JPWO2002064771A1 - 活性化白血球に特異的な新規細胞接着分子 - Google Patents

Abstract

免疫機能の調節に関与する新規な細胞接着分子の遺伝子及び蛋白質と、該蛋白質に対する活性調節剤の効率的な評価方法を提供する。配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ及び該ＤＮＡにコードされる細胞接着分子、該ＤＮＡ配列に対するアンチセンス核酸、該蛋白質の活性調節物質の評価方法。

Description

技術分野
本発明は、活性化白血球に特異的に発現する新規細胞接着分子及びその部分ペプチド、該蛋白質をコードするＤＮＡ及びその断片、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法、該蛋白質若しくはその部分ペプチドに反応性を有する抗体、該抗体を用いた該蛋白質の測定方法、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
従来の技術
細胞は他の細胞とコミュニケーションすることによって、細胞の機能や増殖、分化を制御している。細胞接着分子（ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の中でも、生体内のあらゆる免疫反応に深く関与する白血球の細胞接着分子は免疫機能そのものを調節する重要なものである。
シアロアドヘシンファミリーは、セレクチンとは異なるシアル酸含有糖鎖配列を認識し、イムノグロブリン様ドメイン構造を持つ細胞接着分子ファミリーである。現在までにＣＤ２２（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １５；４４２−４４９（１９９４））、シアロアドヘシン（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）（Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．４；９６５−９７２（１９９４））、ＭＡＧ（ｍｙｅｌｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）（Ｎｅｕｒｏｎ １３；２２９−２４６（１９９４））、ＣＤ３３（Ｂｌｏｏｄ ８５；２００５−２０１２（１９９５））、ＡＩＲＭ１（Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９０；７９３−８０１（１９９９））などが知られている。Ｎ端を細胞外に向けたＩ型膜貫通蛋白質であり、細胞外領域は１個のＶ型と複数個のＣ２型イムノグロブリンドメインからなる（第１図参照）。ＶドメインはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｃ′、Ｃ′′、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇの９個のβストランドからなり、ＧＦＣＣ′Ｃ′′とＡＢＥＤの２個のβシート構造がＢとＥストランドとの間で、ジスルフィド結合で架橋された構造をとる。ＣＤ２２とシアロアドヘシンのＶドメイン内の点変異導入実験の結果から、シアロアドヘシンファミリー分子間で保存されているＦストランドのアルギニン残基がシアル酸依存的な結合に必須であることが示されている。各分子は細胞特異的に発現しており、シアル化糖鎖結合を介して細胞接着に関与する。例えば、ＡＩＲＭ１はＮＫ細胞に、ＣＤ３３は骨髄系前駆細胞に発現しており、それぞれＮＫ細胞の活性化、樹状細胞への分化を抑制する受容体機能を有する。ＣＤ２２は成熟Ｂ細胞、シアロアドヘシンはマクロファージ、ＭＡＧはミエリン形成細胞に特異的に発現していることが知られている。
このように、白血球の細胞接着に関わる因子は近年数多く知られてきているが、生体内の複雑な免疫反応、炎症反応の解明のためには、これらに関与する新たな細胞接着分子の単離同定が望まれている。
発明が解決しようとする課題
本発明は、活性化白血球に特異的に発現する新規接着分子とその遺伝子を同定することにより、免疫疾患の予防並びに治療に有用な医薬及び方法を提供するものである。
課題を解決するための手段
本発明は、新規な遺伝子（ｈｒｃ１２３３７とする）、当該遺伝子にコードされる新規細胞接着分子（ＨＲＣ１２３３７）に関する。また、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞、該蛋白質の活性調節物質の検索方法、該蛋白質若しくはその部分ペプチドに反応性を有する抗体、該抗体を用いた該蛋白質の測定方法、遺伝子組換え非ヒト動物に関する。
（核酸）
本発明は、ＨＲＣ１２３３７（後に詳しく述べる）をコードする遺伝子ｈｒｃ１２３３７を提供する。遺伝子ｈｒｃ１２３３７とは具体的には、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる細胞接着分子をコードするＤＮＡのことであり、配列番号１や配列番号３に示すｃＤＮＡのほか該ｃＤＮＡの由来するゲノムＤＮＡも含まれる。該遺伝子はヒト腎皮質上皮細胞から単離同定することができるが、本明細書に開示された配列を基に、一般的なハイブリダイゼーション等の遺伝子工学的手法を用いたクローニングやホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製されるＤＮＡであってもよい。その形態としてはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡの他、化学合成ＤＮＡなどが含まれるが、特に制限はない。本発明のＤＮＡは１本鎖であっても、それに相補的な配列を有するＤＮＡやＲＮＡと結合して２重鎖、３重鎖を形成していても良い。また、当該ＤＮＡは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素や放射性同位体、蛍光物質、化学発光物質等で標識されていてもよい。
また、ｈｒｃ１２３３７の塩基配列が提供されれば、これより導かれるＲＮＡの配列や、相補的なＤＮＡおよびＲＮＡの配列などは一義的に決定されるので、本発明は、本発明のＤＮＡに対応するＲＮＡあるいは本発明のＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡおよびＲＮＡもまた提供するものと理解すべきである。本明細書中において、「ＤＮＡ」は「ポリヌクレオチド」と同義である。
さらに、本発明のＤＮＡには、配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡをも含むものである。
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡに対しては、これとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ該ＤＮＡにコードされる蛋白質が細胞接着分子であれば、塩基配列のバリエーションが許容される。例えば、いわゆるコドン縮重による同一アミノ酸残基をコードする複数のコドンの存在や、種々の人為的処理例えば部位特異的変異導入、変異剤処理によるランダム変異、制限酵素切断によるＤＮＡ断片の変異・欠失・連結等により、部分的にＤＮＡ配列が変化したものであっても、これらＤＮＡ変異体が配列番号１に記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ細胞接着分子をコードするＤＮＡであれば、配列番号１に示したＤＮＡ配列との相違に関わらず、本発明の範囲内のものである。
上記のＤＮＡ変異の程度は、配列番号１に記載のＤＮＡ配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の同一性を有するものであれば許容範囲内である。ＤＮＡ配列の同一性の判断には、ＢＬＡＳＴ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，Ｖｏｌ．３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２１５；４０３−１０（１９９０））を用いることができる。また、ハイブリダイズする程度としては、ストリンジェントな条件下、例えばＤＩＧ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製 Ｃａｔ Ｎｏ．１１７５０３３）でプローブをラベルした場合に、例えば３２℃、好ましくは３７℃、より好ましくは４２℃のＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂ溶液（ロシュ・ダイアグノスティックス社製Ｃａｔ Ｎｏ．１６０３５５８）中でハイブリダイズさせ、例えば５０℃、好ましくは６５℃の０．５×ＳＳＣ溶液（０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含む）中でメンブレンを洗浄する条件（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウムである）でのサザンハイブリダイゼーションで、配列番号１に記載の核酸にハイブリダイズする程度であればよい。
配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡあるいはその部分断片は、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等本発明の蛋白質が関与する疾患の特異的プローブとして有用であると考えられる。
本発明のＤＮＡは、ＨＲＣ１２３３７を大量に生産するために使用することができる。該ＤＮＡはまた、酵素等で標識して、組織における本発明の蛋白質の発現状況を検査するために使用することができる。すなわち、該ＤＮＡをプローブとして使用し、細胞における本発明の蛋白質の発現量を、ｍＲＮＡ発現量を指標として確認することにより、本発明の蛋白質の製造に適した細胞やその培養条件を決定することができるほか、本発明の蛋白質が関連する疾患、特に自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等の診断を行うことも可能である。
また、本発明のＤＮＡの一部をプライマーとして使用したＰＣＲ−ＲＦＬＰ（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）法、シークエンシング等の方法により、核酸配列上の異常あるいは多形を検査・診断することができる。
また、本発明のＤＮＡを生体内の細胞に導入し、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等の発症を予防または治療するための遺伝子治療にも使用することが出来る。
本発明のＤＮＡは、形質転換細胞の調製、さらには該形質転換細胞を用いた組換蛋白質ＨＲＣ１２３３７の生産方法、あるいはＨＲＣ１２３３７の発現を特異的に抑制する化合物の探索に大いに有用である。
本発明における形質転換細胞は当業者に公知の技術を適用して調製することが可能であり、例えば、市販されあるいは当業者が一般に入手容易な様々なベクターを利用して、適当な宿主細胞へ本発明のＤＮＡを組み入れることが可能である。その際、遺伝子ｈｒｃ１２３３７をプロモーターやエンハンサーに代表される発現制御遺伝子の影響下におくことで、遺伝子ｈｒｃ１２３３７の宿主細胞内での発現を任意にコントロールすることが可能である。この手法は、形質転換された宿主細胞を用いたＨＲＣ１２３３７の生産において好適に用いられる他、遺伝子ｈｒｃ１２３３７の発現制御機構の研究あるいは該遺伝子の発現を調節し得る物質の探索などにも応用することが可能となる。
例えば、任意の被験物質と遺伝子ｈｒｃ１２３３７を含むベクターで形質転換された細胞とを適当な条件下で接触させることで、被験物質の遺伝子ｈｒｃ１２３３７の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質を探索し、あるいは評価を行うことができる。
また、本発明であるＤＮＡと公知の方法とを組み合わせて、マウスまたはその他の適当な動物を基にトランスジェニック動物を作製することが出来る。さらに、本発明の遺伝子ｈｒｃ１２３３７を利用すれば、ヒト以外の動物からヒトｈｒｃ１２３３７に相当する遺伝子を破壊したいわゆるノックアウト動物を作製することも可能である。このモデル動物の物理学的、生物学的、病理学的及び遺伝子的特徴を分析することにより、本発明に係る遺伝子及び蛋白質の機能を解明することが可能となる。さらに、そのようにして内在性遺伝子が破壊された該動物に本発明のヒトｈｒｃ１２３３７を導入することにより、ヒトｈｒｃ１２３３７のみを有するモデル動物を作成することも可能となる。このモデル動物は、該導入されたヒトｈｒｃ１２３３７をターゲットとした薬剤の開発、評価に有用である。
（蛋白質ＨＲＣ１２３３７）
ｈｒｃ１２３３７にコードされる蛋白質ＨＲＣ１２３３７は、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる細胞接着分子である。特にそのアミノ酸配列に見られる構造的特徴から、シアロアドヘシンファミリーに属する新規の細胞接着分子であると判断される。
ＨＲＣ１２３３７は分子内にイムノグロブリンドメイン２つとシアル酸結合モチーフを有し、アミノ酸レベルでＣＤ３３およびＡＩＲＭ１と約４０％の相同性を示す。また、シアル酸依存的な結合に必須とされるＶドメイン中のアルギニン残基が保存されていた（第２図、第３図参照）。従って、他のシアロアドヘシンファミリー分子と同様、本発明の細胞接着分子は、シアル酸含有糖鎖に結合活性を有する蛋白質であると理解される。また、本発明の細胞接着分子は、活性化白血球において特異的に発現することから、免疫担当細胞間の認識や免疫反応を調節する活性を有する蛋白質であると理解される。本発明の細胞接着分子であるＨＲＣ１２３３７のシアル酸含有糖鎖結合活性は、例えば実施例５に示す方法で確認することが出来る。また、Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ．４；９６５−９７２（１９９４）に記載の方法に従って、ＨＲＣ１２３３７が認識するシアル酸含有糖鎖の特異性を決定することが出来る。本発明の細胞接着分子であるＨＲＣ１２３３７の免疫反応を調節する活性は、例えば混合リンパ球反応（免疫実験操作法ＩＩ 右田俊介編 南江堂１９９５年発行 ｐ７３８−７４２）により確認することが出来る。より具体的には、ＨＲＣ１２３３７の免疫反応を調節する活性は、実施例１０に示すように、混合リンパ球反応においてリンパ球を増殖させる活性、および／またはＩＬ−２産生を増強する活性として検出可能である。更に詳しくは、ＩＬ−２産生を増強し、かつＴＮＦα産生およびＩＬ−８産生には影響を与えないことを特徴とする。リンパ球を増殖させる活性および／またはＩＬ−２産生を増殖する活性とは、混合リンパ球反応においてＨＲＣ１２３３７蛋白質存在下と非存在下においてリンパ球増殖の測定値および／またはＩＬ−２産生の測定値に差があることを言う。差があるとはたとえば、下記の式で計算される測定値変動率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
測定値変動率＝（ＨＲＣ１２３３７蛋白質存在下の測定値−ＨＲＣ１２３３７蛋白質非存在下の測定値）の絶対値／ＨＲＣ１２３３７蛋白質非存在下の測定値＊１００
ここで、測定値については蛋白質の活性を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、実施例１０に示す混合リンパ球反応におけるＩＬ−２産生の測定系の場合には、測定値としてはＩＬ−２産生量（ｐｇ／ｍｌ）を用いることができ、ＨＲＣ１２３３７蛋白質存在下の測定値＞ＨＲＣ１２３３７蛋白質非存在下の測定値となる場合、ＩＬ−２産生増強活性があるといえる。実施例１０に示す混合リンパ球反応におけるリンパ球増殖反応の測定系の場合には、ブロモデオキシウリジンの細胞ＤＮＡの取り込み量をＥＬＩＳＡ法により測定しているので吸光度を測定値として用いることができ、ＨＲＣ１２３３７蛋白質存在下の測定値＞ＨＲＣ１２３３７蛋白質非存在下の測定値となる場合、リンパ球増殖活性があるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。ＨＲＣ１２３３７は、ＣＤ３３およびＡＩＲＭ１とは異なり細胞内領域に抑制性シグナルモチーフＩＴＩＭ（ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｍｏｔｉｆ）を有さない。また、ＰＨＡ（ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）で活性化された末梢白血球に誘導的に発現し、脾臓、胸腺、子宮および精巣でやや発現を認めるものの、他の臓器での発現が少ないことが極めて特徴的である。また、実施例８に示すように、各種患者血清中のＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度の測定から、健常人と比較して花粉症・アトピー性皮膚炎・血管炎患者において高値を示す傾向があり、ＨＲＣ１２３３７がこれらの疾患と関係していることが明らかになった。
