TW201105348A - Humanized axl antibodies - Google Patents

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TW201105348A
TW201105348A TW099114946A TW99114946A TW201105348A TW 201105348 A TW201105348 A TW 201105348A TW 099114946 A TW099114946 A TW 099114946A TW 99114946 A TW99114946 A TW 99114946A TW 201105348 A TW201105348 A TW 201105348A
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Peter Wirtz
Jens Ruhe
Takeshi Takizawa
Tomoko Takayama
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U3 Pharma Gmbh
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201105348 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明關於單株人化抗體類，該等抗體與AXL受體酪 胺酸激酶之細胞外結構域結合且該等抗體至少部分地抑制 AXL活性。 【先前技術】
AXL ( Ark, UFO，Tyro-7 )受體酪胺酸激酶係 Tyro-3 激酶家族之成員，該家族之其他成員爲Mer ( Eyk，Nyk， Tyro-12)及 Sky ( Rse，Tyro-3，Dtk，Etk, Brt，Tif) 。AXL 藉由與異嗜性配體Gas6 (與抗凝因子蛋白S同源之70-kD a 蛋白質）結合而活化。不同於其他受體酪胺酸激酶，AXL 酪胺酸磷酸化亦可由同嗜性結合激活。AXL活化導致經由 PI-3-激酶/Akt ( Franke et al.，Oncogene 22: 8983-8998, 2003 )及其他主要途徑如Ras/Erk及冷連鎖蛋白（召-catenin) /TCF ( Goruppi et al., Mol. Cell Biol. 2 1 : 902-9 1 5, 200 1 )之傳訊》 AXL係微弱地表現於一系列正常組織（包括腦、心臟 、骨骼肌、數種其他器官之器官包囊及結締組織）及單核 細胞中，但不表現於淋巴細胞。由AXL誘導之Akt磷酸化 已被描述於纖維母細胞（Goruppi et al·，Mol Cell Biol 17 ·· 4442-4453 1 9 9 7 )、內皮細胞（Hasanbasic et al., Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2004 )、血管平滑肌細胞（
Melaragno et al., J. Mol. Cell Cardiol. 3 7 : 8 8 1 -8 87，2004 201105348 )及神經元（Allen et al·，Mol. Endocrinol. 13: 191-201 1 999 )之存活。另外，AXL在細胞黏附及趨化性上扮演角 色。AXL基因剔除顯示血小板整合素（integrin) IIb3活化 減少所導致之血小板凝集穩定受損及血栓形成。 A XL過度表現已經在多種癌症類型中證實，例如乳癌 (Meric et al., Clin. Cancer Res. 8 ： 3 6 1 -3 67, 2002;
Berclaz et al·，Ann. Oncol. 12 : 819-824, 2001)、結腸癌 (Chen et a 1., Int. J. Cancer 8 3 : 5 79-5 84, 1 999; Craven et al.，Int. J. Cancer 60: 791-797，1995)、前列腺癌（ Jacob et a 1., Cancer Detect. Prev. 23 : 3 2 5 -3 3 2，1 999 )、 肺癌(Wimmel et al., Eur J Cancer 37 : 2264-2274, 200 1 )、胃癌（Wu et al·，Anticancer Res 22 : 1 07 1 - 1 078, 2002 )、卵巢癌(Sun et al., Oncology 66: 450-457, 2004 )、子宮內膜癌（Sun et al.，Ann. Oncol. 14: 898-906，2003 )、腎癌（Chung et al., DNA Cell Biol. 22: 5 3 3-540, 2003 )、肝細胞癌（Tsou et a 1., Genomics 50: 3 3 1 -340, 1 998 )、甲狀腺癌(Ito et al., Thyroid 12 : 971 -975, 2002; Ito et al., Thyroid 9: 563-567, 1 999 )、食道 癌（Nemoto et al·，1 997 )，另外在慢性骨髓性白血病（ C M L ) ( Janssen et a 1., A novel putative tyrosine kinase receptor with oncogenic potential. Oncogene, 6 : 2 113-2120， 19 9 1; Braunger et al., Oncogene 1 4 : 2619-2631 1 997; O’Bryan et al., Mol Cell Biol 11 ： 50 1 6-503 1 , 1 99 1 )、急性骨髓性白血病（AML ) ( Rochlitz et al., 201105348
Leukemia 13 : 1352-1358, 1999) ' 骨肉瘤(Nakano et al., J. Biol. Chem. 270 ： 5702-5705, 2003 )、黑色素瘤( van Ginkel et a 1., Cancer Res 64 · 1 28- 1 34, 2004 )及頭頸 鱗狀細胞癌（Green et al.，Br J Cancer. 2006 94 : 1 446-5, 2006 )。
另外AXL已被鑑別爲轉移相關基因，其在侵入性乳癌 細胞系中相較於非侵入性細胞中上調。在活體外，AXL活 性被發現係爲遷移及侵入所需，且該活性可被抗體治療抑 制（W004008147)。同樣的，藉由負顯性AXL版本之表 現（Vajkoczy， P., et al., Proc. Natl. Acad. Science U.S.A. 1 03: 5799-5 804，2005 )或藉由 siRNA 媒介之 AXL T If ( Holland et al., Cancer Res. 65 : 9294-9303, 2005 ) 廢除AXL活體內活性在鼠異種移植實驗中防止皮下及原位 細胞生長。 目前已經描述與AXL結合且具有生物活性之抗體。舉 φ 例來說，一種已知抗體能減少AXL媒介之細胞侵入（ W004008 1 47 )，另外有其他抗體已被報告能減少AXL/配 體交互作用。然而，所有已知之抗體係多株或非人化單株 抗體。非人化之多株或單株抗體係快速地自循環中移除， 通常導致系統性發炎效應，使彼等不適合用於治療性投予 因此有鑑於AXL之治療潛力，對於可有效且專一地阻 斷AXL媒介之信號傳導且適合供治療性處理之單株人化 AXL抗體、抗體片段或彼等之衍生物有高度需求。 201105348 【發明內容】 因此本發明之第一態樣關於一種單株人化抗體（包括 彼之片段或衍生物）’其與AXL (特定地人AXL)之細胞 外結構域結合且至少部分地抑制AXL活性。 本發明之人化抗體較佳地具有至少一或多種下列特性 :減少或阻斷AXL媒介性信號傳導之能力、減少或阻斷 AXL磷酸化之能力、減少或阻斷細胞增生之能力、減少或 阻斷血管新生之能力、減少或阻斷細胞遷移之能力、減少 或阻斷腫瘤轉移之能力及減少或阻斷AXL媒介性抗細胞凋 亡作用之能力，因此增加例如細胞對於抗腫瘤劑治療之敏 感性。 根據本發明特別較佳之實施態樣，此處所描述之人化 抗體顯示減少及/或阻斷配體誘導之AXL下游傳訊分子（ 諸如 ERK1/2、AKT、GSK-3 冷、TSC2、mTOR及 / 或 S6K1) 之磷酸化之能力。 另外本發明之人化抗體可能展現高度AXL (特定地人 AXL)專一性，且不顯著辨識其他Tyro-3家族成員，例如 MER及/或SKY及/或哺乳動物非靈長動物AXL諸如小鼠 AXL。 此處所使用之用語「活性」係指AXL之生物功能，其影 響細胞之表現型，特定但不限於癌表現型，諸如逃避細胞 凋亡、生長信號自足、細胞增生、組織侵入及/或轉移、 對抗生長信號（抗細胞凋亡）之不敏感性及/或持續血管 -8- 201105348 新生。 用語「AXL媒介性信號傳導」係指活化第二信使途徑， 諸如由AXL與第二信使分子直接或間接交互作用所誘發之 下游傳訊。 用語「AXL磷酸化」係指由第二AXL蛋白（磷酸轉移作 用）或由具有蛋白質激酶活性之其他蛋白質對胺基酸殘基 較佳地酪胺酸殘基之磷酸化。
