CN110913905A

CN110913905A - 不产生生长障碍的小儿骨质疏松症治疗药

Info

Publication number: CN110913905A
Application number: CN201880043731.0A
Authority: CN
Inventors: 高畑雅彦; 佐藤大; 太田昌博; 清水智弘; 福田千惠; 津田英资
Original assignee: Hokkaido University NUC; Daiichi Sankyo Co Ltd
Current assignee: Hokkaido University NUC; Daiichi Sankyo Co Ltd
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2020-03-24
Also published as: JP7181535B2; WO2019004487A1; EP3646885A4; JPWO2019004487A1; EP3646885A1; US20200115446A1

Abstract

本发明的目的在于，提供一种在给药对象中不产生骨生长障碍的、用于治疗和/或预防小儿骨质疏松症的药物。一种用于治疗和/或预防小儿骨质疏松症的药物组合物，其包含与Siglec‑15结合、且具有抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所引起的骨吸收的活性的抗体或其功能性片段。

Description

不产生生长障碍的小儿骨质疏松症治疗药

技术领域

本发明涉及用于治疗和/或预防小儿骨质疏松症的抗Siglec-15抗体的应用。

背景技术

骨质疏松症是由于骨量减少、骨质异常从而骨的强度下降、表现出易骨折性的疾病，主要发生于绝经后女性、老年人。但是，也有时由于药剂、疾病而在生长期的小儿中发生骨质疏松症。

小儿骨质疏松症的发病例中最常见的是由给药类固醇药物、免疫抑制剂等药剂导致的。在以肾病综合征为代表的炎症性疾病的治疗中，在给药了这些药剂的小儿患者中，已经报告了多个发病例。特别是对于接受类固醇大量给药疗法的小儿患者而言，有时发生显著的骨脆化，引发骨痛、脊椎多发骨折。将由给药类固醇药物引起的骨质疏松症称为糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis：GIO)。

此外，作为小儿骨质疏松症的原因，可列举成骨不全症(指定疑难病，发生频率为2～3万分之一)等先天性疾病所致的小儿骨质疏松症。这种情况下，有时会引起由反复骨折、骨变形导致的运动发育滞后。

若由于小儿骨质疏松症而多发脊椎压迫性骨折、四肢骨骨折，则存在骨骼变形、继而终生遗留运动障碍或躯干支撑功能障碍的情况。另外，由于会反复发生微小骨折，还存在慢性骨痛的烦恼。

目前，正在对骨质疏松症患者实施含有骨吸收抑制剂的治疗药物的给药。另外已确认，通过对成骨不全症患者给药双膦酸盐制剂(骨吸收抑制剂)，骨密度、骨痛等得到改善，小儿中进行作为双膦酸盐制剂的帕米膦酸盐的周期性静脉内给药，并且在日本自2014年起已纳入保险。

但是，在使用以双膦酸盐制剂为代表的强效骨吸收抑制剂的治疗中，存在生长障碍、肾损伤、与长期内服相伴随的骨质异常、尿路结石等的发病风险。因此，对于将这类制剂长期用于生长期的小儿，担忧发生生长障碍、骨结构/骨质异常等。目前，对于小儿骨质疏松症患者来说，可以说并不存在能够安全使用的骨吸收抑制剂。

唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Sialic-acid-binding immunoglobulin-likelectin，以下称为“Siglec”。)为识别并结合含有唾液酸的糖链的I型膜蛋白家族。属于该家族的Siglec-15从鱼类到人类中在进化上高度保守，已确认在人脾脏及淋巴节中在树突细胞/巨噬细胞系的细胞中强烈表达。另外确认到，Siglec-15的表达随着破骨细胞的分化、成熟而亢进，若使用RNA干扰来下调表达，则可抑制破骨细胞的分化(专利文献1)。还报道了抗Siglec-15抗体可以抑制破骨细胞的形成、破骨细胞所致的骨吸收，可作为骨代谢异常疾病的治疗剂和/或预防剂使用(专利文献2)。

但是，抗Siglec-15抗体对小儿骨质疏松症的作用/效果到目前为止尚不明确。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2007/093042

专利文献2：WO2009/048072

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的在于，提供即使给药于小儿骨质疏松患者、在给药对象中也不产生生长障碍、可以治疗和/或预防小儿骨质疏松症的药物。

用于解决问题的方法

本发明人为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现，通过给药与Siglec-15结合的抗体，在给药对象中会带来骨量、骨密度的改善而并不会产生骨生长的障碍，因此与Siglec-15结合的抗体作为骨生长显著的处于生长期的小儿的骨质疏松症的治疗药及预防药有用，从而完成了本发明。

即，本发明包含以下发明。

[1]一种用于治疗和/或预防小儿骨质疏松症的药物组合物，其包含与Siglec-15结合、且具有抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所致的骨吸收的活性的抗体或其功能性片段。

[2]根据[1]的药物组合物，其中，上述抗体为单克隆抗体。

[3]根据[1]的药物组合物，其中，上述抗体包含重链和轻链，所述重链包含由序列表的序列号12所示的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列表的序列号13所示的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列表的序列号14所示的氨基酸序列构成的CDRH3，所述轻链包含由序列表的序列号15所示的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列表的序列号16所示的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列表的序列号17所示的氨基酸序列构成的CDRL3。

[4]根据[1]～[3]中任一项的药物组合物，其中，上述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

[5]根据[1]～[4]中任一项的药物组合物，其中，上述抗体的功能性片段为Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv或scFv。

[6]一种小儿骨质疏松症的治疗和/或预防方法，其包括给药[1]～[5]中任一项的药物组合物的步骤。

另外，本发明还包含以下发明。

[2]根据[1]的药物组合物，其不会产生生长障碍、骨结构异常和/或骨质异常。

[3]根据[1]或[2]的药物组合物，其中，小儿骨质疏松症为由于药剂给药而发病的小儿骨质疏松症。

[4]根据[1]或[2]的药物组合物，其中，小儿骨质疏松症为小儿糖皮质激素性骨质疏松症。

[5]根据[1]～[4]中任一项的药物组合物，其中，上述抗体为单克隆抗体。

[6]根据[1]～[4]中任一项的药物组合物，其中，上述抗体包含重链和轻链，所述重链包含由序列表的序列号12所示的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列表的序列号13所示的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列表的序列号14所示的氨基酸序列构成的CDRH3，所述轻链包含由序列表的序列号15所示的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列表的序列号16所示的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列表的序列号17所示的氨基酸序列构成的CDRL3。

[7]根据[1]～[6]中任一项的药物组合物，其中，上述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

[8]根据[1]～[7]中任一项的药物组合物，其中，上述抗体的功能性片段为Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv或scFv。

[9]一种小儿骨质疏松症的治疗和/或预防方法，其包括给药[1]～[8]中任一项的药物组合物的步骤。

[10]与Siglec-15结合、且具有抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所致的骨吸收的活性的抗体或其功能性片段在制造用于治疗和/或预防小儿骨质疏松症的药物组合物中的应用。

[11]与Siglec-15结合、且具有抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所致的骨吸收的活性的抗体或其功能性片段，其在小儿骨质疏松症的治疗和/或预防方法中使用。

本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2017-129129号的说明书和/或附图中记载的内容。

本说明书中引用的全部出版物、专利及专利申请直接以参考形式并入本说明书中。

发明效果

根据本发明，可以提供即使给药于小儿骨质疏松患者在给药对象中也不产生生长障碍、可以治疗和/或预防小儿骨质疏松症的药物。

附图说明

图1示出实验中的各种操作的实施时间表。

图2是示出对于对照组(Ctl)、抗Siglec-15抗体给药组(Sig-15 Ab)、双膦酸盐给药组(ALN)、在给药观察期纵向测量头体长、股骨长的结果的图。(A)示出给药观察期结束时的各动物的头体长及股骨长的测定结果。(B)示出给药观察期(6～12周龄)内各动物的头体长及股骨长的变化量。＊：p＜0.05(vs.Ctl)。

图3是示出对于对照组(Ctl)、抗Siglec-15抗体给药组(Sig-15 Ab)、双膦酸盐给药组(ALN)、在给药开始前和给药6周后(12周龄时)采集的血液样品中的骨形成标志物(血清骨钙素)和骨吸收标志物(血清TRACP-5b)的测定结果的图。(A)示出给药观察期结束时(12周龄时)的、各动物的血清骨钙素量及血清TRACP-5b量的测定结果。(B)示出给药观察期(6～12周龄)内各动物的血清骨钙素量及血清TRACP-5b量的变化量。＊：p＜0.05(vs.Ctl)。

图4-1示出对于对照组(Ctl)、抗Siglec-15抗体给药组(Sig-15 Ab)、双膦酸盐给药组(ALN)、组织学分析药剂对生长的影响的结果。(A)示出12周龄时的胫骨近端部的3D-CT图像的冠状断面照片。(B)示出由在安乐死7天前及安乐死3天前用钙黄绿素标记而得到的胫骨近端部组织制作的未脱钙组织标本的Villanueva染色的结果。箭头(上侧)示出安乐死3天前标记的区域，箭头(下侧)示出安乐死7天前标记的区域。(C)示出12周龄时的生长软骨及紧挨生长软骨下方的初级海绵骨区域的组织标本的番红O染色(对酸性粘多糖类进行染色)的结果。

图4-2示出对于对照组(Ctl)、抗Siglec-15抗体给药组(Sig-15 Ab)、双膦酸盐给药组(ALN)、组织学分析药剂对生长的影响的结果。(D)示出12周龄时的胫骨近端部初级海绵骨区域的组织标本的TRACP染色及甲基绿染色的结果。(E)示出使用未脱钙组织标本测量的骨生长速度及生长软骨宽度，以及(F)示出初级海绵骨区域的破骨细胞面相对于骨表面(Oc.Pm/B.Pm(％))的测定结果。＊：p＜0.05(vs.Ctl)。

图5-1示出对于对照组(Ctl)、抗Siglec-15抗体给药组(Sig-15 Ab)、双膦酸盐给药组(ALN)、使用腰椎分析药剂对骨量及力学强度的影响的结果。(A)示出12周龄时的第5腰椎的3D-CT图像的冠状断面照片。(B)示出12周龄时的第5腰椎的初级及次级海绵骨区域、椎体腹侧的组织标本的TRACP染色及甲基绿染色的结果。

图5-2示出对于对照组(Ctl)、抗Siglec-15抗体给药组(Sig-15 Ab)、双膦酸盐给药组(ALN)、使用腰椎分析药剂对骨量及力学强度的影响的结果。(C)示出12周龄时的第1～第3腰椎的使用DXA法的骨密度测定结果。(D)示出12周龄时的第5腰椎的初级海绵骨区域及次级海绵骨区域的破骨细胞面相对于骨表面(Oc.Pm/B.Pm(％))的测定结果。(E)示出12周龄时的腰椎椎体的压缩力学试验结果(最大断裂强度、刚性、韧性)(第2、3、4、6椎体的平均值)。＊：p＜0.05(vs.Ctl)。

图6-1示出对于对照组(Ctl)、抗Siglec-15抗体给药组(Sig-15 Ab)、双膦酸盐给药组(ALN)、使用长骨分析药剂对骨量及力学强度的影响的结果。(A-1)示出12周龄时的股骨远端部的3D-CT图像的冠状断面照片。(A-2)示出12周龄时的同一部位的使用DXA法的骨密度测定结果。(B-1)示出12周龄时的胫骨近端部的次级海绵骨区域的组织标本的TRACP染色及甲基绿染色的结果。(B-2)示出12周龄时的同一部位的破骨细胞面相对于骨表面(Oc.Pm/B.Pm(％))的测定结果。

图6-2示出对于对照组(Ctl)、抗Siglec-15抗体给药组(Sig-15 Ab)、双膦酸盐给药组(ALN)、使用长骨分析药剂对骨量及力学强度的影响的结果。(C)示出12周龄时的股骨远端骨干端部的压缩力学试验结果(最大断裂强度、刚性、韧性)(第2、3、4、6椎体的平均值)。＊：p＜0.05(vs.Ctl)。

图7示出实验中的各种操作的实施时间表。

图8是示出对于Sham组(假手术组)、GC组(Vehicle)、GC+Siglec-15Ab组(将抗Siglec-15抗体以低用量(low)或高用量(high)给药)、GC+ALN组(将ALN以低用量(low)或高用量(high)给药)、在给药观察期纵向测量体重、头体长、股骨长的结果的图。(A)示出给药观察期及结束时的各动物的(i)体重、(ii)头体长及(iii)股骨长的测定结果。(B)示出给药观察期(6～12周龄)内各动物的(i)体重、(ii)头体长及(iii)股骨长的变化量。#；p＜0.05(vs.sham组)。

