TW201509431A - 人化axl抗體類 - Google Patents
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Abstract
本發明關於單株人化抗體類,該等抗體與AXL受體酪胺酸激酶之細胞外結構域結合且該等抗體至少部分地抑制AXL活性。
Description
本發明關於單株人化抗體類,該等抗體與AXL受體酪胺酸激酶之細胞外結構域結合且該等抗體至少部分地抑制AXL活性。
AXL(Ark,UFO,Tyro-7)受體酪胺酸激酶係Tyro-3激酶家族之成員,該家族之其他成員為Mer(Eyk,Nyk,Tyro-12)及Sky(Rse,Tyro-3,Dtk,Etk,Brt,Tif)。AXL藉由與異嗜性配體Gas6(與抗凝因子蛋白S同源之70-kDa蛋白質)結合而活化。不同於其他受體酪胺酸激酶,AXL酪胺酸磷酸化亦可由同嗜性結合激活。AXL活化導致經由PI-3-激酶/Akt(Franke et al.,Oncogene 22:8983-8998,2003)及其他主要途徑如Ras/Erk及β連鎖蛋白(β-catenin)/TCF(Goruppi et al.,Mol.Cell Biol.21:902-915,2001)之傳訊。
AXL係微弱地表現於一系列正常組織(包括腦、心臟、骨骼肌、數種其他器官之器官包囊及結締組織)及單
核細胞中,但不表現於淋巴細胞。由AXL誘導之Akt磷酸化已被描述於纖維母細胞(Goruppi et al.,Mol Cell Biol 17:4442-4453 1997)、內皮細胞(Hasanbasic et al.,Am J Physiol Heart Circ Physiol,2004)、血管平滑肌細胞(Melaragno et al.,J.Mol.Cell Cardiol.37:881-887,2004)及神經元(Allen et al.,Mol.Endocrinol.13:191-201 1999)之存活。另外,AXL在細胞黏附及趨化性上扮演角色。AXL基因剔除顯示血小板整合素(integrin)IIb3活化減少所導致之血小板凝集穩定受損及血栓形成。
AXL過度表現已經在多種癌症類型中證實,例如乳癌(Meric et al.,Clin.Cancer Res.8:361-367,2002;Berclaz et al.,Ann.Oncol.12:819-824,2001)、結腸癌(Chen et al.,Int.J.Cancer 83:579-584,1999;Craven et al.,Int.J.Cancer 60:791-797,1995)、前列腺癌(Jacob et al.,Cancer Detect.Prev.23:325-332,1999)、肺癌(Wimmel et al.,Eur J Cancer 37:2264-2274,2001)、胃癌(Wu et al.,Anticancer Res 22:1071-1078,2002)、卵巢癌(Sun et al.,Oncology 66:450-457,2004)、子宮內膜癌(Sun et al.,Ann.Oncol.14:898-906,2003)、腎癌(Chung et al.,DNA Cell Biol.22:533-540,2003)、肝細胞癌(Tsou et al.,Genomics 50:331-340,1998)、甲狀腺癌(Ito et al.,Thyroid 12:971-975,2002;Ito et al.,Thyroid 9:563-567,1999)、食道癌(Nemoto et al.,1997),另外在慢性骨髓性白血病(CML)(Janssen et
al.,A novel putative tyrosine kinase receptor with oncogenic potential.Oncogene,6:2113-2120,1991;Braunger et al.,Oncogene 14:2619-2631 1997;O’Bryan et al.,Mol Cell Biol 11:5016-5031,1991)、急性骨髓性白血病(AML)(Rochlitz et al.,Leukemia 13:1352-1358,1999)、骨肉瘤(Nakano et al.,J.Biol.Chem.270:5702-5705,2003)、黑色素瘤(van Ginkel et al.,Cancer Res 64:128-134,2004)及頭頸鱗狀細胞癌(Green et al.,Br J Cancer.2006 94:1446-5,2006)。
另外AXL已被鑑別為轉移相關基因,其在侵入性乳癌細胞系中相較於非侵入性細胞中上調。在活體外,AXL活性被發現係為遷移及侵入所需,且該活性可被抗體治療抑制(WO04008147)。同樣的,藉由負顯性AXL版本之表現(Vajkoczy,P.,et al.,Proc.Natl.Acad.Science U.S.A.103:5799-5804,2005)或藉由siRNA媒介之AXL下調(Holland et al.,Cancer Res.65:9294-9303,2005)廢除AXL活體內活性在鼠異種移植實驗中防止皮下及原位細胞生長。
目前已經描述與AXL結合且具有生物活性之抗體。舉例來說,一種已知抗體能減少AXL媒介之細胞侵入(WO04008147),另外有其他抗體已被報告能減少AXL/配體交互作用。然而,所有已知之抗體係多株或非人化單株抗體。非人化之多株或單株抗體係快速地自循環中移除,通常導致系統性發炎效應,使彼等不適合用於治療性
投予。
因此有鑑於AXL之治療潛力,對於可有效且專一地阻斷AXL媒介之信號傳導且適合供治療性處理之單株人化AXL抗體、抗體片段或彼等之衍生物有高度需求。
因此本發明之第一態樣關於一種單株人化抗體(包括彼之片段或衍生物),其與AXL(特定地人AXL)之細胞外結構域結合且至少部分地抑制AXL活性。
本發明之人化抗體較佳地具有至少一或多種下列特性:減少或阻斷AXL媒介性信號傳導之能力、減少或阻斷AXL磷酸化之能力、減少或阻斷細胞增生之能力、減少或阻斷血管新生之能力、減少或阻斷細胞遷移之能力、減少或阻斷腫瘤轉移之能力及減少或阻斷AXL媒介性抗細胞凋亡作用之能力,因此增加例如細胞對於抗腫瘤劑治療之敏感性。
根據本發明特別較佳之實施態樣,此處所描述之人化抗體顯示減少及/或阻斷配體誘導之AXL下游傳訊分子(諸如ERK1/2、AKT、GSK-3 β、TSC2、mTOR及/或S6K1)之磷酸化之能力。
另外本發明之人化抗體可能展現高度AXL(特定地人AXL)專一性,且不顯著辨識其他Tyro-3家族成員,例如MER及/或SKY及/或哺乳動物非靈長動物AXL諸如小鼠AXL。
此處所使用之用語「活性」係指AXL之生物功能,其影響細胞之表現型,特定但不限於癌表現型,諸如逃避細胞凋亡、生長信號自足、細胞增生、組織侵入及/或轉移、對抗生長信號(抗細胞凋亡)之不敏感性及/或持續血管新生。
用語「AXL媒介性信號傳導」係指活化第二信使途徑,諸如由AXL與第二信使分子直接或間接交互作用所誘發之下游傳訊。
用語「AXL磷酸化」係指由第二AXL蛋白(磷酸轉移作用)或由具有蛋白質激酶活性之其他蛋白質對胺基酸殘基較佳地酪胺酸殘基之磷酸化。
用語「細胞增生」係指為人細胞(特定地但不限於人癌細胞)繁殖基礎之所有AXL相關過程。該些過程貢獻或導致細胞性DNA之複製、將經複製之DNA分離成二組相同大小之染色體及物理分割(稱為細胞質分裂)整體細胞,該些過程應由AXL之非酶催化性或酶催化性活性刺激或媒介,較佳地包括AXL磷酸化及/或AXL媒介性信號傳導。
用語「血管新生」係指導致新的血管自原有血管生長之所有AXL相關過程,特定但不限於新的腫瘤供應血管。這些過程包括多重細胞事件諸如血管內皮細胞之增生、存活、遷移及芽生、周細胞之吸引及移動以及基底膜形成以穩定血管、血管灌流或由基質或腫瘤細胞分泌血管新生因子,該些過程應由AXL之非酶催化性或酶催化性活性刺
激或媒介,較佳地包括AXL磷酸化及/或AXL媒介性信號傳導。
用語「轉移」係指支持癌細胞自原發腫瘤分散、穿透至淋巴管及/或血管、經由血流循環及於身體他處之正常組織遠處焦點(轉移)生長之所有AXL相關過程。特定地,轉移係指腫瘤細胞之細胞事件諸如增生、遷移、錨定不依賴性、逃避細胞凋亡或分泌血管新生因子,該些細胞事件係轉移之基礎且係由AXL之非酶催化性或酶催化性活性刺激或媒介,較佳地包括AXL磷酸化及/或AXL媒介性信號傳導。
用語「AXL媒介性抗細胞凋亡作用」係指防止人細胞(較佳但不限於人癌細胞)發生計畫性細胞死亡(細胞凋亡)之所有AXL相關過程。特定地,其係指防止人細胞(較佳但不限於人癌細胞)透過生長因子抽離、缺氧、暴露於化學治療劑或放射線或啟動Fas/Apo-1受體媒介性傳訊以誘導細胞凋亡之過程,該些過程係由AXL之非酶催化性或酶催化性活性刺激或媒介,較佳地包括AXL磷酸化及/或AXL媒介性信號傳導。
用語「區」及「結構域」在本發明中可彼此相容。
在本發明中被稱為「11B7」及「11D5」之抗體亦分別被稱為「#11B7」及「#11D5」。
根據本發明之第二態樣,此處所描述之人化抗體係源自嵌合(大鼠/人)抗AXL抗體11B7(彼之輕鏈及重鏈胺基酸序列係分別由SEQ ID NO:135及136表示)、11D5
(彼之輕鏈及重鏈胺基酸序列係分別由SEQ ID NO:137及138表示)或10D12中之一者,或辨識AXL之細胞外結構域上相同表位之抗體。特定較佳地,該人化抗體係源自11B7或11D5。較佳地,該人化抗體含有於至少一個可變結構域之架構區中之至少一個突變。該突變可由該領域之技藝人士所知之任何方法導入以改變胺基酸序列。該突變較佳地以在人架構區中之保守胺基酸取代11B7或11D5之架構區中之胺基酸。測定人架構區中之保守或一致胺基酸之方法諸如舉例來說利用諸如IgBLAST程式之同源模擬法係該領域之技藝人士所知。根據另一較佳之實施態樣,本發明之人化抗體係源自抗AXL抗體,較佳地源自抗AXL抗體11B7或11D5,其中該抗體(較佳地11B7或11D5)之至少一個可變結構域之架構區係由人或人化架構區取代。
本發明之抗體對AXL之結合活性可由該領域之技藝人士所知之方法測定。舉例來說,該活性可利用Biacore之表面電漿共振技術及/或ELISA(酶連接免疫吸附分析法)、EIA(酶免疫測定法)、RIA(放射線免疫測定法)或螢光抗體技術例如FACS測定。
較佳地,本發明之人化抗體相較於多株或單株非人化抗AXL抗體(諸如大鼠11B7或11D5)具有較低之免疫原性。除了該領域之技藝人士所知之其他方法之外,降低之免疫原性可由ELISA基底之HAHA或HAMA測定法(明尼蘇達州美國IBL(IBL-America)公司/義大利理史
塔費雪(LiStarFish)公司)測定。另外,該發明抗體較佳地不自血液循環中快速移除,且若對病患投予不造成系統性發炎效應。
本發明之抗體可能具有至少一個抗原結合位,例如一或二個抗原結合位。另外,該抗體較佳地包含至少一個免疫球蛋白重鏈及至少一個免疫球蛋白輕鏈。免疫球蛋白鏈含有可變結構域及可任意選擇地固定結構域。可變結構域可能包含互補決定區(CDR)(例如CDR1區、CDR2區及/或CDR3區)及架構區。用語「互補決定區」(CDR)在該領域係經完整定義(見例如Harlow and Lane,“Antibodies,a Laboratory Manual”,CSH Press,Cold Spring Harbour,1988),代表在抗體之可變區內主要與抗原接觸之胺基酸片段。
在其他實施態樣中,本發明之人化抗體係源自抗AXL抗體11B7且包含選自SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:48之重鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,或選自SEQ ID NO:80至SEQ ID NO:82之重鏈胺基酸序列的可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,及/或選自SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:30之輕鏈
胺基酸序列或至少彼等之可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,或選自SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:79之輕鏈胺基酸序列的可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,或彼等之片段,該片段辨識AXL之細胞外結構域上之相同表位。本發明之序列說明係於下列「序列說明」及序列表中顯示。
在另一實施態樣中,本發明之人化抗體係源自抗AXL抗體11B7且包含選自SEQ ID NO:150或SEQ ID NO:151之重鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,及/或選自SEQ ID NO:146或SEQ ID NO:147之輕鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等。
在特定較佳之實施態樣中,該人化h#11B7抗體類係選自h#11B7-T1、h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、h#11B7-T6、h#11B7-T7、h#11B7-T8、h#11B7-T9、h#11B7-T10、h#11B7-T11、h#11B7-T12、
h#11B7-T13、h#11B7-T14、h#11B7-T15、h#11B7-T16、h#11B7-T17、h#11B7-T18、h#11B7-T19、h#11B7-T20、h#11B7-T21、h#11B7-T22、h#11B7-T23、h#11B7-T24、h#11B7-T25、h#11B7-T26或h#11B7-T27抗體。表1(實施例10)藉由特定人化重鏈及輕鏈胺基酸序列之組合(分別藉由對應表現載體之組合)概述本發明上述人化h#11B7抗體之特徵。
在另一特定較佳之實施態樣中,該人化h#11B7抗體類係選自h#11B7-T28、h#11B7-T29、h#11B7-T30或h#11B7-T31抗體。表2(實施例22)藉由特定人化重鏈及輕鏈胺基酸序列之組合(分別藉由對應表現載體之組合)概述上述人化h#11B7抗體之特徵。
源自大鼠抗人Axl單株抗體#11B7之人化抗體不限於先前段落舉例說明之特定抗體,只要該人化抗體含有所有6個CDR及與Axl抗原之結合活性。該人化抗體分別在彼之重鏈含有CDRH1(SNYWG;SEQ ID NO:124)、CDRH2(YITYSGSTSYNPSLKS;SEQ ID NO:125)及CDRH3(TTFYY;SEQ ID NO:126),在彼之輕鏈含有CDRL4(RASQDIGNYLR;SEQ ID NO:121)、CDRL5(GATNLAA;SEQ ID NO:122)及CDRL6(LQSKESPWT;SEQ ID NO:123)。
在其他實施態樣中,本發明之人化抗體係源自11D5且包含選自SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:72之重鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域,或與彼等具有至少
90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,或選自SEQ ID NO:114至SEQ ID NO:120之重鏈胺基酸序列的可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,及/或選自SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:60之輕鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,或選自SEQ ID NO:83至SEQ ID NO:113之輕鏈胺基酸序列的可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列,該結合活性與具有100%序列一致性者相等,或彼等之片段,該片段辨識AXL之細胞外結構域上之相同表位。
在特定較佳之實施態樣中,該人化h#11D5抗體類係選自h#11D5-T1、h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5或h#11D5-T6抗體。實施例11、12及14藉由特定人化重鏈及輕鏈胺基酸序列之組合(分別藉由對應表現載體之組合)顯示該上述人化h#11D5抗體之特徵。
本發明之較佳實施態樣中之一者係具有相對高熱變性中點(Tm)之人化抗體。在本發明中,人化抗體具有至少70℃之Tm,較佳地至少75℃之Tm,更佳地至少78℃
之Tm,更佳地至少80℃之Tm,另外更佳地至少82℃之Tm。或者,在本發明中,人化抗體具有相當於彼之原型大鼠或嵌合抗體之Tm之Tm,但是較佳地具有相較於彼之原型大鼠或嵌合抗體之Tm至少高3℃之Tm,更佳地至少高6℃之Tm,另外更佳地至少高8℃之Tm,甚至更佳地至少高10℃之Tm。該較佳、更佳、另外更佳或甚至更佳之人化抗體較不易變性(展開)或去活化,且適合被製備成可長時間穩定儲存之溶液調製劑。
源自大鼠抗人Axl單株抗體#11D5之人化抗體不限於先前段落舉例說明之特定抗體,只要該人化抗體含有所有6個CDR及與Axl抗原之結合活性。該人化抗體分別在彼之重鏈含有CDRH1(SNYWG;SEQ ID NO:130)、CDRH2(HITNSGNTTYNPSLKS;SEQ ID NO:131)及CDRH3(GAFDY;SEQ ID NO:132),在彼之輕鏈含有CDRL4(RASQDIGNYLS;SEQ ID NO:127)、CDRL5(GAIKLAV;SEQ ID NO:128)及CDRL6(LQYIQFPLT;SEQ ID NO:129)。
本發明另一較佳之實施態樣係(專一性)結合或辨識靠近羧基端之IG結構域(該結構域包含NCBI蛋白質資料庫登錄號P_30530(SEQ ID NO:139;圖30A)中胺基酸號碼129-220之胺基酸殘基)中之一者之抗體。該較佳之抗體不限於人化抗體,但可為人抗體或彼等中之一者之功能片段。更佳地,該較佳之抗體抑制至少一種Axl所具有之生物活性。
本發明之(完整)抗體可舉例來說藉由執行下列步驟加以產製:建構重鏈表現載體及輕鏈表現載體,其中每個該載體具有包含可變區及固定區之插入物;將該等載體導入宿主細胞中;培養該細胞;自培養上清液(條件培養基)收集抗體多肽,如實施例9至12之例證。
此處所使用之二個多肽序列之間之「序列一致性」表示該等序列之間相同之胺基酸的百分比。測定二個給定多肽序列之間之「序列一致性」之方法係該領域之技藝人士所知。本發明之較佳多肽序列具有至少90%、更佳至少95%且甚至更佳至少98%之序列一致性。該序列一致性可藉由例如由卡林(Karlin)及奧斯舒爾(Altshul)提出之BLAST演算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90,pp5873(1993))或FASTA(Methods in Enzymol.,183,pp63(1990))測定。稱為BLASTN或BLASTX之程式係可獲得的(J.Mol.Biol.,215,pp403(1990))。
本發明之抗體可為IgA-、IgD-、IgE-、IgG-或IgM型,較佳地為IgG-或IgM型,包括但不限於IgG1-、IgG2-、IgG3-、IgG4-、IgM1-或IgM2型。
發明抗體可較佳地藉由同源模擬法使用該領域之技藝人士所知之任何適當程序加以設計。另外,給定抗體諸如11B7或11D5之人化型式可根據該領域已知之方法諸如嵌合或CDR移植加以產製。用於產製人化抗體之替代方法係該領域所廣為周知且係描述於例如EP-A1 0 239 400及W09007861。一般來說,人化抗體具有一或多個自非人來
源導入之胺基酸殘基。該些非人胺基酸殘基通常係指「輸入」殘基,通常取自「輸入」可變區。人化舉例來說可依照溫特(Winter)及同僚(Jones et al.,Nature,321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature,332:323-327(1988);Verhoeyen et al.,Science,239:1534-1536(1988))之方法進行,藉由以人抗體之對應序列取代非人來源之CDR或CDR序列。因此,該「人化」抗體係嵌合抗體(美國專利號碼4,816,567),其中實質上少於完整之人可變結構域被來自非人物種之對應序列取代。實際上,人化抗體通常係其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基被來自非人抗體之類似位置的殘基取代之人抗體。
人抗體可源自人抗體之噬菌體展示庫(Wormstone,I.M.et al,Investigative Ophthalmology & Visual Science(2002)43(7),p.2301-2308;Carmen,S.et al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203;Siriwardena,D.et al.,Opthalmology(2002)109(3),p.427-431),此為技藝人士所廣為周知。
舉例來說,可使用噬菌體展示法,該法包含使人抗體之可變區在噬菌體表面上表現為單鏈抗體(scFv)及篩選與抗原結合之噬菌體(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
藉由分析該經篩選之噬菌體的基因,可測定編碼與抗原結合之人抗體可變區之DNA序列。
在測定scFv之DNA序列後,人抗體可藉由建構包含該序列之表現載體並將該載體導入適當之宿主細胞以表現該抗體加以產製(WO92001047,WO92020791,WO93006213,WO93011236,WO93019172,WO95001438,WO95015388及Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455及Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
不論製備方法為何,任何人抗體可作為本發明之實施態樣,只要該人抗體具有人Axl抗原之結合活性及下列所有6個CDR:分別在彼之重鏈含有CDRH1(SNYWG;SEQ ID NO:130)、CDRH2(HITNSGNTTYNPSLKS;SEQ ID NO:131)及CDRH3(GAFDY;SEQ ID NO:132),且彼之輕鏈含有CDRL4(RASQDIGNYLS;SEQ ID NO:127)、CDRL5(GAIKLAV;SEQ ID NO:128)及CDRL6(LQYIQFPLT;SEQ ID NO:129),或者只要該人抗體具有人Axl抗原之結合活性及下列所有6個CDR:分別在彼之重鏈含有CDRH1(SNYWG;SEQ ID NO:124)、CDRH2(YITYSGSTSYNPSLKS;SEQ ID NO:125)及CDRH3(TTFYY;SEQ ID NO:126),且彼之輕鏈含有CDRL4(RASQDIGNYLR;SEQ ID NO:121)、CDRL5(GATNLAA;SEQ ID NO:122)及CDRL6(LQSKESPWT;SEQ ID NO:123)。
就治療目的而言,抗體可與治療效應基團偶聯,例如放射活性基團或細胞毒性基團。
就診斷目的而言,該抗體可經標記。適當之標記包括放射活性標記、螢光標記或酶標記。
如上討論,本發明之抗體可能以除完整抗體以外之多種型式存在;包括例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、雙鏈抗體(diabody)、微小抗體(minibody)、包含超過一個抗體之片段之雙價或多價抗體,以及單鏈抗體(scFV);見例如W08809344。
本發明之抗體可為雙專一性抗體或多專一性抗體,其對超過一個抗原或表位具專一性。
scFv可藉由將免疫球蛋白重鏈之可變區與免疫球蛋白輕鏈之可變區透過多肽連接子融合以獲得(Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,113,edited by Rosenburg and Moore,Springer Verlag,New York,p.269-315(1994)及Nature Biotechnology(2005),23,p.1126-1136)。BiscFv可藉由透過多肽連接子融合2個不同之scFV加以獲得。
產製scFv之方法係該領域之技藝人士所廣為周知(US4,946,778,US5,260,203,US5,091,513,US5,455,030等)。較佳地,在2個可變區之間的連接子不產生共軛物(Huston,J.S.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85;p.5879-5883)。scFV免疫球蛋白重鏈可變區及scFV免疫球蛋白輕鏈可變區可源自相同抗體或2個彼此不同之抗體。多肽連接子可為例如由12至19個胺基酸殘基組成之單鏈肽。
編碼scFV之DNA可藉由包含放大DNA片段之PCR產製,其利用編碼全長或部分之免疫球蛋白重鏈可變區或輕鏈可變區之DNA及分別對應模板2端之各端以作為一對引子之2個寡核苷酸,且接著利用經設計以使重鏈可變區與輕鏈可變區分別與多肽連接子之一端及另一端連接之一對引子放大。
抗體之功能性片段包括scFv可藉由將編碼該scFv之DNA導入宿主細胞且培養該細胞加以產製,如說明書中他處所述。
本發明之實施態樣之一者係相較於單價抗體具有較高抗原結合親和性之多價抗體。該多價抗體之單位可為相同,或當一單位與抗原之表位結合且另一單位與該相同抗原之不同表位結合時彼此不同。結合IgG CH3結構域及二個與鏈黴抗生物素蛋白結合且導入螺旋-轉角-螺旋模體之scFv可被應用於產製多價抗體。
若需要,本發明之抗體可於該重鏈及/或輕鏈之可變結構域發生突變以改變該抗體之結合特性。舉例來說,突變可在一或多個CDR區發生以增加或減少該抗體對AXL之Kd,或改變該抗體之結合專一性。定點突變之技術係該領域所廣為周知。見例如Sambrook et al.and Ausubel et al.,同上。另外,突變可發生在AXL抗體之可變區中相較於種系已知被改變之胺基酸殘基。
在另一態樣中,除了關於人化之突變以外,其他突變可被導入一或多個架構區之中。突變可發生在架構區或固
定結構域以增加該AXL抗體之半衰期。見例如WO0009560。在架構區或固定結構域之突變亦可能發生以改變該抗體之免疫原性、提供與另一分子共價或非共價結合之位置,或改變諸如補體固定之特性。突變可能發生在單突變抗體之各個架構區、固定結構域及可變區中。或者,突變可能僅發生在單突變抗體之架構區、可變區或固定結構域之一者。
本發明之實施態樣之一者係包含超過一種本發明之抗體之多株抗體。
本發明之實施態樣之一者係本發明之抗體或彼之功能性片段之化學修飾。分子諸如聚合物(聚乙二醇或該類似物)可被用來產製經修飾之抗體或經修飾之功能性片段。
在其他態樣中,本發明之人化抗體可能含有具備效應功能之固定結構域,藉此該細胞表面已與抗體、抗體片段或彼之衍生物結合之AXL表現細胞可能被免疫系統功能攻擊。舉例來說,該抗體能固定補體及參與補體依賴性細胞毒性作用(CDC)。另外,該抗體能結合效應細胞諸如單核細胞及自然殺手(NK)細胞上之Fc受體及參與抗體依賴性細胞性細胞毒性作用(ADCC)。
在其他態樣中,此處所描述之抗體適用於治療性治療,較佳地用於治療過度增生性疾病、心血管疾病(特定地動脈粥樣硬化及血栓形成)、糖尿病相關疾病(特定地腎小球肥大或糖尿病性腎病)及特定地與AXL表現、過度表現或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、過度表
現或高度活性之疾患。該過度增生性疾病係較佳地選自與AXL表現、過度表現或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、過度表現或高度活性之疾患,諸如癌症例如乳癌、結腸癌、肺癌、腎癌、濾泡淋巴瘤、骨髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、巴瑞特(Barrett)氏食道癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌及頭頸癌,或增生性疾病及腫瘤病或其他AXL表現或過度表現之過度增生性疾病。
本發明之抗體於治療任何Axl相關性疾病諸如過度增生性疾病上之應用性可由活體外(in vitro)、活體內(in vivo)或活體外(ex vivo)實驗證實、顯示或建議,包括該些經配體誘導之Axl自體磷酸化、對Axl媒介性下游信號傳導(諸如配體誘導之Akt及p42/44 MAP激酶磷酸化)之效應、癌細胞遷移或增生、表現Axl細胞經配體誘導之遷移或增生、組織或細胞之血管新生及經移植至非人動物諸如異種移植小鼠之人癌或癌細胞之生長或轉移,以及任何其他前臨床/非臨床實驗及臨床試驗。
在另一態樣中,本發明之抗體可被用於與抗腫瘤劑共同投予以供治療上述疾患中之一者。
此處所使用之共同投予包括投予本發明之抗體與抗腫瘤劑(較佳地細胞凋亡誘發性抗腫瘤劑)。用語共同投予另包括以單一組成物之型式或以二或多種不同組成物之型式投予本發明之抗體與抗腫瘤劑(較佳地細胞凋亡誘發性抗腫瘤劑)。共同投予包括同時(意即在相同時間)或連
續(意即隔一段時間)投予本發明之抗體與抗腫瘤劑(較佳地細胞凋亡誘發性抗腫瘤劑)。
本發明另關於編碼本發明之抗體、抗體片段或彼之衍生物之核酸分子。編碼上述抗體、抗體片段或彼之衍生物之本發明之核酸分子可能為例如DNA、cDNA、RNA或合成產製之DNA或RNA或不論是單獨或組合包含任何該些核酸分子之重組產製之嵌合核酸分子。該核酸分子亦可能為對應整個基因或彼之實質部分或對應片段及彼之衍生物之基因組DNA。該核苷酸序列可能對應天然發生之核苷酸序列或可能包含單一或多重核苷酸取代、刪除或加入。在本發明特定較佳之實施態樣中,該核酸分子係cDNA分子。
在其他態樣中,本發明關於選自下列之經分離之核酸分子:(a)編碼本發明之單株人化抗體、抗體片段或彼之衍生物之核酸序列,(b)如選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:54或SEQ ID NO:60至SEQ ID NO:66中之SEQ ID NO之一者所示之核酸序列,(c)編碼選自SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:55至SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:67至SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121
至SEQ ID NO:132之多肽之核酸序列,(d)與(a)至(c)中任一者之序列互補之核酸,或(e)能在嚴謹條件下與(a)、(b)、(c)或(d)雜交且編碼多肽之核酸序列,其中包含該多肽之抗體或彼之功能性片段與AXL之細胞外結構域結合,(f)如選自SEQ ID NO:144及SEQ ID NO:145與SEQ ID NO:148及SEQ ID NO:149中之SEQ ID NO之一者所示之核酸序列,(g)編碼選自SEQ ID NO:146及SEQ ID NO:147與SEQ ID NO:150及SEQ ID NO:151之多肽之核酸序列,(h)與(f)或(g)中任一者之序列互補之核酸,或(i)能在嚴謹條件下與(f)、(g)或(h)雜交且編碼多肽之核酸序列,其中包含該多肽之抗體或彼之功能性片段與AXL之細胞外結構域結合。