用語「細胞增生」係指爲人細胞（特定地但不限於人癌 細胞）繁殖基礎之所有AXL相關過程。該些過程貢獻或導 致細胞性DNA之複製、將經複製之DN A分離成二組相同大 小之染色體及物理分割（稱爲細胞質分裂）整體細胞，該 些過程應由AXL之非酶催化性或酶催化性活性刺激或媒介 ，較佳地包括AXL磷酸化及/或AXL媒介性信號傳導。 用語「血管新生」係指導致新的血管自原有血管生長之 所有AXL相關過程，特定但不限於新的腫瘤供應血管。這 些過程包括多重細胞事件諸如血管內皮細胞之增生、存活 、遷移及芽生、周細胞之吸引及移動以及基底膜形成以穩 定血管、血管灌流或由基質或腫瘤細胞分泌血管新生因子 ，該些過程應由AXL之非酶催化性或酶催化性活性刺激或 媒介，較佳地包括AXL磷酸化及/或AXL媒介性信號傳導。 用語「轉移j係指支持癌細胞自原發腫瘤分散、穿透至 淋巴管及/或血管、經由血流循環及於身體他處之正常組 織遠處焦點（轉移）生長之所有AXL相關過程。特定地， 轉移係指腫瘤細胞之細胞事件諸如增生、遷移、錨定不依 -9 - 201105348 賴性、逃避細胞凋亡或分泌血管新生因子，該些細胞事件 係轉移之基礎且係由A X L之非酶催化性或酶催化性活性刺 激或媒介，較佳地包括AXL磷酸化及/或AXL媒介性信號傳 導。
用語「AXL媒介性抗細胞凋亡作用」係指防止人細胞（ 較佳但不限於人癌細胞）發生計畫性細胞死亡（細胞凋亡 )之所有AXL相關過程。特定地，其係指防止人細胞（較 佳但不限於人癌細胞）透過生長因子抽離、缺氧、暴露於 化學治療劑或放射線或啓動Fas/Apo-1受體媒介性傳訊以 誘導細胞凋亡之過程，該些過程係由AXL之非酶催化性或 酶催化性活性刺激或媒介，較佳地包括A X L磷酸化及/或 AXL媒介性信號傳導。 用語「區」及「結構域」在本發明中可彼此相容。 在本發明中被稱爲「11B7」及「11D5」之抗體亦分別被 稱爲「#11B7」及「#1 1D5」。
根據本發明之第二態樣，此處所描述之人化抗體係源 自嵌合（大鼠/人）抗AXL抗體11B7(彼之輕鏈及重鏈胺 基酸序列係分別由SEQ ID NO: 135及136表示）、11D5( 彼之輕鏈及重鏈胺基酸序列係分別由SEQ ID NO: 137及 138表示）或10D12中之一者，或辨識AXL之細胞外結構域 上相同表位之抗體。特定較佳地，該人化抗體係源自1 1 B 7 或11D5。較佳地，該人化抗體含有於至少一個可變結構 域之架構區中之至少一個突變。該突變可由該領域之技藝 人士所知之任何方法導入以改變胺基酸序列。該突變較佳 -10- 201105348 地以在人架構區中之保守胺基酸取代11B7或11D5之架構 區中之胺基酸。測定人架構區中之保守或一致胺基酸之方 法諸如舉例來說利用諸如IgB LAST程式之同源模擬法係該 領域之技藝人士所知。根據另一較佳之實施態樣，本發明 之人化抗體係源自抗AXL抗體，較佳地源自抗AXL抗體 1 1B7或1 1D5，其中該抗體（較佳地1 1B7或1 1D5 )之至少 一個可變結構域之架構區係由人或人化架構區取代。
本發明之抗體對AXL之結合活性可由該領域之技藝人 士所知之方法測定。舉例來說，該活性可利用Biacore之 表面電漿共振技術及/或E LI S A (酶連接免疫吸附分析法） 、EIA (酶免疫測定法）、RIA (放射線免疫測定法）或 螢光抗體技術例如FACS測定。 較佳地，本發明之人化抗體相較於多株或單株非人化 抗AXL抗體（諸如大鼠11B7或11D5)具有較低之免疫原 性。除了該領域之技藝人士所知之其他方法之外，降低之 免疫原性可由ELISA基底之HAHA或HAMA測定法（明尼蘇 達州美國IBL ( IBL-America )公司/義大利理史塔費雪（ LiStarFish )公司）測定。另外，該發明抗體較佳地不自 血液循環中快速移除，且若對病患投予不造成系統性發炎 效應。 本發明之抗體可能具有至少一個抗原結合位，例如一 或二個抗原結合位。另外，該抗體較佳地包含至少一個免 疫球蛋白重鏈及至少一個免疫球蛋白輕鏈。免疫球蛋白鏈 含有可變結構域及可任意選擇地固定結構域。可變結構域 -11 - 201105348 可能包含互補決定區（CDR)(例如CDR1區、CDR2區及/ 或CDR3區）及架構區。用語「互補決定區」（CDR)在該 領域係經完整定義（見例如Harlow and Lane， “Antibodies, a Laboratory Manual”， CSH Press, Cold Spring Harbour, 1 9 8 8 )，代表在抗體之可變區內主要與 抗原接觸之胺基酸片段。
在其他實施態樣中，本發明之人化抗體係源自抗AXL 抗體UB7且包含選自SEQ ID NO: 40至SEQ ID NO: 48之 重鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有 至少90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之 胺基酸序列，該結合活性與具有1 00%序列一致性者相等
或選自SEQ ID NO: 80至SEQ ID NO: 82之重鏈胺基 酸序列的可變結構域，或與彼等具有至少90%序列一致性 且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列，該結合 活性與具有1 0 0 %序列一致性者相等， 及/或選自SEQ ID NO: 18至SEQ ID NO: 30之輕鏈胺 基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有至少 90%序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基 酸序列’該結合活性與具有1 00%序列一致性者相等， 或選自SEQ ID NO: 73至SEQ ID NO: 79之輕鏈胺基 酸序列的可變結構域，或與彼等具有至少9 0 %序列一致性 且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列，該結合 活性與具有1 00%序列一致性者相等， -12- 201105348 或彼等之片段，該片段辨識AXL之細胞外結構域上之 相同表位。本發明之序列說明係於下列「序列說明」及序列 表中顯示。 在另一實施態樣中，本發明之人化抗體係源自抗AXL 抗體 11B7 且包含選自 SEQ ID NO: 150 或 SEQ ID NO: 151
之重鏈胺基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具 有至少90%序—叛後且代表具有Axl結合活性之可變區之_ 槪m m序η，該結合活性與具有1 〇〇%序列一致性者相等 及/或選自SEQ ID NO: 146或SEQ ID NO: 147之輕鏈 胺基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有至少 μ%序m —致後且代表具有Axi結合活性之可變區之敉基後 序m、該結合活性與具有1 〇〇%序列一致性者相等。 在特定較佳之實施態樣中，該人化h# 11 B7抗體類係選 自 h#llB7-Tl 、 h#l1B7-T2 、 h#l1B7-T3 、 h#l1B7-T4 、 h#l1B7-T5 、 h#l1B7-T6 、 h#l1B7-T7 、 h#l1B7-T8 、 h#l1B7-T9 、 h#l1B7-T10 、 h#l1B7-T1 1 、 h#l1B7-T12 、 h#l1B7-T 1 3、h#l1B7-T14、h#l1B7-T1 5、h#l1B7-T16、 h#l 1 B7-T17、h#l 1B7-T18、h#l1B7-T19、h#llB7-T20、 h#l 1B7-T2 1、h#l1B7-T22、h#11B7-T23、h#l 1B7-T24、 h#l1B7-T25 ' h#llB7-T26或 h#llB7-T27抗體。表 1 (實施 例1 ο)藉由特定人化重鏈及輕鏈胺基酸序列之組合（分別 藉由對應表現載體之組合）槪述本發明上述人化h#llB7抗 體之特徵。 -13- 201105348 在另一特定較佳之實施態樣中，該人化h#l 1B7抗體類 係選自 h#llB7-T28、 h#l1B7-T29 > h#llB7-T30或 h#llB7-T3 1抗體。表2 (實施例22 )藉由特定人化重鏈及輕鏈胺基 酸序列之組合（分別藉由對應表現載體之組合）槪述上述 人化h#l 1B7抗體之特徵。
