoma es cultivado. ! El cultivo a gran escala se realiza mediante cultivo por rotación usando una botella para cultivo grande o mediante cultivo giratorio.

Del sobrenadante obtenido por el cultivo a gran escala,' un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a la proteína de la invención se puede obtener por purificación usando un método conocido por los expertos en la técnica tal como filtración en gel. ¡ Además, el hibridoma es inyectado en la cavidad abdominal de un ratón de la misma cepa que el hibridoma (por ejemplo, el BALB/c antes mencionado) o un ratón Nu/Nu para proliferar el hibridoma, por lo que se pueden obtener los ascitos que contenían una gran cantidad del anticuerpo monoclonal de la invención.

En el caso en donde el hibridoma es administrado en la cavidad abdominal, si un aceite mineral tal como 2,6,10, 14-tetrametil pentadecano (pristano) es administrado 3 a 7 días antes del mismo, se puede obtener una cantidad más grande de los ascitos.

Por ejemplo, un inmunosupresor es previamente inyectado én la cavidad abdominal de un ratón de la misma pieza que el hibridoma para inactivat las células T. 20 días después, 106 a 107 células de clon de hibridoma se suspenden en un medio libre de suero (0.5 mi), y la suspensión es inyectada en la cavidad abdominal del ratón. En general, cuando el abdomen es expandido y llenado con los ascitos, los ascitos se recolectan del ratón. ! Por este método, el anticuerpo monoclonal se puede obtener a una concentración que es aproximadamente 100 veces o más alta que en la solución de cultivo. ! El anticuerpo monoclonal obtenido por el método antes mencionado puede ser purificado por un método descrito, por ejemplo, en Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publicaciones, Oxford (1978).

Es decir, ejemplos del método incluyen un método de precipitación de sulfato de amonio, filtración en gel, cromatografía de intercambio de iones, y cromatografía de afinidad.

Como un método de purificación simple, también se puede usar un kit de purificación de anticuerpo monoclonal comercialmente disponible (por ejemplo, MAbTrap Gil Kit fabricado por Pharmacia, Inc.) o similar.

El anticuerpo monoclonal así obtenido tiene alta especificidad de antigeno para Siglec-15. (h) Prueba de anticuerpo monoclonal El isotipo y subclase del anticuerpo monoclonal asi obtenido se pueden determinar como sigue. j Primero, ejemplos del método de identificación incluyen; un método de Ouchterlony, un método de ELISA y un método de RlUn.

Un método de Ouchterlony es simple, pero cuando la concentración del anticuerpo monoclonal es baja, se requiere una operación de condensación.

Por otra parte, cuando se usa un método de ELISA o un método de RlUn, al hacer reaccionar directamente el sobrenadante de cultivo con una fase sólida antígeno-adsorbida y usando anticuerpos correspondientes a varios tipos de isotipos y subclases de inmunoglobulina como anticuerpos secundarios, el isotipo y subclase del anticuerpo monoclonal se pueden identificar.

Además, como un método más simple, también se puede usar un kit de identificación comercialmente disponible (por ejemplo, Mouse Typer Kit fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) o similar.

Además, la determinación cuantitativa de una proteina se puede realizar por el método de Folin Lowry y un método de cálculo basado en la absorbancia a 280 nm [1.4 (DO 280) = Inmunoglobulina 1 mg/ml]. (3) Otros anticuerpos El anticuerpo de la invención incluye no sólo el anticuerpo monoclonal antes mencionado contra Siglec-15, sino también un anticuerpo recombinante obtenido por modificación artificial para el propósito de reducir la antigenicidad heteróloga a humanos tales como un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano. Estos anticuerpos se pueden producir usando un método conocido.

Como el anticuerpo quimérico, un anticuerpo en el cual las regiones variable y constante de anticuerpo se derivan de diferentes especies, por ejemplo, un anticuerpo quimérico en el cual una región variable de anticuerpo derivado de ratón o rata es conectada a una región constante derivada de humano puede ser ejemplificada (véase Proc. Nati. Acad. ;Sci. USA, 81 , 6851-6855, (1984)). Como un ejemplo del anticuerpo quimérico derivado de un anticuerpo #32A1 anti-ratón de rata, se puede ejemplificar un I anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 41 en el listado de secuencias y una cadena ligera que tiene una i secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a !237 de SEQ ID NO: 43 en el listado de secuencias.

Como el anticuerpo humanizado, se puede ejemplificar un anticuerpo obtenido al integrar sólo una región determinante ¡ de complementariedad (CDR) en un anticuerpo derivado de humano (véase Nature (1986) 321 , pp. 522-525), y un anticuerpo obtenido al injertar una parte de los residuos de aminoácidos del marco de trabajo asi como la secuencia de CDR a un anticuerpo humano por un método de injerto de CDR (WO 90/07861 ). Como un ejemplo del anticuerpo humanizado de un anticuerpo de rata #32A1 , se puede ejemplificar una combinación arbitraria de una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 51 en el listado de secuencias, residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 53, residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 55, residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 57, residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 59, residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 99, residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 10;1 , o residuos de aminoácidos 1 a 121 de cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 72 a 77 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 61 , residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 63, residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 65, residuos de aminoácidos 21 a 132 de SEQ ID NO: 67, residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 69, residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO:' 71 , residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 103, residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 105, o residuos de aminoácidos 1 a ;1 13 de cualquiera de las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NOS: 78 a 96.

Como una combinación preferida, se puede ejemplificar un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 51 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 61 , un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos! de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 53 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 63, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia1 de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 65, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 132 de SEQ ID NO: 67, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ; ID NO: 57 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de i ¡ aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 71 , un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 101 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 69, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 103, o un anticuerpo que comprende una cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de I aminoácidos 20 a 140 de SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de SEQ ID NO: 105.

Como una combinación más preferida, se puede ejemplificar un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 51 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 61 , un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 53 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 63, un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID I NO: 55 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos, que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 65; un i anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 55 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 237 de SEQ ID NO: 67- un í anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 57 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 69\ un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de SEQ ID NO: 59 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 711 un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que i comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 69; un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO: 101 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 69; un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID j NO: 99 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO: 103, o un anticuerpo que comprende una cadena pesada que tiene una secuencia, de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de SEQ ID NO: 99 y una cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de SEQ ID NO. 105. ¡ Sin embargo, el anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo #32A1 no se limita a los anticuerpos humanizados antes mencionados siempre que el anticuerpo humanizado tenga todos los 6 tipos de secuencias i de CDR de #32A1 y tenga una actividad de inhibir la formación de osteoclastos. Incidentalmente, la región variable de cadena pesada del anticuerpo #32A1 tiene CDRH1 (DYFMN) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44, cualquiera de CDRH2 (QIRNKIYTYATFYAESLEG) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 45 y CDRH2 (QIRNKIYTYATFYA) representada por SEQ ID NO: 97, y CDRH3 (SLTGGDYFDY) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46. La CDRH2 representada por SEQ ID NO: 45 es de conformidad con la definición de Kabat (SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL I, QUINTA EDICIÓN (1991)). La CDRH2 representada por SEQ ID NO: 97 se I hace más corta por cinco residuos en el C-terminal que la definición de Kabat.

En la secuencia de cadena pesada que contiene esta CDRH2, la secuencia de CDR derivada de una rata se hace más corta y más de una secuencia de marco de trabajo humana es incorporada, y por lo tanto, cuando se administra a humanos, es mucho menos probable que sea reconocida como un antigeno heterólogo. Además, la región variable de cadena ligera del anticuerpo #32A1 tiene CDRL1 (RASQSVTISGYSFIH) que comprende una secuencia' de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 47, CDRL2 (RASNLAS) que comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48, y CDRL3 (QQSRKSPWT) que comprende una secuencia de aminoácidos i representada por SEQ ID NO: 49. : Además, el anticuerpo de la invención incluye un anticuerpo humano. Un anticuerpo anti-Siglec-15 humano se refiere a un anticuerpo humano que tiene sólo una secuencia de gen de un anticuerpo derivado de un cromosoma humano. El anticuerpo anti-Siglec-15 humano se puede obtener por un método que usa un ratón productor de anticuerpo humano que tiene un fragmento de cromosoma humano que contiene genes de cadena pesada y ligera de un anticuerpo humano (véase Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucí. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and lijima, S. ecls.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Nati. Acad. Sci.

USA (2000) 97, pp. 722-727, etc.). j Dicho ratón productor de anticuerpo humano se puede crear específicamente como sigue. Un animal genéticamente modificado en el cual loci de genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena han sido alterados, y en su lugar, se han introducido loci de genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana mediante un vector de cromosoma artificial de levadura (YAC) o similar es creado al producir; un animal knockout y un animal transgénico y apareando estos animales.

Además, de conformidad con una técnica de ingeniería genética, usando ADNcs que codifican la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo humano, respectivamente, y preferiblemente un vector ¡que contiene los ADNcs, células eucarióticas son transformadas, y un transformante que produce un anticuerpo monoclonal humano recombinánte es cultivado, por lo que el anticuerpo también se puede obtener del sobrenadante de cultivo. ; Aquí, como el hospedero, por ejemplo, se pueden usar células eucarióticas, preferiblemente células de mamífero tales como células CHO, linfocitos o células de mieloma.

Además, también se conoce un método para obtener' un anticuerpo humano derivado de despliegue de fagos determinado selectivamente de una genoteca de anticuerpo humano (véase Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Opthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431 , etc.).

Por ejemplo, se puede usar un método de despliegue de fagos en el cual una región variable de un anticuerpo humano es expresada sobre la superficie de un fago como un anticuerpo de cadena sencilla (scFv), y un fago que se une a un antígeno se selecciona (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1 105-1 116).

Al analizar el gen del fago seleccionado basado en la unión a un antigeno, se puede determinar una secuencia de ADN que codifica la región variable de un anticuerpo humano que se une a un antígeno. j Si la secuencia de ADN de scFv que se une a un antígeno se determina, un anticuerpo humano se puede obtener al preparar un vector de expresión que tiene la secuencia e introducir el vector en un hospedero apropiado a expresarlo (WO 92/01047, WO 92/20791 , WO 93/06213, WO 93/1 1236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, pp. 433-455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1 105-1 1 16).

Los anticuerpos obtenidos por el método anterior son evaluados para la propiedad de unión a un antígeno por el método descrito en el ejemplo 25 o similar, y un anticuerpo preferido se puede seleccionar. Como un ejelnplo de otro índice cuando se comparan las propiedades de anticuerpos, la estabilidad de anticuerpos se puede ejemplificar. La calorimetría de escudriñamiento diferencial (DSC) mostrada en el ejemplo 33 es un instrumento capaz de medir rápido y de manera precisa una temperatura de punto medio de desnaturalización térmica (Tm) que es un índice favorabje de estabilidad estructural relativa de las proteínas. Al medir los valores de Tm usando DSC y al comparar los valores, una diferencia en estabilidad térmica se puede comparar. Se sabe que la estabilidad al almacenamiento de los ! anticuerpos muestra alguna correlación con la estabilidad térmica de los anticuerpos (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), y un anticuerpo preferido se puede seleccionar al usar estabilidad térmica como un índice. Ejemplos de otros índices para seleccionar anticuerpos incluyen lo siguiente: el rendimiento en una célula hospedera apropiada es alto y la capacidad de agregación en una solución acuosa es baja. Por ejemplo, un anticuerpo que muestra el rendimiento más alto no siempre muestra estabilidad térmica alta, y por lo tanto, es necesario seleccionar un anticuerpo más adecuado para administrar a humanos al hacer una evaluación completa basada en los índices antes mencionados.

Además, un método en el cual las secuencias de cadena pesada y ligera de longitud completa de un anticuerpo son ligadas usando un enlazador apropiado, por el que se obtiene una inmunoglobulina de cadena sencilla también es conocido (Lee, H-S, et. al., Molecular Immunology (1999) I 36, pp. 61-71 ; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1 ) pp. 1 -4). Al dimerizar la inmunoglobulina de cadena sencilla, el dímero resultante puede tener una estructura y una actividad similar a las de un anticuerpo que es un tetrámero como tal. Además, el anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo que tiene una región variable de cadena pesada sencilla y no tiene una secuencia de cadena ligera. Dicho anticuerpo se denomina un anticuerpo de dominio sencillo (sdAb) o un nanocuerpo, y de hecho, se observa en camellos y llamas y se ha reportado que tiene una afinidad de unión a antígeno (Muyldemans S. et. al., Protein Eng. (1994) 7(9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). Se puede entender que los anticuerpos antes mencionados son tipos de fragmentos funcionales del anticuerpo, de conformidad con la invención. i Además, al controlar la glicosilación en la cual un glicano se une al anticuerpo de la invención, es posible incrementar la actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpo. En lo que respecta a técnicas para controlar la glicosilación de anticuerpos, se conocen los documentos W0 99/54342, WO 00/61739, WO 02/31 140, etc. Sin embargo, las técnicas no se limitan a éstos.

En casos en donde un anticuerpo es producido aislando primero un gen de anticuerpo y después introduciendo el gen en el hospedero i apropiado, se pueden usar una combinación de un hospedero apropiado y un i vector de expresión apropiado. Ejemplos específicos del gen de anticuerpo incluyen una combinación de un gen que codifica una secuencia de cadena pesada de un anticuerpo descrita en esta descripción y un gen que codifica una secuencia de cadena ligera del mismo. Cuando una célula hospedera es transformada, es posible insertar el gen de la secuencia de cadena pesada y el gen de la secuencia de cadena ligera en el mismo vector de expresión, y también en diferentes vectores de expresión por separado. En casos en donde se usan células eucarióticas como el hospedero, se pueden usar células animales, células vegetales y microorganismos eucarióticos. Como las células animales, (1 ) células de mamífero, por ejemplo, cepas deficientes en dihidrofolato reductasa (Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) de células COS de simio (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), fibroblastos de murino NIH3T3 (ATCC No.

CRL-1658), y células de ovario de hámster chino (células CHO; ATCC: CCL- 61); pueden ser ejemplificadas. Además, en casos en donde se usan células procarióticas, por ejemplo, Escherichia coli y Bacillus subtilis puedení ser ejemplificadas. Al introducir un gen de anticuerpo objetivo en estas células a través de transformación, y al cultivar las células así transformadas in vitro, se ¦I puede obtener el anticuerpo. En el método de cultivo antes mencionado, el rendimiento algunas veces puede variar dependiendo de la secuencia del anticuerpo, y por lo tanto, es posible seleccionar uno que sea fácilmjente producido como un compuesto farmacéutico al usar el rendimiento como un índice entre los anticuerpos que tienen una actividad de unión comparable: No hay limitación sobre el isotipo del anticuerpo de la invención, y ejemplos de los mismos incluyen IgG (lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4), IgM, IgA (lgA1 , lgA2), IgD e IgE, y ejemplos preferidos de los mimos incluyen IgG e IgM, y además, ejemplos más preferidos de los mismos incluyen lgG1 e lgG2.

Además, el anticuerpo de la invención puede ser un fragmento funcional del anticuerpo que tiene un sitio de unión a antígeno del anticuerpo o un fragmento modificado del mismo. El fragmento del anticuerpo se puede obtener al tratar el anticuerpo con una proteasa tal como papaina o pepsina, o al modificar el gen del anticuerpo de conformidad con una técnica de ingeniería genética y expresando el gen modificado en células cultivadas adecuadas. Entre estos fragmentos de anticuerpo, un fragmento que tiene todas o parte de las funciones de la molécula del anticuerpo de longitud completa se puede llamar un fragmento funcional del anticuerpo. ComO las funciones del anticuerpo, generalmente una actividad de unión a antígeno, una actividad de neutralización de la actividad de un antígeno, una actividad de incremento de la actividad de un antigeno, una actividad citotóxica dependiente de anticuerpo, una actividad citotóxica dependiente de complemento y actividad citotóxica celular dependiente de complemento se pueden ejemplificar. La función del fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la invención es una actividad de unión a Siglec-15, preferiblemente una actividad de inhibir la formación de osteoclastos, muy preferiblemente una actividad de inhibir el proceso de fusión celular de los í osteoclastos.

Ejemplos del fragmento del anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv, Fv de cadena sencilla (scFv) en el cual moléculas de Fv de la cadena pesada y la cadena ligera son ligadas mediante un enlazador apropiado, un diacuerpo (diacuerpos), un anticuerpo lineal, y un anticuerpo poliespecifico compuesto del fragmento de anticuerpo. Además, Fab' que es un fragmento monovalente en una región variable de un anticuerpo obtenido mediante tratamiento de F(ab')2 bajo condiciones reductoras es también considerado como un fragmento del anticuerpo.

Además, el anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo I poliespecifico con especificidad para por lo menos dos antigenos diferentes.

En general, dicha molécula se une a dos antigenos (es decir, un anticuerpo I biespecifico), sin embargo, el "anticuerpo poliespecífico", como se usa aquí, incluye un anticuerpo que tiene especificidad para dos o más (por ejemplo, tres) antígenos. ¡ El anticuerpo poliespecífico de la invención puede ser un anticuerpo de longitud completa o un fragmento de dicho anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecifico F(ab')2). El anticuerpo biespecifico puede ser producido al ligar las cadenas pesada y ligera (pares de HL) de dos tipos de anticuerpos, o también puede ser producido al fusionar hibridomas que producen diferentes anticuerpos monoclonales para preparar células fusionadas productoras de anticuerpo biespecifico (Millstein et al., Náture (1983) 305, pp. 537-539). ! El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo de cadena sencilla (también referido como scFv). El anticuerpo de cadena sencilla se puede obtener al ligar la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de un anticuerpo mediante un enlazador de polipétido (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Anticuerpos, 113 (editado por Rosenburg y Moore, Springer Verlag, New York, pp. 269-315 (1994), Náture Biotechnology (2005), 23, pp. 126-1 136). Además, un fragmento de BiscFv producido al ligar dos moléculas de scFv mediante un enlazador de polipétido también se puede usar como el anticuerpo biespecifico.

EL método para producir un anticuerpo de cadena sencilla se conoce en este campo técnico (véase, por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 4,946,778, 5,260,203, 5,091 ,513, 5,455,030, etc.). En este scFv, la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera son ligadas mediante un enlazador que no forma un conjugado, preferiblemente mediante un enlazador de polipétido (Huston, J. S. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA (1988), 85, pp. 5879-5883). En el scFv, la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera se pueden derivar del mismo anticuerpo o diferentes anticuerpos.

Como el enlazador de polipéptido que se ha de usar para ligar las regiones variables, por ejemplo, se usa un péptido de cadena sencilla dado compuesto de 12 a 19 residuos.

ADN que codifica scFv se puede obtener al realizar amplificación usando un ADN que codifica la secuencia entera de aminoácidos, o una secuencia parcial deseada de aminoácidos, seleccionados de la cadena pesada o la región variable de cadena pesada del anticuerpo antes mencionado y la cadena ligera o la región variable de cadena ligera del mismo como una plantilla por un método de PCR usando un par de iniciadores que define ambos extremos de la misma, y además realizando amplificación al combinar el ADN que codifica una porción de enlazador de polipétido y un par de iniciadores que define ambos extremos de la misma para ligar los dos extremos a la cadena pesada y la cadena ligera, respectivamente.

Además, una vez que el ADN que codifica scFv es producido, un vector de expresión que contiene el mismo y un hospedero transformado por el vector de expresión se puede obtener de conformidad con procedimientos comunes. Además, al usar el hospedero resultante, scFv se puede obtener de conformidad con procedimientos comunes. Un fragmento de anticuerpo del mismo se puede producir en un hospedero al obtener un gen y al expresar el I gen de la misma manera como se describió antes.

El anticuerpo de la invención puede ser multimerizado para incrementar su afinidad para un antigeno. El anticuerpo que ha de ser multimerizado puede ser un tipo de anticuerpo o una pluralidad de anticuerpos que reconocen una pluralidad de epítopes del mismo antigeno. Como un método de multimerización del anticuerpo, se puede ejemplificar la unión del dominio CH3 de IgG a dos moléculas de scFv, unión a estreptavidina, introducción de un motivo de hélice-vuelta-hélice y similares. ! El anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo policlonal que es una mezcla de tipos plirales de anticuerpos anti-Siglec-15 que tienen diferentes secuencias de aminoácidos. Como un ejemplo del anticuerpo policlonal, se puede ejemplificar una mezcla de tipos plurales de anticuerpos que tienen diferentes CDR. Como dicho anticuerpo policlonal, se puede usar una mezcla de células que producen diferentes anticuerpos se cultiva, y un anticuerpo purificado del cultivo resultante (véase WO 2004/061104).

Como un anticuerpo modificado, se puede usar un anticuerpo unido a cualquiera de varios tipos de moléculas tales como polietilenglicol (PEG) también. ! Además, el anticuerpo de la invención puede estar en forma de un conjugado formado entre cualquiera de estos anticuerpos y otro agente medicinal (¡nmunoconjugado). Ejemplos de dicho anticuerpo incluyen uno en I I el cual el anticuerpo es conjugado a un material radioactivo o un compufesto que tiene una acción farmacológica (Nature Biotechnology (2005) 23, pp. 1 137-1146).

El anticuerpo obtenido puede ser purificado a homogeneidad. La separación y purificación del anticuerpo se puede realizar utilizando un método de separación y purificación de proteína convencional. Por ejemplo, el i anticuerpo puede ser separado y purificado al seleccionar y combinar apropiadamente la cromatografía en columna, filtración por filtro, ultrafiltración, precipitación de sal, diálisis, electroforesis de gel de poliacrilamida i preparativa, electroforesis de enfoque isoeléctrico, y similares (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Coid Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow y David Lañe, Coid Spring Harbor Laboratory (1988)), pero el método no se limita al mismo.

Ejemplos de dicha cromatografía incluyen cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio de iones, cromatografía hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, y cromatografía de adsorción.

Dicha cromatografía se puede realizar utilizando cromatografía de líquidos tal como CLAR o FPLC. i Como una columna se puede usar en cromatografía de afinidad, una columna Protein A y una columna de proteína G se pueden ejemplificar.

Por ejemplo, como una columna que usa una columna Protein A, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) y similares se pueden ejemplificar. , Además, al usar un vehículo que tiene un antígeno inmovilizado en el mismo, el anticuerpo también se puede purificar utilizando la propiedad de unión del anticuerpo al antigeno.

I 4. Agente farmacéutico que contiene anticuerpo anti-Siqlec-15 De los anticuerpos anti-Siglec-15 obtenidos por el método descrito en el anterior punto "3. Producción de anticuerpo anti-Siglec-15", se puede obtener un anticuerpo que neutraliza la actividad biológica de Siglec- 15. Dicho anticuerpo que neutraliza la actividad biológica de Siglec-15 inhibe la actividad biológica de Siglec-15 ¡n vivo, es decir, la diferenciación y/o maduración de osteoclastos, y por lo tanto se puede usar como un agente terapéutico y/o preventivo para el metabolismo anormal de hueso causado, por diferenciación y/o maduración anormal de osteoclastos como un agente I farmacéutico. El metabolismo anormal de hueso puede ser cualquier trastorno caracterizado por pérdida neta de hueso (osteopenia u osteólisis). En general, el tratamiento y/o prevención por el anticuerpo anti-Siglec-15 son/es aplicado a un caso en donde la inhibición de resorción de hueso es requerida.

Ejemplos del metabolismo anormal de hueso que se puede tratar y/o prevenir por el anticuerpo anti-Siglec-15 incluyen osteoporosis (osteoporosis postmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debido al uso de un agente terapéutico tal como un esteroide o un inmunosupresor, o artritis i I reumatoide acompañante de osteoporosis), artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, hipercalcemia cancerosa, mieloma múltiple acompañante de destrucción de hueso o metástasis de cáncer a hueso, tumor de células gigantes, osteopenia, pérdida de dientes debido a periodontitis, osteólisis alrededor de una articulación prostética, destrucción de hueso en osteomielitis crónica, enfermedad de los huesos de Paget, osteodistrofia renal, y osteogénesis imperfecta, sin embargo, el metabolismo anormal de hueso no está limitado a las mismas siempre que sea una enfermedad acompañada por pérdida neta de hueso causada por osteoclastos. Ejemplos del anticuerpo anti-Siglec-15 que se ha de usar como el agente farmacéutico antes mencionado incluyen un anticuerpo quimérico y un anticuerpo humanizado producido a partir del anticuerpo #32A1 por el método descrito en el punto 3. "(3) Otros anticuerpos". Además, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano que comparten el mismo epítope que el anticuerpo #32A1 también se pueden usar como un agente farmacéutico. El que un cierto anticuerpo anti-Siglec-15 comparta el mismo epítope que el anticuerpo #32A1 se puede confirmar al observar si estos anticuerpos se unen o no al mismo péptido parcial específico de Siglec-15. Además, también se puede determinar que si un cierto anticuerpo anti-Siglec-15 compite con el anticuerpo #32A1 para unión a Siglec-15, estos anticuerpos comparten el mismo epítope.