用語「在嚴謹條件下雜交」係指二個核酸片段在例如Sambrook et al.,“Expression of cloned genes in E.coli”in Molecular Cloning:A laboratory manual(1989),Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York,USA所述之標準雜交條件下互相雜交。該等條件係例如在約45℃之6倍SSC中雜交,隨後於50℃以2倍SSC進行清洗步驟,較佳地於65℃之2倍SSC或於50℃之0.2倍SSC,較佳
地於65℃之0.2倍SSC。
本發明亦關於包含本發明之核酸分子之載體。該載體可能為例如噬菌體、質體、病毒或逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒載體可能為可複製性或複製缺陷性。在後者中,病毒繁殖通常將僅發生於補充性宿主細胞。
本發明之核酸分子可能與包含用於在宿主中繁殖之選擇性標記之載體連接。通常,質體載體利用沉澱法導入諸如磷酸鈣沉澱法或氯化銣沉澱法,或利用帶電脂質複合體或碳基底團簇諸如富勒烯(fullerene)導入。當該載體為病毒時,其在應用至宿主細胞之前可能於活體外利用適當之包裝細胞系包裝。
較佳地,本發明之載體係表現載體,其中該核酸分子係與一或多個允許在原核及/或真核宿主細胞中轉錄及可任意選擇地表現之控制序列可操作地連接。該核酸分子之表現包含使該核酸分子之轉錄成為較佳地可轉譯之mRNA。確保在真核細胞(較佳地哺乳動物細胞)中表現之調節元件係該領域之技藝人士所廣為周知。它們通常包含確保轉錄開始之調節序列及確保轉錄終止及穩定該轉錄物之可任意選擇地多聚A信號。其他調節元件可能包括轉錄及轉譯增強子。允許在原核宿主細胞中表現之可能的調節元件包含例如在大腸桿菌中之lac、trp或tac啟動子,允許在真核宿主細胞中表現之調節元件之例係酵母菌中之AOXI或GAL1啟動子或哺乳動物及其他動物細胞中之CMV啟動子、SV40啟動子、RSV啟動子(勞氏(Rous)
肉瘤病毒)、CMV增強子、SV40增強子或球蛋白內含子。除了負責啟動轉錄之元件以外,該調節元件亦可能包含該多核甘酸下游之轉錄終止信號,諸如SV40-多聚A位置或tk-多聚A位置。就此而論,適當之表現載體係該領域所知,諸如岡山(Okayama)-伯格(Berg)cDNA表現載體pcDV1(法瑪西亞(Pharmacia))、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(英維特基(Invitrogen))或pSPORTI(吉貝可(GIBCO BRL))。較佳地,該載體係表現載體及/或基因轉移或標靶載體。源自病毒(諸如逆轉錄病毒、牛痘病毒、腺相關病毒、皰疹病毒或牛乳突瘤病毒)之表現載體可被用於遞送本發明之多核苷酸或載體至目標細胞族群。該領域之技藝人士所廣為周知之方法可被用於建構重組病毒載體;見例如Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(2001,Third Edition)N.Y.及Ausubel,Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1994)中所描述之技術。或者,本發明之核酸分子可被重組至脂質體以供遞送至目標細胞。
本發明另關於包含本發明之載體之宿主。該宿主可為原核細胞、真核細胞或非人基因轉殖動物。存在於宿主中之本發明之多核苷酸或載體可能被整合至該宿主之基因組中或可能維持在染色體外。就此而言,亦可了解的是本發明之核酸分子可被用於「基因標靶」及/或「基因取代」以恢
復突變基因或經由同源重組產生突變基因;見例如Mouellic,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87(1990),4712-4716;Joyner,Gene Targeting,A Practical Approach,Oxford University Press。
該宿主可為任何原核細胞或真核細胞,諸如細菌、昆蟲、真菌、植物、動物、哺乳動物或較佳地人細胞。較佳之真菌細胞係例如酵母菌屬(Saccharomyces),特別是該些啤酒酵母菌(S.cerevisiae)。用語「原核」係意圖包括所有可被轉形或轉染多核苷酸以表現本發明之變異多肽之細菌。原核宿主可能包括革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌,諸如例如大腸桿菌(E.coli)、鼠傷寒沙門氏菌(S.typhimurium)、黏質色拉雷菌(Serratia marcescens)及枯草桿菌(Bacillus subtilis)。編碼本發明之變異多肽之突變型式之多核苷酸可利用該領域具有一般技藝之人士所通常了解之任何技術被用於轉形或轉染該宿主。用於製備融合、可操作地連接基因及於細菌或動物細胞中表現彼等之方法係該領域所廣為周知(Sambrook,Molecular Cloning A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory(2001,Third Edition)。該處所描述之基因建構物及方法可被利用以於例如原核宿主中表現本發明之變異抗體、抗體片段或彼等之衍生物。一般來說,含有幫助該導入核酸分子有效轉錄之啟動子序列之表現載體係與該宿主一起使用。該表現載體通常含有複製起點、啟動子及終止子,以及能提供該經轉形細胞之表現型選擇之特定基
因。該經轉形之原核宿主可於醱酵器中生長,並根據該領域已知之技術培養以達理想細胞生長。本發明之抗體、抗體片段或彼等之衍生物接著可自該生長培養基、細胞溶解物或細胞膜餾份中分離。經微生物或以其他方式表現之本發明之抗體、抗體片段或彼等之衍生物之分離及純化可藉由任何習知方法進行,諸如舉例來說製備型色層分離法及諸如該些有關使用單株或多株抗體之免疫分離法。
在本發明之較佳實施態樣中,該宿主係細菌、真菌、植物、二棲動物或動物細胞。較佳之動物細胞包括但不限於中國倉鼠卵巢(CHO)細胞(CHO細胞,ATCC CCL-61)或彼之二氫葉酸還原酶缺陷株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)、幼倉鼠腎(BHK)細胞、猴腎細胞(COS)(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182及ATCC CRL-1650)、源自小鼠纖維母細胞(ATCC No.CRL-1658)之3T3細胞或NIH3T3細胞、NS0細胞及一些其他細胞系包括人細胞例如Per.C6。在另一較佳之實施態樣中,該動物細胞係昆蟲細胞。較佳之昆蟲細胞包括但不限於SF9細胞系之細胞。
在本發明更佳之實施態樣中,該宿主係人細胞或人細胞系。該人細胞包括但不限於人胚胎腎細胞(HEK293、293T、293 Freestyle)。另外,該人細胞系包括但不限於海拉(HeLa)細胞、人肝細胞癌細胞(例如Hep G2)、A549細胞。
本發明亦提供含有本發明之一或多種核酸分子之基因轉殖非人動物,該動物可被用於產製本發明之抗體。抗體可於羊、牛、馬、豬、大鼠、小鼠、兔、倉鼠或其他哺乳動物之組織或體液(諸如乳汁、血液或尿液)中產製並自該組織或體液中收集。見例如美國專利號碼5,827,690;5,756,687;5,750,172及5,741,957。如上所述,含有人免疫球蛋白基因座之非人基因轉殖動物可藉由以AXL或彼之部分免疫加以製備。
本發明另外關於一種製備抗體之方法,該方法包含在允許合成該抗體及自該培養基收集該抗體之條件下培養本發明之宿主。
該經轉形之宿主可於醱酵器中生長,並根據該領域已知之技術培養以達理想細胞生長。一經表現後,本發明之完整抗體、彼等之二聚物、個別輕鏈及重鏈或其他免疫球蛋白型式可根據該領域之標準程序加以純化,包括硫酸銨沉澱法、親和性管柱、管柱層析法、膠體電泳法及該類似方法;見Scopes,“Protein Purification”,Springer-Verlag,N.Y.(1982)。本發明之抗體或彼之對應免疫球蛋白鏈接著可自該生長培養基、細胞溶解物或細胞膜餾份中分離。經例如微生物表現之本發明之抗體或免疫球蛋白鏈之分離及純化可藉由任何習知方法進行,諸如舉例來說製備型色層分離法及諸如該些有關使用針對例如本發明之抗體之固定區之單株或多株抗體之免疫分離法。
該領域之技藝人士將顯而易見的是,本發明之抗體可
另與其他基團偶聯以供例如藥物標靶及造影應用。該偶聯可在表現對連接部位之抗體或抗原後以化學法進行,或該偶聯產物可在DNA層級上經工程化成為本發明之抗體或抗原。該DNA接著於適當宿主系統中表現,且該經表現之蛋白質被收集及需要時經復性。
在本發明之較佳實施態樣中,該抗體係與效應物偶聯,諸如放射性同位素或毒性化學治療劑。較佳地,該些抗體共軛物可用於標靶表現AXL之細胞(例如癌細胞)以供清除。本發明之抗體/抗體片段與放射性同位素之連接提供例如腫瘤治療之優點。與化學治療及其他形式之癌症治療不同的是,放射性免疫療法或投予放射性同位素-抗體之組合直接以該癌細胞為標靶,對周邊正常健康組織之傷害極小。較佳之放射性同位素包括例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
另外,當與毒性化學治療劑諸如膠達納黴素(geldanamycin)(Mandler et al.,J.Natl.Cancer Inst.,92(19),1549-51(2000))及美坦素(maytansin)例如類美坦素藥物DM1(Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93:8618-8623(1996)及奧里斯塔丁E(auristatin-E)或單甲基奧里斯塔丁E(Doronina et al.,Nat.Biotechnol.21:778-784(2003))或卡利許黴素(calicheamicit)共軛時,本發明之抗體可被用於治療癌症。在酸性或還原條件下或當暴露於特定蛋白酶時釋放藥物之不同的連接子為此技術所採用。本發明之抗體可如該
領域所描述之共軛。
本發明之實施態樣之一者係本發明之抗體或彼之功能性片段之化學修飾。分子諸如聚合物(聚乙二醇或該類似物)可被用來產製經修飾之抗體或經修飾之功能性片段。
本發明另關於包含本發明之抗體、核酸分子、載體、宿主或由本發明之方法獲得之抗體之醫藥組成物。
此處所使用之用語「組成物」包含至少一種本發明之化合物。較佳地,該組成物係醫藥性或診斷性組成物。
較佳地,該醫藥組成物包含醫藥上可接受之載體及/或稀釋劑。此處所揭示之醫藥組成物可能部分地用於治療與AXL表現、過度表現或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、過度表現或高度活性之疾患,例如過度增生性疾病、心血管疾病(特定地動脈粥樣硬化及血栓形成)、糖尿病相關疾病(特定地腎小球肥大或糖尿病性腎病)。該疾患包含但不限於癌症,例如乳癌、結腸癌、肺癌、腎癌、濾泡淋巴瘤、骨髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、巴瑞特(Barrett)氏食道癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌及頭頸癌,或其他增生性或腫瘤性疾病或其他AXL表現或過度表現之疾病。
此處之用語「高度活性」係指不受控制之AXL傳訊,此可能由負向調節缺乏及/或功能異常造成。舉例來說,負向調節包含蛋白質之去磷酸化、降解及/或內吞作用。另外,不受控制之AXL傳訊可能為基因(不論是體基因
或種系基因)改變之結果,此導致AXL胺基酸序列之改變。
適當醫藥載劑、賦形劑及/或稀釋劑之實例係該領域所廣為周知且包括磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑,諸如油/水乳劑、各種類型之潤濕劑、無菌溶液等。包含該載劑之組成物可由廣為周知之習知方法調製。該等醫藥組成物可以適當劑量對個體投予。適當組成物之投予可藉由不同方式進行,例如藉由靜脈內、腹腔內、皮下、肌肉內、局部、皮內、鼻內或支氣管內投予。本發明之組成物亦可被直接投予至目標部位,例如藉由生物彈道(biolistic)遞送至外部或內部標靶位置如腦部。投藥計畫將由主治醫師及臨床因素決定。如醫學領域所廣為周知的,任何一名病患之劑量取決於許多因素,包括病患大小(size)、體表面積、年齡、欲投予之特定化合物、性別、投予時間及途徑、整體健康及被同時投予之其他藥物。蛋白質之醫藥活性物質可能以每劑量介於1微克至100毫克/公斤體重之量存在;然而,低於或高於此示範性範圍之劑量可被設想,特別是考慮前述因素。若該計畫係連續輸注,其亦應介於每分鐘每公斤體重1皮克至100毫克之範圍。
藉由定期評估可監測進展。本發明之組成物可局部或系統性投予。供非經腸投予之製劑包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液及乳劑。非水性溶劑之實例係丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油及注射型有機酯類諸如油酸乙酯。水性載劑包括水、酒精性/水性溶液、乳劑或懸浮
液,包括鹽水及緩衝介質。非經腸載劑包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖液、葡萄糖及氯化鈉溶液、乳酸林格氏液或固定油。靜脈內載劑包括液體及營養補充液、電解質補充液(諸如該些以林格氏葡萄糖液為基礎者)及該類似物。保存劑及其他添加劑亦可存在,諸如舉例來說抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及惰性氣體及該類似物。另外,本發明之醫藥組成物可能依該醫藥組成物之意圖用途而包含其他劑。
特定較佳的是,該醫藥組成物包含至少一種額外之活性劑,例如額外之抗腫瘤劑、小分子抑制劑、抗腫瘤劑、化學治療劑或該些劑之組合。
本發明亦關於一種醫藥組成物,該醫藥組成物包含本發明之人化抗AXL抗體與至少一種其他抗腫瘤劑之組合。該組合能舉例來說有效地抑制異常細胞生長。
許多抗腫瘤劑係目前該領域所知。通常該用語包括所有能預防、緩和及/或治療過度增生性疾患之劑。在一實施態樣中,該抗腫瘤劑係選自治療性蛋白質,包括但不限於抗體或免疫調節性蛋白質。在另一實施態樣中,該抗腫瘤劑係選自小分子抑制劑或由有絲分裂抑制劑、激酶抑制劑、烷化劑、抗代謝劑、嵌入劑、生長因子抑制劑、細胞週期抑制劑、酶、拓樸異構酶抑制劑、組蛋白去乙醯酶抑制劑、抗存活劑、生物反應調節劑、抗荷爾蒙劑例如抗雄性素及抗血管新生劑組成之化學治療劑。
可與此處所提供之抗體組合使用之抗腫瘤劑之特定實
例包括吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、培美曲塞(pemetrexed)、貝伐珠單抗(bevacisumab)、西妥昔單抗(cetuximab)、伊馬替尼(imatinib)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、阿來組單抗(alemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、埃羅替尼(erlotinib)、硼替佐米(bortezomib)及該類似物。其他被用於此處所描述及主張權利之組成物中之特定抗腫瘤劑包括例如化學治療劑諸如卡培他濱(capecitabine)、柔紅比星(daunorubicin)、柔紅黴素(daunomycin)、更生黴素(dactinomycin)、多柔比星(doxorubicin)、表阿黴素(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、伊索比星(esorubicin)、博來黴素(bleomycin)、馬磷醯胺(mafosfamide)、依弗醯胺(ifosfamide)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、二氯乙基亞硝基脲(bis-chloroethylnitrosurea)、白消安(busulfan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、放線菌素D(actinomycin D)、光輝黴素(mithramycin)、強的松(prednisone)、羥助孕酮(hydroxyprogesterone)、睪固酮(testosterone)、三苯氧胺(tamoxifen)、氮烯唑胺(dacarbazine)、甲基苄胼(procarbazine)、六甲密胺(hexamethylmelamine)、五甲密胺(pentamethylmelamine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、安吖啶(amsacrine)、氯氨布西(chlorambucil)、甲基環己基亞硝基脲
(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥(nitrogen mustard)、美法崙(melphalan)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、6-巰嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、賽他命(cytarabine)(CA)、5-氮雜胞嘧啶核苷(azacytidine)、羥基脲(hydroxyurea)、脫氧柯福黴素(deoxycoformycin)、4-羥基過氧環磷醯胺、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)、5-氟去氧尿苷(5-fluorodeoxyuridine)(5-FUdR)、甲胺喋呤(methotrexate)(MTX)、秋水仙鹼(colchicine)、太平洋紫杉醇(taxol)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依扥泊苷(etoposide)、曲美沙特(trimetrexate)、替尼泊苷(teniposide)、順氯氨鉑(cisplatin)及己烯雌酚(diethylstilbestrol)(DES))。一般見The Merck Manual of Diagnosis and Therapy,15th Ed.1987,pp.1206-1228,Berkow et al.,eds.,Rahway,N.J.。特定較佳者係誘發細胞凋亡之抗腫瘤劑。
本發明亦關於多株抗體,其包含超過一種本發明之抗體。
當與該描述之AXL抗體一起使用時,該抗腫瘤劑可能被單獨使用(例如5-FU與抗體)、連續使用(例如使用5-FU與抗體一段時間之後使用MTX與抗體)或與一或多種其他該等抗腫瘤劑組合使用(例如5-FU、MTX與抗體,或5-FU、放射線治療與抗體)。
用語「抗腫瘤劑」亦可包括治療程序,例如輻射或放射線治療。
本發明之醫藥組成物係較佳地用於人醫但亦可能用於獸醫目的。
此外,本發明關於本發明之抗體、本發明之核酸分子、載體、宿主或由本發明之方法所獲得之抗體於製備供診斷、預防或治療過度增生性疾病、心血管疾病(特定地動脈粥樣硬化及血栓形成)、糖尿病相關疾病(特定地腎小球肥大或糖尿病性腎病)及特定地與AXL表現、過度表現或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、過度表現或高度活性之疾患之用途。
以上提及之過度增生性疾病包括任何腫瘤,意即任何異常及/或不受控制之組織新生。此處所使用之用語「不受控制之組織新生」可能取決於生長調節之功能異常及/或喪失生長調節。過度增生性疾病包括腫瘤疾病及/或癌症,諸如轉移性或侵入性癌症。
在本發明之用途之較佳實施態樣中,該過度增生性疾病係特定地乳癌、結腸癌、肺癌、腎癌、濾泡淋巴瘤、骨髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、巴瑞特(Barrett)氏食道癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌及頭頸癌,或增生性疾病、腫瘤病或其他AXL表現或過度表現之過度增生性疾病。
在另一實施態樣中,本發明關於本發明之人化抗AXL
抗體於製備與抗腫瘤劑共同投予以治療上述疾患之一者的藥物之用途。
根據其他較佳之實施態樣,本發明係關於本發明之人化抗AXL抗體於製備供治療藥物抗性癌症的醫藥組成物之用途。
另外本發明關於一種診斷性組成物,其包含本發明之抗體、本發明之核酸分子、載體、宿主或由本發明之方法所獲得之抗體及可任意選擇地醫藥上可接受之載劑。
本發明之診斷性組成物係用於偵測哺乳動物AXL在不同細胞、組織或另一適當樣本中之非所欲表現、過度表現或高度活性,其包含使樣本與本發明之抗體接觸及偵測AXL於該樣本中之存在。因此,本發明之診斷性組成物可能被用於評估過度增生性疾病之起始或疾病狀態。
另外,惡性細胞諸如表現AXL之癌細胞可為本發明之抗體之標靶。已與本發明之抗體結合之細胞因此可能受到免疫系統功能之攻擊,諸如補體系統或細胞媒介性細胞毒性,藉此減少癌細胞之數目或清除癌細胞。這些考量同樣地適用於轉移及復發性腫瘤之治療。
在本發明之另一態樣中,本發明之抗體係與標記基團偶聯。如上已概述,該等抗體係特別適用於診斷性應用。此處所使用之用語「標記基團」係指可偵測之標記,例如經放射線標記之胺基酸或可被經標記之抗生物素蛋白偵測之生物素基團。各種用於標記多肽及糖蛋白諸如抗體之方法係該領域所知且可被用於進行本發明。適當標記基團之實
例包括但不限於下列:放射性同位素或放射性核種(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、螢光基團(例如FITC、若丹明(rhodamine)、鑭系元素磷光體)、酶基團(辣根過氧化酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶)、化學發光基團、生物素基團或由第二報告物識別之預先決定之多肽表位(例如白胺酸拉鍊對序列、二次抗體之結合位、金屬結合結構域、表位標籤)。
在特定態樣中,標記基團由各種長度之間隔臂連接以減少潛在之立體阻礙係為所欲。
在另一態樣中,本發明關於一種評估AXL表現細胞存在之方法,該方法包含使本發明之抗體與彼等/彼之表面疑似攜帶AXL之細胞或組織接觸。用於偵測樣本中AXL表現之適當方法可能為酶連接免疫吸附測定法(ELISA)或免疫組織化學法(IHC)。
ELISA測定法可能在微滴板格式中進行,其中例如微滴板之孔槽被AXL抗體吸附。該等孔槽以阻斷劑諸如乳蛋白質或白蛋白潤洗及處理以防止該分析物之非特異性吸附。接著該孔槽係以測試樣本處理。在洗去該測試樣本或標準物之後,該孔槽以經標記(例如與生物素共軛)之第二AXL抗體處理。在洗去多餘之第二抗體後,該標記係以例如抗生物素蛋白共軛之辣根過氧化酶(HRP)及適當之發色受質偵測。測試樣本中AXL抗原之濃度係藉由與標準樣本所建立之標準曲線比較加以測定。
以IHC而言,可能使用石蠟包埋組織,其中該組織首
先係於例如二甲苯中去石蠟化,接著以例如乙醇脫水及蒸餾水潤洗。被福馬林固定及石蠟包埋遮蔽之抗原表位可能由表位去遮化、酶消化或皂素加以暴露。以表位去遮化來說,石蠟切片可能於表位修復溶液例如2N HCl溶液(pH 1.0)中在蒸鍋、水浴或微波爐中加熱20至40分鐘。在酶消化之例中,組織切片可能在不同的酶(諸如蛋白酶K、胰蛋白酶、鏈蛋白酶、胃蛋白酶等)溶液中於37℃培養10至30分鐘。在洗去表位修復溶液或多餘之酶後,組織切片經阻斷緩衝液處理以防止非專一性交互作用。一級AXL抗體係以適當濃度添加。將多餘之一級AXL抗體洗去,切片在過氧化酶阻斷溶液中於室溫中培養10分鐘。在經另一次清洗步驟後,組織切片與二次標記抗體培養,例如經可能作為酶之錨定之基團標記。因此實例為經生物素標記之二次抗體,該抗體被與辣根過氧化酶偶聯之鏈黴抗生物素蛋白辨識。該抗體/酶複合物之偵測係藉由與適當發色受質一起培養而達成。
在另一實施態樣中,本發明關於一種阻斷AXL功能之方法,該方法包含使本發明之抗體在其中該抗體能阻斷AXL功能之條件下與彼等/彼之表面疑似攜帶AXL之細胞或組織接觸。該接觸可能在活體外或活體內。
本發明亦關於一種治療過度增生性疾病、心血管疾病(特定地動脈粥樣硬化及血栓形成)、糖尿病相關疾病(特定地腎小球肥大或糖尿病性腎病)之方法,該方法包含對有此需要之病患投予適當劑量之本發明之抗體或抗體
片段或彼之衍生物。該過度增生性疾病係較佳地選自與AXL表現、過度表現或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、過度表現或高度活性之疾患,諸如癌症例如乳癌、結腸癌、肺癌、腎癌、濾泡淋巴瘤、骨髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、巴瑞特(Barrett)氏食道癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌及頭頸癌,或增生性疾病、腫瘤病或其他AXL表現或過度表現之過度增生性疾病。
根據本發明之另一較佳實施態樣,該將被治療之癌係藥物抗性癌症,較佳地選自上述之癌。
本發明另關於一種治療疾病之方法,其中對哺乳動物投予本發明之抗體且其中該疾病係與AXL之異常表現量或活性直接或間接相關。
最後,本發明關於一種套組,其包含抗AXL抗體,較佳地本發明之抗體、抗體片段或彼之衍生物,編碼該成分之核酸分子及/或本發明之載體。
所有涵蓋此處所揭示之化合物之實施態樣可被用來作為單一化合物或組合以供製備藥物。
圖1:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之輕鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11B7-T1L至h#11B7-T7L。
圖2:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之輕鏈
的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11B7-T8L至h#11B7-T14L。
圖3:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之輕鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11B7-T15L至h#11B7-T20L。
圖4:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之重鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11B7-T1H至h#11B7-T6H。
圖5:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之重鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11B7-T7H至h#11B7-T12H。
圖6:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之輕鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11D5-T1L至h#11D5-T7L。
圖7:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之輕鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11D5-T8L至h#11D5-T14L。
圖8:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之輕鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11D5-T15L至h#11D5-T21L。
圖9:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之輕鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11D5-T22L至h#11D5-T28L。
圖10:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之輕
鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11D5-T29L至h#11D5-T35L。
圖11此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之輕鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11D5-T36及h#11D5-T37L。
圖12:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之重鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11D5-T1H至h#11D5-T7H。
圖13:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之重鏈的人化可變區之胺基酸序列,命名為h#11D5-T8H至h#11D5-T13H。
圖14:此圖說明引子EFF1及EfsmR、包含分泌信號及人κ鏈之固定區及多聚(A)加尾信號之片段B、編碼包含人IgG1信號及固定結構域之多肽的DNA片段及前導序列的核苷酸序列,以及該大鼠抗人Axl單株抗體11B7及11D5之CDR、嵌合#11B7抗體重鏈及輕鏈(IgG1/κ)、嵌合#11D5抗體重鏈及輕鏈(IgG1/κ)及前導序列之胺基酸序列。
圖15A:RatI-Mock及RatI-AXL cl.2纖維母細胞之細胞表面AXL的流式細胞分析。收集以pLXSN及pLXSN-hAXL單嗜性病毒分別感染RatI纖維母細胞所產製之RatI-Mock多株細胞及RatI-AXL cl.2種系細胞,並利用3微克/毫升之小鼠對照抗體72A1(左圖)或小鼠抗AXLMAB154一級抗體(右圖)及PE共軛之抗小鼠二級抗體
染色。詳見內文。染色RatI-AXL cl.2細胞導致平移3個數量級且證實AXL在該些細胞之表面過度表現。
圖15B:NIH3T3-Mock及NIH3T3-AXL cl.7纖維母細胞之細胞表面AXL的流式細胞分析。收集以pLXSN及pLXSN-AXL單嗜性病毒分別感染NIH3T3纖維母細胞所產製之NIH3T3-Mock多株細胞及NIH3T3-AXL cl.7種系細胞,並利用3微克/毫升之小鼠對照抗體72A1(左圖)或小鼠抗AXL MAB154一級抗體(右圖)及PE共軛之抗小鼠二級抗體染色。詳見內文。染色NIH3T3-AXL cl.7細胞導致平移2個數量級且證實AXL在該些細胞之表面過度表現。
圖16:探討大鼠抗AXL抗體對於裸鼠中人前列腺癌生長之效應的原位異種移植模型。PC-3-LN前列腺癌細胞經原位接種至NMRI-nu/nu小鼠之前列腺。動物被隨機分成4組,接受25毫克/公斤之同型對照抗體1D5或拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7及40毫克/公斤之紓癌特(Sutent)或12.5毫克/公斤之剋癌易(Taxotere)。在該治療期間,原位生長性PC-3-LN腫瘤之生長以及周邊轉移係於第15、23、29及34天經由活體內生物發光造影每周監測一次。詳見內文。相較於同型對照抗體1D5,拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7減少裸鼠中PC-3-LN前列腺腫瘤之整體生長。