この様に、ＨＲＣ１２３３７はドメイン構造レベルにおいてはシアロアドヘシンファミリーに認められる特徴を高度に保持している一方、ＩＴＩＭを有さない、末梢白血球の刺激時のみ誘導される、混合リンパ球反応においてリンパ球増殖活性を示す、混合リンパ球反応においてＩＬ−２産生を増強する、花粉症・アトピー性皮膚炎・血管炎患者血清中において高値を示すなどの特徴を有する。このことから、ＨＲＣ１２３３７は、免疫機能の調節において、他のシアロアドヘシンファミリー分子にはない特徴的な役割を果たしていることが強く推認される。従って、ＨＲＣ１２３３７を標的とした医薬化合物は、従来にはない特徴を備えた医薬となり得るものと期待される。
なお、細胞接着分子である限り、配列番号２に示す蛋白質のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、欠失、および／もしくは付加したアミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは蛋白質も本発明の範囲内である。
蛋白質の構成要素となるアミノ酸残基側鎖は、疎水性、電荷、大きさなどにおいてそれぞれ異なるが、実質的に蛋白質全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が知られている。例えば、アミノ酸残基の置換については、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、Ｇｌｙとアラニン（Ａｌａ）またはバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とグルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒとセリン（Ｓｅｒ）またはＡｌａ、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）、等が挙げられる。また、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、Ｇｌｙ、Ｃｙｓは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有すると考えられる。非荷電極性アミノ酸としては、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、チロシン（Ｔｙｒ）、Ａｓｎ、Ｇｌｎが挙げられる。酸性アミノ酸としては、ＡｓｐおよびＧｌｕが挙げられる。塩基性アミノ酸としてはＬｙｓ、Ａｒｇ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が挙げられる。また、上述の意味の保存性を損なう場合でも、なおその蛋白質の本質的な機能、本発明においては細胞接着分子としての機能、を失わない変異も当業者に多く知られている。さらに、異なる生物種間に保存される同種の蛋白質が、幾つかのアミノ酸が集中あるいは分散して欠失あるいは挿入されていてもなお本質的な機能を保持している例も多く認められている。
従って、配列番号２に示したアミノ酸配列上の置換、挿入、欠失等による変異蛋白質であっても、それが細胞接着分子であれば、これらは本発明の範囲内にあるものと言うことができる。細胞接着分子であるとは、換言すれば本発明のＨＲＣ１２３３７蛋白質と同等の機能を有することである。同等の機能を有するとは、糖鎖結合活性、リンパ球増殖活性およびＩＬ−２産生増強活性から選ばれる少なくとも一つの活性を保持していることを言う。
このようなアミノ酸の改変は、遺伝子多型等によって生ずる変異の様に自然界において認められる他、当業者に公知の方法、例えばＮＴＧなどの変異誘発剤を用いた突然変異誘発法や種々の組換遺伝子手法を用いた部位特異的変異法を利用して、人為的に行うことができる。アミノ酸の変異部位および個数は、変異蛋白質が細胞接着分子である限り特に制限はないが、変異個数は通常数十アミノ酸以内、好ましくは１０アミノ酸以内、より好ましくは１もしくは数個以内である。
また本発明では、ＨＲＣ１２３３７を上述のような全てのドメイン構造を有する分子全体として理解できるほか、特徴的なドメイン、特にリガンドとの結合能を担うドメインを保持した部分ペプチドとして理解することもできる。膜貫通型蛋白質の中には、リガンド結合部位を含む部分断片が、特徴的な立体構造を保持したまま他のドメインから切り離されるなどして、遊離の（あるいは可溶化とも言われる）部分ペプチドとして存在し得るものがあることが、以前より報告されている。この様な部分ペプチドは、依然として特異的なリガンドとの結合能を保持していることから、これを用いて該蛋白質への結合能を有する化合物の探索が可能となる。ＨＲＣ１２３３７における部分ペプチドも、かかる意味においてそのリガンド結合能を有する限り、実質的には本発明と同等の物質であると理解すべきである。ここで、ＨＲＣ１２３３７についてのリガンドとは、シアル酸含有糖鎖と理解することが出来る。また、ＨＲＣ１２３３７は生体内において可溶型で存在することが示されたこと、および可溶型ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃは混合リンパ球反応においてリンパ球増殖活性およびＩＬ−２産生を増強する活性を示すことから、可溶型ＨＲＣ１２３３７自体がリガンドとして機能し、何らかの受容体に結合し、免疫反応を調節する活性を発揮する可能性も考えられる。ＨＲＣ１２３３７では、細胞外領域を含むＮ末端側の部分ペプチドにおいてかかるリガンド結合機能または免疫反応を調節する活性が保持されるものと推定される。よって、ＨＲＣ１２３７７の細胞外領域を含んでなる蛋白質および該蛋白質をコードするＤＮＡも、本発明の範囲内である。すなわち、本発明は以下の（１）から（４）のものを含有する。（１）以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；（ａ）配列番号：４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；（ｂ）配列番号：４のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシアル酸含有糖鎖結合活性、リンパ球増殖活性およびＩＬ−２産生増強活性から選ばれる少くとも一つの活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。（２）（１）に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質。（３）以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；（ａ）配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；（ｂ）配列番号：５のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシアル酸含有糖鎖結合活性、リンパ球増殖活性およびＩＬ−２産生増強活性から選ばれる少くとも一つの活性を有する蛋白質。（４）（３）に記載の蛋白質を含んでなる融合蛋白質。部分ペプチドの他の好ましい態様としては、例えばＩｇドメインＩ（配列番号２の５７〜１４４ａ．ａ．）、またはＩｇドメインＩＩ（配列番号２の１８７〜２３９ａ．ａ．）のいずれかを含むペプチドが挙げられる。リガンド結合能を有するという観点では、少なくともＩｇドメインＩを含むことが好ましい。少なくともＩｇドメインＩ（配列番号２の５７〜１４４ａ．ａ．）を含む限り、他のドメインの全部または一部が連結していても良いし、他の蛋白質やペプチドとの融合蛋白質となっていても良い。融合蛋白質がＨＲＣ１２３３７の細胞外領域としてのシアル酸含有糖鎖結合活性、リンパ球増殖活性およびＩＬ−２産生増強活性から選ばれる少なくとも一つの活性を有する限りにおいて、ＨＲＣ１２３３７細胞外領域に連結される他のポリペプチドには特に制限はない。このような融合蛋白質の好ましい一例は、配列番号６に示されるＨＲＣ１２３３３７−Ｈｉｓや配列番号７に示されるＨＲＣ１２３３７−Ｆｃである。またシグナル配列を有する蛋白質ではシグナル配列が切断されたものが成熟蛋白として機能している場合もある。よって本発明の蛋白質からシグナル配列が除かれた成熟ペプチドも、実質的には本発明と同等の物質であると理解すべきである。ＨＲＣ１２３３７の場合、配列番号２に示されるアミノ酸配列の７番目から２０番目のアミノ酸残基付近にシグナル配列の存在が予測されている。
本発明の蛋白質またはその部分ペプチドは、該蛋白質の活性を調節する物質の探索に使用することが出来る。探索を通じて得られる化合物等は、本発明の蛋白質が関連する疾患、例えば自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患、腫瘍等に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。
（抗体）
本発明はさらにＨＲＣ１２３３７に結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、ＨＲＣ１２３３７全体あるいはその部分ペプチドを抗原として特異的に認識する抗体であり、モノクローナル抗体及び／またはポリクローナル抗体が含まれる。また、免疫グロブリンの構造、物理化学的性質や免疫学的性質として分類される５つのクラス（ＩｇＧ，ＩｇＡ，ＩｇＭ，ＩｇＤ，ＩｇＥ）、あるいはＨ鎖のタイプによるサブクラスのいずれに属するものであってもよい。さらに、免疫グロブリンを例えばペプシンで分解したときのＦ（ａｂ’）_２、パパインで分解したときのＦａｂなどのフラグメントであっても、またキメラ抗体やヒト化抗体であってもよい。またＨＲＣ１２３３７あるいはその部分ペプチドを特異的に認識するのみでなく、ＨＲＣ１２３３７の活性を調節する機能を有する抗体も本発明に含まれる。ＨＲＣ１２３３７の活性を調節する機能を有する抗体とは、例えばＨＲＣ１２３３７とリガンドの結合を阻害する中和抗体が挙げられる。これらの抗体は、ＨＲＣ１２３３７の研究的あるいは臨床的な検出等に有用である。
（アンチセンス核酸）
本発明は、生体内において核酸レベルでのＨＲＣ１２３３７生合成を抑制することのできる、いわゆるアンチセンス核酸を提供する。かかるアンチセンス核酸は、ＨＲＣ１２３３７をコードするｍＲＮＡを作り出すのに必要なゲノム領域からｐｒｅ−ｍＲＮＡへの転写段階、ｐｒｅ−ｍＲＮＡから成熟ｍＲＮＡへのプロセッシング段階、核膜通過段階、蛋白への翻訳段階のいずれかで、遺伝子情報を担うＤＮＡもしくはＲＮＡに結合し、遺伝情報の伝達の正常な流れに影響を与えて蛋白質の発現を調節するものを意味し、遺伝子ｈｒｃ１２３３７の核酸配列の全体あるいはいずれかの部分に相補する配列からなるものであってもよい。好ましくは、配列番号１または配列番号３に記載の核酸配列に相当あるいは相補する配列から成る核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡを含む）である。また、ゲノム領域から転写されるｍＲＮＡがイントロン構造あるいは５’末端や３’末端に非翻訳領域を含む形であるときは、かかる非翻訳部分の配列に相当あるいは相補するアンチセンス核酸も本発明のアンチセンス核酸と同等の機能を有するものとなろう。
本発明のアンチセンス核酸は、ＤＮＡやＲＮＡの他、その立体構造や機能がＤＮＡあるいはＲＮＡと類似する各種誘導体のすべてを含むものである。例えば、３’末端もしくは５’末端に他の物質が結合した核酸、オリゴヌクレオチドの塩基、糖、リン酸の少なくともいずれか１つにおいて置換や修飾が生じた核酸、天然には存在しないような塩基、糖あるいはリン酸を有する核酸、糖−リン酸骨格以外の骨格（バックボーン）を有する核酸等が挙げられる。これらの核酸は、ヌクレアーゼ耐性、組織選択性、細胞透過性、結合力の少なくとも１つが高められた誘導体として好適である。すなわち、ＨＲＣ１２３３７の活性発現を抑制し得る機能を有する限り、核酸の形態に制限はない。
また本発明では、一般的には、ステム・ループを形成しているｍＲＮＡのループ部分にハイブリダイズするような塩基配列、すなわちステム・ループを形成している領域の塩基配列に相補的な塩基配列をもつアンチセンス核酸が好適である。あるいは、翻訳開始コドン付近、リボソーム結合部位、キャッピング部位、スプライス部位に結合するようなアンチセンス核酸、すなわちこれらの部位の配列に相補的な配列を有するアンチセンス核酸も、一般に高い発現抑制効果が期待できる点で好ましい。
この様なアンチセンス核酸を細胞内に取り込ませ、効率的に作用させるためには、本発明のアンチセンス核酸の鎖長は１５塩基以上３０塩基以下、好ましくは１５塩基以上２５塩基以下、より好ましくは１８塩基以上２２塩基以下の塩基数からなる塩基配列からなるものが好適である。
本発明のアンチセンス核酸の発現抑制効果は、公知の手法、例えば本発明の遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒｉｂｏ ｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ等）とｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ反応（プロメガ社：Ｒａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ等）を併用する系のような本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で被験物質を系に添加し、該レポーター遺伝子の発現量を測定することにより評価することができる。
本発明のアンチセンス核酸は、生体内におけるｈｒｃ１２３３７の発現を抑制することができるので、ＨＲＣ１２３３７が関連する疾患の予防・治療剤として有用である。
発明の実施の最良の形態
（核酸）
本発明のＤＮＡをＤＮＡライブラリーから得る例としては、適当なゲノムＤＮＡライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング法や、抗体を用いたイムノスクリーニング法等でスクリーニングし、目的のＤＮＡを有するクローンを増殖させ、そこから制限酵素等を用いて切り出す方法がある。ハイブリダイゼーション法によるスクリーニングは、配列番号１に記載の塩基配列もしくはその一部を有するＤＮＡを^３２Ｐ等でラベルしてプローブとし、任意のｃＤＮＡライブラリーに対して、公知の方法で（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８２年）行うことができる。イムノスクリーニング法で用いる抗体は、後述する本発明の抗体を使用することができる。本発明の新規ＤＮＡはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーを鋳型とするＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）によっても得る事ができる。ＰＣＲは、配列番号１に記載の塩基配列をもとに、センスプライマー、アンチセンスプライマーを作成し、任意のＤＮＡライブラリーに対し、公知の方法（例えばＭｉｃｈａｅｌ Ａ．Ｉ．等，ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、１９９０年参照）等を行って、本発明のＤＮＡを得る事もできる。上記各種方法で使用するＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するＤＮＡライブラリーを選択して使用する。当該ＤＮＡライブラリーは、本発明のＤＮＡを有するライブラリーであれば、いかなるものも使用可能であり、市販のＤＮＡライブラリーを使用したり、本発明のＤＮＡを有する細胞からｃＤＮＡライブラリーを作成するのに適した細胞を選び公知の方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ 等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９年参照）に従って、ｃＤＮＡライブラリーを作製し、利用することができる。
