TWI833761B - 抗人類ｔｌｒ７抗體以及其製造方法及用途 - Google Patents
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Abstract
藉由本發明而提供一種包含抗體的醫藥組成物等，該抗體係特異性地結合至人類TLR7或猴TLR7，且不結合至小鼠TLR7或大鼠TLR7，而具有抑制人類TLR7或猴TLR7的機能之活性。
Description
本發明係關於用以治療障礙及疾病之抗人類類鐸受體(Toll-like receptor：TLR)7。
為型態辨識分子(pattern recognition molecule)之TLR，已知於人類中存在10種類，且形成一個家族。其中，TLR7(變異體1)為包含1049個胺基酸的單次跨膜蛋白，而在偵測單股RNA並經由I型干擾素或細胞介素產生等而負責生物防禦反應的另一方面，亦被暗示有在各式各樣的發炎性疾病、自體免疫疾病的疾病狀態之形成中扮演重要角色的可能性(非專利文獻1)。又，對於TLR7(變異體2)亦已知為包含1049個胺基酸的單次跨膜蛋白的變異體，且已知具有與上述TLR7(變異體1)相同的機能(非專利文獻2)。特別是於乾癬或全身性紅斑狼瘡等的疾病中，有許多暗示TLR7之參與的報告，而利用TLR7的機能抑制之疾病治療受到期待(非專利文獻3)。
又，從暗示在TLR7缺損於疾病模式中對症狀的減輕起作用的另一方面，TLR9缺損會參與疾病的惡化之報告來看，可認為能特異性地抑制TLR7的藥劑在發炎性疾病等的治療中為有望者(非專利文獻4)。
迄今，雖已嘗試以人類TLR7抑制為目標的核酸或低分子化合物等的研究開發，但難以藉由核酸或低分子化合物等而達成人類TLR7特異性抑制；又，作為TLR7抗體雖已知有小
鼠抗小鼠TLR7抗體(專利文獻1)，但冀求新的人類TLR7特異性抑制劑的研究開發。
[專利文獻1] WO2014/174704
[非專利文獻1] Takeuchi O, Akira S. Cell. 2010 Mar 19; 140(6): 805-2
[非專利文獻2] Chuang TH, Ulevitch RJ, Eur Cytokine Netw. 2000 Sep; 11(3): 372-8
[非專利文獻3] Lyn-Cook BD, Xie C, Oates J, Treadwell E, Word B, Hammons G, Wiley K. Mol Immunol. 2014 Sep; 61(1): 38-43.
[非專利文獻4] Christensen SR, Shupe J, Nickerson K, Kashgarian M, Flavell RA, Shlomchik MJ Immunity. 2006 Sep; 25(3): 417-28.
本發明的目的在於提供免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症、癌症的治療及/或預防劑。
本發明人等為了解決上述課題，探索具有免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症、癌症的治療及/或預防效果的物質，並取得了小鼠抗人類TLR7抗體。將所得的小鼠抗人類TLR7抗體進行人源化，進一步改變該人源化抗體的CDR、框架(framework)及可變區而完成了本發明。
亦即，本發明包含以下的發明。
(1)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其特徵係具有以下之特性：(a)特異性地結合至人類TLR7或猴TLR7，且不結合至小鼠TLR7或大鼠TLR7；及(b)抑制人類TLR7或猴TLR7的機能。
(2)如上述(1)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其中人類TLR7為包含序列識別號2或序列識別號4所記載的胺基酸序列的分子、或猴TLR7為包含序列識別號85所記載的胺基酸序列的分子、或小鼠TLR7為包含序列識別號83所記載的胺基酸序列的分子、或者大鼠TLR7為包含序列識別號84所記載的胺基酸序列的分子。
(3)如上述(1)或(2)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其在對人類TLR7的結合中，係與下列抗體具有競爭抑制活性：具有重鏈及輕鏈的抗體，該重鏈具有包含序列識別號5所記載的胺基酸序列之重鏈可變區，該輕鏈具有包含序列識別號11所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；具有重鏈及輕鏈的抗體，該重鏈具有包含序列識別號7所記載的胺基酸序列之重鏈可變區，該輕鏈具有包含序列識別號13所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；或者具有重鏈及輕鏈的抗體，該重鏈具有包含序列識別號9所記 載的胺基酸序列之重鏈可變區，該輕鏈具有包含序列識別號15所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(4)如上述(1)至(3)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號17所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號18所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號19所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號20所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號21所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號22所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區；(b)包含序列識別號23所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號24所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號25所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號26所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號27所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號28所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區；或者(c)包含序列識別號29所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號30所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號31所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號32所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含 序列識別號33所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號34所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區。
(5)如上述(4)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號17所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號18所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號19所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號20所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號21所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號22所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區。
(6)如上述(1)至(5)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號5所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號11所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含序列識別號7所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號13所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；或者(c)包含序列識別號9所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號15所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(7)如上述(1)至(6)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係恒定區係源自人類的恒定區。
(8)如上述(7)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有： (a)包含序列識別號35所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號36所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(b)包含序列識別號37所記載的胺基酸序列中之第20號至第471號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號38所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；或者(c)包含序列識別號39所記載的胺基酸序列中之第20號至第470號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號40所記載的胺基酸序列中之第21號至第234號的胺基酸序列之輕鏈。
(9)如上述(1)至(8)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係被人源化(humanized)。
(10)如上述(9)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(I)包含選自包含以下(a)~(d)之群組的胺基酸序列之重鏈可變區：(a)序列識別號41所記載的胺基酸序列、(b)序列識別號42所記載的胺基酸序列、(c)相對於(a)或(b)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(d)於(a)或(b)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列，以及包含選自包含以下(e)~(h)之群組的胺基酸序列之輕鏈可變區：(e)序列識別號43所記載的胺基酸序列、(f)序列識別號44所記載的胺基酸序列、(g)相對於(e)或(f)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(h)於(e)或(f)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列；或者(II)包含選自包含以下(a)~(c)之群組的胺基酸序列之重鏈可變區：(a)序列識別號50所記載的胺基酸序列、(b)相對於(a)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(c)於(a)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列，以及包含選自包含以下(d)~(f)之群組的胺基酸序列之輕鏈可變區：(d)序列識別號51所記載的胺基酸序列、(e)相對於(d)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(f)於(d)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列。
(11)如上述(10)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、
及包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(d)包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；或者(e)包含序列識別號50所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號51所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(12)如上述(11)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(13)如上述(11)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(b)包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(c)包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(d)包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(e)包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(f)包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(g)包含序列識別號52所記載的胺基酸序列中之第20號至第471號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號53所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；或者(h)包含序列識別號54所記載的胺基酸序列中之第20號至第468號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號53所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(14)如上述(13)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(15)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其特徵係具有以下之特性：(a)特異性地結合至人類TLR7；(b)抑制人類TLR7的機能；及(c)具有：(1)包含序列識別號17所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號18所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號19所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號20所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號21所記載的胺基酸序列的CDRL2 及包含序列識別號22所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區；(2)包含序列識別號23所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號24所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號25所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號26所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號27所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號28所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區；或者(3)包含序列識別號29所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號30所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號31所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號32所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號33所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號34所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區。
(16)如上述(15)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號17所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號18所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號19所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號20所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號21所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號22所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定 區。
(17)如上述(15)或(16)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號5所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號11所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含序列識別號7所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號13所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；或者(c)包含序列識別號9所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號15所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(18)如上述(15)至(17)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係恒定區係源自人類的恒定區。
(19)如上述(18)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號35所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號36所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(b)包含序列識別號37所記載的胺基酸序列中之第20號至第471號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號38所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；或者(c)包含序列識別號39所記載的胺基酸序列中之第20號至第470號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號40所記載的胺基酸序列中之第21號至第234號的胺基酸序列之輕鏈。
(20)如上述(15)至(19)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係被人源化。
(21)如上述(20)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具 有：(I)包含選自包含以下(a)~(d)之群組的胺基酸序列之重鏈可變區：(a)序列識別號41所記載的胺基酸序列、(b)序列識別號42所記載的胺基酸序列、(c)相對於(a)或(b)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(d)於(a)或(b)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列，以及包含選自包含以下(e)~(h)之群組的胺基酸序列之輕鏈可變區：(e)序列識別號43所記載的胺基酸序列、(f)序列識別號44所記載的胺基酸序列、(g)相對於(e)或(f)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(h)於(e)或(f)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列；或者(II)包含選自包含以下(a)~(c)之群組的胺基酸序列之重鏈可變區：(a)序列識別號50所記載的胺基酸序列、(b)相對於(a)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(c)於(a)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列，以及包含選自包含以下(d)~(f)之群組的胺基酸序列之輕鏈可變區：(d)序列識別號51所記載的胺基酸序列、(e)相對於(d)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(f)於(d)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列。
(22)如上述(21)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(d)包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；或者(e)包含序列識別號50所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號51所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(23)如上述(22)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(24)如上述(22)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的
胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(b)包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(c)包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(d)包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(e)包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(f)包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(g)包含序列識別號52所記載的胺基酸序列中之第20號至第471號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號53所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；或者(h)包含序列識別號54所記載的胺基酸序列中之第20號至第468號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號53所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(25)如上述(24)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(26)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(27)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(28)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(29)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(30)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號52所記載的胺基酸序列中之第20號至第471號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號53所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(31)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號54所記載的胺基酸序列中之第20號至第468號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號53所記載的胺基酸序列中 之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
