CN102421802A - 人源化的axl抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及单克隆人源化抗体，其结合AXL受体酪氨酸激酶的细胞外结构域并且至少部分抑制AXL活性。

Description

人源化的AXL抗体
描述
本发明涉及单克隆人源化抗体，其结合AXL受体酪氨酸激酶的细胞外结构域并且至少部分地抑制AXL活性。
背景
AXL(Ark、UFO、Tyro-7)受体酪氨酸激酶是激酶的Tyro-3家族的成员，该家族其他成员是Mer(Eyk、Nyk、Tyro-12)和Sky(Rse、Tyro-3、Dtk、Etk、Brt、Tif)。其可通过嗜异性配体Gas6(与抗凝血因子蛋白S同源的70-kDa蛋白)的结合来激活。与其他受体酪氨酸激酶相反，AXL酪氨酸磷酸化还可通过嗜同性结合(homophilicbinding)诱导。AXL激活导致通过PI-3-激酶/Akt(Franke等人，Oncogene 22：8983-8998，2003)和其他主要途径如Ras/Erk和β-联蛋白/TCF(Goruppi等人，Mol.Cell Biol.21：902-915，2001)的信号转导。
AXL在许多正常组织包括脑、心脏、骨骼肌、几种其他器官的器官囊和结缔组织中以及在单核细胞但非淋巴细胞中微弱地表达。已在成纤维细胞(Goruppi等人，Mol Cell Biol 17：4442-4453 1997)、内皮细胞(Hasanbasic等人，Am J Physiol Heart Circ Physiol，2004)、血管平滑肌细胞(Melaragno等人，J.Mol.Cell Cardiol.37：881-887，2004)和神经元(Allen等人，Mol.Endocrinol.13：191-2011999)的存活中描述了由AXL诱导的Akt磷酸化。此外，AXL在细胞粘着和趋化性中起着重要作用。AXL的敲除展示削弱的血小板聚集稳定作用和血栓形成(由于减少的血小板整联蛋白IIb3的激活)。
已在不同癌症类型例如乳腺癌(Meric等人，Clin.Cancer Res.8：361-367，2002；Berclaz等人，Ann.Oncol.12：819-824，2001)、结肠癌(Chen等人，Int.J.Cancer 83：579-584，1999；Craven等人，Int.J.Cancer 60：791-797，1995)、前列腺癌(Jacob等人，Cancer Detect.Prev.23：325-332，1999)、肺癌(Wimmel等人，EurJ Cancer 37：2264-2274，2001)、胃癌(Wu等人，Anticancer Res 22：1071-1078，2002)、卵巢癌(Sun等人，Oncology 66：450-457，2004)、子宫内膜癌(Sun等人，Ann.Oncol.14：898-906，2003)、肾癌(Chung等人，DNA Cell Biol.22：533-540，2003)、肝细胞癌(Tsou等人，Genomics 50：331-340，1998)、甲状腺癌(Ito等人，Thyroid 12：971-975，2002；Ito等人，Thyroid 9：563-567，1999)和食管癌(Nemoto等人，1997)中，以及在CML(Janssen等人，A novel putative tyrosinekinase receptor with oncogenic potential.Oncogene，6：2113-2120，1991；Braunger等人，Oncogene 14：2619-2631 1997；O′Bryan等人，Mol Cell Biol 11：5016-5031，1991)、AML(Rochlitz等人，Leukemia 13：1352-1358，1999)、骨肉瘤(Nakano等人，J.Biol.Chem.270：5702-5705，2003)、黑素瘤(van Ginkel等人，Cancer Res64：128-134，2004)中和在头颈鳞状细胞癌(Green等人，Br J Cancer.2006 94：1446-5，2006)中证实了AXL的过表达。
此外，AXL被鉴定为与非侵袭性细胞相比在侵袭性乳腺癌细胞系中上调的转移相关基因。在体外，发现AXL活性是迁移和侵袭所必需的，并且该活性可通过抗体处理来抑制(WO04008147)。类似地，通过AXL的显性负形式(dominant negative version)的表达(Vajkoczy，P.，等人，Proc.Natl.Acad.Science U.S.A.103：5799-5804.2005)或通过AXL的siRNA介导的下调(Holland等人，Cancer Res.65：9294-9303，2005)产生的体内AXL活性的消除在鼠异种移植实验中阻止了皮下和同位(orthotopic)细胞生长。
到目前为止，已描述了结合AXL并且具有生物学活性的抗体。例如，一种已知抗体能够减少AXL介导的细胞侵袭(WO04008147)，而另一种抗体据报导减少AXL/配体相互作用。然而所有已知的抗体都是多克隆抗体或非人源化单克隆抗体。非人源化抗体、多克隆抗体或单克隆抗体被快速地从循环中清除并且通常引发全身性炎症效应，这使得它们不适合于治疗施用。
因此，鉴于AXL的治疗潜能，存在对有效并且特异性地阻止AXL介导的信号转导并且适合于治疗性处理的单克隆人源化AXL抗体、其抗体片段或衍生物的高度需要。
因此，本发明的第一方面涉及结合AXL(特别是人AXL)的细胞外结构域并且至少部分抑制AXL活性的单克隆人源化抗体，包括其片段或衍生物。
优选，本发明的人源化抗体具有至少一个或多个下列特性：减少或阻止AXL介导的信号转导的能力、减少或阻止AXL磷酸化的能力、减少或阻止细胞增殖的能力、减少或阻止血管生成的能力、减少或阻止细胞迁移的能力、减少或阻止肿瘤转移的能力、和减少或阻止AXL介导的抗细胞凋亡(从而增加例如细胞对使用抗肿瘤剂的治疗的敏感性)的能力。
根据本发明的特别优选的实施方案，本文中描述的人源化抗体显示减少和/或阻止配体诱导的AXL下游信号转导分子例如ERK1/2、AKT、GSK-3β、TSC2、mTOR和/或S6K1的磷酸化的能力。
此外，本发明的人源化抗体可展示对AXL，特别地人AXL的高特异性并且不显著识别其他Tyro-3家族成员，例如MER和/或SKY和/或哺乳动物非灵长类AXL，例如鼠AXL。
本文中使用的术语“活性”是指AXL的生物学功能，其影响细胞的表型，特别地但不限于癌症表型，例如细胞凋亡的逃脱、生长信号的自足、细胞增殖、组织侵袭和/或转移、对抗生长信号的不敏感(抗细胞凋亡)和/或持续的血管生成。
术语“AXL介导的信号转导”意指通过AXL与第二信使分子的直接或间接相互作用触发的第二信使途径(例如下游信号转导)的激活。
术语“AXL磷酸化”是指氨基酸残基，优选酪氨酸残基被第二AXL蛋白(转磷酸作用)或被另一种具有蛋白质激酶活性的蛋白质磷酸化。
术语“细胞增殖”是指引起人细胞(特别地但不限于人癌细胞)的增殖的所有牵涉AXL的过程。它们促成或导致细胞DNA的复制、复制的DNA至两个同等大小的染色体组的分离以及整个细胞的物理分裂(称为胞质分裂)，并且受AXL的非催化或催化活性(优选包括AXL磷酸化和/或AXL介导的信号转导)刺激或介导。
术语“血管生成”是指促成从现有血管生长新血管，特别地但不限于新肿瘤供应血管的所有牵涉AXL的过程。这些过程包括多个细胞事件，例如血管内皮细胞的增殖、存活、迁移和出芽(sprouting)、周细胞的吸引和迁移以及用于血管稳定的基底膜形成、血管灌流、或基质或赘生性细胞的血管生成因子的分泌，并且受AXL的非催化或催化活性(优选包括AXL磷酸化和/或AXL介导的信号转导)刺激或介导。
术语“转移”是指支持癌细胞从原发性肿瘤扩散，渗入淋巴管和/或血管，通过血流循环，并且在身体的其他部位的正常组织中的远距离病灶(转移灶)中生长的所有牵涉AXL的过程。特别地，其是指引起转移并且由AXL的非催化或催化活性(优选包括AXL磷酸化和/或AXL介导的信号转导)刺激或介导的肿瘤细胞的细胞事件例如增殖、迁移、锚定不依赖性、细胞凋亡的逃脱或血管生成因子的分泌。
术语“AXL介导的抗细胞凋亡”是指阻止人细胞，优选但不限于人癌细胞程序化细胞死亡(细胞凋亡)的所有牵涉AXL的过程。特别地，其指使人细胞，优选但不限于人癌细胞免受因生长因子的撤离、缺氧、对化疗剂或辐射的暴露或Fas/Apo-1受体介导的信号转导的起始而诱导的细胞凋亡，并且受AXL的非催化或催化活性(优选包括AXL磷酸化和/或AXL介导的信号转导)刺激或介导的过程。
术语“区域”和“结构域”在本发明中是彼此一致的。
称为“11B7”和“11D5”的抗体在本发明中也可分别被称为“#11B7”和“#11D5”。
根据本发明的第二方面，本文中描述的人源化抗体来源于下列之一：嵌合(大鼠/人)抗AXL抗体11B7(其轻链和重链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：135和136显示)、11D5(其轻链和重链的氨基酸序列分别由SEQ ID NO：137和138显示)或10D12或识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的抗体。特别优选的人源化抗体来源于11B7和11D5。优选地，人源化抗体在至少一个可变结构域的构架区中包含至少一个突变。此类突变可通过本领域技术人员已知的任何方法引入，以改变氨基酸序列。优选，突变利用在人构架区中保守的氨基酸替代11B7或11D5的构架区中的氨基酸。用于确定人构架区中的保守或共有氨基酸的方法对于本领域技术人员来说是已知的，例如使用程序例如IgBLAST的同源建模(homology modelling)。
根据另一个优选实施方案，本发明的人源化抗体来源于抗AXL抗体，优选来源于抗AXL抗体11B7或11D5，其中所述抗体(优选11B7或11D5)的至少一个可变结构域的构架区被人或人源化构架区替代。
本发明的抗体对AXL的结合活性可通过本领域技术人员已知的方法来测定。例如，活性可利用Biacore使用表面等离子共振和/或通过ELISA(酶联免疫吸附测定)、EIA(酶免疫测定)、RIA(放射免疫测定)或荧光抗体技术例如FACS来测定。
优选地，当与多克隆或单克隆非人源化抗AXL抗体例如大鼠11B7或11D5相比较时，本发明的人源化抗体具有更低的免疫原性。除了本领域技术人员已知的其他方法以外，减少的免疫原性可通过基于ELISA的HAHA或HAMA测定(IBL-America，Minnesota/LiSrarFish，Italy)来测定。此外，优选地，本发明的抗体不会从血液循环快速清除并且如果给患者施用，不会引发全身性炎症效应。
本发明的抗体可具有至少一个抗原结合部位，例如，1或2个抗原结合部位。此外，抗体优选包含至少一条免疫球蛋白重链和至少一条免疫球蛋白轻链。免疫球蛋白链包含可变结构域和任选地恒定结构域。可变结构域可包含互补决定区(CDR)，例如CDR1、CDR2和/或CDR3区，以及构架区。术语“互补决定区”(CDR)在本领域内已有明确定义(参见，例如，Harlow和Lane，″Antibodies，a Laboratory Manual″，CSH Press，Cold Spring Harbour，1988)，其是指抗体的可变区内主要与抗原接触的氨基酸区段。
根据其他实施方案，本发明的人源化抗体来源于抗AXL抗体11B7，并且可包含选自SEQ ID NO：40至SEQ ID NO：48的重链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，
或选自SEQ ID NO：80至SEQ ID NO：82的重链氨基酸序列的可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，
和/或选自SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：30的轻链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，
或选自SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：79的轻链氨基酸序列的可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，
或其识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的片段。本发明的序列的描述提供于下文的“序列说明”中和序列表中。
根据另一个其他实施方案，本发明的人源化抗体来源于抗AXL抗体11B7，并且可包含选自SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：151的重链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，
和/或选自SEQ ID NO：146和SEQ ID NO：147的轻链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列。
在特别优选的实施方案中，人源化h#11B7抗体选自h#11B7-T1、h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、h#11B7-T6、h#11B7-T7、h#11B7-T8、h#11B7-T9、h#11B7-T10、h#11B7-T11、h#11B7-T12、h#11B7-T13、h#11B7-T14、h#11B7-T15、h#11B7-T16、h#11B7-T17、h#11B7-T18、h#11B7-T19、h#11B7-T20、h#11B7-T21、h#11B7-T22、h#11B7-T23、h#11B7-T24、h#11B7-T25、h#11B7-T26和h#11B7-T27抗体。表1(实施例10)概述了具体人源化重链和轻链氨基酸序列的组合、各自相应的表达载体的组合，其是本发明的上述人源化h#11B7抗体的特征所在。
在另一个特别优选的实施方案中，人源化h#11B7抗体选自h#11B7-T28，h#11B7-T29，h#11B7-T30和h#11B7-T31抗体。表2(实施例22)概述了上述人源化h#11B7抗体特征所在的具体人源化重链和轻链氨基酸序列的组合、各自相应的表达载体的组合。
来源于大鼠抗人Axl单克隆抗体#11B7的人源化抗体不限于上述段落中例举的特定抗体，只要所述人源化抗体保留全部6个CDR和对Axl抗原的结合活性即可。所述人源化抗体分别在其重链中保留CDRH1(SNYWG；SEQ ID NO：124)、CDRH2(YITYSGSTSYNPSLKS；SEQ ID NO：125)和CDRH3(TTFYY；SEQ ID NO：126)和在其轻链中保留CDRL4(RASQDIGNYLR；SEQ ID NO：121)、CDRL5(GATNLAA；SEQ ID NO：122)和CDRL6(LQSKESPWT；SEQ ID NO：123)。
根据其他实施方案，本发明的人源化抗体来源于11D5，并且包含选自SEQ ID NO：67至SEQ ID NO：72的重链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，
或选自SEQ ID NO：114至SEQ ID NO：120的重链氨基酸序列的可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，
和/或选自SEQ ID NO：55至SEQ ID NO：60的轻链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，
或选自SEQ ID NO：83至SEQ ID NO：113的轻链氨基酸序列的可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性并且代表对Axl具有结合活性(所述结合活性等于具有100％的序列同一性的氨基酸序列对Axl的结合活性)的可变区的氨基酸序列，或其识别AXL的细胞外结构域上的相同表位的片段。
在特别优选的实施方案中，人源化h#11D5抗体选自h#11D5-T1、h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5或h#11D5-T6抗体。实施例11、12和14显示上述人源化h#11D5抗体特征所在的具体人源化重链和轻链氨基酸序列的组合、各自相应的表达载体的组合。
本发明的优选实施方案之一是具有相对高的热变性中点(thermaldenaturation midpoint，Tm)的人源化抗体。在本发明中，人源化抗体具有至少70℃的Tm，优选至少75℃的Tm，更优选至少78℃的Tm，更优选至少80℃的Tm，更优选82℃的Tm。或者，在本发明中，人源化抗体具有与其原型(ancenstor)大鼠或嵌合抗体的Tm相等的Tm，但优选具有比其原型大鼠或嵌合抗体的Tm高至少3℃的Tm，更优选高至少6℃的Tm，更优选高至少8℃的Tm，更优选高至少10℃的Tm。这样的优选，更优选，特别优选或更加优选的人源化抗体不易于变性(解折叠)或失活，并且适合于制备成可稳定地长期贮存的溶液制剂。
来源于大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的人源化抗体不限于前述段落中例举的具体抗体，而只要所述人源化抗体保留全部6个CDR和对Axl抗原的结合活性即可。所述人源化抗体分别在其重链中保留CDRH1(SNYWG；SEQ ID NO：130)、CDRH2(HITNSGNTTYNPSLKS；SEQ IDNO：131)和CDRH3(GAFDY；SEQ ID NO：132)以及在其轻链中保留CDRL4(RASQDIGNYLS；SEQ ID NO：127)、CDRL5(GAIKLAV；SEQ ID NO：128)和CDRL6(LQYIQFPLT；SEQ ID NO：129)。
本发明的另一个优选实施方案是(特异性)结合或识别更接近羧基端的IG结构域之一(包含NCBI蛋白质数据库ACCESSION No.P_30530的氨基酸No.129-220的氨基酸残基的结构域：SEQ ID NO：139；图30A)的抗体。这样的优选抗体不限于人源化抗体，并且可以是人抗体或它们之一的功能性片段。更优选地，这样的优选抗体抑制Axl具有的至少一个生物学活性。
本发明的(完整)抗体可以例如通过进行下列步骤来产生：构建重链表达载体和轻链表达载体，其中每一个所述载体具有包含可变区和恒定区的插入物；将所述载体引入宿主细胞；培养所述细胞；从培养上清液(条件化培养基)回收抗体多肽，如实施例9至12中所举例说明的。
如本文中所使用的，两个多肽序列之间的“序列同一性”表示序列之间相同的氨基酸的百分比。用于确定两个给定的多肽序列之间的“序列同一性”的方法对于本领域技术人员来说是已知的。本发明的优选多肽序列具有至少90％，更优选至少95％和更优选至少98％的序列同一性。序列同一性可以例如利用BLAST(Karlin和Altschul(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90，pp5873(1993))开发的算法)或FASTA(Methods in Enzymol.，183，pp63(1990))来测定。称为BLASTN或BLASTX的程序是可获得的(J.Mol.Biol.，215，pp403(1990))。
本发明的抗体可以是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类型，优选IgG或IgM类型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM1和IgM2类型。
优选，可使用本领域技术人员已知的任何适当的方法，通过同源建模设计本发明的抗体。此外，可按照本领域内已知的方法例如嵌合化或CDR移植来产生给定的抗体例如11B7或11D5的人源化形式。用于产生人源化抗体的备选方法在本领域内是熟知的并且描述于例如EP-A1 0 239 400和WO90/07861中。通常，人源化抗体具有一个或多个导入其中的来自非人来源的氨基酸残基。此类非人氨基酸残基通常称为“输入”残基，其通常获自“输入”可变结构域。人源化可以例如按照Winter和同事的方法(Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science，239：1534-1536(1988))，通过用非人来源的CDR或CDR序列置换人抗体的相应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利4,816,567)，其中大体上比完整人可变结构域小的部分被来自非人物种的相应序列置换。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能地一些FR残基被来自非人抗体中类似位点的残基置换的人抗体。
人抗体可来源于人抗体的噬菌体展示文库(Wormstone，I.M.等人，Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7)，p.2301-2308；Carmen，S.等人，Briefings in Functional Genomicsand Proteomics(2002)，1(2)，p.189-203；Siriwardena，D.等人，Opthalmology(2002)109(3)，p.427-431)，其对于本领域技术人员来说是公知的。
例如，可使用噬菌体展示法，其包括：使人抗体的可变区以单链抗体，scFv的形式在噬菌体的表面上表达，然后选择结合抗原的噬菌体(Nature Biotechnology(2005)，23，(9)，p.1105-1116)。
通过分析所选择的噬菌体的基因，可测定编码结合抗原的人抗体的可变区的DNA序列。
在测定scFv的DNA序列后，可通过构建包含所述序列的表达载体并且将所述载体引入适当的宿主细胞(以表达所述抗体)来产生人抗体(WO92001047、WO92020791、WO93006213、WO93011236、WO93019172、WO95001438、WO95015388和Annu.Rev.Immunol(1994)12，p.433-455以及Nature Biotechnology(2005)23(9)，p.1105-1116)。
无论产生其的方法如何，任何人抗体可以是本发明的实施方案，只要所述人抗体具有对人AXL抗原的结合活性和全部下列6个CDR：分别地，其重链中的CDRH1(SNYWG；SEQ ID NO：130)、CDRH2(HITNSGNTTYNPSLKS；SEQ ID NO：131)和CDRH3(GAFDY；SEQ ID NO：132)和其轻链中的CDRL4(RASQDIGNYLS；SEQ ID NO：127)、CDRL5(GAIKLAV；SEQ ID NO：128)和CDRL6(LQYIQFPLT；SEQ ID NO：129)，或者，只要所述人抗体具有对人AXL抗原的结合活性和全部下列6个CDR：分别地，其重链中的CDRH1(SNYWG；SEQ ID NO：124)、CDRH2(YITYSGSTSYNPSLKS；SEQ ID NO：125)和CDRH3(TTFYY；SEQ ID NO：126)和其轻链中的CDRL4(RASQDIGNYLR；SEQ ID NO：121)、CDRL5(GATNLAA；SEQ ID NO：122)和CDRL6(LQSKESPWT；SEQ ID NO：123)。
对于治疗目的，可用治疗效应物基团例如放射性基团或细胞毒性基团(cytotoxic group)缀合抗体。
对于诊断目的，可标记抗体。合适的标记包括放射性标记、荧光标记或酶标记。
如上所论述的，除了完整抗体外，本发明的抗体还可以以多种形式存在，包括例如Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2、双抗体(diabody)、minibody、包含多于1个抗体的片段的二价或多价抗体，以及以单链(scFV)形式存在；参见例如W08809344。
本发明的抗体可以是特异于多于一个抗原或表位的双特异性抗体或多特异性抗体。
scFv可通过下列来获得：通过多肽接头将免疫球蛋白重链的可变区与免疫球蛋白轻链的可变区融合(Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies，113，由Rosenburg和Moore编著，SpringerVerlag，New York，p.269-315(1994)和Nature Biotechnology(2005)，23，p.1126-1136)。BiscFv可通过使用多肽接头融合2个不同的scFV来获得。
用于产生scFv的方法对于本领域技术人员来说是公知的(US4,946,778，US5,260,203，US5,091,513，US5,455,030等)。优选地，两个可变区之间的接头不产生缀合物(Huston，J.S.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85，p.5879-5883)。scFV免疫球蛋白重链可变区和scFV免疫球蛋白轻链可变区可来源于相同抗体或两种抗体(其中的一种与另一种不同)。多肽接头可以是由例如12至19个氨基酸残基组成的单链肽。
编码scFV的DNA可通过PCR产生，其包括：使用编码免疫球蛋白重链可变区或轻链可变区的全长或部分的DNA和相应于两个末端的各末端的两个寡核苷酸分别作为模板和一对引物来扩增DNA片段，随后使用经设计的一对引物来进行扩增，以便将重链可变区和轻链可变区分别连接至多肽接头的一个末端和另一个末端。
抗体的功能性片段(包括scFv)可通过下列来产生：将编码所述scFv的DNA引入宿主细胞并且培养所述细胞，如本说明书的其他地方中所描述的。
本发明的实施方案之一是，对抗原具有比单体抗体更高的结合亲和力的多聚体抗体。所述多聚体抗体的单位可以是相同的或彼此不同的(此时一个单位结合抗原的一个表位并且另一个单位结合相同抗原的不同表位)。IgG CH3结构域与2个结合链霉抗生物素蛋白的scFv的结合以及螺旋-转角-螺旋基序列的引入可用于产生多聚体抗体。
需要时，可在重链和/或轻链的可变结构域中突变本发明的抗体以改变抗体的结合性质。例如，可在一个或多个CDR区中产生突变以增加或减少抗体对于AXL的Kd或改变抗体的结合特异性。定点诱变技术在本领域内是熟知的。参见，例如，Sambrook等人和Ausubel等人，同上。此外，可在AXL抗体的可变区中对已知发生改变(与种系相比)的氨基酸残基进行突变。
在另一个方面，除了关于人源化的突变外，还可将其他突变导入一个或多个构架区。可在构架区或恒定结构域中产生突变以增加AXL抗体的半衰期。参见，例如，WO0009560。还可在构架区或恒定结构域中进行突变以改变抗体的免疫原性，以提供用于与另一个分子共价或非共价结合的位点，或以改变性质如补体结合(complementfixation)。可在单个突变抗体的每一个构架区、恒定结构域和可变区中产生突变。备选地，可以只在单个突变抗体的构架区、可变区或恒定结构域中的一个区域中产生突变。
本发明的实施方案之一是包含多于一种本发明的抗体的多克隆抗体。
本发明的实施方案之一是本发明的抗体或其功能性片段的化学修饰。分子例如聚合物(聚乙二醇等)可用于产生修饰的抗体或修饰的功能性片段。
在另外的方面，根据本发明的人源化抗体可具有拥有效应子功能的恒定结构域，由此在细胞表面上结合抗体、其抗体片段或衍生物的表达AXL的细胞可被免疫系统功能攻击。例如，抗体可能能够结合补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)。此外，抗体可能能够结合效应子细胞例如单核细胞和天然杀伤(NK)细胞上的Fc受体，并参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
在另一个方面，本文中描述的抗体可用于治疗性治疗，优选用于治疗过度增殖性疾病，心血管疾病，特别地动脉粥样硬化和血栓形成，糖尿病相关疾病，特别地肾小球肥大或糖尿病性肾病，和特别地与AXL表达、过表达或过度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症。过度增殖性疾病优选选自与AXL表达、过表达或过度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症，例如癌症，例如乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、滤泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮肤癌/黑色素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管(Barrett′s esophagus)和食管癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌和头颈癌，或增生性和赘生性疾病或其他表达或过表达AXL的过度增殖性疾病。
可通过体外、体内或离体实验来证明、显示或表明本发明的抗体用于治疗任何Axl相关疾病例如过度增殖性疾病的适用性，所述实验包括基于下列的实验：配体诱导的Axl的自磷酸化、对Axl介导的下游信号转导例如配体诱导的Akt和p42/44MAP-激酶磷酸化的影响、癌细胞迁移或增殖、配体诱导的表达Axl的细胞的迁移或增殖、组织或细胞的血管生成，和移植至非人动物例如异种移植小鼠的人癌症或癌细胞的生长或转移，以及任何其他临床前/非临床实验和临床试验。
在另一个方面，本发明的抗体可用于与抗肿瘤剂共施用，以治疗上述病症之一。
如本文中使用的，共施用包括将本发明的抗体与抗肿瘤剂，优选诱导细胞凋亡的抗肿瘤剂一起施用。术语共施用还包括以单一组合物的形式或以两个或更多个不同组合物的形式施用本发明的抗体和抗肿瘤剂，优选诱导细胞凋亡的抗肿瘤剂。共施用包括同时(即，在相同的时间)或相继(即，以一定的间隔)施用本发明的抗体与抗肿瘤剂，优选诱导细胞凋亡的抗肿瘤剂。
本发明还涉及编码本发明的抗体、抗体片段或其衍生物的核酸分子。编码上述抗体、抗体片段或其衍生物的本发明的核酸分子可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或重组产生的嵌合核酸分子(其单独地或组合地包含任何此类核酸分子)。核酸分子还可以是相应于完整基因或其大部分或相应于其片段和衍生物的基因组DNA。核苷酸序列可以相应于天然发生的核苷酸序列或可包含单个或多个核苷酸置换、缺失或添加。在本发明的特别优选的实施方案中，核酸分子是cDNA分子。
根据其他方面，本发明涉及分离的核酸分子，其选自：
(a)编码本发明的多克隆抗体、抗体片段或其衍生物的核酸序列，
(b)如选自SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：31至SEQID NO：39、SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：60至SEQ IDNO：66的SEQ ID NO之一所示的核酸序列，