La actividad in vitro del anticuerpo anti-Siglec-15 de neutralizar la actividad biológica de Siglec-15 se puede determinar, por ejemplo, por la actividad de inhibir la diferenciación de las células que sobreexpresan Siglec- 1 5 en osteoclastos. Por ejemplo, el anticuerpo anti-Siglec-15 se añade a células RAW 264.7 o células RAW 264 que son una línea de células derivadas de monolitos de ratón a varias concentraciones, y la actividad de í inhibir la diferenciación en osteoclastos por estimulación con RANKL o TNF-a se puede determinar. Además, el anticuerpo anti-Siglec-15 se añade a células cultivadas primarias derivadas de médula ósea a varias concentraciones, y la actividad de inhibir la diferenciación en osteoclastos por estimulación con i RANKL, TNF-a, o vitamina D3 activa se puede determinar. Además, el anticuerpo anti-Siglec- 5 se añade a células precursoras de osteoclastos humanos normales (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, disponible de Sanko Junyaku Co., Ltd. , Cat. No. 2T-1 10) a varias concentraciones, y la actividad de inhibir la diferenciación en osteoclastos por estimulación con RANKL o M-CSF se puede determinar. Dicho efecto inhibidor sobre la diferenciación de osteoclastos se puede determinar usando la inhibición de al actividad de la fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRÁP) de osteoclastos como un índice. Además, el efecto inhibidor sobr la diferenciación de osteoclastos también se puede determinar usandq la inhibición de formación de osteoclastos multinucleados TRAP-positivos, es decir, la inhibición de fusión celular de osteoclastos como un índice. Además, en un experimento que utiliza una prueba de fosa (Takada et al. , Bone ánd Mineral, (1992) 17, 347-359) usando células derivadas de fémur y/o tibia, la actividad in vitro de inhibir la resorción de hueso por osteoclastos se puede i determinar añadiendo el anticuerpo anti-Siglec-15 a células derivadas de fémur y/o tibia a varias concentraciones, y observando la formación de fosa en una rebanada de dentina. Como un sistema para determinar la actividad in vitro de inhibir la resorción de hueso por osteoclastos, es también posible usar i una placa revestida con colágeno humano conjugado a europio. El efecto terapéutico o preventivo in vivo del anticuerpo anti-Siglec-15 sobre el metabolismo anormal de hueso usando un animal experimental se puede confirmar administrando el anticuerpo anti-Siglec-15 a un modelo animal de osteoporosis o un animal transgénico que sobreexpresa Siglec-15 y midiendo cualquier cambio en osteoclastos.

El anticuerpo así obtenido que neutraliza la actividad biológica de Siglec-15 es útil como un agente farmacéutico, particularmente como una composición farmacéutica para tratar o prevenir el metabolismo anormal de hueso tales como osteoporosis, artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, o metástasis de cáncer a hueso acompañante de destrucción de hueso, o como un anticuerpo parar diagnóstico inmunológico de dicha enfermedad.

En el tratamiento de artritis reumatoide (RA), un problema mayor es pérdida de hueso que acompaña la ocurrencia de la enfermedad. Se ha reportado que en esta pérdida de hueso que acompaña RA, los osteoclastos i juegan un papel primario. Las citocinas consideradas como las más importantes para inducción de osteoclastos (diferenciación y maduración) y la activación y como la causa de destrucción de hueso en RA son RAN L y I TNF-a (Romas E. et al., Bone 30, pp. 340-346, 2002). OCIF/OPG que es un receptor de señuelo para RANKL puede inhibir la formación de osteoclastos inducida por RANKL pero no inhibe la formación de osteoclastos inducida por TNF-a. Por otra parte, el anticuerpo anti-Siglec-15 de conformidad con la invención efectivamente inhibió la formación de osteoclastos inducida por RANKL y TNF-a. Por lo tanto, se espera que el anticuerpo anti-Siglec-15 de la invención puede inhibir la pérdida de hueso y destrucción de hueso inducida por TNF-a en RA o similar más fuertemente que un bloqueador de RANKL (OCIF/OPG, un anticuerpo anti-RANKL o similar). ! Como un ejemplo, para el tratamiento o prevención de metabolismo anormal de hueso, el anticuerpo anti-Siglec-15 se puede administrar sola o en combinación con por lo menos otro agente terapéutico para una enfermedad relacionada con hueso. Como otro ejemplo, el anticuerpo anti-Siglec-15 se puede administrar en combinación con una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente terapéutico para el metabolismo anormal de hueso. Ejemplos del agente terapéutico que se puede administrar en combinación con el anticuerpo anti-Siglec-15 incluyen, pero no se limitan a: bisbifosfonatos (por ejemplo, alendronato, etidronato, ibandronato, incadronato, pamidronato, risedronato y zoledronato), vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de los mismos, hormonas tales como estradiol, SERMs (moduladores de receptor de estrógeno selectivos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos (por ejerViplo, celecoxib y rofecoxib), receptores de TNF solubles (por ejemplo, etanercept), anticuerpos anti-TNF-a o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, infliximab), anti-PTHrP (proteína relacionada con hormona paratiroidea) anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas de receptor de IL-1 (por ejemplo, anakinra), anticuerpos i antireceptor de IL-1 o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos anti-RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, denosumab), y OCIF (factor inhibidor de osteoclastogénesis). Dependiendo del estado de metabolismo anormal de hueso o el grado pretendido del tratamiento y/o prevención, dos o tres, o más tipos de agentes medicinales se pueden administrar, y estos agentes medicinales se pueden administrar todos juntos encapsulándolos en la misma preparación. Estos agentes medicinales y el anticuerpo anti-Siglec-15 pueden ser suministrados todos juntos encapsulándolos en la misma preparación. Además, estos agentes medicinales pueden ser suministrados todos juntos encapsulándolos como un kit que se ha de usar para el tratamiento y/o prevención. Además, estos agentes medicinales y el anticuerpo anti-Siglec- 5 pueden ser suministrados por separado. En el caso de administración en terapia génica, un gen de un agente terapéutico proteináceo para una enfermedad de los huesos y un gen del anticuerpo anti-Siglec-15 se puéden insertar hacia el extremo 3' de la misma región de promotor o diferentes regiones de promotor, y se pueden introducir en el mismo vector o diferentes vectores. ! Al conjugar un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos al anticuerpo anti-Siglec-15 o un fragmento del mismo, un conjugado de fármaco objetivo como se describe en M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principies and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216 puede ser producido. Para lograr este propósito, otra molécula distinta al anticuerpo, cualquier fragmento de anticuerpo se puede aplicar siempre que no pierda completamente la capacidad para reconocer osteoclastos, y ejemplos de los mismos incluyen fragmentos tales como Fab, F(ab')2, y Fv. En la invención, el anticuerpo y el fragmento se pueden usar de la misma manera. El conjugado formado por el anticuerpo anti-Siglec-15 o un fragmento del mismo y un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos puede ser cualquiera de varias formas descritas en M. C. Garnet "Targeted drug conjugates: principies and progress", Advanced Drug Delivery Reviews, (2001) 53, 171-216, G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press, California (1996), Putnam y J. Kopecek "Polymer Conjugates con Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123 y similares. Es decir, un conjugado en el cual el anticuerpo anti-Siglec-15 y un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos son conjugados uno a otro químicamente y directamente o mediante un separador tal como un oligopéptido y un conjugado formado por un vehículo de fármaco apropiado puede ser ejemplificado. Ejemplos del vehículo de fármaco incluyen! un liposoma y un polímero soluble en agua. Ejemplos más específicos , del conjugado formados por dicho vehículo de fármaco incluyen un conjugado en el cual el anticuerpo y un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos se incorporan en un liposoma y el liposoma y el anticuerpo se conjugan uno otro, y un conjugado en el cual un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos es conjugado a un polímero soluble en agua (un compuesto que tiene un peso molecular de aproximadamente 1000 a 100000) químicamente y directamente o mediante un separador tal como un oligopéptido y el anticuerpo es conjugado al polímero soluble en agua. La conjugación del anticuerpo (o un fragmento del mismo) a un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos o un vehículo de fármaco tal como un liposoma o un polímero soluble en agua se puede efectuar por un método conocido por los expertos en la técnica tal como el método descrito en G. T. Hermanson "Bioconjugate Techniques" Academic Press, California (1996), Putnam y J. Kopecek "Polymer Conjugates con Anticancer Activity" Advances in Polymer Science (1995) 122, 55-123. La incorporación de un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos en un liposoma se puede efectuar por un método conocido por los expertos en la técnica1 tal como el método descrito en D. D. Lasic "Liposomes: From Physics to Applications" Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam (1993) o similar. La conjugación de un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos a un polímero soluble en agua puede ser efectuada por un método conocido por los expertos en la técnica tal como el método descrito en D. Putnam y J. Kopecek "Polymer Conjugates con Anticancer Activity" Advances in Polymer I I Science (1995) 122, 55-123. Un conjugado del anticuerpo (o un fragmento del mismo) y un agente terapéutico proteináceo para una enfermedad de los huesos (o un fragmento del mismo) puede ser producido por métodos conocido por los expertos en la técnica a través de ingeniería genética distinto del método antes mencionado. j La invención también provee una composición farmacéutica que contiene una cantidad terapéuticamente y/o preventivamente efectiva del anticuerpo anti-Siglec-15 y un diluyente, vehículo, agente solubilizante, agente emulsionante, conservador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

La invención también provee una composición farmacéutica ¡que « contiene una cantidad terapéuticamente y/o preventivamente efectiva del ¾ anticuerpo anti-Siglec-15, una cantidad terapéuticamente y/o preventivamente .jsrefectiva de por lo menos un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos, y un diluyente, vehículo, agente solubilizante, agente emulsionante, conservador y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos del agente terapéutico para una enfermedad de los huesos incluyen, pero no se limitan a, bisbifosfonatos (por ejemplo, alendronato, etidronato, ibandronato, incadronato, pamidronato, risedronato y zoledronato), vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de los mismos, hormonas tales como estradiol, SERMs (moduladores de receptor de estrógeno selectivos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos (por ejemplo, celecoxib y rofecoxib), receptores de TNF solubles (por ejemplo, etanercept), anticuerpos anti-TNF-a I o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, infliximab), anticuerpos anti-PTHrP (proteina relacionada con hormona paratiroidea) o i I fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas de receptor de IL-1 (por ejemplo, anakinra), anticuerpos anti-receptor de IL-1 o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, tocilizumab), anticuerpos ánti- RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos (por ejemplo, denosumab) y OCIF (factor inhibidor de osteoclastogénesis). j Una sustancia que se ha de usar en una preparación aceptable en la composición farmacéutica de conformidad con la invención es preferiblemente no tóxica a una persona a quien la composición farmacéutica ha de ser administrada en términos de la dosis y concentración.

La composición farmacéutica de la invención puede contener i una sustancia para uso farmacéutico que es capaz de cambiar o mantener el pH, presión osmótica, viscosidad, transparencia, color, isotonicidad, condición aséptica, estabilidad, solubilidad, velocidad de liberación, velocidad de absorción, y permeabilidad de la misma. Ejemplos de dicha sustancia para uso farmacéutico incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos tales como glicina, alanina, glutamina, asparagina, arginina y Usina; agentes antimicrobianos; antioxidantes tales como ácido ascórbico, sulfato de sodio, y sulfito ácido de sodio; reguladores de pH tales como reguladores de pH de fosfato, citrato, borato, bicarbonato de sodio, y soluciones de Tris-HCI; llenadores tales como manitol y glicina; agentes quelatadores tales como I etilendiamino tetraacetato (EDTA); agentes formadores de complejo tales i como cafeína, polivinilpirrolidina, ß-ciclodextrina e hidroxipropil-p-ciclodextrina; expansores tales como glucosa, mañosa y dextrina; otros carbohidratos tales como monosacáridos y disacáridos; agentes colorantes; sabores; diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidina; conservadores tales como polipéptidos de peso molecular bajo, contraiónes formadores de sal, cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicilico, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, i ácido sórbico y peróxido de hidrógeno; solventes tales como glicerina, propilenglicol y polietilenglicol; alcoholes de azúcar tales como manítol y sorbitol; agentes de suspensión; agentes tensoactivos tales como éster de sorbitán, polisorbatos incluyendo polisorbato 20 y polisorbato 80, Tritón, trometamina, lecitina y colesterol; agentes incrementadores de estabilidad tales como sacarosa y sorbitol; agentes incrementadores de elasticidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, y manitol y sorbitol; agentes de transporte; excipientes; y/o adyuvantes farmacéuticos. La cantidad de estas sustancias añadidas para uso farmacéutico es preferiblemente de 0.01 a 100 veces, particularmente preferiblemente de 0.1 a 10 veces el peso del anticuerpo anti-Siglec-15. Los expertos en la técnica pueden determinar apropiadamente una formulación preferida de la composición farmacéutica en una preparación dependiendo de la enfermedad a la cual se aplica la composición, la vía de administración, o similar.

El excipiente o vehículo en la composición farmacéutica puede estar en forma de un líquido o un sólido. Un excipiente o vehículo apropiado puede ser agua inyectable, solución salina fisiológica, un fluido espinal ? cerebral artificial, u otra sustancia comúnmente usada para administración parenteral. Además, la solución salina fisiológica neutra o solución salina fisiológica que contiene albúmina de suero también se puede usar como un vehículo. La composición farmacéutica puede contener un regulador de pH Tris de pH 7.0 a 8.5, un regulador de pH de acetato de pH 4.0 a 5.5, o un regulador de pH de citrato de pH 3.0 a 6.2. Además, el regulador de pH puede ser complementado con sorbitol u otro compuesto. Ejemplos de la composición farmacéutica de la invención incluyen una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec-15 y una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec-15 y por lo menos un agente terapéutico para una enfermedad de los huesos. La composición farmacéutica de la invención se prepara en forma de un producto liofilizado o un líquido como un agente medicinal que tiene una composición seleccionada y una pureza requerida. La composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec-15 y la composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec- 5 y por lo menos un agente terapéutico para el metabolismo anormal de hueso también se puede formar en un producto liofilizado usando un excipiente apropiado tal como sacarosa.

La composición farmacéutica de la invención se puede preparar para administración parenteral o para absorción gastrointestinal a través de administración oral. La composición y concentración de una preparación se puede determinar dependiendo del método de administración. Mientras más i alta es la afinidad del anticuerpo anti-Siglec-15 contenido en la composición farmacéutica de la invención es para Siglec-15, es decir, mientras más baja es la constante de disociación (valor de Kd) del mismo es para Siglec-15, más el í anticuerpo anti-Siglec-15 puede mostrar su eficacia de fármaco aun cuándo reduce la dosis para humanos. Por lo tanto, la dosis de la composición farmacéutica de la invención para humanos también se puede determinar con base en esta consideración. En cuanto a la dosis, en el caso en donde un anticuerpo anti-Siglec-15 humano es administrado a humanos, el anticuerpo puede ser administrado a una dosis de aproximadamente 0.1 a 100 mg/kgj una vez por uno a 180 días.

Ejemplos de la forma de dosis de la composición farmacéutica de la invención incluyen inyecciones incluyendo infusiones, supositorios, agentes transnasales, agentes sublinguales y absorbentes percutáneos.

EJEMPLOS De aquí en adelante, la invención se describirá más específicamente con referencia a los ejemplos, sin embargo, la invención no se limita a la misma. Nótese que las operaciones respectivas con respecto a manipulación de genes en los siguientes ejemplos se realizaron de conformidad con los métodos descritos en "Molecular Cloning" (escrito por Sambrook, J., Fritsch, E. F. y Maniatis, T. , publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press en 1989), o en el caso de usando reactivos o , kits comercialmente disponibles, se usan de conformidad con los protocolos unidos a los mismos a menos que se indique otra cosa. ' EJEMPLO 1 Producción de constructo de expresión de proteína Siglec-15 soluble de ratón Una secuencia parcial de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de proteína Siglec-15 de ratón está representada por SEQ ID NO: 5 en el listado de secuencias y una secuencia de aminoácidos de la misma está representada por SEQ ID NO: 6 en el listado de secuencias. Al utilizar una secuencia parcial, la proteína Siglec-15 soluble de ratón se puede producir en un sobrenadante de cultivo de una célula animal o similar. a) Amplificación de gen de Siglec-15 soluble de ratón por PCR Como iniciadores para amplificar el ADNc del dominio extracelular de Siglec-15 de ratón por PCR, un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAG GGGTCCCTCC AACTC-3' (mSiglec-15-ECD-F: SEQ ID NO: 7 en el listado de secuencias); y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc TCCGGGGGCG CCGTGGAAGC GGAAC-3' (mSiglec- I 15-ECD-R: SEQ ID NO: 8 en el listado de secuencias) se sintetizaron de conformidad con un procedimiento común. Incidentalmente, estos iniciadores se diseñaron como iniciadores de amplificación para producir un clon de entrada de Gateway, de tal manera que una secuencia de attB1 se añade a mSiglec-15-ECD-F y una secuencia de attB2 se añade a mSiglec-15-ECD-R. El PCR se realizó usando esta combinación de iniciadores y un polinucleótido que contiene una secuencia de marco de lectura abierta del ratón Siglec-15 com una plantilla de conformidad con un procedimiento común. Las condiciones para un ciclador térmico se establecieron como sigue: después de calentar a 94°C durante 5 minutos, un ciclo de temperatura de "94°C durante 0.5 minutos, 55°C durante 0.5 minutos y 68°C durante 1.5 minutos" se repitió 5 veces, seguido por calentamiento a 68°C durante 5 minutos e incubando a 4°C. b) Producción de clon de entrada por reacción de Gateway BP Un clon de entrada en el cual el ADNc de dominio extracelular de Siglec-15 de ratón fue integrado por la tecnología Gateway (Invitrogen, Inc.) utilizando un sistema de recombinación específico del sitio de fago lambda fue producido por el siguiente método. Primero, una reacción de BP que usa BP Clonase se realizó entre el producto de PCR que tiene una secuencia de attB en ambos extremos producidos en a) y pDNOR221 (fabricado por Invitrogen, Inc.) que es un vector donador que tiene una secuencia de attP. Al usar esta solución de reacción, Escherichia coli DH10B fue transformada, PCR de colonia se realizó para clones resistentes a fármacos, y el tamaño de insertos fue confirmado. Después, para un clon que se confirmó que tenía un inserto con el tamaño correcto, se realizó un análisis de secuencia de la secuencia de ADN total del inserto. Como resultado, se obtuvo un clon de entrada que es completamente idéntico a la secuencia objetivo de nucleótidos (SEQ ID NO: 5 en el listado de secuencias) que codifica el dominio extracelular de la proteína Siglec-15 de ratón. | c) Producción de clon de expresión por reacción de Gateway LR Un clon de expresión en el cual el ADNc de dominio extracelular i de Siglec-15 de ratón fue integrado por la tecnología Gateway (Invitrogen, Inc.) utilizando un sistema de recombinación específico del sitio de fago lambda fue producido por el siguiente método. El clon de entrada producido en b) contiene un inserto que tiene una secuencia de attL en ambos extremos.

Una reacción de LR usando LR Clonase se realizó entre este clon de entrada y dos tipos de vectores de destino que tienen una secuencia de attR.

Incidentalmente, como los vectores de destino, dos tipos de vectores de destino: pDONM diseñados de tal manera que una etiqueta de epítope V5 y una etiqueta 6 x His se añaden al C terminal del inserto; y phlgFc diseñado de tal manera que una etiqueta Fe humana se añade al C terminal del insertó se usaron. Al usar la solución de reacción obtenida por la reacción LR, Escherichia coli DH10B fue transformada, y PCR de colonia se realizó para los clones resistentes a fármaco obtenidos, y el tamaño de los insertos^ fue confirmado. Después, para un clon que se confirmó que tenía un inserto con el tamaño correcto, se realizó un análisis de secuencia de ambos extremos del lado del inserto al lado del vector.

Secuencias de iniciador para análisis de secuencia: 1 5'-tgcgtgaagg tgcagggcag-3' (mSiglec-15-ECD-seq-upstm: SEQ ID NO: 9 en el listado de secuencias) y 5'-cctcgcctgg tcgggtc-3' (mSiglec-15-ECD-seq-dnstm: SEQ ID NO: 10 en el i listado de secuencias) Como resultado de la análisis de secuencia, se obtuvieron los clones de expresión (Siglec-15/pDONM soluble de ratón y Siglec-15/phlgFc soluble de ratón) en el cual la recombinación correcta ocurrió tanto para pDONM como para phlgFc, respectivamente. Al transferir el Siglec-15/pDO M soluble de ratón en una célula animal o similar, el ARNm que tiene' una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 11 en el listado de secuencias es transcrito y traducido en una proteína (Siglec-15-His de ratón) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias. Además, al transfectar el Siglec-15/phlgFc soluble de ratón a una célula animal o similar, el ARNm que tiene una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 13 en el listado de secuencias es transcrito y traducido en una proteina (Siglec-15-Fc de ratón) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 14 en el listado de secuencias.

EJEMPLO 2 La preparación a gran escala de solución de cultivo que contiene proteína Siglec-15 soluble de ratón con el uso de células 293-F Los dos tipos de vectores de expresión (Siglec-15/pDON soluble de ratón y Siglec-15/phlgFc soluble de ratón) obtenido en el ejemplo 1 se preparó en una cantidad de aproximadamente 5 mg, respectivamente. Incidentalmente, en la purificación de plásmidos de Escheríchia coli cultivados a gran escala, se usó Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.). El plásmido asi preparado se mezcló con Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), la mezcla resultante fue esterilizada por filtración, 10 mi de un reactivo de transfección 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) se añadió a la misma, y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esta mezcla se añadió a células FreeStyle 293-F (fabricadas por Invitrogen, Inc.) cultivadas en matraces Erlenmeyer de tal manera que la densidad de células alcanzó 1.1 x 106 células/ml x 5 L (1 Umatraz x 5 matraces) en medio FreeStyle 293 Expression Médium (fabricado por Invitrogen, Inc.). Después de que las células habían sido sometidas a cultivo con agitación (125 rotaciones/min) a una concentración de C02 de 8.0% durante 96 horas (4 días) a 37°C, la solución de cultivo se recolectó y se centrifugó para preparar un sobrenadante de cultivo. Se considera que en el sobrenadante de cultivo así preparado, una proteína en la cual una etiqueta de epítope V5 y una His tag 6x se han ? añadido al lado C-terminal del dominio extracelular Siglec-15 de ratón (Siglec- 5-His de ratón) y una proteina en la cual una etiqueta Fe humana se ha añadido al lado C-terminal del dominio extracelular Siglec-15 de ratón (Siglec- i 15-Fc de ratón) se expresan, respectivamente.

EJEMPLO 3 i í Purificación de Siglec-15-His de ratón a) Cromatografía en columna HisTrap HP j I A 2 L de la solución de cultivo de células 293F que expresan Siglec-15-His de ratón preparadas en el ejemplo 2, 225 mL de regulador de pH 10 x (500 mM Tris, 1.5 M NaCI, 200 mM imidazol, pH 8.0) se añadió, !y la mezcla resultante se agitó bien y se filtró a través de un filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Esta solución de cultivo se aplicó a una velocidad de flujo de 2 ml/min a una columna que comprendía tres columnas de HisTrap HP 5 mi (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) conectadas en serie y se trató anteriormente con un agente removedor de pirógeno PyroCLEAN (fabricado por ALerCHEK, Inc.) y se lavó con agua destilada para inyección. Después de que la columna se lavó con 60 mi de regulador de pH 50 mM Tris-HCI (pH 8.0) que contenía 300 mM NaCI a una velocidad de: flujo i I de 1 ml/min, una proteína adsorbida a la columna se eluyó con 50 mi de regulador de pH 50 mM Tris-HCI (pH 8.0) que contenía 300 mM NaCI y 500 mM imidazol a una velocidad de flujo de 1 ml/min. El producto eluido fue fraccionado a 1 mi por fracción en tubos mini-sorp (fabricado por Nunc, Inc.) a los cuales se había añadido previamente 10 µ? de 10% Tween 20. Después de aproximadamente 20 mi de una solución obtenida al combinar las fracciones (fracciones 14 a 20) y que contenía la proteína eluida se concentró a 2.5 mi con un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el concentrado se aplicó a una columna de destilación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con solución salina regulada en su pH con fosfato que contenía 0.01% Tween 20 (T-PBS), seguido por elución con T-PBS, por lo que¡ se obtuvo 3.5 mi de una muestra cuyo solvente fue reemplazado por T-PBS. b) Cromatografía en columna Resource Q A 3.5 mi de la muestra que fue purificada por cromatografía en columna HisTrap HP y cuyo solvente fue reemplazado por T-PBS, 22.5 mi de regulador de pH 50 mM Tris-HCI (pH 7.5) que contenía 0.1 % CHAPS se añadió y la mezcla resultante se agitó. Después, la mezcla se centrifugó a 4°C durante 30 minutos a 3,000 rpm y el precipitado fue removido. Después de que el sobrenadante resultante se filtró a través de un filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el filtrado se aplicó a una velocidad de flujo de 1 ml/min a una columna Resource Q 6 mi (fabricado por Amers¡ham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con regulador de pH 50 mM Tris-HCI (pH 7.5) que contenía 0.1 % CHAPS. Por lo tanto, la columna se lavó con este regulador de pH a una velocidad de flujo de 1 ml/min y una fracción de proteína que no fue adsorbida a la columna fue recolectada. Una proteina adsorbida a la columna se eluyó con regulador de pH 50 mM Tris-HCI (pH 7.5) que contenía 0.1 % CHAPS y 1 M NaCI a l una i velocidad de flujo de 1 ml/min. Después de 26.5 mi de la fracción que no fue adsorbida a la columna se concentró a 2.0 mi con un concentrador de membrana centrifuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el concentrado se centrifugó a 4°C durante 10 minutos a 3,000 rpm y el precipitado fue removido. El sobrenadante después de la centrifugación fue crioconservado a -80°C hasta usarse. El procedimiento de purificación antes mencionado (cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q) se realizó al repetirlo dos veces. c) Detección y prueba de pureza de Siglec-15-His purificada de ratón Al usar una muestra preparada por el procedimiento de purificación antes mencionado (cromatografía en columna HisTrap HP y cromatografía en columna Resource Q), se realizó electroforesis de SDS- poliacrilamida bajo condiciones reductoras y tinción con plata. Es decir, a 5 µ? de cada una de las muestras purificada por los pasos de purificación respectivos, se añadió una cantidad equivalente de una solución de tratamiento de SDS, y la mezcla resultante se trató térmicamente a 95°C durante 10 minutos. 0.3 µ? de cada una de las muestras térmicamente tratadas se usó para electroforesis de SDS-poliacrilamida. Como un gel para electroforesis, se usó un gel de gradiente de poliacrilamida de 8-25% (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.), y la electroforesis se realizó usando PhastSystem (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.). Además, como marcadores de peso molecular, se usaron Rainbow Molecular Weight arkers (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.). Después de completarse la electroforesis, la tinción con plata se realizó usando PhastGel Silver Kit (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) y PhastSystem. Los resultados se muestran en la figura 1. Se mostró que una proteina que tenia un peso molecular de aproximadamente 35 kDa (Siglec-15-His de ratón) | fue eficientemente purificada y concentrada en la fracción de proteina que no' fue adsorbida a la columna Resource Q.