(32)如上述(26)至(31)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有以下之特性：(a)特異性地結合至人類TLR7、及(b)抑制人類TLR7的機能。
(33)如上述(1)至(32)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段，其中抗原結合性片段係選自包含Fab、F(ab)2、Fab’及Fv之群組。
(34)一種多核苷酸，其具有編碼如上述(1)至(33)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段之多核苷酸序列。
(35)如上述(34)所記載的多核苷酸，其具有：(1)編碼包含序列識別號17所記載的胺基酸序列的CDRH1之多核苷酸序列、編碼包含序列識別號18所記載的胺基酸序列的CDRH2之多核苷酸序列、及編碼包含序列識別號19所記載的胺基酸序列的CDRH3之多核苷酸序列，以及編碼包含序列識別號20所記載的胺基酸序列的CDRL1之多核苷酸序列、編碼包含序列識別號21所記載的胺基酸序列的CDRL2之多核苷酸序列、及編碼包含序列識別號22所記載的胺基酸序列的CDRL3之多核苷酸序列；(2)編碼包含序列識別號23所記載的胺基酸序列的CDRH1之多核苷酸序列、編碼包含序列識別號24所記載的胺基酸序列的CDRH2之多核苷酸序列、及編碼包含序列識別號25所記載的胺基酸序列的CDRH3之多核苷酸序列，以及編碼包含序列識別號26所記載的胺基酸序列的CDRL1之多核苷酸序列、編碼包含序列識別號27所記載的胺基酸序列的CDRL2之多核苷酸序列、及編碼包含序列識別號28所記載的胺 基酸序列的CDRL3之多核苷酸序列；或者(3)編碼包含序列識別號29所記載的胺基酸序列的CDRH1之多核苷酸序列、編碼包含序列識別號30所記載的胺基酸序列的CDRH2之多核苷酸序列、及編碼包含序列識別號31所記載的胺基酸序列的CDRH3之多核苷酸序列，以及編碼包含序列識別號32所記載的胺基酸序列的CDRL1之多核苷酸序列、編碼包含序列識別號33所記載的胺基酸序列的CDRL2之多核苷酸序列、及編碼包含序列識別號34所記載的胺基酸序列的CDRL3之多核苷酸序列。
(36)如上述(35)所記載的多核苷酸，其具有：(I)選自包含以下(a)~(c)之群組的多核苷酸序列：(a)編碼序列識別號77所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、(b)編碼序列識別號78所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及(c)會與後述多核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的多核苷酸所具有之多核苷酸序列：包含與(a)或(b)之多核苷酸序列為互補之多核苷酸序列的多核苷酸，以及選自包含以下(d)~(f)之群組的多核苷酸序列：(d)編碼序列識別號79所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列、(e)編碼序列識別號80所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列、及(f)會與後述多核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的多核苷酸所具有之多核苷酸序列：包含與(d)或(e)之多核苷酸序列為互補之多核苷酸序列的多核苷酸；或者(II)選自包含以下(a)~(b)之群組的多核苷酸序列：(a)編碼序列識別號81所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及(b)會與後述多核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的多核苷酸所具 有之多核苷酸序列：包含與(a)之多核苷酸序列為互補之多核苷酸序列的多核苷酸，以及選自包含以下(c)~(d)之群組的多核苷酸序列：(c)編碼序列識別號82所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列、及(d)會與後述多核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的多核苷酸所具有之多核苷酸序列：包含與(c)之多核苷酸序列為互補之多核苷酸序列的多核苷酸。
(37)如上述(36)所記載的多核苷酸，其具有：(a)編碼序列識別號77所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號79所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列；(b)編碼序列識別號77所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號80所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列；(c)編碼序列識別號78所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號79所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列；(d)編碼序列識別號78所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號80所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列；或者(e)編碼序列識別號81所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號82所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列。
(38)一種表現載體，其含有如上述(34)至(37)中任一項所記載的多核苷酸。
(39)一種宿主細胞，其係藉由如上述(38)所記載的表現載體而被轉形。
(40)如上述(39)所記載的宿主細胞，其中宿主細胞為真核細胞。
(41)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段之製造方法，其特徵為 包含：培養如上述(39)或(40)所記載的宿主細胞的步驟、及從該步驟所得的培養物採取目標之該抗體或該片段的步驟。
(42)一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其特徵為其係藉由如上述(41)所記載的製造方法而得。
(43)如上述(1)至(32)中任一項所記載的抗體，其包含選自包含下列之群組的1或2種以上的修飾：對N-鍵結之醣苷化(glycosylation)、對O-鍵結之醣苷化、N末端的加工(processing)、C末端的加工、脫醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、對N末端之甲硫胺酸殘基的附加、脯胺酸殘基的醯胺化、及重鏈的羧基末端之1個或2個胺基酸的缺失。
(44)如上述(43)所記載的抗體，其中2條重鏈係包含選自包含下列之群組的重鏈之任一種或任兩種的組合之重鏈：完整長度、及於羧基末端有1個或2個胺基酸缺失的缺失體。
(45)如上述(44)所記載的抗體，其中在2條重鏈雙方於羧基末端有1個胺基酸缺失。
(46)如上述(43)至(45)中任一項所記載的抗體，其係重鏈的羧基末端之脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
(47)一種用於疾病的治療及/或預防之醫藥組成物，其特徵為含有如上述(1)至(33)及(42)至(46)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段之至少一者、或者如上述(38)所記載的表現載體作為有效成分。
(48)如上述(47)所記載的醫藥組成物，其係用於治療起因於人類TLR7的機能之疾病。
(49)如上述(48)所記載的醫藥組成物，其中起因於人類TLR7的 機能之疾病為免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症或癌症。
(50)如上述(49)所記載的醫藥組成物，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型特發性關節炎、成人史迪爾氏病(adult-onset Still's disease)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、全身性硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、混合性結締組織疾病或肌肉萎縮症。
(51)如上述(49)或(50)所記載的醫藥組成物，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡。
(52)如上述(47)至(51)中任一項所記載的醫藥組成物，其係用以與免疫抑制劑、抗發炎劑、抗過敏劑、抗感染劑或抗癌劑併用。
(53)一種起因於人類TLR7的機能之疾病之治療方法，其特徵為將如上述(1)至(33)及(42)至(46)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段之至少一者對個體進行投予。
(54)一種起因於人類TLR7的機能之疾病之治療方法，其特徵為將如上述(1)至(33)及(42)至(46)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段之至少一者以及免疫抑制劑、抗發炎劑、抗過敏劑、抗感染劑或抗癌劑，對個體同時地、各別地、或連續地進行投予。
(55)如上述(53)或(54)所記載的治療方法，其中起因於人類TLR7的機能之疾病為免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症或癌症。
(56)如上述(55)所記載的治療方法，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型特發性關節炎、成人 史迪爾氏病、僵直性脊椎炎、全身性硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、混合性結締組織疾病或肌肉萎縮症。
(57)如上述(55)或(56)所記載的治療方法，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡。
(58)一種如上述(1)至(33)及(42)至(46)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段或者如上述(38)所記載的表現載體，其係用於起因於人類TLR7的機能之疾病的治療或預防之用途。
(59)如上述(58)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段或者表現載體，其中起因於人類TLR7的機能之疾病為免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症或癌症。
(60)如上述(59)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段或者表現載體，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型特發性關節炎、成人史迪爾氏病、僵直性脊椎炎、全身性硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、混合性結締組織疾病或肌肉萎縮症。
(61)如上述(59)或(60)所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段或者表現載體，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡。
(62)如上述(59)至(61)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段或者表現載體，其係用以與免疫抑制劑、抗發炎劑、抗過敏劑、抗感染劑或抗癌劑併用。
(63)一種如上述(1)至(33)及(42)至(46)中任一項所記載的抗體或該抗體的抗原結合性片段或者如上述(38)所記載的表現載體之用途，其係用於製造起因於人類TLR7的機能之疾病的 治療劑或預防劑。
(64)如上述(63)所記載的用途，其中起因於人類TLR7的機能之疾病為免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症或癌症。
(65)如上述(64)所記載的用途，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型特發性關節炎、成人史迪爾氏病、僵直性脊椎炎、全身性硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、混合性結締組織疾病或肌肉萎縮症。
(66)如上述(64)或(65)所記載的用途，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡。
(67)如上述(63)至(66)中任一項所記載的用途，其中治療劑或預防劑係與免疫抑制劑、抗發炎劑、抗過敏劑、抗感染劑或抗癌劑併用。
若依據本發明，則可得到以TLR7的機能抑制作為作用機制之免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症、癌症的治療劑及/或預防劑。
[圖1]圖1係呈示人類TLR7(變異體1)之胺基酸序列(序列識別號2)的圖。
[圖2]圖2係呈示人類TLR7(變異體2)之胺基酸序列(序列識別號4)的圖。
[圖3]圖3係呈示小鼠TLR7之胺基酸序列(序列識別號83)的圖。
[圖4]圖4係呈示大鼠TLR7之胺基酸序列(序列識別號84)的圖。
[圖5]圖5係呈示猴TLR7之胺基酸序列(序列識別號85)的圖。
[圖6]圖6係呈示AT01抗體、NB7抗體、及FAN2抗體會添加濃度依賴性地抑制來自經CL-264處理的人類末梢血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell)(以下，PBMC)之IL-6的產生的圖。
[圖7]圖7係呈示cAT01抗體之包含訊息序列的重鏈胺基酸序列(序列識別號35)及包含訊息序列的輕鏈胺基酸序列(序列識別號36)的圖。於重鏈胺基酸序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第135號的胺基酸序列為重鏈可變區，第136號至第465號的胺基酸序列為重鏈恒定區。於輕鏈胺基酸序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第126號的胺基酸序列為輕鏈可變區，第127號至第233號的胺基酸序列為輕鏈恒定區。
[圖8]圖8係呈示cNB7抗體之包含訊息序列的重鏈胺基酸序列(序列識別號37)及包含訊息序列的輕鏈胺基酸序列(序列識別號38)的圖。於重鏈胺基酸序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第141號的胺基酸序列為重鏈可變區，第142號至第471號的胺基酸序列為重鏈恒定區。於輕鏈胺基酸序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第126號的胺基酸序列為輕鏈可變區，第127號至第233號的胺基酸序列為輕鏈恒定區。
[圖9]圖9係呈示cFAN2抗體之包含訊息序列的重鏈胺基 酸序列(序列識別號39)及包含訊息序列的輕鏈胺基酸序列(序列識別號40)的圖。於重鏈胺基酸序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第140號的胺基酸序列為重鏈可變區，第141號至第470號的胺基酸序列為重鏈恒定區。於輕鏈胺基酸序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第127號的胺基酸序列為輕鏈可變區，第128號至第234號的胺基酸序列為輕鏈恒定區。
[圖10]圖10係呈示為嵌合化抗人類TLR7抗體之cAT01、cNB7、cFAN2會添加濃度依賴性地抑制來自經CL-264處理的人類PBMC之IL-6的產生的圖。
[圖11]圖11係呈示為經人源化的重鏈之huAT01_H1_IgG1LALA之包含訊息序列的重鏈胺基酸序列(序列識別號45)的圖。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第135號的胺基酸序列為可變區，第136號至第465號的胺基酸序列為恒定區。又，第45號至第54號的胺基酸序列為CDRH1，第69號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第118號至第124號的胺基酸序列為CDRH3。
[圖12]圖12係呈示為經人源化的重鏈之huAT01_H3_IgG1LALA之包含訊息序列的重鏈胺基酸序列(序列識別號46)的圖。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第135號的胺基酸序列為可變區，第136號至第465號的胺基酸序列為恒定區。又，第45號至第54號的胺基酸序列為CDRH1，第69號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第118號至第124號的胺基酸序列為CDRH3。
[圖13]圖13係呈示為經人源化的重鏈之huAT01_H3_ IgG4Pro之包含訊息序列的重鏈胺基酸序列(序列識別號47)的圖。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第135號的胺基酸序列為可變區，第136號至第462號的胺基酸序列為恒定區。又，第45號至第54號的胺基酸序列為CDRH1，第69號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第118號至第124號的胺基酸序列為CDRH3。
[圖14]圖14係呈示為嵌合化抗體cAT01的重鏈之cAT01_H之可變區的胺基酸序列(序列識別號5)(以下，cAT01_H)、以及人源化抗體重鏈huAT01_H1_IgG1LALA之可變區的胺基酸序列(序列識別號41)(以下，huAT01_H1)及huAT01_H3_IgG1LALA之可變區的胺基酸序列(序列識別號42)(以下，huAT01_H3)之比較的圖。huAT01_H1及huAT01_H3的序列中的「‧」表示與cAT01_H相同的胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基的地方表示經取代的胺基酸殘基。
[圖15]圖15係呈示為經人源化的輕鏈之huAT01_L1之包含訊息序列的輕鏈胺基酸序列(序列識別號48)的圖。於該序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第126號的胺基酸序列為可變區，第127號至第233號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號44號至54號為CDRL1，胺基酸編號70號至76號為CDRL2，胺基酸編號109號至116號為CDRL3。
[圖16]圖16係呈示為經人源化的輕鏈之huAT01_L2之包含訊息序列的輕鏈胺基酸序列(序列識別號49)的圖。於該序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第126號的胺基酸序列為可變區，第127號至第233號的胺基酸 序列為恒定區。又，胺基酸編號44號至54號為CDRL1，胺基酸編號70號至76號為CDRL2，胺基酸編號109號至116號為CDRL3。
[圖17]圖17係呈示為嵌合化抗體cAT01的輕鏈之cAT01_L之可變區的胺基酸序列(序列識別號11)(以下，cAT01_L)、以及人源化抗體輕鏈huAT01_L1之可變區的胺基酸序列(序列識別號43)(以下，huAT01_L1)及huAT01_L2之可變區的胺基酸序列(序列識別號44)(以下，huAT01_L2)之比較的圖。huAT01_L1及huAT01_L2的序列中的「‧」表示與cAT01_L相同的胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基的地方表示經取代的胺基酸殘基。
[圖18]圖18係呈示為經人源化的重鏈之huNB7_H3_IgG1LALA之包含訊息序列的重鏈胺基酸序列(序列識別號52)的圖。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第141號的胺基酸序列為可變區，第142號至第471號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號45號至55號為CDRH1，胺基酸編號70號至78號為CDRH2，胺基酸編號118號至130號為CDRH3。
[圖19]圖19係呈示為經人源化的重鏈之huNB7_H3_IgG4Pro之包含訊息序列的重鏈胺基酸序列(序列識別號54)的圖。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第141號的胺基酸序列為可變區，第142號至第468號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號45號至55號為CDRH1，胺基酸編號70號至78號為CDRH2，胺基酸編號118號至130號為CDRH3。
[圖20]圖20係呈示為嵌合化抗體cNB7的重鏈之cNB7_H之可變區的胺基酸序列(序列識別號7)(以下，cNB7_H)、及人源化抗體重鏈huNB7_H3_IgG1LALA之可變區的胺基酸序列(序列識別號50)(以下，huNB7_H3)之比較的圖。huNB7_H3中的「‧」表示與cNB7_H相同的胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基的地方表示經取代的胺基酸殘基。
[圖21]圖21係呈示為經人源化的輕鏈之huNB7_L3之包含訊息序列的輕鏈胺基酸序列(序列識別號53)的圖。於該序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第126號的胺基酸序列為可變區，第127號至第233號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號44號至54號為CDRL1，胺基酸編號70號至76號為CDRL2，胺基酸編號109號至116號為CDRL3。
[圖22]圖22係呈示為嵌合化抗體cNB7的輕鏈之cNB7_L之可變區的胺基酸序列(序列識別號13)(以下，cNB7_L)、以及人源化抗體輕鏈huNB7_L3之可變區的胺基酸序列(序列識別號51)(以下，huNB7_L3)之比較的圖。huNB7_L3中的「‧」表示與cNB7_L相同的胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基的地方表示經取代的胺基酸殘基。
[圖23]圖23係呈示人源化抗人類TLR7抗體(huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、huNB7_H3L3_IgG4Pro)會添加濃度依賴性地抑制來自經CL-264處理的人類PBMC之IL-6的產生的圖。
[圖24]圖24-1係呈示AT01抗體的CDRH1之胺基酸序列(序列識別號17)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號18)及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號19)、以及CDRL1之胺基酸序列(序列識別號20)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號21)及CDRL3之胺基酸序列(序列識別號22)的圖；圖24-2係呈示NB7抗體的CDRH1之胺基酸序列(序列識別號23)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號24)及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號25)、以及CDRL1之胺基酸序列(序列識別號26)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號27)及CDRL3之胺基酸序列(序列識別號28)的圖；圖24-3係呈示FAN2抗體的CDRH1之胺基酸序列(序列識別號29)、CDRH2之胺基酸序列(序列識別號30)及CDRH3之胺基酸序列(序列識別號31)、以及CDRL1之胺基酸序列(序列識別號32)、CDRL2之胺基酸序列(序列識別號33)及CDRL3之胺基酸序列(序列識別號34)的圖。