(c)编码选自SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40至SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：55至SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：67至SEQID NO：72、SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121至132的多肽的核酸序列，
(d)与(a)至(c)中的任何序列互补的核酸，或
(e)在严格条件下能够与(a)、(b)、(c)或(d)杂交并且编码多肽的核酸序列，其中包含所述多肽的抗体或其功能性片段结合AXL的细胞外结构域，
(f)如选自SEQ ID NO：144和SEQ ID 145以及SEQ ID NO：148和SEQ ID NO：149的SEQ ID NO之一所示的核酸序列，
(g)编码选自SEQ ID NO：146和SEQ ID NO：147以及SEQ ID NO：150和SEQ ID NO：151的多肽的核酸序列，
(h)与(f)或(g)中的任何序列互补的核酸，或
(i)能够在严格条件下与(f)，(g)或(h)杂交并且编码多肽的核酸序列，其中包含所述多肽的抗体或其功能性片段结合AXL的细胞外结构域。
术语“在严格条件下杂交”意指两个核酸片段在例如Sambrook等人，″Expression of cloned genes in E.coli″in MolecularCloning：A laboratory manual(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York，USA中描述的标准杂交条件下彼此杂交。此类条件例如在大约45℃下于6.0xSSC中杂交，然后在50℃下使用2.0xSSC，优选在65℃下使用2.0xSSC，或在50℃下使用0.2xSSC，优选在65℃下使用0.2xSSC进行清洗步骤。
本发明还涉及包含本发明的核酸分子的载体。所述载体可以是例如，噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是有复制能力或复制缺陷型载体。在后一种情况下，病毒繁殖通常只在互补宿主细胞(complementing host cell)中发生。
可将本发明的核酸分子与包含选择标记的载体连接以在宿主中进行扩增。通常，以沉淀例如磷酸钙沉淀或氯化铷沉淀的形式，或以与带电荷的脂质的复合物的形式或以碳基簇(carbon-based cluster)例如富勒烯(fulleren)的形式导入质粒载体。如果载体是病毒，那么其在应用于宿主细胞之前可使用合适的包装细胞系进行体外包装。
优选，本发明的载体是其中核酸分子有效地连接至一个或多个控制序列(从而允许在原核和/或真核宿主细胞中转录和任选地表达)的表达载体。所述核酸分子的表达包括核酸分子的转录(优选至可翻译的mRNA)。确保在真核细胞，优选哺乳动物细胞中表达的调控元件对于本领域技术人员来说是熟知的。它们通常包括确保转录的起始的调控序列和任选地确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。另外的调控元件可包括转录和翻译增强子。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括大肠杆菌(E.coli)中的lac、trp或tac启动子，允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOXI或GAL1启动子或哺乳动物和其他动物细胞中的CMV启动子、SV40启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、CMV增强子、SV40增强子或珠蛋白内含子。除了负责转录起始的元件以外，此类调控元件还可包括多核苷酸下游的转录终止信号例如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。在本说明书中，合适的表达载体在本领域内是已知的，例如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)或pSPORTI(GIBCO BRL)。优选，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向性载体。源自病毒例如逆转录病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送入靶向的细胞群体。本领域技术人员熟知的方法可用于构建重组病毒载体；参见，例如，Sambrook，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001，第3版)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1994)中描述的技术。备选地，可将本发明的核酸分子重构入脂质体以递送至靶细胞。
本发明还涉及包含本发明的载体的宿主。所述宿主可以是原核或真核细胞或非人转基因动物。可将存在于宿主中的本发明的多核苷酸或载体整合入宿主的基因组或其可以保持在染色体外。在该方面，还应理解，本发明的核酸分子可用于“基因打靶”和/或“基因替代”，以恢复突变基因或通过同源重组产生突变基因；参见例如Mouellic，Proc.Nat！.Acad.Sci.USA，87(1990)，4712-4716；Joyner，GeneTargeting，A Practical Approach，Oxford University Press。
宿主可以是任何原核或真核细胞，例如细菌细胞、昆虫细胞、真菌细胞、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或优选，人细胞。优选的真菌细胞是例如酵母菌属(Saccharomyces)的真菌细胞，特别地酿酒酵母(S.cerevisiae)的真菌细胞。术语“原核的”意欲包括可用多核苷酸转化或转染以表达本发明的变异多肽的所有细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。可使用本领域技术人员公知的任何技术将编码本发明的变异多肽的突变体形式的多核苷酸用于转化或转染宿主。用于制备融合的，有效连接的基因和在细菌或动物细胞中表达它们的方法在本领域内是熟知的(Sambrook，Molecular Cloning ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(2001，第3版)。本文中描述的基因构建体和方法可用于在例如原核宿主中表达本发明的变异抗体、其抗体片段或衍生物。通常，结合宿主，使用包含促进插入的核酸分子的有效转录的启动子序列的表达载体。表达载体通常包含复制起点、启动子和终止子以及能够提供转化的细胞的表型选择的特定基因。可按照本领域内已知的技术在发酵罐中生长和培养转化的原核宿主以获得最佳的细胞生长。然后可从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分分离本发明的抗体、抗体片段或其衍生物。可通过任何常规方法例如制备型色谱分离和免疫分离(例如包括单克隆或多克隆抗体的使用的那些)来分离和纯化微生物或其他生物表达的本发明的抗体、抗体片段或其衍生物。
在本发明的优选实施方案中，宿主是细菌、真菌、植物、两栖动物或动物细胞。优选的动物细胞包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(CHO细胞，ATCC CCL-61)或其二氢叶酸还原酶缺陷株系(Urlaub，G.和Chasin，L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77，p.4126-4220)、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)(Gluzman，Y.Cell(1981)23，p.175-182和ATCC CRL-1650)、来源于小鼠成纤维细胞(ATCCNo.CRL-1658)的NIH3T3细胞或3T3细胞、NSO细胞和许多其他细胞系包括人细胞，例如Per.C6。在另一个优选实施方案中，所述动物细胞是昆虫细胞。优选的昆虫细胞包括但不限于SF9细胞系细胞。
在本发明的更优选实施方案中，所述宿主是人细胞或人细胞系。所述人细胞包括但不限于人胚肾细胞(HEK293、293T、293freestyle)。此外，所述人细胞系包括但不限于HeLa细胞、人肝细胞癌细胞(例如，Hep G2)、A549细胞。
本发明还提供了转基因非人动物，其包含一个或多个可用于产生本发明的抗体的本发明的核酸分子。可在山羊、牛、马、猪、大鼠、小鼠、兔子、仓鼠或其他哺乳动物的组织或体液例如奶、血液或尿中产生和回收抗体。参见，例如，美国专利5,827,690；5,756,687；5,750,172；和5,741,957。如上所述，可通过用AXL或其部分进行免疫来产生包含人免疫球蛋白基因座的非人转基因动物。
本发明还涉及用于制备抗体的方法，其包括在允许所述抗体合成的条件下培养本发明的宿主和从所述培养物回收所述抗体。
可按照本领域内已知的技术在发酵罐中生长和培养转化的宿主以获得最佳细胞生长。在表达后，可按照本领域内的标准方法包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等纯化本发明的完整抗体、它们的二聚体、单独的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式；参见，Scopes，″Protein Purification″，Springer-Verlag，N.Y.(1982)。然后可从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分分离本发明的抗体或其相应的免疫球蛋白链。可以通过任何常规方法例如制备型色谱分离和免疫分离(例如包括抗例如本发明的抗体的恒定区的单克隆或多克隆抗体的使用的那些)分离和纯化例如微生物表达的本发明的抗体或免疫球蛋白链。
对于本领域技术人员来说很显然的是，还可将本发明的抗体偶联至其他部分以进行例如药物靶向和成像应用。可在抗体或抗原表达后通过化学方法进行至附着位点的偶联，或在DNA水平上将偶联产物工程改造至本发明的抗体或抗原中。然后在合适的宿主系统中表达DNA，以及，需要时收集和使表达的蛋白质复性。
在本发明的优选实施方案中，将抗体偶联至效应物例如放射性同位素或毒性化疗剂。优选，此类抗体缀合物用于靶向表达AXL的细胞，例如癌细胞，以消除其。本发明的抗体/抗体片段与放射性同位素的连接例如为肿瘤的治疗提供了有利方面。与化学疗法和其他形式的癌症疗法不同，放射免疫疗法或放射性同位素-抗体组合的施用直接靶向癌细胞而对周围的正常、健康组织的损害最小。优选的放射性同位素包括例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
此外，当用毒性化疗药物例如格尔德霉素(Mandler等人，J.Natl.Cancer Inst.，92(19)，1549-51(2000))和美登素例如美坦生类(maytansinoid)药物，DM1(Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：8618-8623(1996)和auristatin-E或monomethylauristatin-E(Doronina等人，Nat.Biotechnol.21：778-784(2003)或卡奇霉素(calicheamicit))缀合时，本发明的抗体可用于治疗癌症；将在酸性或还原条件下或当暴露于特定的蛋白酶时释放药物的不同连接体用于该技术。可如本领域中所述缀合本发明的抗体。
本发明的实施方案之一是本发明的抗体或其功能性片段的化学修饰。分子例如聚合物(聚乙二醇等)可用于产生修饰的抗体或修饰的功能性片段。
本发明还涉及包含本发明的抗体、核酸分子、载体、宿主或通过本发明的方法获得的抗体的药物组合物。
术语“组合物”，如本文中所使用的，包含至少一种本发明的化合物。优选，这样的组合物是药物组合物或诊断组合物。
优选，所述药物组合物包含可药用载体和/或稀释剂。本文中公开的药物组合物可部分地用于治疗与AXL表达、过表达或过度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症，例如过度增殖性疾病、心血管疾病，特别地动脉粥样硬化和血栓形成、糖尿病相关疾病，特别地肾小球肥大或糖尿病性肾病。所述病症包括但不限于癌症例如乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、滤泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮肤癌/黑色素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌和头颈癌、或其他增生性疾病或赘生性疾病或其他AXL表达或过表达的疾病。
术语“过度活跃”在本文中是指可由负调控的缺乏和/或功能障碍引起的不受控制的AXL信号转导。例如，负调控包括蛋白质的去磷酸化、降解和/或内吞作用。此外，不受控制的AXL信号转导可以是遗传改变(体细胞或种系)的结果，所述遗传改变导致AXL氨基酸序列的变化。
合适的药物载体、赋形剂和/或稀释剂的实例在本领域内是熟知的，包括磷酸缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的湿润剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可通过熟知的常规方法来配制。可以以合适的剂量给受试者施用此类药物组合物。可通过不同的方法，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部、皮内、鼻内或支气管内施用进行合适的组合物的施用。还可将本发明的组合物直接施用至靶部位，例如通过基因枪(biollistic)递送至外部或内部靶部位如脑。给药方案将由主治医生和临床因素决定。如在医疗领域内是熟知的，用于任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的尺寸大小、身体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、总体健康状况和其他同时施用的药物。蛋白质性质的药物活性物质可以以1μg至100mg/kg体重/剂的量存在；然而，预期使用低于或高于该示例性范围的剂量，特别地在考虑到上述因素的情况下。如果方案是连续输注，其还应当在1pg至100mg/千克体重/分钟的范围内。
可通过定期评估来监控进展。可局部或全身性施用本发明的组合物。用于胃肠外施用的制剂包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油例如橄榄油和可注射有机酯例如油酸乙酯。水性载体包括水、醇/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer′s dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏或不挥发油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏葡萄糖的那些)等。还可存在防腐剂和其他添加剂例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，取决于药物组合物的期望的用途，本发明的药物组合物还可包含另外的试剂。
特别优选，药物组合物包含至少一种另外的活性剂，例如另外的抗肿瘤剂、小分子抑制剂、抗肿瘤试剂或化疗剂或此类试剂的组合。
本发明还涉及包含与至少一种另外的抗肿瘤剂组合的本发明的人源化抗AXL抗体的药物组合物。所述组合在例如抑制异常细胞生长中是有效的。
许多抗肿瘤剂目前在本领域内是已知的。一般地，该术语包括能够预防、减轻和/或治疗过度增殖性病症的所有试剂。在一个实施方案中，抗肿瘤剂选自治疗性蛋白，包括但不限于抗体或免疫调节蛋白。在另一个实施方案中，抗肿瘤剂选自小分子抑制剂或化疗剂，包括有丝分裂抑制剂、激酶抑制剂、烷基化试剂、抗代谢药、嵌入抗生素(intercalating antibiotics)、生长因子抑制剂、细胞周期抑制剂、酶、拓扑异构酶抑制剂、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、抗存活剂(anti-survival agent)、生物学应答调节剂、抗激素例如抗雄激素和抗血管生成剂。
可与本文中提供的抗体组合使用的抗肿瘤剂的特定实例包括例如吉非替尼、拉帕替尼、舒尼替尼、培美曲塞、贝伐珠单抗、西妥昔单抗、伊马替尼、曲妥珠单抗、阿仑珠单抗、利妥昔单抗、厄洛替尼、硼替佐米等。用于本文中描述的和要求保护的组合物的其他特定抗肿瘤剂包括例如化疗剂例如卡培他滨、柔红霉素、道诺霉素、放线菌素D、多柔比星、表柔比星、伊达比星、依索比星、博来霉素、马磷酰胺、异环磷酰胺、阿糖胞苷、双氯乙基亚硝脲、白消安、丝裂霉素C、放线菌素D、普卡霉素、泼尼松、羟孕酮、睾酮、他莫昔芬、达卡巴嗪、丙卡巴肼、六甲蜜胺、五甲蜜胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基环己基亚硝基脲、氮芥、美法仑、环磷酰胺、6-巯嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(CA)、5-氮杂胞苷、羟基脲、脱氧助间型霉素、4-羟基过氧环磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脱氧尿苷(5-FUdR)、甲氨喋呤(MTX)、秋水仙碱、泰素(taxol)、长春新碱、长春碱、依托泊苷、三甲曲沙、替尼泊苷、顺铂和己烯雌酚(DES)。通常参见，The MerckManual of Diagnosis and Therapy，第15版1987，pp.1206-1228，Berkow等人，eds.，Rahway，N.J。特别优选的是诱导细胞凋亡的此类抗肿瘤剂。
本发明还涉及包含多于一种本发明的抗体的多克隆抗体。
当与所述AXL抗体一起使用时，此类抗肿瘤剂可单独地(例如，5-FU和抗体)、相继地(例如，5-FU和抗体进行一段时间，然后施用MTX和抗体)或与一种或多种其他此类抗肿瘤剂组合(例如，5-FU、MTX和抗体，或5-FU、放射疗法和抗体)使用。
术语“抗肿瘤剂”还可包括治疗方法，例如辐射或放射疗法。
本发明的药物组合物优选用于人医疗，但也可用于兽医目的。
此外，本发明涉及本发明的抗体、本发明的核酸分子、载体、宿主或通过本发明的方法获得的抗体用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于诊断、预防或治疗过度增殖性疾病、心血管疾病，特别地动脉粥样硬化和血栓形成、糖尿病相关疾病，特别地肾小球肥大或糖尿病性肾病，和特别地与AXL表达、过表达或过度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症。
上述过度增殖性疾病包括任何瘤形成，即任何异常和/或不受控制的新的组织生长。术语“不受控制的新的组织生长”，如本文中所使用的，可依赖于生长调控的功能障碍和/或丧失。过度增殖性疾病包括肿瘤疾病和/或癌症，例如转移或侵袭性癌症。
在本发明的用途的优选实施方案中，所述过度增殖性疾病特别地是乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、滤泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮肤癌/黑色素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌和头颈癌、或增生性或赘生性疾病或其他表达或过表达AXL的过度增殖性疾病。
在另一个实施方案中，本发明涉及本发明的人源化抗AXL抗体用于制备药物的用途，所述药物用于与抗肿瘤剂共施用，以治疗上述病症之一。
根据另外的优选实施方案，本发明涉及本发明的人源化抗AXL抗体用于制造治疗抗药性癌症的药物组合物的用途。
本发明还涉及包含本发明的抗体、本发明的核酸分子、载体、宿主或通过本发明的方法获得的抗体和任选地可药用的载体的诊断组合物。
本发明的诊断组合物可用于检测不同细胞、组织或其他合适的样品中哺乳动物AXL的不期望的表达、过表达或过度活跃，包括将样品与本发明的抗体接触，和检测AXL在样品中的存在。因此，本发明的诊断组合物可用于评估过度增殖性疾病的起始或疾病状态。
此外，可用本发明的抗体靶向恶性细胞例如表达AXL的癌细胞。因此已结合本发明的抗体的细胞可能受到免疫系统功能例如补体系统或受到细胞介导的细胞毒性的攻击，从而减少癌细胞的数目或根除癌细胞。这些考虑同样地用于治疗转移和复发性肿瘤。
在本发明的另一个方面，将本发明的抗体偶联至标记基团。此类抗体特别适合于诊断应用。如上文所指出的，术语“标记基团”是指可检测的标志物，例如放射性标记的氨基酸或可通过标记的抗生物素蛋白检测的生物素基部分。用于标记多肽或糖蛋白例如抗体的各种方法在本领域内是已知的并且可用于进行本发明。合适的标记基团的实例包括但不限于下列：放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如FITC、罗丹明、镧系元素(lanthanide)、磷光体(phosphor))、酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基团或预先确定的被第二报告分子识别的多肽表位(例如亮氨酸拉链对序列、二抗的结合部位、金属结合结构域、表位标签)。
在某些方面，可能期望通过不同长度的间隔臂连接标记基团以减少潜在的位阻。
在另一个实施方案中，本发明涉及评估表达AXL的细胞的存在的方法，包括将本发明的抗体与怀疑在它们/它的表面具有AXL的细胞或组织接触。用于检测样品中的AXL表达的合适方法可以是酶联免疫吸附测定(ELISA)或免疫组织化学(IHC)。
可在微量滴定板版式中进行ELISA测定，其中例如微量滴定板的孔吸附有AXL抗体。漂洗板，并且用封闭剂例如乳蛋白或白蛋白进行处理以阻止分析物的非特异性吸附。然后用测试样品处理孔。在漂洗掉测试样品或标准后，用标记的第二AXL抗体(例如通过生物素缀合)处理孔。在清洗掉过量第二抗体后，用例如抗生物素蛋白缀合的辣根过氧化物酶(HRP)和合适的生色底物检测标记。通过与由标准样品产生的标准曲线比较来测定测试样品中AXL抗原的浓度。
关于IHC，可使用石蜡包埋的组织，其中例如将组织首先在二甲苯中脱蜡，然后例如用乙醇脱水，和在蒸馏水中漂洗。可通过表位暴露(epitope unmasking)、酶促降解或皂苷来暴露被甲醛固定和石蜡包埋掩蔽的抗原表位。关于表位暴露，可在蒸气发生器、水浴或微波炉中于表位修复液(epitope retrieval solution)例如2N HCl溶液(pH1.0)中加热石蜡切片，进行20至40分钟。在酶促降解的情况下，可将组织切片在不同的酶溶液例如蛋白酶K、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、胃蛋白酶等中于37℃下温育10至30分钟。在漂洗掉表位修复液或过量的酶后，用封闭缓冲液处理组织切片以防止非特异性相互作用。以合适的浓度加入第一AXL抗体。漂洗掉过量的一抗，将切片在室温下于过氧化物酶封闭液中温育10分钟。在进行另一个清洗步骤后，将组织切片与第二标记抗体(例如用可用作酶的锚的基团标记)一起温育。因此，实例是被偶联至辣根过氧化物酶的链霉抗生物素蛋白识别的生物素标记的二抗。通过与合适的生色底物一起温育进行抗体/酶复合物的检测。
在另外的实施方案中，本发明涉及阻止AXL功能的方法，其包括将本发明的抗体与怀疑在它们/其表面上具有AXL的细胞或组织在其中抗体能够阻止AXL功能的条件下接触。接触可以是体外或体内的。
本发明还涉及治疗过度增殖性疾病、心血管疾病，特别地动脉粥样硬化和血栓形成、糖尿病相关疾病，特别地肾小球肥大或糖尿病性肾病的方法，其包括给有此需要的患者施用合适剂量的本发明的抗体或抗体片段或其衍生物。过度增殖性疾病优选选自与AXL表达、过表达或过度活跃相关、与其相伴或由其引起的病症，例如癌症，例如乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌、滤泡性淋巴瘤、髓性白血病、皮肤癌/黑色素瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、巴雷特食管和食管癌、胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌、甲状腺癌和头颈癌或增生性疾病或赘生性疾病或其他表达或过表达AXL的过度增殖性疾病。
根据本发明的另一个优选实施方案，待治疗的癌症是抗药性癌症，优选选自上述癌症。
本发明还涉及治疗疾病的方法，其中给哺乳动物施用本发明的抗体并且其中所述疾病与AXL的异常水平的表达或活性直接或间接相关。
最后，本发明涉及包括抗AXL抗体，优选本发明的抗体、抗体片段或其衍生物、编码所述组分的核酸分子和/或本发明的载体的试剂盒。
涉及本文中公开的化合物的所有实施方案可用作单个化合物或组合地用于药物的制备。
附图概述
图1：本图描述了命名为h#11B7-T1L至h#11B7-T7L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图2：本图描述了命名为h#11B7-T8L至h#11B7-T14L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图3：本图描述了命名为h#11B7-T15L至h#11B7-T20L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图4：本图描述了命名为h#11B7-T1H至h#11B7-T6H的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的重链的人源化可变区的氨基酸序列。
图5：本图描述了命名为h#11B7-T7H至h#11B7-T12H的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的重链的人源化可变区的氨基酸序列。
图6：本图描述了命名为h#11D5-T1L至h#11D5-T7L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图7：本图描述了命名为h#11D5-T8L至h#11D5-T14L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图8：本图描述了命名为h#11D5-T15L至h#11D5-T21L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图9：本图描述了命名为h#11D5-T22L至h#11D5-T28L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图10：本图描述了命名为h#11D5-T29L至h#11D5-T35L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图11：本图描述了命名为h#11D5-T36L和h#11D5-T37L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图12：本图描述了命名为h#11D5-T1H至h#11D5-T7H的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的重链的人源化可变区的氨基酸序列。
图13：本图描述了命名为h#11D5-T8H至h#11D5-T13H的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的重链的人源化可变区的氨基酸序列。
图14：本图描述了引物EFF1和EfsmR、包含分泌信号以及人κ链的恒定区和poly(A)额外信号的片段B、编码包含人IgG1信号和恒定结构域的多肽的DNA片段以及前导序列的核苷酸序列，以及大鼠抗人AXL单克隆抗体11B7和11D5的CDR、嵌合#11B7抗体重链和轻链(IgG1/κ)、嵌合#11D5抗体重链和轻链(IgG1/κ)以及前导序列的氨基酸序列。
图15.A.RatI-模拟和RatI-AXL cl.2成纤维细胞中细胞表面AXL的流式细胞术分析。收集通过分别用pLXSN和pLXSN-hAXL亲嗜性病毒(ecotrophic virus)感染RatI成纤维细胞产生的多克隆RatI-模拟和克隆性RatI-AXL cl.2细胞，并用3μg/ml的小鼠对照抗体72A1(左图)或小鼠抗AXL MAB154一抗(右图)以及PE-缀合的抗小鼠二抗染色。关于详细内容参见正文。RatI-AXL cl.2细胞的染色导致3个数量级的偏移，并证明AXL在这些细胞的表面上过表达。
B.NIH3T3-模拟和NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞中细胞表面AXL的流式细胞术分析。收集通过分别用pLXSN和pLXSN-AXL亲嗜性病毒感染NIH3T3成纤维细胞产生的多克隆NIH3T3-模拟和克隆性NIH3T3-AXL cl.7细胞，并用3μg/ml的小鼠对照抗体72A1(左图)或小鼠抗AXL MAB154一抗(右图)以及PE-缀合的抗小鼠二抗染色。关于详细内容参见正文。NIH3T3-AXL cl.7细胞的染色导致2个数量级的偏移，并证明AXL在这些细胞的表面上过表达。
图16.研究大鼠抗AXL抗体对裸小鼠中人前列腺癌生长的作用的同位异种移植模型。将PC-3-LN前列腺癌细胞同位植入NMRI-nu/nu小鼠的前列腺。动物被随机分入4个组，并且接受25mg/kg的同种型对照抗体1D5或拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7，以及40mg/kg索坦(Sutent)或12.5mg/kg泰索帝(Taxotere)。在处理过程中，通过体内生物发光成像在第15天、第23天、第29天和第34天每周一次监控同位生长的PC-3-LN肿瘤的生长以及外周转移。关于详细内容参见正文。与同种型对照抗体1D5相比较，拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7减少了裸小鼠中PC-3-LN前列腺肿瘤的总体生长。
图17.研究大鼠抗AXL抗体对裸小鼠中人前列腺癌转移的作用的同位异种移植模型。将PC-3-LN前列腺癌细胞同位植入NMRI-nu/nu小鼠的前列腺。动物被随机分入4个组，并且接受25mg/kg的同种型对照抗体1D5或拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7，以及40mg/kg索坦或12.5mg/kg泰索帝。尸体剖检后，收集选择的器官(肝、脾、肺、股骨和部分的腰椎)并且通过生物发光成像分析转移的存在。关于详细内容参见正文。与同种型对照抗体1D5相比较，本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7减少了脾转移的发生。值得注意的是，该实验中11B7的抗转移作用比索坦更强。
图18：本图描述了载体pEF6KCL的构建体。