圖17:探討大鼠抗AXL抗體對於裸鼠中人前列腺癌轉移之效應的原位異種移植模型。PC-3-LN前列腺癌細胞
係經原位接種至NMRI-nu/nu小鼠之前列腺。動物被隨機分成4組,接受25毫克/公斤之同型對照抗體1D5或拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7及40毫克/公斤之紓癌特(Sutent)或12.5毫克/公斤之剋癌易(Taxotere)。在屍體解剖後,收集經選擇之器官(肝、脾、肺、股骨及腰椎之部分),藉由生物發光造影分析轉移之存在。詳見內文。相較於同型對照抗體1D5,本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7減少脾轉移之發生。值得注意的是,此實驗中11B7之抗轉移效應相較於紓癌特之效應為強。
圖18:此圖描述載體pEF6KCL之建構。
圖19:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11B7-T1至h#11B7-T6之結合活性,使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測定。
圖20:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11B7-T7至h#11B7-T13之結合活性,使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測定。
圖21:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11B7-T14至h#11B7-T20之結合活性,使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測定。
圖22:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11B7-T21至h#11B7-T27之結合活性,使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測定。
圖23:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11D5-T1至h#11D5-T6之結合活性,使用人AXL-Fc包覆板由
ELISA測定。
圖24(上圖及下圖):此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11B7-T1至h#11B7-T27之蛋白質濃度,以直接蛋白質吸光度試驗測定。
圖25:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11D5-T1至h#11D5-T6之蛋白質濃度,以直接蛋白質吸光度試驗測定。
圖26:此圖描述在人AXL抗原上與大鼠抗人AXL單株抗體#11B7結合之結構域的決定基。
圖27:探討人化11B7抗Axl抗體對Axl受體磷酸化之效應的ELISA實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,以10微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7(IgG1/Kappa)及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6(T2-T6)預先培養,經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理,然後溶解。溶解物被轉移至抗-磷-酪胺酸抗體4G10-包覆之Maxi-Sorp 96孔板,該板接著經過清洗並與0.125微克/毫升之生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7、AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白及AttoPhos受質溶液培養以收集螢光強度。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能在二種細胞系中阻斷或顯著降低Gas6媒介
之Axl活化,如經Gas6刺激之細胞中Axl酪胺酸磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
圖28A:探討人化11B7抗Axl抗體對ERK1/2磷酸化之效應的西方墨點實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,在經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7(IgG1/Kappa)或本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6(T2-T6)預先培養,然後溶解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離,利用抗-磷-p44/42 MAP激酶(Thr202/Tyr204)抗體進行西方墨點分析。隨後,該相同濾膜以抗p44/42 MAP激酶抗體抗體再次探測。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6干擾Hs578T乳癌細胞中由Gas6誘發之ERK1/2活化微弱增加。然而由於ERK1/2在此細胞系中之基礎活性甚高,這些如經Gas6刺激之細胞中ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示之效應似乎僅相對中等。相對地,嵌合性抗Axl抗體chm11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6在NCI-H292肺癌細胞中所反映之對ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化之抑制效應清楚得多。
圖28B:探討人化11B7抗Axl抗體對AKT磷酸化之效應的西方墨點實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,在經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7(IgG1/Kappa)或本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6預先培養,然後溶解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離,利用抗AKT1/2/3抗體進行西方墨點分析。隨後,該相同濾膜以抗-磷-AKT(Ser473)抗體再次探測。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能顯著降低Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)中由Gas6誘發之AKT活化,如經Gas6刺激之細胞中AKT Ser473磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
圖28C:探討人化11B7抗Axl抗體對GSK-3 β磷酸化之效應的西方墨點實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,在經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7(IgG1/Kappa)或本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6預先培養,然後溶解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離,利用
抗-磷-GSK-3 β(Ser9)抗體進行西方墨點分析。隨後,該相同濾膜以抗-GSK-3 β抗體再次探測。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能顯著降低Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)中由Gas6誘發之GSK-3 β活化,如經Gas6刺激之細胞中GSK-3 β Ser9磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
圖28D:探討人化11B7抗Axl抗體對TSC2磷酸化之效應的西方墨點實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,在經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7(IgG1/Kappa)或本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6預先培養,然後溶解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離,利用抗-TSC2抗體進行西方墨點分析。隨後,該相同濾膜以抗-磷-TSC2(Thr1462)再次探測。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能顯著降低Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)中由Gas6誘發之TSC2在Thr1462之磷酸化,如經Gas6刺激之細胞中此胺基酸殘基之磷酸化程度相較於對應之未經刺激細
胞降低所示。
圖28E:探討人化11B7抗Axl抗體對mTOR磷酸化之效應的西方墨點實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,在經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7(IgG1/Kappa)或本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6預先培養,然後溶解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離,利用抗-磷-mTOR(Ser2448)抗體進行西方墨點分析。隨後,該相同濾膜以抗-mTOR抗體再次探測。詳見內文。該抗Axl抗體之抑制效應在Hs578T乳癌細胞(上)中相對微弱。然而,相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能干擾NCI-H292肺癌細胞中由Gas6誘導之mTOR活化,如經Gas6刺激之細胞中mTOR Ser2448磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示(下圖)。
圖28F:探討人化11B7抗Axl抗體對S6K1磷酸化之效應的西方墨點實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,在經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7(IgG1/Kappa)或本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、
h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6預先培養,然後溶解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離,利用抗-磷-p70 S6激酶1(Thr421/Ser424)抗體進行西方墨點分析。隨後,該相同濾膜以抗-β-肌動蛋白抗體再次探測。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6在Hs578T乳癌細胞中顯示對Gas6誘導之S6K1活化之若干抑制效應,如經Gas6刺激之細胞中S6K1 Thr421/Ser424磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示(上圖)。然而,經嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5或h#11B7-T6前處理之NCI-H292肺癌細胞(下圖)中可觀察到強烈許多之Gas6誘導之S6K1 Thr421/Ser424磷酸化及如此之活化降低。
圖29:探討人化11D5抗Axl抗體對Axl受體磷酸化之效應的ELISA實驗。Hs578T乳癌細胞係經飢餓處理,以10微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chm11D5(IgG1/Kappa)及本發明之人化抗Axl抗體h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5及h#11D5-T6預先培養,經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理,然後溶解。溶解物被轉移至抗-磷-酪胺酸抗體4G10-包覆之Maxi-Sorp 96孔板,該板接著經過清洗並與0.125微克/毫升之生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7、AP
共軛之鏈黴抗生物素蛋白及AttoPhos受質溶液培養以收集螢光強度。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm11D5及本發明之人化抗Axl抗體h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5及h#11D5-T6能阻斷或顯著降低Gas6媒介之Axl活化,如經Gas6刺激之細胞中Axl酪胺酸磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
圖30A:人Axl(NCBI蛋白質資料庫登錄號P_30530)之胺基酸序列。
圖30B:大鼠抗人Axl單株抗體11B7之輕鏈可變區的胺基酸序列。
圖30C:大鼠抗人Axl單株抗體11B7之重鏈可變區的胺基酸序列。
圖30D:大鼠抗人Axl單株抗體11D5之輕鏈可變區的胺基酸序列。
圖30E:大鼠抗人Axl單株抗體11D5之重鏈可變區的胺基酸序列。
圖31:比較大鼠及嵌合抗Axl抗體對Axl磷酸化之效應的ELISA實驗。CaSki子宮頸癌細胞係經飢餓處理,以50奈克/毫升、100奈克/毫升、300奈克/毫升、750奈克/毫升、1微克/毫升及10微克/毫升之大鼠抗Axl抗體11B7(A)或嵌合性抗Axl抗體ch11 B7(B)預先培養,經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理,然後溶解。溶解物被轉移至抗-磷-酪胺酸抗體4G10-包覆之Maxi-Sorp
96孔板。之後,孔板經過清洗並與0.5微克/毫升之生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7、AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白及AttoPhos受質溶液培養以收集螢光強度。詳見內文。如子宮頸癌細胞系CaSki中相對Axl磷酸化之濃度依賴性降低所示,本發明之大鼠抗Axl抗體11B7(A)及嵌合性抗Axl抗體ch11B7(B)能以類似程度阻斷配體誘導之受體酪胺酸激酶Axl之活化。
圖32A:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之輕鏈的人化可變區之胺基酸序列,分別稱為h#11B7-T15L及h#11B7-T18L。
圖32B:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之重鏈的人化可變區之胺基酸序列,分別稱為h#11B7-T11H及h#11B7-T12H。
圖33:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11B7-T28至h#11B7-T31之結合活性,使用人AXL-Fc包覆板(ELISA)由ELISA測定。
圖34:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#11B7-T28至h#11B7-T31之蛋白質濃度,以HPLC測定(見實施例24)。
圖35(1)至35(32):這些圖式說明大鼠抗人AXL人化抗體h#11B7-T1至h#11B7-T31及嵌合性h#11B7抗體之Tm測定,使用微差掃描熱卡計(DSC)測定。
圖36:探討人化11B7抗Axl抗體對Axl受體磷酸化之效應的ELISA實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-
H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,以無抗體或10微克/毫升之Gammagard對照抗體及本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25預先培養,經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理,然後溶解。溶解物被轉移至抗-磷-酪胺酸抗體4G10-包覆之Maxi-Sorp 96孔板,該板接著經過清洗並與0.125微克/毫升之生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7、AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白及AttoPhos受質溶液培養以收集螢光強度。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25在二種細胞系中顯著降低Gas6媒介之Axl活化,如經Gas6刺激之細胞中Axl酪胺酸磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
圖37:探討人化11B7抗Axl抗體對Akt激酶磷酸化之效應的ELISA實驗。Hs578T乳癌細胞(上)及NCI-H292肺癌細胞(下)係經飢餓處理,以無抗體或10微克/毫升之Gammagard對照抗體及本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25預先培養,經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理,然後以甲醛固定。細胞經過清洗、淬熄(quenched)並與抗-磷-Akt(Ser473)一級抗體、HRP共軛之抗兔二級抗體及四甲基聯苯胺溶液培養以測量吸光強度。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體,本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25在
二種細胞系中能阻斷或降低Gas6媒介之Akt激酶活化,如經Gas6刺激之細胞中Akt(Ser473)磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
圖38:探討人化11B7抗Axl抗體對Axl受體內化之效應的FACS分析。Hs578T乳癌細胞係經飢餓處理,以無抗體或10微克/毫升之Gammagard對照抗體及本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25培養所示時間,然後以甲醛固定。細胞係經大鼠抗Axl單株抗體2A1一級抗體及PE共軛之驢抗大鼠IgG二級抗體染色,然後進行FACS分析。詳見內文。與Gammagard對照抗體不同的是,以人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25處理Hs578T乳癌細胞導致Axl受體之內化。此圖顯示相對Axl表現程度之百分比,其係定義為在個別處理時間時經抗Axl單株抗體處理樣本相較於未經處理樣本之平均螢光強度。
圖39 A+B:探討人化11B7抗Axl抗體對Gas6誘導之內皮細胞芽生之效應的球體式細胞性血管新生測定法。經VEGF-A預處理之HUVEC球體細胞係包埋於3D膠原蛋白凝膠中,以1微克/毫升之人Gas6刺激,並經所示濃度之Gammagard對照抗體及本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25處理24小時。分析各資料點10個隨機選擇球體之累積發芽長度的平均值±SEM(左圖),並測定抗體之相對抑制作
用(右圖)。IC50曲線之擬合及IC50數值之計算係利用GraphPad Prism 4.03進行。詳見內文。
實施例1:產製AXL過度表現性RatI纖維母細胞作為免疫原
根據美國國家生物技術資訊中心(NCBI)參考序列(NM_021913)之人受體酪胺酸激酶AXL轉錄變異物1之全長編碼序列經由限制性內切酶EcoRI及BamHI之側翼辨識元件被次選殖至pLXSN,藉此形成逆轉錄病毒表現載體pLXSN-hAXL。
為了產製與人受體酪胺酸激酶AXL專一性結合之抗體,穩定地過度表現人AXL之RatI纖維母細胞係由逆轉錄病毒基因轉移產製。簡言之,3x105個Phoenix-E細胞被接種於60毫米之培養皿上,利用磷酸鈣法轉染2微克/毫升之pLXSN載體或pLXSN-hAXL。經過24小時後,利用其中已經培養Phoenix-E細胞4小時之新鮮培養基更換培養基。釋放pLXSN或pLXSN-hAXL單嗜性病毒之Phoenix-E細胞的上清液被收集,並在聚凝胺(Polybrene)(4毫克/毫升;奧德里奇(Aldrich))存在時用於培養生長中RatI細胞(每6公分培養皿2x105細胞)3小時。同時,Phoenix-E細胞利用新鮮培養基再度培養,再經3小時後在聚凝胺(4毫克/毫升;奧德里奇)存在時被用於二次感染RatI纖維母細胞。同樣地,進行
第三次感染週期。在更換培養基後,開始以G418篩選RatI細胞。通常經21天之篩選後可挑選出穩定克隆。
一組穩定之克隆經過繁殖及利用FACS分析定量膜定位之人AXL表現。詳細地說,1x105細胞以10mM於PBS中之EDTA收集,以FACS緩衝液(PBS,3% FCS,0.4%疊氮化物)清洗一次,並接種至96孔圓底板。該等細胞以1000rpm離心3分鐘以除去上清液,並重懸於小鼠抗AXL一級抗體MAB154(R&D系統,3微克/毫升)中。細胞懸浮液在冰上培養1小時,以FACS緩衝液清洗二次,且重懸於100微升/孔之以FACS緩衝液稀釋50倍之PE共軛之驢抗小鼠二級抗體(傑克森(Jackson)公司)中。該細胞懸浮液於冰上及黑暗中培養30分鐘,以FACS緩衝液清洗二次,並利用Epics XL-MCL流式細胞儀(貝克曼庫爾特(Beckman Coulter)公司)分析。
圖15A顯示經pLXSN空載體穩定感染之多株RatI-Mock族群及經pLXSN-hAXL穩定感染之RatI-AXL cl.2之FACS分析,且證實AXL在此代表性克隆之細胞表面過度表現。
此外,為了產製適當之細胞性模型系統以供實驗目的,以類似RatI所述之程序產製穩定表現AXL之NIH3T3纖維母細胞。簡言之,3x105個Phoenix-E細胞被接種於60毫米之培養皿上,利用磷酸鈣法轉染2微克/毫升之pLXSN載體或pLXSN-AXL cDNA。經過24小時後,利用其中已經培養Phoenix-E細胞4小時之新鮮培養
基更換培養基。釋放pLXSN或pLXSN-hAXL單嗜性病毒之Phoenix-E細胞的上清液被收集,並在聚凝胺(4毫克/毫升;奧德里奇)存在時用於培養生長中NIH3T3細胞(每6公分培養皿2x105細胞)3小時。同時,Phoenix-E細胞利用新鮮培養基再度培養,再經3小時後在聚凝胺(4毫克/毫升;奧德里奇)存在時被用於二次感染NIH3T3纖維母細胞。同樣地,進行第三次感染週期。在更換培養基後,開始以G418篩選NIH3T3細胞。通常經21天之篩選後可挑選出穩定克隆。
一組穩定之克隆經過繁殖及利用FACS分析定量膜定位之AXL表現。詳細地說,1x105細胞以10mM於PBS中之EDTA收集,以FACS緩衝液(PBS,3% FCS,0.4%疊氮化物)清洗一次,並接種至96孔圓底板。該等細胞以1000rpm離心3分鐘以除去上清液,並重懸於小鼠抗AXL一級抗體MAB154(R&D系統,3微克/毫升)中。細胞懸浮液在冰上培養1小時,以FACS緩衝液清洗二次,且重懸於100微升/孔之以FACS緩衝液稀釋50倍之PE共軛之驢抗小鼠二級抗體(傑克森公司)中。該細胞懸浮液於冰上及黑暗中培養30分鐘,以FACS緩衝液清洗二次,並利用Epics XL-MCL流式細胞儀(貝克曼庫爾特公司)分析。
圖15B顯示經pLXSN空載體穩定感染之多株NIH3T3-Mock族群及經pLXSN-hAXL穩定感染之NIH3T3-AXL cl.7之FACS分析,且證實AXL在此代表性
克隆之細胞表面過度表現。
實施例2:產製大鼠抗AXL單株抗體
單株大鼠抗AXL抗體係藉由將大約10x106 RatI-AXL cl.2冷凍細胞經腹腔內及皮下注射至Lou/C或Long Evans大鼠以產製。經過8周間隔後,最後的補強注射在融合前3天經腹腔內及皮下給予。骨髓瘤細胞系P3X63-Ag8.653與大鼠免疫脾細胞之融合係根據標準程序進行及產生105雜交瘤。經過2周後,收集來自雜交瘤之第一上清液並以初步FACS篩選測試與NIH3T3-AXL cl.7纖維母細胞及NIH3T3-Mock對照細胞之結合。AXL結合陽性之克隆經進一步培養。自該些克隆之50毫升上清液純化抗體,再次分析與NIH3T3-AXL cl.7纖維母細胞及NIH3T3-Mock對照細胞上之AXL的專一性結合。與NIH3T3-AXL cl.7纖維母細胞專一性結合但不與NIH3T3-Mock對照細胞專一性結合之經純化之抗體另於Akt-激酶磷酸化之ELISA中測試,且進行測定同型之ELISA。為了純化大鼠抗體,上清液以5000g離心20分鐘接著經無菌過濾。添加500微升之蛋白G瓊脂糖凝膠FF,且在轉盤上於4℃培養至少1小時。瓊脂糖凝膠經離心沉澱,丟棄上清液,在利用檸檬酸緩衝液(100mM)pH 2.1溶離蛋白質前以PBS清洗蛋白G基質二次。溶離組分藉由添加1M Tris pH 8.0被立即再緩衝至中性pH並以PBS透析。
在受測之寡株抗體中,91株與NIH3T3-AXL cl.7纖
維母細胞但非NIH3T3-Mock對照細胞專一性結合,9株在相同細胞中抑制Gas6誘發之Akt磷酸化,然而71株刺激Akt磷酸化。四株拮抗性抗體(I11B7、I10D12、I6E7及III11D5,在下列實施例中分別稱為11B7、10D12、6E7及11D5)、二株協同性抗體(I11D7及III2A1;在下列實施例中稱為11D7及2A1)及一株對照抗體(III1D5;在下列實施例中稱為1D5)係經冷凍保存及次選殖。
實施例3:抗AXL抗體之結構及特徵
3.1 大鼠抗體可變結構域之核苷酸序列
大鼠抗AXL抗體可變結構域係自雜交瘤細胞選殖。利用RNA抽取套組RNeasy(RNeasy midi-kit,凱基(Qiagen)公司)製備RNA。編碼抗體基因之cDNA係利用5’RACE套組(英維特基公司)根據廠商指示加以製備。
簡言之,第一股cDNA係利用基因特異性GSP1-引子及SuperScriptTM II逆轉錄酶自總RNA或RNA合成。在第一股cDNA合成後,該原始之mRNA模板藉由RNase Mix之處理加以移除。接著在該cDNA之3’端添加同聚物尾。PCR放大係利用Taq DNA聚合酶、與位於cDNA分子內之位置黏合之巢式基因特異性引子(GSP2)及該套組提供之錨定引子進行。在放大後,5’RACE產物被選殖至pLXSN-ESK載體以供定序。為了幫助選殖,該錨定引子(AP)包括SalI之識別序列,GSP2引子含有XhoI位
置。
GSP1引子:kappa_GSP1:GATGGATGCATTGGTGCAGC
new_kappa_GSP1:atagatacagttggtgcagc
heavy_GSP1:CAGGGTCACCATGGAGTTA
GSP2引子:XhoI-hGSP2:CCGCTCGAGCGGGCCAGTGGATAGACAGATGG
XhoI-kGSP2:CCGCTCGAGCGGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG
利用GSP引子以選殖大鼠抗AXL單株抗體:11B7:kappa GSP1;XhoI-kGSP2 heavy GSP1;XhoI-hGSP2
10D12:kappa_GSP1,new_kappa_GSP1;XhoI-kGSP2 heavy GSP1;XhoI-hGSP2
11D5:new_kappa_GSP1;XhoI-kGSP2 heavy GSP1;XhoI-hGSP2
3.2 大鼠抗AXL抗體可變結構域之胺基酸序列
大鼠抗體可變結構域序列係自被選殖至pLXSN-ESK載體中之定序基因轉譯。該給定之胺基酸序列始於該可變結構域之位置1。抗體與彼之目標專一性結合所需之互補決定區(CDR)係根據卡巴(Kabat)之定義(Kabat et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth
Edition.NIH Publication No.91-3242,1991)。該卡巴定義係基於可變結構域中之序列變異性。該等抗體之抗AXL專一性CDR區係列於圖14及SEQ ID NO:121至SEQ ID NO:132。該個別之CDR包括下列位置:CDR-L1:24-34
CDR-L2:50-56
CDR-L3:89-97
CDR-H1:31-35b
CDR-H2:50-65
CDR-H3:95-102
大鼠11B7抗體輕鏈及重鏈可變區之胺基酸序列係分別以SEQ ID NO:140及141表示。大鼠11B7抗體之輕鏈及重鏈亞型分別為kappa及IgG1。
大鼠11D5抗體輕鏈及重鏈可變區之胺基酸序列係分別以SEQ ID NO:142及143表示。大鼠11D5抗體之輕鏈及重鏈亞型分別為kappa及IgG2a。
3.3 大鼠抗體之表現及純化
雜交瘤係於37℃、5-7% CO2之Celline CL 1000生物反應器(英特格拉生物科技(Integra Biosciences)公司)中使用包括4.5克/升葡萄糖、1%麩醯胺酸、1%丙酮酸鹽、1% Pen/Strep之DMEM培養。FCS添加係1% FCS之營養組成及5%低IgG FCS之細胞組成。每周進行二次收集及更換培養基。細胞分裂1/1->1/3,依細胞生長而
定。產率藉由SDS-PAGE分析每周測定一次。上清液儲存於-20℃直到純化。持續培養物之黴漿菌測試每周進行一次。
抗體係利用蛋白A或G瓊脂糖凝膠FF(GE醫療集團)經由Äkta Explorer 100系統(GE醫療集團)純化。每次純化分開裝填管柱。管柱大小係經調整至各批量之預期產率及大小(通常為50至500毫克)。含有蛋白質之溶液係保持於只要可能之冰上或4℃中。無菌緩衝液及雙蒸餾水係用於整個過程。
上清液經解凍後以50mM TRIS pH 8.5緩衝,離心後經0.22微米之膜過濾並裝載至管柱上。在以8倍管柱體積(CV)之50mM PO4 pH 8.5清洗後,該抗體係於10CV 100mM甘胺酸pH 3.3內溶離。溶離組分藉由添加1/5 1M Tris pH 8.0(每4毫升溶離組分添加1毫升Tris)被立即再緩衝至中性pH,接著以rSDS-PAGE分析。混合含有純抗體之組分,以PBS於4℃透析並經無菌過濾。