图9是示出对于Sham组、GC组(Vehicle)、GC+Siglec-15Ab组(将抗Siglec-15抗体以低用量(low)或高用量(high)给药)、GC+ALN组(将ALN以低用量(low)或高用量(high)给药)、在给药开始前和给药6周后(12周龄时)采集的血液样品中的骨吸收标志物(血清TRACP-5b)和骨形成标志物(血清骨钙素)的测定结果的图。(A)示出给药观察期结束时(12周龄时)的各动物的血清TRACP-5b量及血清骨钙素量的测定结果。(B)以自给药开始时(6周龄)的变化率示出给药观察期(6～12周龄)内各动物的血清TRACP-5b量及血清骨钙素量的变化量。#；p＜0.05(vs.Sham组)、＊；p＜0.05(vs.GC组)。

图10-1示出对于Sham组、GC组(Vehicle)、GC+Siglec-15Ab组(将抗Siglec-15抗体以低用量(low)或高用量(high)给药)、GC+ALN组(将ALN以低用量(low)或高用量(high)给药)、组织学分析药剂对生长的影响的结果。(A)示出12周龄时的胫骨近端部的3D-CT图像的冠状断面照片。(B)示出由在安乐死5天前用四环素染色及在安乐死2天前用钙黄绿素标记而得到的胫骨近端部组织制作的未脱钙组织标本的Villanueva染色的结果。箭头(上侧)示出安乐死2天前标记的区域，三角形(下侧)示出安乐死5天前标记的区域。(C)示出12周龄时的生长软骨及紧挨生长软骨下方的初级海绵骨区域的组织标本的番红O色(对酸性粘多糖类进行染色)的结果。

图10-2示出对于Sham组、GC组(Vehicle)、GC+Siglec-15Ab组(将抗Siglec-15抗体以低用量(low)或高用量(high)给药)、GC+ALN组(将ALN以低用量(low)或高用量(high)给药)、组织学分析药剂对生长的影响的结果。(D)示出12周龄时的胫骨近端部初级海绵骨区域的组织标本的TRACP染色及甲基绿染色的结果。示出使用未脱钙组织标本测量的(E)生长软骨宽度、(F)骨生长速度、以及(G)初级海绵骨区域的破骨细胞面相对于骨表面(Oc.Pm/B.Pm(％))的测定结果。#；p＜0.05(vs.Sham组)、＊；p＜0.05(vs.GC组)。

图11-1示出对于Sham组、GC组(Vehicle)、GC+Siglec-15Ab组(将抗Siglec-15抗体以低用量(low)或高用量(high)给药)、GC+ALN组(将ALN以低用量(low)或高用量(high)给药)、使用长骨分析药剂对骨量及力学强度的影响的结果。(A)示出12周龄时的股骨远端部的3D-CT图像的冠状断面照片。矩形所包围的区域表示次级海绵骨区域。(B)示出12周龄时的上述次级海绵骨区域的骨量BV/TV(％)、骨小梁宽度Tb.Th(μm)及骨小梁数Tb.N(N/mm)的测定结果。(C)示出使用DXA法的股骨远端部的骨密度BMD的测定结果。#；p＜0.05(vs.Sham组)、＊；p＜0.05(vs.GC组)。

图11-2示出对于Sham组、GC组(Vehicle)、GC+Siglec-15Ab组(将抗Siglec-15抗体以低用量(low)或高用量(high)给药)、GC+ALN组(将ALN以低用量(low)或高用量(high)给药)、(D)12周龄时的股骨远端骨干端部的压缩力学试验的结果(最大断裂强度、刚性、弹性模量、韧性)。#；p＜0.05(vs.Sham组)、＊；p＜0.05(vs.GC组)。

具体实施方式

本说明书中，“基因”这一术语不仅包括DNA，而且还包括mRNA、cDNA及cRNA。

本说明书中，“多核苷酸”这一术语与核酸以相同的含义使用，还包括DNA、RNA、探针、寡核苷酸及引物。

本明细书中，“多肽”和“蛋白质”无差别地使用。

本说明书中，“细胞”也包括动物个体内的细胞、培养细胞。

本说明书中，“Siglec-15”与Siglec-15蛋白以相同的含义使用。

本说明书中，“破骨细胞的形成”与“破骨细胞的分化”或“破骨细胞的成熟”以相同的含义使用。

本说明书中的“抗体的功能性片段”是指具有与抗原结合的活性的、抗体的部分片段，包括Fab、F(ab’)₂、scFv等。另外，在还原条件下处理F(ab’)₂而得的作为抗体的可变区的一价片段的Fab’也包括在抗体的功能性片段中。但是只要具有与抗原结合的能力则不限于这些分子。另外，这些功能性片段中不仅包括用合适的酶处理抗体蛋白的全长分子而得的片段，还包括使用经基因工程改造的抗体基因在合适的宿主细胞中产生的蛋白质。

本说明书中的“表位”是指特定的抗Siglec-15抗体所结合的Siglec-15的部分肽。上述的作为Siglec-15的部分肽的表位可以通过免疫分析法等本领域技术人员熟知的方法来确定，例如可以通过以下的方法来进行。制作Siglec-15的各种部分结构。在制作部分结构时，可以使用公知的寡肽合成技术。例如，在使用本领域技术人员已知的基因重组技术制作从Siglec-15的C末端或N末端起以合适的长度依次缩短的一系列多肽后，研究抗体对它们的反应性而确定大致的识别部位，然后合成更短的肽并研究与这些肽的反应性，从而可以确定表位。若第二抗Siglec-15抗体与第一抗Siglec-15抗体所结合的部分肽结合，则可以判定第一抗Siglec-15抗体和第二抗Siglec-15抗体具有共同的表位。另外，通过确认第二抗Siglec-15抗体和第一抗Siglec-15抗体竞争地与Siglec-15结合(即，第二抗体妨碍第一抗体与Siglec-15的结合)这一点，即使不能确定具体的表位序列，但也可以判定第一抗体和第二抗体具有共同的表位。进一步地，在第一抗体和第二抗体与共同的表位结合且第一抗体具有抗原中和活性等特殊的效果时，可以期待第二抗体也具有同样的活性。

本发明中，“在严谨条件下杂交”是指在市售的杂交溶液ExpressHybHybridization Solution(TAKARA BIO INC.)中、在68℃下杂交，或者在以下条件或与其同等的条件下杂交，所述条件是指在使用固定有DNA的滤器在0.7～1.0M的NaCl存在下、在68℃下进行杂交后能够通过使用0.1～2倍浓度的SSC溶液(1倍浓度SSC包含150mM NaCl、15mM柠檬酸钠)在68℃下洗涤来鉴定的条件。

1.Siglec-15

Siglec-15基因是已确认在巨细胞瘤(Giant cell tumor；GCT)中表达量显著增加的基因，另外，是已确认在来自单核细胞的细胞株向破骨细胞分化时表达量增加的基因(WO2009/048072)。

本发明中使用的Siglec-15可以从人、非人哺乳动物(例如豚鼠、大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、牛、猴等)或鸡的单核细胞或骨髓细胞直接纯化而使用，或者制备上述细胞的细胞膜级分而使用，另外可以通过体外合成Siglec-15或通过基因操作使其在宿主细胞中产生而得到。基因操作具体为：将Siglec-15cDNA整合到可使其表达的载体中，然后在包含转录和翻译所需要的酶、底物及能量物质的溶液中进行合成、或转化其它原核生物或真核生物宿主细胞而使其表达Siglec-15，由此可以得到该蛋白质。

人Siglec-15的cDNA的核苷酸序列以登录号：NM＿213602登录于GenBank，也示于序列表的序列号1，其氨基酸序列示于序列表的序列号2。小鼠Siglec-15的cDNA的核苷酸序列以登录号：XM＿884636登录于GenBank，也示于序列表的序列号3，其氨基酸序列示于序列表的序列号4。去除信号序列的成熟人Siglec-15相当于由序列号2所示的氨基酸序列的第21位至328位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。另外，去除了信号序列的小鼠Siglec-15相当于由序列号4所示的氨基酸序列的第21位至第341位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。需要说明的是，Siglec-15有时被称为CD33 antigen-like 3、CD33 molecule-like 3、CD33-like 3或CD33L3，这些都表示相同的分子。

Siglec-15的cDNA可以通过所谓的PCR法获得，例如以表达Siglec-15的cDNA的cDNA文库为模板，使用特异性扩增Siglec-15的cDNA的引物进行聚合酶链式反应(以下称为“PCR”)(Saiki，R.K.，et al.，Science，(1988)239，487-49)。

需要说明的是，Siglec-15的cDNA中也包括：与由与选自序列表的序列号1及3中的至少任一者所示的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码与Siglec-15具有同等生物活性的蛋白质的多核苷酸。另外，Siglec-15的cDNA中也包括：由人或小鼠Siglec-15基因座转录的剪接变体或与其在严谨条件下杂交的多核苷酸、并且该多核苷酸编码与Siglec-15具有同等的生物活性的蛋白质。

另外，Siglec-15中还包括由下述氨基酸序列构成且具有与Siglec-15同等的生物活性的蛋白质，所述氨基酸序列为：在选自序列表的序列号2及4中的至少任一者所示的氨基酸序列或从这些序列中去除了信号序列的氨基酸序列中置换、缺失或添加1个或几个氨基酸而成的氨基酸序列。另外，Siglec-15中还包括由下述氨基酸序列构成且具有与Siglec-15同等的生物活性的蛋白质，所述氨基酸序列为：由人或Siglec-15基因座转录的剪接变体所编码的氨基酸序列或在该氨基酸序列中置换、缺失或添加1个或几个氨基酸而成的氨基酸序列。

2.抗Siglec-15抗体的制造

本发明的针对Siglec-15的抗体可以如下得到：使用常规方法，用Siglec-15或选自Siglec-15的氨基酸序列中的任意多肽对动物进行免疫，收集、纯化生物体内产生的抗体，从而得到。成为抗原的Siglec-15的生物种属不限于人，也可以用来自小鼠、大鼠等人以外的动物的Siglec-15对动物进行免疫。这种情况下，可以通过试验所获得的与异源Siglec-15结合的抗体与人Siglec-15的交叉性来筛选能应用于人类疾病的抗体。

另外，还可以按照公知的方法(例如Kohler and Milstein，Nature(1975)256，p.495-497、Kennet，R.ed.，Monoclonal Antibody，p.365-367，Prenum Press，N.Y.(1980))，使产生针对Siglec-15的抗体的抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合来建立杂交瘤并得到单克隆抗体。

成为抗原的Siglec-15可以通过利用基因操作使宿主细胞产生Siglec-15基因来得到。

具体而言，可以制作能表达Siglec-15基因的载体，将其导入宿主细胞中并使该基因表达，对表达的Siglec-15进行纯化。以下将具体地说明针对Siglec-15的抗体的获得方法。需要说明的是，以下的关于基因操作的各操作只要没有特别声明则均可以依据“Molecular Cloning第四版”(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.及Maniatis，T.著，Cold SpringHarbor Laboratory Press于2012年出版)中记载的方法来进行。

(1)抗原的制备

作为用于制作抗Siglec-15抗体的抗原，可以列举：Siglec-15；或由其至少6个连续的部分氨基酸序列构成的多肽；或在这些上添加有任意的氨基酸序列、载体的衍生物。作为这样的抗原，例如可以从由以下的(a)～(i)所示的氨基酸序列构成的多肽中选择：

(a)序列表的序列号2所示的氨基酸序列；

(b)由序列表的序列号2所示的氨基酸序列的第21位至第328位的氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(c)由序列表的序列号2所示的氨基酸序列的第1位至第260位的氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(d)由序列表的序列号2所示的氨基酸序列的第21位至第260位的氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(e)序列表的序列号4所示的氨基酸序列；

(f)由序列表的序列号4所示的氨基酸序列的第21位至第341位的氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(g)由序列表的序列号4所示的氨基酸序列的第1位至第258位的氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(h)由序列表的序列号4所示的氨基酸序列的第21位至第258位的氨基酸残基构成的氨基酸序列；

(i)在(a)～(h)所记载的氨基酸序列中伴有1个～几个氨基酸残基的置换、缺失或添加的氨基酸序列。

另外，作为抗原，可以利用由以下的(j)～(n)所示的核苷酸序列所编码的氨基酸序列构成的多肽：

(j)序列号1所示的核苷酸序列；

(k)序列号3所示的核苷酸序列；

(l)序列号5所示的核苷酸序列；

(m)序列号6所示的核苷酸序列；

(n)具有与由与(j)～(m)中记载的核苷酸序列互补的核苷酸序列构成的多核苷酸在严谨条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列。