[圖25]圖25係有關於人源化抗人類TLR7抗體(huAT01_H3L2_IgG1LALA)對抗原(人類TLR7：變異體1)的結合之流動式細胞測量術(flow cytometry)解析結果，且為呈示會特異性地結合至該抗原的圖。
[圖26]圖26係有關於人源化抗人類TLR7抗體(huAT01_H3L2_IgG1LALA)對抗原(人類TLR7：變異體2)的結合之流動式細胞測量術解析結果，且為呈示會特異性地結合至該抗原的圖。
[圖27]圖27係有關於人源化抗人類TLR7抗體(huAT01_H3L2_IgG1LALA)對抗原(猴TLR7)的結合之流動式細胞測量 術解析結果，且為呈示會特異性地結合至該抗原的圖。
[圖28]圖28係有關於人源化抗人類TLR7抗體(huAT01_H3L2_IgG1LALA)對抗原(小鼠TLR7)的結合之流動式細胞測量術解析結果，且為呈示並不結合至該抗原的圖。
[圖29]圖29係有關於人源化抗人類TLR7抗體(huAT01_H3L2_IgG1LALA)對抗原(大鼠TLR7)的結合之流動式細胞測量術解析結果，且為呈示並不結合至該抗原的圖。
於本說明書中，所謂「基因」之用語不僅包含DNA，亦包含mRNA、cDNA及cRNA。
於本說明書中，所謂「多核苷酸」之用語係以與核酸相同的意義來使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
於本說明中，「多肽」與「蛋白質」並未區分而使用。
於本說明書中，「RNA分部(fraction)」係指包含RNA的分部。
於本說明書中，「細胞」中亦包含動物個體內的細胞、培養細胞。
於本說明書中，「TLR7」係以與TLR7蛋白質相同的意義來使用。
本說明書中的「抗體的抗原結合性片段」意指具有與抗原的結合活性之抗體的部分片段，包含Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、雙鏈抗體(diabody)、線狀抗體、及由抗體片段所形成的 多特異性抗體等。又，抗體的抗原結合性片段中亦包含：在還原條件下處理了F(ab’)2之為抗體可變區的一價片段之Fab’。然而，只要具有與抗原的結合能力，則不限定於此等分子。又，此等抗原結合性片段中，不僅包含以適當的酵素處理了抗體蛋白質的全長分子者，亦包含使用經基因工程性地改變的抗體基因而於適當的宿主細胞中所產生的蛋白質。
已知抗體分子的重鏈及輕鏈中各自具有3處的互補性決定區(CDR：Complementarity determining region)。互補性決定區亦稱為高度可變區(hypervariable region)，位於抗體分子的重鏈及輕鏈之可變區內，為一級結構的變異性特別高的部位，於重鏈及輕鏈之多肽鏈的一級結構上各自分離成3處。於本說明書中係針對抗體之互補性決定區，而將重鏈的互補性決定區自重鏈胺基酸序列的胺基末端側起標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈的互補性決定區自輕鏈胺基酸序列的胺基末端側起標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等部位在立體結構上相互接近，並決定對於結合的抗原之特異性。又，各CDR的胺基酸序列係基於AbM的定義(Martin,A.C.R.,Cheetham,J.C.and Rees,A.R.(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA,86,9268-9272)而記載。
於本發明中，「在嚴格的條件下進行雜交」係指於市售的雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(CLONTECH公司製)中於68℃進行雜交；或者在可藉由下述而鑑定的條件或與其同等的條件下進行雜交：使用固定有DNA的過濾器而在0.7-1.0M的NaCl存在下於68℃進行雜交之後，使用0.1-2倍濃度的SSC溶液(所謂1倍濃度SSC係包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)，於68℃進行洗淨。
本發明所使用的人類TLR7係可由人類的B細胞或樹狀細胞直接純化而使用，或者製備上述細胞的細胞膜分部而使用，又，可於活體外(in vitro)合成人類TLR7，或者藉由利用基因操作使其於宿主細胞產生而得。基因操作中具體而言，係可將人類TLR7 cDNA組入可表現的載體後，於包含轉錄與轉譯所需要的酵素、基質及能量物質的溶液中進行合成，或者藉由使其他原核生物或真核生物的宿主細胞轉形而使其表現人類TLR7，藉以得到該蛋白質。
同樣地，猴TLR7、小鼠TLR7及大鼠TLR7可各自由猴、小鼠及大鼠的TLR7表現細胞直接純化而使用，或者製備上述細胞的細胞膜分部而使用，又，可藉由於活體外合成猴TLR7、小鼠TLR7及大鼠TLR7，或者利用基因操作使宿主細胞產生而得。
編碼人類TLR7(變異體1)及人類TLR7(變異體2)的胺基酸序列之多核苷酸序列係各自被記載於序列表的序列識別號1或序列識別號3，人類TLR7(變異體1)及人類TLR7(變異體2)的胺基酸序列係各自被記載於序列表的序列識別號2或序列識別號4。
人類TLR7的cDNA，例如可藉由所謂的PCR法而取得，該PCR法係將表現人類TLR7的mRNA之臟器的cDNA庫作為模版，使用會特異性地增幅人類TLR7的cDNA之引子來進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(Saiki,R.K., et al.,Science,(1988)239,487-49)。
此外，會與包含與編碼人類TLR7之核苷酸序列為互補之核苷酸序列的多核苷酸在嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有與人類TLR7同等的生物活性的蛋白質之多核苷酸，亦包含在人類TLR7的cDNA中。再者，為自人類TLR7基因座轉錄的剪接變異體或會與其在嚴格的條件下進行雜交之多核苷酸，且編碼具有與人類TLR7同等的生物活性的蛋白質之多核苷酸，亦包含在人類TLR7的cDNA中。
又，包含人類TLR7的胺基酸序列或訊息序列已自此等序列被去除的胺基酸序列中有1個、2個或3個或者4個或5個胺基酸經取代、缺失、或附加的胺基酸序列，且具有與人類TLR7同等的生物活性的蛋白質，亦包含在人類TLR7中。再者，包含自人類TLR7基因座轉錄的剪接變異體所編碼的胺基酸序列、或於該胺基酸序列中有1個、2個或3個或者4個或5個胺基酸經取代、缺失、或附加的胺基酸序列，且具有與人類TLR7同等的生物活性的蛋白質亦包含在人類TLR7中。
編碼猴TLR7的胺基酸序列之多核苷酸序列係被記載於序列表的序列識別號58，猴TLR7的胺基酸序列係被記載於序列表的序列識別號85。
猴TLR7的cDNA，係例如可藉由將表現猴TLR7的mRNA之臟器的cDNA庫作為模版，使用會特異性地增幅猴TLR7的cDNA之引子來進行的PCR法而取得。
此外，會與包含與編碼猴TLR7之核苷酸序列為互補之核苷酸序列的多核苷酸在嚴格的條件下進行雜交，且編碼具有與猴TLR7同等的生物活性的蛋白質之多核苷酸，亦包含在猴 TLR7的cDNA中。再者，自猴TLR7基因座轉錄的剪接變異體、或會與其在嚴格的條件下進行雜交之多核苷酸，且編碼具有與猴TLR7同等的生物活性的蛋白質之多核苷酸，亦包含在猴TLR7的cDNA中。
又，包含猴TLR7的胺基酸序列或訊息序列已以自此等序列被去除的胺基酸序列中有1個、2個或3個或者4個或5個胺基酸經取代、缺失、或附加的胺基酸序列，且具有與猴TLR7同等的生物活性的蛋白質，亦包含在猴TLR7中。再者，包含自猴TLR7基因座轉錄的剪接變異體所編碼的胺基酸序列、或於該胺基酸序列中有1個、2個或3個或者4個或5個胺基酸經取代、缺失、或附加的胺基酸序列，且具有與猴TLR7同等的生物活性的蛋白質，亦包含在猴TLR7中。
編碼猴TLR7的胺基酸序列之多核苷酸序列係被記載於序列表的序列識別號58，猴TLR7的胺基酸序列係被記載於序列表的序列識別號85。
猴TLR7的cDNA，係例如可藉由將表現猴TLR7的mRNA之臟器的cDNA庫作為模版，使用會特異性地增幅猴TLR7的cDNA之引子來進行的PCR法而取得。
編碼小鼠TLR7的胺基酸序列之多核苷酸序列係被記載於序列表的序列識別號56，小鼠TLR7的胺基酸序列係被記載於序列表的序列識別號83。
小鼠TLR7的cDNA，係例如可藉由將表現小鼠TLR7的mRNA之臟器的cDNA庫作為模版，使用會特異性地增幅小鼠TLR7的cDNA之引子來進行的PCR法而取得。
編碼大鼠TLR7的胺基酸序列之多核苷酸序列係被 記載於序列表的序列識別號57，大鼠TLR7的胺基酸序列係被記載於序列表的序列識別號84。
大鼠TLR7的cDNA，係例如可藉由將表現大鼠TLR7的mRNA之臟器的cDNA庫作為模版，使用會特異性地增幅大鼠TLR7的cDNA之引子來進行的PCR法而取得。
本發明提供一種特徵為具有以下之特性的抗體或該抗體的抗原結合性片段：(a)特異性地結合至人類TLR7或猴TLR7，且不結合至小鼠TLR7或大鼠TLR7；及(b)抑制人類TLR7或猴TLR7的機能。
本發明的抗體或其抗原結合性片段係特異性地結合至人類TLR7或猴TLR7，且抑制其機能。
抗體或其抗原結合性片段對於TLR7的結合活性，係依照常規方法，以流動式細胞測量術進行解析，藉此而評價。
又，本說明書中，抑制TLR7的機能係指抑制因TLR7表現細胞所造成的IL-6及/或I型干擾素的產生。抑制TLR7的機能之活性，係藉由於活體外，在抗體或其抗原結合性片段的存在下培養TLR7表現細胞(例如PBMC)，並測定培養上清液中IL-6或I型干擾素的濃度而評價。
於本發明的一實施形態中，人類TLR7為包含序列識別號2或序列識別號4所記載的胺基酸序列的分子、或猴TLR7為包含序列識別號85所記載的胺基酸序列的分子、或小鼠TLR7為包含序列識別號83所記載的胺基酸序列的分子、或 者大鼠TLR7為包含序列識別號84所記載的胺基酸序列的分子。 例如，於本發明中，可為人類TLR7為包含序列識別號2或序列識別號4所記載的胺基酸序列的分子，猴TLR7為包含序列識別號85所記載的胺基酸序列的分子，小鼠TLR7為包含序列識別號83所記載的胺基酸序列的分子，且大鼠TLR7為包含序列識別號84所記載的胺基酸序列的分子。
例如，本發明的抗體或其抗原結合性片段可為抗人類TLR7的抗體或其抗原結合性片段，且具有以下的特性： (a)特異性地結合至人類TLR7，且不結合至小鼠TLR7及/或大鼠TLR7；及 (b)抑制人類TLR7的機能； 此處，人類TLR7為包含序列識別號2或序列識別號4所記載的胺基酸序列的分子，小鼠TLR7為包含序列識別號83所記載的胺基酸序列的分子，且大鼠TLR7為包含序列識別號84所記載的胺基酸序列的分子。
例如，本發明的抗體或其抗原結合性片段可為抗猴TLR7的抗體或其抗原結合性片段，且具有以下的特性： (a)特異性地結合至猴TLR7，且不結合至小鼠TLR7及/或大鼠TLR7；及 (b)抑制猴TLR7的機能； 此處，猴TLR7為包含序列識別號85所記載的胺基酸序列的分子，小鼠TLR7為包含序列識別號83所記載的胺基酸序列的分子，且大鼠TLR7為包含序列識別號84所記載的胺基酸序列的分子。
以下，以抗人類TLR7抗體的情形為例，說明本發 明的抗TLR7抗體及其製造方法。關於抗猴TLR7抗體，亦可與抗人類TLR7抗體同樣地製造。
本發明之抗人類TLR7的抗體，可藉由使用常規方法，將人類TLR7或選自人類TLR7的胺基酸序列之任意的多肽，對動物進行免疫，採取於活體內所產生的抗體並進行純化而得。
此外，成為抗原的人類TLR7可藉由下述而得：藉由基因操作而使宿主細胞產生人類TLR7基因。具體而言，只要製作可表現TLR7基因的載體，將其導入宿主細胞而使該基因表現，並將所表現的TLR7純化即可。
本發明之抗人類TLR7的抗體，亦可使用DNA免疫法而得。DNA免疫法係指將抗原表現質體對小鼠或大鼠等的動物個體進行基因導入，使抗原在個體內表現，藉此誘導對於抗原的免疫的手法。
基因導入的手法中，存在有：直接將質體注射至肌肉的方法、或將質體與微脂體或聚伸乙亞胺(polyethyleneimine)等的複合體進行靜脈注射的方法、使用病毒載體的手法、將附著有質體的金粒子藉由基因槍(Gene Gun)射入的手法、急速地將大量的質體溶液進行靜脈注射的流體動力學法(Hydrodynamic method)等。
關於利用表現質體的肌內注射之基因導入法，作為使表現量提升的手法，已知有在將質體進行肌內注射後，於同部位加以電穿孔之所謂活體內電穿孔(in vivo electroporation)的技術(Aihara H,Miyazaki J.Nat Biotechnol.1998 Sep；16(9)：867-70或Mir LM,Bureau MF,Gehl J,Rangara R, Rouy D,Caillaud JM,Delaere P,Branellec D,Schwartz B,Scherman D.Proc Natl Acad Sci U S A.1999 Apr13；96(8)：4262-7.)。本手法係在質體的肌內注射前，將肌肉以玻尿酸酶進行處理，藉此而表現量進一步提升(McMahon JM1,Signori E,Wells KE,Fazio VM,Wells DJ.Gene Ther.2001 Aug；8(16)：1264-70)。
又，亦可依照眾所周知的方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367,Plenum Press,N.Y.(1980))，使會產生抗TLR7的抗體之抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，藉此而樹立融合瘤並得到單株抗體。此種方法的具體例，係被記載於國際公開第WO09/48072號小冊(2009年4月16日公開)及第WO10/117011號(2010年10月14日公開)小冊。
作為如此進行而樹立的小鼠抗人類TLR7抗體之實例，可列舉AT01抗體、NB7抗體、及FAN2抗體。
AT01抗體之重鏈可變區的胺基酸序列係呈示於序列表的序列識別號5，而編碼該序列的多核苷酸序列係呈示於序列表的序列識別號6；NB7抗體之重鏈可變區的胺基酸序列係呈示於序列表的序列識別號7，而編碼該序列的多核苷酸序列係呈示於序列表的序列識別號8；以及FAN2抗體之重鏈可變區的胺基酸序列係呈示於序列表的序列識別號9，而編碼該序列的多核苷酸序列係呈示於序列表的序列識別號10。
又，AT01抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列係呈示於序列表的序列識別號11，而編碼該序列的多核苷酸序列係呈示於序列表的序列識別號12；NB7抗體之輕鏈可變區的胺基酸 序列係呈示於序列表的序列識別號13，而編碼該序列的多核苷酸序列係呈示於序列表的序列識別號14；以及FAN2抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列係呈示於序列表的序列識別號15且編碼該序列的多核苷酸序列係呈示於序列表的序列識別號16。
AT01抗體之重鏈可變區具有：包含序列識別號17所示的胺基酸序列(GYTFTNNWLH)之CDRH1、包含序列識別號18所示的胺基酸序列(DIYPSNGRTN)之CDRH2及包含序列識別號19所示的胺基酸序列(ERGYFDY)之CDRH3。又，該抗體之輕鏈可變區具有：包含序列識別號20所示的胺基酸序列(KASQDINKYIA)之CDRL1、包含序列識別號21所示的胺基酸序列(YTSTLQP)之CDRL2及包含序列識別號22所示的胺基酸序列(LQYDYLLT)之CDRL3。此外，上述CDR的胺基酸序列亦被記載於圖24-1。
NB7抗體之重鏈可變區具有：包含序列識別號23所示的胺基酸序列(GYSITSDYAWN)之CDRH1、包含序列識別號24所示的胺基酸序列(HISYRGNTN)之CDRH2及包含序列識別號25所示的胺基酸序列(WNYYGYVDYAMDY)之CDRH3。又，該抗體之輕鏈可變區具有：包含序列識別號26所示的胺基酸序列(RASQDISNYLN)之CDRL1、包含序列識別號27所示的胺基酸序列(YTSRLHS)之CDRL2及包含序列識別號28所示的胺基酸序列(QQGDTFPT)之CDRL3。此外，上述CDR的胺基酸序列亦被記載於圖24-2。
FAN2抗體之重鏈可變區具有：包含序列識別號29所示的胺基酸序列(GFSLTGYGVN)之CDRH1、包含序列識別號30所示的胺基酸序列(MIWGDGSTD)之CDRH2及包含序列 識別號31所示的胺基酸序列(DKGYDGYYYAMDY)之CDRH3。又，該抗體之輕鏈可變區具有：包含序列識別號32所示的胺基酸序列(RASENIYSYLA)之CDRL1、包含序列識別號33所示的胺基酸序列(DAKTLAE)之CDRL2及包含序列識別號34所示的胺基酸序列(QHHYGIPYT)之CDRL3。此外，上述CDR的胺基酸序列亦被記載於圖24-3。
於一實施形態中，本發明的抗體或其抗原結合性片段在對人類TLR7的結合中與下列抗體可具有競爭抑制活性：具有AT01抗體、NB7抗體、或FAN2抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區的胺基酸序列之抗體。
於另一實施形態中，本發明的抗體或其抗原結合性片段可為：具有AT01抗體的CDRH1~3作為重鏈中的互補性決定區及AT01抗體的CDRL1~3之抗體或其抗原結合性片段作為輕鏈中的互補性決定區之抗體或其抗原結合性片段；具有NB7抗體的CDRH1~3作為重鏈中的互補性決定區及NB7抗體的CDRL1~3作為輕鏈中的互補性決定區之抗體或其抗原結合性片段；或者具有FAN2抗體的CDRH1~3作為重鏈中的互補性決定區及FAN2抗體的CDRL1~3作為輕鏈中的互補性決定區之抗體或其抗原結合性片段。於較佳的態樣中，本發明的抗體或其抗原結合性片段可為具有AT01抗體的CDRH1~3作為重鏈中的互補性決定區及AT01抗體的CDRL1~3作為輕鏈中的互補性決定區之抗體或其抗原結合性片段。
又，於另一實施形態中，本發明的抗體或其抗原結合性片段可為具有AT01抗體、NB7抗體、或FAN2抗體之重鏈可變區及輕鏈可變區序列的抗體
本發明的抗體中，除了抗人類TLR7的上述單株抗體之外，亦包含以使對於人類的異種抗原性降低等作為目的而經人為改變的基因重組型抗體，例如嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體、人類抗體等。此等抗體可使用既知的方法來製造。
作為嵌合抗體，可列舉抗體的可變區與恒定區互為異種之抗體，例如將源自小鼠或大鼠之抗體的可變區接合至源自人類的恒定區之嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。作為源自小鼠抗人類TLR7抗體(AT01抗體)的嵌合抗體，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：具有包含序列識別號5的胺基酸序列之重鏈可變區的重鏈、及具有包含序列識別號11的胺基酸序列之輕鏈可變區的輕鏈。作為此種源自AT01抗體的嵌合抗體之一例，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：包含序列識別號35中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號36中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。於本說明書中，將前述抗體稱為「cAT01」或「cAT01抗體」。
又，作為源自小鼠抗人類TLR7抗體(NB7抗體)的嵌合抗體，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：具有包含序列識別號7的胺基酸序列之重鏈可變區的重鏈、及具有包含序列識別號13的胺基酸序列之輕鏈可變區的輕鏈。作為此種源自NB7抗體的嵌合抗體之一例，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：包含序列識別號37中之第20號至第471號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號38中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。於本說明書中，將前述抗體稱為「cNB7」或「cNB7抗體」。
再者，作為源自小鼠抗人類TLR7抗體(FAN2抗體)的嵌合抗體，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：具有包含序列識別號9的胺基酸序列之重鏈可變區的重鏈、及具有包含序列識別號15的胺基酸序列之輕鏈可變區的輕鏈。作為此種源自FAN2抗體的嵌合抗體之一例，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：包含序列識別號39中之第20號至第470號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號40中之第21號至第234號的胺基酸序列之輕鏈。於本說明書中，將前述抗體稱為「cFAN2」或「cFAN2抗體」。
可將上述抗人類TLR7的嵌合抗體的序列，以使對於人類的異種抗原性降低等作為目的來進行人為地改變，而製作為基因重組型抗體之人源化(Humanized)抗體。又，本發明的抗體中包含將前述人源化抗體的CDR改變的抗體。此等抗體可使用既知的方法來製造。
作為人源化抗體，可列舉僅將CDR組入源自人類的抗體之抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)、除了CDR的序列之外亦將一部分之框架的胺基酸殘基移植至人類抗體之抗體(國際公開第WO90/07861號小冊)。
例如，源自cAT01抗體及cNB7抗體的人源化抗體係保持有源自cAT01或cNB7之6種全部的CDR序列，且具有抑制人類TLR7的機能之活性。
就上述人源化抗體的較適合的事例而言，作為源自cAT01抗體的人源化抗體(huAT01抗體)，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：含有包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區 的重鏈、及含有包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區的輕鏈；含有包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區的重鏈、及含有包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區的輕鏈；含有包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區的重鏈、及含有包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區的輕鏈；含有包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區的重鏈、及含有包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區的輕鏈。
又，能夠藉由組合與上述huAT01抗體之各重鏈可變區的胺基酸序列及各輕鏈可變區的胺基酸序列顯示高同源性的序列，而選擇具有與該抗體同等的活性之抗體。如此之同源性一般而言為80%以上的同源性，較佳為90%以上的同源性，更佳為95%以上的同源性，最佳為99%以上的同源性(惟，各CDR係與上述各抗體相同)。又，藉由組合於上述重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列(惟，排除各CDR的部位)中有1至數個(例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列，亦能夠選擇具有與該抗體同等的活性之抗體。
就更適合的事例而言，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺 基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；或者包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
又，作為源自cNB7抗體的人源化抗體(huNB7抗體)，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：含有包含序列識別號50所記載的胺基酸序列之重鏈可變區的重鏈、及含有包含序列識別號51所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區的輕鏈。
又，能夠藉由組合與上述huNB7抗體之重鏈可變區的胺基酸序列及輕鏈可變區的胺基酸序列顯示高同源性的序列，而選擇具有與該抗體同等的活性之抗體。如此之同源性一般而言為80%以上的同源性，較佳為90%以上的同源性，更佳為95%以上的同源性，最佳為99%以上的同源性(惟，各CDR係與 上述各抗體相同)。又，藉由組合於上述重鏈可變區或輕鏈可變區的胺基酸序列(惟，排除各CDR的部位)中有1至數個(例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個)胺基酸殘基經取代、缺失或附加的胺基酸序列，亦能夠選擇具有與該抗體同等的活性之抗體。