La electroforesis se realizó bajo las mismas condiciones excepto que ECL DualVue Western Blotting Markers (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) se usaron como los marcadores de peso molecular, ¡y la proteína en el gel fue transferido (blott) a una membrana de PVDF (Hybond-P, fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) usando un PhastTransfer Semi-dry Transfer Kit (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) y PhastSystem. Esta membrana de PVDF se agitó suavemente en 10 ml de un agente bloqueador (BlockAce, fabricado por Snow Brand Milk Products, Co., Ltd.) que contenia 0.1% Tween 20 a temperatura ambiente durante 1 hora. A esta solución de bloqueo, 10 µ? de S-proteína HRP (fabricado por Amersham Biosciences,! Inc.) y 10 µ? de un anticuerpo anti-V5-HRP (anticuerpo monoclonal para Pk-TAG- HRP, fabricado por Acris Anticuerpos) se añadieron y la membrana en la solución se agitó suavemente a temperatura ambiente durante 1 hora adicional. La membrana de PVDF se lavó 4 veces al agitarlo suavemente en 50 mL de fosfato-regulador de solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) que contenía 0.01 % Tween 20 durante 5 minutos. Después del lavado, la membrana de PVDF se trató de conformidad con el protocolo que acompañó un kit de detección ECL (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) para revelar el color de la banda de la proteina, y el color revelado se detectó usando una ECL Mini-Camera (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) y película Polaroid (Polapan 3200B, fabricado por Polaroid, Inc.). Los resultados se muestran en la figura 2. También a partir de estos resultados, se pudo confirmar que una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 35 kDa (Siglec-15-His de ratón) y reacciona con un anticuerpo anti-V5-HRP fue eficientemente purificada y concentrada en la fracción de proteína que no fue adsorbida a la columna Resource Q. d) Medición de concentración de proteina de Siqlec- 5-His purificada de ratón i Para la Siglec-15-His purificada de ratón (la fracción de proteina que no fue adsorbida a la columna Resource Q), la concentración de proteína se midió con un kit de prueba de proteína DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albúmina de suero de bovino como una muestra estándar. Como se muestra en el cuadro 1 , un total de 1.66 mg de proteina Siglec-15-His purificada de ratón se obtuvo al realizar el procedimiento de purificación dos veces.

CUADRO 1 EJEMPLO 4 Purificación de Siqlec-15-Fc de ratón I a) Proteina en columna HiTrap Protein A 1.8 L de la solución de cultivo de células 293F que expresan Siglec-15-Fc de ratón preparada en el ejemplo 2 se filtró a través de un filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), y después el filtrado se aplicó a una columna HiTrap Protein A 5 mi (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.) a una velocidad de flujo de 5 ml/min. Después de que la columna se lavó con D-PBS a una velocidad de flujo de 5 ml/min, una proteina adsorbida a la columna se eluyó con 50 mi de regulador dp pH de 0.1 M citrato de sodio (pH 3.0) a una velocidad de flujo de 5 ml/mín. El i material eluido se fraccionó a 5 mi por fracción en tubos mini-sorp (fabricado por Nunc, Inc.), e inmediatamente después, 1.3 mi de 1 M Tris se añadió al mismo para neutralizar el material eluido. Después de que una solución i I obtenida al combinar las fracciones (fracciones 1 y 2) en la cual la proteína eluida fue detectada se concentró a 2.5 mi con un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el concentrado se aplicó a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con Otsuka solución salina fisiológica para inyección (TO-SS, fabricada por Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) que contenía 0.01% Tween 20, seguida por elución con TO-SS, por lo que 3.5 mi de una muestra cuyo solvente fue reemplazado por TO-SS se obtuvo. Esta muestra fue crioconservada a -80°C hasta usarse. Al usar 2.9 L de una solución de cultivo de células 293F, el mismo procedimiento de purificación se realizó al repetirlo una vez más. i b) Detección y prueba de pureza de Siglec-15-Fc purificada de ratón ( Al usar una muestra preparada por el procedimiento de purificación antes mencionado, se realizaron electroforesis de SDS- poliacrilamida bajo condiciones reductoras y tinción con plata. Es decir, a 5 µ? de cada una de las muestras purificada por los pasos de purificación respectivos, una cantidad equivalente de una solución de tratamiento de SDS se añadió, y la mezcla resultante se calentó a 95°C durante 10 minutos, p.3 µ? i de un a muestra obtenida al diluir cada una de las muestras térmicamente tratadas a 1/300 ó 1/900 con una concentración media de la solución de tratamiento de SDS se usó para electroforesis de SDS-poliacrilamida. La electroforesis y tinción con plata se realizaron de la misma manera que la prueba de pureza de Siglec-15-His de ratón descrita en c) del ejemplo 3. Los resultados se muestran en la figura 3 junto con los resultados del examen de condiciones de purificación preliminar a escala pequeña (el pH de la solución de cultivo aplicada fue 8.9 ó 7.0). Se mostró que una proteína que tenia un peso molecular de aproximadamente 55 kDa (Siglec-15-Fc de ratón) fue eficientemente purificada y concentrada en la fracción de proteína que se eluyó de la columna de HiTrap Protein A.

I c) Medición de concentración de proteina de Siqlec-15-Fc purificada de ratón Para la Siglec-15-Fc urificada de ratón (la fracción de proteína eluida de la columna de desalación PD-10), la concentración de proteína se midió con un kit de prueba de proteína DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albúmina de suero de bovino como una muestra estándar. Como se muestra en el cuadro 2, un total de 92 mg de proteína Siglec-15-Fc purificada de ratón se obtuvo al realizar el procedimiento de purificación dos veces.

CUADRO 2 EJEMPLO 5 Establecimiento de hibridoma productor de anticuerpo monoclonal antiratón Siglec-15 de rata ¡ a) Preparación de antigeno La proteina Siglec-15-His de ratón producida en el ejemplo 3 se preparó a 100 µg/0.5 mi, y una cantidad equivalente de un adyuvante se añadió a la misma y una emulsión se produjo usando una jeringa de vidrio.

Como el adyuvante, adyuvante completo de Freund (FCA, fabricado por Difco Laboratories, Inc.) se usó sólo para la primera inmunización, y adyuvante incompleto de Freund (FICA, fabricado por Difco Laboratories, Inc.) se usó para la segunda inmunización y posteriormente. b) Inmunización de rata Cuatro ratas (Wistar, hembras, 6 semanas de edad, comprado de CLEA Japan, Inc.) se usaron como animales inmunizados. La emulsión obtenida en a) se inyectó subcutáneamente e intradérmicamente usando una aguja de inyección de 27 G de tal manera que la cantidad del antigeno fue 50 µ9 por rata. La inmunización se realizó un total de 4 veces cada 7 días después de la primera inmunización. Una pequeña cantidad (200 µ?) de la i sangre fue recolectada de la vena de la cola después de 7 días desde la fecha de la 4a. inmunización, y se preparó un antisuero. Para confirmar el tituló de anticuerpo del antisuero, ELISA que usaba la proteína Siglec- 5-His de ratón que se había usado como el antígeno, la proteina Siglec-15-Fc de ratón producida en el ejemplo 4, o albúmina de suero de bovino (BSA), cada una de las cuales fue inmovilizada, se realizó. Como resultado, la reactividad con la proteína Siglec-15-His de ratón y la proteína Siglec-15-Fc de ratón se observó en todas las cuatro ratas (ratas Nos. 1 a 4). Por otra parte, la reactividad con BSA no se observó. De estos resultados, se confirmó que el título de anticuerpo en el suero de cada una de las ratas inmunizadas se incrementó, y por lo tanto, la rata No. 2 que mostró el título de anticuerpo más alto fue sometida a un procedimiento de fusión celular. i c) Fusión celular Se realizó fusión celular de conformidad con un método común de fusión de células de bazo de ratón (rata) con células de mieloma. La sangre entera fue recolectada del corazón de la rata bajo anestesia con éter y la rata fue sacrificada, y después el bazo fue extirpado. Las células del bazo recolectadas y células P3X63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) que son células de mieloma de ratón fueron sometidas a fusión celular usando polietilenglicol (PEG). Las células resultantes se sembraron en una placa de 96 pozos, y un medio que contenía hipoxantina (H), aminopterina (A) y timidina (T) (medio de selección de HAT) se añadió a las mismas, y después, las células se i cultivaron durante 7 a 10 días. El sobrenadante de cultivo fue recolectado de 61 pozos en los cuales la supervivencia de hibridomas obtenidos por fusión celular fue confirmada. Después, el título de anticuerpo fue evaluado por ELISA usando la proteína Siglec-15-His de ratón que se había usado como el antígeno, la proteína Siglec-15-Fc de ratón producida en el ejemplo 4, o BSA, cada una de las cuales fue inmovilizada, e hibridomas productores de anticuerpo monoclonal anti-Siglec- 5 de ratón se determinaron selectivamente. A partir de los resultados de la determinación selectiva, 12 pozos que mostraron un título de anticuerpo alto se seleccionaron y los hibridomas contenidos en los pozos fueron sometidos a un procedimiento de clonación. d) Clonación de hibridoma Para el hibridoma así seleccionados, se realizó un primer paso de clonación por un método de dilución limitante. Después de la dilúción limitante, los hibridomas se cultivaron durante 2 semanas, y el tituló de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo fue confirmado por ELISA usando la proteína Siglec-15-Fc de ratón producida en el ejemplo 4 o BSA, cada uno de los cuales fue inmovilizado. Para 11 clones que se confirmó que eran clones positivos, se realizó un segundo paso de clonación (de la misma manera que el primer paso de clonación), por lo que 10 clones de los hibridomas productores de anticuerpo monoclonal anti-Siglec-15 de ratón (#1A1 , #3A1 , #8A1 , #24A1 , #32A1 , #34A1 , #39A1 , #40A1 , #41 B1 , #61 A1) se establecieron al final. Incidentalmente, el hibridoma #32A1 se depositó en el International Patent Organism Depositan/ de la National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (ubicado en Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japón) el 28 de agosto de 2008, y se le ha dado un número de acceso de FERM BP-10999 bajo el nombre de anti-Siglec-15 Hybridoma #32A1. ; I i i EJEMPLO 6 j Preparación de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siqlec-15 de rata a) Preparación de ascitos de ratón sin pelo Los hibridomas establecidos en el ejemplo 5 se cultivaron usando medio TIL Media I (fabricado por Immuno-biological Laboratories Co., Ltd.) que contenia 10% FCS. El subcultivo de las células se llevó a cabo al realizar un procedimiento en el cual la solución de cultivo se diluyó a aproximadamente una cuarta parte cada dos a tres días al usar el punto de tiempo cuando las células se hicieron crecer a aproximadamente 5 x 105 i células/ml como un índice. Cada uno de los hibridomas así cultivados fue I implantado intraperitonealmente en un ratón si pelo al cual se había administrado pristano intraperitonealmente (0.2 ml/ratón) previamente á 1 x 107 células por ratón. En la implantación, se usaron tres ratones sin pelo para ¡ ? cada uno de los 10 clones de hibridomas. Después de la implantación, los ascitos fueron recolectados cuando se observó suficiente acumulación de ascitos, que se combinaron con aquellos recolectados de los otros 'dos ratones implantados con el mismo hibridoma, la cantidad de los ascitos así combinados se midió, y los ascitos se crioconservaron hasta la purificación del anticuerpo. Las cantidades de los ascitos recolectados para los hibridomas respectivos se resumen en el cuadro 3.

CUADRO 3 b) Purificación de anticuerpo La cantidad total de los ascitos recolectados se sometió a purificación de IgG usando una columna de 20 mi Protein G (fabricado por GE Healthcare, Co., Ltd.). La IgG purificada se probó para pureza por análisis de filtración en gel (cromatografía en columna Superdex 200), y algunos de los anticuerpos fueron sometidos a concentración de membrana centrífuga; Es decir, entre los anticuerpos monoclonales anti-ratón Siglec-15 purificados, 9 tipos de anticuerpos excepto por el anticuerpo #24A1 se concentraron a aproximadamente una sexta parte a una octava parte del volumen original al centrifugar los anticuerpos a 3,000 rpm durante 30 a 60 minutos a 4°C usando un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Subsecuentemente, para el anticuerpo #24A1 y los otros 9 tipos de anticuerpos concentrados, la concentración ed proteina se midió con un kit de prueba de proteina DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albúmina de suero de bovino (BSA) como una muestra estándar. Mediante procedimiento antes mencionado, se preparó el anticuerpo antiratón Siglec-15 monoclonal.

EJEMPLO 7 Evaluación de propiedad de unión de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata a proteína Siglec-15 de ratón La propiedad del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata que se une a proteina Siglec-15 de ratón fue evaluada por un método de ELISA. La proteina Siglec-15-Fc de ratón producida en el ejemplo 4 se diluyó a 5 pg/ml con regulador de pH de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.5), y la solución resultante se añadió a una placa de 96 pozos (fabricada por Nalge Nunc International, Inc., Cat. No. 430341) a 100 µ?/????. Después de que la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora, la solución fue removida y un regulador de pH de lavado (solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene 0.05% Tween 20) se añadió a 300 µ?/???? y después se removió. Después de este procedimiento de lavado se realizó una vez más, solución salina regulada en su pH con fosfato que contenia 25% BlockAce (fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) se añadió a 200 µ?/????, y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora, por lo que se realizó bloqueo. El líquido fue removido, y la placa se lavó dos veces con 300 µ?/???? del regulador de pH de lavado. Después, cada uno del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de ratas preparado en el ejemplo 6 o IgG de I control de rata (fabricada por R&D Systems, Inc.) se diluyó a una i concentración final de 1.28 a 20,000 ng/ml (serie de dilución de 5 veces) con un regulador de pH de ELISA (solución salina regulada en su pH con fosfato que contenía 12.5% de BlockAce y 0.05% de Tween 20), y la solución de anticuerpo diluida resultante se añadió a la placa a 100 µ?/????. Después de que la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora, el líquido fue removido, y la placa se lavó 3 veces con 300 µ?/???? del regulador de pH de lavado. Subsecuentemente, un anticuerpo anti-rat IgG de cabra marcado con HRP (peroxidasa de rábano picante) (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) diluido a 1,000 veces con un regulador de pH de ELISA se añadió a 100 µ?/????, y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. El líquido fue removido y la placa se lavó 3 veces con 300 µ?/???? del regulador de pH de lavado, y después, usando un kit de revelado de color para peroxidasa (fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), el color fue revelado de conformidad con el protocolo que acompañaba al kit. Después de revelar el color, se midió una absorbancia a 492 nm usando un lector de microplaca (fabricado por Nihon Molecular Devices Corporation). Como resultado, se confirmó que todas las 10 muestras de prueba del anticuerpo monoclonal antiratón Siglec-15 de ratas examinadas se unían a la proteína Siglec-15 de ratón de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo (figura 4). Por otra parte, en el caso de la IgG de control de rata, no se observó la unión a la proteína Siglec-15 de ratón.

EJEMPLO 8 i Preparación de células no adherentes de médula ósea de ratón j El fémur y tibia se extirparon de un ratón ddY macho de 5 a 8 semanas de edad y los tejidos blandos se removieron. Ambos extremos del fémur o tibia se cortaron, y D-PBS se inyectó usando una jeringa con una aguja de inyección de calibre 25 para extraer células de médula ósea, que fueron recolectadas en un tubo de centrífuga. La centrifugación se realizó a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 g, y el sobrenadante fue removido. A la pastilla de células resultante, se añadió 1 mi de un regulador de pH hemolítico (Red Blood Cell Lysing Buffer (regulador de pH de lisis de glóbulos rojos), fabricado por Sigma Co., Ltd.) para suspenderlo, y la suspensión resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. 20 mi de D-PBS se añadió a la misma, y la suspensión se centrifugó a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 g, y el sobrenadante fue removido. A la pastilla de células resultante, se añadió 10 mi de medio MEM-a (fabricado por Invitrogen, Inc.) que contenia 5 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.) y 10% de suero de bovino fetal (FBS) para suspenderlo. Después, la suspensión resultante se hizo pasar a través de un colador de células (40 µ?? Nylon, fabricado por BD Falcon) para remover agregados. Las células resultantes fueron transferidas a un matraz en forma de T de 75 cm2 (para la unión de células adherentes) y se cultivaron durante la noche en una incubadora con CO2. Después del cultivo durante la noche, las células que no se adherieron al matraz en forma de T fueron recuperadas y usadas cómo células no adherentes de médula ósea de ratón.

EJEMPLO 9 Evaluación de actividad biológica de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata basado en prueba para formación de osteoclastos de ratón Al usar todas las 10 muestras de prueba de los anticuerpos monoclonales anti-ratón Siglec-15 producidos en el ejemplo 6, un efecto sóbre diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de ratón se examinó. Las células no adherentes de médula ósea de ratón preparadas por el método del ejemplo 8 se preparó a 1.5 x 105 células/ml en medio a-MEM que contenía 10% de FBS y 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D System, Inc.), y la preparación de células resultante se sembró en cada pozo de una placa de 96 pozos en una cantidad de 200 µ? y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora con CO2. La solución de cultivo viejo en la placa de 96 pozos fue removida, y 100 µ? de medio MEM-a se añadió a cada pozo, los 100 µ? de medio MEM-a que contenía 10% FBS al cual se habían añadido RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales de 20 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo de células, cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-ratón Siglec-15 de ratas producido en el ejemplo 6, una muestra obtenida al remover azida de sodio de IgG de control de rata comercialmente disponible (IgG de rata purificado, fabricado por l¡ &D í Systems, Inc.), o un anticuerpo policlonal anti-ratón Siglec-15 (No. 3) de conejo producido por separado se añadió a una concentración de 32 a 1 ,000 ng/ml, y las células se cultivaron durante 3 días adicionales en una incubadora de CO2. Incidentalménte, el anticuerpo policlonal (No. 3) es un anticuerpo que ya se ha confirmado que inhibe la formación de osteoclastos en el sistema experimental descrito en este ejemplo. Después de completarse el cultivo, la actividad de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados se midió por un procedimiento descrito más adelante. La solución de cultivo en cada pozo de la placa de 96 pozos fue removida por succión, y 50 µ? de 50 mWI citrato de sodio regulador de pH (pH 6.1) que contenía 1% de Tritón X-100 se añadió a cada pozo. Después, la placa se agitó durante 5 minutos sobre un agitador de placa para lisar las células. A cada pozo, 50 µ? de una I solución de sustrato (50 mM citrato de sodio regulador de pH (pH 6.1) que contenia 5 mg/ml de p-nitrofenil fosfato y 0.46% de tartrato de sodio) se añadió, y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos.

Después de la incubación, 50 µ? de una solución de hidróxido de sodio 1 N se añadió a cada pozo de la placa de 96 pozos para detener la reacción enzimática. Después de detener la reacción enzimática, una absorbancia de cada pozo a 405 nm se midió, y la medición obtenida se usó como un índice de actividad de TRAP. Los resultados se muestran en las figuras 5A-5D y 6A- 6D. Una inhibición significativa de actividad de TRAP no se observó en el caso de la IgG de control de rata comercialmente disponible. Por otra parte, juna inhibición significativa de actividad de TRAP se observó en el caso del anticuerpo #32A1 añadido en el intervalo de 32 ng/ml a 1000 ng/ml, y el anticuerpo #8A1 y el anticuerpo policlonal No. 3 de conejo purificado en cuanto a afinidad añadido en el intervalo de 63 ng/ml a 1000 ng/ml. También en el caso del anticuerpo #3A1 , anticuerpo #34A1 y anticuerpo #39A1 , una I inhibición de actividad de TRAP dependiente de la dosis se observó a i una concentración relativamente alta de 500 ng/ml o superior. No se observó inhibición de formación de osteoclastos de ratón por lo otros anticuerpos. De los resultados anteriores, los anticuerpos que inhiben fuertemente la formación de osteoclastos de ratón (diferenciación y maduración de osteoclastos) se encontraron entre el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec- 15 de ratas preparado. Además, como una propiedad común al anticuerpo #3A1 , anticuerpo #8A1 , anticuerpo #32A1 , anticuerpo #34A1 , y anticuerpo #39A1 , la actividad de inhibir la formación de osteoclastos a ; una concentración de 1000 ng/ml, es decir, 1 µg/ml o menor se puede ejemplificar.

EJEMPLO 10 Producción de constructo de expresión de proteína Siglec- 5 humana soluble Una secuencia parcial de nucleótidos que codifica el dominio extracelular de proteina Siglec-15 humana está representada por SEQ ID NO: I 15 en el listado de secuencias y la secuencia de aminoácidos de la misma está representada por SEQ ID NO: 16 en el listado de secuencias. Al utilizar dicha secuencia parcial, la proteína Siglec-15 humana soluble puede ser producida en un sobrenadante de cultivo de una célula animal o similar. a) Amplificación de gen de Siglec-15 humano soluble por PCR Como iniciadores para amplificar el ADNc extracelular del dominio de Siglec-15 humano por PCR, un oligonucleótido que tenia una secuencia de 5'-ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt caccATGGAA AAGTCCATCT GGCTGC-3' (hSiglec-15-ECD-F: SEQ ID NO: 17 en el listado de secuencias); y un oligonucleótido que tenía una secuencia de 5'- ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc CCCGCTGGCG CCATGGAAGC Gp-3' (hSiglec-15-ECD-R: SEQ ID NO: 18 en el listado de secuencias) se sintetizaron de conformidad con un procedimiento común. Incidentalmente, estos iniciadores fueron diseñados, como iniciadores de amplificación para producir un clon de entrada de Gateway, de tal manera que una secuencia de attB1 se añade a hSiglec-15-ECD-F y una secuencia de attB2 se añade a hSiglec-15-ECD-R. La PCR se realizó usando esta combinación de iniciadores y un polinucleótido que contenía una secuencia de lectura abierta de la Siglec- 15 humana como una plantilla de conformidad con un procedimiento común.