图19：本图描述了使用人AXL-Fc包被的板通过ELISA测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11B7-T1至h#11B7-T6的结合活性。
图20：本图描述了使用人AXL-Fc包被的板通过ELISA测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11B7-T7至h#11B7-T13的结合活性。
图21：本图描述了使用人AXL-Fc包被的板通过ELISA测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11B7-T14至h#11B7-T20的结合活性。
图22：本图描述了使用人AXL-Fc包被的板通过ELISA测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11B7-T21至h#11B7-T27的结合活性。
图23：本图描述了使用人AXL-Fc包被的板通过ELISA测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11D5-T1至h#11D5-T6的结合活性。
图24(上图和下图)：本图描述了利用直接蛋白质吸光度测定法测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11B7-T1至h#11B7-T27的蛋白质浓度。
图25：本图描述了利用直接蛋白质吸光度测定法测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11D5-T1至h#11D5-T6的蛋白质浓度。
图26：本图描述了大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7在人AXL抗原上所结合的结构域的确定。
图27.研究人源化11B7抗AXL抗体对Axl受体磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，用10μg/ml的Gammagard对照抗体、本发明的嵌合抗Axl mAbchm11B7(IgG1/κ)以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6(T2-T6)预温育所述细胞，用或不用400ng/ml mGas6处理细胞，然后进行裂解。将裂解物转移至抗磷酸-酪氨酸抗体4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板，之后，清洗板，用0.125g/ml生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7、AP缀合的链霉抗生物素蛋白和AttoPhos底物溶液进行温育以收集荧光强度。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够在两个细胞系中阻止或显著减少Gas6-介导的Axl激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的Axl酪氨酸磷酸化水平所显示的。
图28A.研究人源化11B7抗AXL抗体对ERK1/2磷酸化的作用的Western印迹实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，用10μg/ml的Gammagard对照抗体、本发明的嵌合抗Axl mAb chm11B7(IgG1/κ)或人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6预温育所述细胞，随后用或不用400ng/ml mGas6处理，然后进行裂解。利用SDS-PAGE分离全细胞裂解物，使用抗磷酸-p44/42MAP激酶(Thr202/Tyr204)抗体通过Western印迹法分析。随后，用抗p44/42MAP激酶抗体抗体再探测相同的滤膜。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6干扰Hs578T乳腺癌细胞中微弱的、Gas6-诱导的ERK1/2激活的增加。然而由于ERK1/2在该细胞系中的高基础活性，因此通过Gas6刺激的细胞中减少的ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化水平(相对于相应的非刺激的细胞)显示的这些作用仅显得相对普通。相反地，在NCI-H292肺癌细胞中，嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5或h#11B7-T6对ERK1/2Thr202/Tyr204磷酸化的抑制作用得到清楚得多的反映。
图28B.研究人源化11B7抗AXL抗体对AKT磷酸化的作用的Western印迹实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，用10μg/ml的Gammagard对照抗体、本发明的嵌合抗Axl mAb chm11B7(IgG1/κ)或人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6预温育所述细胞，随后用或不用400ng/ml mGas6处理，然后进行裂解。利用SDS-PAGE分离全细胞裂解物，使用抗AKT1/2/3抗体通过Western印迹法分析。随后，用抗磷酸-AKT(Ser473)抗体再探测相同的滤膜。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够在Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)中显著减少Gas6诱导的AKT激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的AKT Ser473磷酸化水平所显示的。
图28C.研究人源化11B7抗AXL抗体对GSK-3β磷酸化的作用的Western印迹实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，用10μg/ml的Gammagard对照抗体、本发明的嵌合抗Axl mAb chm11B7(IgG1/κ)或人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6预温育所述细胞，随后用或不用400ng/ml mGas6处理，然后进行裂解。利用SDS-PAGE分离全细胞裂解物，使用抗磷酸GSK-3β(Ser9)抗体通过Western印迹法分析。随后，用抗GSK-3β抗体再探测相同的滤膜。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够在Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)中显著减少Gas6诱导的GSK-3β激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的GSK-3βSer9磷酸化水平所显示的。
图28D.研究人源化11B7抗AXL抗体对TCS2磷酸化的作用的Western印迹实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，用10μg/ml的Gammagard对照抗体、本发明的嵌合抗Axl mAb chm11B7(IgG1/κ)或人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6预温育所述细胞，随后用或不用400ng/ml mGas6处理，然后进行裂解。利用SDS-PAGE分离全细胞裂解物，使用抗TSC2抗体通过Western印迹法分析。随后，用抗磷酸-TSC2(Thr1462)再探测相同的滤膜。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够显著减少Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)中Gas6诱导的TCS2在Thr1462上的磷酸化，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的该氨基酸残基的磷酸化水平所显示的。
图28E.研究人源化11B7抗AXL抗体对mTOR磷酸化的作用的Western印迹实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，用10μg/ml的Gammaga rd对照抗体、本发明的嵌合抗Axl mAb chm11B7(IgG1/κ)或人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6预温育所述细胞，随后用或不用400ng/ml mGas6处理，然后进行裂解。利用SDS-PAGE分离全细胞裂解物，使用抗磷酸-mTOR(Ser2448)抗体通过Western印迹法分析。随后，用抗mTOR抗体再探测相同的滤膜。关于详细内容参见正文。抗AXL抗体的抑制作用在Hs578T乳腺癌细胞(顶部)中相对微弱。然而，与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够干扰NCI-H292肺癌细胞中Gas6-诱导的mTOR激活，如与相应的非刺激的细胞(底部)相比，Gas6-刺激的细胞中降低的mTOR Ser2448磷酸化水平所显示的。
图28F.研究人源化11B7抗AXL抗体对S6K1磷酸化的作用的Western印迹实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，用10μg/ml的Gammagard对照抗体、本发明的嵌合抗Axl mAb chm11B7(IgG1/κ)或人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6预温育所述细胞，随后用或不用400ng/ml mGas6处理，然后进行裂解。利用SDS-PAGE分离全细胞裂解物，使用抗磷酸-p70 S6激酶1(Thr421/Ser424)抗体通过Western印迹法分析。随后，用抗β-肌动蛋白抗体再探测相同的滤膜。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6在Hs578T乳腺癌细胞中对Gas6-诱导的S6K1激活显示一定的抑制作用，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的S6K1 Thr421/Ser424磷酸化水平所显示的(顶部)。然而，可在NCI-H292肺癌细胞(底部)中观察到，在用本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5或h#11B7-T6预处理后，Gas6-诱导的S6K1 Thr421/Ser424磷酸化和激活的下降强得多。
图29.研究人源化11D5抗AXL抗体对Axl受体磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞，用10μg/ml的Gammagard对照抗体、本发明的嵌合抗Axl mAb chm11D5(IgG1/κ)以及人源化抗AXL抗体h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5和h#11D5-T6预温育所述细胞，用或不用400ng/ml mGas6处理细胞，然后进行裂解。将裂解物转移至抗磷酸-酪氨酸抗体4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板，之后，清洗板，用0.125g/ml生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7、AP缀合的链霉抗生物素蛋白和AttoPhos底物溶液进行温育以收集荧光强度。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11D5以及人源化抗AXL抗体h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5和h#11D5-T6能够阻止或显著减少Gas6-介导的Axl激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的Axl酪氨酸磷酸化水平所显示的。
图30A：人AXL，NCBI蛋白质数据库的登录号P_30530的氨基酸序列。
图30B：大鼠抗人AXL单克隆抗体11B7的轻链的可变区的氨基酸序列。
图30C：大鼠抗人AXL单克隆抗体11B7的重链的可变区的氨基酸序列。
图30D：大鼠抗人AXL单克隆抗体11D5的轻链的可变区的氨基酸序列。
图30E：大鼠抗人AXL单克隆抗体11D5的重链的可变区的氨基酸序列。
图31.比较大鼠和嵌合抗AXL抗体对Axl磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿CaSki宫颈癌细胞，用50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的大鼠抗AXL抗体11B7(A)或嵌合抗AXL抗体ch11B7(B)预温育细胞，用或不用400ng/ml mGas6处理细胞，然后进行裂解。将裂解物转移至抗磷酸-酪氨酸抗体4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板。之后，清洗板，用0.5μg/ml生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7、AP缀合的链霉抗生物素蛋白和AttoPhos底物溶液进行温育以收集荧光强度。关于详细内容参见正文。如通过宫颈癌细胞系CaSki中相对Axl磷酸化的浓度依赖性减少所显示的，大鼠抗AXL抗体11B7(A)和本发明的嵌合抗AXL抗体ch11B7(B)能够阻止配体诱导的受体酪氨酸激酶Axl的激活至相似的程度。
图32A：本图描述了分别命名为h#11B7-T15L和h#11B7-T18L的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的轻链的人源化可变区的氨基酸序列。
图32B：本图描述了分别命名为h#11B7-T11H和h#11B7-T12H的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的重链的人源化可变区的氨基酸序列。
图33：本图描述了使用人AXL-Fc包被的板(ELISA)通过ELISA测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11B7-T28至h#11B7-T31的结合活性。
图34：本图描述了利用HPLC测定法测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11B7-T28至h#11B7-T31的蛋白质浓度(参见实施例24)。
图35(1)至35(32)：这些图描述了通过差示扫描量热法(DSC)测定的大鼠抗人AXL人源化抗体h#11B7-T1至h#11B7-T31和嵌合h#11B7抗体的Tm的测定。
图36.研究人源化的11B7抗AXL抗体对Axl受体磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，不用抗体或用10μg/ml的Gammagard对照抗体以及本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25预温育细胞，随后用或不用400ng/ml mGas6处理细胞，然后进行裂解。将裂解物转移至抗磷酸-酪氨酸抗体4G10包被的Maxi-Sorp 96孔板，之后，清洗板，用0.125μg/ml生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7、AP缀合的链霉抗生物素蛋白和AttoPhos底物溶液进行温育以收集荧光强度。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25在两个细胞系中都显著减少Gas6-介导的Axl激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的Axl酪氨酸磷酸化水平所显示的。
图37.研究人源化的11B7抗AXL抗体对Akt激酶磷酸化的作用的ELISA实验。饥饿Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)，不用抗体或用10μg/ml的Gammagard对照抗体以及本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25进行预温育，随后用或不用400ng/ml mGas6进行处理，然后用甲醛进行固定。清洗细胞，进行猝灭，并用抗磷酸-Akt(Ser473)一抗、HRP缀合的抗兔二抗和四甲基联苯胺溶液进行温育以测量吸光度强度。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25能够在两个细胞系中阻止或减少Gas6介导的Akt激酶的激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的Akt(Ser473)磷酸水平所显示的。
图38.研究人源化的11B7抗AXL抗体对Axl受体内化的作用的FACS分析。饥饿Hs578T乳腺癌细胞，不用抗体或用10μg/ml的Gammagard对照抗体以及本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25温育细胞，进行指定的时间，用甲醛固定细胞。用大鼠抗Axl mAb 2A1一抗和PE-缀合的驴抗大鼠IgG二抗将细胞染色，然后进行FACS分析。关于详细内容参见正文。与Gammagard对照抗体相比较，用人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25处理Hs 578乳腺癌细胞导致Ax l受体的内化。显示了各个处理时期的以％(定义为抗Axl mAb处理的样品相对于未处理的样品的平均荧光强度)表示的相对Axl表达水平。
图39A+B.研究人源化的11B7抗AXL抗体对Gas6诱导的内皮细胞出芽的作用的基于球状体的(Spheroid-based)细胞血管生成测定。将VEGF-A预处理的HUVEC球状体包埋在3D胶原凝胶中，用1μg/ml人Gas6进行刺激，并用指定浓度的Gammagard对照抗体以及本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25处理24小时。每数据点分析10个随机选择的球状体的累积出芽长度的平均值±SEM(左图)，并测定抗体的相对抑制作用(右图)。用GraphPad Prism 4.03进行IC50曲线的拟合和IC50值的计算。关于详细内容参见正文。
序列说明
[SEQ ID NO：1]用于扩增片段A的命名为引物EFF1的引物的核苷酸序列
[SEQ ID NO：2]用于扩增片段A的命名为引物EFsmaR的引物的核苷酸序列
[SEQ ID NO：3]包含人κ链的分泌信号和恒定区以及用于添加poly(A)的信号的片段B的核苷酸序列
[SEQ ID NO：4]包含编码信号序列和人IgG1恒定区的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA片段的核苷酸序列
[SEQ ID NO：5]编码h#11B7-T1L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
[SEQ ID NO：6]编码h#11B7-T2L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
[SEQ ID NO：7]编码h#11B7-T3L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
[SEQ ID NO：8]编码h#11B7-T4L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
[SEQ ID NO：9]编码h#11B7-T5L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
[SEQ ID NO：10]编码h#11B7-T6L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
[SEQ ID NO：11]编码h#11B7-T7L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
[SEQ ID NO：12]编码h#11B7-T8L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
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[SEQ ID NO：133]前导序列的核苷酸序列
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[SEQ ID NO：139]人AXL的氨基酸序列，NCBI蛋白质数据库的登录号P_30530，其也描述于图30A中
[SEQ ID NO：140]大鼠抗人AXL单克隆抗体11B7的轻链可变区的氨基酸序列，其也描述于图30B中，并且其与由#11B7-嵌合轻链(SEQID NO：135)的氨基酸No.1至108组成的氨基酸序列同一
[SEQ ID NO：141]大鼠抗人AXL单克隆抗体11B7的重链可变区的氨基酸序列，其也描述于图30C中，并且其与由#11B7-嵌合重链(SEQID NO：136)的氨基酸No.1至113组成的氨基酸序列同一
[SEQ ID NO：142]大鼠抗人AXL单克隆抗体11D5的轻链可变区的氨基酸序列，其也描述于图30D中，并且其与由#11D5-嵌合轻链(SEQID NO：137)的氨基酸No.1至108组成的氨基酸序列同一
[SEQ ID NO：143]大鼠抗人AXL单克隆抗体11D5的重链可变区的氨基酸序列，其也描述于图30E中，并且其与由#11D5-嵌合重链(SEQID NO：138)的氨基酸No.1至113组成的氨基酸序列同一
[SEQ ID NO：144]编码h#11B7-T15L的氨基酸序列的核苷酸序列，信号序列(1-60)、可变区(61-387)、恒定区(388-702)
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[SEQ ID NO：151]h#11B7-T12H的氨基酸序列，信号序列(1-19)、可变区(20-132)、恒定区(133-462)
实施例
实施例1.作为免疫原的过表达AXL的RatI成纤维细胞的产生
通过侧翼连接限制性核酸内切酶EcoRI和BamHI的识别元件将根据National Center for Biotechnology Information(NCBI)参照序列(NM_021913)的人受体酪氨酸激酶AXL转录物变体1的全长编码序列亚克隆入pLXSN，从而产生逆转录病毒表达载体pLXSN-hAXL。
为了产生特异性结合人受体酪氨酸激酶AXL的抗体，通过逆转录病毒基因转移产生稳定地过表达人AXL的RatI成纤维细胞。简而言之，将3x105个Phoenix-E细胞接种在60mm培养皿中，然后使用磷酸钙法用2μg/ml pLXSN载体或pLXSN-hAXL转染细胞。24小时后，用新鲜培养基替换培养基，并且将Phoenix-E细胞在其中温育4小时。收获释放pLXSN或pLXSN-hAXL亲嗜性病毒的Phoenix-E细胞的上清液，在聚凝胺(4mg/ml；Aldrich)存在的情况下将其用于温育亚汇合的RatI细胞(2x105个细胞/6cm皿)，进行3小时。同时，用新鲜培养基再温育Phoenix-E细胞，在进行另外3小时之后在聚凝胺(4mg/ml；Aldrich)存在的情况下将其用于RatI成纤维细胞的第二次感染。同样地，进行第三个感染循环。在替换培养基后，开始用G418选择RatI细胞。通常，在选择21天后挑选稳定的克隆。
繁殖一组稳定的克隆，并且通过FACS分析就膜定位的人AXL表达对其进行定量。具体地，用10mM的于PBS中的EDTA收获1x105个细胞，用FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮化钠)清洗细胞一次，将其接种在96孔圆底板中。以1,000rpm将细胞离心3分钟以除去上清液，然后用小鼠抗AXL一抗MAB154(R&D Systems，3μg/ml)进行重悬浮。将细胞悬浮液在冰上温育1小时，用FACS缓冲液清洗2次，然后以100μl/孔重悬浮于以1∶50稀释于FACS缓冲液中的PE-缀合的驴抗小鼠二抗(Jackson)中。将细胞悬浮液在冰上于黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，使用Epics XL-MCL流式细胞仪(BeckmanCoulter)进行分析。
图15A显示用pLXSN空载体稳定感染的多克隆RatI-模拟群体和用pLXSN-hAXL稳定感染的RatI-AXL cl.2的FACS分析，并且证明AXL在该代表性克隆的细胞表面上过表达。
此外，为了产生用于实验目的的合适的细胞模型系统，以类似于对于RatI所描述的方法产生稳定地过表达AXL的NIH3T3成纤维细胞。简而言之，将3x105个Phoenix-E细胞接种在60mm培养皿中，然后使用磷酸钙法用2μg/ml pLXSN载体或pLXSN-AXL cDNA转染细胞。24小时后，用新鲜培养基替换培养基，并将Phoenix-E细胞在其中温育4小时。收获释放pLXSN或pLXSN-hAXL亲嗜性病毒的Phoenix-E细胞的上清液，在聚凝胺(4mg/ml；Aldrich)存在的情况下将其用于温育亚汇合的NIH3T3细胞(2x105个细胞/6cm皿)，进行3小时。同时，用新鲜培养基再温育Phoenix-E细胞，在进行另外3小时之后在聚凝胺(4mg/ml；Aldrich)存在的情况下将其用于NIH3T3成纤维细胞的第二次感染。同样地，进行第三个感染循环。在替换培养基后，开始用G418选择NIH3T3细胞。通常，在选择21天后挑选稳定的克隆。
繁殖一组稳定的克隆，并且通过FACS分析就膜定位的AXL表达对其进行定量。具体地，用10mM的在PBS中的EDTA收获1x105个细胞，用FACS缓冲液(PBS，3％FCS，0.4％叠氮化钠)清洗细胞一次，将其接种在96孔圆底板中。以1,000rpm将细胞离心3分钟以除去上清液，然后用小鼠抗AXL一抗MAB154(R&D Systems，3μg/ml)进行重悬浮。将细胞悬浮液在冰上温育1小时，用FACS缓冲液清洗2次，然后以100μl/孔重悬浮于以1∶50稀释于FACS缓冲液中的PE-缀合的驴抗小鼠二抗(Jackson)中。将细胞悬浮液在冰上于黑暗中温育30分钟，用FACS缓冲液清洗2次，使用Epics XL-MCL流式细胞仪(BeckmanCoulter)进行分析。
图15B显示用pLXSN空载体稳定感染的多克隆NIH3T3-模拟群体和用pLXSN-hAXL稳定感染的NIH3T3-AXL cl.7的FACS分析，并且证明AXL在该代表性克隆的细胞表面上过表达。
实施例2.大鼠抗AXL单克隆抗体的产生
通过将大约10x106个RatI-AXL cl.2的冷冻细胞注射(腹膜内和皮下)入Lou/C或Long Evans大鼠来产生单克隆大鼠抗AXL抗体。在8周间隔后，在融合前3天腹膜内和皮下给予最终的加强。根据标准方法进行骨髓瘤细胞系P3X63-Ag8.653与大鼠免疫脾细胞的融合，产生105个杂交瘤。2周后，收集来自杂交瘤的第一悬浮液，并且就与NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞(对NIH3T3-模拟对照细胞)的结合在初步的FACS筛选中对其进行检测。进一步培养对于AXL结合呈阳性的克隆。从50ml这些克隆的上清液纯化抗体，并且就与NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞(对NIH3T3-模拟对照细胞)上的AXL的特异性结合对其进行再分析。在Akt-激酶磷酸化ELISA中进一步检测特异性结合NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞但不结合NIH3T3-模拟对照细胞的纯化的抗体，并进行确定同种型的ELISA。为了纯化大鼠抗体，以5,000g离心上清液20分钟，然后进行无菌过滤。加入500μl蛋白G琼脂糖(sepharose)FF，在4℃下于旋转轮(spinning wheel)上温育至少1小时。将琼脂糖离心，弃去上清液，在使用柠檬酸盐缓冲液(100mM)pH2.1进行蛋白质洗脱之前用PBS清洗蛋白G基质2次。立即通过加入1M Tris pH 8.0将洗脱级分再缓冲至中性pH，然后对PBS进行透析。
在测试的寡克隆抗体中，91个特异性结合NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞但不结合NIH3T3-模拟对照细胞，9个在相同的细胞中抑制Gas6诱导的Akt磷酸化，然而71个刺激Akt磷酸化。冷冻保存(kryoconserve)和亚克隆4个拮抗型抗体(I11B7、I10D12、I6E7和III11D5，在下列实施例中分别称为11B7、10D12、6E7和11D5)、两个激动型抗体(I11D7和III2A1；在下列实施例中称为11D7和2A1)和1个对照抗体(III1D5；在下列实施例中称为1D5)。
实施例3.抗AXL抗体的结构和表征
3.1.大鼠抗体可变结构域的核苷酸序列
从杂交瘤细胞克隆大鼠抗AXL抗体可变结构域。使用RNA提取试剂盒RNeasy(RNeasy midi-kit，Qiagen)制备RNA。按照厂商的说明书使用5′RACE试剂盒(Invitrogen)制备编码抗体基因的cDNA。
简而言之，使用基因特异性GSP1引物和SuperscriptTM II逆转录酶从总RNA合成第一链cDNA。在第一链cDNA合成后，通过用RNA酶混合物(RNase Mix)处理除去原始mRNA模板。然后向cDNA的3′末端添加同聚体尾。使用Taq DNA聚合酶、与位于cDNA分子内的位点退火的嵌套基因特异性引物(GSP2)和试剂盒提供的锚定引物进行PCR扩增。在扩增后，将5′RACE产物克隆入pLXSN-ESK载体以进行测序。为了促进克隆，锚定引物(AP)包含Sal I的识别序列，GSP2引物包含Xho I位点。
GSP1引物：
kappa_GSP1：GATGGATGCATTGGTGCAGC
new_kappa_GSP1：atagatacagttggtgcagc
heavy_GSP1：CAGGGTCACCATGGAGTTA
GSP2引物：
Xhol-hGSP2：CCGCTCGAGCGGGCCAGTGGATAGACAGATGG
Xhol-kGSP2：CCGCTCGAGCGGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG
将GSP引物用于大鼠抗AXL Mab克隆：
11B7： kappa GSP1；Xhol-kGSP2
       heavy GSP1；Xhol-hGSP2
10D12：kappa_GSP1，new_kappa_GSP1；Xhol-kGSP2
       heavy GSP1；Xhol-hGSP2
11D5： new_kappa_GSP1；Xhol-kGSP2
       heavy GSP1；Xhol-hGSP2
3.2.大鼠抗AXL抗体可变结构域的氨基酸序列
从克隆入pLXSN-ESK载体的经测序的基因翻译大鼠抗体可变结构域序列。给出的氨基酸序列始于可变结构域的位点1。根据Kabat(Kabat等人Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.NIH Publication No.91-3242，1991)定义抗体特异性结合其靶所需的互补决定区(CDR)。Kabat定义基于可变结构域内的序列变异性。抗体的抗AXL特异性CDR区域列于图14和SEQ ID NO：121至SEQ ID NO：132中。单独的CDR包括下列位点：
CDR-L1：24-34
CDR-L2：50-56
CDR-L3：89-97
CDR-H1：31-35b
CDR-H2：50-65
CDR-H3：95-102
大鼠11B7抗体轻链和重链可变区的氨基酸序列分别由SEQ IDNO：140和141表示。大鼠11B7抗体的轻链和重链的亚类分别为κ和IgG1。
大鼠11D5抗体轻链和重链可变区的氨基酸序列分别由SEQ IDNO：142和143表示。大鼠11D5抗体的轻链和重链的亚类分别为κ和IgG2a。
3.3大鼠抗体的表达和纯化：
在Celline CL 1000生物反应器(Integra Biosciences)中使用DMEM(含有4.5g/L葡萄糖；1％谷氨酰胺，1％丙酮酸盐，1％青霉素/链霉素)在37℃，5-7％CO2下培养杂交瘤。FCS补充物是用于营养小室的1％FCS和用于细胞小室的5％的低IgG FCS。每周2次进行收获和培养基替换。细胞分离1/1-＞1/3取决于细胞生长。每周1次通过SDS-PAGE分析检测生产率。将上清液贮存于-20℃下直至进行纯化。每周1次进行工作培养物的支原体(Mycoplasma)检查。
通过 Explorer 100系统(GE-Healthcare)使用蛋白A或G琼脂糖FF(GE-Healthcare)纯化抗体。对于各纯化，单独地填充柱子。将柱子大小调整至各批次的预期的生产率和大小(通常50-500mg)。在可能的情况下将含有蛋白质的溶液保持在冰上或4℃下。在整个过程中使用无菌缓冲液和双蒸水。
将上清液解冻，用50mM TRIS pH 8.5进行缓冲，离心，通过0.22μm膜过滤，然后将其装载至柱子上。在用8倍柱体积(CV)的50mM PO4，pH8.5清洗后，将抗体洗脱在10 CV 100mM甘氨酸，pH 3.3中。立即通过加入1/5 1 M Tris pH 8.0(1ml Tris/4ml洗脱级分)将洗脱级分再缓冲至中性pH，然后利用rSDS-PAGE进行分析。混合含有纯抗体的级分，在4℃下对PBS进行透析，然后无菌过滤。
根据各抗体的单独的性质调整缓冲系统的要求。特别地，将大鼠IgG2a抗体11D5结合至ProteinG 4FF基质(GE-Healthcare)，在高盐(2M NaCl)条件下进行清洗。在根据11D5的高盐条件下通过rProteinA(GE-Healthcare)纯化大鼠抗体IgG1 11B7。在pH 5.5下进行抗体洗脱。大鼠抗体纯化的流速必须保持较低以增加结合效率。
作为第二纯化步骤，可进行离子交换层析(在单独的、合适的条件下)或制备型尺寸排阻层析(PBS，pH 7.4)。
用于纯化的抗体的质量控制的标准方案包括：
rSDS-PAGE凝胶分析；考马斯染色或银染
BCA检测(Pierce #23227 BCA Protein Assay Kit；大鼠IgG标准#31233)
分析型尺寸排阻(Superdex 200 Tricorn 10/300GL，～250mg于250μl中；0.5ml/分钟，
Figure BDA0000107419500000491
Explorer 100)
内毒素检测(LAL，Cambrex QCL-
Figure BDA0000107419500000492
Chromogenic LAL EndpointAssay#US50-648U)
基于细胞的活性测定(FACS结合；pAkt；pAXL)
取决于它们的稳定性，在无菌条件下在4℃或-20℃下将纯化的抗体贮存在PBS，pH 7.4中。
将获得的大鼠抗体之一11B7用于实施例5、6和16。
3.4.通过FACS scatchard进行的抗体亲和力测定
通过用10mM的在PBS中的EDTA温育来收获过表达人AXL的NIH3T3细胞，以6百万个细胞/ml将其重悬浮于FACS缓冲液(PBS pH7.4，3％FCS，0.1％NaN3)中。在圆底微量滴定板中，向100μl的在FACS缓冲液中以40至0.002μg/ml(266至0.01nM)的浓度含有抗体11B7、11D5、ch11B7-IgG1、ch11B7-IgG2、ch11D5-IgG1或ch11D5-IgG2的抗体溶液中加入100μl细胞悬浮液。让抗体结合在冰上进行2小时。然后，用250μl FACS缓冲液/孔清洗细胞2次，将其重悬浮于200μl以1∶50稀释于FACS缓冲液中的二抗(抗大鼠-PE；Jackson)中。在温育45分钟后，在FACS缓冲液中再清洗细胞2次，然后重悬浮于500ml PBS中以用于FACS分析。在Beckman-CoulterFACS FC500上进行分析。为了测定表观亲和常数KDapp，将平均荧光值针对平均荧光与相应抗体浓度([M])的比作图。由直线的斜率倒数(inverse slope)计算的KDapp列于下面：
上文中所列的KD值包括实施例4中获得的嵌合抗体的KD值。
实施例4：大鼠抗AXL抗体嵌合化(chimerization)：
如下所述从人志愿者的外周血单核细胞(PBMC)克隆人κ轻链和重链IgG 1/2基因：
从全血制备PBMC。将血液在室温下于具有10U/ml肝素的PBS/2mMEDTA中稀释1/2，5，在由膈膜(diaphragm)覆盖的15ml Biocoll溶液(35ml/管)[来自Biochrom #L6115的Biocoll]的上方分层。以400xg在室温下离心样品30分钟，弃去血清(约15ml)。使用Pasteur移液器小心地回收含有PBMC的界面。将PBMC在PBS/2mM EDTA中清洗2次(第一次清洗100ml，第二次清洗50ml)，以300xg离心10分钟。将细胞沉淀重悬浮于RPMI/10％FCS(25ml)中，产生5.5x107个PBMC。
根据厂商的说明书，使用来自Qiagen(#75142)的RNeasy试剂盒从PBMC制备RNA。将纯化的RNA(30μg)以等分在-80℃下贮存。
按照厂商的说明书，使用下列引物，利用Superskript III逆转录酶(invitrogen#18080-93)通过RT-PCR从分离的RNA制备抗体IgGγ1和2以及κ链的cDNA：
1)RT-gamma：GCG TGT AGT GGT TGT GCA GAG
2)RT-gamma2：ggg ctt gcc ggc cgt g
3)RT-kappa：TGG AAC TGA GGA GCA GGT GG
4)5′Blp：AGA TAA GCT TTG CTC AGC GTC CAC CAA GGG CCC
ATC GGT
5)3′Bam(GAG)：AGA TGG ATC CTC ATT TAC CCG GAG ACA GGG
AGA G
6)5′Bsi：AGA TAA GCT TCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT
CTT CAT
7)3′Bam(CTT)：AGA TGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC
TCT
将引物溶解为100μM。分别使用2pmol oligo RTγ和RTκ，加入1μg RNA，10mM dNTP混合物并且加热5分钟至65℃来进行RT-PCR反应。加入4μl第一链缓冲液，1μl 0.1M DTT，1μl RNA酶抑制剂(40U/μl Fermentas#EO0311)和2μl Superscript III RT，混合，然后在50℃下温育1小时，然后在70℃下进行热灭活步骤15分钟。
使用Taq聚合酶(Eurochrom#EME010001)将2μl的第一链反应物用于第二步骤PCR以产生抗体恒定结构域的双链DNA。使用下列PCR设置将引物5′Blp和3′Bam(GAG)用于扩增γ-链，且将5′Bsi和3′Bam(CTT)用于扩增κ-链恒定区：
κ-链扩增：
94℃  120秒
94℃  30秒
55℃  30秒
72℃  45秒，循环35次
72℃  10分钟
γ-链扩增：
94℃  120秒
94℃  30秒
45℃  30秒
72℃  60秒，循环5次
94℃  30秒
50℃  30秒
72℃  60秒，循环35次
72℃  10分钟
在TAE缓冲的2％琼脂糖凝胶上分析PCR产物。发现大约350bp的单个条带(对于κ轻链)和大约1000bp的单个条带(对于重链γ1和γ2)。按照厂商的说明书，利用Qiagen凝胶提取试剂盒(QIAGEN，#28784)纯化PCR产物。为了将PCR片段克隆入pcDNA3载体(Invitrogen)的多克隆位点，用HindIII(5′)和BamHI(3′)限制性核酸内切酶降解pcDNA3载体和PCR片段。将限制性位点编码在PCR引物内。使用Qiagen PCR纯化试剂盒(QIAGEN，28104)纯化降解的片段，使用T4DNA连接酶在16℃下将编码γ1、γ2和κ链的DNA连接入pcDNA3载体，进行过夜。将连接酶在65℃下灭活10分钟。使用标准方案将连接的DNA质粒直接转化入CaCl2感受态大肠杆菌，将其涂板至含有氨苄青霉素的LB平板上。在37℃下温育过夜后，挑选单个集落，将其悬浮于10μl H2O中，并且通过PCR(5μl悬浮的细胞，Taq聚合酶，引物5Blp和3Bam(GAG)γ1/γ2以及5Bsi和3Bam(CTT)(对于κ集落))就包含含有各抗体链的质粒验证所述集落：
94℃  120秒
94℃  30秒
55℃  30秒
72℃  60秒，循环35次
72℃  10分钟
就PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上分析样品。选择含有抗体基因的集落以接种5ml LB/氨苄青霉素培养基。在37℃下温育过夜后，收获大肠杆菌，使用Qiagen miniprep试剂盒(QIAGEN，#12123)制备DNA。对照降解物(HindIII，BamHI)在预期的大小上显示所有κ和γ链基因插入物；通过在Medigenomix上测定DNA序列来验证序列。
通过PCR从pLXSN-ESK载体扩增大鼠可变结构域，然后将其克隆入g1/g2和k pcDNA3载体以产生嵌合的全长抗体。使用下列引物(其在5′末端包含HindIII和BsmI位点且在3′末端包含BsiWI位点)扩增可变VL结构域：
VL-11B7-5′：AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA
GGC TCC
VL-11B7-3′：AGA TCG TAC GTT TCA GCT CCA GCT TGG TGC CTC
VL-11D5-5′：AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA
GTC TCC ATC
VL-11D5-3′：AGA TCG TAC GTT TCA GCT TGG TCC CAG
使用下列引物(其在5′末端包含HindIII和BsmI位点且在3′末端包含BlpI位点)扩增可变VH结构域：
VH-11B7/11D5-5′：AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA GGT GCA GCT
TCA GGA GTC AGG
VH-11B7/11D5-3′：AGA TGC TGA GCT GAC AGT GAC CAT GAC TCC
TTG GCC
轻链的BsiWI和重链的BlpI是恒定区的5′末端上的单个位点，其使得能够与可变结构域基因的3′末端直接融合。
将融合至来源于pLNOH2载体(Norderhaug等人.J.Immunol.Methods 204，1997；Neuberger EMBO J.1983；2(8)：1373-8，1983)的前导序列SEQ ID No：133的编码嵌合抗体链的基因克隆入pCEP载体系统以进行重组表达。将轻链基因在NheI(5′)与XhoI(3′)之间克隆入pCEP4(Invitrogen)，将重链基因在KpnI(5′)与XhoI(3′)之间克隆入pCEP-Pu(Kohfeld FEBS第414卷；(3)557ff，1997)。
使用标准CaPO4转染法，用1μg/ml的编码轻链和重链基因的各质粒共转染接种在20x20cm平板中的HEK293细胞以进行瞬时表达。培养条件为37℃，5％CO2于DMEM/F12高葡萄糖培养基(含有5％的低IgG FCS，1％丙酮酸，1％谷氨酰胺，1％青霉素/链霉素)中。转染后24小时，用新鲜培养基替换培养基。每2至3天收集上清液，进行大约3周。如对于大鼠抗体纯化所描述的，在标准缓冲液条件(装载：50mMTris；pH＝8.5，清洗：50mM PO4；pH＝8.5，洗脱：100mM甘氨酸；pH3，3)下使用1 ml Hitrap rProtein A柱子(GE-Healthcare)从大约600ml上清液纯化嵌合抗体。
获得的来源于大鼠11B7抗体的嵌合分子之一由SEQ ID NO：136的氨基酸序列(图14)所示的人IgG1重链和SEQ ID NO：135的氨基酸序列(图14)所示的人κ轻链组成。
获得的来源于大鼠11D5抗体的嵌合分子之一由SEQ ID NO：138的氨基酸序列(图14)所示的人IgG1重链和SEQ ID NO：137的氨基酸序列(图14)所示的人κ轻链组成。
将此类嵌合11B7和11D5抗体(分别命名为ch11B7-IgG1和ch11D5-IgG1)用于实施例3、13、14和17至20。
实施例5.本发明的大鼠抗AXL抗体在裸小鼠中减少人前列腺癌的生长
通常在人异种移植肿瘤研究中评估治疗性抗体的抗肿瘤功效。在此类模型系统中，人肿瘤在免疫削弱的小鼠中生长为异种移植物，根据肿瘤生长抑制的程度来测量治疗功效。本研究的目的是评估本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7在裸小鼠中是否干扰人前列腺癌细胞的肿瘤生长。简而言之，在第0天，以2l/分钟的氧流速用1.5-2.0体积百分比的异氟醚麻醉7至8周龄的雄性NMRI-nu/nu小鼠(适应环境后的大致重量：30g)，将25μl PBS中的1x106个PC-3-LN细胞同位植入前列腺。PC-3-LN细胞来源于用编码萤光素酶-新霉素融合蛋白的逆转录病毒感染的PC-3前列腺癌细胞系。肿瘤生长的起始和肿瘤生长进展从而可通过体内生物发光成像来测量。为此，将萤光素腹膜内(i.p.)注射入小鼠，注射后10分钟使用NightOWL LB 981生物发光成像系统(Berthold Technologies，Germany)测量光的发射。在第一处理之前，将小鼠随机化，并且进行统计检验以确保处理组(每组10只动物)间起始肿瘤体积(平均值、中值和标准差)的一致性。在第8天，开始所有处理并且持续直至第34天，然后在第35天进行尸体剖检。每周3次(周一、周三、周五)分别将25mg/kg的同种型对照抗体1D5和拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7腹膜内(i.p.)施用入组1和2的动物。组3的动物每天1次口服(p.o.)接受40mg/kg索坦。组4的动物接受3次使用12.5mg/kg的泰索帝的静脉内(i.v.)注射(彼此间隔4天)。下面给出治疗组的概述。
图16显示该实验的结果。与同种型对照抗体1D5相比较，本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7在裸小鼠中减少了PC-3-LN前列腺肿瘤的总体生长。
实施例6.本发明的大鼠抗AXL抗体抑制人前列腺癌的转移
在与在“本发明的大鼠抗AXL抗体在裸小鼠中减少人前列腺癌生长”下所描述的相同的实验中，在尸体剖检后分析PC-3-LN肿瘤细胞至其他器官内的再定位(转移)以评估本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7的抗转移作用。为此，在尸体剖检后收集选择的器官(肝、脾、肺、股骨、部分的腰部脊柱)，将其匀浆，并且补充以萤光素。随后，使用NightOWL LB 981生物发光成像系统(Berthold Technologies，Germany)测量光的发射。
图17显示该实验对于脾的分析的结果。与同种型对照抗体1D5相比较，本发明的拮抗型大鼠抗AXL抗体11B7减少了脾转移的发生。值得注意的是，该实验中11B7的抗转移作用比索坦的抗转移作用强。对于肝、肺、股骨和腰部脊柱转移获得相似的观察结果。
实施例7：人源化抗体的设计
7.1#11B7的人源化形式的设计
7.1.1#11B7可变结构域的分子建模
按照本领域内公知的方法如同源建模(Methods in Enzymology，203，121-153，(1991))实施#11B7可变结构域的分子建模。将ProteinData Bank(Nuc.Acid Res.35，D301-D303(2007))中注册的人免疫球蛋白可变结构域的一级序列(来源于X射线晶体结构的三维结构是可获得的)与所确定的#11B7可变结构域相比较。结果，1JPT被选择为与#11B7轻链可变结构域具有最高序列同源性。此外，1F8T被选择为与#11B7重链可变结构域具有高序列同源性。基于通过组合相应于#11B7的轻链和重链的1JPT和1F8T的坐标而获得的“构架模型”制备构架结构域的三维结构。对于#11B7CDR，按照Thornton等人(J.Mol.Biol.，263，800-815，(1996))的分类将CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2分别分配至簇11A、7A、9A、10A和9A。按照H3-法则(FEBSletters 399，1-8(1996))将CDRH3分类在k(3)中。随后，将各CDR的典型构象整合在构架模型中。
最后，为了获得#11B7可变结构域的可能的分子模型(就能量而言)，进行能量计算以排除不利的原子间接触。使用商购可得的三维蛋白质结构预测程序Prime和坐标搜索程序MacroModel(
Figure BDA0000107419500000561
LLC)进行这些方法。
7.1.2人源化#11B7的氨基酸序列的设计
按照本领域内公知的方法如CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))构建人源化的#11B7抗体。通过基于构架结构域内的氨基酸同源性的2种方法来选择受者(acceptor)抗体。
将#11B7构架结构域的序列与包括抗体氨基酸序列的Kabat数据库中注册的所有人构架的序列(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))相比较。结果，GM4672′CL抗体因它们的构架结构域之间的72％的序列同源性而被选择作为受者。将GM4672′CL中的构架结构域的氨基酸残基与#11B7中相应的氨基酸残基比对，以鉴定其间使用不同氨基酸的位置。使用所构建的#11B7的三维模型分析此类残基的位置。随后按照Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))提供的标准选择待移植至受者上的供体残基。
将#11B7构架结构域的序列与IgBLAST中注册的所有人构架的序列相比较(Nuc.Acid Res.36，D25-D30(2007))。结果，BAC01582因它们的构架结构域之间的76％的序列同源性而被选择为L链受者。AAF80028因它们的构架结构域之间的66％的序列同源性而被选择为H链受者。将BAC01582L链和AAF80028H链中的构架结构域的氨基酸残基与#11B7中的相应氨基酸残基相比对，以鉴定其间使用不同氨基酸的位置。使用所构建的#11B7的三维模型分析此类残基的位置。随后按照Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))提供的标准选择待移植至受者上的供体残基。
在所有方法中，如下列实施例中所描述的，通过将一些选择的供体残基转移至受者抗体来构建人源化的#11B7序列。
7.1.3#11B7轻链的人源化(图1、2和3)
7.1.3.1h#11B7-T1L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T1L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、苏氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、65(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、73(亮氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.2h#11B7-T2L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T2L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ IDNO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、65(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、73(亮氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.3h#11B7-T3L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T3L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.4h#11B7-T4L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T4L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.5h#11B7-T5L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T5L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.6h#11B7-T6L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T6L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.7h#11B7-T7L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T7L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.8h#11B7-T8L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T8L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.9h#11B7-T9L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区被命名为“h#11B7-T9L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.10h#11B7-T10L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T10L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ IDNO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.11h#11B7-T11L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T11L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.12h#11B7-T12L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T12L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.13h#11B7-T13L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T13L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.14h#11B7-T14L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T14L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.15h#11B7-T15L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T15L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.16h#11B7-T16L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T16L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.17h#11B7-T17L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T17L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.18h#11B7-T18L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T18L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.19h#11B7-T19L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T19L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.3.20h#11B7-T20L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11B7轻链可变区命名为“h#11B7-T20L”-型轻链可变区：用丝氨酸、丝氨酸、缬氨酸、酪氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQID NO：140(图30B)所示的#11B7轻链可变区的氨基酸No.7(丙氨酸)、12(脯氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(天冬氨酸)、100(甘氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.1.4#11B7重链的人源化(图4和5)
7.1.4.1h#11B7-T1H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T1H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、2(缬氨酸)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、48(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、68(丝氨酸)、70(苏氨酸)、71(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.2h#11B7-T2H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T2H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、丝氨酸、缬氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、2(缬氨酸)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、70(苏氨酸)、71(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.3h#11B7-T3H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T3H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、甘氨酸、亮氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、40(苯丙氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.4h#11B7-T4H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T4H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、6(谷氨酸)、7(丝氨酸)、9(脯氨酸)、12(缬氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、48(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、68(丝氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.5h#11B7-T5H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T5H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、6(谷氨酸)、7(丝氨酸)、9(脯氨酸)、12(缬氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.6h#11B7-T6H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T6H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.7h#11B7-T7H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T7H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、48(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.8h#11B7-T8H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T8H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、68(丝氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.9h#11B7-T9H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区被命名为“h#11B7-T9H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、48(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、68(丝氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.10h#11B7-T10H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区命名为“h#11B7-T10H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和苏氨酸分别置换序列表的SEQID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、6(谷氨酸)、7(丝氨酸)、9(脯氨酸)、12(缬氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、48(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.11h#11B7-T11H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区命名为“h#11B7-T11H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、6(谷氨酸)、7(丝氨酸)、9(脯氨酸)、12(缬氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、68(丝氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.1.4.12h#11B7-T12H-型重链：