源自大鼠抗人Axl單株抗體#11B7之人化抗體不限於先 前段落舉例說明之特定抗體，只要該人化抗體含有所有6 個CDR及與Axl抗原之結合活性。該人化抗體分別在彼之 重鏈含有 CDRH1 (SNYWG; SEQ ID NO: 124 ) 、CDRH2 (YITYSGSTSYNPSLKS; SEQ ID NO : 125)及 CDRH3 ( TTFYY; SEQ ID NO: 126 )，在彼之輕鏈含有 CDR L4( RASQDIGNYLR; SEQ ID NO : 121 ) 、 CDRL5 ( GATNLAA; SEQ ID NO : 122 )及 C D R L 6 ( L Q S K E S P W T ; SEQ ID NO： 123)。
在其他實施態樣中，本發明之人化抗體係源自1 1 D5 且包含選自SEQ ID NO: 67至SEQ ID NO: 72之重鏈胺基 酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有至少9 0% 序列一致性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序 列，該結合活性與具有1 00%序列一致性者相等， 或選自SEQ ID NO: 114至SEQ ID NO: 120之重鏈胺 基酸序列的可變結構域，或與彼等具有至少9 0 %序列一致 性且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列，該結 合活性與具有1 〇 〇 %序列一致性者相等， 及/或選自SEQ ID NO: 55至SEQ ID NO: 60之輕鏈胺 -14 - 201105348 基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有至少 90%序列一致性且代表具有Αχι結合活性之可變區之胺基 酸序列’該結合活性與具有1 00%序列一致性者相等， 或選自SEQ ID NO: 83至SEQ ID NO: 113之輕鏈胺基 酸序列的可變結構域，或與彼等具有至少90%序列一致性 且代表具有Axl結合活性之可變區之胺基酸序列，該結合 活性與具有1 00%序列一致性者相等，
或彼等之片段，該片段辨識AXL之細胞外結構域上之 相同表位。 在特定較佳之實施態樣中，該人化h# 1 1 D 5抗體類係 選白 h#llD5-Tl、h#l 1D5-T2 ' h#UD5-T3、h#llD5-T4、 h#UD5-T5或h#llD5-T6抗體。實施例11、12及14藉由特 定人化重鏈及輕鏈胺基酸序列之組合（分別藉由對應表現 載體之組合）顯示該上述人化h#llD5抗體之特徵。 本發明之較佳實施態樣中之一者係具有相對高熱變性 φ 中點（Tm)之人化抗體。在本發明中，人化抗體具有至 少7 0 °C之Tm，較佳地至少7 5 °C之Tm，更佳地至少7 8 °C之 Tm，更佳地至少80°C之Tm，另外更佳地至少82°C之Tm » 或者，在本發明中，人化抗體具有相當於彼之原型大鼠或 嵌合抗體之Tm之Tm，但是較佳地具有相較於彼之原型大 鼠或嵌合抗體之Tm至少高3 °C之Tm，更佳地至少高6 °C之 Tm，另外更佳地至少高8 t之Tm，甚至更佳地至少高1 0 °C 之Tm。該較佳、更佳、另外更佳或甚至更佳之人化抗體 較不易變性（展開）或去活化，且適合被製備成可長時間 -15- 201105348 穩定儲存之溶液調製劑。 源自大鼠抗人Axl單株抗體#11D5之人化抗體不限於 先前段落舉例說明之特定抗體，只要該人化抗體含有所有 6個CDR及與Axl抗原之結合活性。該人化抗體分別在彼之 重鏈含有 CDRH 1 ( SNYWG; SEQ ID NO : 1 30 ) 、CDRH2 (HITNSGNTTYNPSLKS; SEQ ID NO: 13 1)及 CDRH3( GAFDY; SEQ ID NO: 132 )，在彼之輕鏈含有 CDR L4( RASQDIGNYLS; SEQ ID NO ： 127) 、C D R L 5 ( G AIK L A V; SEQ ID NO ： 12 8)及 C D R L 6 ( L Q Y I Q F P L T ; SEQ ID NO ： 129)。 本發明另一較佳之實施態樣係（專一性）結合或辨識 靠近羧基端之IG結構域（該結構域包含NCBI蛋白質資料 庫登錄號？_3 05 30 (3£() ID NO: 139;圖30A)中胺基酸 號碼129-220之胺基酸殘基）中之一者之抗體。該較佳之 抗體不限於人化抗體，但可爲人抗體或彼等中之一者之功 能片段。更佳地，該較佳之抗體抑制至少一種Axl所具有 之生物活性。 本發明之（完整）抗體可舉例來說藉由執行下列步驟 加以產製：建構重鏈表現載體及輕鏈表現載體，其中每個 該載體具有包含可變區及固定區之插入物：將該等載體導 入宿主細胞中；培養該細胞；自培養上清液（條件培養基 )收集抗體多肽，如實施例9至1 2之例證。 此處所使用之二個多肽序列之間之「序列一致性」表示 該等序列之間相同之胺基酸的百分比。測定二個給定多肽 -16- 201105348 序列之間之「序列一致性」之方法係該領域之技藝人士所知 。本發明之較佳多狀序列具有至少90%、更佳至少95%且 甚至更佳至少9 8 %之序列一致性。該序列一致性可藉由例 如由卡林（Karlin)及奧斯舒爾（Altshul)提出之BLAST 演算法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, pp 5 8 73 ( 1 993 )
)或 F A S T A ( M eth o d s in Enzymol., 183，p p 6 3 ( 1 9 90 )) 測定。稱爲BLASTN或BLASTX之程式係可獲得的（J. Mol. Biol., 2 15, pp403 ( 1 990 ))。 本發明之抗體可爲IgA-、IgD-、IgE-、IgG-或IgM型 ，較佳地爲IgG-或IgM型，包括但不限於IgGl-、IgG2-' IgG3-、IgG4-、IgMl-或 IgM2 型。 發明抗體可較佳地藉由同源模擬法使用該領域之技藝 人士所知之任何適當程序加以設計。另外，給定抗體諸如 11B7或11D5之人化型式可根據該領域已知之方法諸如嵌 合或CDR移植加以產製。用於產製人化抗體之替代方法係 該領域所廣爲周知且係描述於例如EP-A1 0 23 9 400及 W09 00 7861。一般來說，人化抗體具有一或多個自非人來 源導入之胺基酸殘基。該些非人胺基酸殘基通常係指「輸 入」殘基，通常取自「輸入」可變區。人化舉例來說可依照 溫特（Winter)及同僚（Jones et al·，Nature，321 :522-525 ( 1 9 8 6 ) ; Riechmann et al., Nature, 3 3 2 ： 3 23 -3 27 ( 1 98 8 ) ; Verhoeyen et al., Science, 23 9 ： 1 534- 1 536 ( 1 98 8 ))之方法進行，藉由以人抗體之對應序列取代非人 來源之CDR或CDR序列。因此，該「人化j抗體係嵌合抗體 -17- 201105348 (美國專利號碼4,816,567)，其中實質上少於完整之人 可變結構域被來自非人物種之對應序列取代。實際上，人 化抗體通常係其中一些CDR殘基及可能一些FR殘基被來自 非人抗體之類似位置的殘基取代之人抗體。 人抗體可源自人抗體之噬菌體展示庫（Wormstone， I.M.et al, Investigative Ophthalmology & Visual Science (2002 ) 43 ( 7 ) ， p.230 1 -2308; Carmen, S. et al.,
Briefings in Functional Genomics and Proteomics ( 2002 )，1 ( 2 ) ， p. 1 8 9-203; Siriwardena, D. et a 1.,
Opthalmology ( 2002 ) 1 09 ( 3 )，p.427-43 1 )，此爲技藝 人士所廣爲周知。 舉例來說，可使用噬菌體展示法，該法包含使人抗體 之可變區在噬菌體表面上表現爲單鏈抗體（scFv )及篩選 與抗原結合之险菌體（Nature Biotechnology ( 2005 )， 23，（9)，ρ·1105-1116)。