緩衝系統之需求係根據各抗體之個別性質調整。特定地,大鼠IgG2a抗體11D5係與蛋白G 4 FF基質(GE醫療集團)結合並於高鹽條件(2M NaCl)下清洗。大鼠抗體IgG1 11B7係於如11D5之高鹽條件下經由rProteinA(GE醫療集團)純化。抗體溶離係於pH 5.5進行。大鼠抗體純化之流速必須保持低速以增加結合效率。
以第二純化步驟而言,可進行離子交換層析法(在個別適當之條件下)或製備型大小排除層析法(PBS,pH
7.4)。
純化抗體之品質控制的標準程序包括:rSDS-PAGE凝膠分析;考馬斯或銀染色
BCA測試(皮爾斯(Pierce)#23227 BCA蛋白質測定套組;大鼠IgG標準物#31233)
分析性大小排除(Superdex 200 Tricorn 10/300 GL,約250毫克於250微升中;0.5毫升/分鐘,Äkta Explorer 100)
內毒素測試(LAL,Cambrex QCL-1000®發色性LAL終點測定法#US50-648U)
細胞式活性測定法(FACS結合;pAkt;pAXL)
純化抗體係儲存於4℃或-20℃無菌條件下之PBS pH 7.4中,視彼等之穩定性而定。
該獲得之大鼠抗體中之一者11B7係應用於實施例5、6及16中。
3.4 以FACS斯卡查德(scatchard)法測定抗體親和性
人AXL過度表現NIH3T3細胞藉由以10mM於PBS中之EDTA培養收集,並以每毫升6百萬個細胞重懸於FACS緩衝液(PBS pH 7.4,3% FCS,0.1% NaN3)。在圓底微滴板中,將100微升之細胞懸浮液加入100微升之抗體溶液中,該抗體溶液含有介於40至0.002微克/毫升(266至0.01nM)於FACS緩衝液中之濃度的抗體
11B7、11D5、ch11B7-IgG1、ch11B7-IgG2、ch11D5-IgG1或ch11D5-IgG2。允許抗體結合於冰上進行2小時。接著,細胞以每孔250微升之FACS緩衝液清洗二次,並重懸於200微升之經FACS緩衝液稀釋50倍之二級抗體(抗-大鼠-PE;傑克森公司)中。經45分鐘之培養後,細胞再次以FACS緩衝液清洗二次,並重懸於500毫升之PBS中以供FACS分析。分析以貝克曼庫爾特公司之FACS FC500儀器進行。為了測定表觀親和常數KDapp,以平均螢光值對平均螢光與該對應之抗體濃度([M])之比作圖。得自該直線之逆斜率的經計算之KDapp列示於下:
上列之KD值包括於實施例4所獲得之嵌合抗體之值。
實施例4:大鼠抗AXL抗體之嵌合化
人κ輕鏈及重鏈IgG1/2基因係如下述自人志願者之周邊血液單核細胞(PBMC)選殖:
自全血製備PBMC。血液於室溫中經含10單位/毫升肝素之PBS/2mM EDTA稀釋1/2,5,浮置於15毫升之Biocoll溶液之上並蓋上隔膜(diaphragm)(35毫升/試管)[Biocoll購自拜爾控(Biochrom)公司#L6115]。樣本於室溫中以400xg離心30分鐘,倒掉血清(約15毫升)。使用巴斯德吸管小心收集含有PBMC之介面。以PBS/2mM EDTA清洗PBMC二次(第一次清洗100毫升,第二次清洗50毫升),300xg離心10分鐘。細胞沉澱物以RPMI/10% FCS(25毫升)重懸,產生5.5x107 PBMC。利用購自凱基公司之RNeasy套組(#75142),遵照製造商指示自PBMC製備RNA。經純化之RNA(30微克)係等分儲存於-80℃。
抗體IgG gamma 1及2與kappa鏈之cDNA係自經分離之RNA藉由使用Superskript III逆轉錄酶(英特維基公司#18080-93)之RT-PCR根據製造商指示加以製備,並利用下列引子:
1)RT-gamma:GCG TGT AGT GGT TGT GCA GAG
2)RT-gamma2:ggg ctt gcc ggc cgt g
3)RT-kappa:TGG AAC TGA GGA GCA GGT GG
4)5’Blp:AGA TAA GCT TTG CTC AGC GTC CAC CAA GGG CCC ATC GGT
5)3’Bam(GAG):AGA TGG ATC CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG AGA G
6)5’Bsi:AGA TAA GCT TCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT CTT CAT
7)3’Bam(CTT):AGA TGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT
引子溶解成100μM。RT-PCR反應係分別利用2pmol之寡RTγ及RTκ進行,加入1微克之RNA、10mM之dNTP混合物及加熱5分鐘至65℃。添加4微升第一股緩衝液、1微升0.1M DTT、1微升RNase抑制劑(40U/微升,富酶泰斯(Fermentas)公司#EO0311)及2微升Superscript III RT,混合並於50℃培養1小時,之後於70℃進行熱去活步驟15分鐘。
2微升之第一股反應物被用於使用Taq聚合酶(優羅控(Eurochrom)公司#EME010001)之第二步PCR以產生抗體固定結構域之雙股DNA。利用下列PCR條件,使用引子5’Blp及3’Bam(GAG)放大γ鏈,5’Bsi及3’Bam(CTT)放大κ鏈固定區:κ鏈放大:
γ鏈放大:
PCR產物係於TAE緩衝之2%洋菜凝膠上分析。發現κ輕鏈有一條約350bp之亮帶及重鏈γ 1及γ 2有一條約1000bp之亮帶。該PCR產物利用Qiagen膠體抽取套組(凱基,#28784)根據製造商指示加以純化。為了將該PCR片段選殖至pcDNA3載體(英特維基公司)之多克隆位點,pcDNA3載體及PCR片段係經HindIII(5’)及BamHI(3’)限制性內切酶之消化。限制性位點係於該等PCR引子內編碼。經消化之片段利用Qiagen PCR純化套組(凱基,28104)純化,編碼該γ 1、γ 2及κ鏈之DNA由T4 DNA連接酶於16℃隔夜作用被連接至pcDNA3載體。連接酶於65℃去活10分鐘。經連接之DNA質體利用標準程序被直接轉形至CaCl2勝任大腸桿菌中,接著被接種至含安比西林(Ampicillin)之LB板。於37℃隔夜培養後,挑選單獨菌落、使懸浮於10微升H2O,藉由PCR證實含有個別抗體鏈攜帶質體(5微升懸浮細胞、
Taq聚合酶、用於γ 1/γ 2菌落之引子5Blp及3Bam(GAG)及用於κ菌落之5Bsi及3Bam(CTT)):
樣本係於1.5%洋菜凝膠上分析PCR產物。選擇含有抗體基因之菌落以接種於5毫升之LB/安比西林培養基。於37℃隔夜培養後,收集大腸桿菌並利用Qiagen miniprep套組(凱基,#12123)製備DNA。對照消化物(HindIII,BamHI)顯示預期大小之所有κ及γ鏈基因插入物;序列於麥迪基諾米(Medigenomix)公司以DNA定序確認。
大鼠可變結構域係藉由PCR自pLXSN-ESK載體放大,並經選殖至g1/g2及k pcDNA3載體以產生嵌合全長抗體。可變VL結構域係由下列引子放大,該等引子在5’端含有HindIII及BsmI位點及在3’端含有BsiWI位點:VL-11B7-5’:AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA GGC TCC
VL-11B7-3’:AGA TCG TAC GTT TCA GCT CCA GCT TGG TGC CTC
VL-11D5-5’:AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA GTC TCC ATC
VL-11D5-3’:AGA TCG TAC GTT TCA GCT TGG TCC CAG
可變VH結構域係由下列引子放大,該等引子在5’端含有HindIII及BsmI位點及在3’端含有BlpI位點:
VH-11B7/11D5-5’:AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA GGT GCA GCT TCA GGA GTC AGG
VH-11B7/11D5-3’:AGA TGC TGA GCT GAC AGT GAC CAT GAC TCC TTG GCC
輕鏈之BsiWI及重鏈之BlpI係位於固定區5’端之單獨位點,使能與該變異結構域基因之3’端直接融合。
與源自pLNOH2載體(Norderhaug et al.J.Immunol.Methods 204,1997;Neuberger EMBO J.1983;2(8):1373-8,1983)之前導序列SEQ ID NO:133融合,編碼該嵌合抗體鏈之基因係選殖至pCEP載體系統以供重組表現。輕鏈基因以NheI(5’)及XhoI(3’)被選殖至pCEP4(英特維基),重鏈基因以KpnI(5’)及XhoI(3’)被選殖至pCEP-Pu(Kohfeld FEBS Vol 414;(3)557ff,1997)。
種於20x20公分板上之HEK293細胞利用標準CaPO4轉染方法經1微克/毫升之編碼輕鏈及重鏈基因之各個質體共轉染以供瞬時表現。培養條件為37℃、5% CO2於含有5%低IgG FCS、1%丙酮酸鹽、1%麩醯胺酸、1%青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)之DMEM/F12高葡萄糖培養基。轉染24小時後,以新鮮培養基更換培養
基。每2至3天收集上清液共約3周。利用1毫升Hitrap rProtein A管柱(GE醫療集團)自約600毫升之上清液純化嵌合抗體,使用如大鼠抗體純化所述之標準緩衝條件(裝載:50mM Tris pH 8.5;清洗:50mM PO4 pH 8.5;溶離:100mM甘胺酸pH 3.3)。
該獲得之源自大鼠11B7抗體之嵌合分子中之一者係由以SEQ ID NO:136(圖14)之胺基酸序列為代表之人IgG1重鏈及以SEQ ID NO:135(圖14)之胺基酸序列為代表之人κ輕鏈所組成。
該獲得之源自大鼠11D5抗體之嵌合分子中之一者係由以SEQ ID NO:138(圖14)之胺基酸序列為代表之人IgG1重鏈及以SEQ ID NO:137(圖14)之胺基酸序列為代表之人κ輕鏈所組成。
該等嵌合性11B7及11D5抗體(分別稱為ch11B7-IgG1及ch11D5-IgG1)係用於實施例3、13、14及17至20。
實施例5:本發明之大鼠抗AXL抗體減少裸鼠中人前列腺癌之生長
治療性抗體之抗腫瘤療效通常於人異種移植腫瘤試驗中評估。在該些模型系統中,人腫瘤以異種移植物生長於免疫不全小鼠,治療療效係由腫瘤生長抑制之程度加以測量。此試驗之目的係評估本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7是否干擾裸鼠中人前列腺癌細胞之腫瘤生長。簡
言之,在第0天時,7至8周齡之NMRI-nu/nu公鼠(適應環境後體重約30克)以1.5至2.0體積百分比之異氟烷於2升/分鐘之氧氣流速麻醉,將1x106 PC-3-LN細胞於25微升PBS中原位移植至前列腺。PC-3-LN細胞係源自PC-3前列腺癌細胞系,該細胞系受編碼螢光素酶-新黴素融合蛋白之逆轉錄病毒感染。腫瘤生長之發生及腫瘤生長進程因此可經由活體內生物發光造影加以測量。為達此目的,將螢光素經腹腔內(i.p.)注射至小鼠,注射後10分鐘利用NightOWL LB 981生物發光造影系統(德國伯托技術(Berthold Technologies)公司)測量光發射。在第一次治療前,小鼠經隨機分組並進行統計測試以確保各包括10隻動物之治療組間起始腫瘤體積(平均值、中位數及標準差)之一致性。第8天開始所有治療並持續至第34天,第35天進行屍體剖檢。分別對第1及2組之動物經腹腔內(i.p.)投予25毫克/公斤之同型對照抗體1D5及拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7每週3次(週一、週三、週五)。第3組動物接受口服(p.o.)40毫克/公斤之紓癌特(Sutent)一天一次。第4組動物接受三次12.5毫克/公斤之剋癌易(Taxotere)靜脈(i.v.)注射,每次之間相隔4天。治療組之概要如下所述。
圖16顯示此實驗之結果。相較於同型對照抗體1D5,本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7減少裸鼠中PC-3-LN前列腺腫瘤之整體生長。
實施例6:本發明之大鼠抗AXL抗體抑制人前列腺癌之轉移
在如「本發明之大鼠抗AXL抗體減少裸鼠中人前列腺癌之生長」所述之相同實驗中,在屍體解剖後分析PC-3-LN腫瘤細胞移動至其他器官(轉移)以評估本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7之抗轉移效應。為達此目的,經選擇之器官(肝、脾、肺、股骨及腰椎之部分)係於屍體解剖後收集、均質化,並添加螢光素。之後,利用NightOWL LB 981生物發光造影系統(德國伯托技術公司)測量光發射。
圖17顯示此實驗分析脾之結果。相較於同型對照抗體1D5,本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7減少脾轉移之發生。值得注意的是,此實驗中11B7之抗轉移效應相較於紓癌特之效應為強。在肝、肺、股骨及腰椎轉移方面得到類似觀察。
實施例7:人化抗體之設計
7.1 #11B7之人化版本之設計
7.1.1 #11B7可變結構域之分子模擬
#11B7可變結構域之分子模擬係根據該領域眾所周知之同源模擬方法進行(Methods in Enzymology,203,121-153(1991))。在蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))中登記之人免疫球蛋白可變結構域之一級序列(可獲得源自X射線晶體結構之三維結構)係
與該經測定之#11B7可變結構域比較。結果顯示,1JPT被選擇為與#11B7輕鏈可變結構域具有最高序列同源性。另外,1F8T被選擇為與#11B7重鏈可變結構域具有最高序列同源性。架構結構域之三維結構係根據藉由組合對應#11B7輕鏈及重鏈之1JPT與1F8T的座標所獲得之「架構模型」加以製備。以#11B7 CDR而言,根據索頓(Thornton)等人之分類(J.Mol.Biol.,263,800-815(1996)),將CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及CDRH2分別分配至集簇11A、7A、9A、10A及9A。CDRH3根據H3規則(FEBS letters 399,1-8(1996))被分類為k(3)。隨後,各CDR之典型構型被納入該架構模型中。
最後,為了獲得以能量而言#11B7可變結構域之可能的分子模型,進行能量計算以排除不利的原子間碰觸。這些程序係利用可購得之三維蛋白質結構預測程式Prime及座標搜尋程式MacroModel(Schrödinger,LLC)進行。
7.1.2 人化#11B7之胺基酸序列之設計
人化#11B7抗體係根據該領域廣為周知之CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))方法加以建構。接受者抗體係以二種根據該架構結構域內之胺基酸同源性之方式選擇。
#11B7架構結構域之序列係與登錄於卡巴(Kabat)資料庫(Nuc.Acid Res.29,205-206(2001))中有關抗
體胺基酸序列之所有人架構區的序列比較。結果顯示,選擇GM4672’CL抗體作為接受者因為彼等之架構結構域之間具有72%之序列一致性。排列GM4672’CL之架構結構域的胺基酸殘基與#11B7之對應胺基酸殘基以鑑別二者之間使用不同胺基酸之位置。該些殘基之位置係利用#11B7因此建構之三維模型分析。接著,將被移植至接受者之捐贈者殘基係根據昆恩(Queen)等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所提供之標準加以選擇。
#11B7架構結構域之序列係與登錄於IgBLAST(Nuc.Acid Res.36,D25-D30(2007))中之所有人架構區之序列比較。結果顯示,選擇BAC01582作為L鏈接受者因為彼等之架構結構域之間具有76%之序列一致性。選擇AAF80028作為H鏈接受者因為彼等之架構結構域之間具有66%之序列一致性。排列BAC01582 L鏈及AAF80028 H鏈中之架構結構域的胺基酸殘基與#11B7之對應胺基酸殘基以鑑別彼等之間使用不同胺基酸之位置。該些殘基之位置係利用#11B7因此建構之三維模型分析。接著,將被移植至接受者之捐贈者殘基係根據昆恩(Queen)等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所提供之標準加以選擇。
在所有方法中,人化#11B7序列係如下列實施例所述藉由轉移一些經選擇之捐贈者殘基至該接受者抗體加以建構。
7.1.3 #11B7輕鏈之人化(圖1、2及3)
7.1.3.1 h#11B7-T1L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、65(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、73(白胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T1L”型輕鏈可變區。
7.1.3.2 h#11B7-T2L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、65(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、73(白胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、104(白胺酸)、106
(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T2L”型輕鏈可變區。
7.1.3.3 h#11B7-T3L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T3L”型輕鏈可變區。
7.1.3.4 h#11B7-T4L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106
(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T4L”型輕鏈可變區。
7.1.3.5 h#11B7-T5L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T5L”型輕鏈可變區。
7.1.3.6 h#11B7-T6L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺
酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T6L”型輕鏈可變區。
7.1.3.7 h#11B7-T7L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T7L”型輕鏈可變區。
7.1.3.8 h#11B7-T8L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺
酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T8L”型輕鏈可變區。
7.1.3.9 h#11B7-T9L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T9L”型輕鏈可變區。
7.1.3.10 h#11B7-T10L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺
酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T10L”型輕鏈可變區。
7.1.3.11 h#11B7-T11L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T11L”型輕鏈可變區。
7.1.3.12 h#11B7-T12L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T12L”型輕鏈可變區。
7.1.3.13 h#11B7-T13L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸
取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T13L”型輕鏈可變區。
7.1.3.14 h#11B7-T14L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T14L”型輕鏈可變區。
7.1.3.15 h#11B7-T15L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺
酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T15L”型輕鏈可變區。
7.1.3.16 h#11B7-T16L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T16L”型輕鏈可變區。
7.1.3.17 h#11B7-T17L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺
酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T17L”型輕鏈可變區。
7.1.3.18 h#11B7-T18L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T18L”型輕鏈可變區。
7.1.3.19 h#11B7-T19L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、
45(精胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T19L”型輕鏈可變區。
7.1.3.20 h#11B7-T20L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:140(圖30B)所表示之#11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸)、12(脯胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(天冬胺酸)、100(甘胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱為“h#11B7-T20L”型輕鏈可變區。
7.1.4 #11B7重鏈之人化(圖4及5)
7.1.4.1 h#11B7-T1H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、2(纈胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、48(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、68(絲胺酸)、70(蘇胺酸)、71(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、異白胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、纈胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T1H”型重鏈可變區。
7.1.4.2 h#11B7-T2H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、2(纈胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、70(蘇胺酸)、71(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、異
白胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、絲胺酸、纈胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T2H”型重鏈可變區。
7.1.4.3 h#11B7-T3H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、40(苯丙胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、絲胺酸、脯胺酸、甘胺酸、白胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T3H”型重鏈可變區。
7.1.4.4 h#11B7-T4H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、6(麩胺酸)、7(絲胺酸)、9(脯胺酸)、12(纈胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺
酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、48(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、68(絲胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T4H”型重鏈可變區。
7.1.4.5 h#11B7-T5H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、6(麩胺酸)、7(絲胺酸)、9(脯胺酸)、12(纈胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、絲
胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T5H”型重鏈可變區。
7.1.4.6 h#11B7-T6H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T6H”型重鏈可變區。
7.1.4.7 h#11B7-T7H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、48(甲硫胺酸)、67(異
白胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T7H”型重鏈可變區。
7.1.4.8 h#11B7-T8H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、68(絲胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T8H”型重鏈可變區。
7.1.4.9 h#11B7-T9H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、48(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、68(絲胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T9H”型重鏈可變區。
7.1.4.10 h#11B7-T10H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、6(麩胺酸)、7(絲胺酸)、9(脯胺酸)、12(纈胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、48(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺
酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T10H”型重鏈可變區。
7.1.4.11 h#11B7-T11H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、6(麩胺酸)、7(絲胺酸)、9(脯胺酸)、12(纈胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、68(絲胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T11H”型重
鏈可變區。
7.1.4.12 h#11B7-T12H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:141(圖30C)所表示之#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、6(麩胺酸)、7(絲胺酸)、9(脯胺酸)、12(纈胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、48(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、68(絲胺酸)、70(蘇胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(絲胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱為“h#11B7-T12H”型重鏈可變區。
7.2 #11D5之人化版本之設計
7.2.1 #11D5可變結構域之分子模擬
#11D5可變結構域之分子模擬係根據該領域眾所周知之同源模擬方法進行(Methods in Enzymology,203,121-
153(1991))。在蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.35,D301-D303(2007))中登記之人免疫球蛋白可變結構域之一級序列(可獲得源自X射線晶體結構之三維結構)係與該經測定之#11D5可變結構域比較。結果顯示,1D5I被選擇為與#11D5輕鏈可變結構域具有最高序列同源性。另外,1ORS被選擇為與#11D5重鏈可變結構域具有最高序列同源性。架構結構域之三維結構係根據藉由組合對應#11D5輕鏈及重鏈之1D5I與1ORS的座標所獲得之「架構模型」加以製備。以#11D5 CDR而言,根據索頓(Thornton)等人之分類(J.Mol.Biol.,263,800-815(1996)),將CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1及CDRH2分別分配至集簇11A、7A、9A、10A及9A。CDRH3根據H3規則(FEBS letters 399,1-8(1996))被分類為k(3)。隨後,各CDR之典型構型被納入該架構模型中。
最後,為了獲得以能量而言#11D5可變結構域之可能的分子模型,進行能量計算以排除不利的原子間碰觸。這些程序係利用可購得之三維蛋白質結構預測程式Prime及座標搜尋程式MacroModel(Schrödinger,LLC)進行。