通过下列设计的人源化#11B7重链可变区命名为“h#11B7-T12H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：141(图30C)所示的#11B7重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、6(谷氨酸)、7(丝氨酸)、9(脯氨酸)、12(缬氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬氨酸)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、48(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、68(丝氨酸)、70(苏氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(丝氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2#11D5的人源化形式的设计
7.2.1#11D5可变结构域的分子建模
按照本领域内公知的方法如同源建模(Methods in Enzymology，203，121-153，(1991))实施#11D5可变结构域的分子建模。将ProteinData Bank(Nuc.Acid Res.35，D301-D303(2007))中注册的人免疫球蛋白可变结构域的一级序列(来源于X射线晶体结构的三维结构是可获得的)与所确定的#11D5可变结构域相比较。结果，1D5I被选择为与#11D5轻链可变结构域具有最高序列同源性。此外，1ORS被选择为与#11D5重链可变结构域具有最高序列同源性。基于通过组合相应于#11D5的轻链和重链的1D5I和1ORS的坐标而获得的“构架模型”制备构架结构域的三维结构。对于#11D5CDR，按照Thornton等人(J.Mol.Biol.，263，800-815，(1996))的分类将CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1和CDRH2分别分配至簇11A、7A、9A、10A和9A。按照H3-法则(FEBSletters 399，1-8(1996))将CDRH3分类在k(3)中。随后，将各CDR的典型构象整合在构架模型中。
最后，为了获得#11D5可变结构域的可能的分子模型(就能量而言)，进行能量计算以排除不利的原子间接触。使用商购可得的三维蛋白质结构预测程序Prime和坐标搜索程序MacroModel(
Figure BDA0000107419500000711
LLC)进行这些方法。
7.2.2人源化#11D5的氨基酸序列的设计
按照本领域内公知的方法如CDR移植(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))构建人源化的#11D5抗体。通过基于构架结构域内的氨基酸同源性的2种方法来选择受者抗体。
将#11D5构架结构域的序列与包括抗体氨基酸序列的Kabat数据库中注册的所有人构架的序列(Nuc.Acid Res.29，205-206(2001))相比较。结果，T33-4′CL抗体因它们的构架结构域之间的70％的序列同源性而被选择作为受者。将T33-4′CL中的构架结构域的氨基酸残基与#11D5中相应的氨基酸残基比对，以鉴定其间使用不同氨基酸的位置。使用所构建的#11D5的三维模型分析此类残基的位置。随后按照Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))提供的标准选择待移植至受者上的供体残基。
将#11D5构架结构域的序列与IgBLAST中注册的所有人构架的序列相比较(Nuc.Acid Res.36，D25-D30(2007))。结果，1603260B因它们的构架结构域之间的74％的序列同源性而被选择作为L链受者。AAF80028因它们的构架结构域之间的66％的序列同源性而被选择为H链受者。将1603260B L链和AAF80028H链中的构架结构域的氨基酸残基与#11D5中的相应氨基酸残基相比对，以鉴定其间使用不同氨基酸的位置。使用所构建的#11D5的三维模型分析此类残基的位置。随后按照Queen等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，10029-10033(1989))提供的标准选择待移植至受者上的供体残基。
在所有方法中，如下列实施例中所描述的，通过将一些选择的供体残基转移至受者抗体来构建人源化的#11D5序列。
7.2.3#11D5轻链的人源化(图6、7、8、9、10和11)
7.2.3.1h#11D5-T1L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T1L”-型轻链可变区：用缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.2(异亮氨酸)、11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、46(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.2h#11D5-T2L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T2L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、46(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.3h#11D5-T3L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T3L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.4h#11D5-T4L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T4L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.5h#11D5-T5L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T5L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.6h#11D5-T6L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T6L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.7h#11D5-T7L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T7L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.8h#11D5-T8L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T8L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.9h#11D5-T9L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T9L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.10h#11D5-T10L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T10L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.11h#11D5-T11L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T11L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.12h#11D5-T12L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T12L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.13h#11D5-T13L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T13L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.14h#11D5-T14L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T14L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.15h#11D5-T15L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T15L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.16h#11D5-T16L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T16L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.17h#11D5-T17L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T17L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.18h#11D5-T18L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T18L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.19h#11D5-T19L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T19L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.20h#11D5-T20L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T20L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.21h#11D5-T21L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T21L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.22h#11D5-T22L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T22L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.23h#11D5-T23L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T23L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.24h#11D5-T24L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T24L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.25h#11D5-T25L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T25L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.26h#11D5-T26L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T26L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.27h#11D5-T27L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T27L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.28h#11D5-T28L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T28L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.29h#11D5-T29L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T29L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.30h#11D5-T30L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T30L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.31h#11D5-T31L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T31L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.32h#11D5-T32L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T32L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.33h#11D5-T33L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T33L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQID NO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、71(酪氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.34h#11D5-T34L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T34L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、谷氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ IDNO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、70(天冬氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.35h#11D5-T35L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T35L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ IDNO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、47(甲硫氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.36h#11D5-T36L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T36L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ IDNO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、45(精氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.3.37h#11D5-T37L-型轻链：
通过下列设计的人源化#11D5轻链可变区命名为“h#11D5-T37L”-型轻链可变区：用亮氨酸、丙氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苏氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、异亮氨酸和苏氨酸分别置换由序列表的SEQ IDNO：142(图30D)所示的#11D5轻链可变区的氨基酸No.11(甲硫氨酸)、13(苏氨酸)、15(亮氨酸)、36(苯丙氨酸)、40(缬氨酸)、43(丝氨酸)、66(精氨酸)、69(丝氨酸)、72(丝氨酸)、79(谷氨酸)、80(丝氨酸)、83(甲硫氨酸)、85(异亮氨酸)、100(丝氨酸)、104(亮氨酸)、106(亮氨酸)和109(脯氨酸)。
7.2.4#11D5重链的人源化(图12和13)
7.2.4.1h#11D5-T1H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T1H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、缬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、68(丝氨酸)、71(精氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.2h#11D5-T2H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T2H”-型重链可变区：用苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、71(精氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.3h#11D5-T3H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T3H”-型重链可变区：用苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.4h#11D5-T4H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T4H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ IDNO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、6(谷氨酸)、7(丝氨酸)、9(脯氨酸)、12(缬氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、68(丝氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.5h#11D5-T5H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T5H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、色氨酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.6(谷氨酸)、7(丝氨酸)、9(脯氨酸)、12(缬氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.6h#11D5-T6H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T6H”-型重链可变区：用谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ IDNO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.7h#11D5-T7H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T7H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、68(丝氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.8h#11D5-T8H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T8H”-型重链可变区：用谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、68(丝氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.9h#11D5-T9H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T9H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、68(丝氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.10h#11D5-T10H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T10H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.11h#11D5-T11H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T11H”-型重链可变区：用谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、苏氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、68(丝氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.12h#11D5-T12H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T12H”-型重链可变区：用谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、67(异亮氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
7.2.4.13h#11D5-T13H-型重链：
通过下列设计的人源化#11D5重链可变区命名为“h#11D5-T13H”-型重链可变区：用谷氨酰胺、谷氨酸、苏氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、赖氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸、丝氨酸、赖氨酸、丝氨酸、丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸和亮氨酸分别置换由序列表的SEQ ID NO：143(图30E)所示的#11D5重链可变区的氨基酸No.1(谷氨酸)、16(谷氨酰胺)、17(丝氨酸)、23(丝氨酸)、25(苏氨酸)、39(赖氨酸)、40(苯丙氨酸)、43(天冬酰胺)、44(赖氨酸)、45(甲硫氨酸)、75(精氨酸)、79(苯丙氨酸)、81(谷氨酰胺)、83(天冬酰胺)、87(苏氨酸)、88(谷氨酸)、92(苏氨酸)、107(缬氨酸)和108(甲硫氨酸)。
实施例8：用于人源化抗体表达的一般目的的载体的构建
8.1用于人源化抗体轻链的表达的载体pEF6KCL的构建
使用质粒pEF6/V5-His B(Invitrogen Corp.)(作为模板)和下列引物进行PCR，以获得紧接BGHpA(2174)至SmaI(2958)的DNA片段(包含f1复制起始点和SV40启动子和起始点的DNA片段；在下文中称为“片段A”)：
5′-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3′(引物EFF1：SEQ ID NO：1)，和
5′-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3′(引物EFsmaR：SEQ IDNO：2)。
通过重叠PCR将获得的片段A连接至包含编码人κ-链分泌信号、人κ-链恒定区和人加poly(A)信号的DNA序列的DNA片段(SEQ ID NO：3；在下文中称为″片段B″)。用限制性内切酶KpnI和Sma I降解将片段A连接至片段B而获得的DNA片段(在下文中称为“片段A+B)”，将其连接至事先用限制性内切酶KpnI和SmaI降解的质粒pEF6/V5-His B(Invitrogen Corp.)以构建人L链表达质粒″pEF6KCL″(图19)，该质粒具有信号序列、克隆位点、编码人κ-链恒定区的序列和人加poly(A)信号序列(在EF1启动子的下游)。
8.2用于人源化抗体重链的表达的载体pEF1/FCCU-1的构建
8.2.1pEF1/KCL的构建
用限制性内切酶KpnI和SmaI降解通过上述方法获得的质粒pEF6KCL。将所得的DNA片段连接至事先用KpnI和SmaI降解的pEF1/myc-His B(Invitrogen Corp.)，以构建质粒pEF1/KCL。
8.2.2pEF1/FCCU-1的构建
用限制性内切酶NheI和PmeI降解包含编码人IgG1的信号序列和恒定区的氨基酸序列的DNA序列的DNA片段(SEQ ID NO：4)，将其连接至事先用限制性内切酶NheI和PmeI降解的质粒pEF1/KCL以构建人重链表达质粒pEF1/FCCU-1，该质粒具有信号序列、克隆位点、人重链恒定区编码序列和人加poly(A)信号序列(在EF1启动子的下游)。
实施例9：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体基因的产生
a)h#11B7-T1L、h#11B7-T2L、h#11B7-T3L、h#11B7-T4L、h#11B7-T5L、h#11B7-T6L、h#11B7-T7L、h#11B7-T8L、h#11B7-T9L、h#11B7-T10L、h#11B7-T11L、h#11B7-T12L和h#11B7-T13L轻链表达载体的构建
合成各DNA(MBL Medical & Biological Laboratories Co.，Ltd，Artificial Gene Synthesis Service)并且用限制性内切酶NheI和BsiWI进行降解，所述DNA包含编码与分泌信号融合的、分别由序列表的SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30的氨基酸No.21至129表示的h#11B7-T1L、h#11B7-T2L、h#11B7-T3L、h#11B7-T4L、h#11B7-T5L、h#11B7-T6L、h#11B7-T7L、h#11B7-T8L、h#11B7-T9L、h#11B7-T10L、h#11B7-T11L、h#11B7-T12L或h#11B7-T13L轻链可变区(图1和2)的基因。将所得的DNA片段分别插入事先已用限制性内切酶NheI和BsiWI降解的、用于人源化抗体轻链表达的通用载体(pEF6KCL)的位点，从而构建h#11B7-T1L、h#11B7-T2L、h#11B7-T3L、h#11B7-T4L、h#11B7-T5L、h#11B7-T6L、h#11B7-T7L、h#11B7-T8L、h#11B7-T9L、h#11B7-T10L、h#11B7-T11L、h#11B7-T12L和h#11B7-T13L轻链表达载体。将所获得的表达载体命名为″pEF6KCL/h#11B7-T1L″、″pEF6KCL/h#11B7-T2L″、″pEF6KCL/h#11B7-T3L″、″pEF6KCL/h#11B7-T4L″、″pEF6KCL/h#11B7-T5L″、″pEF6KCL/h#11B7-T6L″、″pEF6KCL/h#11B7-T7L″、″pEF6KCL/h#11B7-T8L″、″pEF6KCL/h#11B7-T9L″、″pEF6KCL/h#11B7-T10L″、″pEF6KCL/h#11B7-T11L″、″pEF6KCL/h#11B7-T12L″或″pEF6KCL/h#11B7-T13L″，并且各表达载体的插入物分别由序列表的SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17的核苷酸序列表示。