また、本明細書に開示された配列を基にホスホアミダイト法などの化学合成的手法により調製することも可能である。
本発明のＤＮＡを含む組換えベクターは、環状、直鎖状等いかなる形態のものであってもよい。かかる組換えベクターは、本発明のＤＮＡの全部または一部に加え、必要ならば他の塩基配列を有していてもよい。一部とは例えば本発明の蛋白質の部分ペプチドをコードするＤＮＡである。他の塩基配列とは、エンハンサーの配列、プロモーターの配列、リボゾーム結合配列、コピー数の増幅を目的として使用される塩基配列、シグナルペプチドをコードする塩基配列、他のポリペプチドをコードする塩基配列、ポリＡ付加配列、スプライシング配列、複製開始点、選択マーカーとなる遺伝子の塩基配列等のことである。本発明の組換えベクターの好ましい一例は、発現ベクターである。
遺伝子組み換えに際しては、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて翻訳開始コドンや翻訳終止コドンを本発明のＤＮＡに付加したり、あるいは塩基配列内に適当な制限酵素切断配列を新たに発生させあるいは消失させることも可能である。これらは当業者が通常行う作業の範囲内であり、本発明のＤＮＡを基に任意かつ容易に加工することができる。
また本発明のＤＮＡを保持するベクターは、使用する宿主に応じた適当なベクターを選択して使用すればよく、プラスミドの他にバクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウィルス、ワクシニアウィルス等の種々のウイルスを用いることも可能であり、特に制限はない。
本発明の遺伝子の発現は、該遺伝子固有のプロモーター配列の制御下に発現させることができる。かかる発現系を用いれば、本発明の遺伝子の転写を促進あるいは抑制する物質の探索がより有利に行える。あるいは、本発明の遺伝子の上流に別の適当な発現プロモーターを該遺伝子固有のプロモーター配列に接続あるいは置き換えて使用することもできる。この場合に使用するプロモーターは、宿主及び発現の目的に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌である場合にはＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、λＰＬプロモーターなどが、宿主が酵母である場合にはＰＨＯ５プロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター等が、宿主が動物細胞である場合にはＳＶ４０由来プロモーター、レトロウィルスプロモーター、延長因子１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １α）プロモーター等を例示できるが、当然ながらこれらには限定されない。
ＤＮＡをベクターに導入する方法は公知である（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），１９８９年、参照）。すなわち、ＤＮＡとベクターをそれぞれ適当な制限酵素で消化し、得られたそれぞれの断片を、ＤＮＡリガーゼを用いてライゲーションさせればよい。
（蛋白質）
本発明の蛋白質は、該蛋白質を発現している細胞や組織から調製することができ、またペプチド合成機（例えば、ペプチドシンセサイザー４３３Ａ型、アプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社製）を使用した化学合成法でも、また原核生物あるいは真核生物から選択される適当な宿主細胞を用いた組換え方法によっても調製することができる。しかしながら、その純度の面から遺伝子工学的な手法による生産ならびに組換え型蛋白質が好ましい。
前項の組換えベクターを用いて形質転換させる宿主細胞には特に制限はなく、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓあるいはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅに代表される遺伝子工学手法において利用可能な下等細胞、昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞に代表される動物細胞など多くの細胞が、本発明に対しても利用可能である。
本発明の形質転換細胞は、適当な宿主細胞を本発明の組換えベクターにより形質転換させることで得ることができる。前項の組換えベクターを宿主細胞に導入する方法としては、エレクトロポレーション法、プロトプラスト法、アルカリ金属法、リン酸カルシウム沈澱法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法、ウイルス粒子を用いる方法等の公知方法（実験医学臨時増刊、遺伝子工学ハンドブック１９９１年３月２０日発行、羊土社、参照）があるが、いずれの方法を用いても構わない。
当該蛋白質を遺伝子工学的に生産するには、上述の形質転換細胞を培養して培養混合物を回収し、当該蛋白質を精製する。形質転換細胞の培養は、一般的な方法で行うことができる。形質転換細胞の培養については各種の成書（例、「微生物実験法」社団法人日本生化学会編、株式会社東京化学同人、１９９２年）があるので、それらを参考にして行うことができる。
培養混合物から本発明の蛋白質を精製する方法としては、蛋白質の精製に通常使用されている方法の中から適切な方法を適宜選択して行うことができる。すなわち、塩析法、限外濾過法、等電点沈澱法、ゲル濾過法、電気泳動法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィーや抗体クロマトグラフィー等の各種アフィニティークロマトグラフィー、クロマトフォーカシング法、吸着クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィー等、通常使用され得る方法の中から適切な方法を適宜選択し、必要によりＨＰＬＣシステム等を使用して適当な順序で精製を行えば良い。
また、本発明の蛋白質を他の蛋白質やタグ（例、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＡ、ヘキサヒスチジンタグ、ＦＬＡＧタグその他）との融合蛋白質として発現させることも可能である。発現させた融合型は、適当なプロテアーゼ（例、トロンビン、エンテロカイネースその他）を用いて切り出すことが可能であり、ときとして蛋白質の調製をより有利に行うことが可能となる。本発明の蛋白質の精製は当業者に一般的な手法を適宜組み合わせて行えばよく、特に融合蛋白質の形態で発現させたときは、その形態に特徴的な精製法を採用することが好ましい。
また、組換えＤＮＡ分子を利用して無細胞系の合成方法（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．（１９８９年））で得る方法も、遺伝子工学的に生産する方法の１つである。
この様に本発明の蛋白質は、それ単独の形態でも別種の蛋白質との融合蛋白質の形態でも調製することができるが、これらのみに制限されるものではなく、本願発明の蛋白質を更に種々の形態へと変換させることも可能である。例えば、蛋白質に対する種々の化学修飾、ポリエチレングリコール等の高分子との結合、不溶性担体への結合など、当業者に知られている多種の手法による加工が考えられる。また、用いる宿主によっては糖鎖の付加の有無あるいはその程度にも違いが認められる。かかる場合にあっても、細胞接着分子として機能する限りにおいて、なお、本発明の思想下にあるというべきである。
本発明の蛋白質は、抗体を作製するための抗原として使用し、あるいは該蛋白質に結合する物質や該蛋白の活性を調節する物質のスクリーニングに使用することができ、有用である。
本発明のＨＲＣ１２３３７は、上述のような形質転換細胞、特に動物細胞を培養することにより、その細胞表面に目的分子を高発現させることが可能である。一方、ＨＲＣ１２３３７の細胞外領域蛋白質フラグメントなどの適当な断片を可溶性蛋白質として製造する場合には、当該細胞外領域あるいは各ドメインをコードするＤＮＡを用いて上述のように形質転換細胞を調製し、外形質転換細胞を培養することにより培養上清中に分泌させることにより製造することができる。
一方、ＨＲＣ１２３３７が形質転換細胞のペリプラズムまたは細胞質内に存在する場合は、適当な緩衝液に懸濁した細胞に対して、例えば超音波処理、凍結融解処理、あるいはリゾチーム処理などを行って細胞壁および／または細胞膜を破壊した後、遠心分離やろ過などの方法で本発明の蛋白質を含有する膜画分を得、さらに該膜画分を適当な界面活性剤を用いて可溶化して粗溶液を調製する。そして、当該粗溶液から定法により目的蛋白質を単離、精製することができる。
（ｈｒｃ１２３３７遺伝子組換え非ヒト動物）
本発明は、ｈｒｃ１２３３７遺伝子組換え非ヒト動物を提供する。ｈｒｃ１２３３７遺伝子組換え非ヒト動物には、トランスジェニック非ヒト動物およびノックアウト非ヒト動物が含まれる。ｈｒｃ１２３３７遺伝子組換え非ヒト動物は、本発明の蛋白質をコードする遺伝子を該動物の染色体上に人為的に組み込むことにより、本発明の蛋白質の発現の程度、発現時期、発現部位等が制御されることを特徴とする。非ヒト動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、ウマ、ニワトリなどが挙げられるがこれらに限定されるものではない。非ヒト動物の中でも非ヒト哺乳動物が好ましい。
本発明の遺伝子ｈｒｃ１２３３７を用いれば、トランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。該トランスジェニック非ヒト動物は、トランスジェニック動物の製造において通常使用されるような定法（例、発生工学実験マニュアル、講談社サイエンティフィク発行、勝木元也編、野村達次監修、１９８７年）に従って作製することができる。すなわち、本発明の遺伝子または組換えベクターを非ヒト動物の全能性細胞に導入し、この細胞を個体へと発生させ、体細胞のゲノム中に導入遺伝子が組み込まれた個体を選別する。
具体的には、例えば、トランスジェニックマウスの場合には、正常Ｃ５７Ｂｌａｃｋ／６マウスから取得した前核期受精卵にｈｒｃ１２３３７遺伝子が発現可能なように構築されたＤＮＡを直接注入する。より具体的には、適切なプロモーターの下流にｈｒｃ１２３３７遺伝子を接続して導入したコンストラクトを作製し、その後必要であれば原核生物由来の配列を可能な限り除去した直鎖状ＤＮＡを得て、これを前核期受精卵前核に微細なガラス針を用いて直接注入する。
該受精卵を仮親として別の偽妊娠マウスの子宮に移植する。偽妊娠マウスは一般的にＩＣＲ雌マウスを、精管を切断または結紮した雄マウスと交配して作製する。移植胚由来の仔の組織よりゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲ法またはサザンブロッティング法にてｈｒｃ１２３３７遺伝子の導入の有無を確認しトランスジェニックマウスを得る。
また、ｈｒｃ１２３３７（またはｈｒｃ１２３３７のマウス相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、いわゆる「ノックアウトマウス」を作製することができる。本発明における「ノックアウトマウス」とは、本発明のマウス由来の蛋白質をコードする内在性遺伝子がノックアウト（不活性化）されたマウスであり、例えば相同組換えを応用したポジティブネガティブセレクション法（米国特許第５，４６４，７６４号公報、同５，４８７，９９２号公報、同５，６２７，０５９号公報、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８６，８９３２−８９３５，１９８９、Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４２，４３５−４３８，１９８９など）を用いて作製することができ、このようなノックアウトマウスも本発明の一態様である。
または、最近中大動物においても核移植によるクローン動物の作出が可能となった。これに伴い本技術を用いたトランズジェニックおよびノックアウト動物の作出も実際に行われるようになった。すなわち体細胞、あるいは生殖系列の細胞に対しｈｒｃ１２３３７（または各動物におけるｈｒｃ１２３３７の相同遺伝子）の塩基配列に基づいて、ＥＳ細胞に対して行うのと同様に相同組換えを行い、得られた細胞から核を得て、その核を用いてクローン動物を得ることができる。該動物はｈｒｃ１２３３７（または各動物におけるｈｒｃ１２３３７の相同遺伝子）が失われたノックアウト動物である。または、上述の方法と同様、任意の動物の任意の細胞にｈｒｃ１２３３７（または各動物におけるｈｒｃ１２３３７の相同遺伝子）遺伝子を導入し、その核を用いてクローン動物を得る事によりトランスジェニック動物を作製する事も可能である。このようなノックアウト非ヒト動物およびトランスジェニック非ヒト動物はその種に関わらず本発明の一態様である。
（抗体）
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体いずれも公知方法を参考にして得ることができる（例えば、免疫実験操作法、日本免疫学会編、日本免疫学会発行、参照）。以下に簡単に説明する。
当該新規抗体を得るには、まず動物に、免疫抗原として本発明の蛋白質を必要に応じてフロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）や不完全アジュバント（ＦＩＡ）等の適切なアジュバントとともに接種し、必要があれば２〜４週間の間隔で追加免疫する。追加免疫後、採血を行い、抗血清を得る。抗原として用いる本発明の蛋白質は、それが抗体の作製に使用しうる精製度のものであればいかなる方法で得られたものであってもよい。本発明の蛋白質の部分ポリペプチドも免疫抗原として好適に使用しうる。免疫抗原として使用するポリペプチドが、低分子のポリペプチド、すなわち約１０〜２０アミノ酸からなるポリペプチドである場合には、それをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等のキャリアと結合させて抗原として使用すればよい。免疫する動物はいかなるものであっても良いが、好ましくは通常当業者で免疫学的な実験に使用されるラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、ヤギ、ブタ、ウシ等から、目的の抗体を産生しうる動物種を選択して使用することが好ましい。
ポリクローナル抗体は、得られた抗血清を精製することによって得る事が出来る。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて行えば良い。
モノクローナル抗体を得るには以下のように行う。すなわち、免疫した動物から脾細胞もしくはリンパ球等の抗体産生細胞を採取し、ポリエチレングリコール、センダイウイルス、電気パルス等を用いる公知方法によって、ミエローマ細胞株等と融合し、ハイブリドーマを作製する。その後、本発明の蛋白質に結合する抗体を産生しているクローンを選択して培養し、その選択されたクローンの培養上清を精製することによって得れば良い。精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の公知方法を適宜組み合わせて用いれば良い。