7.2.2 人化#11D5之胺基酸序列之設計
人化#11D5抗體係根據該領域廣為周知之CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))方法加以建構。接受者抗體係以二種根據該架構結構域內
之胺基酸同源性之方式選擇。
#11D5架構結構域之序列係與登錄於卡巴(Kabat)資料庫(Nuc.Acid Res.29,205-206(2001))中有關抗體胺基酸序列之所有人架構區的序列比較。結果顯示,選擇T33-4’CL抗體作為接受者因為彼等之架構結構域之間具有70%之序列一致性。排列T33-4’CL之架構結構域的胺基酸殘基與#11D5之對應胺基酸殘基以鑑別二者之間使用不同胺基酸之位置。該些殘基之位置係利用#11D5因此建構之三維模型分析。接著,將被移植至接受者之捐贈者殘基係根據昆恩(Queen)等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所提供之標準加以選擇。
#11D5架構結構域之序列係與登錄於IgBLAST(Nuc.Acid Res.36,D25-D30(2007))中之所有人架構區之序列比較。結果顯示,選擇1603260B作為L鏈接受者因為彼等之架構結構域之間具有74%之序列一致性。選擇AAF80028作為H鏈接受者因為彼等之架構結構域之間具有66%之序列一致性。排列1603260B L鏈及AAF80028 H鏈中之架構結構域的胺基酸殘基與#11D5之對應胺基酸殘基以鑑別彼等之間使用不同胺基酸之位置。該些殘基之位置係利用#11D5因此建構之三維模型分析。接著,將被移植至接受者之捐贈者殘基係根據昆恩(Queen)等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所提供之標準加以選擇。
在所有方法中,人化#11D5序列係如下列實施例所述
藉由轉移一些經選擇之捐贈者殘基至該接受者抗體加以建構。
7.2.3 #11D5輕鏈之人化(圖6、7、8、9、10及11)
7.2.3.1 h#11D5-T1L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號2(異白胺酸)、11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、46(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由纈胺酸、白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T1L”型輕鏈可變區。
7.2.3.2 h#11D5-T2L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、46(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺
酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T2L”型輕鏈可變區。
7.2.3.3 h#11D5-T3L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T3L”型輕鏈可變區。
7.2.3.4 h#11D5-T4L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪
胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T4L”型輕鏈可變區。
7.2.3.5 h#11D5-T5L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T5L”型輕鏈可變區。
7.2.3.6 h#11D5-T6L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之
#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T6L”型輕鏈可變區。
7.2.3.7 h#11D5-T7L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈
可變區被稱為“h#11D5-T7L”型輕鏈可變區。
7.2.3.8 h#11D5-T8L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T8L”型輕鏈可變區。
7.2.3.9 h#11D5-T9L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺
酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T9L”型輕鏈可變區。
7.2.3.10 h#11D5-T10L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T10L”型輕鏈可變區。
7.2.3.11 h#11D5-T11L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T11L”型輕鏈可變區。
7.2.3.12 h#11D5-T12L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白
胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T12L”型輕鏈可變區。
7.2.3.13 h#11D5-T13L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T13L”型輕鏈可變區。
7.2.3.14 h#11D5-T14L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、
45(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T14L”型輕鏈可變區。
7.2.3.15 h#11D5-T15L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T15L”型輕鏈可變區。
7.2.3.16 h#11D5-T16L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T16L”型輕鏈可變區。
7.2.3.17 h#11D5-T17L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺
酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T17L”型輕鏈可變區。
7.2.3.18 h#11D5-T18L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T18L”型輕鏈可變區。
7.2.3.19 h#11D5-T19L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇
胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T19L”型輕鏈可變區。
7.2.3.20 h#11D5-T20L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化
#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T20L”型輕鏈可變區。
7.2.3.21 h#11D5-T21L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T21L”型輕鏈可變區。
7.2.3.22 h#11D5-T22L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺
酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T22L”型輕鏈可變區。
7.2.3.23 h#11D5-T23L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T23L”型輕鏈可變區。
7.2.3.24 h#11D5-T24L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T24L”型輕鏈可變區。
7.2.3.25 h#11D5-T25L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及
蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T25L”型輕鏈可變區。
7.2.3.26 h#11D5-T26L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T26L”型輕鏈可變區。
7.2.3.27 h#11D5-T27L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104
(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T27L”型輕鏈可變區。
7.2.3.28 h#11D5-T28L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T28L”型輕鏈可變區。
7.2.3.29 h#11D5-T29L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇
胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T29L”型輕鏈可變區。
7.2.3.30 h#11D5-T30L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T30L”型輕鏈可變區。
7.2.3.31 h#11D5-T31L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T31L”型輕鏈可變區。
7.2.3.32 h#11D5-T32L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺
酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T32L”型輕鏈可變區。
7.2.3.33 h#11D5-T33L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、71(酪胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T33L”型輕鏈可變區。
7.2.3.34 h#11D5-T34L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、70(天冬胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺
酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T34L”型輕鏈可變區。
7.2.3.35 h#11D5-T35L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、47(甲硫胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T35L”型輕鏈可變區。
7.2.3.36 h#11D5-T36L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之
#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、45(精胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T36L”型輕鏈可變區。
7.2.3.37 h#11D5-T37L型輕鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:142(圖30D)所表示之#11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸)、13(蘇胺酸)、15(白胺酸)、36(苯丙胺酸)、40(纈胺酸)、43(絲胺酸)、66(精胺酸)、69(絲胺酸)、72(絲胺酸)、79(麩胺酸)、80(絲胺酸)、83(甲硫胺酸)、85(異白胺酸)、100(絲胺酸)、104(白胺酸)、106(白胺酸)及109(脯胺酸)分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱為“h#11D5-T37L”型輕鏈可變區。
7.2.4 #11D5重鏈之人化(圖12及13)
7.2.4.1 h#11D5-T1H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、68(絲胺酸)、71(精胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、麩胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T1H”型重鏈可變區。
7.2.4.2 h#11D5-T2H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、71(精胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯
胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、甲硫胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、麩胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T2H”型重鏈可變區。
7.2.4.3 h#11D5-T3H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T3H”型重鏈可變區。
7.2.4.4 h#11D5-T4H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、6(麩胺酸)、7(絲胺酸)、9(脯胺酸)、12(纈胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺
酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、68(絲胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T4H”型重鏈可變區。
7.2.4.5 h#11D5-T5H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號6(麩胺酸)、7(絲胺酸)、9(脯胺酸)、12(纈胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺
酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T5H”型重鏈可變區。
7.2.4.6 h#11D5-T6H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T6H”型重鏈可變區。
7.2.4.7 h#11D5-T7H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、68(絲
胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T7H”型重鏈可變區。
7.2.4.8 h#11D5-T8H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、68(絲胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T8H”型重鏈可變區。
7.2.4.9 h#11D5-T9H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、68(絲胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、蘇胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T9H”型重鏈可變區。
7.2.4.10 h#11D5-T10H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、
107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T10H”型重鏈可變區。
7.2.4.11 h#11D5-T11H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、68(絲胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、蘇胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T11H”型重鏈可變區。
7.2.4.12 h#11D5-T12H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號16(麩醯胺酸)、17(絲
胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、67(異白胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T12H”型重鏈可變區。
7.2.4.13 h#11D5-T13H型重鏈:
藉由將序列表SEQ ID NO:143(圖30E)所表示之#11D5重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸)、16(麩醯胺酸)、17(絲胺酸)、23(絲胺酸)、25(蘇胺酸)、39(離胺酸)、40(苯丙胺酸)、43(天冬醯胺酸)、44(離胺酸)、45(甲硫胺酸)、75(精胺酸)、79(苯丙胺酸)、81(麩醯胺酸)、83(天冬醯胺酸)、87(蘇胺酸)、88(麩胺酸)、92(蘇胺酸)、107(纈胺酸)及108(甲硫胺酸)分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱為“h#11D5-T13H”型重鏈可變區。
實施例8:建構通用載體以供人化抗體表現
8.1 建構供人化抗體輕鏈表現之載體pEF6KCL
使用質體pEF6/V5-His B(英維特基公司)作為模板及下列引子進行PCR以獲得從緊接著BGHpA(2174)至SmaI(2958)之DNA片段(含有f1複製起點及SV40啟動子及起點之DNA片段,以下稱為「片段A」):5’-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3’(引子EFF1:SEQ ID NO:1)及5’-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3’(引子EFsmaR:SEQ ID NO:2)
該獲得之片段A藉由重疊PCR與包含編碼人κ鏈分泌信號、人κ鏈固定區及人多聚(A)加尾信號之DNA序列的DNA片段(SEQ ID NO:3;以下稱為「片段B))連接。該獲得之其中片段A與片段B連接之DNA片段(以下稱為「片段A+B」)係經限制酶KpnI及SmaI消化,並與先前已經限制酶KpnI及SmaI消化之質體pEF6/V5-His B(英維特基公司)連接,以建構具有信號序列、選殖位點、人κ鏈固定區編碼序列及在EF1啟動子下游之人多聚(A)加尾信號序列之人L鏈表現質體“pEF6KCL”(圖19)。
8.2 建構供人化抗體重鏈表現之載體pEF1/FCCU-1
8.2.1 建構pEF1/KCL
藉由上述方法獲得之質體pEF6KCL係經限制酶KpnI及SmaI消化。該形成之DNA片段與先前已經KpnI及SmaI消化之質體pEF1/myc-His B(英維特基公司)連接,以建構質體pEF1/KCL。
8.2.2 建構pEF1/FCCU-1
包含編碼人IgG1之信號序列及固定區之胺基酸序列(SEQ ID NO:4)的DNA序列之DNA片段係經限制酶NheI及PmeI消化,並與先前已經NheI及PmeI消化之質體pEF1/KCL連接,以建構具有信號序列、選殖位點、人重鏈固定區編碼序列及在EF1啟動子下游之人多聚(A)加尾信號序列之人重鏈表現質體pEF1/FCCU-1。
實施例9:大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體基因之產製
a)建構h#11B7-T1L、h#11B7-T2L、h#11B7-T3L、h#11B7-T4L、h#11B7-T5L、h#11B7-T6L、h#11B7-T7L、h#11B7-T8L、h#11B7-T9L、h#11B7-T10L、h#11B7-T11L、h#11B7-T12L及h#11B7-T13L輕鏈表現載體
與分泌信號融合之各個含有編碼h#11B7-T1L、h#11B7-T2L、h#11B7-T3L、h#11B7-T4L、h#11B7-T5L、h#11B7-T6L、h#11B7-T7L、h#11B7-T8L、h#11B7-T9L、h#11B7-T10L、h#11B7-T11L、h#11B7-T12L或h#11B7-T13L輕鏈可變區(圖1及2)(分別以序列表SEQ ID
NO:18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30之胺基酸編號21至129表示)之基因的DNA係經合成(MBL醫學及生物實驗室有限公司之人工基因合成服務)且經限制酶NheI及BsiWI消化。該形成之DNA片段被分開導入預先經限制酶NheI及BsiWI消化之供人化抗體輕鏈表現之通用載體(pEF6KCL)之位點以藉此建構h#11B7-T1L、h#11B7-T2L、h#11B7-T3L、h#11B7-T4L、h#11B7-T5L、h#11B7-T6L、h#11B7-T7L、h#11B7-T8L、h#11B7-T9L、h#11B7-T10L、h#11B7-T11L、h#11B7-T12L及h#11B7-T13L輕鏈表現載體。該獲得之表現載體被稱為“pEF6KCL/h#11B7-T1L”、“pEF6KCL/h#11B7-T2L”、“pEF6KCL/h#11B7-T3L”、“pEF6KCL/h#11B7-T4L”、“pEF6KCL/h#11B7-T5L”、“pEF6KCL/h#11B7-T6L”、“pEF6KCL/h#11B7-T7L”、“pEF6KCL/h#11B7-T8L”、“pEF6KCL/h#11B7-T9L”、“pEF6KCL/h#11B7-T10L”、“pEF6KCL/h#11B7-T11L”、“pEF6KCL/h#11B7-T12L或“pEF6KCL/h#11B7-T13L”,且各表現載體之導入物係分別以序列表之SEQ ID NO:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17之核苷酸序列表示。
b)建構h#11B7-T1H、h#11B7-T2H、h#11B7-T3H、h#11B7-T4H、h#11B7-T5H、h#11B7-T6H、h#11B7-T7H、h#11B7-T8H及h#11B7-T9H重鏈表現載體
各個含有編碼h#11B7-T1H、h#11B7-T2H、h#11B7-
T3H、h#11B7-T4H、h#11B7-T5H、h#11B7-T6H、h#11B7-T7H、h#11B7-T8H或h#11B7-T9H重鏈可變區(圖4及5)(分別以序列表SEQ ID NO:40、41、42、43、44、45、46、47或48之胺基酸編號20至132表示)之基因的DNA係經合成(MBL醫學及生物實驗室有限公司之人工基因合成服務)且經限制酶BlpI消化。該形成之DNA片段被分開導入預先經限制酶BlpI消化之供人化抗體重鏈表現之通用載體(pEF1/FCCU-1)之位點以藉此建構h#11B7-T1H、h#11B7-T2H、h#11B7-T3H、h#11B7-T4H、h#11B7-T5H、h#11B7-T6H、h#11B7-T7H、h#11B7-T8H及h#11B7-T9H重鏈表現載體。該獲得之表現載體被稱為“pEF1/FCCU/h#11B7-T1H”、“pEF1/FCCU/h#11B7-T2H”、“pEF1/FCCU/h#11B7-T3H”、“pEF1/FCCU/h#11B7-T4H”、“pEF1/FCCU/h#11B7-T5H”、“pEF1/FCCU/h#11B7-T6H”、“pEF1/FCCU/h#11B7-T7H”、“pEF1/FCCU/h#11B7-T8H”或“pEF1/FCCU/h#11B7-T9H”,且各表現載體之導入物係分別以序列表之SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38或39之核苷酸序列表示。
實施例10:製備大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體
a)產製人化抗體
將1.5x108對數生長期之FreeStyle 293-F細胞種至
100毫升之新鮮FreeStyle 293表現培養基(英維特基公司),於37℃、8% CO2之培養箱中搖晃培養(125rpm)。將1毫克之聚乙烯亞胺(伯賽恩斯(Polyscience)#24765)溶解於4毫升之Opti-Pro SFM培養基(英特維基公司)中並於室溫中留置5分鐘。利用PureLink HiPure質體套組(英特維基公司)製備之重鏈表現載體(0.05毫克)及輕鏈表現載體(0.15毫克)係懸浮於4毫升之Opti-Pro SFM培養基(英特維基公司)。將該4毫升之表現載體/Opti-Pro SFM混合溶液加至留置於室溫中5分鐘之4毫升聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合溶液中,另外再留置於室溫中5分鐘。接著,將8毫升之聚乙烯亞胺/表現質體/Opti-Pro SFM混合溶液加入FreeStyle 293-F細胞懸浮液,繼續搖晃培養。於37℃、8% CO2中培養7天後,收集該培養上清液。
b)純化人化抗體
利用Protein A親和管柱層析法純化前段a)所獲得之培養上清液。將100毫升之培養上清液置於有蓋之500毫升角瓶中,接著加入1毫升經PBS平衡之MabSelect SuRe(GE醫療集團拜爾賽恩斯(Bio-science)公司)懸浮液(50%漿狀物)。該混合物於10℃培養箱中以100rpm攪拌隔夜。該FreeStyle 293-F細胞培養上清液/MabSelect SuRe懸浮液被加入空的5毫升Zeba Spin管柱(皮爾斯(PIERCE)公司)。全樹脂被置於管柱中,然
後以10毫升之1M NaCl清洗。接著,加入1毫升之1M精胺酸溶液(pH 4.0)以收集含抗體組分。該組分被加入離心過濾裝置(密理博(Millipore)公司Amicon Ultra-4,截留分子量:50K),接著以檸檬酸緩衝液進行溶液置換及濃縮調整至200微升以製備經純化之樣本。
由pEF6KCL/h#11B7-T1L及pEF1/FCCU/h#11B7-T1H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T1”;由pEF6KCL/h#11B7-T2L及pEF1/FCCU/h#11B7-T2H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T2”;由pEF6KCL/h#11B7-T3L及pEF1/FCCU/h#11B7-T3H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T3”;由pEF6KCL/h#11B7-T4L及pEF1/FCCU/h#11B7-T4H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T4”;由pEF6KCL/h#11B7-T5L及pEF1/FCCU/h#11B7-T5H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T5”;由pEF6KCL/h#11B7-T6L及pEF1/FCCU/h#11B7-T6H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T6”;由pEF6KCL/h#11B7-T7L及pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T7”;由pEF6KCL/h#11B7-T8L及pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T8”;由pEF6KCL/h#11B7-T9L及pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T9”;由pEF6KCL/h#11B7-T10L及pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之組
合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T10”;由pEF6KCL/h#11B7-T11L及pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T11”;由pEF6KCL/h#11B7-T12L及pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T12”;由pEF6KCL/h#11B7-T13L及pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T13”;由pEF6KCL/h#11B7-T7L及pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T14”;由pEF6KCL/h#11B7-T8L及pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T15”;由pEF6KCL/h#11B7-T9L及pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T16”;由pEF6KCL/h#11B7-T10L及pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T17”;由pEF6KCL/h#11B7-T11L及pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T18”;由pEF6KCL/h#11B7-T12L及pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T19”;由pEF6KCL/h#11B7-T13L及pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T20”;由pEF6KCL/h#11B7-T7L及pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T21”;由pEF6KCL/h#11B7-T8L及pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之組合