需要说明的是，由序列表的序列号2中记载氨基酸序列的第1位至第20位的氨基酸残基构成的多肽相当于人Siglec-15的信号肽，由第21位至第260位的氨基酸残基构成的多肽相当于人Siglec-15的成熟蛋白的胞外区域。另外，由序列表的序列号4中记载的氨基酸序列的第1位至第20位的氨基酸残基构成的多肽相当于小鼠Siglec-15的信号肽，由第21位至第258位的氨基酸残基构成的多肽相当于小鼠Siglec-15的成熟蛋白的胞外区域。另外，序列号6所示的核苷酸序列编码由序列号1所示的核苷酸序列编码的人Siglec-15的胞外区域，序列号5所示的核苷酸序列编码由序列号3所示的核苷酸序列编码的小鼠Siglec-15的胞外区域。

可以由人的肿瘤组织或肿瘤细胞直接纯化Siglec-15并使用，另外，可以体外合成Siglec-15或通过基因操作使宿主细胞产生Siglec-15而得到。

基因操作具体为：将Siglec-15的cDNA整合到可使其表达的载体中，然后在包含转录和翻译所需要的酶、底物及能量物质的溶液中进行合成、或转化其它原核生物或真核生物宿主细胞而使其表达Siglec-15，从而可以得到抗原。

另外，通过使合适的宿主/载体系统表达将作为膜蛋白的Siglec-15的胞外区域和抗体的恒定区连接而成的融合蛋白，还可以以分泌蛋白形式得到抗原。

Siglec-15的cDNA可以通过例如以表达Siglec-15的cDNA的cDNA文库为模板、使用特异性扩增Siglec-15cDNA的引物进行聚合酶链式反应(以下称为“PCR”)(Saiki，R.K.，etal.Science(1988)239，p.487-489)的所谓的PCR法获得。

作为多肽的体外(in vitro)合成，可列举例如Roche Diagnostics公司制的快速翻译系统(RTS)，但不限定于此。

作为原核细胞的宿主，可列举例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)等。为了使目标基因转化到这些宿主细胞内，可以用包含来自适合于宿主的种属的复制子、即复制起点和调控序列的质粒载体转化宿主细胞。另外，作为载体，优选具有可以对转化细胞赋予表型(Phenotype)选择性的序列的载体。

真核细胞的宿主细胞包括脊椎动物、昆虫、酵母等的细胞，作为脊椎动物细胞，经常使用例如作为猴细胞的COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞、ATCCCCL-61)的二氢叶酸还原酶缺陷株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77，p.4126-4220)等，但不限于这些。

按照上述而得到的转化体可以按照常规方法进行培养，通过该培养，在细胞内或细胞外产生目标多肽。

作为该培养中使用的培养基，可以根据所采用的宿主细胞适当选择惯用的各种培养基，若为大肠杆菌，例如可以向LB培养基中根据需要添加氨苄青霉素等抗生素、IPMG后使用。

对于通过上述培养而在转化体的细胞内或细胞外产生的重组蛋白，可以通过利用该蛋白质的物理性质、化学性质等的各种公知的分离操作方法来进行分离、纯化。

作为该方法，具体可例示例如：利用通常的蛋白质沉淀剂的处理；超滤；分子筛色谱法(凝胶过滤)、吸附色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等各种液相色谱法；透析法；这些的组合等。

另外，通过将6残基组氨酸与上述要表达的重组蛋白连接，从而可以用镍亲和柱高效地纯化。或者，通过将IgG的Fc区与要表达的重组蛋白连接，从而可以用蛋白A柱高效地纯化。通过将上述方法组合，可以容易地以高收率、高纯度大量制造目标多肽。

(2)抗Siglec-15单克隆抗体的制造

作为与Siglec-15特异性结合的抗体的例子，可列举与Siglec-15特异性结合的单克隆抗体，其获得方法如以下所述。

在制造单克隆抗体时，通常需要下述的操作工序。即，

(a)纯化作为抗原使用的生物体高分子、

(b)对动物注射抗原而进行免疫，然后收集血液并检测其抗体效价以确定脾脏摘出的时机，然后制备抗体产生细胞的工序、

(c)制备骨髓瘤细胞(以下称为“骨髓瘤”)、

(d)使抗体产生细胞和骨髓瘤进行细胞融合、

(e)筛选产生目标抗体的杂交瘤群、

(f)分成单细胞克隆(克隆化)、

(g)根据情况进行用于大量制造单克隆抗体的杂交瘤的培养或移植了杂交瘤的动物的饲养、

(h)研究如此制造的单克隆抗体的生理活性及其结合特异性或检测作为标记试剂的特性，等。

以下，按照上述工序详述单克隆抗体的制作方法，但是该抗体的制作方法不限于此，例如，也可以使用脾细胞以外的抗体产生细胞及骨髓瘤。

(a)抗原的纯化

作为抗原，可以使用按照如上所述的方法制备的Siglec-15或其一部分。

另外，也可以使用由表达Siglec-15的重组细胞制备的膜级分或表达Siglec-15的重组细胞本身、以及使用本领域技术人员已知的方法进行化学合成而得的本发明的蛋白质的部分肽作为抗原。

(b)抗体产生细胞的制备

将工序(a)中所得的抗原与弗氏完全或不完全佐剂或硫酸钾铝之类的助剂混合，将其作为免疫原免疫实验动物。关于实验动物，可以无障碍地使用公知的用于杂交瘤制备方法的动物。具体而言，可使用例如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马等。其中，从要与摘出的抗体产生细胞融合的骨髓瘤细胞的获得容易性的观点出发，优选将小鼠或大鼠作为被免疫动物。

另外，实际使用的小鼠及大鼠的品系没有特别限制，在小鼠的情况下，可以使用例如各品系A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，另外在大鼠的情况下可以使用例如Wistar、Low、Lewis、Spraque、Daweley、ACI、BN、Fischer等。

这些小鼠及大鼠可以由例如日本CLEA、日本Charles River Laboratories等实验动物饲养销售商获得。

其中，若考虑与后述的骨髓瘤细胞的融合适宜性，小鼠中，特别优选BALB/c品系作为被免疫动物，大鼠中，特别优选Wistar及Low品系作为被免疫动物。

另外，考虑到人与小鼠间的抗原同源性，还优选使用除去自身抗体的降低了生物体功能的小鼠、即有自身免疫疾病的小鼠。

需要说明的是，这些小鼠或大鼠的免疫时的周龄优选为5～12周龄，进一步优选为6～8周龄。

在用Siglec-15或其重组体免疫动物时，可以使用例如在Weir，D.M.，Handbook ofExperimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987)、Kabat，E.A.and Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles CThomas Publisher Spigfield，Illinois(1964)等中详细记载的公知方法。

若具体例示这些免疫方法中的适合于本发明的方法，例如如以下所述。

即，首先将作为抗原的膜蛋白级分或表达抗原的细胞给药于动物的皮内或腹腔内。

其中，为了提高免疫效率，优选将两者组合使用，若前半程进行皮内给药、后半程或仅末次进行腹腔内给药，尤其可以提高免疫效率。

抗原的给药时间表根据被免疫动物的种类、个体差异等而不同，通常优选抗原给药次数为3～6次、给药间隔为2～6周，进一步优选给药次数为3～4次、给药间隔为2～4周。

另外，抗原的给药量根据动物的种类、个体差异等而不同，通常设为0.05～5mg、优选0.1～0.5mg左右。

追加免疫可以在以上的抗原给药的1～6周后、优选2～4周后、进一步优选2～3周后进行。

需要说明的是，进行追加免疫时的抗原给药量根据动物的种类、大小等而不同，例如在小鼠的情况下通常设为0.05～5mg、优选0.1～0.5mg、进一步优选0.1～0.2mg左右。

在上述追加免疫起1～10天后、优选2～5天后、进一步优选2～3天后在无菌条件下从被免疫动物中取出包含抗体产生细胞的脾细胞或淋巴细胞。

需要说明的是，若此时测定抗体效价并将抗体效价足够高的动物作为抗体产生细胞的供给源使用，则可以提高此后的操作效率。

作为这里使用的抗体效价的测定方法，可以列举例如RIA法或ELISA法，但不限于这些方法。

例如，若利用ELISA法测定本发明中的抗体效价，则可以按照以下记载的步骤来进行。

首先，使纯化或部分纯化后的抗原吸附于ELISA用96孔板等固相表面，再利用与抗原无关的蛋白质、例如牛血清白蛋白(以下称为“BSA”)包覆未吸附抗原的固相表面，对该表面进行洗涤，然后使其接触作为一抗的逐级稀释后的试样(例如小鼠血清)，使试样中的抗体与上述抗原结合。

再加入作为二抗的进行了酶标记的针对小鼠抗体的抗体，使其与小鼠抗体结合，洗涤，然后加入该酶的底物，测定由底物分解并显色而引起的吸光度变化等，从而计算抗体效价。

从这些脾细胞或淋巴细胞中分离抗体产生细胞时，可以按照公知的方法(例如Kohler et al.，Nature(1975)256，p.495；Kohler et al.，Eur.J.Immnol.(1977)6，p.511；Milstein et al.，Nature(1977)，266，p.550；Walsh，Nature(1977)266，p.495)来进行。

例如，在脾细胞的情况下，可以采用将脾脏切碎并将细胞用不锈钢网过滤、然后悬浮于伊戈尔基本培养基(MEM)并分离抗体产生细胞的常规方法。

(c)骨髓瘤细胞(以下称为“骨髓瘤”)的制备

细胞融合中使用的骨髓瘤细胞没有特别限制，可以从公知的细胞株中适当选择、使用。其中，考虑到从融合细胞中选择杂交瘤时的便利性，优选使用已经建立了选择程序的HGPRT(Hipoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶)缺陷株。

即，来自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.Ul(P3Ul)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等；来自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等；来自人的U266AR(SKO-007)、GM1500·GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)、8226AR/NIP4-1(NP41)等。

这些HGPRT缺陷株可以由例如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)等获得。

这些细胞株用合适的培养基、例如8-氮鸟嘌呤培养基[向在RPMI-1640培养基中加入了谷氨酰胺、2-巯基乙醇、庆大霉素及胎牛血清(以下称为“FCS”)的培养基中添加8-氮鸟嘌呤而成的培养基]、Iscove′s改良杜尔贝科培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium；以下称为“IMDM”)或杜尔贝科改良伊戈尔培养基(Dulbecco’s Modified EagleMedium；以下称为“DMEM”)进行传代培养，从细胞融合之前的3～4天起用正常培养基[例如包含10％FCS的ASF104培养基(味之素(株)公司制)]进行传代培养，在融合当天确保2×10⁷以上的细胞数。

(d)细胞融合

抗体产生细胞与骨髓瘤细胞的融合可以按照公知的方法(Weir，D.M.，Handbookof Experimental Immunology Vol.I.II.III.，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1987)、Kabat，E.A.and Mayer，M.M.，Experimental Immunochemistry，Charles CThomas Publisher Spigfield，Illinois(1964)等)在不会极度降低细胞存活率的程度的条件下适当实施。

关于这类方法，可以使用例如在聚乙二醇等高浓度聚合物溶液中混合抗体产生细胞和骨髓瘤细胞的化学方法、利用电刺激的物理方法等。

以下示出其中的上述化学方法的具体例。即，在使用聚乙二醇作为高浓度聚合物溶液时，在分子量1500～6000、优选2000～4000的聚乙二醇溶液中在30～40℃、优选35～38℃的温度下将抗体产生细胞和骨髓瘤细胞混合1～10分钟、优选5～8分钟。

(e)杂交瘤群的选择

通过上述细胞融合而得到的杂交瘤的选择方法没有特别限制，通常使用HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)选择法(Kohler et al.，Nature(1975)256，p.495；Milsteinetval.，Nature(1977)266，p.550)。

该方法对于使用在氨基蝶呤下无法存活的HGPRT缺陷株的骨髓瘤细胞得到杂交瘤的情况有效。

即，通过在HAT培养基中培养未融合细胞及杂交瘤，从而仅对氨基蝶呤具有耐受性的杂交瘤会选择性地残留和增殖。

(f)分成单细胞克隆(克隆化)

作为杂交瘤的克隆化方法，可以使用例如甲基纤维素法、软琼脂糖法、有限稀释法等公知方法(例如Barbara，B.M.and Stanley，M.S.：Selected Methods in CellularImmunology，W.H.Freeman and Company，San Francisco(1980))。这些方法中，特别优选有限稀释法。