また、遺伝子工学的な方法を用いても当該新規抗体が得られる。例えば、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドで免疫した動物の脾細胞、リンパ球あるいは、本発明蛋白質またはその部分ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマからｍＲＮＡを採取し、これをもとにｃＤＮＡライブラリーを作成する。抗原と反応する抗体を産生しているクローンをスクリーニングし、得られたクローンを培養し、培養混合物から目的とする抗体を公知方法を組み合わせて精製することができる。抗体を治療に使用する場合には、免疫原性の点からヒト化抗体が好ましい。ヒト化抗体は、免疫系をヒトのものと入れ替えたマウス（例 Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５；１４６−１５６（１９９７））を免疫することにより調製することが出来る。また、モノクローナル抗体の超可変領域を用いて遺伝子工学的に調製することもできる（Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３；９９−１２１（１９９１））。
（アンチセンス核酸）
アンチセンス核酸は、公知方法で製造することができる（例えば、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｔ．ＣｒｏｏＫｅおよびＢｅＲＮＡｌｄ Ｌｅｂｌｅｕ編、ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ出版、フロリダ、１９９３年）。天然のＤＮＡやＲＮＡであれば、化学合成機を使用して合成し、あるいはｈｒｃ１２３３７を鋳型としてＰＣＲ法により本発明のアンチセンス核酸を得ることができる。また、メチルフォスフォネート型やフォスフォロチオエート型等、誘導体の中には化学合成機（たとえばアプライドバイオシステムズ ジャパン株式会社製、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９）を使用して合成できるものもある。この場合には、化学合成機に添付されたマニュアルに従って操作を行い、得られた合成産物を、逆相クロマトグラフィー等を用いたＨＰＬＣ法により精製することによっても、アンチセンス核酸を得ることができる。
本発明のＤＮＡやアンチセンス核酸を診断用のプローブとして使用する場合には、それらを公知の方法に従い、ラジオアイソトープ、酵素、蛍光物質、あるいは発光物質等で標識する。次に、検体からＤＮＡもしくはｍＲＮＡを公知方法で調製し、これを被験物質として、前記標識プローブを加えて反応させた後、洗浄して未反応の前記標識プローブを除去する。被験物質中に、遺伝子ｈｒｃ１２３３７もしくはＲＮＡが含まれていれば、当該アンチセンス核酸はそれらと結合する。結合形成の有無は、標識した酵素、蛍光物質、発光物質、あるいは放射性同位元素等による発光、蛍光、放射能等を指標として知ることができる。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターを医薬用途に使用する場合には、医薬品として使用するのに適した純度のものを、薬理学的に許容されうる使用方法で使用することが好ましい。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、それらを直接適当な溶媒に溶解もしくは懸濁して使用してもよいし、リポソーム中に封入したり、適当なベクターに組み込んだ形にして使用してもよい。また、必要に応じて、薬理学的に許容され得る補助成分を添加し、注射剤、錠剤、カプセル剤、点眼剤、クリーム剤、座剤、噴霧剤、パップ剤等適当な剤型にして使用してもよい。薬理学的に許容され得る補助成分とは、溶媒、基剤、安定化剤、防腐剤、溶解剤、賦形剤、緩衝剤等のことである。
本発明のＤＮＡ、アンチセンス核酸または組換えベクターは、上述のような剤型とした場合、患者の年齢や、性別、疾患の種類、程度に応じて、その投与方法、その投与量を設定して使用することができる。すなわち、病態を改善するのに適した量を、経口投与、あるいは、吸入、経皮投与、点眼、膣内投与、関節内投与、直腸投与、静脈内投与、局所投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与等から適当な方法を選んで投与すればよい。
（スクリーニング方法）
本発明は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｈｒｃ１２３３７遺伝子組換え非ヒト動物を用いることを特徴とし、本発明の蛋白質の機能または発現を調節する物質、特にアンタゴニストをスクリーニング方法に関する。より具体的には、（１）被験物質の存在下／非存在下における本発明の蛋白質の活性を評価する方法、（２）被験物質の存在下／非存在下における本発明の蛋白質または遺伝子の発現レベルを比較し、本発明の蛋白質の発現を調節する物質をスクリーニングする方法などが挙げられる。（１）の例としては、実施例５に示す系において、被験物質存在下／非存在下における本発明の蛋白質の活性を測定すればよい。（２）の例としては、ｈｒｃ１２３３７遺伝子の発現制御領域、５’非翻訳領域、翻訳開始部位近傍領域または翻訳領域の一部等を含むＤＮＡとルシフェラーゼ等のレポーター遺伝子を連結した発現プラスミドを作製し、本発明の遺伝子が転写または翻訳される環境下で該レポーター遺伝子の発現量を被験物質の存在下／非存在下で測定し、被験物質の転写促進活性または転写抑制活性を確認する方法が挙げられる。本発明のスクリーニング方法は、本発明の蛋白質、該蛋白質を発現している形質転換細胞、本発明のＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該組換えベクターで形質転換された形質転換細胞またはｈｒｃ１２３３７遺伝子組換え非ヒト動物と被験物質を接触させる工程；被験物質添加群と被験物質無添加群とにおける本発明の蛋白質の活性または本発明のＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを検出する工程；差が認められた被験物質を本発明の蛋白質の活性調節物質または本発明のＤＮＡの発現調節物質として選択する工程を含み得る。本発明の蛋白質の活性を調節する作用を示す物質とは、ＨＲＣ１２３３７蛋白質の活性を模倣（ミミック）ないし増強する（アゴニスト）、あるいは阻害する（アンタゴニスト）作用を有する物質のいずれでも良いが、好ましくはアンタゴニストである。本発明のＤＮＡの発現調節作用を示す物質とは、遺伝子ｈｒｃ１２３３７の発現を促進あるいは抑制する作用を有する物質のいずれでもよいが、好ましくは抑制する作用を有する物質である。被験物質が本発明の蛋白質の活性調節作用または本発明のＤＮＡの発現調節作用を示すかどうかは、蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系に被験物質を添加した場合と無添加の場合の蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルに差があるかどうかを調べればよい。ＤＮＡの発現レベルとは、ｈｒｃ１２３３７遺伝子のｍＲＮＡの発現強度、蛋白質の発現強度のいずれにより検出しても良い。また、ｈｒｃ１２３３７遺伝子またはＨＲＣ１２３３７蛋白質自体の発現レベルではなく、代替としてレポーター遺伝子の発現レベルを検出しても良い。レポーターアッセイ系は、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する物質をスクリーニングするアッセイ系をいう。転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるＣＡＡＴボックス、ＴＡＴＡボックス等を例示することができる。またレポーター遺伝子としては、ＣＡＴ（ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ ａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子等を利用することができる。本発明の遺伝子の発現制御領域や５’非翻訳領域は公知の方法で取得することが可能である（新細胞工学実験プロトコール（秀潤社）、１９９３年）。阻害（または抑制）する作用を有する、あるいは増強（または促進）する作用を有するとは、蛋白質の活性またはＤＮＡの発現レベルの測定値が、被験物質添加群と、被験物質無添加群との間に差があることをいう。たとえば、下記の式で計算される阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率が１０％以上、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、更に好ましくは７０％以上、特に好ましくは９０％以上であることをいう。
阻害（または抑制）率あるいは増強（または促進）率＝（被験物質無添加群の測定値−被験物質添加群の測定値）の絶対値／無添加群の測定値＊１００
ここで、阻害または増強のどちらの活性であるかについて、および測定値については蛋白質の活性を確認できる系またはＤＮＡの発現を確認できる系の種類によって適宜定められる。たとえば、蛋白質の活性を確認できる系が実施例５に示すシアル酸含有糖鎖結合活性の測定系の場合には、測定値としてはｒｏｓｅｔｔｅｓの形成レベルを用いることができ、被験物質添加群の測定値＜被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質にはＨＲＣ１２３３７蛋白質活性阻害作用があるといえる。また蛋白質の活性を確認できる系が実施例１０に示す混合リンパ球反応におけるＩＬ−２産生の測定系の場合には、測定値としてはＩＬ−２産生量を用いることができ、被験物質添加群の測定値＜被験物質無添加群の測定値となる場合、被験物質にはＨＲＣ１２３３７蛋白質活性阻害作用があるといえる。測定系にバックグラウンドやノイズの値が含まれる場合には、そのようなものを差し引いた値を測定値とすることは言うまでもない。
本発明である蛋白質は、細胞接着分子であることから、上述のスクリーニング方法あるいはトランスジェニック動物を用いた探索を通じて得られる化合物等は、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、炎症性疾患等に対する有効な治療薬または予防薬となることが期待される。被験物質としては蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、合成化合物、天然由来化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液などが挙げられるがこれに限定されず、新規物質でも公知物質でもよい。
＜本発明の抗体を用いる測定法、試薬、キット＞
本発明は、（１）本発明の抗体を用いることを特徴とする、被験試料中のＨＲＣ１２３３７蛋白質の測定方法、（２）本発明の抗体を含有すること特徴とする、被験試料中のＨＲＣ１２３３７蛋白質を測定するための試薬またはキット、（３）ヒト体液中のＨＲＣ１２３３７蛋白質量の増加または減少を測定し、ＨＲＣ１２３３７の機能異常、それらを伴う疾患または該疾患に付随する病態の予知、検出または診断に用いる（１）に記載のＨＲＣ１２３３７蛋白質の測定方法、（４）前記疾患が花粉症、アトピー性皮膚炎および血管炎より選ばれる少なくとも１つの疾患である（３）に記載の測定方法を提供する。
本発明の測定方法は、本発明の抗体を用いるステップを含むが、該ステップは、対象試料中の被験物質であるＨＲＣ１２３３７蛋白質と、本発明の抗体との抗原抗体反応による、対象試料中の被験物質をトラップする工程であることが好ましい。本発明の測定方法における被験物質の検出原理は特に限定されないが、凝集法、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法等が例示される。この内、サンドイッチ法及び競合法が好ましく、特にサンドイッチ法が好ましい。凝集法では、抗体を粒子、例えばラテックス粒子や赤血球（例えば羊赤血球）の表面に結合させて、ＨＲＣ１２３３７蛋白質が存在すると粒子の凝集が生じるようにし、この粒子の凝集の程度を指標としてＨＲＣ１２３３７蛋白質を測定する。
なお、この凝集法では、ラテックスや赤血球以外にも、ゼラチンやマイクロビーズ、カーボン粒子等、一般に用いられている粒子を使用することができる。また、サンドイッチ法、固相直接法または固相結合法、競合法では、標識された抗体や抗原を使用し、エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ケミルミネッセンスイムノアッセイ（化学発光免疫測定法）、フルオロイムノアッセイ（蛍光免疫測定法）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲ−ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィーアッセイ（ＩＣＡ）等の原理で測定を行なうことができる。
以下に、本発明の測定方法の好適例の１つである、ＥＩＡの原理に基づく、サンドイッチ法、固相直接法、競合法を説明する。ＥＩＡによるサンドイッチ法では、まず、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素で標識した、ＨＲＣ１２３３７蛋白質を認識する抗体または二次抗体を準備する。特にポリペルオキシダーゼ標識した抗体は好ましい例である。また、使用する固相には、ＨＲＣ１２３３７蛋白質を認識する抗体を吸着させておく。サンプル（試料）もしくはスタンダードを添加後、上述の酵素標識抗体を添加し、抗原抗体反応を行なわしめる。過剰の酵素標識抗体を洗浄操作で除去した後、使用する酵素に応じた発色基質、例えばオルトフェニレンジアミンとＨ_２Ｏ_２、ｐ−ニトロフェニルリン酸、２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド等を加えて酵素と反応させる。基質の発色は、酵素量、ひいてはサンプル中のＨＲＣ１２３３７蛋白質に依存するので、発色最終産物の量を測定することによりＨＲＣ１２３３７蛋白質を定量することができる。
固相直接法では、サンプル（試料）を直接固相に吸着させ、固相のＨＲＣ１２３３７蛋白質非吸着面を、その測定系には影響しないタンパク質、例えばＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などでブロッキング処理し、次いでＨＲＣ１２３３７蛋白質を認識する酵素標識抗体を添加し、反応させる。以降は、サンドイッチ法と同様の操作を行ない、サンプル中のＨＲＣ１２３３７蛋白質の有無を判定するか定量を行う。
競合法では、使用する抗体が認識する一定量のＨＲＣ１２３３７蛋白質を直接固相に吸着させ、次いでブロッキング処理した後、ここに、ＨＲＣ１２３３７蛋白質を認識する酵素標識抗体とサンプル（試料）とを添加する。一定時間反応させた後、洗浄して固相に非結合の物質を除去し、発色基質を加えて酵素と反応させる。反応後、サンプル添加による、酵素標識抗体の固相ＨＲＣ１２３３７蛋白質への結合阻害度を測定することにより、サンプル中のＨＲＣ１２３３７蛋白質を定量する。
なお、はじめに抗体を固相に吸着させ、酵素標識したＨＲＣ１２３３７蛋白質をサンプルと同時に添加し、サンプル添加による標識物の固相化抗体への結合阻害度を測定することにより、サンプル中のＨＲＣ１２３３７蛋白質を定量してもよい。
上記以外の方法として、抗原抗体反応を液相中で行ない、後に、抗体を用いた凝集沈降法もしくは物理化学的な手法によって、標識抗体と結合したＨＲＣ１２３３７蛋白質と結合しなかったＨＲＣ１２３３７蛋白質を分離し定量する方法もある。また、ＨＲＣ１２３３７蛋白質を認識する抗体を標識するのではなく、その抗体を認識する二次抗体を得、それを標識し、抗原抗体反応を行なわせて、ＨＲＣ１２３３７蛋白質を測定することも可能である。
サンドイッチ法、固相直接法、競合法のいずれにおいても、標識酵素−発色基質の組合せを、標識酵素−生物発光基質または化学発光基質、標識酵素−蛍光基質等の組合せに変えることが可能である。この場合の、酵素−発光基質の代表的な組合せは、アルカリフォスファターゼ−ＡＭＰＰＤ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ルミノール、ルシフェラーゼ−ルシフェリン等があり、酵素−蛍光基質の代表的な組合せは、アルカリフォスファターゼ−ウンベリフェリルフォスフェート、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−ｐ−ハイドロキシフェニルプロピオン酸等がある。