所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T22”;由pEF6KCL/h#11B7-T9L及pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T23”;由pEF6KCL/h#11B7-T10L及pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T24”;由pEF6KCL/h#11B7-T11L及pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T25”;由pEF6KCL/h#11B7-T12L及pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T26”;由pEF6KCL/h#11B7-T13L及pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T27”。
實施例11:大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之人化抗體基因之產製
a)建構h#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、
h#11D5-T4L、h#11D5-T5L及h#11D5-T6L輕鏈表現載體
與分泌信號融合之各個含有編碼h#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、h#11D5-T4L、h#11D5-T5L及h#11D5-T6L輕鏈可變區(圖6)(分別以序列表SEQ ID NO:55、56、57、58、59或60之胺基酸編號21至129表示)之基因的DNA係經合成(MBL醫學及生物實驗室有限公司之人工基因合成服務)且經限制酶NheI及BsiWI消化。該形成之DNA片段被分開導入預先經限制酶NheI及BsiWI消化之供人化抗體輕鏈表現之通用載體(pEF6KCL)之位點以藉此建構h#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、h#11D5-T4L、h#11D5-T5L及h#11D5-T6L輕鏈表現載體。該獲得之表現載體被稱為“pEF6KCL/h#11D5-T1L”、“pEF6KCL/h#11D5-T2L”、“pEF6KCL/h#11D5-T3L”、“pEF6KCL/h#11D5-T4L”、“pEF6KCL/h#11D5-T5L”或“pEF6KCL/h#11D5-T6L”,且各表現載體之導入物係分別以序列表之SEQ ID NO:49、50、51、52、53或54之核苷酸序列表示。
b)建構h#11D5-T1H、h#11D5-T2H、h#11D5-T3H、h#11D5-T4H、h#11D5-T5H及h#11D5-T6H重鏈表現載體
各個含有編碼h#11D5-T1H、h#11D5-T2H、h#11D5-T3H、h#11D5-T4H、h#11D5-T5H或h#11D5-T6H重鏈可變區(圖12)(分別以序列表SEQ ID NO:67、68、69、70、71或72之胺基酸編號20至132表示)之基因的DNA係經合成(MBL醫學及生物實驗室有限公司之人
工基因合成服務)且經限制酶BlpI消化。該形成之DNA片段被分開導入預先經限制酶BlpI消化之供人化抗體重鏈表現之通用載體(pEF1/FCCU-1)之位點以藉此建構h#11D5-T1H、h#11D5-T2H、h#11D5-T3H、h#11D5-T4H、h#11D5-T5H及h#11D5-T6H重鏈表現載體。該獲得之表現載體被稱為“pEF1/FCCU/h#11D5-T1H”、“pEF1/FCCU/h#11D5-T2H”、“pEF1/FCCU/h#11D5-T3H”、“pEF1/FCCU/h#11D5-T4H”、“pEF1/FCCU/h#11D5-T5H”或“pEF1/FCCU/h#11D5-T6H”,且各表現載體之導入物係分別以序列表之SEQ ID NO:61、62、63、64、65或66之核苷酸序列表示。
實施例12:製備大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之人化抗體
a)產製人化抗體
將1.5x108對數生長期之FreeStyle 293-F細胞種至100毫升之新鮮FreeStyle 293表現培養基(英維特基公司),於37℃、8% CO2之培養箱中搖晃培養(125rpm)。將1毫克之聚乙烯亞胺(伯賽恩斯(Polyscience)#24765)溶解於4毫升之Opti-Pro SFM培養基(英特維基公司)中並於室溫中留置5分鐘。利用PureLink HiPure質體套組(英特維基公司)製備之重鏈表現載體(0.05毫克)及輕鏈表現載體(0.15毫克)係懸浮於4毫升之Opti-Pro SFM培養基(英特維基公司)。
將該4毫升之表現載體/Opti-Pro SFM混合溶液加至留置於室溫中5分鐘之4毫升聚乙烯亞胺/Opti-Pro SFM混合溶液中,另外再留置於室溫中5分鐘。接著,將8毫升之聚乙烯亞胺/表現質體/Opti-Pro SFM混合溶液加入FreeStyle 293-F細胞懸浮液,繼續搖晃培養。於37℃、8% CO2中培養7天後,收集該培養上清液。
b)純化人化抗體
利用Protein A親和管柱層析法純化前段a)所獲得之培養上清液。將100毫升之培養上清液置於有蓋之500毫升角瓶中,接著加入1毫升經PBS平衡之MabSelect SuRe(GE醫療集團拜爾賽恩斯(Bio-science)公司)懸浮液(50%漿狀物)。該混合物於10℃培養箱中以100rpm攪拌隔夜。該FreeStyle 293-F細胞培養上清液/MabSelect SuRe懸浮液被加入空的5毫升Zeba Spin管柱(皮爾斯(PIERCE)公司)。全樹脂被置於管柱中,然後以10毫升之1M NaCl清洗。接著,加入1毫升之1M精胺酸溶液(pH 4.0)以收集含抗體組分。該組分被加入離心過濾裝置(密理博(Millipore)公司Amicon Ultra-4,截留分子量:50K),接著以檸檬酸緩衝液進行溶液置換及濃縮。終容量調整至200微升以製備經純化之樣本。
由pEF6KCL/h#11D5-T1L及pEF1/FCCU/h#11D5-T1H之組合所獲得之人化抗體#11D5稱為“h#11D5-T1”;由pEF6KCL/h#11D5-T2L及pEF1/FCCU/h#11D5-T2H之組合
所獲得之人化抗體#11D5稱為“h#11D5-T2”;由pEF6KCL/h#11D5-T3L及pEF1/FCCU/h#11D5-T3H之組合所獲得之人化抗體#11D5稱為“h#11D5-T3”;由pEF6KCL/h#11D5-T4L及pEF1/FCCU/h#11D5-T4H之組合所獲得之人化抗體#11D5稱為“h#11D5-T4”;由pEF6KCL/h#11D5-T5L及pEF1/FCCU/h#11D5-T5H之組合所獲得之人化抗體#11D5稱為“h#11D5-T5”;及由pEF6KCL/h#11D5-T6L及pEF1/FCCU/h#11D5-T6H之組合所獲得之人化抗體#11D5稱為“h#11D5-T6”。
實施例13:評估大鼠抗人AXL單株抗體#11B7對人AXL-Fc融合蛋白之親和性
該源自大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體h#11B7-T1至h#11B7-T27藉由下列方法評估彼等對人AXL-Fc之親和性。人AXL-Fc(R&D系統製造,#154-AL)係以PBS稀釋成1微克/毫升。接著,將該溶液以100微升/孔之量分注至免疫板(Immuno Plate)(納爾杰諾科國際公司(Nalge Nunc International K.K.)製造,#437111),於4℃留置隔夜以使蛋白質吸附在該板上。隔天,該孔槽以PBS-T溶液(PBS及0.05%(v/v)Tween 20)清洗5次。接著,將經PBS稀釋至5%之含脫脂乳(森永(Morinaga)乳業株式會社製造)溶液以100微升/孔之量分注,留置於室溫中2小時。移除孔槽中之溶液,以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,將經純化之實施
例10中製備之大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體T1至T27以含0.5%脫脂乳之PBS溶液分開稀釋成終濃度1微克/毫升至0.00256奈克/毫升(5倍連續稀釋)。接著,該溶液以100微升/孔之量分注,留置於室溫中2小時。在此程序中,各抗體濃度係如實施例15所述測定。以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,經TBS-T溶液(TBS及0.05%(v/v)Tween 20)稀釋2500倍之鹼性磷酸酶共軛之AffiniPure羊抗人IgG(傑克森(Jackson)免疫研究實驗室製造,#109-055-097)以100微升/孔之量加入,於室溫中留置1小時。移除孔槽中之溶液,以TBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,添加100微升/孔之螢光受質溶液(羅氏診斷(Roche Diagnostics K.K.)製造,#11681982001)以進行螢光反應。在人AXL-Fc-吸附板上之螢光強度於添加螢光受質溶液後15分鐘利用SpectraMax M5(製造商分子儀器(Molecular Devices)公司)測量。結果顯示,在檢測之27個大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體樣本中,h#11B7-T1及h#11B7-T4經證實相較於人嵌合抗體具有較低之結合活性。然而,其他25個樣本經證實與人嵌合抗體具有幾乎相同之抗體濃度依賴性人AXL-Fc蛋白質結合活性(圖19、20、21及22)。
實施例14:評估大鼠抗人AXL單株抗體#11D5對人AXL-Fc融合蛋白之親和性
大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之人化抗體h#11D5-T1至h#11D5-T6藉由下列方法評估彼等對人AXL-Fc之親和性。人AXL-Fc(R&D系統製造,#154-AL)係以PBS稀釋成1微克/毫升。接著,將該溶液以100微升/孔之量分注至免疫板(Immuno Plate)(納爾杰諾科國際公司(Nalge Nunc International K.K.)製造,#437111),於4℃留置隔夜以使蛋白質吸附在該板上。隔天,該孔槽以PBS-T溶液(PBS及0.05%(v/v)Tween 20)清洗5次。接著,將經PBS稀釋至5%之含脫脂乳(森永(Morinaga)乳業株式會社製造)溶液以100微升/孔之量分注,留置於室溫中2小時。移除孔槽中之溶液,以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,將經純化之實施例12中製備之大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之人化抗體T1至T6以含0.5%脫脂乳之PBS溶液分開稀釋成終濃度1微克/毫升至0.00256奈克/毫升(5倍連續稀釋)。接著,該溶液以100微升/孔之量分注,留置於室溫中2小時。在此程序中,各抗體濃度係如實施例15所述測定。以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,經TBS-T溶液(TBS及0.05%(v/v)Tween 20)稀釋2500倍之鹼性磷酸酶共軛之AffiniPure羊抗人IgG(傑克森(Jackson)免疫研究實驗室製造,#109-055-097)以100微升/孔之量加入,於室溫中留置1小時。移除孔槽中之溶液,以TBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,添加100微升/孔之螢光受質溶液(羅氏診斷(Roche Diagnostics K.K.)製造,#11681982001)
以進行螢光反應。在人AXL-Fc-吸附板上之螢光強度於添加螢光受質溶液後15分鐘利用SpectraMax M5(製造商分子儀器(Molecular Devices)公司)測量。結果顯示,在檢測之6個大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之人化抗體樣本中,h#11D5-T4、h#11D5-T5及h#11D5-T6經證實與人嵌合抗體具有幾乎相同之抗體濃度依賴性人AXL-Fc蛋白質結合活性(圖23)。
實施例15:大鼠抗人AXL單株抗體#11B7及#11D5之人化抗體的吸光係數計算及直接蛋白質吸光測定
源自大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體h#11B7-T1至h#11B7-T27及源自大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之h#11D5-T1至h#11D5-T6的蛋白質濃度係由下列程序測定。分別於實施例10或12製備之大鼠抗人AXL單株抗體#11B7或#11D5之各人化抗體係利用MX5自動化S微平衡器(梅特勒托利多(METTLER TOLEDO))以彼之質量稀釋。各抗體於280奈米之吸光度(A280)係以DU-7400 UV-vis光譜儀(貝克曼庫爾特(Beckman Coulter)公司)使用石英液槽於室溫中測定。各抗體之蛋白質濃度係由吸光係數決定。各抗體之吸光係數係利用軟體Sednterp測定,該軟體可自美國國家衛生研究院的網站下載(http://jphilo.mailway.com/download.htm)。結果列示於圖24(上圖h#11B7-T1至h#11B7-T14;下圖h#11B7-T15至h#11B7-T27)及圖25(h#11D5-T1至
h#11D5-T6)。
實施例16:測定大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之結合位置(表位)
a)人AXL串聯IG結構域之表現及純化
與N端His標籤及凝血酶辨識序列連接之編碼包含人AXL IG結構域之蛋白質(NCBI蛋白質資料庫登錄號P_30530:SEQ ID NO:139胺基酸編號26至220)的DNA被納入載體pDEST14(英維特基公司,目錄編號11801-016)。大腸桿菌Rosetta-gami B(DE3)(諾維根(Novagen)公司目錄編號71136-4)係以此質體轉形並培養於TB培養基(英維特基公司目錄編號22711-022)。如此培養之細菌細胞經超音波破碎及離心,上清液利用HisTrap HP管柱純化(GE醫療集團,目錄編號17-5247-01)。收集該溶離液並以PD-10管柱去鹽(GE醫療集團,目錄編號17-0851-01),接著以凝血酶(西格瑪奧德里奇(Sigma-Aldrich),目錄編號T-7009)切除His標籤。經切割之蛋白質接著以MONO Q 5/50 GL(GE醫療集團,目錄編號17-5166-01)及Superdex 75 10/300管柱(GE醫療集團,目錄編號17-5174-01)分離直到獲得分子量21kDa之單一條帶。
b)人AXL單一IG結構域之表現及純化
與N端His標籤及因子Xa辨識序列連接之編碼包含
人AXL IG結構域之蛋白質(NCBI蛋白質資料庫登錄號P_30530胺基酸編號26至131及129至220)的DNA被納入載體pDEST14(英維特基公司,目錄編號11801-016)。大腸桿菌Rosetta-gami B(DE3)(諾維根(Novagen)公司目錄編號71136-4)係以此質體轉形並培養於TB培養基(英維特基公司目錄編號22711-022)。如此培養之細菌細胞經超音波破碎及離心,上清液利用HisTrap HP管柱純化(GE醫療集團,目錄編號17-5247-01)。接著,該人AXL IG結構域使用Superdex 75 10/300管柱(GE醫療集團,目錄編號17-5174-01)純化,藉由電泳分離直到獲得分子量11kDa之單一條帶。
c)測定人AXL-IG結構域上與大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之結合位置(表位)
人AXL-IG結構域上與大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之結合位置(表位)係利用下列方法評估:含有人AXL之二個IG結構域(NHis-hAXL26-131及NHis-hAXL129-220)中之任一者之肽與含有人AXL之該二個IG結構域(hAXL26-220)之肽分別以PBS稀釋成1微克/毫升。接著,將各溶液以100微升/孔之量分注至免疫板(Immuno Plate)(納爾杰諾科國際公司(Nalge Nunc International K.K.)製造,#437111),於4℃留置隔夜以使肽吸附在該板上。隔天,該孔槽以PBS-T溶液(PBS及0.05%(v/v)Tween 20)清洗5次。接著,將經PBS稀釋至5%
之含脫脂乳(森永(Morinaga)乳業株式會社製造)溶液以100微升/孔之量分注,留置於室溫中2小時。移除孔槽中之溶液,以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,將大鼠抗人AXL單株抗體#11B7以含0.5%脫脂乳之PBS溶液稀釋成0.04微克/毫升。接著,該溶液以100微升/孔之量分注,留置於室溫中2小時。以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,經TBS-T溶液(TBS及0.05%(v/v)Tween 20)稀釋2500倍之鹼性磷酸酶共軛之AffiniPure羊抗人IgG(傑克森(Jackson)免疫研究實驗室製造,#109-055-097)以100微升/孔之量加入,於室溫中留置1小時。移除孔槽中之溶液,以TBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,添加100微升/孔之螢光受質溶液(羅氏診斷(Roche Diagnostics K.K.)製造,#11681982001)以進行螢光反應。在人AXL-IG結構域-吸附板上之螢光強度於添加螢光受質溶液後15分鐘利用SpectraMax M5(製造商分子儀器(Molecular Devices)公司)測量。該ELISA之結果顯示,只有hAXL26-220及NHis-hAXL129-220經證實具有結合活性。因此,此結果顯示大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之表位係在人AXL之二個IG結構域中靠近羧基端之結構域(含有NCBI蛋白質資料庫登錄號P_30530:SEQ ID NO:139胺基酸編號129至220之胺基酸殘基的結構域;圖30A)(圖26)。
實施例17:本發明之人化抗AXL抗體於活體外抑制
配體誘導之AXL磷酸化
由生長停止特定基因6(Gas6)編碼之蛋白質代表受體酪胺酸激酶AXL之天然配體。Gas6與AXL結合導致由受體酪胺酸激酶磷酸化程度增加所反映之受體活化。在實施例17中描述之實驗係用於評估本發明之人化抗AXL抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6干擾Gas6媒介之受體酪胺酸激酶AXL活化之潛力。
實施例17.1:本發明之人化抗AXL抗體於活體外抑制以ELISA測定之配體誘導之AXL磷酸化
進行ELISA實驗以探討本發明之人化抗AXL抗體是否能阻斷配體Gas6誘導之AXL之磷酸化。簡言之,第1天時,將每孔3x104細胞接種於平底96孔板之正常生長培養基中。隔天以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。另外,黑色Maxi-Sorp 96孔板(諾科(Nunc))於4℃中以2微克/毫升PBS之小鼠抗-磷-酪胺酸抗體4G10包覆隔夜。在第3天時,移除4G10抗體溶液,Maxi-Sorp孔槽於室溫中以PBS、0.5% BSA封閉至少4小時。同時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(西格瑪(Sigma)公司)、嵌合性抗Axl單株抗體#11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6
(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。接著輕彈出培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘。同時,移除封閉緩衝液,以清洗緩衝液(PBS,0.05% Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次,之後移入溶解物並於4℃培養隔夜。當孔板於第4天以清洗緩衝液清洗6次後,孔槽與0.5微克/毫升PBS之生物素基化大鼠抗AXL抗體12B7於室溫中培養2小時。孔板經清洗緩衝液清洗6次後,在各孔槽中添加經PBS稀釋4000倍之AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白(加美公(Chemicon)#SA110)並於室溫中培養30分鐘。之後,孔槽以清洗緩衝液清洗6次並加入AttoPhos受質溶液(羅氏#11681982)。使用維克特(Victor)孔板讀取儀(珀金埃爾默(Perkin Elmer)),收集各孔於激發波長430奈米及發射波長580奈米之螢光。
圖27顯示Hs578T乳癌細胞於此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗AXL抗體#11B7及本發明之人化抗AXL抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能在Hs578T乳癌細胞中阻斷或顯著降低Gas6媒介之AXL活化,如AXL酪胺酸磷酸化程度降低所示。該相同組抗體之類似效應亦見於AXL過度表現性NIH3T3-AXL cl.7纖維母細
胞、肺癌細胞系NCI-H292、黑色素瘤細胞系C-8161及前列腺癌細胞系PC-3及DU-145。
實施例17.2:本發明之人化抗AXL抗體於活體外抑制以西方墨點分析測定之配體誘導之AXL磷酸化
另外,進行西方墨點分析以證實該人化抗體干擾配體Gas6誘導之AXL活化之能力。為達此目的,第1天將1.5x106 Hs578T乳癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天,以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在第3天時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(西格瑪(Sigma)公司)、嵌合性抗AXL單株抗體#11B7及人化抗AXL抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之1毫升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘,於4℃以10,000xg離心10分鐘以去除細胞碎片。為進行免疫沉降作用,測定上清液之蛋白質濃度,並將500微克之全細胞溶解物與30微升之蛋白A-瓊脂糖懸浮液及1微克之大鼠抗AXL單株抗體12B7置於4℃之轉盤上培養3小時。該沉澱物以0.7毫升
之冰HNTG緩衝液(20mM HEPES pH 7.5、150mM NaCl、0.1% Triton-X-100、10%甘油及10mM Na4P2O7)清洗三次,懸浮及煮沸於40微升之3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中,然後以SDS PAGE展開。為進行西方墨點分析,蛋白質被轉移至硝化纖維素膜。之後,該膜以NET-明膠封閉,與小鼠單株抗-磷-酪胺酸一級抗體4G10(昂普斯塔(Upstate))隔夜培養。隔天以NET-明膠清洗3次後,該膜於室溫中與HRP共軛之抗小鼠二級抗體培養1小時,接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示(GE醫療集團)使用化學發光偵測套組,該濾膜最後暴露至底片(柯達(Kodak))。之後,該相同濾膜以抗AXL抗體再次探測。
圖27顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗AXL抗體#11B7及本發明之人化抗AXL抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能在Hs578T乳癌細胞中阻斷或顯著降低Gas6誘導之AXL活化,如AXL酪胺酸磷酸化程度降低所示。
實施例18:本發明之人化抗AXL抗體於活體外抑制配體誘導之AXL下游傳訊分子之磷酸化
Gas6誘導之受體酪胺酸激酶Axl之活化不僅藉由Axl本身之酪胺酸磷酸化程度增加反應,同時亦關於誘導下游傳訊級聯,包括ERK1/2及PKB/AKT途徑。我們因此繼
續進行實驗以評估本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6干擾Gas6媒介之ERK1、ERK2及AKT活化之潛力。另外,我們發現傳訊分子GSK-3 β、TSC2、mTOR及S6K1之磷酸化狀態也在Gas6刺激時受到調節,因此同時探討本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6對這些分子之抑制效應。
實施例18.1:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制配體誘導之ERK1/2磷酸化
進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有干擾Gas6誘導之ERK1/2活化之潛力。Gas6媒介之ERK1/2活化係藉由彼之位置Thr202及Tyr204之磷酸化程度增加反映。為達此目的,第1天將5x106 Hs578T乳癌細胞或3x106 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天,以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在第3天時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特(Baxter)公司)、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM
原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之800微升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘,於4℃以10,000xg離心10分鐘以去除細胞碎片。測定上清液中之蛋白質濃度,將50微克之全細胞溶解物懸浮及煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中,然後以SDS PAGE展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時,該膜以NET-明膠封閉,並與兔多株抗-磷-p44/42 MAP激酶(Thr202/Tyr204)一級抗體(細胞傳訊科技(Cell Signaling Technologies),#9101)隔夜培養。隔天以NET-明膠清洗3次後,該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二級抗體(戴爾諾華(Dianova),#111-036-045)培養1小時,接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示(GE醫療集團)使用化學發光偵測套組,濾膜最後暴露至底片(柯達(Kodak))。之後,該相同濾膜以抗p44/42 MAP激酶抗體(聖塔克魯斯(Santa Cruz)K-23,#sc-153)再次探測。
圖28A顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6干擾Hs578T乳癌細胞中由Gas6誘發之ERK1/2活化微弱增加。然而由於ERK1/2在此細胞系中之基礎活性甚高,這些如經Gas6刺激之細胞中ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化程度相較於對
應之未經刺激細胞降低所示之效應似乎僅相對中等(上圖)。相對地,嵌合性抗Axl抗體chm11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6在NCI-H292肺癌細胞中所反映之對ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化之抑制效應清楚得多(下圖)。
實施例18.2:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制配體誘導之AKT磷酸化
進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有干擾Gas6誘導之AKT活化之潛力。Gas6媒介之AKT活化係藉由彼之位置Ser473之磷酸化程度增加反映。為達此目的,第1天將5x106 Hs578T乳癌細胞或3x106 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天,以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在第3天時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特(Baxter)公司)、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之800微升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中
30分鐘,於4℃以10,000xg離心10分鐘以去除細胞碎片。測定上清液中之蛋白質濃度,將50微克之全細胞溶解物懸浮及煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中,然後以SDS PAGE展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時,該膜以NET-明膠封閉,並與兔多株抗AKT1/2/3一級抗體(細胞傳訊科技(Cell Signaling Technologies),#9272)隔夜培養。隔天以NET-明膠清洗3次後,該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二級抗體(戴爾諾華(Dianova),#111-036-045)培養1小時,接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示(GE醫療集團)使用化學發光偵測套組,濾膜最後暴露至底片(柯達(Kodak))。之後,該相同濾膜以抗-磷-AKT(Ser473)抗體(細胞傳訊科技,#9271)再次探測。