b)h#11B7-T1H、h#11B7-T2H、h#11B7-T3H、h#11B7-T4H、h#11B7-T5H、h#11B7-T6H、h#11B7-T7H、h#11B7-T8H和h#11B7-T9H重链表达载体的构建
合成各DNA(MBL Medical & Biological Laboratories Co.，Ltd，Artificial Gene Synthesis Service)并且用限制性内切酶BlpI进行降解，所述DNA包含编码分别由序列表的SEQ ID NO：40、41、42、43、44、45、46、47或48的氨基酸No.20至132表示的h#11B7-T1H、h#11B7-T2H、h#11B7-T3H、h#11B7-T4H、h#11B7-T5H、h#11B7-T6H、h#11B7-T7H、h#11B7-T8H或h#11B7-T9H重链可变区(图4和5)的基因。将所得的DNA片段分别插入事先已用限制性内切酶BlpI降解的、用于人源化抗体重链表达的通用载体(pEF1/FCCU-1)的位点，从而构建h#11B7-T1H、h#11B7-T2H、h#11B7-T3H、h#11B7-T4H、h#11B7-T5H、h#11B7-T6H、h#11B7-T7H、h#11B7-T8H和h#11B7-T9H重链表达载体。将所获得的表达载体命名为″pEF1/FCCU/h#11B7-T1H″、″pEF1/FCCU/h#11B7-T2H″、″pEF1/FCCU/h#11B7-T3H″、″pEF1/FCCU/h#11B7-T4H″、″pEF1/FCCU/h#11B7-T5H″、″pEF1/FCCU/h#11B7-T6H″、″pEF1/FCCU/h#11B7-T7H″、″pEF1/FCCU/h#11B7-T8H″或″pEF1/FCCU/h#11B7-T9H″，并且各表达载体的插入物分别由序列表的SEQ ID NO：31、32、33、34、35、36、37、38或39的核苷酸序列表示。
实施例10：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体的制备
a)人源化抗体的产生
将处于对数生长期的1.5x108个FreeStyle 293-F细胞接种在100mL的新鲜FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)中，并且在37℃下8％CO2中于培养箱中振荡培养(125rpm)。将1mg聚乙烯亚胺(Polyscience#24765)溶解在4mL的Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中，使其在室温下停留5分钟。将使用PureLinkHiPure Plasmid试剂盒(Invitrogen Corp.)制备的重链表达质粒(0.05mg)和轻链表达质粒(0.15mg)悬浮于4mL Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。向4mL聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合液中加入4mL表达质粒/Opti-Pro SFM混合液，随后在室温下停留5分钟，并再于室温下停留5分钟。然后，向FreeStyle 293-F细胞悬浮液中加入8mL聚乙烯亚胺/表达质粒/Opti-Pro SFM混合液，继续振荡培养。在于37℃下8％CO2中培养7天后，收集培养上清液。
b)人源化抗体的纯化。
利用蛋白质A亲和柱层析纯化在前述段落a)中获得的培养上清液。将100mL培养上清液置于带盖的500-mL烧瓶中，然后向所述烧瓶中加入1mL用PBS平衡的MabSelect SuRe(GE HealthcareBio-science Ltd.)悬浮液(50％浆体)。在培养箱中于10℃下以100rpm搅拌混合物过夜。将FreeStyle 293-F细胞培养上清液/MabSelectSuRe悬浮液应用于5mL的空Zeba Spin柱(PIERCE)。将全部树脂置于柱子中，随后用10mL 1M NaCl清洗。然后，将1mL的1M精氨酸溶液(pH 4.0)应用于其以收集含有抗体的级分。将所述级分加至Centrifugal Filter Device(Amicon Ultra-4，分子量截断值：50K，Millipore Corp.)，然后用柠檬酸盐缓冲液替换溶液，将浓度调整至200μL以制备纯化的样品。
通过pEF6KCL/h#11B7-T1L与pEF1/FCCU/h#11B7-T1H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T1″；通过pEF6KCL/h#11B7-T2L与pEF1/FCCU/h#11B7-T2H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T2″；通过pEF6KCL/h#11B7-T3L与pEF1/FCCU/h#11B7-T3H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T3″；通过pEF6KCL/h#11B7-T4L与pEF1/FCCU/h#11B7-T4H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T4″；通过pEF6KCL/h#11B7-T5L与pEF1/FCCU/h#11B7-T5H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T5″；通过pEF6KCL/h#11B7-T6L与pEF1/FCCU/h#11B7-T6H的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T6″；通过pEF6KCL/h#11B7-T7L与pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T7″；通过pEF6KCL/h#11B7-T8L与pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T8″；通过pEF6KCL/h#11B7-T9L与pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T9″；通过pEF6KCL/h#11B7-T10L与pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T10″；通过pEF6KCL/h#11B7-T11L与pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T11″；通过pEF6KCL/h#11B7-T12L与pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T12″；通过pEF6KCL/h#11B7-T13L与pEF1/FCCU/h#11B7-T7H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T13″；通过pEF6KCL/h#11B7-T7L与pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T14″；通过pEF6KCL/h#11B7-T8L与pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T15″；通过pEF6KCL/h#11B7-T9L与pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T16″；通过pEF6KCL/h#11B7-T10L与pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T17″；通过pEF6KCL/h#11B7-T11L与pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T18″；通过pEF6KCL/h#11B7-T12L与pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T19″；通过pEF6KCL/h#11B7-T13L与pEF1/FCCU/h#11B7-T8H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T20″；通过pEF6KCL/h#11B7-T7L与pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T21″；通过pEF6KCL/h#11B7-T8L与pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T22″；通过pEF6KCL/h#11B7-T9L与pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T23″；通过pEF6KCL/h#11B7-T10L与pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T24″；通过pEF6KCL/h#11B7-T11L与pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T25″；通过pEF6KCL/h#11B7-T12L与pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T26″；以及通过pEF6KCL/h#11B7-T13L与pEF1/FCCU/h#11B7-T9H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T27″。
表1
Figure BDA0000107419500000971
Figure BDA0000107419500000981
实施例11：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的人源化抗体基因的产生
a)h#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、h#11D5-T4L、h#11D5-T5L和h#11D5-T6L轻链表达载体的构建
合成各DNA(MBL Medical & Biological Laboratories Co.，Ltd，Artificial Gene Synthesis Service)并且用限制性内切酶NheI和BsiWI进行降解，所述DNA包含编码与分泌信号融合的、分别由序列表的SEQ ID NO：55、56、57、58、59或60的氨基酸No.21至129表示的h#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、h#11D5-T4L、h#11D5-T5L和h#11D5-T6L轻链可变区(图6)的基因。将所得的DNA片段分别插入事先已用限制性内切酶NheI和BsiWI降解的、用于人源化抗体轻链表达的通用载体(pEF6KCL)的位点，从而构建h#11D5-T1L、h#11D5-T2L、h#11D5-T3L、h#11D5-T4L、h#11D5-T5L和h#11D5-T6L轻链表达载体。将所获得的表达载体命名为″pEF6KCL/h#11D5-T1L″、″pEF6KCL/h#11D5-T2L″、″pEF6KCL/h#11D5-T3L″、″pEF6KCL/h#11D5-T4L″、″pEF6KCL/h#11D5-T5L″或″pEF6KCL/h#11B7-T6L″，并且各表达载体的插入物分别由序列表的SEQ ID NO：49、50、51、52、53或54的核苷酸序列表示。
b)h#11D5-T1H、h#11D5-T2H、h#11D5-T3H、h#11D5-T4H、h#11D5-T5H和h#11D5-T6H重链表达载体的构建
合成各DNA(MBL Medical & Biological Laboratories Co.，Ltd，Artificial Gene Synthesis Service)并且用限制性内切酶BlpI进行降解，所述DNA包含编码分别由序列表的SEQ ID NO：67、68、69、70、71或72的氨基酸No.20至132表示的h#11D5-T1H、h#11D5-T2H、h#11D5-T3H、h#11D5-T4H、h#11D5-T5H或h#11D5-T6H重链可变区(图12)的基因。将所得的DNA片段分别插入事先已用限制性内切酶BlpI降解的、用于人源化抗体重链表达的通用载体(pEF1/FCCU-1)的位点，从而构建h#11D5-T1H、h#11D5-T2H、h#11D5-T3H、h#11D5-T4H、h#11D5-T5H和h#11D5-T6H重链表达载体。将所获得的表达载体命名为″pEF1/FCCU/h#11D5-T1H″、″pEF1/FCCU/h#11D5-T2H″、″pEF1/FCCU/h#11D5-T3H″、″pEF1/FCCU/h#11D5-T4H″、″pEF1/FCCU/h#11D5-T5H″或″pEF1/FCCU/h#11D5-T6H″，并且各表达载体的插入物分别由序列表的SEQ ID NO：61、62、63、64、65或66的核苷酸序列表示。
实施例12：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的人源化抗体的制备
a)人源化抗体的制备
将处于对数生长期的1.5x108个FreeStyle 293-F细胞接种在100mL的新鲜FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen Corp.)中，并且在37℃下8％CO2中于培养箱中振荡培养(125rpm)。将1mg聚乙烯亚胺(Polyscience#24765)溶解在4mL的Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中，使其在室温下停留5分钟。将使用PureLinkHiPure Plasmid试剂盒(Invitrogen Corp.)制备的重链表达质粒(0.05mg)和轻链表达质粒(0.15mg)悬浮于4mL Opti-Pro SFM培养基(Invitrogen Corp.)中。向4mL聚乙烯亚胺/Opti-Pro SFM混合液中加入4mL表达质粒/Opti-Pro SFM混合液，随后在室温下停留5分钟，并再于室温下停留5分钟。然后，向FreeStyle 293-F细胞悬浮液中加入8mL聚乙烯亚胺/表达质粒/Opti-Pro SFM混合液，继续振荡培养。在于37℃下8％CO2中培养7天后，收集培养上清液。
b)人源化抗体的纯化
利用蛋白质A亲和柱层析纯化在前述段落a)中获得的培养上清液。将100mL培养上清液置于带盖的500-mL烧瓶中，然后向所述烧瓶中加入1mL用PBS平衡的MabSelect SuRe(GE HealthcareBio-science Ltd.)悬浮液(50％浆体)。在培养箱中于10℃下以100rpm搅拌混合物过夜。将FreeStyle 293-F细胞培养上清液/MabSelectSuRe悬浮液应用于5mL的空Zeba Spin柱(PIERCE)。将全部树脂置于柱子中，随后用10mL 1M NaCl清洗。然后，将1mL的1M精氨酸溶液(pH 4.0)应用于其以收集含有抗体的级分。将所述级分加至Centrifugal Filter Device(Amicon Ultra-4，分子量截断值：50K，Millipore Corp.)，然后用柠檬酸盐缓冲液替换溶液并且进行浓缩。将终容量调整至200μL以制备纯化的样品。
通过pEF6KCL/h#11D5-T1L与pEF1/FCCU/h#11D5-T1H之间的组合获得的人源化抗体#11D5被命名为″h#11D5-T1″；通过pEF6KCL/h#11D5-T2L与pEF1/FCCU/h#11D5-T2H之间的组合获得的人源化抗体#11D5被命名为″h#11D5-T2″；通过pEF6KCL/h#11D5-T3L与pEF1/FCCU/h#11D5-T3H之间的组合获得的人源化抗体#11D5被命名为″h#11D5-T3″；通过pEF6KCL/h#11D5-T4L与pEF1/FCCU/h#11D5-T4H之间的组合获得的人源化抗体#11D5被命名为″h#11D5-T4″；通过pEF6KCL/h#11D5-T5L与pEF1/FCCU/h#11D5-T5H之间的组合获得的人源化抗体#11D5被命名为″h#11D5-T5″；以及通过pEF6KCL/h#11D5-T6L与pEF1/FCCU/h#11D5-T6H之间的组合获得的人源化抗体#11D5被命名为″h#11D5-T6″。
实施例13：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体对于人AXL-Fc融合蛋白的亲和力的评估
利用下文中显示的方法，就它们对于人AXL-Fc的亲和力评估来源于大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体h#11B7-T1至h#11B7-T27。用PBS将人AXL-Fc(由R&D Systems制造，#154-AL)稀释至1μg/ml。随后，将溶液以100μl/孔的量分配至ImmunoPlate(由Nalge Nunc International K.K.制造，#437111)并且于4℃下静置过夜以将蛋白质吸附至板上。第2天，用PBS-T溶液(PBS和0.05％(v/v)Tween 20)清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量分配用PBS稀释至5％的含有脱脂奶粉的溶液(由Morinaga Milk IndustryCo.，Ltd.制造)，在室温下静置2小时。除去孔中的溶液，用PBS-T溶液清洗孔5次。随后，用含有0.5％脱脂奶粉的PBS溶液以1μg/ml至0.00256ng/ml的终浓度(5-倍稀释系列)分别稀释实施例10中制备的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的纯化的人源化抗体T1至T27。随后，将溶液以100μl/孔的量分配，于室温下静置2小时。在该过程中，按照实施例15测定各抗体的浓度。用PBS-T溶液清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量加入用TBS-T溶液(TBS和0.05％(v/v)Tween20)稀释2500倍的碱性磷酸酶缀合的AffiniPure山羊抗人IgG(由Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.制造，#109-055-097)，在室温下静置1小时。除去孔中的溶液，用TBS-T溶液清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量加入荧光底物溶液(由Roche DiagnosticsK.K.制造，#11681982001)以进行荧光反应。在加入荧光底物溶液后15分钟，使用SpectraMax M5(由Molecular Devices Corp.制造)测量人AXL-Fc吸附的板上的荧光强度。结果，在检查的27个大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体的样品中，#11B7-T1和h#11B7-T4被确认具有比人嵌合抗体的结合活性更低的结合活性。然而，另外25个样品被确认具有与人嵌合抗体的结合活性几乎相等的结合活性(对于人AXL-Fc蛋白，以抗体浓度依赖性的方式)(图19、20、21和22)。
实施例14：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的人源化抗体对于人AXL-Fc融合蛋白的亲和力的评估
利用下文中显示的方法，就它们对于人AXL-Fc的亲和力评估来源于大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的人源化抗体h#11D5-T1至h#11D5-T6。用PBS将人AXL-Fc(由R&D Systems制造，#154-AL)稀释至1μg/ml。随后，将溶液以100l/孔的量分配至Immuno Plate(由Nalge Nunc International K.K.制造，#437111)并且于4℃下静置过夜以将蛋白质吸附至板上。第2天，用PBS-T溶液(PBS和0.05％(v/v)Tween 20)清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量分配用PBS稀释至5％的含有脱脂奶粉的溶液(由Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.制造)，在室温下静置2小时。除去孔中的溶液，用PBS-T溶液清洗孔5次。随后，用含有0.5％脱脂奶粉的PBS溶液以1μg/ml至0.00256ng/ml的终浓度(5-倍稀释系列)分别稀释实施例12中制备的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的纯化的人源化抗体T1至T6。随后，将溶液以100μl/孔的量分配，于室温下静置2小时。在该过程中，按照实施例15测定各抗体浓度。用PBS-T溶液清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量加入用TBS-T溶液(TBS和0.05％(v/v)Tween 20)稀释2500倍的碱性磷酸酶缀合的AffiniPure山羊抗人IgG(由JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.制造，#109-055-097)，在室温下静置1小时。除去孔中的溶液，用TBS-T溶液清洗孔5次。随后，以100l/孔的量加入荧光底物溶液(由Roche Diagnostics K.K.制造，#11681982001)以进行荧光反应。在加入荧光底物溶液后15分钟，使用SpectraMax M5(由Molecular Devices Corp.制造)测量人AXL-Fc吸附的板上的荧光强度。结果，在检查的6个大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的人源化抗体的样品中，h#11D5-T4、h#11D5-T5和h#11D5-T6被确认具有与人嵌合抗体的结合活性几乎相等的结合活性(对于人AXL-Fc蛋白，以抗体浓度依赖性的方式)(图23)。
实施例15：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7和#11D5的人源化抗体的吸收系数计算和直接蛋白质吸光度测定
利用下文中显示的方案测定来源于大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体h#11B7-T1至h#11B7-T27和来源于大鼠抗人AXL单克隆抗体#11D5的h#11D5-T1至h#11D5-T6的蛋白质浓度。使用MX5Automated-S微量天平(METTLER TOLEDO)根据其质量稀释分别在实施例10或12中制备的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7或#11D5的各人源化抗体。在室温下使用石英试池，利用DU-7400UV-vis分光光度计(Beckman Coulter，Inc.)测量每一种抗体在280nm处的吸光度(A280)。利用吸收系数测定各抗体的蛋白质浓度。使用软件Sednterp测定各抗体的吸收系数，所述软件可美国国立卫生研究院的网站(http://jphilo.mailway.com/download.htm)下载。结果描述于图24(上图，对于h#11B7-T1至h#11B7-T14；下图，对于h#11B7-T15至h#11B7-T27)和图25(对于h#11D5-T1至h#11D5-T6)中。
实施例16：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的结合位点(表位)的确定
a)人AXL串联IG结构域的表达和纯化
将编码包含连接至N末端His标签和凝血酶识别序列的人AXL IG结构域(NCBI蛋白质数据库登录号P_30530：SEQ ID NO：139中的氨基酸No.26-220)的蛋白质的DNA整合在载体pDEST14(InvitrogenCorp.，catalog No.：11801-016)中。用该质粒转化大肠杆菌(E.coli)Rosetta-gami B(DE3)(Novagen，catalog No.：71136-4)，并在TB培养基(Invitrogen Corp.，catalog No.：22711-022)中进行培养。将所培养的细菌细胞超声破碎，离心，使用HisTrap HP柱(GEHealthcare，catalog No.：17-5247-01)纯化上清液。混合洗脱液，利用PD-10柱(GE Healthcare，catalog No.：17-0851-01)脱盐，随后利用凝血酶(Sigma-Aldrich，catalog No.：T-7009)切割His标签。然后将经切割的蛋白质经历MONO Q 5/50GL(GE Healthcare，catalogNo.：17-5166-01)和Superdex 75 10/300柱(GE Healthcare，catalogNo.：17-5174-01)，直至获得具有21kDa分子量的单个条带。
b)人AXL单IG结构域的表达和纯化
将编码包含连接至N末端His标签和Factor Xa识别序列的人AXLIG结构域(NCBI蛋白质数据库登录号P_30530中的氨基酸No.26-131和129-220)的蛋白质的DNA整合在载体pDEST14(Invitrogen Corp.，catalog No.：11801-016)中。用该质粒转化大肠杆菌Rosetta-gamiB(DE3)(Novagen，catalog No.：71136-4)，并在TB培养基(Invitrogen Corp.，catalog No.：22711-022)中进行培养。将所培养的细菌细胞超声破碎，离心，使用HisTrap HP柱(GE Healthcare，catalog No.：17-5247-01)纯化上清液。随后使用Superdex 75 10/300柱(GE Healthcare，catalog No.：17-5174-01)通过电泳纯化人AXL IG结构域，直至获得具有11kDa分子量的单个条带。
c)大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7在人AXL-IG结构域上的结合位点(表位)的确定
利用下列方法评估大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7在人AXL-IG结构域上的结合位点(表位)：用PBS分别将包含人AXL的2个IG结构域(NHis-hAXL26-131和NHis-hAXL129-220)中的任一个的肽和包含人AXL的两个IG结构域(hAXL26-220)的肽稀释至1μg/ml。随后，将各溶液以100μl/孔的量分配至Immuno Plate(由Nalge NuncInternational K.K.制造，#437111)并且于4℃下静置过夜以将肽吸附至板上。第2天，用PBS-T溶液(PBS和0.05％(v/v)Tween 20)清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量分配用PBS稀释至5％的含有脱脂奶粉的溶液(由Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.制造)，在室温下静置2小时。除去孔中的溶液，用PBS-T溶液清洗孔5次。用含有0.5％脱脂奶粉的PBS溶液将大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7稀释至0.04μg/ml。随后，将溶液以100μl/孔的量分配，于室温下静置2小时。用PBS-T溶液清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量加入用TBS-T溶液(TBS和0.05％(v/v)Tween 20)稀释2500倍的碱性磷酸酶缀合的AffiniPure山羊抗人IgG(由Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.制造，#109-055-097)，在室温下静置1小时。除去孔中的溶液，用TBS-T溶液清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量加入荧光底物溶液(由Roche Diagnostics K.K.制造，#11681982001)以进行荧光反应。在加入荧光底物溶液后15分钟，使用SpectraMax M5(由MolecularDevices Corp.制造)测量人AXL-IG结构域吸附的板上的荧光强度。作为ELISA的结果，只有hAXL26-220和NHis-hAXL129-220被确认具有结合活性。因此证实，在人AXL的2个IG结构域中，大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的表位是更接近于羧基端的结构域(包含NCBI蛋白质数据库登录号P_30530：SEQ ID NO：139；图30A中的氨基酸No.129-220的氨基酸残基的结构域)(图26)。
实施例17：本发明的人源化抗AXL抗体体外抑制配体诱导的AXL磷酸化
由生长停滞特异性基因6，Gas6编码的蛋白质代表了受体酪氨酸激酶AXL的天然配体。Gas6与AXL的结合导致通过增加的受体酪氨酸激酶磷酸化水平反映的受体激活。进行实施例17中描述的实验以阐明本发明的人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6干扰Gas6-介导的受体酪氨酸激酶AXL的激活的潜能。
实施例17.1：本发明的人源化抗AXL抗体体外抑制配体诱导的AXL磷酸化，如通过ELISA测定的