La solución de reacción de PCR resultante fue purificada usando PuréLink PCR Purificación Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.). j b) Producción de clon de entrada por reacción de Gateway BP Un clon de entrada en el cual el ADNc extracelular del dominio de Siglec-15 humano fue integrado por la tecnología Gateway (Invitrogen, Inc.) utilizando un sistema de recombinación específico del sitio de fago lambda fue producido por el siguiente método. Primero, una reacción de BP usando BP Clonase se realizó entre el producto de PCR que tenía una secuencia de attB en ambos extremos producida en a) y pDNOR221 (fabricado por Invitrogen, Inc.) que es un vector donador que tenía una secuencia de attP. Al usar esta solución de reacción, Escherichia coli TOP10 fue transformada, se realizó PCR de colonia para clones resistentes a fármacos, y el tamaño de los insertos fue confirmado. Después, para un clon que se confirmó que tenía un inserto con el tamaño correcto, se realizó un I análisis de secuencia de la secuencia de ADN total del inserto. Como resultado, se obtuvo un clon de entrada que es completamente idéntico a la secuencia objetivo de nucleótidos (SEQ ID NO: 15 en el listado de secuencias) que codifica el dominio extracelular de la proteína Siglec- 5 humana. c) Producción de clon de expresión por reacción de Gateway LR Un clon de expresión en el cual el ADNc extracelular del dominio de Siglec-15 humano fue integrado por la tecnología Gateway (Invitrogen, Inc.) utilizando un sistema de recombinación específico del sitio de fago lambda fue producido por el siguiente método. El clon de entrada producido en b) contenia un inserto que tenía una secuencia de attL en ambos extremos. Una reacción de LR usando LR Clonase se realizó entre este clon de entrada y dos tipos de vectores de destino que tenían una secuencia de attR. Incidentalmente, como los vectores de destino, dos tipos de vectores de destino: pDONM diseñados de tal manera que una etiqueta de epítope V5 y una His tag 6x se añaden al C terminal del inserto; y phlgFc diseñados de tal manera que una etiqueta Fe humana se añade al C terminal del inserto, se usaron. Al usar la solución de reacción obtenida por la reacción LR, Escherichia coli TOP10 fue transformada, y un análisis de secuencia se realizó para los clones resistentes a fármacos resultantes para confirmar si ocurrió recombinación correcta.

Como resultado del análisis de secuencia, se obtuvieron clones de expresión (Siglec-15/pDONM humano soluble y Siglec-15/phlgFc humano soluble) en el cual ocurrió recombinación correcta tanto para pDONM como para phlgFc, respectivamente. Al transfectar el Siglec-15/pDONM humano soluble en una célula animal o similar, ARNm que tenía una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 19 en el listado de secuencias es transcrita y traducida en una proteína (Siglec- 5-His humana) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 20 en el listado de secuencias. Además, al transfectar el Siglec-15/phlgFc humano soluble en una célula animal o similar, ARNm que tiene una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 21 en el listado de secuencias es transcrita y traducida en una proteina (Siglec-15-Fc humana) que tiene una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 22 en el listado de secuencias. i EJEMPLO 11 Preparación a gran escala de solución de cultivo que contiene soluble proteina Siglec-15 humana usando células 293-F a) Preparación de solución de cultivo que contiene Siqlec-15-His humana La Siglec-15/pDONM humana soluble obtenida en el ejemplo 10 se preparó en una cantidad de aproximadamente 25 mg. Incidentalmente, en la purificación de plásmidos de Escherichia coli cultivada a gran escala, se usó un kit Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.). El plásmido así preparado se mezcló con Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), 50 mi de reactivo de transfección 293fect¡n (fabricado por Invitrogen, Inc.) se añadió al mismo, y la mezcla resultante se I incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esta mezcla se añadió a células FreeStyle 293-F (fabricado por Invitrogen, Inc.) cultivadas en medio de expresión FreeStyle 293 Expression Médium (fabricado por Invitrogen, Une.) que contenia 1 % de penicilina-estreptomicina de tal manera que la densidad de células alcanzó 1.0 a 3.4 x 106 células/ml usando un aparato de cultivo de bioproceso 25 L (WAVE Bioreactor). Después de que las células habían sido sometidas a cultivo con agitación (30 rotaciones/min) a una concentración de CO2 de 6 a 12% durante 96 horas (4 días) a 37°C, la solución de cultivo se recolectó y se centrifugó para preparar un sobrenadante de cultivo. < Se observa que en el sobrenadante de cultivo así preparado, una proteína en la cual una etiqueta de epítope V5 y una His tag 6x se han añadido al lado C- terminal del dominio extracelular Siglec-15 humano (Siglec-15-His humana) es expresada.

I b) Preparación de solución de cultivo que contenia Siqlec-15-Fc humana La Siglec-15/phlgFc humana soluble obtenida en el ejemplo 10 se preparó en una cantidad de aproximadamente 5 mg. Incidentalmente, en la purificación de plásmidos de Escherichia coíi cultivada a gran escala, se usó un kit Invitrogen PureLink HiPure Plasmid Gigaprep Kit (fabricado por Invitrogen, Inc.). El plásmido así preparado se mezcló con Opti-MEM (fabricado por Invitrogen, Inc.), seguido por esterilización en filtro. Después, 10 mi de un reactivo de transfección 293fectin (fabricado por Invitrogen, Inc.) se añadió al mismo, y la mezcla resultante se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. Esta mezcla se añadió a células FreeStyle 293-F (fabricado por Invitrogen, Inc.) cultivadas en matraces Erlenmeyer de tal manera que la densidad de células alcanzó 1.0 a 3.0 x 106 células/ml x 5 L (1 L/matraz x 5 matraces) en medio de expresión FreeStyle 293 (fabricado por Invitrogen, Inc.). Después de que las células habían sido sometidas a cultivo con agitación (125 rotaciones/min) a una concentración de CO2 de 8.0% durante 96 horas (4 días) a 37°C, la solución de cultivo se recolectó y se centrifugó para preparar un sobrenadante de cultivo. Se observa que en el sobrenadante de cultivo asi preparado, una proteína en la cual una etiqueta Fe humana se ha añadido al lado C-terminal del dominio extracélular Siglec- 15 humano (Síglec-15-Fc humana) es expresada.

EJEMPLO 12 I Purificación de proteína Siglec-15 humana soluble a) Purificación de Siglec-15-His humana soluble a-i) Cromatografía en columna HisTrap HP A 12 L de la solución de cultivo de células 293F que expresan Siglec-15-His humana preparada en a) del ejemplo 1 , 1350 mL de ,10 x regulador de pH (500 mM Tris, 1.5 M NaCI, 200 mM imidazol, pH 8.0) se añadió, y la mezcla resultante se agitó bien y se filtró a través de un: filtro MilliPak-60 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). Esta solución de cultivo se aplicó a una velocidad de flujo de 10 ml/min a una columna Ni-Sepharose HP (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) de 100 mi que previamente había sido lavada con agua pura (Milli-Q water). Después de que la columna había sido lavada con 400 mi de regulador de pH Tris-HCI 50 mM (pH 8.0) que contiene 300 mM NaCI a una velocidad de flujo de 8 mL/min, una proteína adsorbida a la columna se eluyó con 200 mi de regulador de pH 50 mM Tris-HCI (pH 8.0) que contenía 300 mM NaCI y 500 mM imidazol a una velocidad de flujo de 2.5 ml/min, y el material eluido fue fraccionado en tubos mini-sorp (fabricado por Nunc, Inc.). Para prevenir la precipitación de la proteína, 8 mi de una solución NaCI 5 M se añadió a aproximadamente 40 mi de una fracción que contenía la proteína eluida, seguida por agitación, y después la mezcla resultante se concentró a aproximadamente 20 mi con un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.). El material insoluble generado durante la concentración fue removido por centrifugación a 3000 rpm durante 30 minutos a 4°C, y 2:5 mi del sobrenadante resultante se aplicó a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con solución salina regulada en su pH con fosfato que contenía 1 M NaCI (N-PBS), seguido por elución con N-PBS, por lo que 3.5 mi de una muestra cuyo solvente fue reemplazado por N-PBS se obtuvo. Este procedimiento se realizó repitiéndolo 7 veces más, y se obtuvo aproximadamente 28 mi de una solución de Siglec-15-His humana parcialmente purificada. a-ii) Cromatografía en columna Resource Q 12 mi de la muestra que habla sido purificada por cromatografía en columna Ni-Sepharose HP y cuyo solvente había sido reemplazado por ÑIPEIS se dializó durante la noche a 4°C contra regulador de pH Tris-HCI 50 mM (pH 7.5) que contenía 0.1 % CHAPS (1 L, 3 veces) y el dializado resultante se centrifugó a 3,000 rpm durante 30 minutos a 4°C, y el precipitado fue removido. Después de que el sobrenadante resultante se había filtrado a través de un filtro Millex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el filtradp se aplicó a una velocidad de flujo de 1 ml/min a una columna Resource Q 6 mi (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con regulador de pH Tris-HCI 50 mM (pH 7.5) que contenía 0.1 % CHAPS. Por lo tanto, la columna se lavó con este regulador de pH a una velocidad de flujo de 1 ml/min y una fracción de proteína que no fue adsorbida a la columna fue recolectada. Una proteína adsorbida a la columna se eluyó con regulador de pH Tris-HCI 50 mM (pH 7.5) que contiene 0.1 % CHAPS y NaCI 1 M a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Después de que 26.5 mi de la fracción que no había sido adsorbida a la columna se concentró a 3.0 mi con un concentrador de membrana centrífuga Amicon Ultra-15 (fabricado por Millipore Co., Ltd.), el concentrado se centrifugó a 3,000 rpm durante 10 minutos a 4°C y el precipitado fue removido. 2.5 mi del sobrenadante resultante se aplicó a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con solución salina regulada en su pH con fosfato que contiene clorhidrato de arginina 50 mM (pH 7.0, A-PBS), seguido por elución con A-PBS, por lo que 3.5 mi de una muestra cuyo solvente fue reemplazado por A-PBS se obtuvo. El clorhidrato de arginina en el solvente de la muestra preparada se añadió a fin de prevenir Siglec-15-His humana soluble a partir de precipitación. El sobrenadante después de la centrifugación fue crioconservado a -80°C hasta usarse. El procedimiento de purificación antes mencionado (cromatografía en columna Resource Q) se realizó al repetirlo dos veces. purificada Al usar una muestra preparada por el procedimiento, de purificación antes mencionado (cromatografía en columna Ni-Sepharose HP y cromatografía en columna Resource Q), se realizó electroforesis de SDS-poliacrilamida bajo condiciones reductoras y tinción con plata. Es decir, a 5 µ? de cada una de las muestras purificada por los pasos de purificación respectivos, una cantidad equivalente de una solución de tratamiento de SDS se añadió, y la mezcla resultante se trató térmicamente a 95°C durante 10 minutos. 0.3 µ? de cada una de las muestras térmicamente tratadas se usó para electroforesis de SDS-poliacrilamida. El procedimiento de electroforesis se realizó de la misma manera que en el ejemplo 3 excepto que Rainbow Molecular Weight Markers (fabricado por Amersham Biosciences, lnc.|) se usaron como los marcadores de peso molecular. Después de completarse la electroforesis, se realizó tinción con plata usando un kit PhastGel Silver Kit (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) y PhastSystem. Los resultados se muestran en la figura 7. Se mostró que una proteina que tenia un peso molecular de aproximadamente 35 kDa (human Siglec-15-His) fue eficientemente purificada y concentrada en la fracción de proteína que no fue adsorbida a la columna Resource Q. a-iv) Medición de concentración de proteina de Siglec-1 5-His humana purificada Para la S¡glec-15-His humana purificada (la fracción de proteina que no fue adsorbida a la columna Resource Q), la concentración de proteina se midió con un kit de prueba de proteína DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albúmina de suero de bovino como una muestra estándar. Al realizar el procedimiento de purificación dos veces, se obtuvo un total de 1.66 mg de Siglec-15-His humana purificada. b) Purificación de Siglec-15-Fc humana soluble b-i) Proteina en columna HiTrap Protein A 1 .5 L de la solución de cultivo de células 293F que expresan Siglec-15-Fc humana preparada en b) del ejemplo 11 se filtró a través de un filtro Sterivex-GV (fabricado por Millipore Co., Ltd.), y después el filtrado se aplicó a una velocidad de flujo de 5 ml/min a una columna HiTrap Protein A 5 mi (fabricado por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con PBS de Dulbecco (D-PBS, fabricado por Invitrogen, Inc.).

Después de que la columna había sido lavada con 70 mi de D-PBS a una velocidad de flujo de 5 ml/min, una proteína adsorbida a la columna se eluyó con 24 mi de 0.1 M citrato de sodio regulador de pH (pH 3.0) a una velocidad de flujo de 1.2 ml/min. El material eluido se fraccionó a 1.2 mi por fracción en tubos míni-sorp (fabricado por Nunc, Inc.), e inmediatamente después, 0.31 mi de 1 M Tris se añadió al mismo para neutralizar el material eluido. Una alícuota de 2.5 mi de una solución (aproximadamente 7.5 mi) obtenida al combinar las fracciones de proteína eluida (fracciones 5 a 9) se aplicó a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con solución salina regulada en su pH con fosfato que contenía clorhidrato de arginina 50 mM (pH 7.0, A-PBS), seguido por elución con A-PBS, por lo que se obtuvo 3.5 mi de una muestra cuyo solvente fue reemplazado por A-PBS. Este procedimiento se realizó al repetirlo dos veces. El clorhidrato de arginina en el solvente se añadió para evitar que Siglec-15-Fc humana soluble se precipitara. 2.5 mi de la solución restante de las fracciones de proteína eluidas (fracciones 5 a 9) se aplicó a una columna de desalación PD-10 (fabricada por Amersham Biosciences, Inc.) que previamente había sido equilibrada con solución salina regulada en su pH con fosfato que contenía NaCI 1 M (pH 6.7, N-PBS), seguido por elución con N-PBS, por lo que se obtuvo 3.5 mi de una muestra cuyo solvente fue reemplazado por N-PBS. NaCI en el solvente en la muestra preparada se añadió para evitar que Siglec-15-Fc humana soluble se precipitara sin añadir un grupo amino que contenía compuestos tales como arginina. Las muestras i preparadas por el procedimiento antes mencionado fueron crioconservadas a -80°C hasta usarse.

I b-ii) Detección y prueba de pureza de Siglec-15-Fc humana purificada Al usar las muestras preparadas por el procedimiento ! de purificación antes mencionado, se realizaron electroforesis de SDS- poliacrilamida bajo condiciones reductoras y tinción con plata. Es decir, a 5 µ? de cada una de las muestras purificada por los pasos de purificación respectivos, una cantidad equivalente de una solución de tratamiento de SDS se añadió, y la mezcla resultante se calentó a 95°C durante 10 minutos. 0.3 µ? de una muestra obtenida al diluir cada una e las muestras térmicamente tratadas a 1/100 ó 1/300 con una mitad de la concentración de la solución de tratamiento con SDS se usó para electroforesis de SDS-poliacrilamida. La electroforesis y tinción con plata se realizaron de la misma manera que la prueba de pureza de Siglec-15-His human descrita en a-iii). Los resultados se muestran en la figura 8. Se mostró que una proteina que tenia un peso I molecular de aproximadamente 55 kDa (Siglec-15-Fc humana) fue eficientemente purificada y concentrada en la fracción de proteína que se eluyó de la columna de HiTrap Protein A. I b-iii) Medición de concentración de proteina de Siglec-15-Fc purificada humana Para la Siglec-15-Fc humana purificada (la fracción de proteína eluida de la columna de desalación de PD-10), la concentración de proteína se midió con un kit de prueba de proteina DC (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) usando albúmina de suero de bovino como una muestra estándar. Como se muestra en el cuadro 4, un total de 25.2 mg de Siglec-15-Fc purificada humana se obtuvo al realizar el procedimiento de purificación dos veces. i CUADRO 4 EJEMPLO 13 Evaluación de propiedad de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata que se une a proteína Siglec-15 humana La propiedad del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata que se une a proteina Siglec-15 humana se evaluó por un método de ELISA. La proteína Siglec-15-Fc humana (sometida a reemplazo con A-PBS) producida en b) del ejemplo 12 se diluyó a 5 µ9/??? con un regulador de pH de carbonato de sodio 0.1 M (pH 9.5), y la solución resultante se añadió a una placa de 96 pozos (fabricado por Nalge Nunc International, Inc., Cat. No. 430341 ) a 100 µ?/????. Después de que la placa se había dejado a temperatura ambiente durante 1 hora, la solución fue removida y un regulador de pH de lavado (solución salina regulada en su pH con fosfato que contenía 0.05% de Tween 20) se añadió a 300 µ?/???? y después se removió. Después de que este procedimiento de lavado se había realizado una vez más, la solución salina regulada en su pH con fosfato que contenía 25% de BlockAce (fabricado por Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.) se añadió a 200 µ?/????, y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora, por lo que se realizó el bloqueo. El líquido fue removido, y la placa se lavó dos veces con 300 µ?/???? del regulador de pH de lavado. Después, cada uno del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de ratas preparado en el ejemplo 6 o IgG de control de rata (fabricado por R&D Systems, Inc.) se diluyó a una concentración final de 1.28 a 20,000 ng/ml (series de dilución de 5 veces) con un regulador de pH de ELISA (solución salina regulada en su pH con fosfato que contenia 12.5% de BlockAce y 0.05% de Tween 20), y la solución de anticuerpo diluida se añadió a la placa a 100 µ?/????. Después de que la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora, el líquido fue removido, y la placa se lavó 3 veces con 300 µ?/???? del regulador de pH de lavado.

Subsecuentemente, un anticuerpo de IgG anti-rata de cabra careado con HRP (peroxidasa de rábano picante) (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) diluido a 1 ,000 veces con un regulador de pH de ELISA se añadió a 100 µ?/????, y la placa se dejó a temperatura ambiente durante 1 hora. El líquido fue removido y la placa se lavó 3 veces con 300 µ?/???? del regulador de pH de lavado, y después, usando un kit de revelado de color para peroxidasa (fabricado por Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), el color fue revelado de conformidad co¡n el protocolo que acompañaba al kit. Después de revelar el color, una absorbancia a 492 nm se midió usando un lector de microplaca (fabricado por Nihon Molecular Devices Corporation). Como resultado, se confirmó que todas las 10 muestras de prueba examinadas del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de ratas se unen a la proteína Siglec-15 humana de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo (figura 9). En particular, la actividad de unión de 5 muestras de prueba, a saber #1A1 , #3A1 , #24A1 , #32A1 y #61 Al , fue alta, y la actividad de unión de 3 muestras de prueba, a saber #8A1 , #34A1 y #39A1 , fue relativamente baja. Por otra parte, en el caso de la IgG de control de rata, no se observó la unión a la proteína Siglec-15 humana. De los resultados anteriores, se mostró que el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de ratas preparado en el ejemplo 6 se une no sólo a Siglec-15 de ratón, sino también a Siglec-15 humana, y además, se encontró que algunos anticuerpos se unen fuertemente a Siglec-15 humana.

EJEMPLO 14 Efecto de la adición de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata sobre la fusión celular y actividad de resorción de hueso de células precursoras de osteoclastos humanos normales (evaluación de actividad biológica ¡n vitro) Puesto que se confirmó que el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de ratas se une también a Siglec-15 humana en el ejemplo 13, los i efectos de estos anticuerpos sobre la formación de osteoclastos humanos y la actividad de resorción de hueso se examinaron. a) Efecto de la adición de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata sobre la fusión celular de los osteoclastos a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales (tinción TRAP) Células precursoras de osteoclastos humanos normales (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, compradas de Sanko Junyaku Co, Ltd., Cat. No. 2T-110) se sembraron en una placa de 96 pozos a 1 x 104 células/pozo de conformidad con el protocolo que acompaña las células.

Como el medio, se usó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT- 8201 ) complementadas con un conjunto de complemento de O GM (comprado de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501 ) que contenia suero de bovino fetal (concentración final: 10%), RANKL humana (concentración final: 66 ng/ml), M-CSF humana (concentración final: 33 ng/ml), y similares. Al sobrenadante de cultivo resultante, cada uno del anticuerpo monoclonal antiratón Siglec- 5 de ratas preparado en el ejemplo 6 o IgG de control de rata (fabricado por R&D Systems, Inc.) se añadió para dar una concentración final de 30 µg/ml, y las células se cultivaron durante 4 días en una incubadora de CO2. Después del cultivo, el sobrenadante fue removido, y 10% de formalina neutra se añadió para fijar las células. Después de fijar las células, las células i i se lavaron dos veces con agua destilada, una solución de tinción de TRAP (0.27 mM naftol AS-MX fosfato (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1.6 mM sal de violeta rojo resistente (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1% de dimetilformamida, 50 mM tartrato de sodio, 0.1 M regulador de pH de acetato de sodio (pH 5.0)) se añadió a 100 µ?/????, y una reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción, las células se lavaron dos veces con agua destilada, y después se observaron por microscopía (figuras 10A-10E). Como resultado, la formación de osteoclastos gigantes que resultan de un alto grado de fusión celular fue casi completamente inhibido mediante la adición del anticuerpo #32A1. Adeijnás, en el caso del anticuerpo #41 A1 , la formación de osteoclastos gigantes que resultan de un alto grado de fusión celular también fue significativamente inhibida. Por otra parte, en el caso de los otros anticuerpos monoclonal antiratón Siglec-15 de ratas (el anticuerpo #1A1 y otros) y la IgG de control de rata, no se observó la inhibición significativa de osteoclasto de fusión celular. De esta manera, se reveló que la multinucleación y fusión celular de osteoclastos TRAP-positivos a partir de células precursoras de osteoclastos humanos normales son inhibidas por anticuerpos monoclonales que se Unen específicamente a la proteina Siglec-15.

I b) Efecto de la adición de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siqlec-15 de rata (#32A1) sobre la fusión celular de osteoclastos a partir de i células precursoras de osteoclastos humanos normales (tinción TRAP) Células precursoras de osteoclastos humanos normales (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) se sembraron en una placa de 96 pozos a 1 x 104 células/pozo de conformidad con el protocolo que acompaña las células.

Como el medio, se usó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT- 8201) complementadas con un conjunto de complemento de OPGM (comprado de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501) que contenia suero i de bovino fetal (concentración final: 10%), RANKL humana (concentración final: 68.4 ng/ml), M-CSF humana (concentración final: 33 ng/ml), y similares.

Al sobrenadante de cultivo resultante, el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1 ) preparado en el ejemplo 6 se añadió para dar una concentración final de 0.1 , 0.3, 1 ó 3 µg/ml, y las células se cultivaron durante 3 días en una incubadora de C02. Después del cultivo, el sobrenadante fue removido, y 10% de formalina neutra se añadió para fijar las células. Después de fijar las células, las células se lavaron dos veces con agua destilada, una solución de tinción de TRAP (0.27 mM naftol AS-MX I fosfato (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1.6 mM sal de violeta rojo resistente LB (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1% de dimetilformamida, 50 mM tartrato de sodio, 0.1 M regulador de pH de acetato de sodio (pH 5.0)) se añadió a 100 µ?/????, y una reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción, las células se lavaron dos veces con agua destilada, y después se observaron por microscopía (figuras 1 1A-11 E). Como resultado, la formación de osteoclastos multinucleados TRAP-positivos fue i inhibida de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo #32A1 dentro del intervalo de 0.3 µ?/??? a 3 glvn . i c) Efecto de la adición de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (#32A1) sobre la actividad de resorción de hueso de células precursoras de osteoclastos humanos normales (Evaluación usando placa revestida con colágeno) Se sabe que los osteoclastos liberan una proteasa tal como catepsina K y degradan colágeno de tipo I que es un componente constitucional de tejido óseo. El OsteoLyse Assay Kit (fabricado por Lonza, Inc., Cat. No. PA-1500) provee una placa de 96 pozos revestida con colágeno humano conjugado con europio (placa de cultivo de células de 96 pozos OsteoLyse), y es posible evaluar la actividad de resorción de hueso de osteoclastos in vitro al medir la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente liberados en el sobrenadante cuando los osteoclastos son cultivados en la placa. Células precursoras de osteoclastos humanos normales (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-1 10) se sembraron en una placa de cultivo de células de 96 pozos OsteoLyse a 1 x 104 células/pozo de conformidad con de conformidad con el protocolo que acompaña las células.

Como el medio, se usó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT- 8201 ) complementadas con un conjunto de complemento de OPGM i (comprado de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501 ) que contenía suero de bovino fetal (concentración final: 10%), RANKL humana (concentración final: 68.4 ng/ml), M-CSF humana (concentración final: 33 ng/ml), y similares.