该方法中，可以在微孔板上预先接种来自大鼠胎鼠的成纤维细胞株或正常小鼠的脾细胞、胸腺细胞、腹水细胞等饲养细胞(feeder)。

另一方面，预先按照达到0.2～0.5个/0.2ml的方式将杂交瘤稀释到培养基中，将该稀释后的杂交瘤的悬浮液向各孔中分别加入0.1ml，每隔一定时间(例如每3天)将约1/3的培养基交换为新的培养基，如此地持续培养2周左右，则可以使杂交瘤的克隆增殖。

对于确认到抗体效价的孔，例如将利用有限稀释法的克隆化重复进行2～4次，选择稳定地确认到抗体效价的克隆作为抗Siglec-15单克隆抗体产生杂交瘤株。

作为如此克隆化的杂交瘤株的例子，可列举杂交瘤#32A1及杂交瘤#41B1。杂交瘤#32A1及杂交瘤#41B1于2008年8月28日保藏于日本独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(现：日本独立行政法人制品评价技术基盘机构生物技术中心专利微生物保藏中心)，杂交瘤#32A1的名称为anti-Siglec-15 Hybridoma#32A1，保藏编号为FERM BP-10999，杂交瘤#41B1的名称为anti-Siglec-15Hybridoma#41B1，保藏编号为FERM BP-11000。

(g)通过培养杂交瘤来制备单克隆抗体

通过对如此选择出的杂交瘤进行培养，可以高效地得到单克隆抗体，在培养之前，期望筛选出产生目标单克隆抗体的杂交瘤。

该筛选可以采用方法本身为已知的方法。

本发明中的抗体效价的测定例如可以通过上述(b)的项目中说明的ELISA法来进行。

通过以上方法得到的杂交瘤可以以冷冻状态保存在液氮中或-80℃以下的冰箱中。

对于完成了克隆化的杂交瘤，将培养基从HT培养基换成正常培养基并进行培养。

大量培养可通过使用大型培养瓶的旋转培养或转瓶培养来进行。通过从该大量培养的上清中使用凝胶过滤等本领域技术人员已知的方法进行纯化，可以得到特异性结合本发明的蛋白的单克隆抗体。

另外，可以通过向同品系的小鼠(例如上述的BALB/c)或Nu/Nu小鼠的腹腔内注射杂交瘤并使该杂交瘤增殖，来得到大量包含本发明的单克隆抗体的腹水。

在向腹腔内给药时，若事先(3～7天前)给药2,6,10,14-四甲基十五烷(姥鲛烷)等矿物油则可得到更多量的腹水。

例如，预先向与杂交瘤同品系的小鼠的腹腔内注射免疫抑制剂，使T细胞失活后，20天后，使10⁶～10⁷个杂交瘤/克隆细胞悬浮于不含血清的培养基中(0.5ml)，将其给药到腹腔内，通常当腹部膨胀、充满腹水时，从小鼠采集腹水。

利用该方法，与培养液时相比，可以得到约100倍以上的浓度的单克隆抗体。

利用上述方法得到的单克隆抗体可以通过例如Weir，D.M.：Handbook ofExperimental Immunology，Vol.I，II，III，Blackwell Scientific Publications，Oxford(1978)中记载的方法来纯化。

即，硫酸铵盐析法、凝胶过滤法、离子交换色谱法、亲和色谱法等。

作为纯化的简便方法，也可以利用市售的单克隆抗体纯化试剂盒等。

如此得到的单克隆抗体对Siglec-15具有高抗原特异性。

(h)单克隆抗体的检验

如此得到的单克隆抗体的同种型及亚类可以如下来确定。

首先，作为鉴定方法，可列举Ouchterlony法、ELISA法或RIA法。

Ouchterlony法虽然简便，但是在单克隆抗体的浓度低时需要浓缩操作。

另一方面，当使用ELISA法或RIA法时，通过使培养上清与吸附有抗原的固相直接反应，并使用与各种免疫球蛋白同种型、亚类对应的抗体作为二抗，从而可以鉴定单克隆抗体的同种型和亚类。

另外，作为更简便的方法，也可以使用市售的鉴定试剂(例如小鼠分型试剂盒；Bio-Rad公司制)等。

另外，通过Folin Lowry法及由280nm下的吸光度[1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml]进行计算的方法可以进行蛋白质的定量。

(3)其它抗体

本发明的抗体中，除了上述针对Siglec-15的单克隆抗体以外，还包括为了降低对人的异种抗原性等而进行了人工改造的基因重组型抗体，例如嵌合(Chimeric)抗体、人源化(Humanized)抗体、人抗体等。这些抗体可以使用已知的方法来制造。

作为嵌合抗体，可列举抗体的可变区和恒定区的种属彼此不同的抗体，例如将来自小鼠的抗体可变区与来自人的恒定区结合的嵌合抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，6851-6855(1984))。

作为人源化抗体，可列举仅将互补决定区(CDR；complementarity determiningregion)整合到来自人的抗体中的抗体(Nature(1986)321，p.522-525)、通过CDR移植法将CDR序列以及部分框架的氨基酸残基移植到人抗体中而成的抗体(WO90/07861)。

另外还可以列举人抗体。抗Siglec-15人抗体是指仅具有来自人染色体的抗体的基因序列的人抗体。抗Siglec-15人抗体可以通过使用人抗体产生小鼠的方法(Tomizuka，K.et al.，Nature Genetics(1997)16，p.133-143；Kuroiwa，Y.et.al.，Nuc.Acids Res.(1998)26，p.3447-3448；Yoshida，H.et.al.，Animal Cell Technology：Basic andApplied Aspects vol.10，p.69-73(Kitagawa，Y.，Matuda，T.and Iijima，S.eds.)，KluwerAcademic Publishers，1999；Tomizuka，K.et.al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97，p.722-727)来获得，所述人抗体产生小鼠具有包含人抗体的H链和L链的基因的人染色体片段。

这种转基因动物具体可以如下制作：制作作为基因敲除动物及转基因动物的、破坏掉非人哺乳动物的内源性免疫球蛋白的重链及轻链的基因座且取而代之地导入人免疫球蛋白的重链及轻链的基因座的基因重组动物，以及使这些动物彼此交配。

另外，通过基因重组技术使分别编码这样的人抗体的重链及轻链的cDNA、优选包含该cDNA的载体转化真核细胞，并培养产生基因重组人单克隆抗体的转化细胞，从而还可以从培养上清中得到该抗体。

在此，作为宿主，可以使用例如真核细胞，优选CHO细胞、淋巴细胞、骨髓瘤等哺乳动物细胞。

另外，还已知获得由人抗体文库筛选出的来自噬菌体展示的人抗体的方法(Wormstone，I.M.et.al，Investigative Ophthalmology&Visual Science.(2002)43(7)，p.2301-2308；Carmen，S.et.al.，Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002)，1(2)，p.189-203；Siriwardena，D.et.al.，Opthalmology(2002)109(3)，p.427-431)。

例如，可以使用使噬菌体表面以单链抗体(scFv)形式表达人抗体的可变区、并选择与抗原结合的噬菌体的噬菌体展示法(Nature Biotechnology(2005)，23，(9)，p.1105-1116)。

通过分析基于与抗原结合而选择的噬菌体的基因，可以确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。

若明确了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以制作具有该序列的表达载体并导入到合适的宿主中使其表达，从而获得人抗体(WO92/01047，WO92/20791，WO93/06213，WO93/11236，WO93/19172，WO95/01438，WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12，p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9)，p.1105-1116)。

在将抗体基因暂时分离后将其导入到合适的宿主而制作抗体时，可以使用合适的宿主和表达载体的组合。

在使用真核细胞作为宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞、真核微生物。

作为动物细胞，可列举：(1)哺乳类细胞，例如作为猴细胞的COS细胞(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175-182、ATCC CRL-1650)、小鼠成纤维细胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞、ATCC CCL-61)的二氢叶酸还原酶缺陷株(Urlaub，G.and Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126-4220)。

在使用原核细胞时，可列举例如大肠杆菌、枯草杆菌。

通过转化向这些细胞中导入作为目标的抗体基因，体外培养转化后的细胞，从而可得到抗体。

作为本发明的抗体的同种型，没有限制，可列举例如IgG(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)、IgM、IgA(IgA1，IgA2)、IgD或IgE等，可优选列举IgG或IgM，可更优选列举IgG2。

另外，本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合部位的抗体的功能性片段或其修饰物。通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶等蛋白酶处理抗体，或利用基因工程方法改造抗体基因并使其在合适的培养细胞中表达，从而可以得到该抗体的片段。在这类抗体片段中，具有全长抗体分子所具有的全部或部分功能的片段可以称为抗体的功能片段。作为抗体的功能，通常可以例举抗原结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性的细胞毒性活性、补体依赖性的细胞毒性活性、以及补体依赖性细胞的细胞毒性活性。本发明中的抗体的功能性片段所保持的功能优选为抑制破骨细胞的形成的活性，更优选为抑制破骨细胞的细胞融合过程的活性。

例如，作为抗体的片段，可列举Fab、F(ab’)₂、Fv或用合适的接头连接重链和轻链的Fv而成的单链Fv(scFv)、双抗体(diabodies)、线性抗体及由抗体片段形成的多特异性抗体等。另外，抗体片段中也包括在还原条件下处理F(ab’)₂而得的、作为抗体的可变区的一价片段的Fab’。

另外，本发明的抗体可以为对至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。

通常这类分子结合2个抗原(即双特异性抗体(bispecific antibody))，而本发明中的“多特异性抗体”包括对两种以上(例如3种)抗原具有特异性的抗体。

本发明的抗体中，多特异性抗体可以是由全长构成的抗体或这种抗体的片段(例如F(ab’)₂双特异性抗体)。双特异性抗体可以通过使两种抗体的重链和轻链(HL对)结合而制作，也可以通过使产生不同的单克隆抗体的杂交瘤融合而制作双特异性抗体产生融合细胞来制作(Millstein et al.，Nature(1983)305，p.537-539)。

本发明的抗体可以是单链抗体(也记作scFv)。单链抗体可通过将抗体的重链V区和轻链V区用多肽接头连接而得到(Pluckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，113(Rosenburg及Moore编、Springer Verlag，New York，p.269-315(1994)、Nature Biotechnology(2005)，23，p.1126-1136)。另外，还可以将用多肽接头使两个scFv结合而制作的BiscFv片段作为双特异性抗体使用。

制作单链抗体的方法在当技术领域中是已知的(例如，参照美国专利第4,946,778号、美国专利第5,260,203号、美国专利第5,091,513号、美国专利第5,455,030号等)。在该scFv中，重链V区和轻链V区介由不形成缀合的接头、优选多肽接头而连接(Huston，J.S.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)，85，p.5879-5883)。scFv中的重链V区及轻链V区可以来自相同的抗体，也可以来自不同的抗体。作为用来连接V区的多肽接头，可使用例如包含12～19残基的任意单链肽。

编码scFv的DNA可如下得到：以编码上述抗体的重链或重链V区的DNA及编码轻链或轻链V区的DNA中的、编码上述序列的全部氨基酸序列或期望氨基酸序列的DNA部分为模板，使用规定其两端的引物对通过PCR法进行扩增，接着再组合编码多肽接头部分的DNA及规定了其两端而使其分别与重链、轻链连接的引物对进行扩增，从而得到。

另外，若制作了编码scFv的DNA，则可以按照常规方法得到含有它们的表达载体以及用该表达载体转化的宿主，另外，可以使用该宿主按照常规方法得到scFv。

通过与上述同样地获得并表达基因，则可以使宿主产生这些抗体片段。

本发明的抗体可以通过多聚化来提高对抗原的亲和性。作为要多聚化的抗体，可以是1种抗体，也可以是识别同一抗原的多个表位的多个抗体。作为对抗体进行多聚化的方法，可列举将IgG CH3结构域与2个scFv结合、与链霉亲和素结合、导入螺旋-转角-螺旋基序的导入等。

本发明的抗体可以是作为氨基酸序列不同的多种抗Siglec-15抗体的混合物的多克隆抗体。作为多克隆抗体的一例，可列举CDR不同的多种抗体的混合物。作为这类多克隆抗体，可以使用培养产生不同抗体的细胞的混合物、且从该培养物中纯化而得的抗体(参照WO2004/061104号)。

作为抗体的修饰物，也可以使用结合有聚乙二醇(PEG)等各种分子的抗体。

可以将得到的抗体纯化至均一。抗体的分离、纯化可以使用通常用于蛋白质的分离、纯化方法。

例如，可以适当选择和组合色谱柱、过滤器、超滤、盐析、透析、制备用聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点电泳等来进行抗体的分离、纯化(Strategies for ProteinPurification and Charcterization：A Laboratoy Course Manual，Daniel R.Marshaket al.eds.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A LaboratoryManual.Ed Harlow and David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但是不限于这些。