さらに、上記３種の測定方法において、酵素に代わって、放射性物質や化学発光物質あるいは蛍光物質で直接あるいは間接的に標識された抗体や抗原を用い、放射能や発光、蛍光の強度を測定することにより、サンプル中のＨＲＣ１２３３７蛋白質を測定することも可能である。
放射性物質としては、^１２５Ｉや^１３１Ｉ等が一般に使用されており、化学発光物質の代表的な物には、アクリジニウムエステル等がある。また、蛍光強度を測定する場合には、より高感度な方法として、抗体あるいは抗原にキレート剤を直接あるいは間接的に結合させ、励起光照射後にそのキレート剤に結合する希土類金属から発せられる蛍光の強度を時間分解的に測定することにより、試料中のＨＲＣ１２３３７蛋白質を測定する方法（時間分解蛍光免疫測定法）も有用である。なお、代表的な希土類金属の例として、ユーロピウムがあげられる。
本発明の測定方法は、以上説明したように、試料中のＨＲＣ１２３３７蛋白質を検出または測定することを目的としている。この場合、被験試料は動物、特にヒトの体液あるいは、組織、細胞および菌体ならびにそれらの抽出液、培養上清、塗末標本および切片があげられるが、体液であることが好ましい。より好ましくは、血液、血漿、血清、尿、髄液、リンパ液、唾液、腹水、胸水より選ばれる試料である。
本発明の測定方法を用いて健常人及び種々の疾患を有する患者の体液中のＨＲＣ１２３３７蛋白質を測定することができる。また、初めて体液中のＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度が明らかとなり、特定の疾患においてＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度が変動することも明らかとなった。健常人及び種々の疾患を有する患者の体液中のＨＲＣ１２３３７蛋白質の濃度を比較する際には、当業者が通常用い得る統計学的手法を用いて両者の測定値に差があるか否かを判断すればよい。
なお、本発明の測定試薬及びキットは、上記した測定方法の構成等に準拠することができる。
実施例
以下の実施例により本発明を更に詳述するが、本発明はこれら実施例に限定して理解されるべきものではない。
実施例１ 遺伝子ｈｒｃ１２３３７のクローニング
（１）オリゴキャップ法による完全長ｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト腎皮質上皮細胞よりＳａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．）に従い、オリゴｄＴセルロースを用いてポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを調製した。次に５−１０μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む緩衝液中で、１．２ＵのＢａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＢＡＰと略する）（ＴａＫａＲａ）と３７℃で４０分間反応させ、キャップ構造を持たないポリ（Ａ）^＋ＲＮＡの脱リン酸化を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出し、ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡをエタノール沈殿として回収した。回収したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡは、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１００ＵのＲＮａｓｉｎを含む緩衝液中で２０ＵのＴｏｂａｃｃｏ ａｃｉｄ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（以下ＴＡＰと略する）（Ｍａｒｕｙａｍａ ａｎｄ Ｓｕｇａｎｏ，Ｇｅｎｅ ｖｏｌ．１３８，１７１−１７４）にて３７℃で４５分間処理し、キャップ構造の除去を行った。その後、フェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて反応液を２回抽出して、エタノール沈殿を行い、ＢＡＰ−ＴＡＰ処理済ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを回収した。
この回収したポリ（Ａ）^＋ＲＮＡ２−４μｇを０．４μｇの５オリゴマー（５’−ＡＧＣ ＡＵＣ ＧＡＧ ＵＣＧ ＧＣＣ ＵＵＧ ＵＵＧ ＧＣＣ ＵＡＣ ＵＧＧ−３’）とライゲーション反応を行った。この反応は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭのＡＴＰ、２５％のＰＥＧ８０００及び１００ＵのＲＮＡｓｉｎを含む緩衝液中で、２５０ＵのＲＮＡリガーゼ（ＴａＫａＲａ）を用いて２０℃で３−１６時間行った。その後、未反応のオリゴマーを除去してｃＤＮＡ合成を行った。すなわち、２−４μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを１０ｐｍｏｌのｄＴアダプタープライマー（５’−ＧＣＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＴＡＴＧＴ ＧＧＣ ＣＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ−３’）と混合し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ⁻Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用い、添付の緩衝液中で４２℃、１時間反応させた。
鋳型のＲＮＡを除去するために１５ｍＭのＮａＯＨを用いて６５℃で１時間反応させた後に、ｃＤＮＡの増幅操作を行った。１μｇのオリゴキャップポリ（Ａ）^＋ＲＮＡより合成されたｃＤＮＡを１６ｐｍｏｌのセンスプライマー１（５’−ＡＧＣ ＡＴＣ ＧＡＧ ＴＣＧ ＧＣＣ ＴＴＧ ＴＴＧ−３’）及びアンチセンスプライマー１（５’−ＧＣＧ ＧＣＴ ＧＡＡ ＧＡＣ ＧＧＣ ＣＴＡ ＴＧＴ−３’）と混合し、ＸＬ ＰＣＲ ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて増幅した。この際のＰＣＲ反応の条件は、９４℃で１分間、５８℃で１分間、７２℃で１０分間のサイクルを５−１０回行った。ＰＣＲ産物をフェノール：クロロホルム＝１：１の混合液にて抽出し、エタノール沈殿として回収した。その後、回収物をＳｆｉＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にて１０００ｂｐ以上のｃＤＮＡを分離し、哺乳動物細胞発現ベクターであるｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ００９８６４）のＤｒａＩＩＩサイトに挿入した。尚、ｐＭＥ１８Ｓ−ＦＬ３のＤｒａＩＩＩサイトは非対称性となっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩサイトとなっているため、挿入したｃＤＮＡ断片は一方向性に挿入されている。
（２）ｃＤＮＡクローン塩基配列及びその推定蛋白質情報の解析
（１）の方法で作製したｃＤＮＡライブラリーより、ＰＩ−１００ロボット（ＫＵＲＡＢＯ）を用いてプラスミドを調製し、各クローンの塩基配列を確認し、データベース化した。塩基配列決定は、ＡｕｔｏＣｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とＲ．Ｏ．Ｂ．ＤＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い添付のプロトコールに従ってシークエンス反応を行い、ＡＬＦ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により行った。
（１）に記載の方法で取得したクローンＣ−ＨＲＣ１２３３７には、配列番号２で表される３２８個のアミノ酸からなる新規な蛋白質をコードする、配列番号１で表される９８４塩基の塩基配列からなるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む、全長１５２３塩基対の塩基配列（配列番号３）からなるｃＤＮＡが含まれていた。このプラスミドＣ−ＨＲＣ１２３３７は、国際微生物寄託機関である独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６）に、平成１３年（２００１）２月１４日付にて受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７８８２として寄託されている。
（３）ｃＤＮＡクローン及びその推定蛋白質の相同性解析
相同性の検索にはＢＬＡＳＴ（Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６；２９０−３００（１９９３）、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５；４０３−１０（１９９０））を用いて、局部的な配列の一致を検索した。
Ｃ−ＨＲＣ１２３３７完全長ｃＤＮＡ配列から推定される蛋白質配列を相同性検索をおこなうｂｌａｓｔｐプログラムを用いてＧｅｎｂａｎｋ蛋白質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）に対しＢＬＡＳＴ相同性検索を行った。１９９残基にわたりヒトＣＤ３３ ａｎｔｉｇｅｎ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１７６３）との相同性が４３％、２６０残基にわたりヒトＤ−ｓｉｇｌｅｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０５７６２７）との相同性が４０％、２６０残基にわたりヒトＱＡ７９ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＣＡＢ５１１２７）との相同性が４０％、２０１残基にわたりヒトｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｌｅｃｔｉｎ−５（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＡＤ５０９７８）との相同性が４３％みられた。
さらに推定された蛋白質配列と相同性検索から得られた蛋白質配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿００１７６３、ＮＰ＿０５７６２７、ＣＡＢ５１１２７、ＡＡＤ５０９７８）をマルチプルアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２；４６７３−８０（１９９４））を用いて多重整列した結果を第２図に示す。
モチーフとは実験などから同定された機能部位（例えば、酵素などの活性部位やリガンドやエフェクターなどの結合部位、リン酸化などの修飾部位）のコンセンサス配列として記述されたもので、特に重要な機能部位は進化的にも保存されるケースが多いことから、ある機能を発現する蛋白質に特徴的に現れる保存配列、さらには類縁蛋白質ファミリーを特徴づける指標としても用いられる。このように、モチーフを検索することでホモロジー検索に比べてより直接的に機能に結びついた解釈が期待できる。
モチーフデータベースであるＰＲＯＳＩＴＥデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｐｒｏｓｉｔｅ／）ではモチーフを、「コンセンサス配列をパターンで標記」又は、「出現頻度などに基くスコアをモチーフ内の各位置に対して各アミノ酸ごとに行列であらわしたプロファイルで標記」している。
推定される蛋白質配列の機能について、ＰＲＯＳＩＴＥデータベースに対しパターン検索した結果、１７２番目および、３１２番目のアスパラギンが糖鎖結合部位であるモチーフがみられた。
隠れマルコフモデルを用いた相同性検索プログラムであるＨＭＭＥＲ（Ｒ．Ｄｕｒｂｉｎ，Ｓ．Ｅｄｄｙ，Ａ．Ｋｒｏｇｈ，Ｇ．Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８））を用いて蛋白質ドメインデータベースであるＰｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｆａｍ／）に検索を実施した結果、有為な相同性のあるドメインとしてアミノ酸番号５７から１４４番目および１８７から２３９番目、にＩｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ［Ｐｆａｍ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＰＦ０００４７］が見出された。
重み行列を用いた膜貫通予測プログラムｔｍａｐ（Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２３７；１８２−９２（１９９４））により膜貫通ヘリックスの予測をおこなったところ、２５５番目から２８３番目のアミノ酸残基の２９残基において膜貫通領域が予測された。またＳＯＳＵＩ ｐｒｏｇｒａｍでは、２６３番目から２８５番目のアミノ酸残基に膜貫通領域が予測された。
重み行列を用いたシグナルペプチド切断部位予測プログラムｓｉｇｃｌｅａｖｅ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．１４；４６８３−４６９０（１９８６））によりシグナルペプチの予測をおこなったところ、７番目から２０番目のアミノ酸残基の１４残基においてシグナルペプチドが予測された。またＳＯＳＵＩ ｐｒｏｇｒａｍでは、３番目から２２番目のアミノ酸配列においてシグナルペプチドが予測された。
実施例２ ＰＣＲによる発現プロファイルの確認
Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３８；５８６−５９０（２０００））は外部研究機関に委託し、以下の手法で行った。
ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＣＡＥＣ）及びヒト白血球、ヒト胎盤組織から定法によりｔｏｔａｌ ＲＮＡを調製した。また、白血球を５μｇ／ｍｌのＰＨＡにて２４時間白血球を刺激した後にｔｏｔａｌ ＲＮＡを定法により調製した。さらにヒトの肺、腎臓、膵臓、肝臓、大腸、小腸、胸腺、脾臓、心臓、子宮、精巣、前立腺、骨格筋、脳のｔｏｔａｌ ＲＮＡについてはクローンテック社より購入した。次に、各ｔｏｔａｌ ＲＮＡ １−２μｇよりオリゴｄＴプライマーを用いて１本鎖ｃＤＮＡの合成を定法に従って行った。逆転写酵素としてはＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＮａｓｅ Ｈ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いた。これらの合成したｃＤＮＡを鋳型にＲｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲを行い、ｈｒｃ１２３３７のｍＲＮＡの発現について確認した。Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲはＬｉｇｈｔ Ｃｙｃｌｅｒ（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）を用いてプロトコールに従って行った。伸長用のプライマーとしてはセンス側のプライマー（５’−ＣＡＣ ＣＡＡ ＣＡＴ ＣＣＡ ＴＴＴ ＣＡＧ Ｃ−３’）及びアンチセンス側のプライマー（５’−ＡＴＧ ＧＴＴ ＧＴＣ ＣＡＣ ＡＴＡ ＧＧＡ ＧＧ）を用いた。また、ハイブリダイゼーションプローブとして５’端をＲｅｄ ６４０標識した２０ｍｅｒよりなるオリゴマー（５’−ＴＧＴ ＧＣＣ ＡＧＣ ＣＡＡ ＧＣＣ ＴＣＧ−３’）及び３’端をＦＩＴＣ標識した２０ｍｅｒよりなるオリゴマー（５’−ＴＧＣ ＣＣＧ ＡＧＡ ＡＣＣ ＡＧＧ ＡＣＴ ＧＧ−３’）を用いた。その結果、脾臓、ＰＨＡ刺激白血球、子宮及び精巣でｈｒｃ１２３３７の発現が確認でき、特にＰＨＡ刺激白血球でその発現が高かった（第４図）。