进行ELISA实验以研究本发明的人源化抗AXL抗体是否能够阻止配体Gas6-诱导的AXL的磷酸化。简而言之，在第1天，将3x104个细胞/孔于正常生长培养基中接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。同样地，还在4℃下用2μg/ml的在PBS中的小鼠抗磷酸酪氨酸抗体4G10包被黑色Maxi-Sorp 96孔板(Nunc)过夜。在第3天，除去4G10抗体溶液，用PBS，0.5％BSA在室温下封闭Maxi-Sorp孔，进行至少4小时。平行地，用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Sigma)、嵌合抗AXL mAb#11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6在37℃下预温育细胞3小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)在37℃下处理15分钟。然后弃去培养基，在冰上于补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％TritonX-100)中裂解细胞30分钟。同时，除去封闭缓冲液，在将裂解物转移和于4℃下温育过夜之前，用清洗缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次。在第4天用清洗缓冲液清洗板6次后，在室温下用0.5μg/ml的在PBS中的生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7温育孔，进行2小时。用清洗缓冲液清洗板6次，向各孔中加入以1∶4,000稀释于PBS中的AP缀合的链霉抗生物素蛋白(Chemicon#SA110)，在室温下温育30分钟。之后，用清洗缓冲液清洗孔6次，加入AttoPhos底物溶液(Roche#11681982)。通过使用Victor板读取器(PerkinElmer)，在430nm的激发波长和580nm的发射波长处收集各孔的荧光。
图27显示该实验对于Hs578T乳腺癌细胞的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，嵌合抗AXL抗体#11B7以及本发明的人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够在Hs578T乳腺癌细胞中阻止或显著减少Gas6介导的AXL激活，如由减少的AXL酪氨酸磷酸化水平所显示的。在过表达AXL的NIH3T3-AXL cl.7成纤维细胞、肺癌细胞系NCI-H292、黑色素瘤细胞系C-8161以及前列腺癌细胞系PC-3和DU-145中，对于相同的抗体组观察到相似的作用。
实施例17.2：本发明的人源化抗AXL抗体体外抑制配体诱导的AXL磷酸化，如通过Western印迹分析所测定的
此外，进行Western印迹分析以确认所述人源化抗体干扰配体Gas6诱导的AXL激活的能力。为此，在第1天将1.5x106个Hs578T乳腺癌细胞接种在10cm培养皿上。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。在第3天，用10μg/mlGammagard对照抗体(Sigma)、嵌合抗AXL mAb#11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6于37℃下预温育细胞3小时，随后用或不用400ng/ml Gas6(R&DSystems)于37℃处理15分钟。之后，除去培养基，将细胞在冰上于1ml补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟，通过在4℃下以10,000xg离心10分钟除去细胞碎片。为了进行免疫沉淀，测定上清液的蛋白质浓度，将500μg全细胞裂解物与30μl蛋白质A-sepharose悬浮液和1μg大鼠抗AXL单克隆抗体12B7一起在旋转轮上于4℃下温育3小时。用0.7ml冷的HNTG缓冲液(20mM HEPES pH 7.5，150mM NaCl，0.1％Triton-X-100，10％甘油和10mM Na4P2O7)清洗沉淀3次，将其悬浮，并于40μl 3xSDSLaemmli样品缓冲液中煮沸，然后经历SDS PAGE。对于Western印迹分析，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。之后，用NET-Gelatine封闭膜，将其与小鼠单克隆抗磷酸酪氨酸一抗4G10(Upstate)一起温育过夜。在第2天用NET-Gelatine清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗小鼠二抗一起在室温下温育1小时，随后用NET-Gelatine再清洗3次。按照制造商的说明书(GE Healthcare)使用化学发光检测试剂盒，最终将滤膜暴露于胶片(Kodak)。之后，用抗AXL抗体再探测相同的滤膜。
图27显示该实验的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体#11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够在Hs578T乳腺癌细胞中阻止或显著减少Gas6诱导的AXL激活，如降低的AXL酪氨酸磷酸化水平所显示的。
实施例18：本发明的人源化抗AXL抗体体外抑制配体诱导的AXL下游信号转导分子的磷酸化
Gas6诱导的受体酪氨酸激酶Axl的激活不仅反映在Axl本身的增加的酪氨酸磷酸化水平，而且还与下游信号转导级联包括ERK1/2和PKB/AKT途径的诱导相关。因此，我们继续实验以说明本发明的人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6干扰Gas6介导的ERK1和ERK2以及AKT的激活的潜能。此外，我们还发现，在用Gas6刺激后，信号转导分子GSK-3β、TSC2、mTOR和S6K1的磷酸化状态也被调节，从而还研究了本发明的人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6对此类分子的抑制作用。
实施例18.1：本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制配体诱导的ERK1/2的磷酸化
进行Western印迹分析以研究本发明的人源化抗体是否具有干扰Gas6诱导的ERK1/2激活的潜能。Gas6介导的ERK1/2的激活反映为在其位置Thr202和Tyr204上的增加的磷酸化水平。为此，在第1天将5x106个Hs578T乳腺癌细胞或3x106个NCI-H292肺癌细胞接种在10cm培养皿上。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。在第3天，用10μg/ml Gammagard对照抗体(Baxter)、嵌合抗Axl mAb chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6于37℃下预温育细胞3小时，随后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)于37℃处理15分钟。之后，除去培养基，将细胞在冰上于800μl补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟，通过在4℃下以10,000xg离心10分钟除去细胞碎片。测定上清液的蛋白质浓度，将50μg全细胞裂解物悬浮于3xSDS Laemmli样品缓冲液中并且煮沸，经历SDS PAGE。在将蛋白质转移至硝酸纤维素膜后，用NET-Gelatine封闭膜，将其与兔多克隆抗磷酸p44/42MAP激酶(Thr202/Tyr204)一抗(Cell Signaling Technologies，#9101)一起温育过夜。在第2天用NET-Gelatine清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗兔二抗(Dianova，#111-036-045)一起在室温下温育1小时，随后用NET-Gelatine再清洗3次。按照制造商的说明书(GE Healthcare)使用化学发光检测试剂盒，最终将滤膜暴露于胶片(Kodak)。之后，用抗p44/42MAP激酶抗体(Santa Cruz K-23，#sc-153)再探测相同的滤膜。
图28A显示该实验的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够在Hs578T乳腺癌细胞中干扰微弱的、Gas6诱导的ERK1/2激活的增加。然而，由于该细胞系中ERK1/2的高基础活性，因此通过Gas6刺激的细胞中减少的ERK1/2Thr202/Tyr204磷酸化水平(相对于相应的非刺激的细胞)显示的这些作用仅显得相对普通(顶部)。相反地，在NCI-H292肺癌细胞(底部)中，嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5或h#11B7-T6对ERK1/2Thr202/Tyr204磷酸化的抑制作用得到清楚得多的反映。
实施例18.2：本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制配体诱导的AKT的磷酸化
进行Western印迹分析以研究本发明的人源化抗体是否具有干扰Gas6诱导的AKT的激活的潜能。Gas6介导的AKT激活反映为在其位置Ser473上的增加的磷酸化水平。为此，在第1天将5x106个Hs578T乳腺癌细胞或3x106个NCI-H292肺癌细胞接种在10cm培养皿上。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。在第3天，用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Baxter)、嵌合抗AxlmAb chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6于37℃下预温育细胞3小时，随后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)于37℃处理15分钟。之后，除去培养基，将细胞在冰上于800μl补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟，通过在4℃下以10,000xg离心10分钟除去细胞碎片。测定上清液的蛋白质浓度，将50μg全细胞裂解物悬浮于3xSDS Laemmli样品缓冲液中并且煮沸，经历SDS PAGE。在将蛋白质转移至硝酸纤维素膜后，用NET-Gelatine封闭膜，将其与兔多克隆抗AKT1/2/3一抗(CellSignaling Technologies，#9272)一起温育过夜。在第2天用NET-Gelatine清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗兔二抗(Dianova，#111-036-045)一起在室温下温育1小时，随后用NET-Gelatine再清洗3次。按照制造商的说明书(GE Healthcare)使用化学发光检测试剂盒，最终将滤膜暴露于胶片(Kodak)。之后，用抗磷酸AKT(Ser473)抗体(Cell Signaling Technologies，#9271)再探测相同的滤膜。
图28B显示本实验的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够显著减少Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)中Gas6-诱导的AKT激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的AKTSer473磷酸化水平所显示的。
实施例18.3：本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制配体诱导的GSK-3β的磷酸化
进行Western印迹分析以研究本发明的人源化抗体是否具有干扰Gas6诱导的GSK-3β的激活的潜能，所述Gas6诱导的GSK-3β的激活反映为在其位置Ser9上的增加的磷酸化水平。为此，在第1天将5x106个Hs578T乳腺癌细胞或3x106个NCI-H292肺癌细胞接种在10cm培养皿上。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。在第3天，用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Baxter)、嵌合抗Axl mAb chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6于37℃下预温育细胞3小时，随后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)于37℃处理15分钟。之后，除去培养基，将细胞在冰上于800μl补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟，通过在4℃下以10,000xg离心10分钟除去细胞碎片。测定上清液的蛋白质浓度，将50μg全细胞裂解物悬浮于3xSDS Laemmli样品缓冲液中并且煮沸，经历SDS PAGE。在将蛋白质转移至硝酸纤维素膜后，用NET-Gelatine封闭膜，将其与兔多克隆抗磷酸GSK-3β(Ser9)一抗(Cell Signaling Technologies，#9336)一起温育过夜。在第2天用NET-Gelatine清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗兔二抗(Dianova，#111-036-045)一起在室温下温育1小时，随后用NET-Gelatine再清洗3次。按照制造商的说明书(GE Healthcare)使用化学发光检测试剂盒，最终将滤膜暴露于胶片(Kodak)。之后，用抗GSK-3β抗体(BectonDickinson，#610201)和HRP缀合的抗小鼠二抗(Dianova，#315-036-045)再探测相同的滤膜。
图28C显示本实验的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够显著减少Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)中Gas6-诱导的GSK-3β激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的GSK-3βSer9磷酸化水平所显示的。
实施例18.4：本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制配体诱导的TSC2的磷酸化
进行Western印迹分析以研究本发明的人源化抗体是否具有干扰Gas6诱导的和PI3K/AKT介导的TSC2在其氨基酸残基Thr1462上的磷酸化的潜能。TSC2在Thr1462上的磷酸化通常与TSC复合物的肿瘤抑制功能的抑制相关并且，因此与下游mTOR途径的活化相关。简而言之，在第1天将5x106个Hs578T乳腺癌细胞或3x106个NCI-H292肺癌细胞接种在10cm培养皿上。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。在第3天，用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Baxter)、嵌合抗Axl mAb chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6于37℃下预温育细胞3小时，随后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)于37℃处理15分钟。之后，除去培养基，将细胞在冰上于800μl补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟，通过在4℃下以10,000xg离心10分钟除去细胞碎片。测定上清液的蛋白质浓度，将50μg全细胞裂解物悬浮于3xSDS Laemmli样品缓冲液中并且煮沸，经历SDS PAGE。在将蛋白质转移至硝酸纤维素膜后，用NET-Gelatine封闭膜，将其与兔多克隆抗TSC2一抗(CellSignaling Technologies，#3612)一起温育过夜。在第2天用NET-Gelatine清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗兔二抗(Dianova，#111-036-045)一起在室温下温育1小时，随后用NET-Gelatine再清洗3次。按照制造商的说明书(GE Healthcare)使用化学发光检测试剂盒，最终将滤膜暴露于胶片(Kodak)。之后，用抗磷酸TSC2(Thr1462)抗体(Cell Signaling Technologies，#3617)再探测相同的滤膜。
图28D显示本实验的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够显著减少Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)中Gas6-诱导的TCS2在Thr1462上的磷酸化，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的该氨基酸残基的磷酸化水平所显示的。
实施例18.5：本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制配体诱导的mTOR的磷酸化
鉴于对TSC2磷酸化的作用，进行Western印迹分析以研究本发明的人源化抗体是否也确实具有干扰Gas6诱导的mTOR的激活的潜能。Gas6介导的mTOR激活反映为在其位置Ser2448上的增加的磷酸化水平。为此，在第1天将5x106个Hs578T乳腺癌细胞或3x106个NCI-H292肺癌细胞接种在10cm培养皿上。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。在第3天，用10μg/ml Gammagard对照抗体(Baxter)、嵌合抗Axl mAb chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6于37℃下预温育细胞3小时，随后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)于37℃处理15分钟。之后，除去培养基，将细胞在冰上于800μl补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟，通过在4℃下以10,000xg离心10分钟除去细胞碎片。测定上清液的蛋白质浓度，将50μg全细胞裂解物悬浮于3xSDS Laemmli样品缓冲液中并且煮沸，经历SDS PAGE。在将蛋白质转移至硝酸纤维素膜后，用NET-Gelatine封闭膜，将其与兔多克隆抗磷酸mTOR(Ser2448)一抗(Cell Signaling Technologies，#2971)一起温育过夜。在第2天用NET-Gelatine清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗兔二抗(Dianova，#111-036-045)一起在室温下温育1小时，随后用NET-Gelatine再清洗3次。按照制造商的说明书(GE Healthcare)使用化学发光检测试剂盒，最终将滤膜暴露于胶片(Kodak)。之后，用抗mTOR激酶抗体(Cell Signaling Technologies，#2972)再探测相同的滤膜。
图28E显示本实验的代表性结果。抗AXL抗体的抑制作用在Hs578T乳腺癌细胞(顶部)中相对较弱。然而，与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6能够干扰NCI-H292肺癌细胞中Gas6-诱导的mTOR激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的mTOR Ser2448磷酸化水平所显示的(底部)。
实施例18.6：本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制配体诱导的S6K1的磷酸化
最后，进行Western印迹分析以研究本发明的人源化抗体是否具有干扰Gas6诱导的S6K1的激活的潜能。Gas6介导的S6K1激活反映为在其位置Thr421和Ser424上的增加的磷酸化水平。为此，在第1天将5x106个Hs578T乳腺癌细胞或3x106个NCI-H292肺癌细胞接种在10cm培养皿上。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。在第3天，用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Baxter)、嵌合抗Axl mAb chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6于37℃下预温育细胞3小时，随后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)于37℃处理15分钟。之后，除去培养基，将细胞在冰上于800μl补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟，通过在4℃下以10,000xg离心10分钟除去细胞碎片。测定上清液的蛋白质浓度，将50μg全细胞裂解物悬浮于3xSDS Laemmli样品缓冲液中并且煮沸，经历SDS PAGE。在将蛋白质转移至硝酸纤维素膜后，用NET-Gelatine封闭膜，将其与兔多克隆抗磷酸p70 S6激酶1(Thr421/Ser424)一抗(Cell Signaling Technologies，#9204)一起温育过夜。在第2天用NET-Gelatine清洗3次后，将膜与HRP-缀合的抗兔二抗(Dianova，#111-036-045)一起在室温下温育1小时，随后用NET-Gelatine再清洗3次。按照制造商的说明书(GE Healthcare)使用化学发光检测试剂盒，最终将滤膜暴露于胶片(Kodak)。之后，用抗β肌动蛋白抗体(Cell Signaling Technologies，#4967)再探测相同的滤膜。
图28F显示本实验的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6在Hs578T乳腺癌细胞中对Gas6-诱导的S6K1激活显示一定的抑制作用，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的S6K1 Thr421/Ser424磷酸化水平所显示的(顶部)。然而，可在NCI-H292肺癌细胞(底部)中观察到，在用本发明的嵌合抗AXL抗体chm11B7以及人源化抗AXL抗体h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5或h#11B7-T6预处理后，Gas6-诱导的S6K1 Thr421/Ser424磷酸化和激活的下降强得多。
实施例19：本发明的人源化11D5抗AXL抗体体外抑制配体诱导的Axl磷酸化，如通过ELISA测定的
除了表征人源化h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5和h#11B7-T6抗Axl mAb系列外，进行ELISA实验以研究本发明的人源化抗AXL抗体h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5和h#11D5-T6干扰Gas6-诱导的受体酪氨酸激酶Axl的磷酸化和激活的潜能。
简而言之，在第1天，将3x104个Hs578T乳腺癌细胞/孔于正常生长培养基中接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。同样地，还在4℃下用2μg/ml的在PBS中的小鼠抗磷酸酪氨酸抗体4G10包被黑色Maxi-Sorp 96孔板(Nunc)过夜。在第3天，除去4G10抗体溶液，用封闭缓冲液(PBS，0.5％BSA)在室温下封闭Maxi-Sorp孔，进行至少4小时。平行地，用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Baxter)、嵌合抗AXL mAb chm11D5以及人源化抗AXL抗体h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5和h#11D5-T6在37℃下预温育细胞3小时，然后用或不用400ng/mlGas6(R&D Systems)在37℃下处理15分钟。然后弃去培养基，将细胞在冰上于每孔110μl补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟。同时，除去封闭缓冲液，在将每孔100μl裂解物转移和于4℃下温育过夜之前，用清洗缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次。在第4天用清洗缓冲液清洗板6次后，在室温下用0.125μg/ml的在稀释缓冲液(20mM Tris，50mM NaCl，pH7.3，0.05％Tween 20，0.1％BSA)中的生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7温育孔，进行2小时。用清洗缓冲液清洗板6次，向各孔中加入以1∶20000稀释于稀释缓冲液中的AP缀合的链霉抗生物素蛋白(Chemicon #SA110)，在室温下温育30分钟。之后，用清洗缓冲液清洗孔6次，加入AttoPhos底物溶液(Roche#11681982)。通过使用SpectraMax-GeminiEM板读取器(Molecular Devices)，在430nm的激发波长和580nm的发射波长处收集各孔的荧光。
图29显示该实验的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的嵌合抗AXL抗体chm11D5以及人源化抗AXL抗体h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5和h#11D5-T6能够阻止或显著减少Gas6-介导的Axl激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的Axl酪氨酸磷酸化水平所显示的。
实施例20：本发明的大鼠和嵌合抗AXL抗体在体外抑制配体诱导的Axl磷酸化至相似的程度
作为本发明的部分，产生大鼠抗AXL抗体11B7和11D5的嵌合衍生物(参见上文)。为了研究本发明的大鼠抗AXL抗体和本发明的相应嵌合抗AXL抗体是否能够体外抑制配体Gas6-介导的Axl激活至相似的程度，在CaSki宫颈癌细胞上进行ELISA实验。从而通过增加的受体酪氨酸磷酸化来检测Gas6介导的Axl激活。简而言之，在第1天，将3x104个细胞/孔于正常生长培养基中接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。同样地，还在4℃下用2μg/ml的在PBS中的小鼠抗磷酸酪氨酸抗体4G10包被黑色Maxi-Sorp 96孔板(Nunc)过夜。在第3天，除去4G10抗体溶液，用PBS，0.5％BSA在室温下封闭Maxi-Sorp孔，进行至少4小时。平行地，用50ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、750ng/ml、1μg/ml和10μg/ml的大鼠抗AXL抗体11B7或嵌合抗AXL抗体ch11B7在37℃下预温育细胞3小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)在37℃下处理10分钟。然后弃去培养基，在冰上于补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解细胞30分钟。同时，除去封闭缓冲液，在将裂解物转移和于4℃下温育过夜之前，用清洗缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次。在第4天用清洗缓冲液清洗板6次后，在室温下用0.5μg/ml的在PBS中的生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7温育孔，进行2小时。用清洗缓冲液清洗板6次，向各孔中加入以1∶4,000稀释于PBS中的AP缀合的链霉抗生物素蛋白(Chemicon#SA110)，在室温下温育30分钟。之后，用清洗缓冲液清洗孔6次，加入AttoPhos底物溶液(Roche#11681982)。通过使用Victor板读取器(Perkin Elmer)，在430nm的激发波长和580nm的发射波长处收集各孔的荧光。图31显示对于宫颈癌细胞系CaSki的该实验的代表性结果。如通过相对Axl磷酸化的浓度依赖性减少所显示的，大鼠抗AXL抗体11B7(A)和本发明的嵌合抗AXL抗体ch11B7(B)能够阻止配体诱导的受体酪氨酸激酶Axl的激活至相似的程度。应用相同的实验设置，在黑色素瘤细胞系C-8161中观察到相当的作用。
实施例21：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体基因的产生
a)h#11B7-T15L和h#11B7-T18L，轻链表达载体的构建
合成各DNA(MBL Medical & Biological Laboratories Co.，Ltd，Artificial Gene Synthesis Service)并且用限制性内切酶NheI和BsiWI进行降解，所述DNA包含编码与分泌信号融合的、分别由序列表的SEQ ID NO：146或147的氨基酸No.21至129表示的#11B7-T15L或h#11B7-T18L轻链可变区(图32A)的基因。将所得的DNA片段分别插入事先已用限制性内切酶NheI和BsiWI降解的、用于人源化抗体轻链表达的通用载体(pEF6KCL)的位点，从而构建h#11B7-T15L和h#11B7-T18L轻链表达载体。将所获得的表达载体命名为″pEF6KCL/h#11B7-T15L″或″pEF6KCL/h#11B7-T18L″，并且各表达载体的插入物分别由序列表的SEQ ID NO：144或145的核苷酸序列表示。
b)h#11B7-T11H或h#11B7-T12H重链表达载体的构建
合成各DNA(MBL Medical & Biological Laboratories Co.，Ltd，Artificial Gene Synthesis Service)并且用限制性内切酶BlpI进行降解，所述DNA包含编码分别由序列表的SEQ ID NO：150或151的氨基酸No.20至132表示的h#11B7-T11H或h#11B7-T12H重链可变区(图32B)的基因。将所得的DNA片段分别插入事先用限制性内切酶BlpI降解的、用于人源化抗体重链表达的通用载体(pEF1/FCCU-1)的位点，从而构建h#11B7-T11H和h#11B7-T12H重链表达载体。所获得的表达载体命名为″pEF1/FCCU/h#11B7-T11H″或″pEF1/FCCU/h#11B7-T12H″，并且各表达载体的插入物分别由序列表的SEQ ID NO：148或149的核苷酸序列表示。