作为色谱法，可列举亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水性色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、吸附色谱法等。

这些色谱法可以使用HPLC、FPLC等液相色谱法来进行。

作为亲和色谱法中使用的色谱柱，可列举蛋白A柱、蛋白G柱。

例如，作为使用蛋白A柱的色谱柱，可列举POROS，Sepharose F.F.等。

另外，还可以使用固定化有抗原的载体并利用抗体对抗原的结合性来纯化抗体。

优选地，本发明中的抗Siglec-15抗体为具有抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所致的骨吸收的活性的抗体。

抗Siglec-15抗体所具有的该活性可以通过体外测定抑制过量表达Siglec-15的细胞向破骨细胞分化的活性来评价。例如，可以以各种浓度向来自小鼠单核细胞的细胞株RAW264.7细胞或RAW264细胞中添加抗Siglec-15抗体，测定抑制RANKL(receptoractivator of NF-κB)或TNF-α刺激所致的向破骨细胞分化的活性。另外，可以以各种浓度向来自骨髓的原代培养细胞中添加抗Siglec-15抗体，测定抑制RANKL、TNF-α或活性型维生素D₃刺激所致的向破骨细胞分化的活性。另外，可以以各种浓度向正常人破骨细胞前体细胞中添加抗Siglec-15抗体，测定抑制由RANKL及M-CSF刺激所致的向破骨细胞分化的活性。这种破骨细胞的分化抑制效果可以以破骨细胞的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)活性的抑制为指标来测定。另外，也可以以TRACP阳性多核破骨细胞的形成的抑制、即破骨细胞的细胞融合的抑制为指标来测定破骨细胞的分化抑制效果。例如，可以选择在上述破骨细胞分化的试验体系中以30μg/ml以下的浓度显示细胞融合的抑制效果、或以3μg/ml以下或1μg/ml以下的浓度显示抑制效果的抗体。另外，在测试更低浓度侧的效果时，可以选择在例如63ng/ml至1μg/ml的范围内显示破骨细胞的分化抑制效果的抗体。另外，在使用来自股骨和/或胫骨的细胞的凹陷分析法(Pit assay，Takada et al.，Bone and Mineral(1992)17，347-359)实验中，以各种浓度向来自股骨和/或胫骨的细胞中添加抗Siglec-15抗体，观察象牙切片上的凹陷形成，由此也可以测定体外的破骨细胞所致的骨吸收的抑制活性。另外，作为测定体外的破骨细胞所致的骨吸收的抑制活性的体系，还可以使用涂敷有结合铕的人胶原蛋白的平板(WO2009/048072的实施例37)。例如，可以选择在上述的破骨细胞所致的骨吸收的试验体系中以3μg/ml以下的浓度、即0.3μg/ml至3μg/ml的范围显示骨吸收抑制效果的抗体。另一方面，在体内的、即使用实验动物的情况下，可以通过测定次级海绵骨区域的破骨细胞的变化来确认抗Siglec-15抗体所具有的该活性为。

作为本发明中可使用的抗Siglec-15抗体的例子，可列举WO2009/048072、WO2010/117011、WO2013/147212、WO2013/147213、WO2012/045481等中公开的抗Siglec-15抗体。例如，作为本发明中可使用的抗Siglec-15抗体，可列举上述杂交瘤#32A1(FERM BP-10999)所产生的抗体(以下称为“#32A1抗体”)，#32A1抗体具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含由序列号21的第20～140位的氨基酸残基构成的氨基酸序列，所述轻链可变区包含由序列号22的第21～132位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。另外，作为本发明中可使用的抗Siglec-15抗体，可列举具有下述特征的抗体等，所述特征为：其为在对Siglec-15的结合中与#32A1抗体发生竞争或具有共同的表位、且抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所致的骨吸收的单克隆抗体，以3μg/ml以下的浓度体外抑制破骨细胞所致的骨吸收。#32A1抗体的表位为人Siglec-15 V-set结构域((由NCBI的蛋白质数据库的登录号NP＿998767的氨基酸序列或序列表的序列号2中记载的氨基酸序列的第39～165位的氨基酸残基构成的结构域)。

作为本发明中可使用的抗Siglec-15抗体，可优选列举#32A1抗体的人源化抗体或其CDR改造体。作为#32A1抗体的人源化抗体的实例，可列举：包含含有由序列号7的第20～140位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链、与包含含有由序列号8的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合；包含含有由序列号9的第20～140位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链、与包含含有由序列号8的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合；包含含有由序列号9的第20～140位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链、与包含含有由序列号10的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合；包含含有由序列号9的第20～140位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链、与包含含有由序列号11的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合。

作为更优选的人源化抗体，可列举：包含含有由序列号7的第20～466位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链、与包含含有由序列号8的第21～238位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合；包含含有由序列号9的第20～466位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链、与包含含有由序列号8的第21～238位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合；包含含有由序列号9的第20～466位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链、与包含含有由序列号10的第21～238位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合；包含含有由序列号9的第20～466位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链及包含含有由序列号11的第21～238位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合。

其中，作为#32A1抗体的人源化抗体，只要保有#32A1抗体的全部6种CDR序列、且具有抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所致的骨吸收的活性，则不限于上述人源化抗体。需要说明的是，#32A1抗体的重链可变区保有由序列号12所示的氨基酸序列构成的CDRH1(DYFMN)、由序列号13所示的氨基酸序列构成的CDRH2(QIRNKIYTYATFYA)及由序列号14所示的氨基酸序列构成的CDRH3(SLTGGDYFDY)。另外，#32A1抗体的轻链可变区保有由序列号15所示的氨基酸序列构成的CDRL1(RASQSVTISGYSFIH)、由序列号16所示的氨基酸序列构成的CDRL2(RASNLAS)及由序列号17所示的氨基酸序列构成的CDRL3(QQSRKSPWT)。

作为#32A1抗体的人源化抗体的CDR改造体，可列举在#32A1抗体的人源化抗体中将序列号14的CDRH3的第3位的苏氨酸残基置换为谷氨酸残基的抗体。Siglec-15为碱性蛋白质，通过向抗体序列中导入天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸残基，可期待在抗原-抗体间形成离子键，从而提高结合能力。设计了下述置换体：在位于被认为是抗体的识别位点中最重要的CDRH3环的中央、通过X射线晶体结构分析预测朝向抗原侧的苏氨酸残基位置，导入作为酸性氨基酸且侧链较长的谷氨酸残基的置换体。具有上述置换的CDRH3(SLEGGDYFDY)相当于序列表的序列号18的氨基酸序列。

作为CDR改造体的实例，可列举：包含含有由序列号19的第20～140位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的重链可变区的重链、与包含含有由序列号20的第21～133位的氨基酸残基构成的氨基酸序列的轻链可变区的轻链的组合。

作为更优选的CDR改造体，可列举包含下述重链和下述轻链的抗体，所述重链具有由序列号19的第20～466位的氨基酸残基构成的氨基酸序列，所述轻链具有由序列号20的第21～238位的氨基酸残基构成的氨基酸序列。

其中，#32A1抗体的人源化抗体的CDR改造体只要保有序列号18的CDRH3序列、且具有抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所致的骨吸收的活性，则不限于上述的CDR改造体。

需要说明的是，已知哺乳类的培养细胞所生产的抗体的重链的羧基末端的赖氨酸残基是缺失的(Journal of Chromatography A，705：129-134(1995))，另外还已知上述重链的羧基末端的甘氨酸、赖氨酸这2个氨基酸残基是缺失的，重新出现于羧基末端的脯氨酸残基被酰胺化(Analytical Biochemistry，360：75-83(2007))。但是，这些重链序列的缺失及修饰不影响抗体的抗原结合能力及效应物功能(补体的活化、抗体依赖性细胞毒性作用等)。因此，本发明中也包括该接受修饰的抗体，其可列举重链羧基末端中缺失了1或2个氨基酸的缺失体及酰胺化的该缺失体(例如，羧基末端部位的脯氨酸残基被酰胺化的重链)等。其中，只要保留了抗原结合能力及效应物功能，则本发明的抗体的重链的羧基末端的缺失体不限于上述种类。构成本发明的抗体的2条重链可以是选自由全长及上述缺失体组成的组中的任一重链，也可以是任意二种的组合。各缺失体的量比可能会受到产生本发明的抗体的哺乳类培养细胞的种类及培养条件的影响，作为本发明的抗体的主要成分，可列举2条重链两者为羧基末端缺失1个氨基酸残基的情况。

3.含有抗Siglec-15抗体的药物

上述的抗Siglec-15抗体可以作为用于治疗和/或预防小儿骨质疏松症的药物的有效成分使用。

小儿骨质疏松症是指处于生长期的小儿(约17岁左右以下)中发生的骨质疏松症。小儿骨质疏松症的原因多种多样，有原因在于成骨不全或特发性小儿骨质疏松症的小儿骨质疏松症(分类为原发性骨质疏松症)以及原因在于神经疾病、内分泌·炎症性疾病、血液疾病或药剂给药的小儿骨质疏松症(分类为继发性骨质疏松症)。优选地，本发明中“小儿骨质疏松症”是由于药剂给药而发生的小儿骨质疏松症。作为成为小儿骨质疏松症的病因的药剂，可列举：甲基泼尼松龙、泼尼松龙等类固醇药物；他克莫司、环孢素、氨甲喋呤等免疫抑制剂，但不限于这些。更优选地，本发明中“小儿骨质疏松症”是由于给药类固醇药物而发生的小儿糖皮质激素性骨质疏松症。小儿由于处于骨形成·生长显著的时期，因此容易受到为了治疗骨质疏松症而给药的以双膦酸盐制剂为代表的现有的强力骨吸收抑制剂的影响。因此，小儿骨质疏松症是在使用骨吸收抑制剂进行治疗时非常担忧发生生长障碍、骨结构异常、骨质异常的疾病。

本发明中，上述的抗Siglec-15抗体可以与药学上允许的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、保存剂和/或助剂一起以药物组合物的方式来提供。该药物组合物中，可以包含治疗和/或预防上的有效量的上述抗Siglec-15抗体。

作为在本发明的药物组合物中允许的、用于制剂的物质，优选在优选给药量、给药浓度下对给药药物组合物者无毒性。

本发明的药物组合物可包含用于改变或维持pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、无菌性、稳定性、溶解度、缓释率、吸收率、渗透率的制剂用物质。作为制剂用物质，可列举但不限于以下物质：甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸类；抗菌剂；抗坏血酸、硫酸钠或亚硫酸氢钠等抗氧化剂；磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸缓冲液、碳酸氢钠、Tris盐酸(Tris-HCl)溶液等缓冲剂；甘露醇、甘氨酸等填充剂；乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合剂；咖啡因、聚乙烯吡咯烷、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精等络合剂；葡萄糖、甘露糖或糊精等增量剂；单糖类、二糖类等其它碳水化合物；着色剂；香味剂；稀释剂；乳化剂；聚乙烯吡咯烷等亲水聚合物；低分子量多肽；成盐抗衡离子；苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、羟苯甲酯、羟苯丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢等防腐剂；甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶剂；甘露醇或山梨醇等糖醇；悬浮剂；失水山梨醇酯、聚山梨酯20和聚山梨酯80等聚山梨酯；三硝基甲苯(triton)、氨基丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或胆固醇等表面活性剂；蔗糖和山梨醇等稳定性强化剂；氯化钠、氯化钾和甘露醇、山梨醇等弹性增强剂；转运剂；稀释剂；赋形剂和/或药学上的佐剂。这些制剂用物质的添加量相对于抗Siglec-15抗体的重量优选添加0.01～100倍、特别是0.1～10倍。制剂中的优选的药物组合物的组成可以由本领域技术人员根据所应用的疾病、所应用的给药途径等适当确定。

药物组合物中的赋形剂、载体可以为液体也可以为固体。合适的赋形剂、载体可以为注射用水、生理盐水、人工脑脊髓液、非经口给药中通常使用的其它物质。还可以使用中性的生理盐水、包含血清白蛋白的生理盐水作为载体。药物组合物中还可以包含pH7.0～8.5的Tris缓冲液、pH4.0～5.5的乙酸缓冲液以及使它们中包含山梨醇、其它化合物。本发明的药物组合物可作为具有所选择的组成和必要的纯度的药剂以冷冻干燥品或液体形式来准备。本发明的药物组合物还可以使用蔗糖之类的合适的赋形剂成型为冷冻干燥品。