圖28B顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能顯著降低Hs578T乳癌細胞(上圖)及NCI-H292肺癌細胞(下圖)中由Gas6誘發之AKT活化,如經Gas6刺激之細胞中AKT Ser473磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
實施例18.3:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制配體誘導之GSK-3 β磷酸化
進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有
干擾Gas6誘導之GSK-3 β活化之潛力,該Gas6誘導之GSK-3 β活化係藉由彼之位置Ser9之磷酸化程度增加反映。為達此目的,第1天將5x106 Hs578T乳癌細胞或3x106 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天,以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在第3天時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特(Baxter)公司)、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之800微升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘,於4℃以10,000xg離心10分鐘以去除細胞碎片。測定上清液中之蛋白質濃度,將50微克之全細胞溶解物懸浮及煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中,然後以SDS PAGE展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時,該膜以NET-明膠封閉,並與兔多株抗-磷-GSK-3 β(Ser9)一級抗體(細胞傳訊科技,#9336)隔夜培養。隔天以NET-明膠清洗3次後,該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二級抗體(戴爾諾華,#111-036-045)培養1小時,接著用NET-明膠再清洗3
次。根據廠商指示(GE醫療集團)使用化學發光偵測套組,濾膜最後暴露至底片(柯達)。之後,該相同濾膜以抗GSK-3 β抗體(必帝(Becton Dickinson)公司,#610201)及HRP共軛之抗小鼠二級抗體(戴爾諾華,#315-036-045)再次探測。
圖28C顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能顯著降低Hs578T乳癌細胞(上圖)及NCI-H292肺癌細胞(下圖)中由Gas6誘發之GSK-3 β活化,如經Gas6刺激之細胞中GSK-3 β Ser9磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
實施例18.4:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制配體誘導之TSC2磷酸化
進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有干擾Gas6誘導及PI3K/AKT媒介之TSC2於彼之胺基酸殘基Thr1462磷酸化之潛力。SC2於Thr1462之磷酸化通常與抑制TSC複合物之腫瘤抑制功能有關,及因此導致下游mTOR途徑之活化。簡言之,第1天將5x106 Hs578T乳癌細胞或3x106 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天,以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在第3天時,細胞以10
微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特)、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之800微升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘,於4℃以10,000xg離心10分鐘以去除細胞碎片。測定上清液中之蛋白質濃度,將50微克之全細胞溶解物懸浮及煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中,然後以SDS PAGE展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時,該膜以NET-明膠封閉,並與兔多株抗TSC2一級抗體(細胞傳訊科技,#3612)隔夜培養。隔天以NET-明膠清洗3次後,該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二級抗體(戴爾諾華,#111-036-045)培養1小時,接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示(GE醫療集團)使用化學發光偵測套組,濾膜最後暴露至底片(柯達)。之後,該相同濾膜以抗-磷-TSC2(Thr1462)抗體(細胞傳訊科技,#3617)再次探測。
圖28D顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、
h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能顯著降低Hs578T乳癌細胞(上圖)及NCI-H292肺癌細胞(下圖)中由Gas6誘發之TSC2在Thr1462之磷酸化,如經Gas6刺激之細胞中此胺基酸殘基之磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
實施例18.5:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制配體誘導之mTOR磷酸化
考慮TSC2磷酸化之效應,進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否亦具有干擾Gas6誘導之mTOR活化之潛力。Gas6媒介之mTOR活化係藉由彼之位置Ser2448之磷酸化程度增加反映。為達此目的,第1天將5x106 Hs578T乳癌細胞或3x106 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天,以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在第3天時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特)、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之800微升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,
10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘,於4℃以10,000xg離心10分鐘以去除細胞碎片。測定上清液中之蛋白質濃度,將50微克之全細胞溶解物懸浮及煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中,然後以SDS PAGE展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時,該膜以NET-明膠封閉,並與兔多株抗-磷-mTOR(Ser2448)一級抗體(細胞傳訊科技,#2971)隔夜培養。隔天以NET-明膠清洗3次後,該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二級抗體(戴爾諾華,#111-036-045)培養1小時,接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示(GE醫療集團)使用化學發光偵測套組,濾膜最後暴露至底片(柯達)。之後,該相同濾膜以抗-mTOR激酶抗體(細胞傳訊科技,#2972)再次探測。
圖28E顯示此實驗之代表性結果。該抗Axl抗體之抑制效應在Hs578T乳癌細胞(上圖)中相對微弱。然而,相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6能干擾NCI-H292肺癌細胞中由Gas6誘導之mTOR活化,如經Gas6刺激之細胞中mTOR Ser2448磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示(下圖)。
實施例18.6:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制配體誘導之S6K1磷酸化
最後,進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有干擾Gas6誘導之S6K1活化之潛力。Gas6媒介之S6K1活化係藉由彼之位置Thr421及Ser424之磷酸化程度增加反映。為達此目的,第1天將5x106 Hs578T乳癌細胞或3x106 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天,以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在第3天時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特)、嵌合性抗Axl單株抗體chm11B7及人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之800微升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘,於4℃以10,000xg離心10分鐘以去除細胞碎片。測定上清液中之蛋白質濃度,將50微克之全細胞溶解物懸浮及煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中,然後以SDS PAGE展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時,該膜以NET-明膠封閉,並與兔多株抗-磷-p70 S6激酶1(Thr421/Ser424)一級抗體(細胞傳訊科技,#9204)隔夜培養。隔天以NET-明膠清洗3次後,該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二級抗體(戴爾諾
華,#111-036-045)培養1小時,接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示(GE醫療集團)使用化學發光偵測套組,濾膜最後暴露至底片(柯達)。之後,該相同濾膜以抗-β-肌動蛋白抗體(細胞傳訊科技,#4967)再次探測。
圖28F顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6在Hs578T乳癌細胞中顯示對Gas6誘導之S6K1活化之若干抑制效應,如經Gas6刺激之細胞中S6K1 Thr421/Ser424磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示(上圖)。然而,經嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5或h#11B7-T6前處理之NCI-H292肺癌細胞(下圖)中可觀察到強烈許多之Gas6誘導之S6K1 Thr421/Ser424磷酸化及如此之活化降低。
實施例19:本發明之人化11D5抗Axl抗體於活體外抑制以ELISA測定之配體誘導之Axl磷酸化
除了人化h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5及h#11B7-T6抗Axl單株抗體系列之特徵以外,進行ELISA實驗以探討本發明之人化抗Axl抗體h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5及
h#11D5-T6干擾Gas6誘導之磷酸化及因此活化受體酪胺酸激酶Axl之潛力。簡言之,第1天時,將每孔3x104 Hs578T乳癌細胞接種於平底96孔板之正常生長培養基中。隔天以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。另外,黑色Maxi-Sorp 96孔板(諾科(Nunc))於4℃中以2微克/毫升PBS之小鼠抗-磷-酪胺酸抗體4G10包覆隔夜。在第3天時,移除4G10抗體溶液,Maxi-Sorp孔槽於室溫中以封閉溶液(PBS、0.5% BSA)封閉至少4小時。同時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特(Baxter)公司)、嵌合性抗Axl單株抗體chm11D5及人化抗Axl抗體h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5及h#11D5-T6於37℃預先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。接著輕彈出培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之每孔110微升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘。同時,移除封閉緩衝液,以清洗緩衝液(PBS,0.05% Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次,之後移入每孔100微升之溶解物並於4℃培養隔夜。當孔板於第4天以清洗緩衝液清洗6次後,孔槽與0.125微克/毫升稀釋緩衝液(20mM Tris,50mM NaCl pH7.3,0.05% Tween 20,0.1% BSA)之
生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7於室溫中培養2小時。孔板經清洗緩衝液清洗6次後,在各孔槽中添加經稀釋緩衝液稀釋20000倍之AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白(加美公(Chemicon)#SA110)並於室溫中培養30分鐘。之後,孔槽以清洗緩衝液清洗6次並加入AttoPhos受質溶液(羅氏#11681982)。使用SpectraMax-GeminiEM孔板讀取儀(分子儀器(Molecular Devices)公司),收集各孔於激發波長430奈米及發射波長580奈米之螢光。
圖29顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,該嵌合性抗Axl抗體chm11D5及本發明之人化抗Axl抗體h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5及h#11D5-T6能阻斷或顯著降低Gas6媒介之Axl活化,如經Gas6刺激之細胞中Axl酪胺酸磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
實施例20:本發明之大鼠及嵌合性抗Axl抗體於活體外以類似程度抑制配體誘導之Axl磷酸化
大鼠抗Axl抗體11B7及11D5之嵌合性衍生物係經產製以作為本發明之部分(見上)。為了探討本發明之大鼠抗Axl抗體及該對應之本發明之嵌合性抗Axl抗體是否能以類似程度於活體外抑制Gas6媒介之Axl活化,因此於CaSki子宮頸癌細胞進行ELISA實驗。Gas6媒介之Axl活化因此藉由受體酪胺酸磷酸化增加而偵測。簡言之,第1天時,將每孔3x104細胞接種於平底96孔板之
正常生長培養基中。隔天以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。另外,黑色Maxi-Sorp 96孔板(諾科(Nunc))於4℃中以2微克/毫升PBS之小鼠抗-磷-酪胺酸抗體4G10包覆隔夜。在第3天時,移除4G10抗體溶液,Maxi-Sorp孔槽於室溫中以PBS、0.5% BSA封閉至少4小時。同時,細胞以50奈克/毫升、100奈克/毫升、300奈克/毫升、750奈克/毫升、1微克/毫升及10微克/毫升之大鼠抗Axl抗體11B7或嵌合性抗Axl抗體ch11B7於37℃預先培養1小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理10分鐘或不經處理。接著輕彈出培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘。同時,移除封閉緩衝液,以清洗緩衝液(PBS,0.05% Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次,之後移入溶解物並於4℃培養隔夜。當孔板於第4天以清洗緩衝液清洗6次後,孔槽與0.5微克/毫升PBS之生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7於室溫中培養2小時。孔板經清洗緩衝液清洗6次後,在各孔槽中添加經PBS稀釋4000倍之AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白(加美公(Chemicon)#SA110)並於室溫中培養30分鐘。之後,孔槽以清洗緩衝液清洗6次並加入AttoPhos受質溶液(羅氏#11681982)。使用維克特
(Victor)孔板讀取儀(珀金埃爾默(Perkin Elmer)),收集各孔於激發波長430奈米及發射波長580奈米之螢光。圖31顯示子宮頸癌細胞系CaSki於此實驗之代表性結果。如相對Axl磷酸化之濃度依賴性降低所示,本發明之大鼠抗Axl抗體11B7(A)及嵌合性抗Axl抗體ch11B7(B)能以類似程度阻斷配體誘導之受體酪胺酸激酶Axl之活化。使用相同實驗設計之黑色素瘤細胞系C-8161可觀察到類似效應。
實施例21:大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體基因之產製
a)建構h#11B7-T15L及h#11B7-T18L輕鏈表現載體
與分泌信號融合之各個含有編碼h#11B7-T15L或h#11B7-T18L輕鏈可變區(圖32A)(分別以序列表SEQ ID NO:146或147之胺基酸編號21至129表示)之基因的DNA係經合成(MBL醫學及生物實驗室有限公司之人工基因合成服務)且經限制酶NheI及BsiWI消化。該形成之DNA片段被分開導入預先經限制酶NheI及BsiWI消化之供人化抗體輕鏈表現之通用載體(pEF6KCL)之位點以藉此建構h#11B7-T15L及h#11B7-T18L輕鏈表現載體。該獲得之表現載體被稱為“pEF6KCL/h#11B7-T15L或“pEF6KCL/h#11B7-T18L”,且各表現載體之導入物係分別以序列表SEQ ID NO:144或145之核苷酸序列表示。
b)建構h#11B7-T11H及h#11B7-T12H重鏈表現載體
各個含有編碼h#11B7-T11H或h#11B7-T12H重鏈可變區(圖32B)(分別以序列表SEQ ID NO:150或151之胺基酸編號20至132表示)之基因的DNA係經合成(MBL醫學及生物實驗室有限公司之人工基因合成服務)且經限制酶BlpI消化。該形成之DNA片段被分開導入預先經限制酶BlpI消化之供人化抗體重鏈表現之通用載體(pEF1/FCCU-1)之位點以藉此建構h#11B7-T11H及h#11B7-T12H重鏈表現載體。該獲得之表現載體被稱為“pEF1/FCCU/h#11B7-T11H”或“pEF1/FCCU/h#11B7-T12H”,且各表現載體之導入物係分別以序列表SEQ ID NO:148或149之核苷酸序列表示。
實施例22:製備大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體
a)產製人化抗體
見實施例10之a)。
b)純化人化抗體
利用Protein A親和管柱層析法純化前段a)所獲得之培養上清液。將100毫升之培養上清液置於有蓋之500毫升角瓶中,接著加入1毫升經PBS平衡之MabSelect SuRe(GE醫療集團拜爾賽恩斯(Bio-science)公司)懸
浮液(50%漿狀物)。該混合物於10℃培養箱中以100rpm攪拌隔夜。該FreeStyle 293-F細胞培養上清液/MabSelect SuRe懸浮液被加入空的5毫升Zeba Spin管柱(皮爾斯(PIERCE)公司)。全樹脂被置於管柱中,然後以10毫升之1M NaCl清洗。接著,加入1毫升之1M精胺酸溶液(pH 4.0)以收集含抗體組分。該組分被加入離心過濾裝置(密理博(Millipore)公司Amicon Ultra-4,截留分子量:50K),接著以檸檬酸緩衝液進行溶液置換及濃縮調整至200微升以製備經純化之樣本。
由pEF6KCL/h#11B7-T15L及pEF1/FCCU/h#11B7-T11H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T28”;由pEF6KCL/h#11B7-T18L及pEF1/FCCU/h#11B7-T11H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T29”;由pEF6KCL/h#11B7-T15L及pEF1/FCCU/h#11B7-T12H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T30”;由pEF6KCL/h#11B7-T18L及pEF1/FCCU/h#11B7-T12H之組合所獲得之人化抗體#11B7稱為“h#11B7-T31”。
實施例23:評估大鼠抗人AXL單株抗體#11B7對人AXL-Fc融合蛋白之親和性
該源自大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體h#11B7-T28至h#11B7-T31藉由下列方法評估彼等對人AXL-Fc之親和性。人AXL-Fc(R&D系統製造,#154-AL)係以PBS稀釋成1微克/毫升。接著,將該溶液以100微升/孔之量分注至免疫板(Immuno Plate)(納爾杰諾科國際公司(Nalge Nunc International K.K.)製造,#437111),於4℃留置隔夜以使蛋白質吸附在該板上。隔天,該孔槽以PBS-T溶液(PBS及0.05%(v/v)Tween 20)清洗5次。接著,將經PBS稀釋至5%之含脫脂乳(森永(Morinaga)乳業株式會社製造)溶液以100微升/孔之量分注,留置於室溫中2小時。移除孔槽中之溶液,以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,將經純化之實施例10中製備之大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體T28至T31以含0.5%脫脂乳之PBS溶液分開稀釋成終濃度1微克/毫升至0.00256奈克/毫升(5倍連續稀釋)。接著,該溶液以100微升/孔之量分注,留置於室溫中2
小時。在此程序中,各抗體濃度係如實施例15所述測定。以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,經TBS-T溶液(TBS及0.05%(v/v)Tween 20)稀釋2500倍之鹼性磷酸酶共軛之AffiniPure羊抗人IgG(傑克森(Jackson)免疫研究實驗室製造,#109-055-097)以100微升/孔之量加入,於室溫中留置1小時。移除孔槽中之溶液,以TBS-T溶液清洗孔槽5次。接著,添加100微升/孔之螢光受質溶液(羅氏診斷(Roche Diagnostics K.K.)製造,#11681982001)以進行螢光反應。在人AXL-Fc-吸附板上之螢光強度於添加螢光受質溶液後15分鐘利用SpectraMax M5(製造商分子儀器(Molecular Devices)公司)測量。結果顯示,該大鼠抗人AXL單株抗體之人化抗體h#11B7-T28至h#11B7-T31經證實與人嵌合抗體具有幾乎相同之抗體濃度依賴性人AXL-Fc蛋白質結合活性(圖19及33)。
實施例24:大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體的HPLC測定
源自大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體h#11B7-T28至h#11B7-T31的蛋白質濃度係由下列程序測定。各人化抗體樣本係經注射至大小排除管柱(東曹(Tosoh)SW3000XL),蛋白質濃度由所形成之HPLC(安捷倫(Agilent)1200 SL)尖峰面積及各抗體之吸光係數決定,利用泰加吐珠單抗(tigatuzumab)(IgG1型
人化抗人DR5單株抗體)作為標準物。泰加吐珠單抗抗體標準樣本之濃度係由實施例15所述之直接吸光測定法測定。結果摘列於圖34。
實施例25:使用微差掃描熱卡計(DSC)測量人化抗體之熱穩定性
比較抗體性質之指標的一個實例包括抗體穩定性。抗體穩定性指標之實例包括熱穩定性。
熱變性中點(Tm)低之抗體極可能被變性。該經變性之抗體易於集結,也被認為具有較高之抗原性。相反地,高Tm之抗體較不易變性(展開)或去活化,可被製備成可長時間穩定儲存之溶液調製劑。
微差掃描熱卡計(DSC)是一種可快速、準確地測量Tm之儀器,Tm被當作蛋白質之相對結構穩定性之良好指標。Tm值可利用DSC測量,比較該些測量值以藉此決定其間之熱穩定性差異。
測量h#11B7-T1、h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、h#11B7-T6、h#11B7-T7、h#11B7-T8、h#11B7-T9、h#11B7-T10、h#11B7-T11、h#11B7-T12、h#11B7-T13、h#11B7-T14、h#11B7-T15、h#11B7-T16、h#11B7-T17、h#11B7-T18、h#11B7-T19、h#11B7-T20、h#11B7-T21、h#11B7-T22、h#11B7-T23、h#11B7-T24、h#11B7-T25、h#11B7-T26、h#11B7-T27、h#11B7-T28、h#11B7-T29、h#11B7-T30、h#11B7-T31及嵌合性11B7之
熱穩定性。分別調整該些樣本之濃度至0.5毫克/毫升(CBS溶液),取400微升等分以作為DSC測量之樣本溶液。該DSC測量條件設定如下:初始溫度20℃、終末溫度100℃、溫度上升速率每小時60℃及過濾時間10秒。使用CBS作為參考溶液。由美國麥克卡公司(MicroCal Inc.,US)製造之VP-Capillary DSC平台被用來做為DSC測量儀器。基準校正藉由從樣本溶液獲得之掃描曲線減去基準值(將參考溶液裝填至樣本槽所獲得之掃描曲線)進行。
圖35(1)顯示h#11B7-T1之熱譜圖;圖35(2)顯示h#11B7-T2之熱譜圖;圖35(3)顯示h#11B7-T3之熱譜圖;圖35(4)顯示h#11B7-T4之熱譜圖;圖35(5)顯示h#11B7-T5之熱譜圖;圖35(6)顯示h#11B7-T6之熱譜圖;圖35(7)顯示h#11B7-T7之熱譜圖;圖35(8)顯示h#11B7-T8之熱譜圖;圖35(9)顯示h#11B7-T9之熱譜圖;圖35(10)顯示h#11B7-T10之熱譜圖;圖35(11)顯示h#11B7-T11之熱譜圖;圖35(12)顯示h#11B7-T12之熱譜圖;圖35(13)顯示h#11B7-T13之熱譜圖;圖35(14)顯示h#11B7-T14之熱譜圖;圖35(15)顯示h#11B7-T15之熱譜圖;圖35(16)顯示h#11B7-T16之熱譜圖;圖35(17)顯示h#11B7-T17之熱譜圖;圖35(18)顯示h#11B7-T18之熱譜圖;圖35(19)顯示h#11B7-T19之熱譜圖;圖35(20)顯示h#11B7-T20之熱譜圖;圖35(21)顯示h#11B7-T21之熱
譜圖;圖35(22)顯示h#11B7-T22之熱譜圖;圖35(23)顯示h#11B7-T23之熱譜圖;圖35(24)顯示h#11B7-T24之熱譜圖;圖35(25)顯示h#11B7-T25之熱譜圖;圖35(26)顯示h#11B7-T26之熱譜圖;圖35(27)顯示h#11B7-T27之熱譜圖;圖35(28)顯示h#11B7-T28之熱譜圖;圖35(29)顯示h#11B7-T29之熱譜圖;圖35(30)顯示h#11B7-T30之熱譜圖;圖35(31)顯示h#11B7-T31之熱譜圖;圖35(32)顯示嵌合性h#11B7之熱譜圖。
在本文中,全熱譜圖之峰頂值係定義為Fab區之熱變性中點Tm。測量之結果顯示,h#11B7-T1之Tm為71.6℃;h#11B7-T2之Tm為77.2℃;h#11B7-T3之Tm為73.0℃;h#11B7-T4之Tm為70.2℃;h#11B7-T5之Tm為73.1℃;h#11B7-T6之Tm為79.0℃;h#11B7-T7之Tm為76.5℃;h#11B7-T8之Tm為83.5℃;h#11B7-T9之Tm為82.5℃;h#11B7-T10之Tm為77.4℃;h#11B7-T11之Tm為83.5℃;h#11B7-T12之Tm為76.6℃;h#11B7-T13之Tm為77.6℃;h#11B7-T14之Tm為75.8℃;h#11B7-T15之Tm為83.1℃;h#11B7-T16之Tm為82.2℃;h#11B7-T17之Tm為76.6℃;h#11B7-T18之Tm為83.0℃;h#11B7-T19之Tm為75.9℃;h#11B7-T20之Tm為76.9℃;h#11B7-T21之Tm為76.6℃;h#11B7-T22之Tm為83.6℃;h#11B7-T23之Tm為83.0℃;h#11B7-T24之Tm為77.6℃;h#11B7-T25之Tm為83.9℃;h#11B7-T26之
Tm為76.9℃;h#11B7-T27之Tm為77.9℃;h#11B7-T28之Tm為77.4℃;h#11B7-T29之Tm為77.4℃;h#11B7-T30之Tm為77.8℃;h#11B7-T31之Tm為77.9℃;及嵌合性之Tm為73.1℃。
實施例26:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制以ELISA測定之配體誘導之Axl磷酸化
由生長停止特定基因6(Gas6)編碼之蛋白質代表受體酪胺酸激酶Axl之天然配體。Gas6與Axl結合導致由受體酪胺酸激酶磷酸化程度增加所反映之受體活化。進行ELISA實驗以評估本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6及11B7-T6之衍生物11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25干擾Gas6誘導之磷酸化及因此受體酪胺酸激酶Axl活化之潛力。