藉由分析該經篩選之噬菌體的基因，可測定編碼與抗 原結合之人抗體可變區之DNA序列。 在測定scFv之DN A序列後，人抗體可藉由建構包含該 序列之表現載體並將該載體導入適當之宿主細胞以表現該 抗體加以產製（W092001047，W092020791, W093006213, WO93 0 1 1 23 6，WO930 1 9 1 72，W095001 43 8, WO950 1 53 8 8 及 Annu. Rev. Immunol ( 1 994 ) 1 2, p.43 3 -45 5 及 Nature
Biotechnology ( 2005) 23 ( 9) ， p.1105-1116) 〇 不論製備方法爲何，任何人抗體可作爲本發明之實施 -18 - 201105348
態樣，只要該人抗體具有人Axl抗原之結合活性及下列所 有6個CDR:分別在彼之重鏈含有CDRH1 (SNYWG; SEQ ID NO ： 13 0) 、CDRH2 ( HITNSGNTTYNPSLKS; SEQ ID NO: 13 1)及 CDRH3 (GAFDY; SEQ ID NO: 132)，且彼 之輕鏈含有 CDRL4 ( RASQDIGNYLS; SEQ ID NO: 127 ) 、CDRL5 ( GAIKLAV; SEQ ID NO : 128 )及 CDRL6 (
LQYIQFPLT; SEQ ID NO ： 129)，或者只要該人抗體具有 人Axl抗原之結合活性及下列所有6個CDR :分別在彼之重 鏈含有 CDRH 1 ( SNYWG; SEQ ID NO ： 124 ) 、CDRH2 ( YITYSGSTSYNPSLKS; SEQ ID NO : 125)及 CDRH3 ( TTFYY; SEQ ID NO: 126)，且彼之輕鏈含有 C D R L4 ( RASQDIGNYLR; SEQ ID NO ： 121 ) 、 CDRL5 ( GATNLAA; SEQ ID NO: 122)及 CDRL6(LQSKESPWT; SEQ ID NO ： 123)。 就治療目的而言，抗體可與治療效應基團偶聯，例如 放射活性基團或細胞毒性基團。 就診斷目的而言’該抗體可經標記。適當之標記包括 放射活性標記、螢光標記或酶標記。 如上討論’本發明之抗體可能以除完整抗體以外之多 種型式存在；包括例如Fv' Fab、Fab，、F(ab，）2、雙鏈 抗體（diabody)、微小抗體（minibody)、包含超過一 個抗體之片段之雙價或多價抗體’以及單鏈抗體（scFV) ;見例如 W08 809344 〇 本發明之抗體可爲雙專一性抗體或多專一性抗體，其 -19- 201105348 對超過一個抗原或表位具專一性。 scFv可藉由將免疫球蛋白重鏈之可變區與免疫球蛋白 輕鏈之可變區透過多肽連接子融合以獲得（Pluckthun， The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113，edited by Rosenburg and Moore, Springer Verlag， New York， p . 2 6 9 - 3 1 5 ( 1 994 )及 Nature Biotechnology ( 2005 )，23, p.1126-1136) 。BiscFv可藉由透過多肽連接子融合2個不
同之scFV加以獲得。 產製scFv之方法係該領域之技藝人士所廣爲周知（ US4,946,778, US 5,260,2 03, US5,091,513，US 5,455,03 0 等 )。較佳地，在2個可變區之間的連接子不產生共軛物（ Huston, J . S . e t a 1., P r o c . Natl. Acad. Sci. U.S.A. ( 1 98 8 ) 85; p.5 8 79-5 8 8 3 ) 。scFV免疫球蛋白重鏈可變區及scFV免
疫球蛋白輕鏈可變區可源自相同抗體或2個彼此不同之抗 體。多肽連接子可爲例如由1 2至1 9個胺基酸殘基組成之單 鏈肽。 編碼scFV之DNA可藉由包含放大DNA片段之PCR產製 ，其利用編碼全長或部分之免疫球蛋白重鏈可變區或輕鏈 可變區之DNA及分別對應模板2端之各端以作爲一對引子 之2個寡核苷酸，且接著利用經設計以使重鏈可變區與輕 鏈可變區分別與多肽連接子之一端及另一端連接之一對引 子放大。 抗體之功能性片段包括scFv可藉由將編碼該scFv之 DNA導入宿主細胞且培養該細胞加以產製，如說明書中他 -20- 201105348 處所述。 本發明之實施態樣之一者係相較於單價抗體具有較高 抗原結合親和性之多價抗體。該多價抗體之單位可爲相同 ’或當一單位與抗原之表位結合且另一單位與該相同抗原 之不同表位結合時彼此不同。結合I gG C Η 3結構域及二個 與鏈黴抗生物素蛋白結合且導入螺旋-轉角-螺旋模體之 scFv可被應用於產製多價抗體。
若需要’本發明之抗體可於該重鏈及/或輕鏈之可變 結構域發生突變以改變該抗體之結合特性。舉例來說，突 變可在一或多個CDR區發生以增加或減少該抗體對AXL之 Kd’或改變該抗體之結合專一性。定點突變之技術係該 領域所廣爲周知。見例如Sambrook et al. and Ausubel et al·，同上。另外，突變可發生在AXL抗體之可變區中相較 於種系已知被改變之胺基酸殘基。 在另一態樣中，除了關於人化之突變以外，其他突變 φ 可被導入一或多個架構區之中。突變可發生在架構區或固 定結構域以增加該AXL抗體之半衰期。見例如W00009560 。在架構區或固定結構域之突變亦可能發生以改變該抗體 之免疫原性、提供與另一分子共價或非共價結合之位置， 或改變諸如補體固定之特性。突變可能發生在單突變抗體 之各個架構區、固定結構域及可變區中。或者，突變可能 僅發生在單突變抗體之架構區、可變區或固定結構域之一 者。 本發明之實施態樣之一者係包含超過一種本發明之抗 -21 - 201105348 體之多株抗體。 本發明之實施態樣之一者係本發明之抗體或彼之功能 性片段之化學修飾。分子諸如聚合物（聚乙二醇或該類似 物）可被用來產製經修飾之抗體或經修飾之功能性片段。
在其他態樣中，本發明之人化抗體可能含有具備效應 功能之固定結構域，藉此該細胞表面已與抗體、抗體片段 或彼之衍生物結合之AXL表現細胞可能被免疫系統功能攻 擊。舉例來說，該抗體能固定補體及參與補體依賴性細胞 毒性作用（CDC )。另外，該抗體能結合效應細胞諸如單 核細胞及自然殺手（NK )細胞上之Fc受體及參與抗體依 賴性細胞性細胞毒性作用（ADCC )。
在其他態樣中，此處所描述之抗體適用於治療性治療 ，較佳地用於治療過度增生性疾病、心血管疾病（特定地 動脈粥樣硬化及血栓形成）、糖尿病相關疾病（特定地腎 小球肥大或糖尿病性腎病）及特定地與AXL表現、過度表 現或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、過度表現或高 度活性之疾患。該過度增生性疾病係較佳地選自與AXL表 現、過度表現或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、過 度表現或高度活性之疾患，諸如癌症例如乳癌、結腸癌、 肺癌、腎癌、濾泡淋巴瘤、骨髓性白血病、皮膚癌/黑色 素瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、巴瑞 特（Barrett)氏食道癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌 、甲狀腺癌及頭頸癌，或增生性疾病及腫瘤病或其他AXL 表現或過度表現之過度增生性疾病。 -22- 201105348