就更適合的事例而言，可列舉包含下列重鏈及輕鏈的抗體：包含序列識別號52所記載的胺基酸序列中之第20號至第471號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號53所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；或者包含序列識別號54所記載的胺基酸序列中之第20號至第468號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號53所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
本發明的抗體可為對上述人源化抗體進一步導入變異而變更對於人類TLR7的結合能力者。此種手法係稱為親和力成熟(affinity maturation)，作為具體的方法可列舉核糖體展示(ribosome display)法。核糖體展示法係使用蛋白質與為其基因情報的mRNA經由核糖體而結合的三元複合體，而單離與標的分子結合之蛋白質的基因序列之方法(Stafford RL.et.al.Protein Eng.Des.Sel.2014(4)：97-109.)。
為了迴避對正常的人類TLR7表現細胞之細胞毒性，期望抗體的效應活性(effector activity)低。已知效應活性係依抗體的子類(subclass)而異。觀察到IgG4係ADCC、CDC活性低；IgG2雖具有CDC活性但ADCC活性低等的特徵。由此特徵，而能夠將IgG1的恒定區取代成IgG2或IgG4的恒定 區，藉以製作使ADCC、CDC活性減低了的抗體。又，能夠藉由將IgG1的恒定區之一部分的序列參考IgG2或IgG4來進行取代，而製作使ADCC、CDC活性減低了的IgG1抗體。作為一例，若依據Marjan Hezareh et.al.Journal of Virology,75(24)：12161-12168(2001)，則將IgG1的第234號、第235號的白胺酸殘基(數字係依據Kabat等人之EU索引(EU index))各自取代成丙胺酸殘基時，顯示ADCC、CDC活性降低。
本發明中亦包含抗體或該抗體的抗原結合性片段之修飾體。該修飾體意指對本發明之抗體或該抗體的抗原結合性片段施加化學性或生物學性的修飾而成者。化學性的修飾體中，包含對胺基酸骨架之化學部分的結合、N-鍵結或O-鍵結碳水化合物鏈之化學修飾體等。生物學性的修飾體中，包含經轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結的醣苷化、N末端或C末端的加工、脫醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化)者、藉由使用原核生物宿主細胞來使其表現而於N末端附加甲硫胺酸殘基者等。又，為了使本發明的抗體或抗原之檢測或單離成為可能而被標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和力標識體亦包含於該修飾物之意義中。此種本發明的抗體之修飾物或該抗體的抗原結合性片段之修飾物，係有用於原本之本發明的抗體之穩定性及血中滯留性的改善、抗原性的減低、該抗體或抗原的檢測或單離等。
已知以哺乳類培養細胞生產的抗體之重鏈的羧基末端之離胺酸殘基係缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，已知同樣地重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2個胺基酸殘基係缺失，且新位於羧基末端之脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。
然而，此等重鏈序列之缺失及修飾，對抗體的抗原結合能力及效應機能(effector function)(補體的活化或抗體依賴性細胞毒性作用等)並不會造成影響。
因此，作為本發明之抗體及該抗體的抗原結合性片段的修飾體，可列舉：於重鏈羧基末端有1或2個胺基酸經缺失的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。惟，只要保有抗原結合能力及效應機能，則有關於本發明之抗體的重鏈的羧基末端之缺失體並不限定於上述種類。
構成有關於本發明之抗體的2條重鏈，可為包含選自包含完整長度及上述缺失體之群組的重鏈之任一種的組合者，亦可為包含任兩種的組合者。各缺失體的量比雖會受到產生有關於本發明之抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件的影響，但作為有關於本發明之抗體的主成分，可列舉在2條重鏈雙方羧基末端1個胺基酸殘基缺失的情形。亦即，包含下列胺基酸序列的重鏈亦可使用於本發明的抗體：於序列表所記載的序列識別號35中之第20號至第465號的胺基酸序列、序列識別號37中之第20號至第471號的胺基酸序列、序列識別號39中之第20號至第470號的胺基酸序列、序列識別號45中之第20號至第465號的胺基酸序列、序列識別號46中之第20號至第465號的胺基酸序列、序列識別號47中之第20號至第462號的胺基酸序列、序列識別號52中之第20號至第471號的胺基酸序列、及序列識別號54中之第20號至第468號的胺基酸序列所示的各重鏈序列之羧基末端有1或2個胺基酸經缺失的胺基酸序列。
藉由以上方法所得到的抗體，可評價對抗原的結合 性，且選出適合的抗體。作為比較抗體的性質時之其他指標之一例，可列舉抗體的穩定性。示差掃描量熱法(DSC)係可快速又正確的測定為蛋白的相對構造穩定性之優異指標的熱變性中點(Tm)之方法。而藉由使用DSC測定Tm值，將其值進行比較，可比較熱穩定性的差異。抗體的保存穩定性已知係顯示與抗體的熱穩定性有某種程度的相關性(Lori Burton,et.Al.,Pharmaceutical Development and Technology(2007)12,p.265-273)，可將熱穩定性作為指標，而選出適合的抗體。作為用以選出抗體的其他指標，可列舉於適當的宿主細胞中之產量高、及在水溶液中的凝集性低。由於例如產量最高的抗體並不一定顯示最高的熱穩定性，所以有必要基於以上所述的指標而綜合性地判斷，來選出最適合投予至人類的抗體。
又，亦已知使用適當的連接子(linker)來連結抗體之重鏈及輕鏈的全長序列，取得單鏈免疫球蛋白(single chain immunoglobulin)的方法(Lee,H-S,et.al.,Molecular Immunology(1999)36,p.61-71；Shirrmann,T.et.al.,mAbs(2010),2,(1)p.1-4)。此種單鏈免疫球蛋白能夠藉由二聚體化，而保持與本來為四聚體的抗體類似之結構及活性。又，本發明的抗體，可為具有單一的重鏈可變區且不具有輕鏈序列之抗體。此種抗體係稱為單域抗體(single domain antibody：sdAb)或奈米抗體(nanobody)，已被報告實際上在駱駝或駱馬被觀察到，且保持抗原結合能力(Muyldemans S.et.al.,Protein Eng.(1994)7(9),1129-35；Hamers-Casterman C.et.al.,Nature(1993)363(6428)446-8)。上述抗體亦可解釋為本發明中之抗體的抗原結合性片段的一種。
又，能夠藉由調節結合於本發明的抗體之糖鏈修飾，而增強抗體依賴性細胞毒性活性。作為抗體的糖鏈修飾之調節技術，已知有WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140、WO2007/133855、WO2013/120066等，但不限定於此等。
在一旦將抗體基因單離之後導入適當的宿主而製作抗體的情形，可使用適當的宿主與表現載體之組合。
作為抗體基因的具體例，可列舉組合編碼本說明書所記載的抗體的重鏈序列之基因、及編碼輕鏈序列之基因者。更具體而言，作為抗體基因，可列舉例如具有編碼本發明的抗體或其抗原結合性片段之多核苷酸序列的多核苷酸、具有編碼本發明的抗體或其抗原結合性片段之重鏈可變區的胺基酸序列之多核苷酸序列的多核苷酸及具有編碼輕鏈可變區的胺基酸序列之多核苷酸序列的多核苷酸之組合等。構成抗體基因的重鏈序列基因中，亦包含具有會與下述之多核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的多核苷酸所具有之多核苷酸序列的多核苷酸：包含與編碼重鏈可變區之上述多核苷酸序列為互補之多核苷酸序列的多核苷酸。又，構成抗體基因的輕鏈序列基因中，亦包含具有會與下述之多核苷酸在嚴格的條件下進行雜交的多核苷酸所具有的多核苷酸序列的多核苷酸：包含與編碼輕鏈可變區之上述多核苷酸序列為互補之多核苷酸序列的多核苷酸。
將宿主細胞轉形時，重鏈序列基因與輕鏈序列基因可插入相同的表現載體，又亦可插入各別的表現載體。使用真核細胞作為宿主的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。作為動物細胞，可列舉(1)哺乳類細胞，例如，為猴的細胞之COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182，ATCC CRL- 1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)的二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。又，使用原核細胞的情形，可列舉例如大腸桿菌、枯草桿菌。將作為目標之抗體基因藉由轉形而導入此等細胞中，將經轉形的細胞於活體外培養，藉此可得到抗體。於以上的培養法中，有依抗體的序列而產量不同的情形，可自具有同等的結合活性之抗體中，以產量為指標，而挑選作為醫藥的生產為容易者。
就本發明的抗體之同型(isotype)而言沒有限制，可列舉例如IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA(IgA1、IgA2)、IgD或IgE等，較佳可列舉IgG或IgM，更佳可列舉IgG1或IgG4。
又，本發明的抗體可為具有抗體的抗原結合部位之抗體的抗原結合性片段或其修飾物。將抗體以木瓜酶、胃蛋白酶等的蛋白質分解酵素進行處理，或者藉由基因工程的手法而改變抗體基因並於適當的培養細胞使其表現，可藉此而得到該抗體的片段。於此種抗體片段中，可將保持抗體全長分子所具有的機能之全部或一部分的片段稱為抗體的抗原結合性片段。
作為抗體的機能、一般而言可列舉抗原結合活性、中和抗原活性的活性，增強抗原活性的活性、抗體依賴性細胞毒性活性、補體依賴性細胞毒性活性及補體依賴性細胞性細胞毒性活性。本發明中之抗體的抗原結合性片段所保持的機能，為對於人類TLR7的結合活性，較佳為抑制人類TLR7的機能之活性，更佳為抑制因TLR7表現細胞所造成的IL-6及/或I型干擾素的 產生之活性。
例如，作為抗體的片段，可列舉Fab、F(ab’)2、Fv、或以適當的連接子連結重鏈及輕鏈的Fv而成的單鏈Fv(scFv)、雙鏈抗體(diabody)、線狀抗體、及由抗體片段所形成的多特異性抗體等。又，抗體的片段中亦包含：將F(ab’)2於還原條件下處理而成之為抗體的可變區的一價片段之Fab’。
再者，本發明的抗體可為至少對於2種類的不同抗原具有特異性之多特異性抗體。通常，此種分子係結合至2種類的抗原者(即雙特異性抗體(bispecific antibody))，但本發明中之「多特異性抗體」包含對於其以上(例如，3種類)的抗原具有特異性之抗體。
本發明的多特異性抗體，可為包含全長的抗體、或該種抗體的片段(例如，F(ab’)2雙特異性抗體)。雙特異性抗體可使2種類的抗體之重鏈及輕鏈(HL對)結合而製作，亦可藉由使會產生不同單株抗體的融合瘤融合，製作雙特異性抗體產生融合細胞而製作(Millstein et al.,Nature(1983)305,p.537-539)。
本發明的抗體可為單鏈抗體(亦記載為scFv)。單鏈抗體可藉由以多肽的連接子來連結抗體的重鏈可變區與輕鏈可變區而得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113(Rosenberg及Moore編，Springer Verlag,New York,p.269-315(1994))、Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。又，亦可使用以多肽的連接子結合2個scFv所製作的BiscFv片段作為雙特異性抗體。
製作單鏈抗體的方法在當技術領域中為周知者(參 照例如美國專利第4,946,778號、美國專利第5,260,203號、美國專利第5,091,513號、美國專利第5,455,030號等)。於此scFv中，重鏈可變區與輕鏈可變區係經由不會作成結合物(conjugate)的連接子、較佳為多肽連接子而連結(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988),85,p.5879-5883)。scFv中的重鏈可變區及輕鏈可變區可源自相同的抗體，亦可源自各別的抗體。作為連結可變區的多肽連接子，可使用例如包含12~19個殘基之任意的單鏈肽。
編碼scFv的DNA，係藉由下述而得：在編碼前述抗體之重鏈或重鏈可變區的DNA、及編碼輕鏈或輕鏈可變區的DNA當中，將編碼彼等序列中全部或所期望之胺基酸序列的DNA作為模版，使用規定其兩端的引子對來藉由PCR法進行增幅，接著，進一步組合編碼多肽連接子部分的DNA及以其兩端各自與重鏈、輕鏈連結的方式規定的引子對而進行增幅。
又，若一旦製作編碼scFv的DNA，則可依照常規方法而得到含有彼等的表現載體、及藉由該表現載體而被轉形的宿主，又，可藉由使用該宿主，而依照常規方法來得到scFv。此等抗體片段可與前述同樣地進行而取得基因並使其表現，且藉由宿主來使其產生。
本發明的抗體可為經多聚化(multimerization)而提高了對於抗原的親和性者。作為多聚化的抗體，可為1種類的抗體，亦可為辨識相同的抗原之複數的表位(epitope)之複數的抗體。作為將抗體多聚化的方法，可列舉IgG CH3域(domain)與2個scFv的結合、與鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)的結合、螺旋-轉折-螺旋模體(helix-turn-helix motif)的導入等。
本發明的抗體可為多株抗體，該多株抗體為胺基酸序列不同的複數種類之抗人類TLR7抗體的混合物。作為多株抗體的一例，可列舉CDR不同的複數種類之抗體的混合物。作為該種多株抗體，可使用培養會產生不同抗體之細胞的混合物，並自該培養物純化的抗體(參照WO2004/061104號)。
作為抗體的修飾物，亦可使用經與聚乙二醇(PEG)等的各種分子結合之抗體。
本發明的抗體進一步可為此等抗體與其他藥劑形成結合物者(免疫結合物(Immunoconjugate))。作為此種抗體之例，可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理作用的化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23,p.1137-1146)。
所獲得的抗體，可純化至均一為止。抗體的分離、純化只要使用通常的蛋白質所使用的分離、純化方法即可。例如，若將管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、製備用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等適宜選擇、組合，則可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限定於此等。
作為層析，可列舉親和力層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析、逆相層析、吸附層析等。此等層析可使用HPLC或FPLC等液相層析來進行。作為用於親和力層析的管柱，可列舉蛋白質A(Protein A)管柱、蛋白質G(Protein G)管柱。作為例如使用了蛋白質A管柱的管柱，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。又，亦能夠使用將抗原經固定化的擔體，利用對抗原的結合性而純化抗體。
可自以上述「2.抗TLR7抗體及其製造」之項目所記載的方法得到的抗人類TLR7抗體中，得到抑制人類TLR7的機能之抗體。此等抑制人類TLR7的機能之抗體，由於可抑制於活體內的人類TLR7之生物活性，即可抑制以血球細胞為代表的人類TLR7表現細胞之因人類TLR7配體所造成的活性化，而作為醫藥，可作為對於起因於此等人類TLR7的機能之疾病的治療及/或預防劑來使用。
起因於人類TLR7的機能之疾病或狀態中，包含免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症或癌症等。
作為免疫炎症相關疾病之例，可列舉結締組織或肌肉骨骼系(全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型特發性關節炎、成人史迪爾氏病、僵直性脊椎炎、全身性硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、混合性結締組織疾病、肌肉萎縮症等)、血液系(自體免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血、特發性血小板減少性紫瘢病等)、消化器官系(克隆氏症(Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎、迴腸炎等)、肝膽胰及內分泌系(自體免疫性肝炎、病毒性肝炎、酒精性肝炎、非酒精性脂肪肝炎、原發性硬化性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化、修格連氏症候群(Sjogren’s syndrome)、第一型糖尿病、自體免疫甲狀腺炎、巴塞多氏病(Basedow’s disease)、橋本氏病(Hashimoto’s
disease)等)、呼吸器官系(慢性阻塞性肺病(chronic obstructive lung disease)、囊腫纖化症、間質性肺炎等)、腦神經系(多發性硬化症、重症肌無力症、髓膜炎、腦脊髓炎、自體免疫性腦炎等)、視覺系(葡萄膜炎(uveitis)、砂眼、眼內炎等)、心血管系(血管炎症候群、伴隨多血管炎之肉芽腫病(Granulomatosis with Polyangiitis)華格納氏肉芽病、心肌炎、缺血性心臟病、動脈粥狀硬化症等)、皮膚表皮系(乾癬、天疱瘡、白斑、接觸性皮膚炎、濕疹等)、腎系(絲球體腎炎、糖尿病性腎病變、IgA腎病變、紫瘢病性腎炎(purpura nephritis)、腎病(nephrosis)、間質性膀胱炎等)、內分泌系(第一型糖尿病、自體免疫甲狀腺炎、巴塞多氏病(Basedow’s disease)、橋本氏病(Hashimoto’s disease)等)、全身性炎症(貝西氏病(Behcet’s Disease)、抗磷脂質抗體症候群、IgG4相關疾病、敗血症、出血、過敏症、移植排斥、起因於癌症化學療法等之休克症狀等)等。
作為過敏性疾病之例，可列舉異位性皮膚炎、氣喘、急性過敏(anaphylaxis)、類過敏反應、食物過敏、鼻炎、中耳炎、藥物反應、昆蟲刺傷反應、植物反應、乳膠過敏、結膜炎、蕁麻疹等
作為感染症之例，可列舉起因於下列之感染的疾病：病毒(單股RNA病毒、雙股RNA病毒、單股DNA病毒、雙股DNA病毒等)、細菌(革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、耐酸菌、放線菌、螺旋體、螺旋菌、立克次體、披衣菌、黴漿菌等)、真菌(髮癬菌、念珠菌、隱球菌、麴菌、肺囊蟲、馬拉色氏菌(Malassezia)等)、寄生蟲(絲蟲、吸蟲、條蟲、雙口蛭、包囊蟲、溶組織阿米巴、蚤、虱、蟎、蛔蟲、蟯蟲等)等。
作為癌症治療之例，可列舉淋巴瘤、白血病、乳癌、肺癌、皮膚癌等。
就作為上述醫藥的抗人類TLR7抗體之例而言，可列舉由AT01抗體及/或NB7抗體所製作的嵌合抗體、人源化抗體及其CDR改變體。
於活體外之因抗人類TLR7抗體所造成的人類TLR7的機能抑制活性，可藉由例如表現人類TLR7之血球細胞的活化抑制活性來測定。例如，可藉由對於人類PBMC以各種濃度來添加抗人類TLR7抗體，而測定對於因CL264刺激所造成的自人類PBMC的IL-6釋放之抑制活性。
於以全身性紅斑狼瘡為首的各種免疫炎症相關疾病中，人類TLR7的配體濃度上升、人類TLR7表現亢進、或刺激人類TLR7係經實驗上證明的事實，且已被廣泛認識。藉由因人類TLR7配體對於人類TLR7表現細胞進行作用所產生的介白素6(IL-6)等的發炎性細胞介素類所造成的發炎反應、或因抗體產生增強、活化所造成的I型干擾素的釋放，而產生全身性的免疫發炎反應，全身性紅斑狼瘡等的自體免疫係發病/惡化。因此，抑制此等依賴人類TLR7刺激的細胞介素類的產生，係與全身性紅斑狼瘡等的預防或治療有關，並且可藉由將其抑制活性作為指標，而判斷作為人類TLR7抗體的治療藥之有用性。
作為本發明中之適合的抗體，可列舉一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其特徵係特異性地結合至具有序列識別號2或4所記載的胺基酸序列之人類TLR7，且添加濃度依賴性地抑制人類PBMC所釋放的IL-6量。
再者，抗人類TLR7抗體對於各種疾病的治療或預 防效果亦可藉由下列而確認：利用對於與抗人類TLR7抗體具有交叉反應的猴投予該抗體之活體內(in vivo)評價系統或離體(ex vivo)評價系統、或者利用對於人類TLR7基因轉殖且小鼠TLR7基因剔除的小鼠投予抗人類TLR7抗體之以下的活體內評價系統。
對於發炎性細胞介素產生的效果，可藉由下述而評價：於藉由對小鼠的腹腔內或靜脈內投予TLR7配體而引起的炎症中，在抗TLR7抗體組及非投予組之間比較末梢血液中的細胞介素產生能力。
對於異位性皮膚炎的效果，可藉由下述而評價：藉由利用穿戴於小鼠兩腳背的磁鐵與搔癢行動測定裝置之搔癢次數的測定、或檢查皮膚/末梢血液/脊髓組織之病理的特徵，而將起因於異位性皮膚炎的行動定量化，並在抗TLR7抗體組及非投予組之間進行比較，其中，該異位性皮膚炎係藉由對於耳廓或背部每3日~2週重複塗布3~6次蟎抗原霜劑、或者對於耳廓或腹部或背部每日~每週1次塗布不全抗原(hapten)類、對於耳廓皮內或背部皮下或者膜下腔內投予搔癢誘發物質、或者使用為自然發病異位性皮膚炎小鼠之NC/Nga小鼠等的方法所引起或使其自然發病的異位性皮膚炎。
對於乾癬的效果，可藉由下述而評價：將藉由對於耳廓及剃毛完成的背部塗布咪喹莫特(Imiquimod)或R848、對於小鼠耳廓皮內投予IL-23等的細胞介素等之方法所誘導的乾癬樣皮膚炎，藉由發炎部位的重量、厚度、其部位中所浸潤的嗜中性球的髓過氧化酶活性、所浸潤的細胞的流動式細胞測量術解析、基因解析、細胞介素濃度等之測定而定量化，並在抗TLR7 抗體組及非投予組之間進行比較。
對於關節炎的效果，可藉由下述而評價：將藉由對於小鼠的尾根部皮內投予混合牛第二型膠原蛋白溶液及弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)並乳化者且在2~3週後投予混合牛第二型膠原蛋白溶液與弗氏不完全佐劑(Freund’s incomplete adjuvant)並乳化者、或者投予抗牛第二型膠原蛋白抗體及TLR配體等之方法所誘導的關節炎，在抗TLR7抗體組及非投予組之間比較其後之關節腫脹的分數化、腳掌的厚度測定、血液或組織中的抗體/細胞介素/血中生物標記(biomarker)濃度、自末梢血液/脾臟/淋巴節/骨髓/關節部位所得的細胞之增殖活性/細胞介素產生能力/表面抗原等。
對於結腸炎的效果，可藉由下述而評價：藉由對於絕食24小時下的小鼠腸管內投予三硝基苯磺酸、於4日起至2週間使其由給水瓶自由飲用1-10%的葡聚糖硫酸鈉水溶液、對於Rag2缺損小鼠的腹腔內移入採取自人類TLR7基因轉殖小鼠的淋巴節及脾臟並純化的CD4+CD25-CD45RBhi T細胞等之方法而誘導結腸炎，在抗TLR7抗體組及非投予組之間比較觀察期間中的體重、利用試驗結束後的剖檢之腸管的肥厚度/息肉的個數及大小/病理組織學的特徵、血液或組織中的抗體/細胞介素/血中生物標記濃度、自腸管/末梢血液/胸腺/脾臟/淋巴節/骨髓/派氏淋巴叢(Peyer’s patch)所得的細胞之增殖活性/細胞介素產生能力/表面抗原等。
對於全身性紅斑狼瘡的效果，可藉由下述而評價：在抗TLR7抗體組及非投予組之間比較從為自然發病模式的NZB/WF1小鼠、MRL/lpr小鼠、BXSB小鼠按時採取之血液或 組織中的抗體/細胞介素/血中生物標記濃度、尿中的抗體價或生物標記濃度、自試驗結束後所採取的脾臟/淋巴節等的臟器製備細胞並移入至無處置小鼠中所引起的症狀等。
對於肝炎的效果，可藉由下述而評價：藉由將D-半乳胺糖單獨或與脂多醣組合而對於小鼠的腹腔內進行投予、將刀豆球蛋白A(concanavalin A)單獨對於尾靜脈內進行投予等之方法而誘導肝炎，在抗TLR7抗體組及非投予組之間比較誘炎物質投予之1小時~1週後所採取的血液中之AST及ALT濃度、細胞介素濃度、肝病變之組織病理學的狀態。
如此進行所得的抑制人類TLR7的生物活性之抗體，有用於作為醫藥，特別是作為用以預防或治療以全身性紅斑狼瘡為首的免疫發炎性疾病、過敏性疾病、感染症、或癌症等之抗體。
抗人類TLR7抗體就一例而言，對於免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症、或癌症的治療或預防，可將該抗體單獨、或與至少一種其他的治療劑併用而投予。作為可與抗人類TLR7抗體併用而投予的其他治療劑，可列舉腎上腺皮質類固醇劑、非類固醇性抗發炎藥、核酸代謝拮抗劑、核酸合成抑制劑、葉酸代謝拮抗劑、鈣調磷酸酶(calcineurin)抑制劑、抗瘧疾藥、抗胸腺細胞球蛋白劑、以細胞表面抗原為標的之生物製劑、或者以細胞介素/干擾素或細胞介素/干擾素受體為標的之生物製劑等，但不限定於此等。
就上述治療劑的具體例而言，作為腎上腺皮質類固醇劑，可列舉甲基培尼皮質醇(Methylprednisolone)等；作為非類固醇性抗發炎藥，可列舉洛普芬鈉水合物(Loxoprofen Sodium Hydrate)、雙氯芬酸鈉(Diclofenac sodium)、吲哚美辛(Indomethacin)、乙醯水楊酸(Acetyl salicylic acid)等；作為核酸代謝拮抗劑，可列舉黴酚酸