実施例３ ＨＲＣ１２３３７蛋白質の発現
（１）可溶型ＨＲＣ１２３３７蛋白質の発現
可溶型のＨＲＣ１２３３７蛋白質として、細胞外ドメインのＣ端側にＨｉｓタグを結合したキメラ蛋白の発現を行った。発現プラスミドは下記の方法で構築した。まず、センスプライマー（５’−ＣＧＴ ＴＡＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＣ ＴＧ−３’）とアンチセンスプライマー（５’−ＣＣＧ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＣＡ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＧＣ ＴＧＧ ＣＣＴ Ｃ−３’）を設計し、Ｃ−ＨＲＣ１２３３７を鋳型にし、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒のサイクルを２５回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られた約１．１ｋｂのＰＣＲ産物をＸｈｏＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動にて約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。またｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ ＣをＸｈｏＩにて消化した後に、脱リン酸化を行った。このベクターＤＮＡと前述のＰＣＲ断片をｌｉｇａｔｉｏｎし、定法に従いコンピテンとセルＪＭ１０９をｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎしてＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓ ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ発現プラスミドを構築した。
得られたプラスミド１２．５μｇをＦｕＧＮＥＮ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ^２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ−１細胞に添加した。５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で７２時間培養した後に、上清を回収した。その後Ｈｉｓ Ｔｒａｐ Ｋｉｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社）を用い、バイオ基礎実験攻略ガイド ２０００−２００１（アマシャムファルマシアバイオテク社）に従い、ＨＲＣ１２３３７蛋白質−Ｈｉｓ ｔａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、ＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓと呼ぶ場合がある）を精製した。ＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓのアミノ酸配列を配列番号６に示す。
（２）全長ＨＲＣ１２３３７蛋白質の発現
Ｃ−ＨＲＣ１２３３７プラスミドを下記の方法でＣＯＳ細胞に導入し、全長蛋白質の発現を行った。
ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌを上記プラスミドＤＮＡ１２．５μｇと添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ^２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ細胞に添加した。５％ＣＯ_２、３７℃の条件下で７２時間培養した後に、ＨＲＣ１２３３７蛋白質発現細胞を回収し、実施例５に示す活性測定アッセイに供した。
（３）ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃの作製
ＨＲＣ１２３３７蛋白質の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントとのキメラ（融合）蛋白質を生産した。ＨＲＣ１２３３７蛋白質の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ Ｆｃフラグメントのキメラ蛋白質であるＨＲＣ１２３３７−Ｆｃの発現プラスミドは以下の方法で構築した。センスプライマー（５’−ＣＧＴ ＴＡＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＡＧ ＣＴＣ ＴＧ−３’）及びアンチセンスプライマー（５’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＴＡ ＧＡＣ ＧＣＴ ＧＧＣ ＣＴ−３’）を合成し、Ｃ−ＨＲＣ１２３３７を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）により９８℃で１０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分のサイクルを２５回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られた約１．１ｋｂのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動にて約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。また再公表ＷＯ９７／４２３１９に記載のｐＭ１３０４をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて消化し、前述のＤＮＡ断片をライゲーションした。コンピテントセルＨＢ１０１（ＴＡＫＡＲＡ）を形質転換して定法に従いＨＲＣ１２３３７−Ｆｃ発現プラスミドを調製した。得られた発現プラスミドは、以下の方法でＣＯＳ細胞に導入した。即ち、ＦｕＧＥＮＥ６（ロシュ・ダイアグノスティックス社）５０μｌと上記各プラスミドＤＮＡ１２．５μｇとを添付プロトコールに従い混合し、１５０ｃｍ^２フラスコにセミコンフルエントに増殖したＣＯＳ細胞に添加した。５％ＣＯ_２存在下、３７℃で３日間培養した後に培養上清を回収した。培養上清中に含まれるＨＲＣ１２３３７−ＦｃはＰｒｏｔｅｉｎＡカラムを用いて精製した。精製ＨＲＣ１２３３７−ＦｃをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動後、抗Ｆｃ抗体（パーオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＡ，ＩｇＧ，ＩｇＭ，Ｋａｐｐａ，Ｌａｍｂｄａ抗体；ＤＡＫＯ）を用いてウエスタンブロッティングにて検出した。ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃのアミノ酸配列を配列番号７に示す。
実施例４ 抗ＨＲＣ１２３３７抗体の作製
（１）ＨＲＣ１２３３７の部分ペプチドの調製
ＨＲＣ１２３３７に対する抗体を作製するため、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ及びＲｏｂｓｏｎの２次構造予測プログラムを用いて蛋白質の表面上に露出されていると予想されるペプチド配列を解析した。その結果、Ｎ末のアミノ酸のうち２４番目から３９番目の配列（ＫＩＤＴＴＥＮＬＬＮＴＥＶＨＳＳ）は親水性が高く、αヘリックスを含む構造であり免疫が可能と判断した。また、６４番目から７５番目の配列（ＣＴＦＴＨＰＨＲＨＹＤＧ）、１２１番目から１４２番目の配列（ＲＲＮＤＬＳＬＲＶＥＲＬＡＬＡＤＤＲＲＹＦＣ）は中に一部ターン構造を有するコンビネーション構造を取ることが予想されたため、蛋白質表面に露出されているものと推定し、免疫が可能と判断した。ＫＩＤＴＴＥＮＬＬＮＴＥＶＨＳＳのペプチドはキャリア蛋白と結合するため、Ｃ端にシステインを結合した配列とした。ペプチドの合成はＡＢＩ４３２Ａペプチド合成機（アプライドバイオシステムズ社）を用いて行い、定法により樹脂よりペプチドの切り出し脱保護を行い、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ（ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ、資生堂）を用いて精製した。
（２）ＨＲＣ１２３３７のペプチドキャリア抗原の調製
合成したペプチドを蒸留水で１０ｍｇ／ｍＬに溶解し、１０ｍｇ／ｍＬのマレイミド化キーホールリンペットヘモシアニン（ＰＩＥＲＣＥ）と等量混合した。室温で２時間反応後、ＮＡＰ−１０カラム（ファルマシア）で脱塩した。蛋白濃度は使用したＫＬＨ量を液量で割ったものを用いた。
（３）ペプチド抗体の作製
調製した各ペプチドキャリア抗原２０μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合した。ＢＡＬＢ／ｃマウス５週齢メスの腹腔に投与し、２週間後ペプチドキャリア抗原２０μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し同様に腹腔に投与した。また、各ペプチドキャリア抗原１００μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、Ｗｉｓｔａｒラット８週齢メスの各後足フットパッドに１００μＬづつ投与した。マウスは２回目投与１週間後、ラットは初回投与２週間後に眼底より採血を行い抗体価の上昇をウエスタンブロッティングにより確認した。すなわち精製 ＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓを４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（ＴＥＦＣＯ）にて泳動し、ミリポア社の方法にしたがってＰＶＤＦ膜に転写した。転写後５％スキンミルク、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）（以下ＰＢＳと記載）にてブロッキングを行った。採血した抗血清を０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０７６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．４）で５００倍に希釈し転写したＰＶＤＦ膜と４℃で一夜反応させた。メンブレンを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）で３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）又はペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を０．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）で５００倍に希釈しメンブレンと室温で１時間反応させた。メンブレンを同様に３回洗浄後、化学発光試薬ＥＣＬ（アマシャム）で検出した。その結果、約３７ｋＤａ付近にバンドが検出され抗体価の上昇が確認された。抗体価の上昇した個体のうち、特に力価が高かった２４番目から３９番目の配列（ＫＩＤＴＴＥＮＬＬＮＴＥＶＨＳＳ）を投与したラットより腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行った。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と混合後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。また、抗体価の上昇したマウスは最終投与を行い、３日後脾細胞よりリンパ球を分離し、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４と混合後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」（講談社）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。また、マウスは腹腔に抗原１００μｇを最終投与投与し、３日後、脾臓を摘出した。脾臓よりリンパ球を分離し、Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１と１０：１で混合しポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。その結果、ＨＲＣ１２３３７と反応したウエルを限界希釈法によりクローニングした。
スクリーニングは０．０１Ｍ炭緩衝液（ｐＨ９．５）で精製ＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓを１μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）に５０μＬ／ウエル添加した。３７℃にて１時間反応後イオン交換水で５回洗浄し、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を各ウエルに１００μＬ添加しブロッキングを行った。次に培養上清を各ウエルに添加し３７℃で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で３回洗浄した。ペルオキシダーゼ標識抗マウスイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）又はペルオキシダーゼ標識抗ラットイムノグロブリン抗体（ＤＡＫＯ）を１０％ウサギ血清を含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）で１０００倍に希釈し各ウエルに５０μＬ添加した。３７℃で１時間反応後、同様に５回洗浄し０．０１％過酸化水素を含むテトラメチルベンジジン溶液を各ウエルに添加した。室温で１０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。その結果、ＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓと反応した細胞を選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、同様にスクリーニングを行い、マウスからはＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ５クローン（Ｆ１１０５−１〜５）を得た。また、ラットからはＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ２クローン（Ｆ１１１４−１−２、Ｆ１１１４−４−１）得た。選択したハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ又はＰｒｏｓｅｐ−Ｇカラム（ミリポア）を用いて抗体を精製した。得られた抗体のうち、特に反応性の高いＦ１１１４−１−２抗体のサブタイプをＺＹＭＥＤ社のラットタイピングキットを用いて決定したところサブタイプはＩｇＧ２ｂ・κであった。
（４）ポリクローナル抗体の作製