本發明之抗體於治療任何Axl相關性疾病諸如過度增 生性疾病上之應用性可由活體外（/» ν/αο )、活體內（ νίνσ )或活體外（ex vfvo )實驗證實、顯示或建議，包括 該些經配體誘導之Axl自體磷酸化、對AX1媒介性下游信號 傳導（諸如配體誘導之Akt及p42/44 MAP激酶磷酸化）之 效應、癌細胞遷移或增生、表現Axl細胞經配體誘導之遷 移或增生、組織或細胞之血管新生及經移植至非人動物諸 如異種移植小鼠之人癌或癌細胞之生長或轉移，以及任何 其他前臨床/非臨床實驗及臨床試驗。 在另一態樣中，本發明之抗體可被用於與抗腫瘤劑共 同投予以供治療上述疾患中之一者。 此處所使用之共同投予包括投予本發明之抗體與抗腫 瘤劑（較佳地細胞凋亡誘發性抗腫瘤劑）。用語共同投予 另包括以單一組成物之型式或以二或多種不同組成物之型 式投予本發明之抗體與抗腫瘤劑（較佳地細胞凋亡誘發性 抗腫瘤劑）。共同投予包括同時（意即在相同時間）或連 續（意即隔一段時間）投予本發明之抗體與抗腫瘤劑（較 佳地細胞凋亡誘發性抗腫瘤劑）。 本發明另關於編碼本發明之抗體、抗體片段或彼之衍 生物之核酸分子。編碼上述抗體、抗體片段或彼之衍生物 之本發明之核酸分子可能爲例如DNA、cDNA、RNA或合 成產製之DN A或RNA或不論是單獨或組合包含任何該些核 酸分子之重組產製之嵌合核酸分子。該核酸分子亦可能爲 對應整個基因或彼之實質部分或對應片段及彼之衍生物之 -23- 201105348 基因組DNA°該核苷酸序列可能對應天然發生之核苷酸序 列或可能包含單一或多重核苷酸取代、刪除或加入。在本 發明特定較佳之實施態樣中，該核酸分子係cDNA分子。 在其他態樣中，本發明關於選自下列之經分離之核酸 分子： (a)編碼本發明之單株人化抗體、抗體片段或彼之 衍生物之核酸序列，
(b )如選自 SEQ ID NO: 5 至 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 31 至 SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49 至 SEQ ID NO: 54 或 SEQ ID NO: 60 至 SEQ ID NO: 66 中之 SEQ ID NO之一者所示之核酸序列，
(c )編碼選自 SEQ ID NO: 18 至 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO : 40 至 SEQ ID NO : 48、SEQ ID NO : 55 至 SEQ ID NO : 60、SEQ ID NO : 67 至 SEQ ID NO : 72、SEQ ID NO: 73 至 SEQ ID NO: 120 或 SEQ ID NO: 121 至 SEQ ID NO: 132之多肽之核酸序列， (d)與（a)至（c)中任一者之序列互補之核酸， 或 (e )能在嚴謹條件下與（a ) 、 （ b ) 、 （ c )或（d )雜交且編碼多肽之核酸序列’其中包含該多肽之抗體或 彼之功能性片段與AXL之細胞外結構域結合， (f)如選自 SEQ ID NO: 144 及 SEQ ID NO: 145 與 SEQ ID NO: 1 48 及 SEQ ID NO : 149 中之 SEQ ID NO 之一 者所示之核酸序列， -24- 201105348 (g)編碼選自 SEQ ID NO: 146 及 SEQ ID NO: 147 與 SEQIDNO: 15 0及SEQ ID NO: 151之多肽之核酸序列， (h )與（f)或（g )中任一者之序列互補之核酸， 或 (i)能在嚴謹條件下與（f) 、（g)或（h)雜交且 編碼多肽之核酸序列，其中包含該多肽之抗體或彼之功能 性片段與AXL之細胞外結構域結合。
用語「在嚴謹條件下雜交」係指二個核酸片段在例如 Sambrook et al·，“Expression of cloned genes in E · coli” in Molecular Cloning: A laboratory manual ( 1989 )， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA所述 之標準雜交條件下互相雜交。該等條件係例如在約4 5 之 6倍SSC中雜交，隨後於50°C以2倍SSC進行清洗步驟，較 佳地於65°C之2倍SSC或於50°C之0.2倍SSC，較佳地於65 °C 之0.2倍 SSC。 本發明亦關於包含本發明之核酸分子之載體。該載體 可能爲例如噬菌體、質體、病毒或逆轉錄病毒載體。逆轉 錄病毒載體可能爲可複製性或複製缺陷性。在後者中，病 毒繁殖通常將僅發生於補充性宿主細胞。 本發明之核酸分子可能與包含用於在宿主中繁殖之選 擇性標記之載體連接。通常，質體載體利用沉澱法導入諸 如磷酸鈣沉澱法或氯化铷沉澱法，或利用帶電脂質複合體 或碳基底團族諸如富勒燃（fullerene)導入。當該載體爲 病毒時’其在應用至宿主細胞之前可能於活體外利用適當 -25- 201105348 之包裝細胞系包裝。 較佳地，本發明之載體係表現載體，其中該核酸分子 係與一或多個允許在原核及/或真核宿主細胞中轉錄及可 任意選擇地表現之控制序列可操作地連接。該核酸分子之 表現包含使該核酸分子之轉錄成爲較佳地可轉譯之mRNA 。確保在真核細胞（較佳地哺乳動物細胞）中表現之調節 元件係該領域之技藝人士所廣爲周知。它們通常包含確保 轉錄開始之調節序列及確保轉錄終止及穩定該轉錄物之可 任意選擇地多聚A信號。其他調節元件可能包括轉錄及轉 譯增強子。允許在原核宿主細胞中表現之可能的調節元件 包含例如在大腸桿菌中之lac、trp或tac啓動子，允許在真 核宿主細胞中表現之調節元件之例係酵母菌中之AOXI或 GAL1啓動子或哺乳動物及其他動物細胞中之CMV啓動子 ' SV40啓動子、RSV啓動子（勞氏（R0US)肉瘤病毒）、 CMV增強子、SV40增強子或球蛋白內含子。除了負責啓 動轉錄之元件以外，該調節元件亦可能包含該多核甘酸下 游之轉錄終止信號，諸如SV4〇-多聚A位置或tk-多聚A位置 。就此而論，適當之表現載體係該領域所知，諸如岡山（ Okayama)-伯格（Berg) cDNA表現載體pcDVl (法瑪西 亞（Pharmacia ) ) 、pCDM8 ' pRc/CMV、pcDNAl、 pcDNA3 (英維特基（Invitrogen))或 pSPORTI (吉貝可 (GIBCO BRL ))。較佳地’該載體係表現載體及/或基 因轉移或標靶載體。源自病毒（諸如逆轉錄病毒、牛痘病 毒 '腺相關病毒、皰疹病毒或牛乳突瘤病毒）之表現載體 -26- 201105348 可被用於遞送本發明之多核苷酸或載體至目標細胞族群。 該領域之技藝人士所廣爲周知之方法可被用於建構重組病 毒載體；見例如 Sambrook， Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ( 200 1， Third Editiοn ) N · Y ·及 Ausub e 1， Current Protoco 1 s in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y. ( 1994)中所描述之技術。或者
，本發明之核酸分子可被重組至脂質體以供遞送至目標細 胞。 本發明另關於包含本發明之載體之宿主。該宿主可爲 原核細胞、真核細胞或非人基因轉殖動物。存在於宿主中 之本發明之多核苷酸或載體可能被整合至該宿主之基因組 中或可能維持在染色體外。就此而言，亦可了解的是本發 明之核酸分子可被用於「基因標靶」及/或「基因取代」以恢 復突變基因或經由同源重組產生突變基因；見例如 Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8 7 ( 1 990 ) , 47 1 2- 4716; Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Press o 該宿主可爲任何原核細胞或真核細胞，諸如細菌、昆 蟲、真菌、植物、動物、哺乳動物或較佳地人細胞。較佳 之真囷細胞係例如酵母菌屬（Saccharomyces)，特別是 該些啤酒酵母菌（S. cerevisiae )。用語「原核」係意圖包 括所有可被轉形或轉染多核苷酸以表現本發明之變異多肽 之細菌。原核宿主可能包括革蘭氏陰性及革蘭氏陽性細菌 -27- 201105348
，諸如例如大腸桿菌（E. coli )、鼠傷寒沙門氏菌（S. typhimurium)、黏質色拉雷菌（Serratia marcescens)及 枯草桿菌（Bacillus subtilis )。編碼本發明之變異多肽之 突變型式之多核苷酸可利用該領域具有一般技藝之人士所 通常了解之任何技術被用於轉形或轉染該宿主。用於製備 融合、可操作地連接基因及於細菌或動物細胞中表現彼等 之方法係該領域所廣爲周知（Sambrook，Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory ( 2001，Third Edition)。該處所描述之基因建 構物及方法可被利用以於例如原核宿主中表現本發明之變 異抗體、抗體片段或彼等之衍生物。一般來說，含有幫助 該導入核酸分子有效轉錄之啓動子序列之表現載體係與該 宿主一起使用。該表現載體通常含有複製起點、啓動子及 終止子，以及能提供該經轉形細胞之表現型選擇之特定基 因。該經轉形之原核宿主可於醱酵器中生長，並根據該領 域已知之技術培養以達理想細胞生長。本發明之抗體、抗 體片段或彼等之衍生物接著可自該生長培養基、細胞溶解 物或細胞膜餾份中分離。經微生物或以其他方式表現之本 發明之抗體、抗體片段或彼等之衍生物之分離及純化可藉 由任何習知方法進行，諸如舉例來說製備型色層分離法及 諸如該些有關使用單株或多株抗體之免疫分離法。 在本發明之較佳實施態樣中，該宿主係細菌、真菌、 植物、二棲動物或動物細胞。較佳之動物細胞包括但不限 於中國倉鼠卵巢（CHO )細胞（CHO細胞，ATCC CCL-61 -28 - 201105348