啉乙酯(Mycophenolate mofetil)等；作為核酸合成抑制劑，可列舉環磷醯胺(Cyclophosphamide)等；作為鈣調磷酸酶抑制劑，可列舉環孢素(Cyclosporin)、他克莫司(Taclorims)等；作為抗瘧疾藥，可列舉羥氯奎(Hydroxychloroquine)等；作為葉酸代謝拮抗劑，可列舉胺甲喋呤(Methotrexate)等；作為抗胸腺細胞球蛋白劑，可列舉Zetbulin、Lymphoglobuline、Thymoglobulin；作為以細胞表面抗原為標的之生物製劑，可列舉阿侖單抗(Alemtuzumab)、利妥昔單抗(Rituximab)、巴他西普(Abatacept)等；作為以細胞介素/干擾素或細胞介素/干擾素受體為標的之生物製劑，可列舉英利昔單抗(Infliximab)、依那西普(Etanercept)、阿達木單抗(Adalimumab)、妥西珠單抗(Tocilizumab)、貝利木單抗(Belimumab)、阿尼法魯單抗(Anifrolumab)等。
依免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症、或癌症的狀態、以何種程度的治療及/或預防為目標，亦可投予2、3或其以上的種類的其他治療劑，且彼等其他治療劑可藉由封入相同的製劑中而同時進行投予。其他治療劑與抗人類TLR7抗體亦可藉由封入相同的製劑中而同時進行投予。又，亦可將抗人類TLR7抗體與其他治療劑封入各別的製劑而同時進行投予。再者，亦可將其他治療劑與抗人類TLR7抗體互為前後而各別進行投予。亦即，可在投予其他治療劑後，投予含有抗人類TLR7抗體或該抗體的抗原結合性片段作為有效成分的治療劑；或者在投予 含有抗人類TLR7抗體或該抗體的抗原結合性片段作為有效成分的治療劑後，投予其他治療劑。於基因治療中進行投予的情形，蛋白質性治療劑的基因與抗人類TLR7抗體的基因，可插入至各別或相同的啟動子區之下游，可導入至各別或相同的載體中。
可藉由對於抗人類TLR7抗體或其片段，使治療劑結合，而製造M.C.Garnet「Targeted drug conjugates：principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216所記載的標的型藥物複合體。於此目的中，除了抗體分子之外，只要沒有完全喪失T細胞的辨識性，亦可適用任一抗體片段，可列舉例如Fab、F(ab’)2、Fv等的片段作為例子，於本發明中亦可同樣地使用抗體及該片段。抗人類TLR7抗體或該抗體的片段與治療劑之結合樣式，可為M.C.Garnet「Targeted drug conjugates：principles and progress」,Advanced Drug Delivery Reviews,(2001)53,171-216、G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123等所記載的各種形態。亦即，可列舉抗人類TLR7抗體與治療劑於化學上直接或經由寡肽等的間隔物(spacer)而結合的樣式、或者使適當的藥物載體(carrier)存在於其間而結合的樣式。作為藥物載體之例，可列舉微脂體、水溶性高分子。作為使此等藥物載體存在於其間的樣式，更具體而言，可列舉使抗體與治療劑包含於微脂體中且該微脂體與抗體結合的樣式、以及治療劑化學上直接或使寡肽等的間隔物存在於其間而結合至水溶性高分子(分子量1000 至10萬左右的化合物)且抗體結合至該水溶性高分子的樣式作為例子。抗體(或該片段)與治療劑、微脂體及水溶性高分子等的藥物載體之結合，可藉由G.T.Hermanson「Bioconjugate Techniques」Academic Press,California(1996)、Putnam and J.Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123所記載的方法等之當業者周知的方法而實施。治療劑被包含至微脂體，可藉由D.D.Lasic「Liposomes：From Physics to Applications」,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam(1993)等所記載的方法等之當業者周知的方法而實施。治療劑對水溶性高分子的結合，可藉由D.Putnam and J Kopecek「Polymer Conjugates with Anticancer Activity」Advances in Polymer Science(1995)122,55-123記載的方法等之當業者周知的方法而實施。抗體(或該片段)與蛋白質性治療劑(或該片段)的複合體，除了上述方法之外，亦可藉由基因工程上當業者周知的方法而製作。
本發明亦提供一種醫藥組成物，其含有對於疾病的治療及/或預防為有效量之抗人類TLR7抗體或該抗體的抗原結合性片段之至少一者或者含具有編碼彼等的多核苷酸序列之多核苷酸的表現載體作為有效成分，並且包含藥學上容許的稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑。
本發明亦提供一種醫藥組成物，其包含：對於疾病的治療及/或預防為有效量之抗人類TLR7抗體或該抗體的抗原結合性片段之至少一者或者含具有編碼彼等的多核苷酸序列之多核苷酸的表現載體、對於疾病的治療及/或預防為有效量之至 少一種治療劑、以及藥學上容許的稀釋劑、載劑、增溶劑、乳化劑、保存劑及/或輔助劑。
作為治療劑，可例舉先前所述的葉酸代謝拮抗劑、鈣調磷酸酶抑制劑、腎上腺皮質類固醇劑、抗胸腺細胞球蛋白劑、核酸代謝拮抗劑、核酸合成抑制劑、以細胞表面抗原為標的之生物製劑、或者以細胞介素或細胞介素受體為標的之生物製劑等，但不限定於此等。
作為於本發明的醫藥組成物中容許之製劑所使用的物質，較佳為於投予量、投予濃度上對於被投予醫藥組成物者為非毒性。
本發明的醫藥組成物可包含用以改變或保持pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、穩定性、溶解率、持續釋放率、吸收率、滲透率之製劑用物質。作為製劑用物質，可列舉以下者，但並未限制於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等的胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等的抗氧化劑、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、磷酸、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、三羥甲基胺基甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等的緩衝劑、甘露糖醇或甘胺酸等的填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等的螯合劑、咖啡因、聚乙烯吡咯啶、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精等的錯合劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等的增量劑、單醣類、雙醣類等的其他炭水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯吡咯啶等的親水聚合物、低分子量多肽、鹽形成相對離子、氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)、苯甲酸、柳酸、乙汞硫柳酸鈉、苯乙醇、羥苯甲酸甲酯(methylparaben)、羥苯甲酸丙酯(propylparaben)、洛赫西 定、山梨酸或過氧化氫等的防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等的溶媒、甘露糖醇或山梨糖醇等的糖醇、懸浮劑、山梨醇酐酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等的聚山梨醇酯、Triton、胺基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等的界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等的穩定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘露糖醇/山梨糖醇等的彈性增強劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上的輔助劑。此等製劑用物質的添加量，相對於抗人類TLR7抗體的重量，較佳為添加0.01~100倍，特佳為添加0.1~10倍。製劑中適合的醫藥組成物的組成可依當業者，因應適用疾病、適用投予路徑等而適宜決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載劑可為液體，亦可為固體。適當的賦形劑或載劑可為注射用的水或生理食鹽水、人工腦脊髓液或通常使用於非經口投予的其他物質。中性的生理食鹽水或包含血清白蛋白的生理食鹽水亦可用於載劑。醫藥組成物中可包含pH7.0-8.5的Tris緩衝液、pH4.0-5.5的乙酸緩衝液、pH3.0-6.2的檸檬酸緩衝液。又，此等緩衝液中亦可包含山梨糖醇或其他化合物。本發明的醫藥組成物中可列舉包含抗人類TLR7抗體的醫藥組成物、以及包含抗人類TLR7抗體及至少一種治療劑的醫藥組成物，且本發明的醫藥組成物就具有所選擇的組成與必要的純度之藥劑而言，可作為冷凍乾燥品或液體來準備。包含抗人類TLR7抗體的醫藥組成物、以及包含抗人類TLR7抗體及至少一種骨代謝異常治療藥劑的醫藥組成物，亦可作為使用如蔗糖的適當賦形劑之冷凍乾燥品來成型。
本發明的醫藥組成物可製備成非經口投予用，亦可製備成利用口服之消化道吸收用。製劑的組成及濃度可依投予方 法而決定，且由於本發明的醫藥組成物所包含的抗人類TLR7抗體對人類TLR7的親和性(即相對於對人類TLR7的解離常數(Kd值)之親和性)越高(Kd值越低)，則越可即使減少對人類的投予量亦發揮藥效，故亦可基於此結果而決定本發明的醫藥組成物對人的投予量。本發明中之投予量，於對人類投予抗人類TLR7抗體時，只要在1~180日間投予0.1~100mg/kg一次即可。
作為本發明的醫藥組成物之形態，可列舉包含點滴的注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經皮吸收劑等。
被承認的抗體製劑幾乎為靜脈內投予，但在許多醫療現場更佳為皮下投予。於該情形，由於容量被限制於1.0~1.5mL，故依投予量而被要求高濃度的抗體溶液。然而，由於若進行高濃度化則藥液的黏性增加，故於常用的注射針粗細，發生所謂因其高黏性而無法注射的事態。亦即，作為醫藥組成物的形態，於選擇注射劑的情形，所謂黏度低之性質應視為優先，且有重要的意義，能以黏度為指標而選擇適合的抗體。
以下，藉由實施例而具體地說明本發明，但本發明不限定於此等。此外，於下述實施例，關於基因操作之各操作只要沒有特別指明，則依據「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold SpringHarbor Laboratory Press於1989年發行)所記載的方法進行，或者於使用市售的試藥或套組的情形，係依照市售品的說明書使用。
使用In Fusion(註冊商標)酵素(Takara公司製)，將人類TLR7(變異體2)基因(序列識別號3)組入至於基因的C末端側附加有Flag-His×6之反轉錄病毒載體pMXs(Cell Biolabs公司)中。使用為轉染試藥之Fugene(註冊商標)6(Roche)，將該反轉錄病毒載體進行基因導入至源自HEK293細胞的包裝細胞株(packaging cell line)Plat-E(Cell Biolabs公司)中。24小時後，回收培養上清液作為病毒懸浮液。將該病毒懸浮液與為轉染試藥之DOTAP(Roche)混合，加入至Ba/F3細胞株(RIKEN,BRC)，以2000rpm、1小時進行高速離心，樹立人類TLR7-Flag-His×6表現Ba/F3細胞株。
人類TLR7(變異體2)基因(序列識別號3)所編碼的人類TLR7，具有序列識別號4的胺基酸序列。將該序列示於圖2。
使用In Fusion(註冊商標)酵素(Takara公司製)，將人類Unc93B1基因(序列識別號55)組入至於基因的C末端側附加有HA×2之反轉錄病毒載體pMXs(Cell Biolabs公司)中。使用為轉染試藥之Fugene(註冊商標)6(Roche)，將該反轉錄病毒載體進行基因導入至源自HEK293細胞的包裝細胞株Plat-E(Cell Biolabs公司)中。24小時後，回收培養上清液作為病毒懸浮液。將該病毒懸浮液與為轉染試藥之DOTAP(Roche)混合，加入至上述所樹立的人類TLR7-Flag-His×6表現Ba/F3細胞株，以2000rpm、1小時進行高速離心，樹立人類 TLR7-Flag-His×6/人類Unc93B1-HA×2強制表現Ba/F3細胞株。
將1)-1-1所樹立的人類TLR7-Flag-His×6/人類Unc93B1-HA×2強制表現Ba/F3細胞株與為佐劑之TiterMAX(註冊商標)Gold(TiterMax USA公司製)混合，作為抗原而對東京大學醫科學研究所所製作的以BALB/c為背景的TLR9缺損小鼠，以每週合計3次投予至足底部、尾根部、腹腔內。
於第4次，將以1×PBS懸浮的人類TLR7-Flag-His×6/人類Unc93B1-HA×2強制表現Ba/F3細胞株投予至腹腔內。
於自最終免疫日起第5日摘出脾臟，用於融合瘤的製作。
將免疫後的脾臟細胞與Sp2/o細胞株(ATCC)混合，使用HVJ-E細胞融合套組(石原產業)進行細胞融合。自細胞融合操作的翌日起，為了選擇融合瘤，以含有HAT(Thermo Fisher Scientific)的培養液(包含10% FBS、50μM 2-巰乙醇(Life Technologies)、50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies)的RPMI1640(Life Technologies))進行培養，回收所出現的融合瘤群落，藉此製作單株融合瘤。
自在顯微鏡下形成群落的融合瘤採取培養上清液而用於篩選。將經0.1%皂素(Sigma-Aldrich)進行細胞膜通透化處理的hTLR7-Flag-His×6/hUnc93B1-HA×2強制表現Ba/F3細胞株、與皆沒有表現的Ba/F3細胞，於培養上清液中各自進行染色，以流動式細胞測量術(LSRFortessaTMX-20，Nippon Becton Dickinson股份有限公司)進行解析，挑選產生抗hTLR7抗體的融合瘤。
使用反轉錄病毒，將人類TLR7(變異體2)基因(序列識別號3)及人類Unc93B1 D34A突變型-HA×2基因(序列識別號86)導入至Ba/F3細胞株(RIKEN,BRC)中。進一步藉由電穿孔法將NF-κB-綠色螢光蛋白質(GFP)報導質體(reporter plasmid)(STRATAGENE)進行基因導入至該細胞中，確立可解析NF-κB的活化之hTLR7/hUnc93B1 D34A突變型-HA×2強制表現Ba/F3細胞株，對該細胞株添加融合瘤的培養上清液。4小時後，藉由為TLR7配體之R848(InvivoGen)25ng/ml進行刺激。24小時後，使用流動式細胞測量術，測定GFP的螢光度而解析人類TLR7反應的抑制效果，結果選出3個小鼠抗人類TLR7抗體產生融合瘤，各自命名為AT01、NB7及FAN2。
於本案說明書中，將融合瘤AT01、NB7及FAN2所產生的抗體各自稱為AT01抗體、NB7抗體及FAN2抗體。
使用IsoStrip小鼠單株抗體分型套組(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit)(Merck)確定1)-4所取得的各小鼠抗人類TLR7抗體產生融合瘤(AT01、NB7及FAN2)所產生之抗體的同型。其結果顯示AT01抗體、NB7抗體及FAN2抗體的同型各自為IgG1/κ。
小鼠抗人類TLR7單株抗體，係將融合瘤對於經姥鮫烷(pristane)(SIGMA-ALDRICH，現Merck)前處置的ICR-CD1-Foxnl裸鼠(ICR-nu，Charles River Laboratories Japan)進行腹腔內投予，約10日後，由所回收的腹水進行純化。
首先，將姥鮫烷對ICR-nu進行腹腔內投予而飼育7日以上。其次，將AT01、NB7、FAN2產生融合瘤以包含10% FBS、50μM 2-巰乙醇(Life Technologies)、50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies)的RPMI1640(Life Technologies)進行培養，使其增殖至充分量後，懸浮於1×PBS而對ICR-nu進行腹腔內投予。
10日後，回收腹水，以高速離心機使血球沈降並回收上清液。以1×PBS將腹水稀釋成10倍後，通過0.45μm的過濾器(Millipore)。
抗體係由上述腹水，使用AKTAprime plus(GE Healthcare Japan)並以Protein G管柱(GE Healthcare Japan)進行純化。
接著，藉由PD-10(GE Healthcare Japan)，進行緩衝液取代成生理食鹽水的同時，進行濃縮，將抗體濃度調製成 1.0mg/mL以上。
最後，以Millex-GV 0.22μm(Millipore)進行滅菌，作為純化樣本。
使用In Fusion(註冊商標)酵素(Takara公司製)，將小鼠TLR7基因(序列識別號56)組入至於基因的C末端側附加有Flag-His×6之反轉錄病毒載體pMXs(Cell Biolabs公司)中。使用為轉染試藥之Fugene(註冊商標)6(Roche)，將該反轉錄病毒載體進行基因導入至源自HEK293細胞的包裝細胞株Plat-E(Cell Biolabs公司)中。24小時後，回收培養上清液作為病毒懸浮液。將該病毒懸浮液與為轉染試藥之DOTAP(Roche)混合，加入至Ba/F3細胞株(RIKEN,BRC)，以2000rpm、1小時進行高速離心，樹立小鼠TLR7-Flag-His×6強制表現Ba/F3細胞株。
小鼠TLR7基因(序列識別號56)所編碼的小鼠TLR7，具有序列識別號83的胺基酸序列。將該序列示於圖3。
使用In Fusion(註冊商標)酵素(Takara公司製)，將大鼠TLR7基因(序列識別號57)組入至於基因的C末端側附加有Flag-His×6之反轉錄病毒載體pMXs(Cell Biolabs公司)中。使用為轉染試藥之Fugene(註冊商標)6(Roche)，將該反轉錄 病毒載體進行基因導入至源自HEK293細胞的包裝細胞株Plat-E(Cell Biolabs公司)中。24小時後，回收培養上清液作為病毒懸浮液。將該病毒懸浮液與為轉染試藥之DOTAP(Roche)混合，加入至Ba/F3細胞株(RIKEN,BRC)，以2000rpm、1小時進行高速離心，樹立大鼠TLR7-Flag-His×6強制表現Ba/F3細胞株。
大鼠TLR7基因(序列識別號57)所編碼的大鼠TLR7，具有序列識別號84的胺基酸序列。將該序列示於圖4。
使用In Fusion(註冊商標)酵素(Takara公司製)，將猴TLR7基因(序列識別號58)組入至於基因的C末端側附加有Flag-His×6之反轉錄病毒載體pMXs(Cell Biolabs公司)中。使用為轉染試藥之Fugene(註冊商標)6(Roche)，將該反轉錄病毒載體進行基因導入至源自HEK293細胞的包裝細胞株Plat-E(Cell Biolabs公司)中。24小時後，回收培養上清液作為病毒懸浮液。將該病毒懸浮液與為轉染試藥之DOTAP(Roche)混合，加入至Ba/F3細胞株(RIKEN,BRC)，以2000rpm、1小時進行高速離心，構築猴TLR7-Flag-His×6強制表現Ba/F3細胞株。
猴TLR7基因(序列識別號58)所編碼的猴TLR7，具有序列識別號85的胺基酸序列。將該序列示於圖5。
將1)-1-1所樹立之強制表現人類TLR7-Flag-His×6/人類Unc93B1-HA×2的Ba/F3細胞株、2)-1-1所樹立之小鼠TLR7-Flag-His×6強制表現Ba/F3細胞株、2)-1-2所樹立之大鼠TLR7-Flag-His×6強制表現Ba/F3細胞株、及2)-1-3所樹立之猴TLR7-Flag-His×6強制表現Ba/F3細胞株，以0.1%皂素進行細胞膜通透化處理，並使用AT01抗體、NB7抗體及FAN2抗體、與為二級抗體之山羊抗小鼠IgG(H+L)-PE(eBioscience)進行染色。各抗體之結合選擇能力的評價係以流動式細胞測量術進行解析，比較平均螢光強度(MFI)。
其結果，AT01抗體、NB7抗體及FAN2抗體特異性地結合至人類TLR7或猴TLR7，且不結合至小鼠TLR7或大鼠TLR7。
將1)-1-1所樹立之強制表現人類TLR7-Flag-His×6/人類Unc93B1-HA×2的Ba/F3細胞株，以0.1%皂素進行細胞膜通透化處理，並使用AT01抗體、NB7抗體及FAN2抗體、與為二級抗體之山羊抗小鼠IgG(H+L)-PE(eBioscience)進行染色。各抗體之結合活性的評價係以流動式細胞測量術進行解析，比較平均螢光強度(MFI)。
其結果，自結合活性強者起，依序為AT01抗體、NB7抗體、FAN2抗體。
人類PBMC係自Cellular Technology公司作為冷凍品購
入，依照說明書進行解凍而使用。
將藉由包含10% FBS、1mM丙酮酸鈉(Life Technologies公司)、0.1mM MEM非必需胺基酸(Life Technologies公司)、50μM 2-巰乙醇(Life Technologies公司)、50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司)的RPMI1640(Life Technologies)調製成2.5x106個細胞/mL的濃度之PBMC，以各100μL接種於96孔細胞培養盤，將為小鼠抗人類TLR7抗體之AT01抗體、NB7抗體、FAN2抗體、或小鼠IgG對照抗體(Biolegend公司)以80μL/孔進行添加，於37℃培養箱(incubator)內進行前處置4小時。
之後，將1mg/mL CL-264(InvivoGen公司)以20μL/孔進行添加，充分攪拌後，在37℃、5% CO2下培養約20小時。將盤充分攪拌後，以1500rpm離心5分鐘，並以FRET法(Cisbio公司)測定上清液中所包含的介白素-6(IL-6)濃度。
將結果示於圖6。小鼠抗人類TLR7抗體係添加濃度依賴性地抑制來自經CL-264處理的人類PBMC之IL-6的產生。AT01抗體、NB7抗體及FAN2抗體係添加濃度依賴性地抑制來自人類PBMC之IL-6的產生。AT01抗體、NB7抗體及FAN2抗體的半數抑制濃度(IC50)，係從包夾50%抑制活性之二點間的濃度、與添加該濃度時的抑制活性而算出，各為192ng/mL、771ng/mL、8389ng/mL。
另一方面，於小鼠IgG對照抗體，即使在10μg/mL的濃度下亦沒有觀察到抑制。
使用TRIzol Reagent(Ambion)，自AT01、NB7、FAN2的融合瘤回收總RNA(total RNA)。接著，使用PrimeScript 1st Strand cDNA合成套組(TAKARA)而合成cDNA。
合成的cDNA所包含的編碼抗體可變區的核苷酸序列，係藉由GENESCRIPT公司進行解讀。
於序列表的序列識別號5呈示經確定之編碼AT01抗體的重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
於序列表的序列識別號11呈示經確定之編碼AT01抗體的輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
於序列表的序列識別號7呈示經確定之編碼NB7抗體的重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
於序列表的序列識別號13呈示經確定之編碼NB7抗體的輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
於序列表的序列識別號9呈示經確定之編碼FAN2抗體的 重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
於序列表的序列識別號15呈示經確定之編碼FAN2抗體的輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列所編碼的胺基酸序列。
將以限制酶XbaI及PmeI消化質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)所得的約5.4kb之片段、與包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類kappa鏈恒定區的DNA序列之DNA片段(序列識別號59)，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)而結合，製作pcDNA3.3/LK。藉由自pcDNA3.3/LK除去新黴素表現單元，而構築pCMA-LK。
將以XbaI及PmeI消化pCMA-LK而移除輕鏈訊息序列及人類kappa鏈恒定區之DNA片段、與包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恒定區的DNA序列之DNA片段(序列識別號60)，使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)而結合，構築pCMA-G1。