Al sobrenadante de cultivo resultante, el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6 se añadió para dar una concentración final de 0.1 , 0.3, 1 ó 3 µg/ml, y las células se cultivaron durante 3 días en una incubadora de CO2. Una alícuota de 10 µ? del sobrenadante de cultivo fue recolectada, y 200 µ? de reactivo de liberación de fluoróforo incluido en el OsteoLyse Assay Kít se añadió al mismo, y una intensidad de fluorescencia se midió (Excitación: 340 nm, Emisión: 615 nm) i usando un lector de placa de fluorescencia (ARVO MX, fabricado por Pérkin Elmer Inc.), por lo que la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente libres liberados en el sobrenadante de cultivo se determinó (figura 12). Gomó resultado, la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente incrementada mediante la adición de RANKL fue reducida por el anticuerpo #32A1 de una manera dependiente de la concentración dentro del intervalo de 0.3 µ?/?t?? a 3 µ9/G??. A partir de este resultado, se reveló que la actividad de resorción de hueso de osteoclastos humanos es inhibida por el anticuerpo monoclonal estudiado que se une específicamente a la proteina Siglec-15. ' EJEMPLO 15 Evaluación de actividad biológica de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata usando ratas ovariectomizadas a) Protocolo de experimento con animales ¡ Los ovarios en ambos lados fueron removidos de ratas F344 hembras (obtenidas de Charles River Laboratories Japan, Inc.) de 12 semanas de edad, y las ratas se dividieron en tres grupos: un grupo de administración de vehículo; un grupo de administración de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #8A1 ; y un grupo de administración de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1. Además, un grupo se preparó como un grupo de operación simulador. En los grupos de administración de anticuerpo, el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #8A1 o el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 preparado en el ejemplo 6 se administró intraperitonealmente a una dosis de 1 mg/kg tres veces a la semana repetidamente durante 4 semanas desde el día siguiente de la operación. En el grupo de administración de vehículo y el grupo de operación simulador, PBS que contenia 0.01 % de Tween 20 se administró intraperitonealmente como el vehículo. A 4 semanas después del inicio de la administración, la orina fue recolectada durante 24 horas bajo condiciones de ayunas, y las muestras de orina se almacenaron a -80°C hasta medición. Después de completarse la recolección de orina, las ratas fueron sacrificadas, y la espina lumbar se extirpó de cada rata b) Medición de densidad de minerales de hueso de espina lumbar | Los tejidos blandos adheridos a la espina lumbar extirpada se removieron, y la 4a. a 6a. vertebras lumbares fueron extraídas. Las vertebras lumbares extraídas fueron desgrasadas y deshidratadas al ser agitadas en etanol y después secadas con aire, y la densidad de minerales de hueso se midió usando un densitómetro de hueso (DCS-600EX, fabricado por Aloka Co.( Ltd.). Los resultados se muestran en la figura 13A. Una disminución significativa en densidad de minerales de hueso de la espina lumbar se observó en el grupo ovariectomizado como se comparó con el grupo de operación simulador, sin embargo, en los grupos de administración de anticuerpo #8A1 y #32A1 , una disminución en densidad de minerales de hueso debida a ovariectomía fue significativamente inhibida. c) Medición excreción de desoxipiridinolina Una variedad de metabolitos entrelazados de colágeno de tipo I refleja agudamente el recambio metabólico de hueso, particularmente ! I resorción de hueso. Por sobre todo, la desoxipiridinolina está localizada principalmente en colágeno de hueso, y por lo tanto, se considera que es altamente confiable como un índice de resorción de hueso.

La muestra de orina crioconservada fue descongelada, y el material insoluble se precipitó por una operación centrífuga, por lo que se obtuvo un sobrenadante. La cantidad de desoxipiridinolina contenida en ,este sobrenadante se midió usando Osteolinks "DPD" (fabricado por DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Además, usando Creatinine Test Wako (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.), el contenido de creatinina en el i sobrenadante también se midió, y se calculó la cantidad de desoxipiridinolina corregida para creatinina. Los resultados se muestran en la figura 13B. La excreción de desoxipiridinolina urinaria fue significativamente increentada en el grupo ovariectomizado en comparación con el grupo simulador, y por lo tanto, se indicó que en las ratas ovariectomizadas, la resorción osteoclastica j de hueso es incrementada. Por otra parte, en los grupos de administración de anticuerpo #8A1 y #32A1, un incremento en excreción de desoxipiridinolina debido a ovariectomía fue inhibido de tal manera que el nivel de excreción de desoxipiridinolina fue comparable con el del grupo de operación de simulación. A partir de este resultado, también se confirmó en los modelos animales que los anticuerpos monoclonales estudiados que se unen específicamente a Siglec-15 inhiben la resorción osteoclastica de hueso, y se indicó fuertemente que debido al efecto inhibidor sobre la resorción de hueso, una disminución en densidad de minerales en hueso de la espina lumbar en las ratas ovariectomizadas fue inhibida. i EJEMPLO 16 Determinación del sitio de unión (epítope) de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata a) Expresión y purificación de dominio Siglec-15 V-set humano Un ADN que codifica una proteína en la cual una His tag y una secuencia de reconocimiento de trombina se fijaron al lado N-terminal de un dominio Siglec-15 V-set humano (un polipétido que comprende 39 a 165 residuos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos en la base de datos NCBI Protein con el número de acceso de NP_998767 o una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias) fue integrada en un vector pDEST14 (Invitrogen, Inc., Cat. No. 1801-016). Al usar este plásmido, Escheríchia coli Rosetta-gamiB (DE3) (Novagen, Inc., Cat.

No. 71 136-4) fue transformada y cultivada en un medio TB (Invitrogen, Inc., Cat. No. 2271 1-022). Después del cultivo, las células bacterianas fueron homogeneizadas por ultrasonido, el homogenado resultante fue centrifugado, y el sobrenadante fue purificado con una columna HisTrap HP (GE Healthcare, Co., Ltd., Cat. No. 17-5247-01 ). Por lo tanto, la His tag fue digerida con trombina, y después el dominio Siglec-15 V-set humano fue I purificado usando una columna Mono S5/50 GL (GE Healthcare, Co., Ltd . , Cat. No. 17-5168-01) y una columna Superdex 75 10/300 (GE Healthcare, Co., Ltd., Cat. No. 17-5174-01 ) hasta que una banda sencilla con un peso molecular de 14 kDa se obtuvo por electroforesis. b) Purificación de Siqlec- 5-Fc humana soluble La Siglec-15-Fc humana soluble fue purificada por el método descrito en el ejemplo 12. c) ELISA competitiva de dominio V-set humano y anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec- 5 de rata #32A1 ¡ En una placa maxi-sorp de 96 pozos (fabricada por Nunc, Inc., número de modelo: 442404), 100 µ? de un anticuerpo FC anti-human de cabra (Jackson ImmunoResearch, Inc., número de modelo: 109-005-098) (1.25 µg/ml) se añadió a cada pozo y fue inmovilizado durante la noche a 4°C. Después de que la placa maxi-sorp de 96 pozos se lavó dos veces con PBS, 100 µ? de la Siglec-15-Fc humana soluble (1 µg/ml) se añadió a cada pozo e inmovilizada a temperatura ambiente durante 1 hora. Por lo tanto, 300 µ? de una solución al 5% de leche descremada/PBS se añadió a cada pozo, y el bloqueo de los pozos se realizó a temperatura ambiente durante 3 horas. Mientras tanto, 2 µg/ml del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 se mezcló con una cantidad equivalente de 0, 0.032, 0.16, 0.8, 4 p 20 µg/ml del dominio Siglec-15 V-set humano, y una reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 1.5 horas. Después de que la placa maxi-sorp de 96 pozos había sido lavada dos veces con PBS, 100 µ? de la solución mixta de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 y el dominio Siglec-15 V-set humano se añadió al mismo, y una reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de que la placa maxi-sorp de 96 pozos se había lavado 5 veces con una solución de 0.05% de Tween 20 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Cat. No. 170-6531)/PBS (de aquí en adelante referida como "solución de PBST"), 100 µ? de un anticuerpo anti-rata IgG de cabra marcado con HRP (Beckman Coulter, Inc., Cat. No. 732664, diluidas a 2000 veces) se añadió a las mismas, y una reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de que la placa había sido lavada 5 veces con la solución, de PBST 100 µ? de un líquido de revelado de color de ELISA POD Substrate ABTS Kit (Nacalai Tesque Co., Ltd., Cat. No. 14351-80) se añadió a la misma, y una reacción se dejó proceder durante 30 minutos. Después, 100 µ? de una solución de detención de reacción se añédió a la misma, y una absorbancia a 405 nm se midió. Los resultados de ELISA competitiva mostró que la unión del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 a la Siglec-15 humana inmovilizada es inhibida en un dominio V-set humano de una manera dependiente de la concentración. Por consiguiente, se mostró que el epítope para el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 es el dominio Siglec-15 V-set humano (un dominio que comprende 39 a 165 residuos de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos en la base de datos NCBI Protein con el número de acceso I de NP_998767 o una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID I NO: 2 en el listado de secuencias) (figura 14).

EJEMPLO 17 Amplificación de ADNc que codifica la región variable de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 y análisis dé secuencia de bases de la misma i a) Preparación de ARNm | El hibridoma #32A1 fue cultivada de conformidad con a) del 7 i ejemplo 6. De 4 x 10 células del hibridoma #32A1 , aproximadamente 65 µg de ARNm se preparó usando un kit de purificación de ARNm QuickPrep (GE Healthcare, Co., Ltd.). b) Síntesis de ADNc (5'-RACE-Readv cDNA) ¡ La síntesis de ADNc (5'-RACE-Ready cDNA) se realizó usando 0.3 µ9 del ARNm preparado en a) con PrimeScript Reverse Transcriptase (TaKaRa Bio, Inc.) y SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Co., Ltd.). ? c) Amplificación de ADNc de región variable de cadena pesada de gen #32A1 por 5'-RACE PCR Como iniciadores para amplificar el ADNc de la región variable del gen de cadena pesada #32A1 por PCR, se usaron UPM (Universal Primer A Mix, unido al SMART RACE cDNA Amplification Kit) y un oligonucleótido que tiene una secuencia de ¡ 5'- GGCCGGGTGGGCTACGTTGCAGGTGACGGTCTG-3' (RG2AR2: SEQ ID NO: 23 en el listado de secuencias). Como el UPM, se usó uno unido al SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Co., Ltd.), y el RG2AR2 se diseñó a partir de la secuencia de la región constante de cadena pesada de rata (lgG2a) en la base de datos y sintetizados de conformidad con un j procedimiento común.

El ADNc de la región variable del gen de cadena pesada #32A1 fue amplificado por 5'-RACE PCR usando esta combinación de iniciadores y el ADNc sintetizado en b) (5'-RACE-Ready cDNA) como una plantilla. La PCR se realizó usando Advantage 2 PCR Kit (Clontech Co., Ltd.), y las condiciones para un ciclador térmico se establecieron como sigue: después de calentar un 94°C durante 1 minuto, un ciclo de temperatura de "94°C durante 0.5 minutos y 72°C durante 3 minutos" se repitió 5 veces, entonces un ciclo de temperatura de "94°C durante 0.5 minutos, 70°C durante 0.5 minutos, y 72°C durante 3 minutos" se repitió 5 veces, y posteriormente, un ciclo de temperatura de "94°C durante 0.5 minutos, 68°C durante 0.5 minutos, y 72°C durante 3 minutos" se repitió 20 veces, seguido por incubación a 4°C. : d) Amplificación de ADNc de región variable de gen de cadena ligera #32A1 por 5'-RACE PCR Como iniciadores para amplificar el ADNc de la región variable de gen de cadena ligera #32A1 por PCR, se usaron UPM (Universal Primer A Mix, unido al SMART RACE cDNA Amplification Kit) y un oligonucleótido que tienen una secuencia de 5'- CATGCTGTACGTGCTGTCTTTGCTGTCCTGATCAG-3'(RKR2: SEQ ID NO: 24 en el listado de secuencias). Como el UPM, se usó uno unido al SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Co., Ltd.), y el RKR2 se diseñó a partir de la secuencia de la región constante de cadena ligera de rata (cadena K) en la base de datos y sintetizada de conformidad con un procedimiento común.

El ADNc de la región variable de gen de cadena ligera #32A1 fue amplificado por 5'-RACE PCR usando esta combinación de iniciadores y el ADNc sintetizado en b) (5'-RACE-Ready cDNA) como una plantilla. La PCR se realizó usando Advantage 2 PCR Kit (Clontech Co., Ltd.), y las condiciones para un ciclador térmico se establecieron como sigue: después de calentar a 94°C durante 1 minuto, un ciclo de temperatura de "94°C durante 0.5 minutos y 72°C durante 3 minutos" se repitió 5 veces, después, un ciclo de temperatura de "94°C durante 0.5 minutos, 70°C durante 0.5 minutos, y 72°C durante 3 minutos" se repitió 5 veces, y posteriormente, un ciclo de temperatura de "94°C durante 0.5 minutos, 68°C durante 0.5 minutos, y 72°C durante 3 minutos" se repitió 20 veces, seguido para incubación a 4°C. j e) Determinación de secuencias de ADNcs de base de cadena regiones variables pesada y ligera El ADNc de la región variable de cadena pesada amplificada en c) fue purificado usando el MinElute PCR Purificaron Kit (QIAGEN Inc.), y después se realizó el análisis de secuencia de la secuencia de ADN. Como un iniciador de secuenciación, un ologinucleótido que tiene una secuencia dé 5'-CTCCAGAGTTCCAGGTCACGGTGACTGGC-3' (RG2AR3: SEQ ID NO:, 25 en el listado de secuencias) se diseñó a partir de la secuencia de la región constante de cadena pesada de rata (lgG2a) en la base de datos y se sintetizó de conformidad con un procedimiento común. I i El ADNc de la región variable de cadena ligera amplificada en d) fue purificada usando el MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN Inc.), y después el análisis de secuencia de la ADN secuencia se realizó. Como un iniciador de secuenciación, un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-TCCAGTTGCTAACTGTTCCG-3' (sqRK: SEQ ID NO: 26 en el listado de secuencias) se diseñó a partir de la secuencia de la región constante de cadena ligera de rata (cadena ?) en la base de datos y se sintetizo de conformidad con un procedimiento común. I El ADNc que contiene la región variable de cadena pesada obtenida por el análisis de secuencia tiene una base secuencia representada por SEQ ID NO: 27 en el listado de secuencias y codifica la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias. La secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 1 a 19 I de SEQ ID NO: 28 corresponde a una señal secretora, la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 20 a 140 de la misma corresponde a una región variable de cadena pesada, y la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 141 a 167 de la misma corresponde a una región constante de cadena pesada (parcial). La región variable de cadena pesada antes mencionada contiene CDRH1 (DYFMN) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44, CDRH2 (QIRNKIYTYATFYAESLEG) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 45, y CDRH3 (SLTGGDYRDY) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: i 46. Además, el ADNc que contiene la región variable de cadena ligera tiene una secuencia de bases representada por SEQ ID NO: 29 en el listado de secuencias y codifica la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias. La secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 1 a 20 de SEQ ID NO: 30 corresponde a una señal secretora, la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 21 a 132 de la misma corresponde a una región variable de cadena ligera, y la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 133 a 139 de la misma corresponde a una región constante de cadena ligera (parcial). La región variable de cadena ligera antes mencionada contiene CDRL1 (RASQSVTISGYSFIH) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 47, CDRL2 ( RAS N LAS) que comprende la ? secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48, y CDRL3 (QQSRKSPWT) que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 49.

EJEMPL0 18 Producción de constructo de expresión de gen de anticuerpo quimérico humano de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 a) Producción de vectores de expresión universales pEF1/FCCU-1 y PEF6KCL a)-i) Construcción de vector de expresión de cadena ligera humana pEF6KCL Al realizar PC R usando un plásmido pEF6A/5-HisB (Invitrogen) como una plantilla y también usando los siguientes iniciadores, se obtuvb un fragmento de ADN desde el extremo 3' inmediatamente de BGHpA (2174) a Smal (2958) (un fragmento de ADN que contiene origen de replicación f1 y promotor SV40 y origen, de aquí en adelante referido como "fragmento A"). 5'-CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC-3' (iniciador EFF1 : SEQ ID NO: 31 en el listado de secuencias) 5 \CCCGGGAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGG-3' (iniciador EFsmaR: SEQ í ID NO: 32) El fragmento A obtenido y un fragmento de ADN (SEQ I D¡ NO: 33, de aquí en adelante referido como "fragmento B") que contiene una secuencia de ADN que codifica una señal secretora de cadena ? humana, una región constante de cadena ? humana, y una señal adicional poli-A humana fueron ligadas por PCR de traslape. El fragmento de ADN asi obtenido en el cual el fragmento A y el fragmento B se ligaron (de aquí en adelante referido como "fragmento A+B") fue digerido con las enzimas de restricción Kpnl y Smal, que se ligó a un plásmido pEF6/V5-HisB (Invitrogen) que fue digerido con las enzimas de restricción Kpnl y Smal, por lo que un vector de expresión de cadena ligera humana pEF6KCL que tenia una secuencia de señal, un sitio de clonación,' una región constante de cadena ? humana, y una secuencia de señal adicional poli-A humana hacia el extremo 3' del promotor EF1 se construyó. a)-ii) Construcción de pEF1/KCL Un fragmento de ADN obtenido al digerir el pEF6KCL obtenido por el método antes mencionado con las enzimas de restricción Kpnl y Smal se ligó a pEF1/myc-HisB (Invitrogen, Inc.) que fue digerido con Kpnl y Smal, por lo que se construyó un plásmido pEF1/KCL. a)-iii) Construcción de vector de expresión de cadena pesada humana pEF1/FCCU-1 Un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 34 en el listado de secuencias) que contiene una secuencia de ADN que codifica una secuencia de señal de lgG1 humana y una región constante secuencia de aminoácidos fue digerida con las enzimas de restricción Nhel y Pmel y fue ligada al plásmido pEF1/KCL que fue digerido con Nhel y Pmel, por lo que un vector de expresión de cadena pesada humana pEF1/FCCU-1 que tenía una secuencia de señal, un sitio de clonación, una región constante de cadena pesada humana, y una secuencia de señal adicional poli-A humana hacia el extremo 3' del promotor EF1 se construyó. b) Producción de #32A1 cadena pesada de constructo de j expresión de anticuerpo quimérico humano 1 Como iniciadores para amplificar el ADNc de la región variable de cadena pesada #32A1 por PCR, un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-aaagctgagcGAGGTGCAAATTTTGGAGACTGGAGGAGGC-3' (32A1 HF: SEQ ID NO: 35 en el listado de secuencias) y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-aaagctgagctGACTGTGACCATGACTCCTTGGCCCCAG-3' (32A1 HR: SEQ ID NO: 36 en el listado de secuencias) se sintetizaron de conformidad con un procedimiento común.

Incidentalmente, para integrar un producto de PCR en pEF1/FCCU-1 , estos iniciadores fueron diseñados de tal manera que una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción BIpI se añadió. El i PCR se realizó de conformidad con un procedimiento común usando esta combinación de iniciadores y el ADNc de la región variable de cadena pesada purificado en e) del ejemplo 17 como una plantilla. El producto de PCR I resultante fue purificado usando el MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, Inc.), y después un fragmento de ADN obtenido al digerir el producto de PCR con la enzima de restricción BIpI (NEW ENGLAND BIOLABS, Inc.) se insertó en el pEF1/FCCU-1 en el sitio digerido con la enzima de restricción BIpI, pór lo que una cadena pesada de constructo de expresión de anticuerpo quimérico humano #32A1 se construyó. La secuencia del inserto fue confirmada por un análisis de secuencia. Como un iniciador para secuenciación, un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-TAATACGACTCACTATAGGG- 3' (F1 1 : SEQ ID NO: 37 en el listado de secuencias) fue sintetizado de conformidad con un procedimiento común. Un vector de expresión en el cual el inserto podría ser insertado correctamente se denominó "32A1 H/pEF1/FCCU". c) Producción de cadena ligera de constructo de expresión de anticuerpo quimérico humano #32A1 Como iniciadores para amplificar el ADNc de la región variable de cadena ligera #32A1 por PCR, un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-aaacatatggcGACATTGTCTTGACCCAGTCTCCTGCTTTGG-3' (32A1 LF: SEQ ID NO: 38 en el listado de secuencias) y un oligonucleótido que tiene una secuencia de 5'-aaacgtacgTCTCAATTCCAGCTTGGTGCCTCCAGCG-3' (32A1 LR SEQ ID NO: 39 en el listado de secuencias) se sintetizaron de conformidad con un procedimiento común.

Incidentalmente, para integrar un producto de PCR a pEF6KCL, estos iniciadores fueron diseñados de tal manera que una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Ndel se añadió a 32A1 LF, y, una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción BsiWI se añadió a 32A1 LR. La PCR se realizó de conformidad con un procedimiento común usando esta combinación de iniciadores y el ADNc de la región variable de cadena ligera purificado en e) del ejemplo 17 como una plantilla. El producto de PCR resultante fue purificado usando el MinElute PCR Purification Kit (QIAGEN, Inc.), y después, un fragmento de ADN obtenido al digerir el producto de PCR con las enzimas de restricción Ndel (TaKaRa Bio, Inc.) y BsiWI (NEW ENGLAND BIOLABS, Inc.) se insertó en el pEF6KCL en el sitio digerido con las enzimas de restricción Ndel (TaKaRa Bio, Inc.) y BsiWI (NEW ENGLAND BIOLABS, Inc.), por lo que una cadena ligera de constructo de expresión de anticuerpo quimérico humano #32A1 se construyó. La secuencia del inserto fue confirmada por un análisis de secuencia. Como un iniciador para secuenciación, se usó un iniciador F1 1 representado por SEQ ID NO: 37 en el listado de secuencias. Un vector de expresión en el cual el inserto podría ser insertado correctamente se denominó "32A1 L/pEF6KCL".

El gen de cadena pesada de anticuerpo quimérico humano #32A1 producido en b) tiene la secuencia de nucleótidos representada por i SEQ ID NO: 40 en el listado de secuencias y codifica la secuencia de I aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 en el listado de secuencias. La secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 1 á 19 de SEQ ID NO: 41 corresponde a una señal secretora, la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 20 a 140 de la misma corresponde a una región variable de cadena pesada, y la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 141 a 470 de la misma corresponde a una región constante de cadena pesada. Además, el gen de cadena ligera de anticuerpo quimérico humano #32A1 producido en c) tiene la secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 42 en el listado de secuencias y codifica la secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 43 en el listado de secuencias. La secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 1 a 20 de SEQ ID NO 43 corresponde a una señal secretora, la secuencia de aminoácidos i representada por los aminoácidos números 21 a 132 de la misma corresponde a una región variable de cadena ligera, y la secuencia de aminoácidos representada por los aminoácidos números 133 a 237 de la misma corresponde a una región constante de cadena ligera.

EJEMPL0 19 i Preparación de anticuerpo quimérico humano de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siqlec-15 de rata #32A1 a) Producción de anticuerpo quimérico humano 3 x 107 células de células 293 FreeStyle en fase de crecimiento logarítmica se sembró en 30 mi de medio de expresión FreeStyle 293 fresco (Invitrogen, Inc.) (se prepararon cuatro lotes, en el cual el cultivo de 30 mi se i tomó como un lote) y se sometió a cultivo en agitación (125 rpm) a 37°C en una incubadora con 8% de C02. 300 µg de polietilenimina (fabricada por Polyscience, Inc. #24765) se disolvió en 1 mi de medio Opti-Pro SFM (fabricado por Invitrogen, Inc.), y la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. El vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo quimérico humano #32A1 , 32A1 H/pEF1/FCCU y el vector de expresión cadena ligera de anticuerpo quimérico humano #32A1 , 32A1L/pEF6KCL producida en el ejemplo 18 se preparó usando el Pureünk HiPure Plasmid Kit (Invitrogen, Inc.). The 32A1 H/pEF1/FCCU (15 µg) y el 32A L/pEF6KCL (45 µg) fue suspendido en 1 mi de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen, Inc.), y la suspensión resultante se añadió a 1 mi del líquido mixto de polietilenimin/Opti-Pro SFM que había sido dejado a temperatura ambiente durante 5 minutos, y la mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos adicionales. Subsecuentemente, 2 mi del liquido mixto de polietilenimina/los vectores de expresión/Opti-Pro SFM se añadió a cada lote de la suspensión de células 293 FreeStyle, y el cultivo en agitación se continuó. Después de que las células se cultivaron durante 7 días a 37°C en 8% de CO2, el sobrenadante de cultivo fue recolectado de cada lote. ¡ i b) Purificación de anticuerpo quimérico humano 90 mi del sobrenadante de cultivo (para tres lotes) obtenido anteriormente se filtró a través de un filtro (fabricado por NALGENE,¡ Inc., #295-4545), y 0.5 mi de MabSelect SuRe (fabricado por GE Healthcare Bio- science Co., Ltd., #17-5438-01) equilibrado con PBS se añadió al filtrado,, y la mezcla resultante se agitó durante la noche a 80 rpm y 10°C. El día siguiente, el vehículo fue recolectado y lavado con PBS, y posteriormente, el anticuerpo se eluyó con solución 1 M de arginina (pH 4.0). El material eluido se aplicó a una columna PD-10 (fabricado por GE Healthcare Bio-science Co., Ltd., #17- 0851-01) para reemplazar el líquido con PBS, y después se concentró con Amicon Ultra-4 (fabricado por Millipore Co., Ltd., #UFC805008), por lo que se obtuvo 1.2 mi de un anticuerpo quimérico humano (0.98 mg/ml). La concentración del anticuerpo se calculó de la medición a 280 nm obtenida usando Hitachi Diode Array BioPhotometer U-0080D.