本发明的药物组合物可以制备成非经口给药用，也可以制备成经口的消化道吸收用。制剂的组成及浓度可根据给药方法来确定，另外就本发明的药物组合物中所含的抗Siglec-15抗体对Siglec-15的亲和性、即相对于Siglec-15的解离常数(Kd值)而言，亲和性越高(Kd值越低)越可以减少对人的给药量并发挥药效，因此也可以基于该结果确定本发明的药物组合物对人的给药量。在将人抗Siglec-15抗体给药于人时，给药量可以设为将约0.1～100mg/kg在1～180天内给药1次。

作为本发明的药物组合物的形态，可列举包括点滴在内的注射剂、栓剂、经鼻剂、舌下剂、经皮吸收剂等。

本发明的药物组合物中，可以与抗Siglec-15抗体一起包含对治疗和/或预防骨病有效的一种或多种成分。作为这样的成分，可列举活性型维生素D₃、降钙素及其衍生物、雌二醇等激素制剂、SERMs(selective estrogen receptor modulators，选择性雌激素受体调节剂)、依普黄酮、维生素K₂(四烯甲萘醌)、钙制剂、PTH(parathyroid hormone，甲状旁腺激素)制剂、非糖皮质激素性抗炎剂、可溶性TNF受体制剂、抗TNFα抗体或该抗体的功能性片段、抗PTHrP(parathyroid hormone-related protein，甲状旁腺激素相关蛋白)抗体或该抗体的功能性片段、IL-1受体拮抗剂、抗IL-6受体抗体或该抗体的功能性片段等，但不限于这些。

该成分可以与抗Siglec-15抗体包含在同一制剂中，也可以与抗Siglec-15抗体分别包含在不同的制剂中且一起或分别供给。或者，该成分也可以以与抗Siglec-15抗体或其功能性片段结合的方式供给。抗Siglec-15抗体或其功能性片段和该成分的结合方式可利用M.C.Garnet“Targeted drug conjugates：principles and progress”，Advanced DrugDelivery Reviews，(2001)53，171-216、G.T.Hermanson“Bioconjugate Techniques”Academic Press，California(1996)、Putnam and J.Kopecek“Polymer Conjugates withAnticancer Activity”Advances in Polymer Science(1995)122，55-123等中记载的各种方式。

实施例

以下通过实施例具体说明本发明，但本发明不受这些例子限定。

A.使用生长期健康大鼠的评价

I.实验方法

(1)使用动物

使用6周龄的生长期雄性F344 Rat。

(2)实验组(各n＝10)

(i)对照组(以下记作“Ctl组”)

(ii)抗Siglec-15抗体给药组(以下记作“Sig-15 Ab给药组”)：抗Siglec-15抗体使用上述#32A1抗体。抗Siglec-15抗体以0.25mg/kg、1mg/kg、4mg/kg的用量每3周一次皮下给药。

(iii)双膦酸盐给药组(以下记作“ALN给药组”)：将阿伦膦酸盐(ALN)(LKTLaboratories公司制)以0.028mg/kg、0.140mg/kg的用量每周2次皮下给药。

基于每周进行一次的体重测定的结果来调整各药剂的给药量。

(3)给药观察期

给药开始起的6周(6周龄至12周龄)。该时期结束后(12周龄)安乐死，并进行评价。

各实验组的大鼠在无特殊病原体(Specific-pathogen free，SPF)环境下用常规饲料来饲养。使其自由摄取饲料、水。

为了进行骨标记，在安乐死7天前及安乐死3天前(间隔4天)给药钙黄绿素。将钙黄绿素以10mg/ml的浓度溶解于1.4％的小苏打溶液中，以10mg/kg的用量对各动物进行皮下注射。

(4)评价项目

＜纵向的评价＞

(i)头体长及体重

在给药0、3、6周后进行头体长的测定。每周进行一次体重测定。

(ii)股骨长

在麻醉下通过微CT拍摄每3周进行一次股骨长的测定。

(iii)骨形成标志物和骨吸收标志物

在给药开始前和给药6周后且安乐死前，从尾静脉采血，通过ELISA法测定血中的骨形成标志物(血清骨钙素)和骨吸收标志物(血清TRACP-5b)的值。

各种操作按照图1中记载的时间表来实施。

＜分析物摘出后的评价＞

安乐死后进行解剖，采集股骨、胫骨、腰椎，作为评价样品。

(i)骨形态的测量

进行股骨、胫骨、第5腰椎的微CT拍摄，测定右股骨长轴长。

(ii)组织学的研究

未脱钙硬组织标本：使用左胫骨近端1/2(长度约1.5cm)的冠状切断组织。浸渍于70％乙醇而固定后，保存于冷暗处。将得到的未脱钙硬组织标本用于Villanueva染色、明视野观察及荧光观察、以及定量性骨形态测量。

脱钙组织标本：分离膝关节，制作胫骨近端部的冠状切断组织(右膝胫骨近端1/2)、以及第5腰椎冠状切断组织的标本。

对于上述未脱钙硬组织标本及脱钙组织标本，进行组织学的生长软骨板宽度测量和长轴方向上的生长速度测量，评价生长障碍(“新的骨形态测量”、2014年、WE-NET出版)。

通过针对抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase；TRACP)的化学染色(以下记作“TRACP染色”)和利用甲基绿的对比染色，来检测·评价破骨细胞。

利用番红O染色(对酸性粘多糖类进行染色)来检测·评价生长软骨部。

(iii)力学试验

对于第2、3、4、6腰椎椎体和左股骨远端骨干端部，进行压缩试验，来评价最大断裂强度(至断裂为止可承受的最大载荷)、刚性(不易变形性)及韧性(断裂所需要的能量)。

(iv)骨密度测定

使用骨密度测定装置(日立Allo Medica公司制)利用双能X射线吸收(DualEnergy X-Ray Absorptiometry，DXA)法进行腰椎(第1～3腰椎)、左股骨远端的BMD测定。

II.实验结果

(1)药剂对头体长及体重的影响

将从给药观察期开始起的纵向头体长及股骨长的测量结果示于图2。在给药观察期结束时(12周龄时)，Sig-15 Ab给药组与Ctl组相比在头体长及股骨长方面未确认到显著差异。另一方面，ALN给药组与Ctl组相比确认到头体长及股骨长的下降(图2(A)。在给药观察期内的头体长及股骨长的变化量方面也确认到同样的倾向(图2(B))。

该结果表明，与双膦酸盐不同，给药抗Siglec-15抗体不会使给药对象产生生长障碍。

(2)药剂对骨代谢(骨形成标志物和骨吸收标志物)的影响

将在给药观察期开始之前和之后所采集的血液样品中的骨形成标志物(血清骨钙素)和骨吸收标志物(血清TRACP-5b)的测定结果示于图3。关于给药观察期结束时(12周龄时)的血清TRACP-5b量，在Sig-15 Ab给药组及ALN给药组中均确认到依赖于给药的药剂的用量而下降(图3(A))。另一方面，关于血清骨钙素量，任一给药组与Ctl组间均未确认到显著差异。在给药观察期的变化量方面也确认到同样的倾向(图3(B))。

该结果表明，抗Siglec-15抗体的给药及双膦酸盐的给药均用量依赖性地抑制骨吸收。

(3)药剂对生长的影响的组织学评价

将关于给药观察期结束时(12周龄时)的胫骨近端部的、药剂对生长的影响的组织学评价结果示于图4-1、图4-2。图4-1(A)示出对该胫骨近端部进行微CT拍摄、将获得的数据进行三维重建而得到的图像(3D-CT图像)的冠状断面照片。Sig-15 Ab给药组与Ctl组相比均未确认到大的变化。另一方面，ALN给药组、特别是高用量给药组则确认到杯状的形态(即，骨粗度的变化量从近端部向远端侧变少)(正常情况下为喇叭状的形态)，另外确认到生长软骨板宽度(三角形)变小。

图4-1(C)示出使用用于软骨评价的番红O染色(对酸性粘多糖类进行染色)标本进行生长软骨及紧挨生长软骨下方的初级海绵骨区域的观察的结果。与上述3D-CT图像同样地，确认到ALN给药组中生长软骨的宽度变小。另外，关于在初级海绵骨区域的骨内确认到的番红O染色阳性(红色)的区域，Siglec-15抗体给药组与Ctl组之间未确认到差异，而ALN给药组中确认到该区域增大。另外，若详细观察番红O染色阳性的生长软骨区域，表现出下述倾向：在Ctl组及Siglec-15抗体给药组中，该区域从增殖层向肥大软骨细胞层、钙化软骨细胞层沿着长轴方向规则地排列，而在ALN给药组中，该区域具有不规则的排列。

图4-1(B)示出制作在安乐死7天前及安乐死3天前用钙黄绿素标记而得到的胫骨近端部的未脱钙组织标本并进行Villanueva染色的结果。可见2处与生长软骨平行地被标记的部位，位于近端的标记部位(箭头(上))表示安乐死3天前标记的区域，位于相对远端的部位(箭头(下))表示安乐死7天前标记的区域。基于这2处被标记的区域之间的距离来评价骨生长速度。结果确认到，Sig-15 Ab给药组中的该距离与Ctl给药组的该距离没有差异，在两者的骨生长速度方面未确认到不同。另一方面，ALN给药组(特别是高用量给药组)中的该距离与Ctl给药组的该距离相比变小，确认到ALN给药组的骨生长速度变小。

图4-2(D)示出使用用于破骨细胞的评价的TRACP染色标本进行胫骨近端部的初级海绵骨区域的观察的结果。Siglec-15抗体给药组中的TRACP阳性细胞数与Ctl组中的其数量之间未确认到差异，但确认到ALN给药组中的TRACP阳性细胞数明显减少。

进一步地，将关于骨生长速度、生长软骨宽度、初级海绵骨区域的破骨细胞面相对于骨表面(Oc.Pm/B.Pm(％))的进行定量评价的结果示于图4-2(E)、(F)。Siglec-15抗体给药组与Ctl组相比，在骨生长速度、生长软骨宽度、破骨细胞面方面均未确认到显著差异。另一方面确认，ALN给药组(特别是高用量给药组)与Ctl组相比，在骨生长速度、生长软骨宽度、初级海绵骨区域的破骨细胞面方面均显著下降。

以上结果暗示，紧挨生长软骨下方的骨吸收在长骨生长中承担了重要作用，由于ALN给药会抑制该骨吸收，因此会妨碍骨的正常发育、塑造过程。另一方面则暗示，Siglec-15抗体给药不抑制该区域的骨吸收，不会对骨生长造成影响。

(4)药剂对骨量及力学强度的影响

将使用富含海绵骨的腰椎来评价、检验药剂给药所带来的影响的结果示于图5-1、图5-2。将关于给药观察期结束时(12周龄时)的腰椎的、进行微CT拍摄并由制作的3D-CT图像得到的腰椎的冠状断面照片示于图5-1(A)。与Ctl组相比，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组均确认到依赖于给药药剂的用量的海绵骨骨量增加。ALN给药组中，初级海绵骨的骨量增加尤其显著。

图5-2(C)示出使用DXA法的腰椎的骨密度测定结果。与Ctl组相比，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组均确认到依赖于给药药剂的用量的腰椎BMD值增大。

图5-1(B)示出腰椎组织的基于TRACP染色的初级及次级海绵骨区域的破骨细胞观察结果。与Ctl组相比，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组均确认到次级海绵骨区域的TRACP阳性细胞减少，关于破骨细胞面相对于骨表面(Oc.Pm/B.Pm(％))，与Ctl组相比，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组均确认到下降(图5-2(D))。该结果暗示，Sig-15 Ab给药及ALN给药均抑制次级海绵骨(重塑骨)的骨吸收。

图5-2(E)示出腰椎的压缩试验的测定结果。关于最大断裂强度、刚性、韧性，Sig-15 Ab给药组与Ctl组相比均未确认到显著差异。另一方面，在ALN给药组(特别是高用量给药组)中，确认最大断裂强度及刚性与Ctl组相比显著增加。这暗示，不仅是由于海绵骨骨量改变，而且还由于与骨吸收的抑制相伴随的初级海绵骨的骨量增加而产生。

(5)药剂对长骨的影响

将使用海绵骨量多的胫骨近端部及股骨远端骨干端部来评价、检验药剂给药对长骨的影响的结果示于图6-1、图6-2。将关于给药观察期结束时(12周龄时)的股骨远端部的、进行微CT拍摄并由所制作的3D-CT图像得到的股骨的冠状断面照片示于图6-1(A-1)。与Ctl组相比，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组均确认到依赖于给药药剂的用量的海绵骨骨量增加。图6-1(A-2)示出使用DXA法的同一部位的骨密度测定结果。与Ctl组相比，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组均确认到依赖于给药药剂的用量的BMD值增大。组织学上也确认到用量依赖性的骨量增加，ALN给药组(特别是高用量给药组)中确认到骨小梁宽度的增加。