合成含有序列識別號61所示的核苷酸序列的核苷酸編號36至422所示之編碼cAT01抗體重鏈可變區之核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組 (Clontech公司)，將合成的DNA片段插入至將pCMA-G1以限制酶BlpI切斷處，藉此構築cAT01抗體重鏈表現載體。cAT01抗體的重鏈係包含訊息序列而具有序列識別號35的胺基酸序列。將該序列示於圖7。
合成包含編碼cAT01抗體輕鏈的DNA序列之DNA片段(序列識別號62)(GENEART公司)。使用實施例4)-1-1所製作的pCMA-LK，以與上述同樣的方法構築cAT01抗體輕鏈表現載體。cAT01抗體的輕鏈係包含訊息序列而具有序列識別號36的胺基酸序列。將該序列示於圖7。
合成含有序列識別號63所示的核苷酸序列的核苷酸編號36至440所示之編碼cNB7抗體重鏈可變區之核苷酸序列的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-1-3同樣的方法構築cNB7重鏈表現載體。cNB7抗體的重鏈係包含訊息序列而具有序列識別號37的胺基酸序列。將該序列示於圖8。
合成包含編碼cNB7輕鏈的DNA序列之DNA片段(序列識別號64)(GENEART公司)。使用實施例4)-1-1所製作的pCMA-LK，以與實施例4)-1-3同樣的方法構築cNB7輕鏈表現載體。cNB7抗體的輕鏈係包含訊息序列而具有序列識別號38的胺基酸序列。將該序列示於圖8。
合成含有序列識別號65所示的核苷酸序列的核苷酸編號36至437所示之編碼cFAN2抗體重鏈可變區之核苷酸序列的 DNA片段(GENEART公司)。以與實施例4)-1-3同樣的方法構築cFAN2重鏈表現載體。cFAN2抗體的重鏈係包含訊息序列而具有序列識別號39的胺基酸序列。將該序列示於圖9。
合成包含編碼cFAN2輕鏈的DNA序列之DNA片段(序列識別號66)(GENEART公司)。使用實施例4)-1-1所製作的pCMA-LK，以與實施例4)-1-3同樣的方法構築cFAN2輕鏈表現載體。cFAN2抗體的輕鏈係包含訊息序列而具有序列識別號40的胺基酸序列。將該序列示於圖9。
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係依照手冊進行繼代、培養。將對數增殖期的1.2×109個FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於3L Fernbach Erlenmeyer燒瓶(CORNING公司)，以FreeStyle293表現培養基(Invitrogen公司)稀釋而調製成2.0×106細胞/mL。於40mL的Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中加入0.24mg的上述4)-1-3所構築之重鏈表現載體、0.36mg的上述4)-1-3所構築之輕鏈表現載體、及1.8mg的聚伸乙亞胺(Polyscience #24765)並緩緩攪拌，在進一步放置5分鐘後，添加FreeStyle 293F細胞。在37℃、8% CO2培養箱中，以4小時、90rpm進行振盪培養後，添加600ml的EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、18ml的GlutaMAX I(GIBCO公司)、及30mL的Yeastolate超濾液(GIBCO公司)，並在37℃、8% CO2培養箱中以7日、90rpm進行振盪培養，將所得的培養上清液以拋棄式 膠囊型過濾器(Advantec #CCS-045-E1H)過濾，製造嵌合化AT01抗體。
使用上述4)-1-4所構築之重鏈表現載體及輕鏈表現載體，藉由上述4)-2-1的方法製造嵌合化NB7抗體。
使用上述4)-1-5所構築之重鏈表現載體及輕鏈表現載體，藉由上述4)-2-1的方法製造嵌合化FAN2抗體。
自實施例4)-2所得的各培養上清液，將目標之抗體以rProtein A親和力層析的1階段步驟進行純化。將培養上清液施用於經PBS平衡化之填充有MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量的2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行沖提，收集包含抗體的分部。將該分部藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer透析匣)進行緩衝液取代成PBS(-)。以離心式UF過濾裝置VIVASPIN20(截留分子量(cutoff molecular weight)UF10K，Sartorius公司)來濃縮抗體，將IgG濃度調製成10mg/mL以上。最後，以Minisart-Plus過濾器進行過濾，作為純化樣本。
將強制表現人類TLR7-Flag-His×6/hUnc93B1-HA×2的Ba/F3細胞株，以0.1%皂素進行細胞膜通透化處理，並使用實施例4所得的經嵌合化之AT01抗體、NB7抗體、及FAN2抗體之抗體濃度的稀釋系列、與為二級抗體之山羊抗人類IgG Fc-PE(eBioscience)進行染色。各抗體之結合活性的評價係以流動式細胞測量術進行解析，比較MFI。其結果，自結合活性強者起，依序為嵌合化AT01抗體(cAT01)、嵌合化NB7抗體(cNB7)、嵌合化FAN2抗體(cFAN2)。
人類PBMC係自Cellular Technology公司作為冷凍品購入，依照說明書進行解凍而使用。將藉由包含10% FBS、1mM丙酮酸鈉(Life Technologies公司)、0.1mM MEM非必需胺基酸(Life Technologies公司)、50μM 2-巰乙醇(Life Technologies公司)、50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司)的RPMI1640(Life Technologies)調製成2.5x106個細胞/mL的濃度之PBMC，以各100μL接種於96孔細胞培養盤，將為嵌合化抗人類TLR7抗體之cAT01、cNB7、cFAN2、或人類IgG對照抗體(EUREKA Therapeutics公司)以80μL/孔進行添加，於37℃培養箱內進行前處置4小時。之後，將1mg/mL CL-264(InvivoGen公司)以20μL/孔進行添加，充分攪拌後，在37℃、5% CO2下培養約20小時。將盤充分攪拌後，以1500rpm離心5分鐘，並以FRET法(Cisbio 公司)測定上清液中所包含的IL-6濃度。
圖10呈示嵌合化抗人類TLR7抗體會添加濃度依賴性地抑制來自經CL-264處理的人類PBMC之IL-6的產生。cAT01、cNB7、cFAN2係添加濃度依賴性地抑制來自人類PBMC之IL-6的產生。cAT01、cNB7、cFAN2的半數抑制濃度(IC50)，係從包夾50%抑制活性之二點間的濃度、與添加該濃度時的抑制活性而算出，各為35ng/mL、196ng/mL、10000ng/mL以上。
另一方面，於人類IgG對照抗體，即使在10μg/mL的濃度下亦沒有觀察到抑制。
可變區的分子模擬係利用就同源性模擬(homology modeling)而言眾所周知的方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))，並使用市售的蛋白質立體結構解析程式BioLuminate(Schrodinger公司製)來進行。模版係使用相對於重鏈與輕鏈的可變區具有高序列相同性之登錄於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))的結構。
人源化係利用就CDR移植(CDR-grafting)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))而言已知的手法。 自Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))所既定的共通序列、或登錄於IMGT(THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM(註冊商標)，http：//www.imgt.org)的人類胚原序列(germline sequence)中選擇相同性高的接受體(acceptor)，而應移入至接受體上的供體殘基(donor residue)則參考Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所給予的基準等，藉由分析三維模型來選擇。
人類之gamma鏈子群(subgroup)1及kappa鏈子群1的共通序列，因為相對於cAT01的框架區具有高相同性，而被選擇作為cAT01的接受體。可變區的分子模擬則係以既知結構(PDB ID：1E4W)作為模版。
(1)將所設計的重鏈命名為huAT01_H1_IgG1LALA。huAT01_H1_IgG1LALA係包含訊息序列而具有序列識別號45所記載的胺基酸序列作為重鏈全長胺基酸序列。將該序列示於圖11。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第135號的胺基酸序列為可變區，第136號至第465號的胺基酸序列為恒定區。又，第45號至第54號的胺基酸序列為CDRH1，第69號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第118號至第124號的胺基酸序列為CDRH3。
編碼序列識別號45的胺基酸序列之核苷酸序列，係具有序列識別號67所記載的序列。又，編碼重鏈可變區之核苷酸序列，係具有序列識別號77所記載的序列。
(2)將所設計的重鏈命名為huAT01_H3_IgG1LALA。huAT01_H3_IgG1LALA係包含訊息序列而具有序列識別號46所記載的胺基酸序列作為重鏈全長胺基酸序列。將該序列示於圖12。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第135號的胺基酸序列為可變區，第136號至第465號的胺基酸序列為恒定區。又，第45號至第54號的胺基酸序列為CDRH1，第69號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第118號至第124號的胺基酸序列為CDRH3。
編碼序列識別號46的胺基酸序列之核苷酸序列，係具有序列識別號68所記載的序列。又，編碼重鏈可變區之核苷酸序列，係具有序列識別號78所記載的序列。
(3)將所設計的重鏈命名為huAT01_H3_IgG4Pro。huAT01_H3_IgG4Pro係包含訊息序列而具有序列識別號47所記載的胺基酸序列作為重鏈全長胺基酸序列。將該序列示於圖13。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第135號的胺基酸序列為可變區，第136號至第462號的胺基酸序列為恒定區。又，第45號至第54號的胺基酸序列為CDRH1，第69號至第78號的胺基酸序列為CDRH2，第118號至第124號的胺基酸序列為CDRH3。
編碼序列識別號47的胺基酸序列之核苷酸序列，
係具有序列識別號69所記載的序列。又，編碼重鏈可變區之核苷酸序列，係具有序列識別號78所記載的序列。
於圖14中呈示為嵌合化抗體cAT01的重鏈之cAT01_H之可變區的胺基酸序列(序列識別號5)(以下，cAT01_H)、以及人源化抗體重鏈huAT01_H1_IgG1LALA之可變區的胺基酸序列(序列識別號41)(以下，huAT01_H1)及huAT01_H3_IgG1LALA之可變區的胺基酸序列(序列識別號42)(以下，huAT01_H3)之比較。huAT01_H1及huAT01_H3的序列中的「‧」表示與cAT01_H相同的胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基的地方表示經取代的胺基酸殘基。
將所設計的輕鏈命名為huAT01_L1。huAT01_L1係包含訊息序列而具有序列識別號48所記載的胺基酸序列作為輕鏈全長胺基酸序列。將該序列示於圖15。於該序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第126號的胺基酸序列為可變區，第127號至第233號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號44號至54號為CDRL1，胺基酸編號70號至76號為CDRL2，胺基酸編號109號至116號為CDRL3。
編碼序列識別號48的胺基酸序列之核苷酸序列，係具有序列識別號70所記載的序列。又，編碼輕鏈可變區之核苷酸序列，係具有序列識別號79所記載的序列。
將所設計的輕鏈命名為huAT01_L2。huAT01_L2係包含訊息序列而具有序列識別號49所記載的胺基酸序列作為輕鏈全長胺基酸序列。將該序列示於圖16。於該序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第126號的胺基酸序列為可變區，第127號至第233號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號44號至54號為CDRL1，胺基酸編號70號至76號為CDRL2，胺基酸編號109號至116號為CDRL3。
於序列識別號71中記載編碼序列識別號49的胺基酸序列之核苷酸序列。又，編碼輕鏈可變區之核苷酸序列，係具有序列識別號80所記載的序列。
於圖17中呈示為嵌合化抗體cAT01的輕鏈之cAT01_L之可變區的胺基酸序列(序列識別號11)(以下，cAT01_L)、以及人源化抗體輕鏈huAT01_L1之可變區的胺基酸序列(序列識別號43)(以下，huAT01_L1)及huAT01_L2之可變區的胺基酸序列(序列識別號44)(以下，huAT01_L2)之比較。huAT01_L1及huAT01_L2的序列中的「‧」表示與cAT01_L相同的胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基的地方表示經取代的胺基酸殘基。
因為人類胚原序列的IGHV4-30-4*02與IGHJ6*01相對於cNB7的框架區具有高相同性，而被選擇作為cNB7的接受體。可變區的分子模擬則係以既知結構(PDB ID：3CDF)作為模版。
(1)將所設計的重鏈命名為huNB7_H3_IgG1LALA。huNB7_H3_IgG1LALA係包含訊息序列而具有序列識別號52 所記載的胺基酸序列作為重鏈全長胺基酸序列。將該序列示於圖18。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第141號的胺基酸序列為可變區，第142號至第471號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號45號至55號為CDRH1，胺基酸編號70號至78號為CDRH2，胺基酸編號118號至130號為CDRH3。
於序列識別號72中記載編碼序列識別號52的胺基酸序列之核苷酸序列。又，編碼重鏈可變區之核苷酸序列，係具有序列識別號81所記載的序列。
(2)將所設計的重鏈命名為huNB7_H3_IgG4Pro。huNB7_H3_IgG4Pro係包含訊息序列而具有序列識別號54所記載的胺基酸序列作為重鏈全長胺基酸序列。將該序列示於圖19。於該序列中，第1號至第19號的胺基酸序列為訊息序列，第20號至第141號的胺基酸序列為可變區，第142號至第468號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號45號至55號為CDRH1，胺基酸編號70號至78號為CDRH2，胺基酸編號118號至130號為CDRH3。
於序列識別號73中記載編碼序列識別號54的胺基酸序列之核苷酸序列。又，編碼重鏈可變區之核苷酸序列，係具有序列識別號81所記載的序列。
於圖20中呈示為嵌合化抗體cNB7的重鏈之cNB7_H之可變區的胺基酸序列(序列識別號7)(以下，cNB7_H)、及人源化抗體重鏈huNB7_H3_IgG1LALA之可變區的胺基酸序列(序列識別號50)(以下，huNB7_H3)之比較。 huNB7_H3中的「‧」表示與cNB7_H相同的胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基的地方表示經取代的胺基酸殘基。
將所設計的輕鏈命名為huNB7_L3。huNB7_L3係包含訊息序列而具有序列識別號53所記載的胺基酸序列作為輕鏈全長胺基酸序列。將該序列示於圖21。於該序列中，第1號至第20號的胺基酸序列為訊息序列，第21號至第126號的胺基酸序列為可變區，第127號至第233號的胺基酸序列為恒定區。又，胺基酸編號44號至54號為CDRL1，胺基酸編號70號至76號為CDRL2，胺基酸編號109號至116號為CDRL3。
於序列識別號74中記載編碼序列識別號53的胺基酸序列之核苷酸序列。又，編碼輕鏈可變區之核苷酸序列，係具有序列識別號82所記載的序列。
於圖22中呈示為嵌合化抗體cNB7的輕鏈之cNB7_L之可變區的胺基酸序列(序列識別號13)(以下，cNB7_L)、以及人源化抗體輕鏈huNB7_L3之可變區的胺基酸序列(序列識別號51)(以下，huNB7_L3)之比較。huNB7_L3中的「‧」表示與cNB7_L相同的胺基酸殘基，記載有胺基酸殘基的地方表示經取代的胺基酸殘基。
(1)將具有下述重鏈及輕鏈的抗體命名為「huAT01_H1L1_IgG1LALA抗體」或「huAT01_H1L1_IgG1LALA」：包含序列 識別號45中之第20號至第465號的胺基酸序列之huAT01_H1_IgG1LALA作為重鏈、以及包含序列識別號48中之第21號至第233號的胺基酸序列之huAT01_L1作為輕鏈。
(2)將具有具有下述重鏈及輕鏈的抗體命名為「huAT01_H3L1_IgG1LALA抗體」或「huAT01_H3L1_IgG1LALA」：包含序列識別號46中之第20號至第465號的胺基酸序列之huAT01_H3_IgG1LALA作為重鏈、以及包含序列識別號48中之第21號至第233號的胺基酸序列之huAT01_L1作為輕鏈，命名為。1
(3)將具有下述重鏈及輕鏈的抗體命名為「huAT01_H3L2_IgG1LALA抗體」或「huAT01_H3L2_IgG1LALA」：包含序列識別號46中之第20號至第465號的胺基酸序列之huAT01_H3_IgG1LALA作為重鏈、以及包含序列識別號49中之第21號至第233號的胺基酸序列之huAT01_L2作為輕鏈。
(4)將具有下述重鏈及輕鏈的抗體命名為「huAT01_H3L2_IgG4Pro抗體」或「huAT01_H3L2_IgG4Pro」：包含序列識別號47中之第20號至第462號的胺基酸序列之huAT01_H3_IgG4Pro作為重鏈、以及包含序列識別號49中之第21號至第233號的胺基酸序列之huAT01_L2作為輕鏈。
(1)將包含下述重鏈及輕鏈的抗體命名為「huNB7_H3L3_ IgG1LALA抗體」或「huNB7_H3L3_IgG1LALA」：包含序列識別號52中之第20號至第471號的胺基酸序列之huNB7_H3_IgG1LALA作為重鏈、以及包含序列識別號53中之第21號至第233號的胺基酸序列之huNB7_L3作為輕鏈。
(2)將包含下述重鏈及輕鏈的抗體命名為「huNB7_H3L3_IgG4Pro抗體」或「huNB7_H3L3_IgG4Pro」：包含序列識別號54中之第20號至第468號的胺基酸序列之huNB7_H3_IgG4Pro作為重鏈、以及包含序列識別號53中之第21號至第233號的胺基酸序列之huNB7_L3作為輕鏈。
使用包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1LALA恒定區胺基酸序列的核苷酸序列之DNA片段(序列識別號75)，以與實施例4)-1-2同樣的方法構築pCMA-G1LALA。
使用包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG4Pro恒定區胺基酸序列的核苷酸序列之DNA片段(序列識別號76)，以與實施例4)-1-2同樣的方法，構築pCMA-G4Pro。
合成序列識別號46所示的huAT01_H1_IgG1LALA的核苷酸序列之核苷酸編號第36號至第422號所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，將合成的DNA片段插入至將pCMA-G1LALA以限制酶BlpI切斷處，藉此構築huAT01_H1_IgG1LALA表現載體。
合成序列識別號68所示的huAT01_H3_IgG1LALA的核苷酸序列之核苷酸編號第36號至第422號所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-3-3-1同樣的方法構築huAT01_H3_IgG1LALA表現載體。
合成序列識別號69所示的huAT01_H3_IgG4Pro的核苷酸序列之核苷酸編號第36號至第422號所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，將合成的DNA片段插入至將pCMA-G4Pro以限制酶BlpI切斷處，藉此構築huAT01_H3_IgG4Pro表現載體。
合成序列識別號70所示的huAT01_L1的核苷酸序列之核苷酸編號第37號至第399號所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，將合成的DNA片段插入至將pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷處，藉此構築huAT01_L1表現載體。
合成序列識別號71所示的huAT01_L2的核苷酸序列之核苷酸編號第37號至第399號所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，以與實施例6)-3-4-1同樣的方法構築huAT01_L2表現載體。
合成序列識別號72所示的huNB7_H3_IgG1LALA的核苷酸序列之核苷酸編號第36號至第440號所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-3-3-1同樣的方法構築huNB7_H3_IgG1LALA表現載體。
合成序列識別號73所示的huNB7_H3_IgG4Pro的核苷酸序列之核苷酸編號第36號至第440號所示的DNA片段(GENEART公司)。以與實施例6)-3-3-3同樣的方法構築huNB7_H3_IgG4Pro表現載體。
合成序列識別號74所示的huNB7_L3的核苷酸序列之核苷酸編號第37號至第399號所示的DNA片段(GENEART公司)。使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)，以與實施例6)-3-4-1同樣的方法構築huNB7_L3表現載體。
針對實施例6)-2所設計之利用重鏈與輕鏈的組合之huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、及huNB7_H3L3_IgG4Pro，使用實施例6)-3-1至6)-3-6所構築的各表現載體，以與實施例4)-2同樣的方法製造各人源化抗體。
將實施例6)-3-7-1所得的培養上清液以rProtein A親和力層析與陶瓷羥磷灰石(ceramic hydroxyapatite)之2階段步驟進行純化。
將培養上清液施用於經PBS平衡化之填充有MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量的2倍以上之PBS將管柱洗淨。其次，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行沖提。
將包含抗體的分部藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer透析匣)進行緩衝液取代成PBS，以5mM磷酸鈉/50mM MES/pH7.0的緩衝液進行5倍稀釋後，施用於經5mM NaPi/50mM MES/30mM NaCl/pH7.0的緩衝液平衡化之陶瓷羥磷灰石管柱(Bio-Rad Japan，Bio-Scale CHT Type-1羥磷灰石管柱)。
實施利用氯化鈉之線性濃度梯度沖提，收集包含抗體的分部。將該分部藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer透析匣)進行緩衝液取代成HBSor(25mM組胺酸/5%山梨糖醇，pH6.0)。以離心式UF過濾裝置VIVASPIN20(截留分子量UF10K，Sartorius公司)來濃縮抗體，將IgG濃度調製成50mg/mL。最後，以Minisart-Plus過濾器進行過濾，作為純化樣本。
人類PBMC係自Cellular Technology公司作為冷凍品購入，依照說明書進行解凍而使用。
將藉由包含10% FBS、1mM丙酮酸鈉(Life Technologies公司)、0.1mM MEM非必需胺基酸(Life Technologies公司)、50μM 2-巰乙醇(Life Technologies公司)、50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司)的RPMI1640(Life Technologies)調製成2.5x106個細胞/mL的濃度之PBMC，以各100μL接種於96孔細胞培養盤，將為人源化抗人類TLR7抗體之huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、huNB7_H3L3_IgG4Pro或人類IgG對照抗體(EUREKA Therapeutics公司)以80μL/孔進行添加，於37℃培養箱內進行前處置4小時。
之後，將1mg/mL CL-264(InvivoGen公司)以20μL/孔進行添加，充分攪拌後，在37℃、5% CO2下培養約20小時。
將盤充分攪拌後，以1500rpm離心5分鐘，並以FRET法(Cisbio公司)測定上清液中所包含的IL-6濃度。
圖23呈示人源化抗人類TLR7抗體會添加濃度依賴性地抑制來自經CL-264處理的人類PBMC之IL-6的產生。
huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、huNB7_H3L3_IgG4Pro係添加濃度依賴性地抑制來自人類PBMC之IL-6的產生。
huAT01_H1L1_IgG1LALA、huAT01_H3L1_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG1LALA、huAT01_H3L2_IgG4Pro、huNB7_H3L3_IgG1LALA、huNB7_H3L3_IgG4Pro的半數抑制濃度(IC50)，係從包夾50%抑制活性之二點間的濃度、與添加該濃度時的抑制活性而算出，各為74ng/mL、138ng/mL、38ng/mL、24ng/mL、307ng/mL、31ng/mL。
將Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)以4.5×106個細胞/燒瓶的濃度接種於75cm2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製)，在包含10% FBS及50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司製)的DMEM培養基(FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製)中，且在37℃、5% CO2的條件下進行隔夜培養。
翌日，使用為轉染試藥之Lipofectamine(註冊商標)2000(Life Technologies公司製)，將Genscript公司所製作的pcDNA3.1-人類TLR7(變異體1)-Flag表現質體進行基因導入至Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)，在37℃、5% CO2的條件下進一步進行隔夜培養。
翌日，將表現質體導入細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司製)進行處理，將處理後的細胞以流動式細胞測量術染色緩衝液(Flow Cytometry Staining Buffer)(Life Technologies公司製)洗淨後，懸浮於流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)。將所得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
藉由下述而確認人類TLR7在pcDNA3.1-人類TLR7(變異體1)-Flag表現質體導入細胞中表現：使用抗Flag-PE抗體(Biolegend公司)或作為陰性對照組之同型對照抗體(isotype control antibody)(Biolegend公司)，以流動式細胞測量術(Miltenyi Biotec公司)進行檢測。
人類TLR7(變異體1)的胺基酸序列及編碼其的多核苷酸序列，係各自被記載於序列表的序列識別號2及1。
將Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)以 4.5×106個細胞/燒瓶的濃度接種於75cm2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製)，在包含10% FBS及50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司製)的DMEM培養基(FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製)中，且在37℃、5% CO2的條件下進行隔夜培養。
翌日，使用為轉染試藥之Lipofectamine(註冊商標)2000(Life Technologies公司製)，將Genscript公司所製作的pcDNA3.1-人類TLR7(變異體2)-Flag表現質體進行基因導入至Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)，在37℃、5% CO2的條件下進一步進行隔夜培養。
翌日，將表現質體導入細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司製)進行處理，將處理後的細胞以流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)洗淨後，懸浮於流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)。將所得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
藉由下述而確認人類TLR7在pcDNA3.1-人類TLR7(變異體2)-Flag表現質體導入細胞中表現：使用抗Flag-PE抗體(Biolegend公司)或作為陰性對照組之同型對照抗體(Biolegend公司)，以流動式細胞測量術(Miltenyi Biotec公司)進行檢測。
將Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)以4.5×106個細胞/燒瓶的濃度接種於75cm2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製)，在包含10% FBS及50U/mL青黴素及50 μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司製)的DMEM培養基(FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製)中，且在37℃、5% CO2的條件下進行隔夜培養。
翌日，使用為轉染試藥之Lipofectamine(註冊商標)2000(Life Technologies公司製)，將Genscript公司所製作的pcDNA3.1-猴TLR7-Flag表現質體進行基因導入至Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)，在37℃、5% CO2的條件下進一步進行隔夜培養。
翌日，將表現質體導入細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司製)進行處理，將處理後的細胞以流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)洗淨後，懸浮於流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)。將所得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
藉由下述而確認猴TLR7在pcDNA3.1-猴TLR7-Flag表現質體導入細胞中表現：使用抗Flag-PE抗體(Biolegend公司)或作為陰性對照組之同型對照抗體(Biolegend公司)，以流動式細胞測量術(Miltenyi Biotec公司)進行檢測。
將Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)以4.5×106個細胞/燒瓶的濃度接種於75cm2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製)，在包含10% FBS及50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司製)的DMEM培養基(FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製)中，且在37℃、5%
CO2的條件下進行隔夜培養。
翌日，使用為轉染試藥之Lipofectamine(註冊商標)2000(Life Technologies公司製)，將Genscript公司所製作的pcDNA3.1-小鼠TLR7-Flag表現質體進行基因導入至Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)，在37℃、5% CO2的條件下進一步進行隔夜培養。
翌日，將表現質體導入細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司製)進行處理，將處理後的細胞以流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)洗淨後，懸浮於流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)。將所得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
藉由下述而確認小鼠TLR7在pcDNA3.1-小鼠TLR7-Flag表現質體導入細胞中表現：使用抗Flag-PE抗體(Biolegend公司)或作為陰性對照組之同型對照抗體(Biolegend公司)，以流動式細胞測量術(Miltenyi Biotec公司)進行檢測。
將Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)以4.5×106個細胞/燒瓶的濃度接種於75cm2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司製)，在包含10% FBS及50U/mL青黴素及50μg/mL鏈黴素(Life Technologies公司製)的DMEM培養基(FUJIFILM Wako Pure Chemical公司製)中，且在37℃、5% CO2的條件下進行隔夜培養。
翌日，使用為轉染試藥之Lipofectamine(註冊商
標)2000(Life Technologies公司製)，將Genscript公司所製作的pcDNA3.1-大鼠TLR7-Flag表現質體進行基因導入至Lenti-X(註冊商標)HEK293T細胞(Clontech公司)，在37℃、5% CO2的條件下進一步進行隔夜培養。
翌日，將表現質體導入細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司製)進行處理，將處理後的細胞以流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)洗淨後，懸浮於流動式細胞測量術染色緩衝液(Life Technologies公司製)。將所得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
藉由下述而確認大鼠TLR7在pcDNA3.1-大鼠TLR7-Flag表現質體導入細胞中表現：使用抗Flag-PE抗體(Biolegend公司)或作為陰性對照組之同型對照抗體(Biolegend公司)，以流動式細胞測量術(Miltenyi Biotec公司)進行檢測。
將8)-1所製備的人類TLR7(變異體1)-Flag強制表現HEK293細胞、8)-2所製備的人類TLR7(變異體2)-Flag強制表現HEK293細胞、8)-3所製備的猴TLR7-Flag強制表現HEK293細胞、8)-4所製備的小鼠TLR7-Flag強制表現HEK293細胞、及8)-5所製備的大鼠TLR7-Flag強制表現HEK293細胞，以固定及通透化溶液(Fixation and Permeabilization Solution)(Becton Dickinson公司製)進行固定/細胞膜通透化處理後，使用為人源化抗人類TLR7抗體之
一的huAT01_H3L2_IgG1LALA、及為二級抗體之Alexa Fluor(註冊商標)647 AffiniPure山羊抗人類IgG+IgM(H+L)(Jackson ImmunoResearch Inc.公司製)進行染色。
人源化抗人類TLR7抗體對於人類TLR7的結合係以流動式細胞測量術(Miltenyi Biotec公司)進行檢測，並使用為解析流動式細胞測量術的數據的軟體之Flowjo來解析數據。
其結果，為人源化抗人類TLR7抗體之一的huAT01_H3L2_IgG1LALA，係特異性地結合至人類TLR7(變異體1)、人類TLR7(變異體2)、或猴TLR7，且不結合至小鼠TLR7或大鼠TLR7。將結果示於圖25~29。
本發明的人源化抗TLR7抗體，具有人類TLR7機能抑制活性，可成為免疫炎症相關疾病等的治療或預防劑。
序列識別號1：編碼人類TLR7(變異體1)的核苷酸序列
序列識別號2：人類TLR7(變異體1)的胺基酸序列
序列識別號3：編碼人類TLR7(變異體2)的核苷酸序列
序列識別號4：人類TLR7(變異體2)的胺基酸序列
序列識別號5：AT01抗體之重鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號6：編碼cAT01抗體的重鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號7：NB7抗體之重鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號8：編碼cNB7抗體的重鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號9：FAN2抗體之重鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號10：編碼cFAN2抗體的重鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號11：AT01抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號12：編碼cAT01抗體的輕鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號13：NB7抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號14：編碼cNB7抗體的輕鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號15：FAN2抗體之輕鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號16：編碼cFAN2抗體的輕鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號17：AT01抗體之CDRH1的胺基酸序列
序列識別號18：AT01抗體之CDRH2的胺基酸序列
序列識別號19：AT01抗體之CDRH3的胺基酸序列
序列識別號20：AT01抗體之CDRL1的胺基酸序列
序列識別號21：AT01抗體之CDRL2的胺基酸序列
序列識別號22：AT01抗體之CDRL3的胺基酸序列
序列識別號23：NB7抗體之CDRH1的胺基酸序列
序列識別號24：NB7抗體之CDRH2的胺基酸序列
序列識別號25：NB7抗體之CDRH3的胺基酸序列
序列識別號26：NB7抗體之CDRL1的胺基酸序列
序列識別號27：NB7抗體之CDRL2的胺基酸序列
序列識別號28：NB7抗體之CDRL3的胺基酸序列
序列識別號29：FAN2抗體之CDRH1的胺基酸序列
序列識別號30：FAN2抗體之CDRH2的胺基酸序列
序列識別號31：FAN2抗體之CDRH3的胺基酸序列
序列識別號32：FAN2抗體之CDRL1的胺基酸序列
序列識別號33：FAN2抗體之CDRL2的胺基酸序列
序列識別號34：FAN2抗體之CDRL3的胺基酸序列
序列識別號35：AT01嵌合化抗人類TLR7抗體(cAT01)之重鏈的胺基酸序列
序列識別號36：AT01嵌合化抗人類TLR7抗體(cAT01)之輕鏈的胺基酸序列
序列識別號37：NB7嵌合化抗人類TLR7抗體(cNB7)之重鏈的胺基酸序列
序列識別號38：NB7嵌合化抗人類TLR7抗體(cNB7)之輕鏈的胺基酸序列
序列識別號39：FAN2嵌合化抗人類TLR7抗體(cFAN2)之重鏈的胺基酸序列
序列識別號40：FAN2嵌合化抗人類TLR7抗體(cFAN2)之輕鏈的胺基酸序列
序列識別號41：huAT01_H1_IgG1LALA之重鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號42：huAT01_H3_IgG1LALA之重鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號43：huAT01_L1之輕鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號44：huAT01_L2之輕鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號45：huAT01_H1_IgG1LALA的胺基酸序列
序列識別號46：huAT01_H3_IgG1LALA的胺基酸序列
序列識別號47：huAT01_H3_IgG4Pro的胺基酸序列
序列識別號48：huAT01_L1的胺基酸序列
序列識別號49：huAT01_L2的胺基酸序列
序列識別號50：huNB7_H3_IgG1LALA之重鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號51：huNB7_L3之輕鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號52：huNB7_H3_IgG1LALA的胺基酸序列
序列識別號53：huNB7_L3的胺基酸序列
序列識別號54：huNB7_H3_IgG4Pro的胺基酸序列
序列識別號55：人類Unc93B1基因的核苷酸序列
序列識別號56：小鼠TLR7基因的核苷酸序列
序列識別號57：大鼠TLR7基因的核苷酸序列
序列識別號58：猴TLR7基因的核苷酸序列
序列識別號59：包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類kappa鏈恒定區的核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號60：包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恒定區的核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號61：編碼cAT01抗體的重鏈之核苷酸序列
序列識別號62：包含編碼cAT01抗體的輕鏈之核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號63：編碼cNB7抗體的重鏈之核苷酸序列
序列識別號64：包含編碼cNB7抗體的輕鏈之核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號65：編碼cFAN2抗體的重鏈之核苷酸序列
序列識別號66：包含編碼cFAN2抗體輕鏈之核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號67：編碼huAT01_H1_IgG1LALA的核苷酸序列
序列識別號68：編碼huAT01_H3_IgG1LALA的核苷酸序列
序列識別號69：編碼huAT01_H3_IgG4Pro的核苷酸序列
序列識別號70：編碼huAT01_L1的核苷酸序列
序列識別號71：編碼huAT01_L2的核苷酸序列
序列識別號72：編碼huNB7_H3_IgG1LALA的核苷酸序列
序列識別號73：編碼huNB7_H3_IgG4Pro的核苷酸序列
序列識別號74：編碼huNB7_L3的核苷酸序列
序列識別號75：包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1LALA恒定區的核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號76：包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG4Pro恒定區的核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號77：編碼huAT01_H1的重鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號78：編碼huAT01_H3的重鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號79：編碼huAT01_L1的輕鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號80：編碼huAT01_L2的輕鏈可變區之核苷酸 序列
序列識別號81：編碼huNB7_H3的重鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號82：編碼huNB7_L3的輕鏈可變區之核苷酸序列
序列識別號83：小鼠TLR7的胺基酸序列
序列識別號84：大鼠TLR7的胺基酸序列
序列識別號85：猴TLR7的胺基酸序列
序列識別號86：人類Unc93B1 D34A突變型-HA×2基因的核苷酸序列
<110> 第一三共有限公司(DAIICHI SANKYO COMPANY,LIMITED) 東京大學(THE UNIVERSITY OF TOKYO)
<120> 抗人類TLR7抗體以及其製造方法及用途
<130> FA1511-19113
<140> 108118694
<141> 2019-05-30
<150> JP 2018-104676
<151> 2018-05-31
<160> 86
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3150
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
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<212> DNA
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<212> DNA
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<213> 小鼠
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<212> PRT
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<212> PRT
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<212> PRT
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<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 嵌合抗人類TLR7抗體AT01(cAT01)之重鏈的胺基酸序列
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<213> 人工序列
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<223> 嵌合抗人類TLR7抗體AT01(cAT01)之輕鏈的胺基酸序列
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<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗人類TLR7抗體NB7(cNB7)之輕鏈的胺基酸序列
<400> 38 
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗人類TLR7抗體FAN2(cFAN2)之重鏈的胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 嵌合抗人類TLR7抗體FAN2(cFAN2)之輕鏈的胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huAT01_H1_IgG1LALA之重鏈可變區的胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huAT01_L1的胺基酸序列
<400> 48 
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<212> PRT
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<220>
<223> huAT01_L2的胺基酸序列
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<220>
<223> huNB7_H3_IgG1LALA之重鏈可變區的胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huNB7_L3之輕鏈可變區的胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huNB7_H3_IgG1LALA的胺基酸序列
<400> 52 
<210> 53
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huNB7_L3的胺基酸序列
<400> 53 
<210> 54
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> huNB7_H3_IgG4Pro的胺基酸序列
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 55 