)或彼之二氫葉酸還原酶缺陷株（Urlaub，G. and Chasin， L.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ( 1 980 ) 77，p.4126-4220 )、幼倉鼠腎（BHK )細胞、猴腎細胞（COS )( Gluzman，Y. Cell ( 1 98 1 ) 23，p.1 75- 1 82 及 ATCC CRL-1 650 )、源自小鼠纖維母細胞（ATCC No_ CRL- 1 65 8 )之 3T3細胞或NIH3T3細胞、NSO細胞及一些其他細胞系包括 人細胞例如Per. C6。在另一較佳之實施態樣中，該動物細 胞係昆蟲細胞。較佳之昆蟲細胞包括但不限於S F 9細胞系 之細胞。 在本發明更佳之實施態樣中，該宿主係人細胞或人細 胞系。該人細胞包括但不限於人胚胎腎細胞（HEK293、 293 T、2 93 Freestyle )。另外，該人細胞系包括但不限於 海拉（HeLa )細胞、人肝細胞癌細胞（例如Hep G2 )、 A 5 4 9細胞。 本發明亦提供含有本發明之一或多種核酸分子之基因 φ 轉殖非人動物，該動物可被用於產製本發明之抗體。抗體 可於羊、牛、馬、豬、大鼠、小鼠、兔、倉鼠或其他哺乳 動物之組織或體液（諸如乳汁、血液或尿液）中產製並自 該組織或體液中收集。見例如美國專利號碼5,827,690; 5,756,687;5,750,172及5,741，957。如上所述，含有人免 疫球蛋白基因座之非人基因轉殖動物可藉由以AXL或彼之 部分免疫加以製備。 本發明另’外關於一種製備抗體之方法’該方法包含在 允許合成該抗體及自該培養基收集該抗體之條件下培養本 -29- 201105348 發明之宿主。
該經轉形之宿主可於醱酵器中生長，並根據該領域已 知之技術培養以達理想細胞生長。一經表現後，本發明之 完整抗體、彼等之二聚物、個別輕鏈及重鏈或其他免疫球 蛋白型式可根據該領域之標準程序加以純化，包括硫酸銨 沉澱法、親和性管柱、管柱層析法、膠體電泳法及該類似 方法；見 Scopes, “Protein Purification”，Springer-Verlag， N.Y. ( 1982)。本發明之抗體或彼之對應免疫球蛋白鏈接 著可自該生長培養基、細胞溶解物或細胞膜餾份中分離。 經例如微生物表現之本發明之抗體或免疫球蛋白鏈之分離 及純化可藉由任何習知方法進行，諸如舉例來說製備型色 層分離法及諸如該些有關使用針對例如本發明之抗體之固 定區之單株或多株抗體之免疫分離法。
該領域之技藝人士將顯而易見的是，本發明之抗體可 另與其他基團偶聯以供例如藥物標靶及造影應用。該偶聯 可在表現對連接部位之抗體或抗原後以化學法進行，或該 偶聯產物可在DNA層級上經工程化成爲本發明之抗體或抗 原。該DN A接著於適當宿主系統中表現，且該經表現之蛋 白質被收集及需要時經復性。 在本發明之較佳實施態樣中，該抗體係與效應物偶聯 ，諸如放射性同位素或毒性化學治療劑。較佳地，該些抗 體共軛物可用於標靶表現AXL之細胞（例如癌細胞）以供 清除。本發明之抗體/抗體片段與放射性同位素之連接提 供例如腫瘤治療之優點。與化學治療及其他形式之癌症治 -30- 201105348 療不同的是，放射性免疫療法或投予放射性同位素-抗體 之組合直接以該癌細胞爲標靶，對周邊正常健康組織之傷 害極小。較佳之放射性同位素包括例如3H、14C、15N ' 35S、90γ、99Tc、lllIn、丨251、丨311。 另外，當與毒性化學治療劑諸如膠達納黴素（ geldanamycin ) ( Mandler et al., J. Natl. Cancer Inst., 92 (19)，1549-51 ( 2000))及美坦素（may tansin)例如
類美坦素藥物 DM1 ( Liu et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 : 8618-8623 ( 1 996 )及奧里斯塔丁 E ( auristatin-E)或單甲基奧里斯塔丁 E ( Doronina et al·， Nat. Biotechnol. 21: 778-784 ( 2003))或卡利許黴素（ calicheamicit)共軛時，本發明之抗體可被用於治療癌症 。在酸性或還原條件下或當暴露於特定蛋白酶時釋放藥物 之不同的連接子爲此技術所採用。本發明之抗體可如該領 域所描述之共軛。 本發明之實施態樣之一者係本發明之抗體或彼之功能 性片段之化學修飾。分子諸如聚合物（聚乙二醇或該類似 物）可被用來產製經修飾之抗體或經修飾之功能性片段。 本發明另關於包含本發明之抗體、核酸分子、載體、 宿主或由本發明之方法獲得之抗體之醫藥組成物。 此處所使用之用語「組成物」包含至少一種本發明之化 合物。較佳地，該組成物係醫藥性或診斷性組成物。 較佳地，該醫藥組成物包含醫藥上可接受之載體及/ 或稀釋劑。此處所揭示之醫藥組成物可能部分地用於治療 -31 - 201105348
與AX L表現、過度表現或高度活性有關、伴隨或導致AXL 表現、過度表現或高度活性之疾患，例如過度增生性疾病 、心血管疾病（特定地動脈粥樣硬化及血栓形成）、糖尿 病相關疾病（特定地腎小球肥大或糖尿病性腎病）。該疾 患包含但不限於癌症，例如乳癌、結腸癌、肺癌、腎癌、 濾泡淋巴瘤、骨髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、神經膠 母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、巴瑞特（Barrett ) 氏食道癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌及 頭頸癌，或其他增生性或腫瘤性疾病或其他AXL表現或過 度表現之疾病。 此處之用語「高度活性」係指不受控制之AXL傳訊，此 可能由負向調節缺乏及/或功能異常造成。舉例來說，負 向調節包含蛋白質之去磷酸化、降解及/或內吞作用。另 外，不受控制之AXL傳訊可能爲基因（不論是體基因或種 系基因）改變之結果，此導致AXL胺基酸序列之改變。
適當醫藥載劑、賦形劑及/或稀釋劑之實例係該領域 所廣爲周知且包括碟酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑，諸如 油/水乳劑、各種類型之潤濕劑、無菌溶液等。包含該載 劑之組成物可由廣爲周知之習知方法調製。該等醫藥組成 物可以適當劑量對個體投予。適當組成物之投予可藉由不 同方式進行，例如藉由靜脈內、腹腔內、皮下、肌肉內、 局部、皮內、鼻內或支氣管內投予。本發明之組成物亦可 被直接投予至目標部位，例如藉由生物彈道（bioli Stic ) 遞送至外部或內部標靶位置如腦部。投藥計畫將由主治醫 -32- 201105348 師及臨床因素決定。如醫學領域所廣爲周知的，任何一名 病患之劑量取決於許多因素，包括病患大小（size )、體 表面積、年齡、欲投予之特定化合物、性別、投予時間及
途徑、整體健康及被同時投予之其他藥物。蛋白質之醫藥 活性物質可能以每劑量介於1微克至100毫克/公斤體重之 量存在：然而，低於或高於此示範性範圍之劑量可被設想 ，特別是考慮前述因素。若該計畫係連續輸注，其亦應介 於每分鐘每公斤體重1皮克至100毫克之範圍。 藉由定期評估可監測進展。本發明之組成物可局部或 系統性投予。供非經腸投予之製劑包括無菌水性或非水性 溶液、懸浮液及乳劑。非水性溶劑之實例係丙二醇、聚乙 二醇、植物油諸如橄欖油及注射型有機酯類諸如油酸乙酯 。水性載劑包括水、酒精性/水性溶液、乳劑或懸浮液， 包括鹽水及緩衝介質。非經腸載劑包括氯化鈉溶液、林格 氏葡萄糖液、葡萄糖及氯化鈉溶液、乳酸林格氏液或固定 油。靜脈內載劑包括液體及營養補充液、電解質補充液（ 諸如該些以林格氏葡萄糖液爲基礎者）及該類似物。保存 劑及其他添加劑亦可存在，諸如舉例來說抗微生物劑、抗 氧化劑、螯合劑及惰性氣體及該類似物。另外，本發明之 醫藥組成物可能依該醫藥組成物之意圖用途而包含其他劑 特定較佳的是，該醫藥組成物包含至少一種額外之活 性劑’例如額外之抗腫瘤劑、小分子抑制劑、抗腫瘤劑、 化學治療劑或該些劑之組合。 -33- 201105348 本發明亦關於一種醫藥組成物，該醫藥組成物包含本 發明之人化抗AXL抗體與至少一種其他抗腫瘤劑之組合。 該組合能舉例來說有效地抑制異常細胞生長。