图6-1(B-1)示出12周龄的胫骨近端部的基于TRACP染色的次级海绵骨区域的破骨细胞观察结果。与Ctl组相比，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组均确认到TRACP阳性细胞减少，关于破骨细胞面相对于骨表面(Oc.Pm/B.Pm(％))，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组与Ctl组相比均下降(图6-1(B-2))。

图6-2(C)示出12周龄的股骨远端骨干端部的压缩试验的测定结果。关于最大断裂强度、刚性、韧性，Sig-15 Ab给药组及ALN给药组与Ctl组相比均确认到用量依赖性增大。

如上所述，抗Siglec-15抗体及双膦酸盐均使给药对象产生海绵骨骨量、骨密度、力学特性的增大，这表明作为骨质疏松症的治疗药及预防药有用，但是，在抗Siglec-15抗体的给药中，未确认到在双膦酸盐的给药中所确认到的紧挨生长软骨下方(初级海绵骨区域)的骨吸收的抑制、及作为其结果的骨的发育及塑造的障碍。该结果表明，抗Siglec-15抗体作为骨生长特别显著的生长期的小儿的骨质疏松症的治疗药及预防药有用。

B.使用小儿糖皮质激素性骨质疏松症模型大鼠的评价

I.实验方法

(1)使用动物

使用6周龄的生长期雌性LEW/CrlCrlj Rat。

(2)小儿糖皮质激素性骨质疏松症模型动物

作为骨质疏松症模型动物，大多使用对啮齿类中的小鼠给药糖皮质激素的模型，但通过给药糖皮质激素而与人同样地显示骨量减少的品系仅限于Swiss Webster及FVB/N这两个品系(Thiele S，et al.Bone KEy Reports 3：552(2014))。但是，这些品系中，20周龄以前的骨生长尚未结束的年轻小鼠中并不会发生骨量减少，从而已经作为小儿骨质疏松症模型被建立的小鼠并不存在。另外，在观察药剂对骨量、结构、骨生长的影响时，小鼠有时由于体型小而不适合。

另一方面，大鼠中尚未建立糖皮质激素性骨质疏松症模型。因此，本实施例中采用在LEW/CrlCrlj Rat雌6周龄的皮下埋入强的松龙25mg/粒/60天的模型大鼠，来作为小儿糖皮质激素性骨质疏松症模型。该模型在埋入强的松龙后2、4、6周时确认到股骨BMD下降，另外确认到股骨和腰椎的最大断裂强度也下降。

需要说明的是，强的松龙25mg/粒/60天相当于每天给药0.42mg。该量对于6周龄的大鼠(体重120g)为3.5mg/kg/天，若换算为体重30kg的小儿则为相当于105mg/天的给药量。

(3)实验组(各n＝10)

(i)Sham组：假手术+Vehicle(PBS)(皮下给药)

(ii)GC组：强的松龙(PSL)颗粒25mg/粒/60天皮下埋入手术(GC)+Vehicle(PBS)(皮下给药)

(iii)GC+Siglec-15Ab组：与GC处理一起，将抗Siglec-15抗体以1mg/kg的用量(低用量)或10mg/kg的用量(高用量)每3周一次皮下给药。抗Siglec-15抗体使用上述#32A1抗体。

(iv)GC+ALN组：与GC处理一起，将ALN以0.014mg/kg的用量(低用量)或0.140mg/kg的用量(高用量)每周2次皮下给药。

PSL皮下埋入手术与抗Siglec-15抗体或ALN的给药同时开始。

(4)给药观察期

给药开始起的6周(6周龄至12周龄)。在该时期结束后(12周龄)安乐死，并进行评价。

各实验组的大鼠在SPF环境下用常规饲料来饲养。使其自由摄取饲料、水。

为了进行骨标记，在安乐死5天前给药四环素，进一步在安乐死2天前给药钙黄绿素(间隔3天)。在给药钙黄绿素的36小时后安乐死。关于四环素，以10mg/ml的浓度溶解于PBS中，以25mg/kg的用量对各动物进行皮下注射。另外，关于钙黄绿素，以10mg/ml的浓度溶解于1.4％小苏打溶液中，以10mg/kg的用量对各动物进行皮下注射。

(5)评价项目

＜纵向的评价＞

(i)头体长及体重

(ii)股骨长

在麻醉下通过微CT拍摄每3周进行一次股骨长的测定。

(iii)骨形成标志物和骨吸收标志物

在给药开始前和给药6周后的安乐死前，从尾静脉采血，通过ELISA法测定血中的骨形成标志物(血清骨钙素)和骨吸收标志物(血清TRACP-5b)的值。

各种操作按照图7中记载的时间表来实施。

＜分析物摘出后的评价＞

安乐死后进行解剖，采集股骨、胫骨、第5腰椎，作为评价样品。

(i)骨形态的测量

进行股骨、胫骨的微CT拍摄，测定右股骨长。

(ii)组织学研究

未脱钙硬组织标本：利用左胫骨近端1/2(长度约1.5cm)的冠状切断组织。浸渍于70％乙醇而固定后，保存于冷暗处。将得到的未脱钙硬组织标本用于Villanueva染色、明视野观察及荧光观察、以及定量性骨形态测量。

关于生长障碍，由于为期6周的给药中可能并不会产生在股骨长方面出现差异之类的变化，因此在组织学上进行使用上述未脱钙及脱钙组织进行生长软骨板宽度测量和长轴方向上的生长速度测量，来评价生长障碍(“新的骨形态测量”、2014年、WE-NET出版)。

(iii)力学试验

对于左股骨骨干部，进行3点弯曲试验，另外对于第3腰椎和左股骨远端，进行压缩试验，来评价最大断裂强度、刚性、弹性模量及韧性。

(iv)骨密度测定

使用骨密度测定装置(日立Allo Medica公司制)利用DXA法进行腰椎、左股骨远端BMD及BMC测定。

II.实验结果

(1)药剂对生长的影响

将从给药观察期开始起纵向测量体重、头体长、股骨长的结果示于图8。在8周龄时，GC组、GC+Siglec-15 Ab组、GC+ALN组中存在体重减少峰，其后体重逐渐恢复、增加(图8A(i))。头体长、股骨长则在9周龄至12周龄间与体重同样地存在增加的倾向(图8A(ii)，(iii))。

关于6周龄至12周龄的体重、头体长、股骨长的变化量，GC组与Sham组相比显著下降，但GC组与GC+Siglec-15 Ab组及GC+ALN组之间均未确认到显著差异(图8B)。

(2)药剂对骨代谢(骨形成标志物和骨吸收标志物)的影响

将给药观察期开始前及6周后所采集的血液样品中的骨形成标志物(血清骨钙素)和骨吸收标志物(血清TRACP-5b)的测定结果示于图9。

GC组中，作为骨吸收标志物的TRACP-5b在6周后(12周龄)增加了75％(图9A、B)。

与此相对地，GC+Siglec-15 Ab组、GC+ALN组中，血清TRACP-5b显著减少(图9A，B)。

另一方面，关于作为骨形成标志物的骨钙蛋白，Sham组中在6周龄至12周龄间降低了27％左右(图9A，B)。血清骨钙素在GC组中显示出少许下降倾向，但与Sham组、GC+Siglec-15 Ab组、GC+ALN组相比均未确认到显著差异(图9A，B)。

(3)药剂对初级海绵骨区域的影响

将关于给药观察期结束时(12周龄时)的胫骨近端部的、药剂对生长的影响的组织学评价结果示于图10-1、图10-2。图10-1(A)示出对该胫骨近端部进行微CT拍摄、将获得的数据进行三维重建而得到的图像(3D-CT图像)的冠状断面照片。若观察3D-CT图像，GC+Siglec-15 Ab组与Sham组相比在形态方面没有大的变化，但GC+ALN组(高用量)中骨端部至骨干端部呈圆杯状(Cupping)的形态(正常情况下为喇叭状的形态)。

为了更详细地研究各药剂对初级海绵骨区域的效果，进行了组织学研究。

用荧光显微镜观察在安乐死5天前给药四环素、继而在安乐死2天前用钙黄绿素进行了标记的未脱钙组织标本(图10-1(B))，评价生长速度(图10-2(F))。图10-1(B)中示出在安乐死2天前与生长软骨平行地被标记在远端部位的区域(白下箭头)，另外被平行地标记在远端的部位表示安乐死5天前所标记的区域(白上三角形)。基于这2个位置的标记的区域之间的距离来评价骨生长速度。

结果，在Sham组、GC组、GC+Siglec-15 Ab组、GC+ALN组之间均未确认到显著差异(图10-2(F))。

另外，将使用用于软骨的评价的番红O染色(对酸性粘多糖类进行染色)标本进行生长软骨及紧挨生长软骨下方的初级海绵骨区域的观察的结果示于图10-1(C)。关于初级海绵骨区域的骨内的番红O染色阳性(红色)区域(软骨基质)，确认到GC+ALN组与Sham组、GC组、GC+Siglec-15Ab组相比番红O染色阳性的区域多且广泛分布至远端。关于生长软骨宽度，虽然GC+ALN组显示出少许的下降倾向，但是与Sham组、GC组、GC+Siglec-15 Ab组相比未确认到统计学上的显著差异(图10-2(E))。

另外将为了评价初级海绵骨区域的骨吸收而观察TRACP染色标本的结果示于图10-2(D)。GC组与Sham组相比，确认到初级海绵骨区域的TRACP阳性细胞增加。GC+Siglec-15Ab组中的TRACP阳性细胞与GC组为同等程度。另一方面，GC+ALN组中的TRACP阳性细胞与Sham组、GC组相比，确认到显著的减少。进一步对初级海绵骨区域的破骨细胞面相对于骨表面(Oc.Pm/B.Pm(％))进行了定量评价，结果是，在GC+Siglec-15 Ab组和GC组之间没有显著性差异，但是确认到ALN给药组与GC组相比显著下降(图10-2(G))。

(4)药剂对次级海绵骨的影响

将关于给药观察期结束时(12周龄时)的股骨远端骨干端部的、药剂对生长的影响的组织学评价结果示于图11-1、图11-2。图11-1(A)示出对该股骨远端骨干端部进行微CT拍摄而得的图像(3D-CT图像)的冠状断面照片。观察3D-CT图像可确认，GC组与Sham组相比，在紧挨生长区上方区域确认到骨量增加，在从生长区起远离近端侧的次级海绵骨区域(框内)确认到骨量下降(图11-1(A))。

在GC+Siglec-15 Ab组及GC+ALN组中，从紧挨生长区上方向着股骨近端的区域均确认到用量依赖性的骨量加。而且颇具意味的是，GC+Siglec-15 Ab组与GC+ALN组相比，连更接近近端的区域内也确认到骨量增加。该结果暗示，ALN给药阻碍了长轴方向的生长。

另外，以次级海绵骨区域(框内)为关注区域，进行骨微细结构分析，定量评价骨量变化(图11-1(B))。关于骨量(BV/TV(％))，GC组与Sham组相比，确认到下降的倾，GC+Siglec-15 Ab组和GC+ALN组(高用量)与GC组相比确认到显著增加。关于骨小梁宽度(Tb.Th(μm))，GC组与Sham组相比未确认到显著差异，但GC+Siglec-15 Ab组的骨小梁数(Tb.N(N/mm))与GC组相比，确认到显著的增加。另外，在使用DXA法的同一部位的骨密度测定中，关于股骨远端部的BMD，GC组Sham组相比确认到下降，GC+Siglec-15 Ab组及GC+ALN组与GC组相比确认到用量依赖性的增加(图11-1(C))。

另外，进行股骨远端部的压缩试验，来评价股骨远端部的力学强度(图11-2(D))。在GC+Siglec-15 Ab组中，确认到最大断裂强度及韧性均呈用量依赖性增大。GC+ALN组的最大断裂强度及韧性虽然也都显示出增加倾向，但是与GC组相比，均未确认到显著差异。可以认为，股骨骨干端部压缩试验中的GC+Siglec-15 Ab组和GC+ALN组的力学强度差异是由于，Siglec-15 Ab组中骨量在更接近近端的区域的广泛范围内均增加，而GC+ALN组中骨量增加的范围窄。