EJEMPLO 20 Evaluación de propiedad de anticuerpo quimérico humano de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 que se une a proteína Siglec-15 de ratón La inhibición competitiva del anticuerpo #32A1 de rata contra el anticuerpo quimérico humano purificado preparado en el ejemplo 19 se determinó por el siguiente método. El Siglec-15-Fc de ratón purificado én el ejemplo 4 fue diluido a 1 µg/ml con PBS, la solución diluida se suministró a I 100 µ?/???? en una inmunoplaca (fabricada por Nunc, Inc., #4371 11 ), y la placa se dejó reposar durante la noche a 4°C, por lo que la proteina fue adsorbida a la placa. El día siguiente, cada pozo se lavó dos veces con una ? solución PBS-T (PBS, 0.05% (v/v) Tween 20), una solución obtenida por dilución de leche descremada (fabricado por Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) a 5% con PBS se suministró a 350 µ?/????, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. El líquido en cada pozo fue removido, y cada pozo se lavó 3 veces con la solución de PBS-T. Por lo tanto, una solución mixta (una solución de PBS que contiene leche descremada a una concentración final de 0.5%) que contenia el anticuerpo quimérico humano a 0.25 µ?/??? y el anticuerpo #32A1 o un IgG de control de rata anticuerpo (fabricado por R&D Systems, Inc. , #6-001-A) a una concentración diferente (0 Mg ml, 0.016 µ?/???, 0.05 µg/ \, 0.16 µg/ml, 0.5 µg/m), 1.66 µg/ml o 5 µg/m ) se suministró a 100 µ?/????, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de cada pozo se lavó 3 veces con la solución de PBS-T, IgG anti-humano de cabra AffiniPure conjugado como fosfatasa alcalina (fabricado por Jackson ImmunoResearch, Inc., #109-055-097) diluido a 2500 veces con una solución de TBS-T (TBS, 0.05% (v/v) Tween 20) se añadió a 100 µ?/????, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. El líquido en cada pozo fue removido, y cada pozo se lavó 5 veces con la solución de TBS-T. Por lo tanto, una solución de sustrato fluorescente (fabricado por Roche Co., Ltd., #1 1681982001) se añadió a! 100 µ?/????, y una reacción de fluorescencia se dejó proceder. A 10 minutos después de la adición de la solución de sustrato fluorescente, la intensidad de fluorescencia se midió usando un lector de placa. Como resultado, se mostró que el anticuerpo #32A1 inhibe la unión del anticuerpo quimérico humano al Siglec-15-Fc de ratón de una manera dependiente de la concentración.

Además, cuyo el anticuerpo #32A1 y el anticuerpo quimérico humano se mezclaron a la misma concentración (1 :1), aproximadamente 40% | de inhibición competitiva se exhibió. Por lo tanto, se considera que el anticuerpo #32A1 y el anticuerpo quimérico humano tiene sustancialmente la misma afinidad para el Siglec-15-Fc de ratón. Por otra parte, la IgG de control de rata no mostró inhibición competitiva (figura 15). í EJEMPLO 21 ! Evaluación de actividad biológica de anticuerpo quimérico humano de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 con base en prueba para la formación de osteoclastos de ratón y prueba para formación de osteoclastos humanos a) Prueba para formación de osteoclastos en ratón Usando el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 preparado en el ejemplo 9, el efecto sobre la diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de ratón se examinó. Células de médula ósea no adherentes de ratón preparadas por el método del ejemplo 8 se preparó a 1.5 x ¡ 105 células/ml en un medio a-MEM que contiene 10% FBS y 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.), la preparación de células resultante se sembró en cada pozo de una placa de 96 pozos en una cantidad de 200 µ? y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora con CO2. La solución de cultivo vieja en la placa de 96 pozos fue removida, y 100 µ? de medio MEM-a se añadió a cada pozo, los 100 µ? de medio ???-a , que contenia 10% de FBS al cual RANKL humano (RANKL, fabricado t por Peprotech, Inc.) y M-CSF se había añadido para dar concentraciones finales de 20 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo de células, el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 producido en el ejemplo 6 o el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal anti- ratón Siglec-15 de rata #32A1 preparado en el ejemplo 19 se añadió a ^ una concentración de 3 a 100 ng/ml, y las células se cultivaron durante 3 días adicionales en una incubadora con CO2. Después de completarse el cultivo, la actividad de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados se midió por el método descrito en el ejemplo 9. Después de detener la reacción enzimática, una absorbancia de cada pozo a 405 nm se i midió, y la medición obtenida se usó como un índice de actividad de TRAP.

Los resultados se muestran en las figuras 16A-16B. Una inhibición de actividad de TRAP dependiente de la dosis se observó a una concentración de 50 ng/ml o superior en el caso de el anticuerpo #32A1 y el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1. De este resultado, se mostró que el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 tiene una actividad de inhibir la formación de osteoclastos (diferenciación de osteoclastos y maduración) sustancialmente comparable con la del anticuerpo #32A1 de rata. b) Evaluación usando células precursoras de osteoclastos humanos normales (tinción de TRAP) Las células precursoras de osteoclastos humanas normales (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-110) se sembraron en una placa de 96 pozos a 1 x 104 células/pozo de conformidad con el protocolo unido a las células.

Como el medio, se usó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPB , compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-8201 ) complementadas con un conjunto de complemento OPGM (comprado de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501) que contenía suero de bovino fetal (concentración final: 10%), RANKL humana (concentración final: 66 ng/ml), M-CSF humana (concentración final: 33 ng/ml), y similares, Al sobrenadante de cultivo resultante, el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 preparado en el ejemplo 19 se añadió a una concentración final de 0.3, 1 , 3, o 10 µg/ml, y las células se cultivaron durante 3 días en una incubadora con CO2. Después del cultivo, el sobrenadante fue removido, y 10% de formalina neutra se añadió i para fijar las células. Después de fijar las células, las células se lavaron dos veces con agua destilada, una solución de tinción de TRAP (0.27 mM fosfato de naftol AS-MX o (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1.6 mM de sal de LB rojo violeta resistente (fabricado por Sigma Co., Ltd.), 1 % de dimetilformamida, 50 mM de tartrato de sodio, 0.1 M de regulador de pH de acetato de sodio, (pH 5.0)) se añadió at 100 µ?/????, y a reacción se dejó proceder a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después de la reacción, las células se lavaron dos veces con agua destilada, y después se observaron por microscopía (figuras 17A-17E). Como resultado, la formación de osteoclastos multinucleados TRAP-positívos fue inhibida mediante la adición del anticuerpo I quimérico humano de #32A1 dentro del intervalo de 0.3 µ9/??? a 10 µ?/???.

EJEMPLO 22 ¡ Diseño de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siqlec-15 de rata #32A1 (1) a) Diseño de versión humanizada de #32A1 a)-¡) Modelado molecular de región variable de #32A1 El modelado molecular de la región variable de #32A1 se realizó por un método generalmente conocido como modelado de homología (Methods ¡n Enzymology, 203, 121-153, (1991 )). Las secuencias primarias (estructuras tridimensionales derivadas de las estructuras de cristal de rayos X están disponibles) de las regiones variables de inmunoglobulina humana registrada en el Protein Data Bank (Banco de Datos de Proteínas) (Nuc. Acid Res. 35, D301 -D303 (2007)) se compararon con la región variable de #3;2A1 determinada anteriormente. Como resultado, 1 LK3 se seleccionó como teniendo la homología de secuencia más alta con la región variable de la i i cadena ligera de #32A1 entre anticuerpos que tenían una deleción similar en el marco de trabajo. Además, 1AD0 se seleccionó como teniendo la homología de secuencia más alta con la región variable de la cadena pesada de #32A1. La estructura tridimensional de la región del marco de trabajo se generó al obtener el "modelo de marco de trabajo" combinando las coordenadas de 1LK3 y 1AD0 correspondientes a las cadenas ligera y pesada de #32A1. Las CDRs de #32A1 se clasificaron de conformidad con la clasificación de Thornton et al. (J. Mol. Biol., 263, 800-815, (1996)) como sigue: CDRL1 , CDRL2, CDRL3, CDRH1 , y CDRH2 fueron asignadas a las agrupaciones 15A, 7A, 9A, 10A y 12B, respectivamente. CDRH3 se clasificó en k(8)C de conformidad con las reglas de H3 (FEBS letter 399, 1-8 (1996)). Después, las conformaciones representativas de los CDRs respectivos se integraron en el modelo de marco de trabajo. i Finalmente, para obtener un probable modelo molecular de la región variable de #32A1 en términos de energía, un cálculo de energía se realizó para excluir contacto interatómico desventajoso. El procedimiento anterior se realizó usando el programa de predicción de estructura de proteína tridimensional comercialmente disponible Prime y el programa de búsqueda de coordenadas MacroModel (Schrodinger, LLC). | a)-ii) Diseño de secuencia de aminoácidos de #32A1 humanizado Un anticuerpo humanizado #32A1 se construyó de conformidad con un método generalmente conocido como injerto de CDR (Proc. Nati.

Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Un anticuerpo aceptor se seleccionó en dos formas basadas en la homología de aminoácido dentro de la región del marco de trabajo. La secuencia de la región del marco de trabajo de #32A1 se comparó con la secuencias de todos los marcos de trabajo humanos en la Kabat Datábase (Base de datos de Kabat) (Nuc. Acid Res. 29, 205-206 I (2001)) que implica secuencias de aminoácidos de anticuerpo. Como resultado, un anticuerpo M37G037'CL se seleccionó como un aceptor basado en una homología de secuencia de 73% en la región de marco de trabajo. Los residuos de aminoácidos en la región de marco de trabajo de M37G037'CL se alinearon con los residuos de aminoácidos de #32A1 , y las posiciones en donde diferentes aminoácidos se usaron fueron identificados. Las posiciones de estos residuos se analizaron usando el modelo tridimensional de #32A1 construido anteriormente. Después, los residuos donadores que han de ser injertados en el aceptor se seleccionaron de conformidad con los criterios provistos por Queen et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). ¡ La secuencia de la región de marco de trabajo de #32A(1 se comparó con las secuencias de todos los marcos de trabajo humanos en el IgBLAST (Nuc. Acid Res.36, D25-D30 (2007)). Como resultado, para la i cadena L, AAB34430 se seleccionó como un aceptor basado en una homología de secuencia de 79% en la región de marco de trabajo. En cuanto a la cadena H, CAF31288 se seleccionó como un aceptor basado en una homología de secuencia de 78% en la región de marco de trabajo. Con respecto a la cadena L, los residuos de aminoácidos en la región de marco de trabajo de AAB34430, y con respecto a la cadena H, los residuos de aminoácidos en la región de marco de trabajo de CAF31288, se alinearon con los residuos de aminoácidos de #32A1 , y se identificaron las posiciones en i donde diferentes aminoácidos se usaron. Las posiciones de estos residuos se analizaron usando el modelo tridimensional de #32A1 construido anteriormente. Después, los residuos donadores que habían de ser injertados en el acceptor se seleccionaron de conformidad con los criterios provistos por Queen et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). En estos métodos, al transferir algunos residuos donadores seleccionados al anticuerpo aceptor, secuencias #32A1 humanizadas se construyeron como se describe en los siguientes ejemplos. b) Humanización de cadena pesada #32A1 b)-i) Cadena pesada tipo h#32A1-T1 H: ¦ Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina)', 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (¡soleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada tipo h#32A1-T1 H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo h#32A1-T1 H está representada por SEQ ID NO: 51 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 , la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 141 a 470 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena pesada, y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 está representada por SEQ ID NO: 50 e(n el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 50, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 50 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51 también se muestran en la figura 27. b)-ii) Cadena pesada tipo h#32A1-T2H: Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 1 18 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, Í leucina, metionina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, i se denominó "cadena pesada tipo h#32A1-T2H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo h#32A1- T2H está representada por SEQ ID NO: 53 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 141 a 470 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena pesada, y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de i aminoácidos de SEQ ID NO: 53 está representada por SEQ ID NO: 52 en el Í listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 52, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifica la secuencia de señalj la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 52 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 53 también se muestran en la figura 28. b)-iii) Cadena pesada tipo h#32A1-T3H: Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 104 (valina), 14 (isoleucina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias I con valina, serina, glutamina, metionina, valina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó " cadena pesada tipo h#32A1-T3H". ' La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo h#32A1- T3H está representada por SEQ ID NO: 55 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55, la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 141 a 470 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena pesada, y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia1 de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 está representada por SEQ ID NO: 54 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 54, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 54 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 55 también se muestran en la figura 29. b)-iv) Cadena pesada tipo h#32A1-T5H: Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 61 (ácido glutámico), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 97 (ácido glutámico), 99 (serina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (isoleucina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con valina, valina, serina, glutamina, glicina, fenilalanina, asparagina, lisina, treonina, metionina, asparagina, valina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada tipo h#32A1-T5H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo h#32A1-T5H está representada por SEQ ID NO: 57 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57, la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 141 a 470 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena pesada, y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuenciá de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 está representada por SEQ ID NO: 56 én el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 56, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma, y la secuencia que comprende; los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifica la secuencia de seña|, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 56 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 también se muestran en la figura 30. b)-v) Cadena pesada tipo h#32A1-T6H: Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 95 (ácido aspártico), 97 (ácido glutámico), 99 (serina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con valina, valina, serina, glutamina, asparagina, lisina, treonina, metionina, valina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada tipo h#32A1-T6H". 1 La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo h#32A1-T6H está representada por SEQ ID NO: 59 en el listado de secuencias:. La I secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 141 a 470 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena pesada, y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 está representada por SEQ ID NO: 58 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 58, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1410 de la misma codifican una secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 58 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 también se muestran en la figura 31. b)-vi) Cadena pesada tipo h#32A1-T7H: i Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar I los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), ! 1 14 (isoleucina), 1 18 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina)¡de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de ! ! secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada tipo h#32A1-T7H". 1 La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo h#32A1- T7H está representada por SEQ ID NO: 72 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 72 también se muestra en la figura 38. ' b)-vii) Cadena pesada tipo h#32A1-T8H: Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), 14 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado! de secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada tipo i h#32A1-T8H". ¡ La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada tipo h#32A1- T8H está representada por SEQ ID NO: 73 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 también se muestra en la figura 38. ' b-viii) Cadena pesada de tipo h#32A1-T9H: Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 1 14 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, valina, alanina, I treonina, leucina y serina respectivamente, se denominó "cadena pesada de I tipo h#32A1-T9H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1 -T9H está representada por SEQ ID NO: 74 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 también se muestra en la figura 38. b)-ix) Cadena pesada de tipo h#32A1-T10H: Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, asparagina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T10H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T10H está representada por SEQ ID NO: 75 en el listado1 de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 también se muestra en la figura 39. b)-x) Cadena pesada de tipo h#32A1-T11H: Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 114 (isoleucina), 118 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada i #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T11 H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T11H está representada por SEQ ID NO: 76 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, i respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 también se muestra en la figura 39. ! b) -xi) Cadena pesada de tipo h#32A1-T12H: ' Una cadena pesada #32A1 humanizada diseñada al reemplazar residuos de aminoácidos 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 95 (ácido aspártíco), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 114 (isoleucina), i 1 18 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de la cadena pesada #32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, valina, alanina, treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-T12H".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-T12H está representada por SEQ ID NO: 77 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 121 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 122 a 451 de la misma corresponden a la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada, I respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 77 también se muestra en la figura 39. c) Humanización de cadena ligera #32A1 ¡ c) -i) Cadena ligera de tipo h#32A1-T L: j I Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo fallante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 1 10 (fenilalanina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, glicina, valina, isoleucina, lisina, y treoijiina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T1 L". ¡ La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de ( tipo h#32A1-T1L está representada por SEQ ID NO: 61 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 20 de í la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 , la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 134 a 238 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 está representada por SEQ ID NO: 60 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleotidos 1 a 60 de la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 60, la secuencia que comprende los nucleotidos 61 a 399 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleotidos 400 a 714 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la I región constante de cadena ligera secuencia, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 60 y la secuencia de aminoácidos de SEO. ID NO: 61 también se muestran en la figura 32. 1 c)-ii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T2L: , Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metiohina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T2L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T2L está representada por SEQ ID NO: 63 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63, la secuencia que comprende i residuos de aminoácidos 21 a 133 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 134 a 238 de la misma corresponde' a la secuencia de señal, la región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 está representada por SEQ ID NO: 62 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 62, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera secuencia, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 62 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 también se muestran en la figura 33. c)-iii) Cadena ligera tipo h#32A1-T3L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con ácido aspártico, serina, ácido glutámico, serina, s rina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T3L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de ' tipo í h#32A1-T3L está representada por SEQ ID NO: 65 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 20 de I la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65, la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 134 a 238 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 está representada por SEQ ID NO: 64 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende: los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 64, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera secuencia, respectivamente. La secuencia i de nucleótidos de SEQ ID NO: 64 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 también se muestran en la figura 34. c)-iv) Cadena ligera de tipo h#32A1-T4L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 36 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con ácido glutámico, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T4L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T4L está representada por SEQ ID NO: 67 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67, la secuencia que comprende I residuos de aminoácidos 21 a 132 de la misma, y la secuencia que i comprende residuos de aminoácidos 133 a 237 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena ligera, y la región constante i de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica I la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 está representada por SEQ ID NO: 66 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 66, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 396 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 397 a 711 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera,' y la región constante de cadena ligera secuencia, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 66 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 también se muestran en la figura 35. c)-v) Cadena ligera de tipo h#32A1-T5L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 I i (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 1 10 (fenilalanina), 122 (alanina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, projlina, lisina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, tirosina, glicina, glutamina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T5L".

I La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T5L está representada por SEQ ID NO: 69 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69, la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 134 a 238 de la misma corresponde1 a la secuencia de señal, la región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 está representada por SEQ ID NO: 68 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 68, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma, y la i secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera secuencia, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 68 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID i i NO: 69 también se muestran en la figura 36. c)-vi) Cadena ligera de tipo h#32A1-T6L: ' Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina),, 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T6L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T6L está representada por SEQ ID NO: 71 en el listado; de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 , la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 134 a 238 de la misma corresponde a la i secuencia de señal, la región variable de cadena ligera, y la región constante i de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 está representada por SEQ ID NO: 70 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende! los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 70, la I secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera secuencia, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 70 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 también se muestran en la figura 37. ! c)-vii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T7l_: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), '110 (fenilalanina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y¡132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, glicina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T7L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T7L está representada por SEQ ID NO: 78 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 14 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 también se muestra en la figura 40. c)-viii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T8L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, glicina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T8L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de 1 tipo h#32A1-T8L está representada por SEQ ID NO: 79 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 á 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 y la secuencia' que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 79 también se muestra en la figura 40. j c)-ix) Cadena ligera de tipo h#32A1-T9L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, i valina, valina, glicina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T9L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T9L está representada por SEQ ID NO: 80 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 80 también se muestra en la figura 40. c)-x) Cadena ligera de tipo h#32A1-T10L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar i los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), | 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonína), 1 10 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) I de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de i secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, Usina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T10L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T10L está representada por SEQ ID NO: 81 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 1 13 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 81 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 también se I muestra en la figura 40.

I c)-xi) Cadena ligera de tipo h#32A1-T11 L.

Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 1 10 (fenilalanina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, glicina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1 -T11 L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T11 L está representada por SEQ ID NO: 82 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 1 13 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, i respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 también se muestra en la figura 40. ¡ cVxin Cadena ligera de tipo h#32A1-T12L: ' Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, glióina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T12L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T12L está representada por SEQ ID NO: 83 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 83 también se muestra en la figura 41. c)-xiii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T13L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), , 110 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T13L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T13L está representada por SEQ ID NO: 84 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 y la secuencia ¡que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 también se muestra en la figura 41. c)-xiv) Cadena ligera de tipo h#32A1-T14L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, glicina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T14L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de 1 tipo h#32A1-T14L está representada por SEQ ID NO: 85 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 también se muestra en la figura 41. c)-xy) Cadena ligera de tipo h#32A1-T15L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina) i 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), ! 110 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, I valina, tirosina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T15L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo I h#32A1-T15L está representada por SEQ ID NO: 86 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 1 13 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 14 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 86 también se muestra en la figura 41. ! c)-xyi) Cadena ligera de tipo h#32A1-T16L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), i 41 (serina), 66 (glutamina), 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T16L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de | tipo h#32A1-T16L está representada por SEQ ID NO: 87 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a i la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 también se muestra en la figura 41. ¡ i c)-xyii) Cadena ligera de tipo h#32A1 -T17L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 122 (alanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, glicina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de ' tipo h#32A1-T17L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de j tipo h#32A1 -T17L está representada por SEQ ID NO: 88 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a' 1 13 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 14 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 también se muestra en la figura 42.

I c)-xyiii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T18L: | Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (tréonina), 110 (fenilalanina), ¡127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, valina, serena, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, tirosina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T18L". i La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T18L está representada por SEQ ID NO: 89 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 89 también se muestra en la figura 42.

I i c)-xix) Cadena ligera de tipo h#32A1-T19L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), i 66 (glutamina); 68 (arginina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con I metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, prolina, lisina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1- T19L". ! La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de | tipo h#32A1-T19L está representada por SEQ ID NO: 90 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 90 también se muestra en la figura 42. ' i i I I c)-xx) Cadena ligera de tipo h#32A1-T20L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), 29 (alanina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 36 (glutamina), 41 (serina), 66 (glutamina), 81 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con metionina, ácido aspártico, serina, ácido glutámico, asparagina, prolina, valina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, valina, valina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T20L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo i h#32A1-T20L está representada por SEQ ID NO: 91 en el listado de I secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91 también se muestra en la figura 42. c)-xxi) Cadena ligera de tipo h#32A1-T2 L: 1 Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 21 (ácido aspártico), 24 (leucina), entre 29 y 30 I (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), ! 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), ¡ 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con ácido glutámico, metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina, glutamina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T21L". , La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T21L está representada por SEQ ID NO: 92 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 92 también se muestra en la figura 42. ¡ c)-xxü) Cadena ligera de tipo h#32A1-T22L: I Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 21 (ácido aspártico), 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir, inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadenaí ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con| ácido glutámico, metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, glutamina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T22L".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T22L está representada por SEQ ID NO: 93 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 14 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 también se muestra en la figura 43. ¦ c)-xxiii) Cadena ligera de tipo h#32A1-T23L: ¡ Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir inserción de i un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 I I (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginin'a), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en i el listado de secuencias con metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, i respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T23L". i La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T23L está representada por SEQ ID NO: 94 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 y la secuencia que i comprende residuos de aminoácidos 14 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 también se muestra en la figura 43. ! I c)-xxiv) Cadena ligera de tipo h#32A1-T24L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 21 (ácido aspártico), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo fallante del marco de trabajo de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 1 10 (fenilalanina), 122 (alanina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con ácido glutámico, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina, glutamina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T24L".