許多抗腫瘤劑係目前該領域所知。通常該用語包括所 有能預防、緩和及/或治療過度增生性疾患之劑。在一實 施態樣中’該抗腫瘤劑係選自治療性蛋白質，包括但不限 於抗體或免疫調節性蛋白質。在另一實施態樣中，該抗腫 瘤劑係選自小分子抑制劑或由有絲分裂抑制劑、激酶抑制 劑、烷化劑、抗代謝劑、嵌入劑、生長因子抑制劑、細胞 週期抑制劑、酶、拓樸異構酶抑制劑、組蛋白去乙醯酶抑 制劑、抗存活劑、生物反應調節劑、抗荷爾蒙劑例如抗雄 性素及抗血管新生劑組成之化學治療劑。
可與此處所提供之抗體組合使用之抗腫瘤劑之特定實 例包括吉非替尼（gefitinib)、拉帕替尼（lapatinib) ' 舒尼替尼（sunitinib)、培美曲塞（pemetrexed)、貝伐 珠單抗（bevacisumab)、西妥昔單抗（cetuximab)、伊 馬替尼（imatinib)、曲妥珠單抗（trastuzumab)、阿來 組單抗（alemtuzumab)、利妥昔單抗（rituximab)、埃 羅替尼（erlotinib)、硼替佐米（bortezomib)及該類似 物。其他被用於此處所描述及主張權利之組成物中之特定 抗腫瘤劑包括例如化學治療劑諸如卡培他濱（ capecitabine)、柔紅比星（daunorubicin)、柔紅黴素（ daunomycin)、更生黴素（dactinomycin)、多柔比星（ doxorubicin )、表阿黴素（epirubicin )、伊達比星（ -34- 201105348
idarubicin )、伊索比星（esorubicin)、博來黴素（ bleomycin)、馬磷醯胺（mafosfamide)、依弗醯胺（ ifosfamide)、胞喃 D定阿拉伯糖苷（cytosine arabinoside )、二氯乙基亞硝基脲（bis-chloroethylnitrosurea)、白 消安（busulfan)、絲裂黴素C( mitomycin C)、放線菌 素 D(actinomycin D)、光輝黴素（mithramycin)、強的 松（prednisone)、經助孕酮（hydroxyprogesterone)、 睪固酮（testosterone)、三苯氧胺（tamoxifen)、氮稀 口坐胺（dacarbazine )、甲基节肼（procarbazine )、六甲 密胺（hexamethylmelamine ) 、五甲密胺（ pentamethylmelamine )、米托惠酿（mitoxantrone)、安 口丫 Π定（amsacrine)、氯氨布西（chlorambucil)、甲基環 己基亞硝基脈（methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥（ nitrogen mustard)、美法斋（melphalan)、環磷醯胺（ cyclophosphamide ) 、6 -疏嘌 Π令（6-mercaptopurine) 、6- 硫鳥曙哈（6-thioguanine)、賽他命（cytarabine) (CA )、5 -氮雜胞喃陡核苷（azacytidine)、經基脲（ hydroxyurea)、脫氧柯福黴素（deoxycoformycin) 、4-控基過氧環磷醯胺、5-氟尿嚼'D定（5-fluorouracil) ( 5-FU )' 5-氟去氧尿苷（5-fluorodeoxyuridine ) ( 5-FUdR)、 甲胺碟哈 （methotrexate) ( MTX )、秋水仙驗 （ colchicine )、太平洋紫杉醇（taxol )、長春新鹼（ vincristine )、長春驗（vinblastine)、依托泊苷（ etoposide )、曲美沙特（trimetrexate)、替尼泊苷（ -35- 201105348 teniposide )、順氯氨鉑（c i s p 1 a t i η )及己烯雌酚（ diethylstilbestrol ) ( DES) ) 。一·般見 The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. 1 9 8 7, p p. 1 206- 1 22 8, Berkow et al.，eds.，Rahway, N.J·。特定較佳者係誘發細 胞凋亡之抗腫瘤劑。 本發明亦關於多株抗體，其包含超過一種本發明之抗 體。
當與該描述之AXL抗體一起使用時，該抗腫瘤劑可能 被單獨使用（例如5-FU與抗體）、連續使用（例如使用5-FU與抗體一段時間之後使用MTX與抗體）或與一或多種 其他該等抗腫瘤劑組合使用（例如5-FU、MTX與抗體，或 5-FU、放射線治療與抗體）。 用語「抗腫瘤劑」亦可包括治療程序，例如輻射或放射 線治療》
本發明之醫藥組成物係較佳地用於人醫但亦可能用於 獸醫目的。 此外，本發明關於本發明之抗體、本發明之核酸分子 、載體、宿主或由本發明之方法所獲得之抗體於製備供診 斷、預防或治療過度增生性疾病、心血管疾病（特定地動 脈粥樣硬化及血栓形成）、糖尿病相關疾病（特定地腎小 球肥大或糖尿病性腎病）及特定地與AXL表現、過度表現 或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、過度表現或高度 活性之疾患之用途。 以上提及之過度增生性疾病包括任何腫瘤，意即任何 -36- 201105348 異常及/或不受控制之組織新生。此處所使用之用語「不受 控制之組織新生』可能取決於生長調節之功能異常及/或喪 失生長調節。過度增生性疾病包括腫瘤疾病及/或癌症， 諸如轉移性或侵入性癌症。
在本發明之用途之較佳實施態樣中，該過度增生性疾 病係特定地乳癌、結腸癌、肺癌、腎癌、濾泡淋巴瘤、骨 髓性白血病、皮膚癌/黑色素瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢 癌、前列腺癌、胰癌、巴瑞特（Barrett )氏食道癌、胃癌 、膀胱癌、子宮頸癌、肝癌、甲狀腺癌及頭頸癌，或增生 性疾病、腫瘤病或其他AXL表現或過度表現之過度增生性 疾病。 在另一實施態樣中，本發明關於本發明之人化抗AXL 抗體於製備與抗腫瘤劑共同投予以治療上述疾患之一者的 藥物之用途。 根據其他較佳之實施態樣，本發明係關於本發明之人 φ 化抗AXL抗體於製備供治療藥物抗性癌症的醫藥組成物之 用途。 另外本發明關於一種診斷性組成物，其包含本發明之 抗體、本發明之核酸分子、載體、宿主或由本發明之方法 所獲得之抗體及可任意選擇地醫藥上可接受之載劑。 本發明之診斷性組成物係用於偵測哺乳動物AXL在不 同細胞、組織或另一適當樣本中之非所欲表現、過度表現 或高度活性’其包含使樣本與本發明之抗體接觸及偵測 AXL於該樣本中之存在。因此，本發明之診斷性組成物可 -37- 201105348 能被用於評估過度增生性疾病之起始或疾病狀態。 另外，惡性細胞諸如表現AXL之癌細胞可爲本發明之 抗體之標靶。已與本發明之抗體結合之細胞因此可能受到 免疫系統功能之攻擊，諸如補體系統或細胞媒介性細胞毒 性，藉此減少癌細胞之數目或清除癌細胞。這些考量同樣 地適用於轉移及復發性腫瘤之治療。
在本發明之另一態樣中，本發明之抗體係與標記基團 偶聯。如上已槪述，該等抗體係特別適用於診斷性應用。 此處所使用之用語「標記基團」係指可偵測之標記，例如經 放射線標記之胺基酸或可被經標記之抗生物素蛋白偵測之 生物素基團。各種用於標記多肽及糖蛋白諸如抗體之方法 係該領域所知且可被用於進行本發明。適當標記基團之實 例包括但不限於下列：放射性同位素或放射性核種（例如 3H、14C、l5N、35S、90Y、99Tc、丨丨Μη、1251、"丨1 )、螢 光基團（例如FITC、若丹明（rhodamine )、鑭系元素磷 光體）、酶基團（辣根過氧化酶、/3-半乳糖苷酶、螢光 素酶、鹼性磷酸酶）、化學發光基團、生物素基團或由第 二報告物識別之預先決定之多肽表位（例如白胺酸拉鍊對 序列、二次抗體之結合位、金屬結合結構域、表位標籤） 在特定態樣中，標記基團由各種長度之間隔臂連接以 減少潛在之立體阻礙係爲所欲。 在另一態樣中，本發明關於一種評估AXL表現細胞存 在之方法，該方法包含使本發明之抗體與彼等/彼之表面 -38- 201105348 疑似攜帶AXL之細胞或組織接觸。用於偵測樣本中AXL表 現之適當方法可能爲酶連接免疫吸附測定法（ELISA )或 免疫組織化學法（IHC )。 ELISAMJ f & $ tg & ◎丰反辛各 $ 中 ϋ @ , g 中 Μ $口 ◎ 滴板之孔槽被AXL抗體吸附。