实施例22：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体的制备
a)人源化抗体的产生
参见实施例10的a)。
b)人源化抗体的纯化
利用蛋白质A亲和柱层析纯化在前述段落a)中获得的培养上清液。将100mL培养上清液置于带盖的500-mL烧瓶中，然后向所述烧瓶中加入1mL用PBS平衡的MabSelect SuRe(GE HealthcareBio-science Ltd.)悬浮液(50％浆体)。在培养箱中于10℃下以100rpm搅拌混合物过夜。将FreeStyle 293-F细胞培养上清液/MabSelectSuRe悬浮液应用于5mL的空Zeba Spin柱(PIERCE)。将全部树脂置于柱子中，随后用10mL 1M NaCl清洗。然后，将1mL的1M精氨酸溶液(pH 4.0)应用于其以收集含有抗体的级分。将所述级分加至Centrifugal Filter Device(Amicon Ultra-4，分子量截断值：50K，Millipore Corp.)，然后用柠檬酸盐缓冲液替换溶液，将浓度调整至200μL以制备纯化的样品。
通过pEF6KCL/h#11B7-T15L与pEF1/FCCU/h#11B7-T11H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T28″；通过pEF6KCL/h#11B7-T18L与pEF1/FCCU/h#11B7-T11H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T29″；通过pEF6KCL/h#11B7-T15L与pEF1/FCCU/h#11B7-T12H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T30″；通过pEF6KCL/h#11B7-T18L与pEF1/FCCU/h#11B7-T12H之间的组合获得的人源化抗体#11B7被命名为″h#11B7-T31″。
表2
  h#11B7   H质粒   L质粒
  h#11B7-T28   pEF1/FCCU/h#11B7-T11H   pEF6KCL/h#11B7-T15L
  h#11B7-T29   pEF1/FCCU/h#11B7-T11H   pEF6KCL/h#11B7-T18L
  h#11B7-T30   pEF1/FCCU/h#11B7-T12H   pEF6KCL/h#11B7-T15L
  h#11B7-T31   pEF1/FCCU/h#11B7-T12H   pEF6KCL/h#11B7-T18L
实施例23：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体对于人AXL-Fc融合蛋白的亲和力的评估
利用下文中显示的方法，就它们对于人AXL-Fc的亲和力评估来源于大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体h#11B7-T28至h#11B7-T31。用PBS将人AXL-Fc(由R&D Systems制造，#154-AL)稀释至1μg/ml。随后，将溶液以100μl/孔的量分配至ImmunoPlate(由Nalge Nunc International K.K.制造，#437111)并且于4℃下静置过夜以将蛋白质吸附至板上。第2天，用PBS-T溶液(PBS和0.05％(v/v)Tween 20)清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量分配用PBS稀释至5％的含有脱脂奶粉的溶液(由Morinaga Milk IndustryCo.，Ltd.制造)，在室温下静置2小时。除去孔中的溶液，用PBS-T溶液清洗孔5次。随后，用含有0.5％脱脂奶粉的PBS溶液以1μg/ml至0.00256ng/ml的终浓度(5-倍稀释系列)分别稀释实施例10中制备的大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的纯化的人源化抗体T28至T31。随后，将溶液以100μl/孔的量分配，于室温下静置2小时。在该过程中，按照实施例15测定各抗体浓度。用PBS-T溶液清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量加入用TBS-T溶液(TBS和0.05％(v/v)Tween 20)稀释2500倍的碱性磷酸酶缀合的AffiniPure山羊抗人IgG(由Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.制造，#109-055-097)，在室温下静置1小时。除去孔中的溶液，用TBS-T溶液清洗孔5次。随后，以100μl/孔的量加入荧光底物溶液(由Roche DiagnosticsK.K.制造，#11681982001)以进行荧光反应。在加入荧光底物溶液后15分钟，使用SpectraMax M5(由Molecular Devices Corp.制造)测量人AXL-Fc吸附的板上的荧光强度。结果，大鼠抗人AXL单克隆抗体的人源化抗体h#11B7-T28至#11B7-T31被确认具有与人嵌合抗体的结合活性几乎相等的结合活性(对于人AXL-Fc蛋白，以抗体浓度依赖性的方式)(图19和33)。
实施例24：大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体的HPLC测定
利用下文中显示的方案，测定来源于大鼠抗人AXL单克隆抗体#11B7的人源化抗体h#11B7-T28至h#11B7-T31的蛋白质浓度。将各人源化抗体样品注射至尺寸排阻柱(Tosoh SW3000XL)上，利用所得的各抗体的HPLC(Agilent 1200SL)峰面积和吸收系数测定蛋白质浓度，使用tigatuzumab(IgG1型人源化抗人DR5单克隆抗体)的样品作为标准。利用实施例15中描述的直接吸收方案测定tigatuzumab抗体标准样品的浓度。结果概述于图34中。
实施例25：使用差示扫描量热法(DSC)测量人源化抗体的热稳定性
用于比较抗体性质的指数的一个实例可包括抗体稳定性。抗体稳定性的指数的实例可包括热稳定性。
具有低热变性中点(Tm)的抗体极可能变性。变性抗体易于聚集并且还被认为具有增加的抗原性。相反地，具有高Tm的抗体不易变性(解折叠)或失活并且可被制备成可稳定地长期贮存在的液体制剂。
差示扫描量热法(DSC)是可快速精确地测量Tm的仪器，所述Tm可用作蛋白质的相对结构稳定性的良好指数。可使用DSC测量Tm值，可比较这些测量的值，从而测定它们之间的热稳定性的差异。
测量h#11B7-T1、h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、h#11B7-T6、h#11B7-T7、h#11B7-T8、h#11B7-T9、h#11B7-T10、h#11B7-T11、h#11B7-T12、h#11B7-T13、h#11B7-T14、h#11B7-T15、h#11B7-T16、h#11B7-T17、h#11B7-T18、#11B7-T19、h#11B7-T20、h#11B7-T21、h#11B7-T22、h#11B7-T23、h#11B7-T24、h#11B7-T25、h#11B7-T26、h#11B7-T27、h#11B7-T28、h#11B7-T29、h#11B7-T30、h#11B7-T31和嵌合体11B7的热稳定性。分别将这些样品调整至0.5mg/mL的浓度(CBS溶液)，将其400μL的等分用作DSC测量中的样品溶液。如下设置DSC测量条件：起始温度：20℃，最终温度：100℃，以及升温速度：60℃/1小时，过滤时间：10秒。将CBS用作参照溶液。由MicroCal Inc.，US制造的VP-毛细管DSC平台用作DSC测量仪器。通过从获自样品溶液的扫描曲线扣除基线(通过将参照溶液加载至样品池而获得的扫描曲线)来进行基线校正。
图35(1)显示h#11B7-T1的热谱图(thermogram)；图35(2)显示h#11B7-T2的热谱图；图35(3)显示h#11B7-T3的热谱图；图35(4)显示h#11B7-T4的热谱图；图35(5)显示h#11B7-T5的热谱图；图35(6)显示h#11B7-T6的热谱图；图35(7)显示h#11B7-T7的热谱图；图35(8)显示h#11B7-T8的热谱图；图35(9)显示h#11B7-T9的热谱图；图35(10)显示h#11B7-T10的热谱图；图35(11)显示h#11B7-T11的热谱图；图35(12)显示h#11B7-T12的热谱图；图35(13)显示h#11B7-T13的热谱图；图35(14)显示h#11B7-T14的热谱图；图35(15)显示h#11B7-T15的热谱图；图35(16)显示h#11B7-T16的热谱图；图35(17)显示h#11B7-T17的热谱图；图35(18)显示h#11B7-T18的热谱图；图35(19)显示h#11B7-T19的热谱图；图35(20)显示h#11B7-T20的热谱图；图35(21)显示h#11B7-T21的热谱图；图35(22)显示h#11B7-T22的热谱图；图35(23)显示h#11B7-T23的热谱图；图35(24)显示h#11B7-T24的热谱图；图35(25)显示h#11B7-T25的热谱图；图35(26)显示h#11B7-T26的热谱图；图35(27)显示h#11B7-T27的热谱图；图35(28)显示h#11B7-T28的热谱图；图35(29)显示h#11B7-T29的热谱图；图35(30)显示h#11B7-T30的热谱图；图35(31)显示h#11B7-T31的热谱图；和图35(32)显示嵌合体h#11B7的热谱图。
在本说明书中，完整热谱图中峰顶的值被定义为Fab区的热变性中点Tm。测量结果显示，h#11B7-T1具有71.6℃的Tm；h#11B7-T2具有77.2℃的Tm；h#11B7-T3具有73.0℃的Tm；h#11B7-T4具有70.2℃的Tm；h#11B7-T5具有73.1℃的Tm；h#11B7-T6具有79.0℃的Tm；h#11B7-T7具有76.5℃的Tm；h#11B7-T8具有83.5℃的Tm；h#11B7-T9具有82.5℃的Tm；h#11B7-T10具有77.4℃的Tm；h#11B7-T11具有83.5℃的Tm；h#11B7-T12具有76.6℃的Tm；h#11B7-T13具有77.6℃的Tm；h#11B7-T14具有75.8℃的Tm；h#11B7-T15具有83.1℃的Tm；h#11B7-T16具有82.2℃的Tm；h#11B7-T17具有76.6℃的Tm；h#11B7-T18具有83.0℃的Tm；h#11B7-T19具有75.9℃的Tm；h#11B7-T20具有76.9℃的Tm；h#11B7-T21具有76.6℃的Tm；h#11B7-T22具有83.6℃的Tm；h#11B7-T23具有83.0℃的Tm；h#11B7-T24具有77.6℃的Tm；h#11B7-T25具有83.9℃的Tm；h#11B7-T26具有76.9℃的Tm；h#11B7-T27具有77.9℃的Tm；h#11B7-T28具有77.4℃的Tm；h#11B7-T29具有77.4℃的Tm；h#11B7-T30具有77.8℃的Tm；h#11B7-T31具有77.9℃的Tm；以及嵌合体h#11B7具有73.1℃的Tm。
实施例26.本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制配体诱导的Axl磷酸化，如通过ELISA测定的
由生长停滞特异性基因6，Gas6编码的蛋白质代表了受体酪氨酸激酶Axl的天然配体。Gas6与Axl的结合导致通过增加的受体酪氨酸激酶磷酸化水平反映的受体激活。进行ELISA实验以研究本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5和11B7-T6以及11B7-T6衍生物11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25干扰Gas6-诱导的受体酪氨酸激酶Axl的磷酸化和激活的潜能。
简而言之，在第1天，将3x104个细胞/孔于正常生长培养基中接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换生长培养基以饥饿细胞过夜，进行24小时。同样地，还在4℃下用2μg/ml的在PBS中的小鼠抗磷酸酪氨酸抗体4G10包被黑色Maxi-Sorp 96孔板(Nunc)过夜。在第3天，除去4G10抗体溶液，用封闭缓冲液(PBS，0.5％BSA)在室温下封闭Maxi-Sorp孔，进行至少4小时。平行地，使细胞保持未处理，或用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Baxter)以及人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25在37℃下预温育细胞1小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)在37℃下处理15分钟。然后弃去培养基，将细胞在冰上于每孔110μl补充有磷酸酶和蛋白酶抑制剂(10mM Na4P2O7，1mM苯甲基磺酰氟，1mM原钒酸盐，1mM NaF和0.5％抑肽酶)的裂解缓冲液(50mM HEPES，pH 7.5，150mM NaCl，1mM EDTA，10％甘油和1％Triton X-100)中裂解30分钟。同时，除去封闭缓冲液，在将每孔100μl裂解物转移和于4℃下温育过夜之前，用清洗缓冲液(PBS，0.05％Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次。在第4天用清洗缓冲液清洗板6次后，在室温下用0.125μg/ml的在稀释缓冲液(20mM Tris，50mM NaCl，pH7.3，0.05％Tween 20，0.1％BSA)中的生物素化的大鼠抗AXL抗体12B7温育孔，进行2小时。用清洗缓冲液清洗板6次，向各孔中加入以1∶20000稀释于稀释缓冲液中的AP缀合的链霉抗生物素蛋白(Chemicon#SA110)，在室温下温育30分钟。之后用清洗缓冲液清洗孔6次，加入AttoPhos底物溶液(Roche#11681982)。使用SpectraMax-GeminiEM板读取器(Molecular Devices)，在430nm的激发波长和580nm的发射波长处收集各孔的荧光。
图37显示该实验对于Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25在两个细胞系中显著减少Gas6介导的Axl激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的Axl酪氨酸磷酸化水平所显示的。
实施例27.本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制配体诱导的Akt磷酸化，如通过ELISA测定的
此外，进行ELISA实验以研究本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5和11B7-T6以及11B7-T6衍生物11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25是否能够阻止配体Gas6-介导的Akt激酶的激活。Gas6介导的Akt激酶的激活通过增加的蛋白质(Ser473)磷酸化来检测。
简而言之，在第1天，将2x104个细胞/孔接种在平底96孔板中。第二天，用无血清培养基替换正常生长培养基以饥饿细胞36小时。之后，使细胞保持未处理，或用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Baxter)以及人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25在37℃下预温育细胞1小时，然后用或不用400ng/ml Gas6(R&D Systems)在37℃下处理15分钟。弃去培养基，用4％的在PBS(pH7.5)中的甲醛在室温下固定细胞30分钟。除去甲醛溶液，用清洗缓冲液(PBS，0.1％Tween20)清洗细胞2次。用1％H2O2，0.1％NaN3(于清洗缓冲液中)猝灭细胞，在室温下温育20分钟。之后，除去猝灭溶液，用清洗缓冲液清洗细胞2次，然后用PBS，0.5％BSA在室温下进行封闭，进行4小时。加入以1∶500稀释于PBS，0.5％BSA，5mM EDTA中的抗磷酸-Akt(Ser473)一抗(多克隆兔；Cell Signaling#9271)，在4℃下过夜。在第4天，除去抗体溶液，用清洗缓冲液清洗板3次。然后向各孔中加入以1∶2,500稀释于PBS，0.5％BSA中的HRP缀合的抗兔二抗(Dianova#111-036-045)，在室温下温育1.5小时。用清洗缓冲液清洗板3次，用PBS清洗2次，每次5分钟。加入四甲基联苯胺(TMB，Calbiochem)，在620nm处进行监测。通过加入100μl 250nM HCl终止反应，使用Vmax板读取器(Thermo Lab Systems)，在450nm处(使用620nm的参照波长)读取吸光度。
图38显示对于Hs578T乳腺癌细胞(顶部)和NCI-H292肺癌细胞(底部)的该实验的代表性结果。与Gammagard对照抗体相比较，本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25在两个细胞系中都能够阻止或减少Gas6介导的Akt激酶激活，如与相应的非刺激的细胞相比，Gas6-刺激的细胞中降低的Akt(Ser473)磷酸水平所显示的。
实施例28：本发明的人源化11B7抗AXL抗体诱导Axl受体内化
Axl已被鉴定为，可通过Axl介导的信号转导途径(包括上文中阐明的Akt途径)影响肿瘤细胞的迁移和存活的因子。因此，如果通过受体内化将Axl从细胞表面/膜有效清除，那么最终可减小或抑制细胞信号转导和从而细胞的维持以及肿瘤生长和转移。
为了研究本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5和11B7-T6以及11B7-T6衍生物11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25是否能够诱导加速的Axl的内吞，在将细胞与本发明的人源化抗AXL抗体一起温育2、4、6和20小时后，比较细胞表面上的Axl分子的相对量。
简而言之，在第1天，将2x105个细胞/孔于正常生长培养基中接种在6孔皿中，并让其生长过夜。第二天，除去培养基，用无血清培养基清洗细胞。之后，在无血清培养基(补充有10mM HEPES)中，使细胞保持未处理，或用10μg/ml的Gammagard对照抗体(Baxter)以及人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25在4℃下温育细胞40分钟。随后，将细胞转移至37℃，进行指定的时间，以允许内化发生。之后，用10mM EDTA分离细胞，将其重悬浮于100μl清洗缓冲液(PBS，3％FCS)中。关于随后的固定，逐滴加入100μl的在PBS中的2％多聚甲醛，同时剧烈地振荡细胞。在室温下温育20分钟后，清洗细胞，将其重悬浮于100μl清洗缓冲液中，贮存在冰箱中，直至收集到所有样品。为了最终染色细胞以分析Axl表达水平，将样品转移至圆底96孔板，在4℃下与3μg/ml的在清洗缓冲液中的大鼠抗Axl mAb 2A1一起温育1小时。用清洗缓冲液清洗细胞2次，将其在4℃与以1∶100稀释的驴抗大鼠IgG-PE二抗(Dianova)一起温育60分钟，再用清洗缓冲液清洗2次，利用FACS(Beckman Coulter EPICS，EXPO32)进行分析。
图38中的代表性数据证明，用人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25处理Hs578T乳腺癌细胞导致Axl受体的内化，然而Gammagard对照抗体不具有任何作用。显示了各个处理时期的以％(定义为抗AxlmAb处理的样品相对于未处理的样品的平均荧光强度)表示的相对Axl表达水平。
实施例29.本发明的人源化11B7抗AXL抗体体外抑制基于球状体的细胞血管生成
Axl是多种血管生成行为(包括内皮细胞迁移、增殖和管形成)(体外)的关键调节剂(Holland等人，Cancer Res：65，9294-9303，2005)。因此，就对Gas6诱导的HUVEC-球状体的血管出芽的抑制作用检测本发明的人源化抗AXL抗体11B7-T5和11B7-T6以及11B7-T6衍生物11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25。按照最初公开的方案(Korff和Augustin：J Cell Sci 112：3249-58，1999)的改进方案进行实验。
简而言之，如所描述的(Korff和Augustin：J Cell Biol 143：1341-52，1998)，通过下列来制备球状体：用移液器将500个人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(与VEGF-A[25ng/ml]组合)于悬滴中转移至塑料皿上，让其球状聚集过夜。然后将50个HUVEC球状体接种于0.9ml的胶原溶液(2mg/ml)中，并用移液器转移至24孔板的单独的孔中以让其聚合。30分钟后，通过用移液器将100μl的10倍浓缩的工作稀释物转移至聚合的凝胶的顶部来加入浓度递减的Gammagard对照抗体(Baxter)或人源化抗AXL抗体11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、11B7-T23和11B7-T25(1x10-6M，3x10-7M，1x10-7M，3x10-8M，1x10-8M，3x10-9M，1x10-10M)以及人Gas6(R&D Systems)(人GAS6终浓度1μg/ml)。将板在37℃下温育24小时，然后加入4％的Roti-Histofix(Roth，Karlsruhe，Germany)进行固定。通过图像分析系统定量HUVEC球状体的出芽强度，所述图像分析系统使用倒置显微镜和数字成像软件Analysis 3.2(Soft imaging system，Munster，Germany)测定每个球状体的累积出芽长度。分析10个随机选择的球状体的累积出芽长度的平均值，将其作为单独的数据点。
图39显示该实验的代表性结果。
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Claims (35)

1.结合AXL的细胞外结构域并且至少部分抑制AXL活性的单克隆人源化抗体。
2.权利要求1的单克隆人源化抗体，其减少和/或阻止AXL介导的信号转导、AXL磷酸化、细胞增殖、血管生成、细胞迁移、肿瘤转移和/或AXL介导的抗细胞凋亡。
3.权利要求1或2的单克隆人源化抗体，其减少和/或阻止配体诱导的AXL下游信号转导分子例如ERK1/2、AKT、GSK-3β、TSC2、mTOR和/或S6K1的磷酸化。
4.权利要求1-3的任一项的单克隆人源化抗体，其来源于嵌合抗AXL抗体11B7(SEQ ID NO：135，136)或11D5(SEQ ID NO：137，138)之一并且在11B7或11D5的至少一个可变结构域的构架区中包含至少一个突变。
5.权利要求1-4的单克隆人源化抗体，其包含选自SEQ ID NO：40至SEQ ID NO：48的重链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，
或选自SEQ ID NO：80至SEQ ID NO：82的重链氨基酸序列的可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，
和/或选自SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：30的轻链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，
或选自SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：79的轻链氨基酸序列的可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，
或其识别AXL细胞外结构域上的相同表位的片段。
6.权利要求5的单克隆人源化抗体，其选自人源化h#11B7抗体，所述人源化h#11B7抗体选自h#11B7-T1、h#11B7-T2、h#11B7-T3、h#11B7-T4、h#11B7-T5、h#11B7-T6、h#11B7-T7、h#11B7-T8、h#11B7-T9、h#11B7-T10、h#11B7-T11、h#11B7-T12、h#11B7-T13、h#11B7-T14、h#11B7-T15、h#11B7-T16、h#11B7-T17、h#11B7-T18、h#11B7-T19、h#11B7-T20、h#11B7-T21、h#11B7-T22、h#11B7-T23、h#11B7-T24、h#11B7-T25、h#11B7-T26、h#11B7-T27或h#11B7-T28。
7.权利要求1-4的单克隆人源化抗体，其包含选自SEQ ID NO：67至SEQ ID NO：72的重链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，
或选自SEQ ID NO：114至SEQ ID NO：120的重链氨基酸序列的可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，
和/或选自SEQ ID NO：55至SEQ ID NO：60的轻链氨基酸序列，或至少其可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，
或选自SEQ ID NO：83至SEQ ID NO：113的轻链氨基酸序列的可变结构域，或与其具有至少90％的序列同一性的氨基酸序列，
或其识别AXL细胞外结构域上的相同表位的片段。
8.权利要求7的单克隆人源化抗体，其选自人源化h#11D5抗体，所述人源化h#11D5抗体选自h#11D5-T1、h#11D5-T2、h#11D5-T3、h#11D5-T4、h#11D5-T5或h#11D5-T6。
9.权利要求1-8的任一项的单克隆人源化抗体，其被偶联至标记基团。
10.权利要求1-9的任一项的单克隆人源化抗体，其被偶联至效应物基团。
11.分离的核酸分子，其选自下列：
(a)编码权利要求1-10的任一项的单克隆抗体、其抗体片段或衍生物的核酸序列，
(b)选自SEQ ID NO：5至SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：31至SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：49至SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：61至SEQ ID NO：66的SEQ ID NO之一中所示的核酸序列，
(c)编码选自SEQ ID NO：18至SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40至SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：55至SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：66至SEQID NO：73、SEQ ID NO：73至SEQ ID NO：120和SEQ ID NO：121至SEQID NO：132的多肽的核酸序列，
(d)与(a)至(c)中的任何序列互补的核酸，或
(e)能够在严格条件下与(a)、(b)、(c)或(d)杂交并且编码多肽的核酸序列，其中包含所述多肽的抗体或其功能性片段结合AXL的细胞外结构域。
12.包含权利要求11的核酸序列的载体。
13.权利要求12的载体，其为表达载体并且所述核酸序列可操作地连接至控制序列。
14.包含权利要求12或13的载体的宿主。
15.权利要求14的宿主，其为人、细菌、动物、真菌、两栖动物或植物细胞。
16.权利要求14的宿主，其为非人转基因动物。
17.制造权利要求1-12的任一项的单克隆人源化抗体的方法，其包括从权利要求14、15或16的宿主获得所述多肽的步骤。
18.一种药物组合物，其包含人源化抗AXL抗体，优选权利要求1-10的任一项的单克隆人源化抗体、权利要求11的核酸分子、权利要求12或13的载体、权利要求14、15或16的宿主，或通过权利要求17的方法产生的多肽。
19.权利要求18的药物组合物，其包含药学上可接受的载体、稀释剂和/或佐剂。
20.权利要求18或19的药物组合物，其包含另外的活性剂。
21.权利要求18-20的任一项的药物组合物，其用于过度增殖性疾病的诊断、预防或治疗。
22.权利要求18-21的任一项的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病与AXL表达、过表达和/或过度活跃相关。
23.权利要求22的药物组合物，其中所述过度增殖性疾病选自乳腺癌、肺癌和其他表达或过表达AXL的癌症以及肿瘤转移的形成。
24.权利要求1-10的任一项的单克隆人源化抗体，其用于过度增殖性疾病的诊断、预防或治疗。
25.权利要求1-10的任一项的单克隆人源化抗体在制造用于过度增殖性疾病的诊断、预防或治疗的药物组合物中的用途。
26.权利要求24或25的用途，其中所述过度增殖性疾病为权利要求22或23的任一项中定义的过度增殖性疾病。
27.用于诊断与AXL的表达相关的状况的方法，其包括将样品与权利要求1-10的任一项的单克隆人源化抗体接触，和检测AXL的存在。
28.权利要求27的方法，其中所述状况是权利要求22或23的任一项中定义的过度增殖性疾病。
29.用于预防或治疗患者的与AXL的表达相关的状况的方法，其包括给有此需要的患者施用有效量的至少权利要求1-10的任一项的单克隆人源化抗体。
30.权利要求29的方法，其中所述状况是权利要求27或29的任一项中定义的过度增殖性疾病。
31.权利要求29或30的方法，其中所述患者是哺乳动物患者，特别是人患者。
32.试剂盒，其包含抗AXL抗体，优选权利要求1-10的任一项的单克隆抗体、权利要求11的核酸序列或权利要求12或13的载体。
33.权利要求32的试剂盒，其还包含另外的抗肿瘤剂。
34.权利要求1-10的任一项的人源化抗AXL抗体用于制造药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗抗药性癌症。
35.权利要求1-9的任一项的人源化抗AXL抗体用于制造药剂的用途，所述药剂用于与抗肿瘤剂共施用，以治疗过度增殖性疾病。
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