I La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-T24L está representada por SEQ ID NO: 95 en el listado1 de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 1 13 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 95 también se muestra en la figura 43. ' c)-xxy) Cadena ligera de tipo h#32A1-T25L: Una cadena ligera #32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 j (glutamina), 40 (isoleucina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 1 10 (fenilalanina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de la cadena ligera #32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leücina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, tirosina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-T25L". ! La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de > tipo h#32A1-T25L está representada por SEQ ID NO: 96 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 113 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 y la secuencia que i comprende residuos de aminoácidos 114 a 218 de la misma corresponden a la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera, respectivamente. La secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 96 también se muestra en la figura 43. ¡ EJEMPLO 23 Producción de gen de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 a) Construcción de vectores de expresión de cadena ligera de tipo h#32A1-T1 L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L. h#32A1-T5L v h#32A1-T6L Cada ADN que contiene un gen que codifica una región variable de cadena ligera de tipo h#32A1-T1L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L, h#32A1-T5L o h#32A1-T6L fusionada a una señal secretora representada por: los aminoácidos números 1 a 133 de SEQ ID NO: 61 en el listado de secuencias; los aminoácidos números 1 a 133 de SEQ ID NO: 63;' los aminoácidos números 1 a 133 de SEQ ID NO: 65; los aminoácidos números 1 a 132 de SEQ ID NO: 67; los aminoácidos números 1 a 133 de SEQ ID NO: 69; o los aminoácidos números 1 a 133 de SEQ ID NO: 71 se sintetizaron (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Artificial Gene Synthesis Service). Después, cada uno de los fragmentos de ADN obtenidos por digestión de los ADNs sintetizados con las enzimas de restricción Nhel y BsiWI se insertó en un vector de expresión de cadena ligera de anticuerpo humanizado universal (pEF6KCL) en el sitio digerido con las enzimas de restricción Nhel y BsiWI, por lo que se construyeron vectores de expresión de cadena ligera de 'tipo h#32A1-T1 L, h#32A1-T2L, h#32A1-T3L, h#32A1-T4L, h#32A1 -T5L y h#32A1-T6L. Los vectores de expresión asi obtenidos se nombraron "pEF6KCL/h#32A1-T1 L", "pEF6KCL/h#32A1-T2L", "pEF6KCL/h#32A1-T3L", "pEF6KCL/h#32A1-T4L", "pEF6KCL/h#32A1-T5L", y "pEF6KCL/h#32A1-T6L", respectivamente. b) Construcción de vectores de expresión de cadena pesada h#32A1-T1 H, h#32A1-T2H. h#32A1-T3H. h#32A1-T5H y h#32A1-T6H Cada ADN que contiene un gen que codifica una h#32A1-Tm, h#32A1-T2H, h#32A1-T3H, h#32A1-T5H, o región variable de cadena pesada de tipo h#32A1-T6H fusionada a una señal secretora representada por los aminoácidos números 1 a 140 de SEQ ID NO: 51 , 53, 55, 57 o 59 en el listado de secuencias se sintetizaron (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Artificial Gene Synthesis Service). Después, cada uno de los fragmentos de ADN obtenidos por digestión de. los ADNs sintetizados con la enzima de restricción Blpl se insertó en un vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo humanizado universal (pEF1/FCCU-1) en el sitio digerido con la enzima de restricción Blpl, por lo que se construyeron vectores de expresión de cadena pesada h#32A1-T1 H, h#32A1-T2H, h#32A1-T3H, h#32A1-T5H y h#32A1-T6H. Los vectores de expresión así obtenidos se nombraron "pEF1/FCCU/h#32A1-T1 H", "pEF1/FCCU/h#32A1-T2H", "pEF1/FCCU/h#32A1-T3H", "pEF1/FCCU/h#32A1-T5H", ; y "pEF1/FCCU/h#32A1-T6H", respectivamente. I ? EJEMPLO 24 Preparación de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal antiratón Siglec-15 de rata #32A1 i i a) Producción de anticuerpo humanizado 1.5 x 10 células de células 293 FreeStyle en fase de crecimiento logarítmica se sembró en 100 mi de medio de expresión FreeStyle 293 fresco (Invitrogen, Inc.) y se sometió a cultivo en agitación (125 rpm) a 37°C en una I incubadora con 8% de C02. 1 mg de polietilenimina (fabricado ' por Polyscience, Inc. #24765) se disolvió en 4 mi de medio Opti-Pro $FM (fabricado por Invitrogen, Inc.), y la solución resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Un plásmido de expresión de cadena pesada (0.05 mg) y un plásmido de expresión de cadena ligera (0.15 mg) preparados usando PureLink HiPure Plasmid Kit (Invitrogen, Inc.) fue suspendido en 4 mi de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen, Inc.). Después, 4 mi de los plásmidos de expresión resultantes/liquido mixto de Opti-Pro SFM se añadió a 4 mi de la polietilenimina/líquido mixto de Opti-Pro SFM que se había dejado a temperatura ambiente durante 5 minutos, y la mezcla resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos adicionales. Subsecuentemente, 8 mi de la polietilenimina/los plásmidos de expresión/líquido mixto de Opti-Pro SFM se añadió a la suspensión de células 293 FreeStyle, y el cultivo en agitación se continuó. Después de que las células se cultivaron durante 7 días a 37°C en 8% de CO2, el sobrenadante de cultivo se recolectó. b) Purificación de anticuerpo humanizado ¡ El sobrenadante de cultivo obtenido en a) anterior se purificó por cromatografía de afinidad de proteina A. 100 mi del sobrenadante de cultivo se puso en un matraz con tapón de 500 mi, y 1 mi de una suspensión (50% de suspensión) de MabSelect SuRe (fabricado por GE Healthcare Bio-science Co., Ltd.) equilibrado con PBS se añadió al mismo. La mezcla resultante se agitó durante la noche a 100 rpm en una incubadora a 10°C. Después, el sobrenadante de cultivo 293F/suspensión de MabSelect SuRe se aplicó a Zeba Spin Column vacía de 5 mL (PIERCE, Inc.). Después de que se vació toda la resina en la columna, la columna se lavó con 10 mi de NaCI 1 M. Subsecuentemente, 1 mi de solución de arginina 1 M (pH 4.0) se aplicó a la columna, y una fracción que contenía el anticuerpo fue recolectada. La fracción se añadió a un dispositivo de filtro de centrífuga (Amicon Ultra-4, peso molecular fraccionado: 50 K, Millipore Co., Ltd.), y reemplazo de líquido con un regulador de pH de citrato y condensación se realizaron. El volumen 'final se hizo hasta 200 µ?, que se usó como una muestra purificada.

Un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T1 L y pEF1/FCCU/h#32A1-T1 H , se denominó "h#32A1-T1"¡ un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T2L y pEF1/FCCU/h#32A1-T2h se denominó "h#32A1-T2"¡ un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T3L y pEF1/FCCU/h#32A1-T3H se denominó "h#32A1-T3"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCUh#32A1-T4L y pEF1/FCCU/h#32A1-T3H se denominó "h#32A1-T4"¡ un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido ¡ por una combinación de pEF6KCUh#32A1-T5L y pEF1/FCCU/h#32A1-T5H se denominó "h#32A1-T5"; y un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCUh#32A1-T6L y pEF1/FCCU/h#32A1-T6H se denominó "h#32A1-T6". i I EJEMPLO 25 i Evaluación de propiedad de unión de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 a proteína Siglec-15 de ratón 1 La propiedad de unión de los anticuerpos humanizados de anti- i ratón Siglec-15 #32A1 T1 a T6 de rata a Siglec-15-Fc de ratón y Siglec-15-Fc humana fue evaluado por el siguiente método. La Siglec-15-Fc de ratón purificada en el ejemplo 4 o la Siglec-15-Fc humana purificada en el ejemplo 12 se diluyó a 1 µg/ml con PBS, y la solución diluida se suministró a 100 I µ?/???? sobre una inmunoplaca (fabricada por Nunc, Inc., #4371 11 ), y la placa se dejó reposar durante la noche a 4°C, por lo que cada proteína fue adsorbida a la placa. El día siguiente, cada pozo se lavó 5 veces con una solución de PBS-T (PBS, 0.05% (v/v) Tween 20), y una solución obtenida al diluir leche descremada (fabricada por Morinaga Milk Industry Co., Ltd.) a ¡5% con PBS se suministró a 350 µ?/????, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. El liquido en cada pozo fue removido, y cada pozo se lavó 5 veces con la solución de PBS-T. Por lo tanto, cada uno de los anticuerpo humanizados purificados de la anti-ratón Siglec-15 #32A1 T1 a¡ T6 de rata preparados en el ejemplo 24 o el anticuerpo quimérico humano preparado en el ejemplo 19 se diluyó a una concentración final de 1 a 0.004 i g/ml (series de dilución de 4 veces) con una solución de PBS que contiene 0.5% leche descremada, la solución diluida se suministró a 100 µ?/????, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 2 horas. En este tiempo, la concentración de cada anticuerpo se determinó al realizar medición a 280 nm usando un espectrofotómetro DU-7400 (fabricado por Beckman Coulter, Inc.) y realizando cálculos basados en un coeficiente de extinción molecular molar de cada anticuerpo. Después de que cada pozo había sido lavado 5 veces con la solución de PBS-T, IgG anti-humano de cabra AffiniPure conjugado como fosfatasa alcalina (fabricada por Jackson ImmunoResearch, Inc., #109-055-097) se diluyó a 2500 veces con una solución de TBS-T (TBS, 0.05% (v/v) Tween 20) se añadió a 100 µ?/????, y la placa se dejó reposar a temperatura ambiente durante 1 hora. El liquido en cada pozo fue removido, y cada pozo se lavó 5 veces con la solución de TBS- T. Por lo tanto, una solución de sustrato fluorescente (fabricado por Roche I Co., Ltd., #11681982001) se añadió a 100 µ?/????, y una reacción de fluorescencia se dejó proceder. Después de 10 minutos de la adición de' la solución de sustrato fluorescente en el caso de la placa que tenía el Siglec-15- | I I Fe de ratón adsorbido a la misma, y después de 15 minutos en el caso de la placa que tenia la Siglec-15-Fc humana adsorbida a la misma, una intensidad de fluorescencia se midió usando Spectra Max M5 (fabricado por Molecular Devices, Inc.). Como resultado, se confirmó que todos los seis anticuerpos i humanizados de la anti-ratón Siglec-15 de rata examinados se unen a la proteína Siglec-15 de ratón (figura 18) y la proteina Siglec-15 humana (figura 19) de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo. | EJEMPLO 26 Efecto de la adición de anticuerpo quimérico de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 sobre la diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de ratón (estimulación con FNTa) Usando el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 preparado en el ejemplo 6 y el anticuerpo quimérico del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 preparado en el ejemplo 19, se examinó un efecto sobre la diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de ratón por estimulación con FNTa. Las células no adherentes de médula ósea de ratón preparadas por el método del ejemplo 8 se preparó a 1.5 x 105 células/ml en medio a-MEM que contenía 10% de suero de bovino fetal (FBS), 10 ng/ml de M-CSF, y 2 ng/ml de TGF-ß (fabricado por R&D Systems, Inc.), la preparación de células resultante se I sembró en cada pozo de una placa de 96 pozos en una cantidad de 200 µ? y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora de C02. La solución de cultivo vieja en la placa de 96 pozos fue removida, y 100 µ? de medio MEM-a se añadió a cada pozo, los 100 µ? de medio ???-a que contenía 10% de FBS al cual se había añadido TNF a humano recombinante (fabricado por R&D Systems, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales de 30 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo de células, el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 preparado en el I ejemplo 6 o el anticuerpo quimérico del anticuerpo monoclonal anti-ratón I Siglec-15 de rata #32A1 preparado en el ejemplo 19 se añadió a una i concentración de 0.125 a 4 µ9/???, y las células se cultivaron durante 3 días adicionales en una incubadora de CO2. Al mismo tiempo, un pozo en el cual las células se cultivaron añadiendo OCIF/OPG humano recombinante preparado por el método descrito en la descripción de la publicación de solicitud de patente No. WO 96/26217 a una concentración de 100 ng/ml también se preparó. Después de completarse el cultivo, se realizó tinción de TRAP usando un kit de fosfatase acida de leucocitos (fabricado por Sigma Co., Ltd.) de conformidad con el protocolo que acompaña el kit, y se observó la formación de osteoclastos multinucleados TRAP-positivos. Como resultado, la formación de osteoclastos multinucleados gigantes TRAP-positivos fue inhibida mediante la adición del anticuerpo policlonal anti-ratón Siglec-15 (figuras 20A-20D). Aunque los osteoclastos mononucleares pequeños se ? formaron incluso en el caso en donde el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 o el anticuerpo quimérico de la misma se añadió, la formación de osteoclastos multinucleados grandes inducidos por FNTq fue casi completamente inhibida. Por otra parte, aun cuando una cantidad suficiente de OCIF/OPG, que es un bloqueador de RANKL, se añadió, la I formación de osteoclastos multinucleados grandes fue inhibida sólo un poco. i Además, de la misma manera, la actividad de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados se midió por el procedimiento descrito en el ejemplo 9. Después de detener la reacción enzimáticaj una I absorbancia de cada pozo a 405 nm se midió, y la medición obtenida se usó como un índice de actividad de TRAP. Los resultados se muestran en las figuras 21A-21 B. Una inhibición de actividad de TRAP significativa se observó en el caso del anticuerpo #32A1 y el anticuerpo quimérico de #32A1 dentro del intervalo de 125 ng/ml a 4 µg/ml. A partir de estos resultados, se mostró que el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata y el anticuerpo quimérico de la misma inhiben fuertemente el proceso de -fusión celular en ... i diferenciación de osteoclastos y maduración inducidas por FNTa. ? j EJEMPLO 27 i Evaluación de actividad biológica de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de ratas #8A1 y #32A1 basada en prueba para formación de osteoclastos de rata ^ Usando el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de ratas #8A1 y #32A1 preparado en el ejemplo 6, un efecto sobre diferenciación de osteoclastos de células no adherentes de médula ósea de rata se examinó. i Las células no adherentes de médula ósea de rata se prepararon modificando el método del ejemplo 8. Es decir, el fémur fue extirpado de ambas pierna^ de una rata F344 hembra de 12 semanas de edad y los tejidos blandos fueron I removidos. Ambos extremos del fémur se cortaron, y medio MEM-a se inyectó usando una jeringa con una aguja de inyección de calibre 23 para sacar las células de médula ósea, que se recolectaron en un tubo de centrifuga^ La centrifugación se realizó a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 g, y el sobrenadante fue removido. A la pastilla de células resultante, 1 mi dé un regulador de pH hemolítico (regulador de pH de lisis de glóbulos rojos, fabricado por Sigma Co., Ltd.) se añadió para suspenderlo, y la suspensión resultante se dejó a temperatura ambiente durante 5 minutos. 20 mi de D-PBS se añadió a la misma, la suspensión se centrifugó a temperatura ambiente durante 5 minutos a 100 g, y el sobrenadante fue removido. A la pastilla de células resultante, 10 mi de medio MEM-a (fabricado por Invitrogen, Inc.) que i contiene 5 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.) y 10% suero de I bovino fetal (FBS) se añadió para suspenderlo. Después, la suspensión resultante se hizo pasar a través de un colador de células (40 µ?? Nylon, fabricado por BD Falcon) para remover agregados. Las células resultantes fueron transferidas a un matraz en forma de T de 75 cm2 (para la unión de i células adherentes) y se cultivaron durante la noche en una incubadora de CO2. Después de cultivar durante la noche, las células no se adhirieron al matraz en forma de T fueron recuperadas y usadas como células no i adherentes de médula ósea de rata. i Las células no adherentes de médula ósea de rata preparadas por este método se cultivaron y una prueba para la formación de osteoclastos de rata se realizó de conformidad con el método del ejemplo 9. Es decir, las células no adherentes de médula ósea de rata asi preparadas se prepararon a 1.5 x 105 células/ml en un medio a-MEM que contenia 10% de FBS y 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systems, Inc.), y la preparación de células resultante se sembró en cada pozo de una placa de 96 pozos en una cantidad de 200 µ? y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora de CO2.

La solución de cultivo vieja en la placa de 96 pozos fue removida, y 100 µ? de medio MEM-a se añadió a cada pozo, los 100 µ? de medio MEM-a que contenia 10% de FBS al cual se había añadido RANKL humano (RANKL, I fabricado por Peprotech, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales dé 20 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo de células, el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec- 5 de rata #8A1 o #32A1 producido en el ejemplo 6 se añadió a una concentración de 31 a 1000 ng/ml, y las células se cultivaron durante 3 días adicionales en una incubadora de CO2.

Después de completarse el cultivo, la actividad de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados se midió por el método descrito i en el ejemplo 9. Después de detener la reacción enzimática, una absorbencia de cada pozo a 405 nm se midió, y la medición obtenida se usó como un I índice de actividad de TRAP. Los resultados se muestran en las figuras 22A- I 22B. En el caso del anticuerpo #8A1 , una inhibición de actividad de TRAP dependiente de la dosis se observó a una concentración de 63 ng/ml o superior, y en el caso de el anticuerpo #32A1 , una inhibición de actividad de TRAP dependiente de la dosis se observó a una concentración de 31 ng/ml o superior. A partir de estos resultados, se mostró que el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de ratas #8A1 y #32A1 inhiben fuertemente la formación de osteoclastos de rata de la misma manera que la formación de osteoclastos de ratón, y la actividad in vitro de inhibir la formación de osteoclastos de rata i del anticuerpo #32A1 es más alta que la del anticuerpo #8A1.

I EJEMPLO 28 Diseño del anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 (2) , i a) Diseño de la versión humanizada de #32A1 I a)-i) Diseño de secuencia de aminoácidos de #32A1 humanizada Un anticuerpo humanizado #32A1 se construyó de conformidad con a método generalmente conocido como injerto de CDR (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). En cuanto a las definiciones de regiones de CDR, las definiciones de Kabat (SEQUENCES OF PROTEINs! OF IMMUNOLOGICAL INTEREST VOL I, QUINTA EDICIÓN (1991)) se usaron para todas excepto para CDRH2. En cuanto a CDRH2, la secuencia de la misma se hizo más corta por cinco residuos en el C terminal que la definjción de Kabat usando una definición propia. En la secuencia de cadena pesada que contiene la CDRH2 así definida, la secuencia de CDR derivada de una rata se hace más corta y más de una secuencia de marco de trabajo humana es incorporada, y por lo tanto, cuando se administra a humanos, es mucho menos probable que sea reconocida como un antígeno heterólogo. Un anticuerpo aceptor se seleccionó con base en la homología de aminoácidos dentro de la región de marco de trabajo. La secuencia de la región de marco de trabajo de #32A1 se comparó con las secuencias de todos los marcos de trabajo humanos en la base de datos de Kabat (Nuc. Acid Res. 29, 205--206 (2001)) que implicaban secuencias de aminoácidos de anticuerpo. Como resultado, para la cadena L, GF4/1.1 'CL se seleccionó como un aceptor basado en una homología de secuencia de 71 % en la región de marco de trabajo. En cuanto a la cadena H, M37G037'CL se seleccionó como un aceptor basado en una homología de secuencia de 73% en la región de marco de trabajo. Con respecto a la cadena L, los residuos de aminoácidos en la región de marco de trabajo de GF4/1.1'CL, y con respecto a la cadena H, los residuos de aminoácidos en la región de marco de trabajo, de M37GO37'CL se alinearon con los residuos de aminoácidos de #32A1 , y las posiciones en donde diferentes aminoácidos se usaron fueron identificadas. Las posiciones de estos residuos se analizaron usando el modelo tridimensional de #32A1 construido en a)-i) del ejemplo 22. Después, residuos donadores que han de ser injertados en el aceptor se seleccionaron de conformidad con los criterios provistos por Queen et al. (Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)). Al transferir algunos residuos donadores seleccionados al anticuerpo aceptor, se construyeron secuencias #32A1 humanizadas como se describe en los siguientes ejemplos. a)-ii) Humanización de cadena pesada #32A1 ^ a)-ii)-¡) Cadena pesada de tipo h#32A1-H1-1 : Una cadena pesada 32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 23 (isoleucina), 24 (leucina), 26 (treonina), 32 (lisina), 43 (treonina), 61 (ácido glutámico), 83 (ácido glutámico), 85 (leucina), 86 (ácido glutámico), 89 (valina), 95 (ácido aspártico), 96 (serina), 97 (ácido glutámico), 98 (serina), 100 (valina), 104 (valina), 105 (serina), ' 114 (isoleucina), 1 18 (treonina), 134 (valina), 135 (metionina), y 140 (leucina) de 32A1 representada por SEQ ID NO: 28 en el listado de secuencias con leucina, valina, serina, glutamina, alanina, glicina, alanina, valina, Usina, fenilalanina, asparagina, alanina, lisina, asparagina, leucina, metionina, i asparagina, valina, alanina , treonina, leucina y serina, respectivamente, se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-H1 -1 ". .

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de tipo h#32A1-H1-1 está representada por SEQ ID NO: 99 en el listadó de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 19 de I la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99, la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de la misma, y la secuencia j que comprende residuos de aminoácidos 141 a 466 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena pesada, y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 está representada por SEQ ID NO: 98 en el listado de secuencias. La secuencia I que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 98, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1398 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 98 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 también se muestran en la figura 54. a)-üi) Humanización de cadena ligera #32A1 a)-iii)-i) Cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15: Una cadena ligera 32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 21 (ácido aspártico), 23 (valina), 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir, inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 i I (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina)j 103 i (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 110 (fenilalanina), 122 (alanina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina),; 130 (arginina), y 132 (alanina) de 32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con ácido glutámico, leucina, metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prolina, ácido glutámico, fenilalanina, leucina, tirosina, glicina, glutamina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de^ tipo h#32A1-L2-15 está representada por SEQ ID NO: 103 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 20 de I la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103, la secuencia ¡ que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de la misma, y la secuencia ? que comprende residuos de aminoácidos 134 a 238 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleójidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 jestá representada por SEQ ID NO: 102 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ S ID NO: 102, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera secuencia, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 102 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 103 también se muestran en la figura 56. j i a)-iii)-ii) Cadena ligera de tipo h#32A1-L2-16: Una cadena ligera 32A1 humanizada diseñada al reemplazar los números de aminoácido 21 (ácido aspártico), 23 (valina), 24 (leucina), entre 29 y 30 (es decir inserción de un residuo faltante del marco de trabajo de rata), 31 (alanina), 32 (valina), 34 (leucina), 36 (glutamina), 40 (isoleucina), 66 (glutamina), 99 (asparagina), 100 (prolina), 101 (valina), 102 (glutamina), 103 (alanina), 104 (ácido aspártico), 106 (isoleucina), 108 (treonina), 123 (glicina), 127 (leucina), 129 (leucina), 130 (arginina), y 132 (alanina) de 32A1 representada por SEQ ID NO: 30 en el listado de secuencias con ácido glutámico, leucina, metionina, treonina, serina, leucina, prolina, ácido glutámico, leucina, alanina, serina, serina, leucina, ácido glutámico, prqlina, i ácido glutámico, fenilalanina, leucina, glutamina, valina, isoleucina, lisina, y treonina, respectivamente, se denominó "cadena ligera de tipo h#32A1-L2|16".

La secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de tipo h#32A1-L2-16 está representada por SEQ ID NO: 105 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 20 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105, la secuencia ¡ que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 134 a 238 de la misma corresponde I a la secuencia de señal, la región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 está representada por SEQ ID NO: 104 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende los nucleótidos 1 a 60 de la secuencia de nucleótidos de SEQ i ID NO: 104, la secuencia que comprende los nucleótidos 61 a 399 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 400 a 714 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena ligera, y la región constante de cadena ligera secuencia, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 104 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 105 también se muestran en la figura 57.

I b) Producción de gen de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siqlec-15 de rata #32A1 b)-i) Construcción de vector de expresión de cadena pesada humana universal pEG2 Un fragmento de ADN que contenia una secuencia de ADN| que codificaba aminoácidos de la secuencia de señal y la región constante de lgG2 humana representada por SEQ ID NO: 106 fue sintetizado (Medical & Biological Laboratories Co., Ltd., Artificial Gene Synthesis Service), y digerido con las enzimas de restricción Nhel y Pmel, por lo que se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 1100 bp. Este fragmento de ADN fue ligado a un fragmento de ADN de aproximadamente 6200 bp obtenido por digestión de pEF1/FCCU-1 con Nhel y Pmel y removiendo un fragmentó de ADN de aproximadamente 1 100 bp, por lo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo humanizado pEG2 universal (tipo hlgG2). ¡ b)-ii) Construcción de vector de expresión de cadena pesada h#32A1-H1-1 Un fragmento de ADN obtenido al sintetizar un ADN que contenía un gen que codificaba la región variable de cadena pesada h#32A1-H1-1fusionada a una señal secretora representada por los aminoácidos números 1 a 140 de SEQ ID NO: 99 en el listado de secuencias (Invitrogen), y al digerir el ADN con la enzima de restricción BIpI se insertó en el vector de I expresión de cadena pesada (pEG2) humana universal (tipo hlgG2) en el sitio digerido con la enzima de restricción BIpI, por lo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada h#32A1-H1-1. El vector de expresión asi obtenido se denominó "pEG2/h#32A1-H1-1". b)-iii) Construcción de vector de expresión de cadena pesada h#32A1-H5 Una cadena pesada 32A1 humanizada en la cual la secuencia de señal y la región constante de cadena pesada tipo h#32A1-T5H designada en b)-iv) del ejemplo 22 se cambiaron a aquellas del tipo lgG2 se denominó "cadena pesada de tipo h#32A1-H5".

La secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de' tipo h#32A1-H5 está representada por SEQ ID NO: 101 en el listado de secuencias. La secuencia que comprende residuos de aminoácidos 1 a 19 de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 , la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de la misma, y la secuencia que comprende residuos de aminoácidos 141 a 466 de la misma corresponde a la secuencia de señal, la región variable de cadena pesada, y la región constante de cadena pesada, respectivamente. Una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 está i representada por SEQ ID NO: 100 en el listado de secuencias. La secuéncia que comprende los nucleótidos 1 a 57 de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 100, la secuencia que comprende los nucleótidos 58 a 420 de la misma, y la secuencia que comprende los nucleótidos 421 a 1398 de la misma codifica la secuencia de señal, la secuencia de región variable de cadena pesada, y la secuencia de región constante de cadena pesada, respectivamente. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 100 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 101 también se muestran en la figura 55.