ＨＲＣ１２３３７蛋白質に対するウサギポリクローナル抗体を作製するため、調製した各ペプチドキャリア抗原をそれぞれ各４０μｇずつ混合し、さらにフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、ニュージランド白色ウサギ（北山ラベス）メス、２．０−２．４９ｋｇの背部皮内に１ｍＬ投与した。２週間後、抗原をフロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、同様に投与した。１週間後耳静脈より採血し抗血清を調製した。また、同様に精製したＨＲＣ１２３３７を３０μｇ／ｂｏｄｙで複数回投与し、抗血清を作製した。得られた抗血清を（３）に記載のＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓ固定化プレートを用いて抗体価の上昇を確認したところ抗体価の上昇はわずかに認められるものの、免疫組織染色、免疫測定等に使用できるほど高い力価ではなかった。ＨＲＣ１２３３７が哺乳動物においてホモロジーが高く、抗原性が低いことが抗体価の上昇を抑制している原因として考えられたことから、ヒト、ウサギ等の哺乳動物と種が遠く離れているニワトリを用いて抗体の作成を試みた。投与抗原としては実施例３に記載の抗原性が強いヒトのガンマーグロブリンのＦｃを結合した融合蛋白質 ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃを用い、ニワトリの免疫はサワディーテクノロジー株式会社に依頼した。投与開始から６０日後にニワトリを全採血し、抗血清を得た。しかしながら同様に抗体価を測定したところ、免疫組織染色、免疫測定等に使用できるほど高い力価の抗体は得られなかった。
（５）抗ＨＲＣ１２３３７モノクローナル抗体の作製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、６週令）の腹腔に精製したＨＲＣ１２３３７蛋白質（ＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓ又はＨＲＣ１２３３７−Ｆｃ）２０μｇをフロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合して投与した。初回投与２週間後に抗原２０μｇを生食に溶解し、フロインド不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合後腹腔に投与した。１週間後、抗体価の上昇を実施例２記載の方法により確認し最終投与を行った。マウスの腹腔に抗原１００μｇを投与し、３日後、脾臓を摘出した。脾臓よりリンパ球を分離し、Ｐ３×６３−Ａｇ．８．Ｕ・１と１０：１で混合しポリエチレングリコールを用いて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。（３）に記載の方法により抗ＨＲＣ１２３３７抗体産生ウエルのスクリーニングを行い、ＨＲＣ１２３３７と反応したウエルを限界希釈法によりクローニングした。再度スクリーニングを行い抗ＨＲＣ１２３３７モノクローナル抗体（Ｆ１１４４−１−１〜１０）１０種類を得た。ハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ａカラム（ミリポア）を用いて抗体を精製した。しかしながら同様に抗体価を測定したところ、免疫組織染色、免疫測定等に使用できるほど高い力価の抗体は得られなかった。
また、ラットモノクローナル抗体は以下のように作製した。まず、ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃ蛋白質１００μｇを１００μＬの生食に溶解し、フロインド完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ）と等量混合し、Ｗｉｓｔａｒラット８週齢メスの各後足フットパッドに１００μＬづつ投与した。２週間後、腸骨リンパ節を摘出し細胞融合を行った。すなわち、リンパ節よりセルストレイナー（ファルコン）を用いてリンパ球を分離し、ミエローマ細胞（Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４）と混合後、ポリエチレングリコールを用いて安東民衛・千葉丈／著「単クローン抗体実験操作入門」８３ページ、１９９１年（講談社）にしたがって細胞融合を行った。ＨＡＴ培地によりハイブリドーマを選択し、１週間後目的の抗体を産生しているハイブリドーマのスクリーニングを行った。
スクリーニングはＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓ蛋白質を直接プレートに固定化する（３）に記載のＥＬＩＳＡ法で行った。その結果、ＨＲＣ１２３３７蛋白質と反応する抗体を産生しているハイブリドーマを含むウエルを選択し、限界希釈法によりクローニングを行った。１０日後、ＨＲＣ１２３３７蛋白質と結合する抗体を産生するハイブリドーマを同様にスクリーニングした。その結果、ＨＲＣ１２３３７蛋白質と結合するラットモノクローナル抗体Ｆ１１３３を得た。ハイブリドーマを１０％ＦＣＳ／ＲＰＭＩ−１６４０培地（ＧＩＢＣＯ）で培養後、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（ＧＩＢＣＯ）で培養し抗体を産生させ、Ｐｒｏｓｅｐ−Ｇカラム（Ｂｉｏｐｒｏｓｓｅｓｉｎｇ）を用いて抗体を精製した。
実施例５ ＨＲＣ１２３３７のシアル酸含有糖鎖結合活性の確認
実施例３で調製した組換えＨＲＣ１２３３７発現ＣＯＳ細胞をヒト赤血球とＤＭＥＭ＋０．２％ＢＳＡ中で３７℃１時間インキュベートしたのち、結合しなかった赤血球を洗浄して除き、残った細胞を０．２５％ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅで固定しＣＯＳ細胞と赤血球の結合を観察した。対照群として、組換えＨＲＣ１２３３７を発現しないＣＯＳ細胞を用意し、同様に処理した。その結果、組換えＨＲＣ１２３３７発現細胞群では対照群に比較して、顕著なｒｏｓｅｔｔｅｓの形成が認められた。
実施例６ サンドイッチＥＬＩＳＡ系の作製
Ｆ１１３３抗体固相／ペルオキシダーゼ標識Ｆ１１１４−１−２抗体を用いて以下のようにサンドイッチＥＬＩＳＡ系を作製した。まず、中根らの方法（Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，２２，１０８４，１９７４）に従い１ｍｇのペルオキシダーゼ（東洋紡）を蒸留水に溶解し、蒸留水で溶解した１００ｍＭの過ヨウ素酸を添加し２５℃で２０分間反応した。反応終了後１．５％エチレングリコールを添加し２５℃で１０分間反応後１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．４）に対して透析した。Ｆ１１１４−１−２抗体を１０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で透析し、抗体１ｍｇに対して１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）を添加して活性化した１ｍｇのペルオキシダーゼを混合し２５℃で２時間反応した。４ｍｇ／ｍＬの水素化ホウ素ナトリウムを添加しさらに２時間４℃で反応した後、反応液をＰＢＳ（ｐＨ６．４）に透析しペルオキシダーゼ標識Ｆ１１１４−１−２抗体を得た。次に、Ｆ１１３３抗体固相化プレートはＦ１１３３抗体をＰＢＳ（ｐＨ６．４）で１０μｇ／ｍＬに希釈し、イムノプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ、ＮＵＮＣ）の各ウエルに５０μＬ添加し、４５℃で３０分間反応後イオン交換水で５回洗浄し、２０％ブロックエース（雪印乳業）を含むＰＢＳ（ｐＨ６．４）を各ウエルに１００μＬ添加し調製した。標準品は精製ＨＲＣ１２３３７−Ｈｉｓ蛋白質をラット血清で８、１６、３１、６３、１２５、２５０、５００ｎｇ／ｍｌに希釈し調製した。ブランクはラット血清を使用した。測定は、まずプレートのブロッキング剤を廃棄し、調製した標準品及びブランクを２５μｌ分注し、続けて、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）により５μｇ／ｍｌに希釈したペルオキシダーゼ標識Ｆ１１１４−１−２抗体を２５μｌ添加し、４℃で一晩反応させた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む生理食塩水で５回洗浄しテトラメチルベンジジン溶液（ＴＭＢ．ＢｉｏＦＸ）を各ウエルに添加した。室温で２０分間反応後、０．５Ｍ硫酸溶液で反応を停止し、プレート分光光度計（ＮＪ−２１００、日本インターメッド）で４５０ｎｍの吸光度を測定し、標準曲線を作成した。第５図に作成した標準曲線を示した。
実施例７ 各種細胞株培養上清中ＨＲＣ１２３３７蛋白質の測定
各種細胞株（１７３種類）の培養上清中ＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度を実施例６に記載の測定系を用いて測定した。その結果、第６図に示すように培養上清中のＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度はＨｅＬａ、Ａ５４９細胞同様多くの細胞では１０ｎｇ／ｍｌ前後であったが（第６図に示す１５種以外の１５８種の細胞株では、いずれも０〜２０ｎｇ／ｍＬの範囲内であった）、Ｄａｕｄｉ、ＤＧ７５、ＢＡＬＬ細胞等のＢリンパ球系の細胞株では５０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌ程度の濃度のＨＲＣ１２３３７蛋白質が検出された。また、ＣＭＫ細胞に代表される巨核球系細胞でも５０ｎｇ／ｍｌ程度のＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度が検出された。以上の結果はＨＲＣ１２３３７蛋白質が抗体産生に関与するＢリンパ球や血小板産生に関与する巨核球の制御に関与している可能性を示唆している。
実施例８ 各種患者血清中ＨＲＣ１２３３７蛋白質の測定
健常人４０例（男性２０例、女性２０例）及び各種疾患患者（３５疾患、１０３例）を実施例６に記載の測定系を用いて測定した。その結果、健常人のＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度は０〜５０ｎｇ／ｍＬに分布し、平均値は２４ｎｇ／ｍＬであった。男女差は認められなかった。各種患者血清中のＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度は第７図に示すように花粉症、アトピー性皮膚炎で高値傾向を示した。また、血管炎患者血清中ＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度も高値傾向を示した。
各種培養細胞株培養上清中ＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度及び患者血清中ＨＲＣ１２３３７蛋白質濃度測定の結果は、ＨＲＣ１２３３７蛋白質が免疫系及び血液系細胞の分化制御に関与している可能性を示している。特に、花粉症、アトピー性皮膚炎、血管炎に関連することが明らかになった。また、生体内において可溶型のＨＲＣ１２３３７蛋白質が存在することを示すものである。
実施例９ ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙによるＨＲＣ１２３３７発現細胞の解析（１）抗ＨＲＣ１２３３７ペプチド抗体の蛍光染色
実施例４で作製したＦ１１１４−１−２抗体をＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙで用いるために蛍光色素染色を行なった。即ち、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社）を用い、添付のプロトコールに従って、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８ ｄｙｅ標識を行った（以下Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ ４８８標識Ｆ１１１４−１−２をＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２と称する。）。さらにこのＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２抗体の反応性を確認するために、以下の方法でＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析を行なった。実施例３−（２）に示す方法で、Ｃ−ＨＲＣ１２３３７プラスミドをＣＯＳ細胞に導入した後、０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻にて細胞を剥離した。剥離したＣＯＳ形質転換体を１０μｇ／ｍｌのラットＩｇＧと氷上で３０分間インキュベーションした後に、０．１５％ラット血清、０．１５％マウス血清および０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻で２度洗浄した。次にＣＯＳ形質転換体を３％ラット血清、３％マウス血清および０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻の溶液中で、ＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２と氷上で６０分間インキュベーションし、０．１５％ラット血清、０．１５％マウス血清および０．１％ＥＤＴＡを含むＰＢＳ⁻で三度洗浄した後に、ＦＡＣＡＣａｌｉｂｕｒ（日本ベクトンディッキンソン）で解析を行なった。その結果、ＯＧ標識したコントロール抗体に比べ、ＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２で特異的な染色が確認でき、ＨＲＣ１２３３７の細胞膜上への発現が確認された（第８図）。
（２）ヒト末梢血単核球におけるＨＲＣ１２３３７の発現
ヒト末梢血単核球を用い、ＨＲＣ１２３３７を発現する単核球画分を調べた。ＢＩＯ ＷＨＩＴＴＡＫＥＲ社（代理店；三光純薬）より購入したヒト末梢血単核球を５％非動化ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）に懸濁し、１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２４ｗｅｌｌ−ｐｌａｔｅに植え込んだ。その際に、培地のみもしくは５ｎｇ／ｍｌのＰｈｏｒｂｏｌ １２−ｍｙｒｉｓｔａｔｅ １３−ａｃｅｔａｔｅ（以下、ＰＭＡと表記、Ｓｉｇｍａ）と０．５μｇ／ｍｌのＩｏｎｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ）あるいは５μｇ／ｍｌのＬｅｕｃｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（以下ＰＨＡ−Ｌと表記、Ｓｉｇｍａ）を添加した。５％ＣＯ_２、３７℃で１６時間培養後、（１）で作製したＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２抗体を用い、（１）と同様の方法でＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析した。その結果、未刺激の末梢血単核球ではＨＲＣ１２３３７の発現はほとんど確認できないが、ＰＭＡ＋ＩｏｎｏｍｙｃｉｎあるいはＰＨＡ−Ｌで刺激することにより、末梢血単核球でＨＲＣ１２３３７の発現が上昇していた（第９図）。この結果は、実施例２の発現プロファイル解析とも一致している。また、市販のＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）標識細胞表面マーカー（日本ベクトンディッキンソン）とＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２で末梢血単核球を二重染色した結果、ＨＲＣ１２３３７はＣＤ３ポジティブ細胞の一部で発現が確認され、ＰＭＡ＋ＩｏｎｏｍｙｃｉｎあるいはＰＨＡ−Ｌ刺激でその割合が上昇しており、ＨＲＣ１２３３７は活性化したＴ細胞で発現していると思われる。ＨＲＣ１２３３７と相同性を示すＣＤ３３ポジティブ細胞ではＨＲＣ１２３３７の発現は確認されなかった。
実施例１０ 混合リンパ球反応