簡言之,第1天時,將每孔3x104細胞接種於平底96孔板之正常生長培養基中。隔天以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。另外,黑色Maxi-Sorp 96孔板(諾科(Nunc))於4℃中以2微克/毫升PBS之小鼠抗-磷-酪胺酸抗體4G10包覆隔夜。在第3天時,移除4G10抗體溶液,Maxi-Sorp孔槽於室溫中以封閉緩衝液(PBS、0.5% BSA)封閉至少4小時。同時,細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特(Baxter)公司)及人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25於37℃預
先培養3小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。接著輕彈出培養基,使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑(10mM Na4P2O7,1mM苯甲磺醯氟、1mM原釩酸鹽、1mM NaF及0.5%抑肽酶)之110微升溶解緩衝液(50mM HEPES pH 7.5,150mM NaCl,1mM EDTA,10%甘油及1% Triton X-100)中30分鐘。同時,移除封閉緩衝液,以清洗緩衝液(PBS,0.05% Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次,之後移入每孔100微升之溶解物並於4℃培養隔夜。當孔板於第4天以清洗緩衝液清洗6次後,孔槽與0.125微克/毫升稀釋緩衝液(20mM Tris,50mM NaCl pH7.3,0.05% Tween 20,0.1% BSA)之生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7於室溫中培養2小時。孔板經清洗緩衝液清洗6次後,在各孔槽中添加經稀釋緩衝液稀釋20000倍之AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白(加美公(Chemicon)#SA110)並於室溫中培養30分鐘。之後,孔槽以清洗緩衝液清洗6次並加入AttoPhos受質溶液(羅氏#11681982)。使用SpectraMax-GeminiEM孔板讀取儀(分子儀器(Molecular Devices)公司),收集各孔於激發波長430奈米及發射波長580奈米之螢光。
圖37顯示Hs578T乳癌細胞(上圖)及NCI-H292肺癌細胞(下圖)於此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25在二種
細胞系中顯著降低Gas6媒介之Axl活化,如經Gas6刺激之細胞中Axl酪胺酸磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
實施例27:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制以ELISA測定之配體誘導之Akt磷酸化
另外,進行ELISA實驗以評估本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6及11B7-T6之衍生物11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25是否能阻斷配體Gas6媒介之Akt激酶活化。Gas6媒介之Akt-激酶活化係藉由蛋白質(Ser473)磷酸化增加加以偵測。
簡言之,第1天時,將每孔2x104細胞接種於平底96孔板中。隔天以不含血清之培養基更換正常生長培養基以使細胞接受飢餓處理達36小時。之後,細胞維持不經處理或以10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特(Baxter)公司)及人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25於37℃預先培養1小時,接著於37℃以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統)處理15分鐘或不經處理。輕彈出培養基,細胞於室溫中以4%甲醛於PBS(pH 7.5)中固定30分鐘。移除甲醛溶液,細胞以清洗緩衝液(PBS,0.1% Tween 20)清洗二次。細胞以1% H2O2、0.1% NaN3於清洗緩衝液中淬熄(quenched)並於室溫中培養20分鐘。之後,移除該淬熄溶液,細胞以清洗緩衝液清洗二次,於室溫中以PBS、
0.5% BSA封閉4小時。添加以PBS、0.5% BSA、5mM EDTA稀釋500倍之抗-磷-Akt(Ser473)一級抗體(多株兔抗體;細胞傳訊科技(Cell Signaling Technologies)#9271)於4℃中隔夜培養。第4天時,移除抗體溶液,以清洗緩衝液清洗該板3次。接著在各孔中加入經PBS、0.5% BSA稀釋2500倍之HRP共軛之抗兔二級抗體(戴爾諾華(Dianova)#111-036-045),於室溫中培養1.5小時。該板以清洗緩衝液清洗3次及PBS清洗2次,每次各5分鐘。加入四甲基聯苯胺(TMB,卡柏肯(Calbiochem)),並以620奈米監測。該反應藉由添加100微升之250nM HCl停止,使用Vmax孔板讀取儀(熱實驗室系統(Thermo Lab Systems)公司)於波長450奈米處讀取吸光度,參考波長為620奈米。
圖38顯示Hs578T乳癌細胞(上圖)及NCI-H292肺癌細胞(下圖)於此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對照抗體,本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25在二種細胞系中能阻斷或降低Gas6媒介之Akt激酶活化,如經Gas6刺激之細胞中Akt(Ser473)磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。
實施例28:本發明之人化11B7抗Axl抗體誘導Axl受體內化
Axl已被認定為可影響腫瘤細胞遷移及存活之因子,
該影響透過Axl媒介之信號傳導途徑包括上述之Akt途徑。因此,若可藉由受體內化而自細胞表面/細胞膜有效地清除Axl,細胞傳訊及因此之細胞維持及腫瘤生長及轉移最後可被減少或抑制。
為了探討本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6及11B7-T6之衍生物11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25是否能誘導加速之Axl內吞作用,比較細胞與本發明之人化抗Axl抗體經過2、4、6及20小時之培養後在細胞表面上Axl分子之相對量。
簡言之,第1天時,將2x105細胞接種於6孔板之正常生長培養基中,使其隔夜生長。隔天,移除該培養基,以不含血清之培養基清洗細胞。之後,細胞維持不經處理或與10微克/毫升之Gammagard對照抗體(百特(Baxter)公司)及人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25於4℃添加10mM HEPES之不含血清培養基中培養40分鐘。隨後將細胞轉移至37℃中所示時間,以允許內化發生。之後,以10mM EDTA使細胞脫離,重懸於100微升之清洗緩衝液(PBS,3% FCS)。後續之固定作用係當劇烈搖晃細胞時滴加100微升於PBS中之2%多聚甲醛。於室溫中培養20分鐘後,細胞經過清洗並重懸於100微升之清洗緩衝液中以存放在冰箱中直到收集所有樣本。為了最後染色細胞之Axl表現程度,將樣本轉移至圓底96孔板並於4℃之清洗緩衝液中與3微克/毫升之大鼠抗Axl單株抗體2A1培養
1小時。以清洗緩衝液清洗細胞2次,與經100倍稀釋之驢抗大鼠IgG-PE二級抗體(戴爾諾華(Dianova))於4℃中培養60分鐘,以清洗緩衝液再次清洗細胞2次,以FACS(貝克曼庫爾特(Beckman Coulter)EPICS,EXPO32)進行分析。
圖38之代表性資料顯示,Hs578T乳癌細胞經人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25處理導致Axl受體之內化,然而Gammagard對照抗體不具任何效應。此圖顯示相對Axl表現程度之百分比,其係定義為在個別處理時間時經抗Axl單株抗體處理樣本相較於未經處理樣本之平均螢光強度。
實施例29:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑制球體式細胞性血管新生
Axl係多重血管新生行為之關鍵調節物,包括活體外之內皮細胞遷移、增生及微管形成(Holland et al.,Cancer Res:65,9294-9303,2005)。因此,測試本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6及11B7-T6之衍生物11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25對Gas6誘導之HUVEC球體細胞之血管芽生之抑制效應。該等實驗調整原本發表之程序(Korff and Augustin:J Cell Sci 112:3249-58,1999)。
簡言之,球體細胞係如所述製備(Korff and Augustin:J Cell Biol 143:1341-52,1998),將500個人
臍靜脈內皮細胞(HUVEC)與VEGF-A(25奈克/毫升)懸滴在塑膠培養皿上,留置隔夜以使球體聚集。50個HUVEC球體細胞接著被接種於0.9毫升之膠原蛋白溶液中(2毫克/毫升),並吸取至24孔板之各孔槽以允許聚合作用。經30分鐘後,藉由吸取100微升之10倍濃縮之工作稀釋液至該聚合膠體之上以添加濃度漸減之Gammagard對照抗體(百特(Baxter)公司)或人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25(1x10-6M,3x10-7M,1x10-7M,3x10-8M,1x10-8M,3x10-9M,1x10-10M)與人GAS6(R&D系統)(人GAS6終濃度1微克/毫升)。孔板於37℃培養24小時,並藉由添加4% Roti-Histofix(德國喀斯魯羅斯(Roth)公司)加以固定。HUVEC球體之發芽強度係由影像分析系統定量,該系統利用倒置顯微鏡及數位影像軟體分析3.2(德國明斯特軟影像系統(Soft imaging system)公司)測定每個球體之累積發芽長度。分析10個隨機選擇球體之累積發芽長度的平均值以作為各資料點。
圖39顯示此實驗之代表性結果。
序列說明
[SEQ ID NO:1]用於放大片段A之引子的核苷酸序列,稱為引子EFF1
[SEQ ID NO:2]用於放大片段A之引子的核苷酸序列,稱為引子EFsmaR
[SEQ ID NO:3]片段B之核苷酸序列,其包含分泌信號及人κ鏈之固定區及添加多聚(A)之信號
[SEQ ID NO:4]DNA片段之核苷酸序列,其包含編碼人IgG1之信號序列及固定區的胺基酸序列之核苷酸序列
[SEQ ID NO:5]編碼h#11B7-T1L信號序列(1-60)、可變區(61-387)、固定區(388-702)之胺基酸序列的核苷酸序列
[SEQ ID NO:6]編碼h#11B7-T2L信號序列(1-60)、可變區(61-387)、固定區(388-702)之胺基酸序列的核苷酸序列
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[SEQ ID NO:9]編碼h#11B7-T5L信號序列(1-60)、可變區(61-387)、固定區(388-702)之胺基酸序列的核苷酸序列
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60)、可變區(61-387)、固定區(388-702)之胺基酸序列的核苷酸序列
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序列的核苷酸序列
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[SEQ ID NO:37]編碼h#11B7-T7H信號序列(1-57)、可變區(58-396)、固定區(397-1386)之胺基酸序列的核苷酸序列
[SEQ ID NO:38]編碼h#11B7-T8H信號序列(1-57)、可變區(58-396)、固定區(397-1386)之胺基酸序列的核苷酸序列
[SEQ ID NO:39]編碼h#11B7-T9H信號序列(1-57)、可變區(58-396)、固定區(397-1386)之胺基酸
序列的核苷酸序列
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[SEQ ID NO:44]h#11B7-T5H信號序列(1-19)、可變區(20-132)、固定區(133-462)之胺基酸序列
[SEQ ID NO:45]h#11B7-T6H信號序列(1-19)、可變區(20-132)、固定區(133-462)之胺基酸序列
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列
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[SEQ ID NO:133]前導序列之核苷酸序列
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[SEQ ID NO:138]#11D5嵌合重鏈之胺基酸序列
[SEQ ID NO:139]人Axl(NCBI蛋白質資料庫登錄號P_30530)之胺基酸序列,亦描述於圖30A
[SEQ ID NO:140]大鼠抗人Axl單株抗體11B7輕鏈可變區之胺基酸序列,其亦描述於圖30B且係與#11B7嵌合輕鏈(SEQ ID NO:135)之胺基酸1至108的胺基
酸序列相同
[SEQ ID NO:141]大鼠抗人Axl單株抗體11B7重鏈可變區之胺基酸序列,其亦描述於圖30C且係與#11B7嵌合重鏈(SEQ ID NO:136)之胺基酸1至113的胺基酸序列相同
[SEQ ID NO:142]大鼠抗人Axl單株抗體11D5輕鏈可變區之胺基酸序列,其亦描述於圖30D且係與#11D5嵌合輕鏈(SEQ ID NO:137)之胺基酸1至108的胺基酸序列相同
[SEQ ID NO:143]大鼠抗人Axl單株抗體11D5重鏈可變區之胺基酸序列,其亦描述於圖30E且係與#11D5嵌合重鏈(SEQ ID NO:138)之胺基酸1至113的胺基酸序列相同
[SEQ ID NO:144]編碼h#11B7-T15L信號序列(1-60)、可變區(61-387)、固定區(388-702)之胺基酸序列的核苷酸序列
[SEQ ID NO:145]編碼h#11B7-T18L信號序列(1-60)、可變區(61-387)、固定區(388-702)之胺基酸序列的核苷酸序列
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<223> h#11D5-T10H重鏈可變區(AA)
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<211> 113
<212> PRT
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<220>
<223> h#11D5-T11H重鏈可變區(AA)
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<212> PRT
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<220>
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<223> h#11D5-T13H重鏈可變區(AA)
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<400> 123
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<220>
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<400> 124
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<212> PRT
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<220>
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<400> 125
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<211> 5
<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 11D5輕鏈CDRL4
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<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11D5輕鏈CDRL5
<400> 128
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11D5輕鏈CDRL6
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11D5重鏈CDRH1
<400> 130
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11D5重鏈CDRH2
<400> 131
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11D5重鏈CDRH3
<400> 132
<210> 133
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 前導序列(核苷酸序列)
<400> 133
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 前導序列(胺基酸序列)
<400> 134
<210> 135
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> #11B7嵌合輕鏈
<400> 135
<210> 136
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> #11B7嵌合重鏈
<400> 136
<210> 137
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> #11D5嵌合輕鏈
<400> 137
<210> 138
<211> 443
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> #11D5嵌合重鏈
<400> 138
<210> 139
<211> 887
<212> PRT
<213> 智人
<400> 139
<210> 140
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11B7輕鏈可變區
<400> 140
<210> 141
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11B7重鏈可變區
<400> 141
<210> 142
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11D5輕鏈可變區
<400> 142
<210> 143
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 11D5重鏈可變區
<400> 143
<210> 144
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> h#11B7-T15L輕鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 信號序列
<220>
<221> V_region
<222> (61)..(387)
<220>
<221> C_region
<222> (388)..(702)
<400> 144
<210> 145
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> h#11B7-T18L輕鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(60)
<223> 信號序列
<220>
<221> V_region
<222> (61)..(387)
<220>
<221> C_region
<222> (388)..(702)
<400> 145
<210> 146
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> h#11B7-T15L輕鏈
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<220>
<221> SITE
<222> (21)..(129)
<223> 可變區
<220>
<221> SITE
<222> (130)..(234)
<223> 固定區
<400> 146
<210> 147
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> h#11B7-T18L輕鏈
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<220>
<221> SITE
<222> (21)..(129)
<223> 可變區
<220>
<221> SITE
<222> (130)..(234)
<223> 固定區
<400> 147
<210> 148
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> h#11B7-T11H重鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 信號序列
<220>
<221> V_region
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<220>
<221> C_region
<222> (397)..(1386)
<400> 148
<210> 149
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> h#11B7-T12H重鏈
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 信號序列
<220>
<221> V_region
<222> (58)..(396)
<220>
<221> C_region
<222> (397)..(1386)
<400> 149
<210> 150
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> h#11B7-T11H重鏈
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<220>
<221> SITE
<222> (20)..(132)
<223> 可變區
<220>
<221> SITE
<222> (133)..(462)
<223> 固定區
<400> 150
<210> 151
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> h#11B7-T12H重鏈
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<220>
<221> SITE
<222> (20)..(132)
<223> 可變區
<220>
<221> SITE
<222> (133)..(462)
<223> 固定區
<400> 151
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> 引子Kappa_GSP1
<400> 152
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
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Claims (27)
- 一種單株人化抗體,其與AXL之細胞外結構域結合且至少部分地抑制AXL活性,其包含選自SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:48之重鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性之胺基酸序列,或選自SEQ ID NO:80至SEQ ID NO:82之重鏈胺基酸序列的可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性之胺基酸序列,及/或選自SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:30之輕鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性之胺基酸序列,或選自SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:79之輕鏈胺基酸序列的可變結構域,或與彼等具有至少90%序列一致性之胺基酸序列,或彼等之片段,該片段辨識AXL之細胞外結構域上之相同表位。
- 如申請專利範圍第1項之單株人化抗體,其減少及/或阻斷AXL媒介性信號傳導、AXL磷酸化、細胞增生、血管新生、細胞遷移、腫瘤轉移及/或AXL媒介性抗細胞凋亡作用。
- 如申請專利範圍第2項之單株人化抗體,其減少及/或阻斷配體誘導之AXL下游傳訊分子(諸如ERK1/2、AKT、GSK-3 β、TSC2、mTOR及/或S6K1)之磷酸化。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗體,該抗體係源自嵌合抗AXL抗體11B7(SEQ ID NO:135,136),且該抗體含有於11B7之至少一個可變結構域之架構區中之至少一個突變。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗體,其係選自由h#11B7-T1、h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、h#11B7-T6、h#11B7-T7、h#11B7-T8、h#11B7-T9、h#11B7-T10、h#11B7-T11、h#11B7-T12、h#11B7-T13、h#11B7-T14、h#11B7-T15、h#11B7-T16、h#11B7-T17、h#11B7-T18、h#11B7-T19、h#11B7-T20、h#11B7-T21、h#11B7-T22、h#11B7-T23、h#11B7-T24、h#11B7-T25、h#11B7-T26、h#11B7-T27或h#11B7-T28所組成之人化h#11B7抗體類。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗體,其係與標記基團偶聯。
- 如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗體,其係與效應基團偶聯。
- 一種經分離之核酸分子,其係選自:(a)如選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:31至SEQ ID NO:39中之SEQ ID NO之一者所示之核酸序列,(b)編碼選自SEQ ID NO:18至SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:40至SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:73至SEQ ID NO:82或SEQ ID NO:121至SEQ ID NO:126 之多肽之核酸序列,(c)與(a)至(b)中任一者之序列互補之核酸,或(d)能在嚴謹條件下與(a)、(b)或(c)雜交且編碼多肽之核酸序列,其中包含該多肽之抗體或彼之功能性片段與AXL之細胞外結構域結合。
- 一種載體,其包含如申請專利範圍第8項之核酸分子。
- 如申請專利範圍第9項之載體,其係表現載體且該核酸序列係與控制序列可操作地連接。
- 一種宿主,其包含如申請專利範圍第9或10項之載體。
- 一種製備如申請專利範圍第1至7項中任一項之單株人化抗體之方法,該方法包含自如申請專利範圍第11項之宿主獲得該多肽之步驟。
- 一種醫藥組成物,其包含人化抗AXL抗體,較佳地如申請專利範圍第1至7項中任一項之單株人化抗體,如申請專利範圍第8項之核酸分子,如申請專利範圍第9或10項之載體,如申請專利範圍第11項之宿主,或如申請專利範圍第12項之方法所產製之多肽。
- 如申請專利範圍第13項之醫藥組成物,其包含醫藥上可接受之載劑、稀釋劑及/或佐劑。
- 如申請專利範圍第13項之醫藥組成物,其包含其他活性劑。
- 如申請專利範圍第13至15項中任一項之醫藥組成物,其係用於診斷、預防或治療過度增生性疾病。
- 如申請專利範圍第13至15項中任一項之醫藥組成物,其中該過度增生性疾病係與AXL表現、過度表現及/或活性過高有關。
- 如申請專利範圍第17項之醫藥組成物,其中該過度增生性疾病係選自乳癌、肺癌、其他AXL表現性或過度表現性癌或腫瘤轉移形成。
- 如申請專利範圍第1至7項中任一項之單株人化抗體,其係用於診斷、預防或治療過度增生性疾病。
- 一種如申請專利範圍第1至7項中任一項之單株人化抗體於製備供診斷、預防或治療過度增生性疾病的醫藥組成物之用途。
- 如申請專利範圍第20項之用途,其中該過度增生性疾病係如申請專利範圍第17或18項所定義之過度增生性疾病。
- 一種診斷與AXL表現有關之症狀之活體外方法,該方法包含使樣本與如申請專利範圍第1至7項中任一項之單株人化抗體接觸,及偵測AXL之存在。
- 如申請專利範圍第22項之方法,其中該症狀係如申請專利範圍第17或18項所定義之過度增生性疾病。
- 一種套組,其包含抗AXL抗體,較佳地如申請專利範圍第1至7項中任一項之單株人化抗體,如申請專利範圍第8項之核酸分子,或如申請專利範圍第9或10項 之載體。
- 如申請專利範圍第24項之套組,其另包含其他抗腫瘤劑。
- 一種如申請專利範圍第1至7項中任一項之單株人化抗體於製備供治療藥物抗性癌症的醫藥組成物之用途。
- 一種如申請專利範圍第1至7項中任一項之單株人化抗體於製備與抗腫瘤劑共同投予以治療過度增生性疾病的藥物之用途。
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