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<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 56 
<210> 57
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<212> DNA
<213> 褐鼠(Rattus norvegicus)
<400> 57 
<210> 58
<211> 3150
<212> DNA
<213> 恆河獼猴(Macaca mulatta)
<400> 58 
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 59 
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 60 
<210> 61
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼cAT01抗體的重鏈之核苷酸序列
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<220>
<223> 含有編碼cAT01抗體的輕鏈之核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
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<220>
<223> 編碼cNB7抗體的重鏈之核苷酸序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 含有編碼cNB7抗體的輕鏈之核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼cFAN2抗體的重鏈之核苷酸序列
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<213> 人工序列
<220>
<223> 含有編碼cFAN2抗體的輕鏈之核苷酸序列之DNA片段的核苷酸序列
<400> 66 
<210> 67
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_H1_IgG1LALA的核苷酸序列
<400> 67 
<210> 68
<211> 1395
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_H3_IgG1LALA的核苷酸序列
<400> 68 
<210> 69
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_H3_IgG4Pro的核苷酸序列
<400> 69 
<210> 70
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_L1的核苷酸序列
<400> 70 
<210> 71
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_L2的核苷酸序列
<400> 71 
<210> 72
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huNB7_H3_IgG1LALA的核苷酸序列
<400> 72 
<210> 73
<211> 1404
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huNB7_H3_IgG4Pro的核苷酸序列
<400> 73 
<210> 74
<211> 699
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huNB7_L3的核苷酸序列
<400> 74 
<210> 75
<211> 1137
<212> DNA
<213> 智人
<400> 75 
<210> 76
<211> 1117
<212> DNA
<213> 智人
<400> 76 
<210> 77
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_H1的重鏈可變區之核苷酸序列
<400> 77 
<210> 78
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_H3的重鏈可變區之核苷酸序列
<400> 78 
<210> 79
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_L1的輕鏈可變區之核苷酸序列
<400> 79 
<210> 80
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huAT01_L2的輕鏈可變區之核苷酸序列
<400> 80 
<210> 81
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huNB7_H3的重鏈可變區之核苷酸序列
<400> 81 
<210> 82
<211> 318
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼huNB7_L3的輕鏈可變區之核苷酸序列
<400> 82 
<210> 83
<211> 1050
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 83 
<210> 84
<211> 1050
<212> PRT
<213> 褐鼠
<400> 84 
<210> 85
<211> 1049
<212> PRT
<213> 恆河獼猴
<400> 85 
<210> 86
<211> 1797
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人類Unc93B1 D34A突變型-HA×2基因的核苷酸序列
<400> 86 
Claims (52)
- 一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其特徵係具有以下之特性：(a)特異性地結合至人類TLR7或猴TLR7，且不結合至小鼠TLR7或大鼠TLR7；(b)抑制人類TLR7或猴TLR7的機能；及(c)具有：包含序列識別號17所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號18所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號19所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號20所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號21所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號22所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區。
- 如請求項1之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其中人類TLR7為包含序列識別號2或序列識別號4所記載的胺基酸序列的分子、或猴TLR7為包含序列識別號85所記載的胺基酸序列的分子、或小鼠TLR7為包含序列識別號83所記載的胺基酸序列的分子、或者大鼠TLR7為包含序列識別號84所記載的胺基酸序列的分子。
- 如請求項1或2之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係在對人類TLR7的結合中，與下列抗體具有競爭抑制活性：具有重鏈及輕鏈的抗體，該重鏈具有包含序列識別號5所記載的胺基酸序列之重鏈可變區，該輕鏈具有包含序列識別號11 所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；具有重鏈及輕鏈的抗體，該重鏈具有包含序列識別號7所記載的胺基酸序列之重鏈可變區，該輕鏈具有包含序列識別號13所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；或者具有重鏈及輕鏈的抗體，該重鏈具有包含序列識別號9所記載的胺基酸序列之重鏈可變區，該輕鏈具有包含序列識別號15所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項1或2之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號5所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號11所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項1或2之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係恒定區源自人類的恒定區。
- 如請求項5之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號35所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號36所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 如請求項1或2之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係被人源化(humanized)。
- 如請求項7之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含選自包含以下(a)~(d)之群組的胺基酸序列之重鏈可變區：(a)序列識別號41所記載的胺基酸序列、(b)序列識別號42所記載的胺基酸序列、 (c)相對於(a)或(b)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(d)於(a)或(b)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列，以及包含選自包含以下(e)~(h)之群組的胺基酸序列之輕鏈可變區：(e)序列識別號43所記載的胺基酸序列、(f)序列識別號44所記載的胺基酸序列、(g)相對於(e)或(f)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(h)於(e)或(f)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列。
- 如請求項8之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；或者(d)包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項9之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、 及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項9之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(b)包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(c)包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(d)包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(e)包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；或者(f)包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 如請求項11之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺 基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其特徵係具有以下之特性：(a)特異性地結合至人類TLR7；(b)抑制人類TLR7的機能；及(c)具有；包含序列識別號17所記載的胺基酸序列的CDRH1、包含序列識別號18所記載的胺基酸序列的CDRH2及包含序列識別號19所記載的胺基酸序列的CDRH3作為重鏈中的互補性決定區，以及包含序列識別號20所記載的胺基酸序列的CDRL1、包含序列識別號21所記載的胺基酸序列的CDRL2及包含序列識別號22所記載的胺基酸序列的CDRL3作為輕鏈中的互補性決定區。
- 如請求項13之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號5所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號11所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項13或14之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係恒定區源自人類的恒定區。
- 如請求項15之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號35所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號36所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 如請求項13或14之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係被人源化。
- 如請求項17之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其 具有：包含選自包含以下(a)~(d)之群組的胺基酸序列之重鏈可變區：(a)序列識別號41所記載的胺基酸序列、(b)序列識別號42所記載的胺基酸序列、(c)相對於(a)或(b)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(d)於(a)或(b)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列，以及包含選自包含以下(e)~(h)之群組的胺基酸序列之輕鏈可變區：(e)序列識別號43所記載的胺基酸序列、(f)序列識別號44所記載的胺基酸序列、(g)相對於(e)或(f)的序列而具有至少95%以上之同源性的胺基酸序列、及(h)於(e)或(f)的序列中有1至10個胺基酸經缺失、取代或附加的胺基酸序列。
- 如請求項18之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(b)包含序列識別號41所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；(c)包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、 及包含序列識別號43所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區；或者(d)包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項19之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號42所記載的胺基酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號44所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
- 如請求項19之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：(a)包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(b)包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(c)包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(d)包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；(e)包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈；或者(f)包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至 第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 如請求項21之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號45所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號48所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號46所記載的胺基酸序列中之第20號至第465號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有：包含序列識別號47所記載的胺基酸序列中之第20號至第462號的胺基酸序列之重鏈、及包含序列識別號49所記載的胺基酸序列中之第21號至第233號的胺基酸序列之輕鏈。
- 如請求項23至26中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其具有以下之特性：(a)特異性地結合至人類TLR7、 及(b)抑制人類TLR7的機能。
- 如請求項1、2、13、14及23至26中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其中抗原結合性片段係選自包含Fab、F(ab)2、Fab’及Fv之群組。
- 一種多核苷酸，其具有編碼如請求項1至28中任一項之抗體或該抗體的抗原結合性片段之多核苷酸序列。
- 如請求項29之多核苷酸，其具有：編碼包含序列識別號17所記載的胺基酸序列的CDRH1之多核苷酸序列、編碼包含序列識別號18所記載的胺基酸序列的CDRH2之多核苷酸序列、及編碼包含序列識別號19所記載的胺基酸序列的CDRH3之多核苷酸序列，以及編碼包含序列識別號20所記載的胺基酸序列的CDRL1之多核苷酸序列、編碼包含序列識別號21所記載的胺基酸序列的CDRL2之多核苷酸序列、及編碼包含序列識別號22所記載的胺基酸序列的CDRL3之多核苷酸序列。
- 如請求項30之多核苷酸，其具有：選自包含以下(a)~(b)之群組的多核苷酸序列：(a)編碼序列識別號77所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及(b)編碼序列識別號78所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列，以及選自包含以下(d)~(e)之群組的多核苷酸序列：(d)編碼序列識別號79所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列、及 (e)編碼序列識別號80所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列。
- 如請求項31之多核苷酸，其具有：(a)編碼序列識別號77所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號79所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列；(b)編碼序列識別號77所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號80所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列；(c)編碼序列識別號78所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號79所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列；或者(d)編碼序列識別號78所記載的重鏈可變區之多核苷酸序列、及編碼序列識別號80所記載的輕鏈可變區之多核苷酸序列。
- 一種表現載體，其含有如請求項29至32中任一項之多核苷酸。
- 一種宿主細胞，其係藉由如請求項33之表現載體而被轉形。
- 如請求項34之宿主細胞，其中宿主細胞為真核細胞。
- 一種抗體或該抗體的抗原結合性片段之製造方法，其特徵為包含：培養如請求項34或35之宿主細胞的步驟、及從該步驟所得的培養物採取目標之該抗體或該片段的步驟。
- 一種抗體或該抗體的抗原結合性片段，其特徵為其係藉由如請求項36之製造方法而得。
- 如請求項1、2、13、14及23至26中任一項之抗 體或該抗體的抗原結合性片段，其包含選自包含下列之群組的1或2種以上的修飾：對N-鍵結之醣苷化(glycosylation)、對O-鍵結之醣苷化、N末端的加工(processing)、C末端的加工、脫醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、對N末端之甲硫胺酸殘基的附加、脯胺酸殘基的醯胺化、及重鏈的羧基末端之1個或2個胺基酸的缺失。
- 如請求項38之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其中2條重鏈係包含選自包含下列之群組的重鏈之任一種或任兩種的組合之重鏈：完整長度、及於羧基末端有1個或2個胺基酸缺失的缺失體。
- 如請求項39之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其中在2條重鏈雙方於羧基末端有1個胺基酸缺失。
- 如請求項38之抗體或該抗體的抗原結合性片段，其係重鏈的羧基末端之脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
- 一種用於疾病的治療及/或預防之醫藥組成物，其特徵為含有如請求項1至28及37至41之抗體或該抗體的抗原結合性片段之至少一者、或者如請求項33之表現載體作為有效成分。
- 如請求項42之醫藥組成物，其係用於治療起因於人類TLR7的機能之疾病。
- 如請求項43之醫藥組成物，其中起因於人類TLR7的機能之疾病為免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症或癌症。
- 如請求項44之醫藥組成物，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型特發性關節炎、成 人史迪爾氏病(adult-onset Still's disease)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、全身性硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、混合性結締組織疾病或肌肉萎縮症。
- 如請求項44或45之醫藥組成物，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡。
- 如請求項42至45中任一項之醫藥組成物，其係用以與免疫抑制劑、抗發炎劑、抗過敏劑、抗感染劑或抗癌劑併用。
- 一種如請求項1至28及37至41之抗體或該抗體的抗原結合性片段之用途，其係用以製造將抗體或該抗體的抗原結合性片段之至少一者對個體進行投予之治療起因於人類TLR7的機能之疾病的醫藥品。
- 如請求項48之用途，其中將抗體或該抗體的抗原結合性片段之至少一者以及免疫抑制劑、抗發炎劑、抗過敏劑、抗感染劑或抗癌劑，對個體同時地、各別地、或連續地進行投予。
- 如請求項48或49之用途，其中起因於人類TLR7的機能之疾病為免疫炎症相關疾病、過敏性疾病、感染症或癌症。
- 如請求項50之用途，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、幼年型特發性關節炎、成人史迪爾氏病、僵直性脊椎炎、全身性硬皮症、多發性肌炎、皮肌炎、乾癬性關節炎、骨關節炎、混合性結締組織疾病或肌肉萎縮症。
- 如請求項51之用途，其中免疫炎症相關疾病為全身性紅斑狼瘡。
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Citations (1)
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| EP2990419A1 (en) | 2013-04-22 | 2016-03-02 | The University of Tokyo | Preventive or therapeutic agent for inflammatory disease |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2990419A1 (en) | 2013-04-22 | 2016-03-02 | The University of Tokyo | Preventive or therapeutic agent for inflammatory disease |
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