ＨＲＣ１２３３７のリンパ球機能に対する影響を検討するため、混合リンパ球反応にＨＲＣ１２３３７−Ｆｃを添加し、その影響を検討した。密度勾配遠心法により分取された異なるドナー由来のヒト末梢血単核細胞（三光純薬株式会社ＣＣ−２７０２）を５％非動化ＦＢＳを含むＲＰＭ１１６４０培地（ＳＩＧＭＡ社Ｒ６５０４）にて細胞濃度１ｘ１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍｌに調製した。９６穴プレートにＨＲＣ１２３３７−Ｆｃを終濃度２μｇ／ｍｌになるよう分注し、ここに異なるドナー由来のヒト末梢血単核細胞を１００μｌづつ添加した。ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養後、リンパ球増殖反応をブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡへの取り込みを指標としたＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ，ＢｒｄＵ（ロシュ・ダイアグノスティック社１６４７２２９）にて定量した。その結果、ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃは混合リンパ球反応におけるヒト末梢リンパ球増殖を促進することが示された（第１０図）。同時に培養上清中の各種サイトカイン濃度をＥＬＩＳＡ法（アマシャムファルマシアＲＰＮ２７５２）にて測定した。その結果、ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃ添加時にＩＬ−２濃度上昇が観察された（第１１図）。一方、ＴＮＦα及びＩＬ−８濃度に関してはＨＲＣ１２３３７−Ｆｃ添加による変動は観察されなかった。
実施例１１ トランスジェニックマウスの作製
（１）ｈｒｃ１２３３７遺伝子を含むトランスジェニック作製用ベクターの構築 トランスジェニックマウス作製に用いるプラスミドは以下の方法で構築した。センスプライマー（５’−ＧＣＴ ＣＴＡ ＧＡＡ ＴＧＧ ＡＡＡ ＡＧＴ ＣＣＡ ＴＣＴ ＧＧＣ ＴＧＣ ＴＧＧ ＣＣＴ ＧＣＴ ＴＧＧ−３’）及びアンチセンスプライマー（５’−ＣＧＧ ＧＧＴ ＡＣＣ ＴＣＡ ＣＧＧ ＴＧＡ ＧＣＡ ＣＡＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＣＴ ＣＣ−３’）を合成し、Ｃ−ＨＲＣ１２３３７を鋳型にＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）により９８℃で５秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒のサイクルを２５回繰り返し、ＰＣＲ反応を行った。得られた約１．０ｋｂのＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＫｐｎＩにて消化し、アガロースゲル電気泳動にてＤＮＡ断片を回収した。また発現ベクターｐＭ１１０１（ヒトＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ １αプロモーター及びＳＶ４０ ｐｏｌｙ Ａ付加シグナルを持つ発現ベクター）をＸｂａＩ及びＫｐｎＩにて消化し、前述のＤＮＡ断片をライゲーションした。コンピテントセルＨＢ１０１（ＴＡＫＡＲＡ）を形質転換して定法に従いトランスジェニックマウス作製用プラスミドを構築した。
（２）インジェクション用ＤＮＡの調整
（１）で得たプラスミドベクターを原核生物のプラスミド由来配列を除去するために制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ、ＳａｌＩ、ＢｓａＩで切断し、得られた２．９ｋｂのＤＮＡ断片をインジェクションに用いた。
（３）インジェクション
マイクロマニュピレーターを用い、常法に従い（２）で得られたインジェクション用ＤＮＡをＣ５７Ｂｌａｃｋ／６（以下Ｂ６と記載する）マウスの前核期受精卵雄性前核へ注入した。合計４５３個の受精卵に注入し、正常に生存していた４２８個の卵を偽妊娠０．５日目のＩＣＲ系偽妊娠雌マウス（計１７匹）の輸卵管に移植し、分娩予定日に帝王切開を施し、仔は里親に哺育させた。その結果これらの処置胚から１０９匹の産仔を得た。これらのうち離乳期まで成長した９６匹について導入遺伝子の伝達の有無を確認した。
（４）遺伝子伝達個体の確認
遺伝子伝達個体の確認は、サザーンブロッティングによって以下の通りに行った。
▲１▼ＤＮＡ抽出
（３）で得た遺伝子注入胚由来の産仔９６匹のマウスについて生後３週目に尾部の先端５ｍｍを切断した。切断した尾部より以下の手順でＤＮＡを抽出した。尾部は０．５ｍｌ組織溶解液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ，、０．５％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）中で一晩処理し、溶解させた。これをフェノール、クロロホルム処理を行なった後にイソプロパノールを用いてＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを７０％エタノールでリンスし、ＴＥに溶解した。
▲２▼プローブの作製
発現ベクターｐＭ１１０１のＥｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒのプロモーター領域に相当する部位を制限酵素ＥｃｏＴ２２ＩおよびＸｂａ Ｉで切断した。得られたＤＮＡ断片はジーンイメージ（アマシャムファルマシア社製）をプロトコルに従って用いてフルオレセイン標識しプローブ（以下便宜上ＥＦプローブと呼称する）とした。
▲３▼ブロッティングおよび検出
▲１▼で得たゲノミックＤＮＡを以下の手順で泳動、ブロッティングおよび検出を行なった。
ａ．ゲノムＤＮＡ５μｇを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ処理（３７℃、３時間）
ｂ．制限酵素消化ＤＮＡ２．５μｇを０．５％のアガロースゲルＴＡＥバッファー中で電気泳動（５０Ｖ、１時間）
ｃ．アガロースゲルをアルカリ液（０．４Ｍ ＮａＯＨ、０．６Ｍ ＮａＣｌ）で処理（２０分×２回）
ｄ．アガロースゲルにナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎアマシャム社）をのせアルカリ液でブロッティング（約３時間）
ｅ．メンブレンを２×ＳＳＣでリンス
ｆ．メンブレンをハイブリバッグ（コスモバイオ社製）に入れハイブリダイゼーションバッファー（５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５％デキストラン硫酸、１／２０量のブロッキング試薬（アマシャム社ジーンイメージキット添付）、１００μｇ／ｍｌ ニシン精子ＤＮＡ）にてプレハイブリダイゼイション（６０℃、２０分）
ｇ．ハイブリダイゼーションバッファーに１μｌ／ｍｌのプローブを加えてハイブリダイゼイション（６０℃ Ｏ／Ｎ）
ｈ．メンブレンを１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃にて２０分間、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃にて３０分間洗浄
ｉ．抗フルオレセイン抗体アルカリフォスファターゼ標識（ジーンイメージキット）を０．５％ＢＳＡを含むバッファーＡ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５））にて５０００倍希釈し室温で１時間処理
ｊ．メンブレンを０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含むバッファーＡにて室温で１０分間洗浄（３回）
ｋ．メンブレンをバッファーＡにて室温でリンス
ｌ．メンブレンをハイブリバッグに入れＣＤＰ−Ｓｔａｒを加え、フィルムに感光させる。
遺伝子が導入されている個体では約２．９ｋｂのバンドが検出される。
これらの解析の結果、遺伝子の導入が認められたものは２個体であった。産仔数に対する生存遺伝子導入個体数は通常より極めて低く、ｈｒｃ１２３３７遺伝子産物の胎児期の違所性発現は胎生致死をもたらす可能性が高いことが示唆された。
発明の効果
本発明のＨＲＣ１２３３７は、免疫機能の異常による疾患の発症あるいは進行に対してその原因となり得る蛋白質であり、自己免疫疾患、免疫不全、アレルギー性疾患、血管炎・肝炎・敗血性ショックなとの炎症性疾患、腫瘍等の予防あるいは治療のための医薬品の開発において、極めて有用である。
また、遺伝子ｈｒｃ１２３３７は、アンチセンス医薬品として、また遺伝子治療において利用することができ、蛋白質ＨＲＣ１２３３７は、それ自体あるいはその可溶性断片（細胞外領域や各ドメイン）を作製することにより可溶性蛋白医薬品として有用である。さらに、ＨＲＣ１２３３７またはその断片に反応性を有する抗体及びその抗体の一部は、生体内でのＨＲＣ１２３３７機能を制御する抗体医薬品として有用である。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
第１図は、シアロアドヘシンファミリーの構造図を示す。Ｓ−Ｓはジスルフィド結合による架橋を表す。
第２図は、ＨＲＣ１２３３７と公知のシアロアドヘシンファミリーとのアライメント結果を示す。図中、左端の表示は蛋白質をＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号で表したものであり、ＮＰ＿００１７６３はヒトＣＤ３３ ａｎｔｉｇｅｎを、ＮＰ＿０５７６２７はヒトＤ−ｓｉｇｌｅｃ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒを、ＣＡＢ５１１２７はヒトＱＡ７９ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎを、ＡＡＤ５０９７８はヒトｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ ｂｉｎｄｉｎｇ Ｉｇ−ｌｉｋｅ ｌｅｃｔｉｎ−５を表す。
第３図は、ＨＲＣ１２３３７の構造の模式図を示す。図中、シアル酸結合モチーフは、シアル酸含有糖鎖結合に必須なアルギニン残基が保存されていることを示す。
第４図は、ｈｒｃ１２３３７遺伝子のヒト臓器および各種細胞での発現プロファイルを表す。
第５図は、抗ＨＲＣ１２３３７抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系の標準曲線を示したものである。
第６図は、抗ＨＲＣ１２３３７抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて各種細胞株培養上清中のＨＲＣ１２３３７濃度の測定結果を示したものである。
第７図は、抗ＨＲＣ１２３３７抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ系を用いて各種患者血清中のＨＲＣ１２３３７濃度の測定結果を示したものである。
第８図は、ＯＧ標識抗ＨＲＣ１２３３７抗体によるＣＯＳ細胞形質転換体のＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ解析結果を示す。白抜きの領域がＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２抗体で染色した結果を示し、塗りつぶしの領域はＯＧ標識したコントロール抗体での染色結果を示す。
第９図は、ヒト末梢血単核球でのＨＲＣ１２３３７発現をＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙにて解析した結果を示す。塗りつぶしの領域は未刺激の末梢血単核球をＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２抗体で染色した結果を示し、白抜き実線で示される領域はＰＭＡ＋Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎで刺激した末梢血単核球をＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２抗体で染色した結果を、白抜き点線で示される領域はＰＨＡ−Ｌで刺激した末梢血単核球をＯＧ標識Ｆ１１１４−１−２抗体で染色した結果をそれぞれ示す。
第１０図は、ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃの混合リンパ球反応に対する作用を混合リンパ球反応時のブロモデオキシウリジンの細胞ＤＮＡへの取り込みを指標に測定したものである。
第１１図は、ＨＲＣ１２３３７−Ｆｃの混合リンパ球反応に対する作用を混合リンパ球反応時の培養上清中ＩＬ−２濃度を指標に測定したものである。

Claims (17)

1. 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
   （ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｂ）配列番号１のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ細胞接着分子をコードするＤＮＡ。
2. 請求項１に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質。
3. 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
   （ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
   （ｂ）配列番号２のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる細胞接着分子。
4. 以下の（ａ）または（ｂ）のＤＮＡ；
   （ａ）配列番号４に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｂ）配列番号４のＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシアル酸含有糖鎖結合活性、リンパ球増殖活性およびＩＬ−２産生増強活性から選ばれる少くとも一つの活性を有する蛋白質をコードするＤＮＡ。
5. 請求項４に記載のＤＮＡにコードされる蛋白質。
6. 以下の（ａ）または（ｂ）の蛋白質；
   （ａ）配列番号５に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質；
   （ｂ）配列番号５のアミノ酸配列においてアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつシアル酸含有糖鎖結合活性、リンパ球増殖活性およびＩＬ−２産生増強活性から選ばれる少くとも一つの活性を有する蛋白質。
7. 請求項６に記載の蛋白質を含んでなる融合蛋白質。
8. 請求項１に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
9. 請求項８に記載の組換えベクターにより形質転換された形質転換細胞。
10. 請求項２または請求項３に記載の蛋白質の発現を抑制するアンチセンス核酸。
11. 塩基配列が、請求項１に記載のＤＮＡの核酸の全部または一部に相補する配列である、請求項１０に記載のアンチセンス核酸。
12. 請求項２または請求項３に記載の蛋白質もしくはその部分ペプチドに対する抗体。
13. 請求項２または請求項３に記載の蛋白質あるいは該蛋白質を発現している形質転換細胞と被験物質とを接触させることを特徴とする、該蛋白質の活性調節作用を示す物質の検索方法。
14. 請求項８に記載の組換えベクターまたは請求項９に記載の形質転換細胞と被験物質とを接触させることを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡの発現調節作用を示す物質の検索方法。
15. ｈｒｃ１２３３７遺伝子組換え非ヒト動物。
16. 請求項１２に記載の抗体を用いることを特徴とする、被験試料中の請求項２または請求項３に記載の蛋白質の測定方法。
17. 請求項１２に記載の抗体を含有すること特徴とする、被験試料中の請求項２または請求項３に記載の蛋白質を測定するための試薬またはキット。

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