Un fragmento de ADN obtenido al digerir el pEF1/FCCU/h#32A1- T5H producido en el ejemplo 23 con la enzima de restricción Blpl se insertó en el vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo (tipo hlgG2) (pEG2) en el sitio digerido con la enzima de restricción Blpl, por lo que se construyó un vector de expresión de cadena pesada h#32A1-H5. El vector de expresión así obtenido se denominó "pEG2/h#32A1-H5". b)-iv) Construcción de vectores de expresión de cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15 y h#32A1-L2-16 i i Cada ADN que contenía un gen que codificaba una región variable de cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15 o h#32A1-L2-16 fusionada a I una señal secretora representada por los aminoácidos números 1 a 133 de SEQ ID NO: 103 en el listado de secuencias o los aminoácidos números 1 a 133 de SEQ ID NO: 105 se sintetizó (Invitrogen), y se construyeron vectores j de expresión de cadena ligera de tipo h#32A1-L2-15 y h#32A1 -L2-16 de la misma manera as en el ejemplo 23. Los vectores de expresión asi obtenidos se denominaron "pEF6KCL/h#32A1-L2-15" y "pEF6KCL/h#32A1-L2-16", respectivamente. c) Preparación de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siqlec-15 de rata #32A1 ' c)-i) Producción de anticuerpo humanizado j 1.2 x 109 células de células FreeStyle 293F (Invitrogen) en fase de crecimiento logarítmica se sembró en 1.2 L de medio de expresión FreeStyle 293 fresco (Invitrogen) y se sometió a cultivo en agitación a 37°C en una incubadora con 8% de C02 a 90 rpm durante 1 hora. 3.6 mg de polietilenimina (Polyscience, #24765) se disolvió en 20 mi de medio Opti-Pro SFM (Invitrogen). Subsecuentemente, un plásmido de expresión de cadena H (0.4 mg) y un plásmido de expresión de cadena L (0.8 mg) preparado usando PureLink HiPure Plasmid Kit (Invitrogen, Inc.) fue suspendido en 20 mi de medio Opti-Pro SFM. Después, 20 mi de los plásmidos de expresión resultantes/líquido mixto de Opti-Pro SFM se añadió a 20 mi de la polietilenimina/líquido mixto de Opti-Pro SFM, y la mezcla resultante se agitó suavemente y después se dejó durante 5 minutos. Por lo tanto, la mezcla se añadió a las células FreeStyle 293F, y el cultivo en agitación se realizó durante 7 días a 37°C en una incubadora con 8% de CO2 a 90 rpml El sobrenadante de cultivo resultante se filtró a través de un filtro de cápsula desechable (Advantec #CCS-045-E1 H).

Un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T5L y pEG2/h#32A1-H5 se denominó I "h#32A1-H5/L5"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una combinación de pEF6KCL/h#32A1-T5L y pEG2/h#32A1-H1-1 se denominó i "h#32A1-H1-1/L5"; un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por una j combinación de pEF6KCUh#32A1-L2-15 y pEG2/h#32A1-H1-1 se denominó "h#32A1-H1-1/L2-15"; y un anticuerpo humanizado de #32A1 obtenido por¡ una combinación de pEF6KCL/h#32A1-L2-16 y pEG2/h#32A1-H1-1 se denominó "h#32A1-H1-1/L2-16". i c)-ii) Purificación de anticuerpo humanizado i El sobrenadante de cultivo obtenido en c)-i) anterior fue purificado por un procedimiento de dos pasos que incluyó cromatografía de afinidad de rProtein A (a 4 a 6°C) y hidroxiapatita de cerámica (a temperatura ambiente). Un paso de reemplazo de regulador de pH después dé la purificación por cromatografía de afinidad de rProtein A y después d|e la purificación por hidroxiapatita de cerámica se realizó a temperatura ambiente.

Primero, 1 100 a 1200 mi del sobrenadante de cultivo se aplicó a MabSélect SuRe (fabricado por GE Healthcare Bioscience Co., Ltd., columnas 2 x 1 mi HiTrap en serie) equilibrado con PBS. Después de que toda la solución de cultivo se vació en la columna, la columna se lavó con 15 a 30 mi de PBS.

Subsecuentemente, elución se realizó con solución 2 M de clorhidrato de arginina (pH 4:0), y una fracción que contenía el anticuerpo fue recolectada.

La fracción se aplicó a una columna de desalación (fabricada por GE Healthcare Bioscience Co., Ltd., columnas de desalación 2 x 5 mi HiTrap en serie) y el líquido fue reemplazado por un regulador de pH que contenía 5 mM i fosfato de sodio, 50 mM MES, y 20 mM NaCI a pH 6.5. Además, la solución de anticuerpo sometida al reemplazo con el regulador de pH se aplicó ai una columna de hidroxiapatita de cerámica (Japan Bio-Rad Laboratories, jlnc, columna de hidroxiapatita Bio-Scale CHT2-1 (volumen de 2 mi)) equilibrada con a regulador de pH que contenía 5 mM NaPi, 50 mM MES, y 20 mM NaCI a pH 6.5. Después, se realizó la elución de gradiente de concentración! con cloruro de sodio, y una fracción que contenía el anticuerpo fue recolectada. La fracción se aplicó a una columna de desalación (fabricada por GE Healthcare Bioscience Co., Ltd., columna de desalación de 2 x 5 mi HiTrap en serie) y el líquido fue reemplazado por CBS (10 mM regulador de pH de citrato que contenía 140 mM cloruro de sodio, pH 6.0). Finalmente, la solución resultante se concentró usando Centrifugal UF Filter Device VIVASP-IN 20(peso molecular fraccionado: 30 K, Sartorius Co., Ltd., a 4°C), la concentración de IgG se ajustó a 1.0 mg/ml o más, y la solución asi obtenida se usó como' una muestra purificada. Los volúmenes de las muestras purificadas respectivas fueron como sigue: h#32A1-H1-1/L5: 2.2 mi, h#32A1-H5/L5: 1.8 mi, h#32A1- I H1-1/L2-16: 6.0 mi, y h#32A1-H1-1/L2-15: 2.2 mi.

I EJEMPLO 29 Evaluación de actividad biológica de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 basada en prueba para la formación de osteoclastos de ratón ¡ ! Un efecto inhibidor sobre la formación de osteoclastos de ratón exhibido por los anticuerpos humanizados obtenidos en los ejemplos 24 y 28 fue evaluado al modificar parcialmente el método descrito en el ejemplo 9.' Las I células no adherentes de médula ósea de ratón preparadas por el método del I ejemplo 8 se prepararon a 1.5 x 105 células/ml en un medio a-ME que í contenía 10% de FBS y 10 ng/ml de M-CSF (fabricado por R&D Systéms, i Inc.), la preparación de células resultante se sembró en cada pozo de una I placa de 96 pozos en una cantidad de 200 µ? y las células se cultivaron durante 2 días en una incubadora de C02. La solución de cultivo vieja en la placa de 96 pozos fue removida, y 100 µ? de medio MEM-a se añadió a cada pozo, los 100 µ? de medio MEM-a que contenia 10% de FBS al cual se había añadido RANKL humano (RANKL, fabricado por Peprotech, Inc.) y M-CSF para dar concentraciones finales de 20 ng/ml y 10 ng/ml, respectivamente. A la solución de cultivo de células, el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6 o cada uno de los 6 tipos de anticuerpo humanizado #32A1s (h#32A1-T1 , h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5 y h#32A1 -T6) preparados en el ejemplo 24 se añadió I a una concentración de 3 a 100 ng/ml, y las células se cultivaron durante 3 i i i días adicionales en una incubadora de CO2. Después de completarse el cultivo, la actividad de fosfatasa acida resistente a tartrato (TRAP) de los osteoclastos formados se midió por el siguiente procedimiento. La solución de i cultivo en cada pozo de la placa de 96 pozos fue removida por succión, y 50 µ? I de 50 mM de citrato de sodio regulador de pH (pH 6.1) que contenía 1 % de Tritón X-100 se añadió a cada pozo. Después, la placa se agitó durante 5 minutos sobre un agitador de placa para lisar las células. A cada pozo, 50 µ? de a solución de sustrato (50 mM citrato de sodio regulador de pH (pH 6.1) que contenía 5 mg/ml de p-nitrofenil fosfato y 0.46% de tartrato de sodio) se añadieron, y la placa se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, 50 µ? de una solución 1 N de hidróxido de sodio se añadió a cada pozo de la placa de 96 pozos para detener la reacción enzimática. Después de detener la reacción enzimática, se midió, una absorbancia de cada pozo a 405 nm, y la medición obtenida se usó como un índice de actividad de TRAP. Los resultados se muestran en las figuras 44A-44D y 45A-45D. Además, para el anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec- 5 de rata (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6, el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo #32A1 preparado en el ejemplo 19, y 4 tipos de anticuerpo humanizado #32A1s (h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16, y h#32A1-H1-1/L2-15) preparado en el ejemplo 28, la actividad i biológica fue evaluada por el mismo método que en esta prueba, y los resultados se muestran en las figuras 46A-46D y 47A-47D. En todos los casos de los 10 tipos de anticuerpo humanizado #32A1s (h#32A1-T1 , h#32A1 -T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1-T5, h#32A1-T6, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1- H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16, y h#32A1-H1-1/L2-15) para los cuales se evaluó la actividad, se observó una fuerte actividad de inhibir la formación de i osteoclastos sustancialmente comparable con la del anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata (anticuerpo #32A1 ) o el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo #32A1. ¡ EJEMPLO 30 Efecto de la adición de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 sobre la resorción de hueso actividad de células precursoras de osteoclastos humanos normales (evaluación que usó placa revestida con colágeno) Células precursoras de osteoclastos humanas normales (Normal Human Natural Osteoclast Precursor Cells, compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. 2T-1 10) se sembraron en una placa de cultivo OsteoLyse de 96 pozos (comprada de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PA-1500) a 1 x 10" células/pozo de conformidad con el protocolo que acompaña las células.

Como el medio, se usó un medio esencial mínimo para células precursoras de osteoclastos (OPBM, compradas de Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT- I 8201 ) complementados con un conjunto de complemento de OPGM (comprado con Sanko Junyaku Co., Ltd., Cat. No. PT-9501 ) que contenia suero de bovino fetal (concentración final: 10%), RANKL humano (concentración final: 63.8 ng/ml), M-CSF (concentración final humana; 33 ng/ml), y similares. Al sobrenadante de cultivo resultante, cada uno del anticuerpo monoclonal anti-ratón S¡glec-15 de rata (anticuerpo #32A1) preparado en el ejemplo 6, el anticuerpo quimérico humano del anticuerpo #32A1 preparado en el ejemplo 19, y los 10 tipos de anticuerpo humanizado #32A1s (h#32A1-T1 , h#32A1-T2, h#32A1-T3, h#32A1-T4, h#32A1¡-T5, h#32A1-T6, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L2-16, y h#32A1- H1-1/L2-15) preparados en los ejemplos 24 y 28 se añadió a una concentración final de 4, 20, 100 ó 500 ng/ml, y las células se cultivaron I durante 5 días en una incubadora de CO2. Una alícuota de 10 µ? del sobrenadante de cultivo fue recolectada, 200 µ? de reactivo de liberación de fluoróforo incluido en el OsteoLyse Assay Kit se añadió a la mism , y mediante el uso de un lector de placa de fluorescencia (ARVO MX, fabricado por Perkin Elmer Inc.), fluorometría resuelta en el tiempo (fluorómetro de fluorescencia resuelta en el tiempo) (Excitación: 340 nm, Emisión: 615 nm) adecuado para medición de fluorescencia usando europio se realizó, por lo que la cantidad de fragmentos libres de colágeno fluorescente liberado en el sobrenadante de cultivo se determinó (figuras 48A-48D y 49A-49B). Como resultado, la cantidad de fragmentos de colágeno fluorescente incrementado mediante la adición de RANKL fue reducido mediante la adición del anticuerpo #32A1 de rata o el anticuerpo quimérico humano #32A1 de una manera dependiente de la concentración. De la misma manera, también por todos los 10 tipos de anticuerpo humanizado #32A1 examinados, se observó una inhibición dependiente de la concentración. A partir de este resultado, se reveló que la actividad de resorción de hueso de osteoclastos humanos es inhibida por los anticuerpos humanizados #32A1 específicamente la unión, a la proteína Siglec-15. ! EJEMPLO 31 Evaluación biológica de anticuerpo humanizado de anticuerpo ; monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 usando ratas ovariectomizadas i Un efecto inhibidor sobre una disminución en la densidad de minerales en hueso en ratas ovariectomizadas presentado por el anticuerpo humanizado obtenido en los ejemplos 24 y 28 puede ser evaluado por el método descrito en el ejemplo 15.

EJEMPLO 32 Evaluación de actividad biológica de anticuerpo humanizado de anticuerpo monoclonal anti-ratón Siglec-15 de rata #32A1 basado en prueba para la formación de osteoclastos de ratón por estimulación con el FNTa ? ¡ Un efecto inhibidor sobre la formación de osteoclastos de ratón por estimulación con FNTa presentada por los anticuerpos humanizados obtenidos en los ejemplos 24 y 28 pueden ser evaluados por el método descrito en el ejemplo 26.

EJEMPLO 33 Determinación de estabilidad térmica de anticuerpo humanizado usando calorimetría de escudriñamiento diferencial (DSC) Para h#32A1-H5/L5, h#32A1-H1-1/L5, h#32A1-H1-1/L2-15, y j h#32A1-H1-1/L2-16, se determinó la estabilidad térmica. Cada una de las j muestras se preparó a una concentración de 0.5 mg/ml (en una solución de CBS), y una alícuota de 400 µ? de la misma se usó como una solución de muestra para la medición de DSC. Las condiciones para la medición de DSC se fijaron como sigue. Es decir, la temperatura inicial se fijó a 20°C, la temperatura final se fijó a 100°C, la velocidad de incremento de temperatura se fijó a 60°C/hora, y el tiempo en el filtro se fijó a 10 segundos. Como una solución de referencia, se usó CBS. Como un instrumento para la medición de DSC se usó la plataforma, VP-Capillary DSC fabricada por MicroCal Inc.

E.U.A. La linea basal (una curva de escudriñamiento obtenida al llenar la solución de referencia también en una celda de muestras) se sustrajo de una • i curva de escudriñamiento obtenida para cada solución de muestra, por lo que i se realizó la corrección de linea basal. La figura 50 muestra un termograma para h#32A1-H5/L5, la figura 51 muestra un termograma para h#32A1-H1 - 1/L5, la figura 52 muestra un termograma para h#32A1-H1-1/L2-15, y la figura 53 muestra un termograma para h#32A1-H1-1/L2-16. Cuando un valor superior pico en cada termograma se tomó como una temperatura de punto medio de desnaturalización térmica (Tm) en la región Fab, el valor de Tm de h#32A1-H5/L5 fue 81.2°C, el valor de Tm de h#32A1-H1-1/L5 fue 84.1 °C, el valor de Tm de h#32A1-H1-1/L2-15 fue 80.0°C, y el valor de Tm de h#32A1- H1-1/L2-16 (lgG2) fue 77.9°C. j i Aplicabilidad industrial ¡ El anticuerpo anti-Siglec-15 quimérico o humanizado de la invención tiene una capacidad para inhibir la diferenciación de osteoclastos o actividad de resorción de hueso, y una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-Siglec-15 puede ser un agente terapéutico o preventivo para una enfermedad del metabolismo anormal de hueso.

Número de acceso ! i FERM BP-10999 1 i

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES !

1.- Un anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo que se une a un polipétido que comprende residuos de aminoácidos 39 a 165 de¡una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 2 e inhibe la formación de osteoclastos y/o resorción osteoclástica de hueso. ¡

2. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: ¡una secuencia de cadena pesada contiene una región variable que tiene CDRH1 , I CDRH2, y CDRH3, y la CDRH1 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 44, la CDRH2 comprende cualquiera dé las secuencias de aminoácidos representadas por SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 97, y la CDRH3 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 46; y una secuencia de cadena ligera contiene una región variable que tiene CDRL1 , CDRL2, y CDRL3, y la CDRL1 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 47, la CDRL2 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 48, y la CDRL3 comprende una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 49.

3. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque contiene una secuencia de región variable de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 y una secuencia de región variable de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 132 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 43.

4. - El fragmento funcional del anticuerpo de conformidad | con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que se selecciona del grupo que consiste de Fab, F(ab')2, Fab' y Fv.

5. - El anticuerpo de conformidad con cualquiera de ¡ las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque es scFv.

6. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

7. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 41 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 237 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 43. j

8.- El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y 6, caracterizado además porque el anticuerpo es humanizado.

9.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque la cadena pesada tiene una región constante de i una cadena pesada de inmunoglobulina G2 humana y la cadena ligera tiene una región constante de una cadena ligera ? de inmunoglobulina humana.

10.- Un anticuerpo que inhibe la formación de osteoclastos y/o resorción osteoclástica de hueso o un fragmento funcional del anticuerpo, caracterizado además porque el anticuerpo contiene: (a) una región variable de cadena pesada seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos: a1) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 ; a2) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de j una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 53; a3) una I secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55; a4) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 aj 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 57; a5) una i secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a1 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 59; a6) una i secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a' 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99; a7) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 101 ; a8) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 95% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de a1) a a7); a9) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de a1) aj a7); y a10) una secuencia de aminoácidos que incluye una sustitución, deleción o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en cualquiera de( las secuencias de aminoácidos seleccionadas de a1) a a7); y (b) una región variable de cadena ligera seleccionada del grupo que consiste de las siguientes secuencias de aminoácidos: b1) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 61 ; b2) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de j una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 63; b3) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 65; b4) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a! 132 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 67, b5) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 á 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69; b6) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 71 ; b7) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO. 103; b8) una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 105; b9) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 95% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de b1) a b8)¡ b10) una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de por lo menos 99% con cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de b1) a b8); y b11) una secuencia de aminoácidos que incluye una sustitución, j deleción o adición de uno a varios residuos de aminoácidos en cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de b1 ) a b8).

1 1. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de 'una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 61.

12. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 53 y una secuencia de cadena ligera , que I i ¡ contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia i de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 63.

13. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende I residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 65. !

14. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 67.

15. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69.

16. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 59 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 71.

17. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 0, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia I de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una i secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69.

18. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene i una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 101 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69. '

19. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 dé una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 103. i

20. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que contiene una región variable de cadena I I pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 20 a 140 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que contiene una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende residuos de aminoácidos 21 a 133 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 105.

21. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 51 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 61.

22. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 53 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 63.

23. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a ¡ i I 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 65. 1

24. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 55 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos|21 a 237 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 67.

25. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 57 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoác¡dosi21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69.

26. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 470 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 59 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos'21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 71 .

27.- El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos ,21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69.

28. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 101 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 69. i

29. - El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 103.-

30.- El anticuerpo o un fragmento funcional del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque contiene una secuencia de cadena pesada que comprende residuos de aminoácidos 20 a 466 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 99 y una secuencia de cadena ligera que comprende residuos de aminoácidos 21 a 238 de una secuencia de aminoácidos representada por SEQ ID NO: 105.'

31 - Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende por lo menos uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos de las reivindicaciones 1 a 30. i

32.- La composición farmacéutica de conformidad con la i reivindicación 31 , para usarse como un agente terapéutico y/o preventivo para el metabolismo anormal de hueso. !

33 - Una composición farmacéutica útil para tratar y/o prevenir el metabolismo anormal de hueso, caracterizada porque comprende por lo j menos uno de los anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos de las reivindicaciones 1 a 30 y por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de bisbifosfonatos, vitamina D3 activa, calcitonina y derivados de los mismos, hormonas tales como estradiol, SERMs (moduladores de receptor de estrógeno selectivos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), agentes antiinflamatorios no esteroideos, receptores de TNF solubles, anti-TNF-a anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anti-PTHrP (proteína í relacionada con hormona paratiroidea) anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas de receptor de IL- , anticuerpos anti-receptor de IL-1 o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anticuerpos anti-RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos, y OCIF (factor inhibidor de i osteoclastogénesis).

34.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 32 ó 33, caracterizada además porque el metabolismo anormal de hueso se selecciona del grupo que consiste de osteoporosis, artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, hipercalcemia cancerosa, I mieloma múltiple acompañante de destrucción de hueso o metástasis de cáncer a hueso, tumor de células gigantes, osteopenia, pérdida de dientes I debido a periodontitis, osteólisis alrededor de una articulación prostética, destrucción de hueso en osteomielitis crónica, enfermedad de los huesos de i Paget, osteodistrofia renal, y osteogénesis imperfecta.

35.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada además porque el metabolismo anormal de hueso es osteoporosis, artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, o metástasis de cáncer a hueso acompañante de destrucción de hueso.

36.- La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque el metabolismo anormal de hueso es osteoporosis.

37. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque la osteoporosis es osteoporosis postmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debido al uso de un agente terapéutico tales como un esferoide o un inmunosupresor, o artritis reumatoide acompañante de osteoporosis. !

38. - El uso de un anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 30, o un fragmento funcional del mismo, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención del metabolismo anormal de hueso.

39. - El uso de un anticuerpo de las reivindicaciones 1 a 30, o un fragmento funcional del mismo y por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste de bisbifosfonatos, vitamina D3 activa, calcitoniña y derivados de los mismos, hormonas tales como estradiol, SERMs (moduladores de receptor de estrógeno selectivos), ipriflavona, vitamina K2 (menatetrenona), preparaciones de calcio, PTH (hormona paratiroidea), I agentes antiinflamatorios no esteroideos, receptores de TNF solubles, anti- I TNF-a anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anti-PTHrP (proteína relacionada con hormona paratiroidea) anticuerpos o fragmentos funcionales de los anticuerpos, antagonistas de receptor de IL-1 , anticuerpos anti-receptor de IL-1 o fragmentos funcionales de los anticuerpos, anticuerpos anti-RANKL o fragmentos funcionales de los anticuerpos, y OCIF (factor inhibidor de osteoclastogénesis) para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención metabolismo anormal de hueso, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo están adaptados para ser administrables de manera simultánea o sucesiva.

40. - El uso como se reclama en la reivindicación 38 ó 39, en donde el metabolismo anormal de hueso es osteoporosis, artritis reumatoide acompañante de destrucción de hueso, o metástasis de cáncer a hueso acompañante de destrucción de hueso.

41. - El uso como se reclama en la reivindicación 40, en donde el metabolismo anormal de hueso es osteoporosis. ¡

42.- El uso como se reclama en la reivindicación 41 , en donde la osteoporosis es osteoporosis postmenopáusica, osteoporosis senil, osteoporosis secundaria debido al uso de un agente terapéutico tal como un i esteroide o un inmunosupresor, o artritis reumatoide acompañante de i 250 i osteoporosis. 1

43. - Un polinucleótido que codifica el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, y 10 a 30. i

44. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque contiene una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos i representada por SEQ ID NO: 40 y una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 42. !

45.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación' 44, caracterizado además porque contiene una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 40 y una secuencia de nucleótidos ¡que comprende los nucleótidos 61 a 711 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 42.

46.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado además porque contiene: (a) un polinucleótido seleccionado del i grupo que consiste de las siguientes secuencias de nucleótidos: a1 ) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de luna secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 50; a2) !una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de ¡una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 52; a3) ,una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una I ¡ I i secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54; a4) ¡una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una i secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 56; a5) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una i secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 58; a6) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de ,una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98; al) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de !una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 100; a8) una I secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que híbrida a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementarios a cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de a1) a al) bajo condiciones astringentes; y a9) una secuencia de nucleótidos que incluye una sustitución, deleción o adición de uno a varios nucleótidos en cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de a1 ) a al); y (b) un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste de las siguientes secuencias de nucleótidos: b1) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO:¡ 60; b2) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 62; b3) ¡una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 64; b4) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 66; b5) ¡ una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68; b6) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 70; b7) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 102; b8) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 104; b9) una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido que híbrida a un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos complementarios a cualquiera de las secuencias de nucleótidos seleccionadas de b1) a b8) bajo condiciones astringentes; y b10) una secuencia de nucleótidos que incluye una sustituqión, deleción o adición de uno a varios nucleótidos en cualquiera de ^ las secuencias de nucleótidos seleccionadas de b1) a b8).

47. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 50, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 60. ,

48. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación ! 46, I caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 52, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende i los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 62. I

49.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una i secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una i secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54, y un i polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 64.

50 - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 396 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 66. j

51 - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una I secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una I secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 56, un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. I

52.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una i secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 58, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 70.

53. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68.

54. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación' 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 100, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende i los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. ,

55.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende) una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de¡ una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y: un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprénde los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 102. '

56.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, í caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 420 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 399 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 104.

57 - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende, una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de¡ una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 50, y! un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 60. ' | I I

58. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 52, y! , un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por I SEQ ID NO: 62.

59. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de l una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54, yj un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 64. '

60.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación! 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende ¡una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 54, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 711 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 66. j

61 .- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una i secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una I secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 56, y un I polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada^ por SEQ ID NO: 68. 1

62. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación' 46, . i caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende ¡una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1410 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 58, y ' un I polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada! por SEQ ID NO: 70. i

63. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación ¡ 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1398 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y i un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68.

64.- El polinucleótido de conformidad con la reivindicación i 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1398 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 100, y , un i i 258 i polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 68. ¡

65. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación! 46. caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende ¡una secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1398 de luna secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y' un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende i los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 102. '

66. - El polinucleótido de conformidad con la reivindicación' 46, caracterizado además porque contiene un polinucleótido que comprende una I secuencia de nucleótidos que comprende los nucleótidos 58 a 1398 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 98, y un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que comprende I los nucleótidos 61 a 714 de una secuencia de nucleótidos representada por SEQ ID NO: 104.

67. - Un vector, que comprende cualquiera de los polinucleótidos de las reivindicaciones 43 a 66. ¡

68.- Una célula hospedera transformada, que comprende cualquiera de los polinucleótidos de las reivindicaciones 43 a 66. 1

69.- Una célula hospedera transformada, que comprendé el I vector de la reivindicación 67.

70.- Un método para producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 3, 7, y 10 a 30, que comprende cultivar la célula hospedera de la reivindicación 68 ó 69, y purificar un anticuerpo del producto de cultivo resultante. I I i