(5)结论

由以上结果可确认，抗Siglec-15抗体、双膦酸盐中的任一药剂均会使作用于次级海绵骨的重塑的破骨细胞显著减少，这会带来骨量增加效果。特别有意味的一点是，与用双膦酸盐治疗时相比，用抗Siglec-15抗体治疗时可在长轴方向上的更大范围内确认到骨量增加。对于生长期的小儿而言，在紧挨生长区下方形成的初级海绵骨逐渐被塑造为次级海绵骨并且以被推出的方式逐渐向着骨干部方向移动。可认为，在用双膦酸盐治疗时，该海绵骨的移动变慢，与此相对地，抗Siglec-15抗体不会产生这种延迟，从而在更大的范围内有效地产生骨量增加。该结果暗示，在小儿骨质疏松症中，抗Siglec-15抗体可发挥与双膦酸盐同等或更高的骨量增加效果，可以说显示了在该疾病的治疗中的有用性。

关于骨的生长障碍，在上述“A.使用生长期健康大鼠的评价”的使用生长期健康大鼠的实验中，确认到双膦酸盐的给药导致长骨生长障碍的产生、而抗Siglec-15抗体的给药不会产生这种障碍。另外，通过组织学方式确认到，双膦酸盐的给药导致作用于生长区软骨的吸收、骨干端部的初级海绵骨及皮质骨的塑造的破骨细胞显著减少，而抗Siglec-15抗体的给药中则不减少。该结果暗示，双膦酸盐可能对生长区附近组织的塑造造成了负面影响。需要说明的是，在上述“B.使用小儿糖皮质激素性骨质疏松症模型大鼠的评价”的使用小儿糖皮质激素性骨质疏松症模型大鼠的实验中，双膦酸盐的给药导致骨干端附近的骨形态产生异常，而长轴方向的生长未观察到显著的生长障碍。认为其原因在于，在该骨质疏松症模型大鼠中，类固醇引起了重度生长障碍，与该影响相比，双膦酸盐产生的影响小、不显著。实际上，在双膦酸盐高用量给药组中，头体长、股骨长均观察到下降的倾向。

关于双膦酸盐给药导致骨干端附近的骨形态异常这一点，在实际的人类小儿的使用例中也有报道，担忧长期使用所造成的影响(Michael P，et al.N Engl J Med，2003)。由于到目前为止，几乎没有得到关于双膦酸盐制剂在小儿糖皮质激素性骨质疏松症中长期应用的效果、安全性的数据，因此需要谨慎应用(Cochrane Database Syst Rev.2007Oct 17；(4)：CD005324.，Marini JC.Nat Rev Endocrinol.2009May；5(5)：241-3.；美国国立卫生研究院(https：//www.bones.nih.gov/health-info/bone/bone-health/juvenile/juvenile-osteo porosis#a))。

另一方面，上述结果显示，在骨的生长区附近存在Siglec-15的代偿机制，且利用抗Siglec-15抗体的治疗抑制次级海绵骨中的重塑破骨细胞而不抑制与骨生长相关的塑造破骨细胞。因此，抗Siglec-15抗体疗法对于小儿骨质疏松症患者也可以比较安全地使用，可以说是不会产生生长障碍、骨结构异常、骨质异常等的极为合适的治疗方法。

序列表

<110> 国立大学法人北海道大学（National University Corporation HokkaidoUniversity）

第一三共株式会社（DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED）

<120> 不产生生长障碍的小儿骨质疏松症治疗药（A drug for childhoodosteoporosisthe osteoclast without growth

disorder）

<130> PD20-9022WO

<150> JP 2017-129129

<151> 2017-6-30

<160> 22

<170> PatentIn version 3.4

<210> 1

<211> 987

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(987)

<400> 1

atg gaa aag tcc atc tgg ctg ctg gcc tgc ttg gcg tgg gtt ctc ccg 48

Met Glu Lys Ser Ile Trp Leu Leu Ala Cys Leu Ala Trp Val Leu Pro

1 5 10 15

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Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu

20 25 30

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Asn Thr Glu Val His Ser Ser Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val

35 40 45

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50 55 60

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Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325

<210> 2

<211> 328

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

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1 5 10 15

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20 25 30

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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145 150 155 160

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165 170 175

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195 200 205

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210 215 220

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305 310 315 320

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325

<210> 3

<211> 1026

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1026)

<400> 3

atg gag ggg tcc ctc caa ctc ctg gcc tgc ttg gcc tgt gtg ctc cag 48

Met Glu Gly Ser Leu Gln Leu Leu Ala Cys Leu Ala Cys Val Leu Gln

1 5 10 15

atg gga tcc ctt gtg aaa act aga aga gac gct tcg ggg gat ctg ctc 96

Met Gly Ser Leu Val Lys Thr Arg Arg Asp Ala Ser Gly Asp Leu Leu

20 25 30

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Asn Thr Glu Ala His Ser Ala Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val

35 40 45

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Pro Ala Glu Val Asn Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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<211> 341

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

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1 5 10 15

Met Gly Ser Leu Val Lys Thr Arg Arg Asp Ala Ser Gly Asp Leu Leu

20 25 30

Asn Thr Glu Ala His Ser Ala Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val

35 40 45

Pro Ala Glu Val Asn Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys

50 55 60

Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile

65 70 75 80

Trp Arg Ser Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Thr

85 90 95

Ala Ala Pro Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly

100 105 110

Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg

115 120 125

Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Ser Gly Arg Tyr Phe Cys Arg Val

130 135 140

Glu Phe Thr Gly Asp Ala His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val

145 150 155 160

Arg Leu Arg Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu

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Pro Gly Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly Glu

180 185 190

Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Pro Gly Asn Ser Ser

195 200 205

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210 215 220

Pro Ala Leu Thr Arg Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala Asn Ser

225 230 235 240

Leu Gly Arg Ala Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His Gly Ala

245 250 255

Pro Gly Thr Ser Thr Leu Ala Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gly Leu Lys

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Ala Leu Leu Leu Leu Gly Ile Leu Gly Ala Arg Ala Thr Arg Arg Arg

275 280 285

Leu Asp His Leu Val Pro Gln Asp Thr Pro Pro Arg Ser Gln Ala Gln

290 295 300

Glu Ser Asn Tyr Glu Asn Leu Ser Gln Met Ser Pro Pro Gly His Gln

305 310 315 320

Leu Pro Arg Val Cys Cys Glu Glu Leu Leu Ser His His His Leu Val

325 330 335

Ile His His Glu Lys

340

<210> 5

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<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(774)

<400> 5

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1 5 10 15

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Met Gly Ser Leu Val Lys Thr Arg Arg Asp Ala Ser Gly Asp Leu Leu

20 25 30

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Asn Thr Glu Ala His Ser Ala Pro Ala Gln Arg Trp Ser Met Gln Val

35 40 45

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Pro Ala Glu Val Asn Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys

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Thr Phe Thr His Pro His Arg His Tyr Asp Gly Pro Leu Thr Ala Ile

65 70 75 80

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Trp Arg Ser Gly Glu Pro Tyr Ala Gly Pro Gln Val Phe Arg Cys Thr

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Ala Ala Pro Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly

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Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Ser Gly Arg Tyr Phe Cys Arg Val

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Glu Phe Thr Gly Asp Ala His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val

145 150 155 160

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Arg Leu Arg Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu

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180 185 190

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Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Pro Gly Asn Ser Ser

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Pro Ala Leu Thr Arg Asp Gly Arg Tyr Thr Cys Thr Ala Ala Asn Ser

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ctg ggc cgc gcc gag gcc agc gtc tac ctg ttc cgc ttc cac ggc gcc 768

Leu Gly Arg Ala Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His Gly Ala

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Pro Gly

<210> 6

<211> 780

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> CDR

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<220>

<221> CDS

<222> (1)..(780)

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1 5 10 15

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Thr Gly Ser Phe Val Arg Thr Lys Ile Asp Thr Thr Glu Asn Leu Leu

20 25 30

aac aca gag gtg cac agc tcg cca gcg cag cgc tgg tcc atg cag gtg 144

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35 40 45

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Pro Pro Glu Val Ser Ala Glu Ala Gly Asp Ala Ala Val Leu Pro Cys

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Ala Ala Arg Gly Ser Glu Leu Cys Gln Thr Ala Leu Ser Leu His Gly

100 105 110

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Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asn Pro Arg Arg Asn Asp Leu Ser Leu Arg

115 120 125

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Val Glu Arg Leu Ala Leu Ala Asp Asp Arg Arg Tyr Phe Cys Arg Val

130 135 140

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Glu Phe Ala Gly Asp Val His Asp Arg Tyr Glu Ser Arg His Gly Val

145 150 155 160

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Arg Leu His Val Thr Ala Ala Pro Arg Ile Val Asn Ile Ser Val Leu

165 170 175

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Pro Ser Pro Ala His Ala Phe Arg Ala Leu Cys Thr Ala Glu Gly Glu

180 185 190

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Pro Pro Pro Ala Leu Ala Trp Ser Gly Pro Ala Leu Gly Asn Ser Leu

195 200 205

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Ala Ala Val Arg Ser Pro Arg Glu Gly His Gly His Leu Val Thr Ala

210 215 220

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225 230 235 240

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Asn Ser Leu Gly Arg Ser Glu Ala Ser Val Tyr Leu Phe Arg Phe His

245 250 255

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Gly Ala Ser Gly

260

<210> 7

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 7

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Phe

35 40 45

Asn Asp Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Ile Tyr Thr Tyr Ala Thr Phe

65 70 75 80

Tyr Ala Glu Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Ser Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

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115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

145 150 155 160

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

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Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn

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Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

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Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 8

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 8

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala

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Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

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Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

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Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

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Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 9

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 9

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

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Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe

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Asn Asp Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Ile Tyr Thr Tyr Ala Thr Phe

65 70 75 80

Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

85 90 95

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

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Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

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Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 10

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 10

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

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Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

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Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

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Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

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Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

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180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 11

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 11

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Phe Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Ala Gln Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 12

Asp Tyr Phe Met Asn

1 5

<210> 13

<211> 14

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 13

Gln Ile Arg Asn Lys Ile Tyr Thr Tyr Ala Thr Phe Tyr Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 14

Ser Leu Thr Gly Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 15

<211> 15

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 15

Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His

1 5 10 15

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 16

Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 17

<211> 9

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 17

Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr

1 5

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 18

Ser Leu Glu Gly Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 19

<211> 466

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 19

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe

35 40 45

Asn Asp Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Ile Tyr Thr Tyr Ala Thr Phe

65 70 75 80

Tyr Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

85 90 95

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Leu Glu Gly Gly Asp Tyr Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

130 135 140

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu

145 150 155 160

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

165 170 175

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

195 200 205

Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn

210 215 220

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg

225 230 235 240

Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly

245 250 255

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

260 265 270

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

275 280 285

Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg

305 310 315 320

Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

325 330 335

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu

340 345 350

Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

355 360 365

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

370 375 380

Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

385 390 395 400

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met

405 410 415

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

420 425 430

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

435 440 445

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

450 455 460

Gly Lys

465

<210> 20

<211> 238

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成结构

<400> 20

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser

1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Glu Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Leu Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 21

<211> 167

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 21

Met Lys Leu Trp Leu Ser Trp Ile Phe Leu Val Val Leu Phe Lys Gly

1 5 10 15

Val Arg Cys Glu Val Gln Ile Leu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Phe

35 40 45

Asn Asp Tyr Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Gln Ile Arg Asn Lys Ile Tyr Thr Tyr Ala Thr Phe

65 70 75 80

Tyr Ala Glu Ser Leu Glu Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

85 90 95

Glu Ser Ser Val Tyr Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Leu Thr Gly Gly Asp Tyr Phe Asp

115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Leu Ala Glu Thr Thr

130 135 140

Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn

145 150 155 160

Ser Met Val Thr Leu Gly Cys

165

<210> 22

<211> 139

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 22

Met Glu Thr Asp Arg Leu Leu Leu Trp Ala Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val

20 25 30

Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

35 40 45

Thr Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Gln Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly

65 70 75 80

Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Asn Pro Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

100 105 110

Gln Ser Arg Lys Ser Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Leu Arg Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser

130 135

Claims

1.一种用于治疗和/或预防小儿骨质疏松症的药物组合物，其包含与Siglec-15结合、且具有抑制破骨细胞的形成和/或破骨细胞所致的骨吸收的活性的抗体或其功能性片段。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其不会产生生长障碍、骨结构异常和/或骨质异常。

3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，小儿骨质疏松症为由于药剂给药而发病的小儿骨质疏松症。

4.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中，小儿骨质疏松症为小儿糖皮质激素性骨质疏松症。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗体为单克隆抗体。

6.根据权利要求1～4中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含由序列表的序列号12所示的氨基酸序列构成的CDRH1、由序列表的序列号13所示的氨基酸序列构成的CDRH2及由序列表的序列号14所示的氨基酸序列构成的CDRH3，所述轻链包含由序列表的序列号15所示的氨基酸序列构成的CDRL1、由序列表的序列号16所示的氨基酸序列构成的CDRL2及由序列表的序列号17所示的氨基酸序列构成的CDRL3。

7.根据权利要求1～6中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗体的功能性片段为Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv或scFv。