該等孔槽以阻斷劑諸如乳蛋 白質或白蛋白潤洗及處理以防止該分析物之非特異性吸附 。接著該孔槽係以測試樣本處理。在洗去該測試樣本或標 φ 準物之後，該孔槽以經標記（例如與生物素共軛）之第二 AXL抗體處理。在洗去多餘之第二抗體後，該標記係以例 如抗生物素蛋白共軛之辣根過氧化酶（HRP )及適當之發 色受質偵測。測試樣本中AXL抗原之濃度係藉由與標準樣 本所建立之標準曲線比較加以測定。 以IH C而言，可能使用石蠟包埋組織，其中該組織首 先係於例如二甲苯中去石蠘化，接著以例如乙醇脫水及蒸 餾水潤洗。被福馬林固定及石蠟包埋遮蔽之抗原表位可能 φ 由表位去遮化、酶消化或皂素加以暴露。以表位去遮化來 說，石蠟切片可能於表位修復溶液例如2N HC1溶液（pH 1.0)中在蒸鍋、水浴或微波爐中加熱20至40分鐘。在酶 消化之例中，組織切片可能在不同的酶（諸如蛋白酶K、 胰蛋白酶、鏈蛋白酶、胃蛋白酶等）溶液中於37 °C培養10 至3 0分鐘。在洗去表位修復溶液或多餘之酶後，組織切片 經阻斷緩衝液處理以防止非專一性交互作用。一級AX乙抗 體係以適當濃度添加。將多餘之一級AXL抗體洗去，切片 在過氧化酶阻斷溶液中於室溫中培養1 〇分鐘。在經另一次 -39- 201105348 清洗步驟後’組織切片與二次標記抗體培養，例如經可能 作爲酶之錨定之基團標記。因此實例爲經生物素標記之二 次抗體’該抗體被與辣根過氧化酶偶聯之鏈黴抗生物素蛋 白辨識。該抗體/酶複合物之偵測係藉由與適當發色受質 一起培養而達成。 在另一實施態樣中，本發明關於一種阻斷AXL功能之 方法’該方法包含使本發明之抗體在其中該抗體能阻斷 A XL功能之條件下與彼等/彼之表面疑似攜帶AXL之細胞或 組織接觸。該接觸可能在活體外或活體內。 本發明亦關於一種治療過度增生性疾病、心血管疾病 (特定地動脈粥樣硬化及血栓形成）、糖尿病相關疾病（ 特定地腎小球肥大或糖尿病性腎病）之方法，該方法包含 對有此需要之病患投予適當劑量之本發明之抗體或抗體片 段或彼之衍生物。該過度增生性疾病係較佳地選自與AXL 表現、過度表現或高度活性有關、伴隨或導致AXL表現、 過度表現或高度活性之疾患，諸如癌症例如乳癌、結腸癌 、肺癌、腎癌、濾泡淋巴瘤、骨髓性白血病、皮膚癌/黑 色素瘤、神經膠母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰癌、巴 瑞特（Barrett)氏食道癌、胃癌、膀胱癌、子宮頸癌、肝 癌、甲狀腺癌及頭頸癌，或增生性疾病、腫瘤病或其他 AXL表現或過度表現之過度增生性疾病。 根據本發明之另一較佳實施態樣，該將被治療之癌係 藥物抗性癌症，較佳地選自上述之癌。 本發明另關於一種治療疾病之方法，其中對哺乳動物 -40- 201105348 投予本發明之抗體且其中該疾病係與AXL之異常表現量或 活性直接或間接相關。 最後，本發明關於一種套組，其包含抗AXL抗體，較 佳地本發明之抗體、抗體片段或彼之衍生物，編碼該成分 之核酸分子及/或本發明之載體。 所有涵蓋此處所揭示之化合物之實施態樣可被用來作 爲單一化合物或組合以供製備藥物。
【實施方式】 實施例1 :產製AXL過度表現性Rati纖維母細胞作爲 免疫原 根據美國國家生物技術資訊中心（NCBI )參考序列 (NM_021913 )之人受體酪胺酸激酶AXL轉錄變異物1之 全長編碼序列經由限制性內切酶EcoRI及BamHI之側翼辨
識元件被次選殖至PLXSN，藉此形成逆轉錄病毒表現載體 pLXSN-hAXL。 爲了產製與人受體酪胺酸激酶AXL專一性結合之抗體 ，穩定地過度表現人AXL之Rati纖維母細胞係由逆轉錄病 毒基因轉移產製。簡言之，3xl05個Phoenix-E細胞被接種 於60毫米之培養皿上，利用磷酸鈣法轉染2微克/毫升之 pLXSN載體或pLXSN-hAXL。經過24小時後，利用其中已 經培養Phoenix-E細胞4小時之新鮮培養基更換培養基。釋 放pLXSN或pLXSN-hAXL單嗜性病毒之Phoenix-E細胞的上 清液被收集，並在聚凝胺（Polybrene) (4毫克/毫升；奧 -41 - 201105348 德里奇（Aldrich))存在時用於培養生長中Rati細胞（每 6公分培養皿2 X 1 05細胞）3小時。同時，p h 〇 e n i X - E細胞利 用新鮮培養基再度培養，再經3小時後在聚凝胺（4毫克/ 毫升；奧德里奇）存在時被用於二次感染Rati纖維母細胞 。同樣地，進行第三次感染週期。在更換培養基後，開始 以G4 18篩選Rati細胞。通常經21天之篩選後可挑選出穩定 克隆。
一組穩定之克隆經過繁殖及利用FACS分析定量膜定 位之人AX L表現。詳細地說，1 X 1 〇5細胞以1 〇 mM於P B S中 之E D T A收集，以F A C S緩衝液（P B S , 3 % F C S，0.4 %疊氮化 物）清洗一次，並接種至96孔圓底板。該等細胞以 lOOOrpm離心3分鐘以除去上清液，並重懸於小鼠抗AXL — 級抗體ΜΑΒΙ 54 ( R&D系統，3微克/毫升）中。細胞懸浮 液在冰上培養1小時，以FACS緩衝液清洗二次，且重懸於 1〇〇微升/孔之以FACS緩衝液稀釋50倍之PE共軛之驢抗小 鼠二級抗體（傑克森（Jackson )公司）中。該細胞懸浮 液於冰上及黑暗中培養30分鐘，以FACS緩衝液清洗二次 ，並利用Epics XL-MCL流式細胞儀（貝克曼庫爾特（ Beckman Coulter)公司）分析。 圖15A顯示經pLXSN空載體穩定感染之多株Ratl-Mock 族群及經pLXSN-hAXL穩定感染之Ratl-AXL cl.2之FACS分 析，且證實AXL在此代表性克隆之細胞表面過度表現。 此外，爲了產製適當之細胞性模型系統以供實驗目的 ，以類似Rati所述之程序產製穩定表現AXL之NIH3T3纖維 -42 - 201105348
母細胞。簡言之’ 3xl05個Phoenix-E細胞被接種於60毫米 之培養皿上，利用磷酸鈣法轉染2微克/毫升之pLXSN載體 或pLXSN-AXL cDNA。經過24小時後，利用其中已經培養 Phoenix-E細胞4小時之新鮮培養基更換培養基。釋放 pLXSN或pLXSN-hAXL單嗜性病毒之Ph〇enix-E細胞的上清 液被收集，並在聚凝胺（4毫克/毫升；奧德里奇）存在時 用於培養生長中NIH3T3細胞（每6公分培養皿2x1 05細胞 )3小時。同時，Phoenix-E細胞利用新鮮培養基再度培養 ，再經3小時後在聚凝胺（4毫克/毫升；奧德里奇）存在 時被用於二次感染NIH3T3纖維母細胞。同樣地，進行第 三次感染週期。在更換培養基後，開始以G4 1 8篩選 NIH3T3細胞。通常經21天之篩選後可挑選出穩定克隆。 一組穩定之克隆經過繁殖及利用FACS分析定量膜定 位之AXL表現。詳細地說，lxl〇5細胞以1〇 mM於PBS中之 EDTAlJ^S > (PBS, 3% FCS, 0.4%#^^^ )清洗一次，並接種至9 6孔圓底板。該等細胞以1 0 0 〇 r p m 離心3分鐘以除去上清液，並重懸於小鼠抗AXL—級抗體 ΜΑΒΙ 54 ( R&D系統，3微克/毫升）中。細胞懸浮液在冰 上培養1小時，以FACS緩衝液清洗二次，且重懸於100微 升/孔之以FACS緩衝液稀釋50倍之PE共軛之驢抗小鼠二級 抗體（傑克森公司）中。該細胞懸浮液於冰上及黑暗中培 養30分鐘，以FACS緩衝液清洗二次，並利用Epics XL-MCL流式細胞儀（貝克曼庫爾特公司）分析。 圖15B顯示經pLXSN空載體穩定感染之多株NIH3T3· -43- 201105348
Mock族群及經 pLXSN-hAXL穩定感染之 NIH3T3-AXL cl.7 之FACS分析，且證實AXL在此代表性克隆之細胞表面過 度表現。 實施例2 :產製大鼠抗AXL單株抗體
單株大鼠抗AXL抗體係藉由將大約lOxlO6 Ratl-AXL cl. 2冷凍細胞經腹腔內及皮下注射至Lou/C或Long Evans大 鼠以產製。經過8周間隔後，最後的補強注射在融合前3天 經腹腔內及皮下給予。骨髓瘤細胞系P3X63-Ag8.653與大 鼠免疫脾細胞之融合係根據標準程序進行及產生1 05雜交 瘤。經過2周後，收集來自雜交瘤之第一上清液並以初步 FACS篩選測試與NIH3T3-AXL c 1.7纖維母細胞及N IΗ 3 T 3-Mock對照細胞之結合。AXL結合陽性之克隆經進一步培養 。自該些克隆之50毫升上清液純化抗體，再次分析與 NIH3T3-AXL c丨.7纖維母細胞及NIΗ 3 T 3 - Μ o ck對照細胞上 之AXL的專一性結合。與NIH3T3-AXL cl.7纖維母細胞專 —性結合但不與NIH 3 T3-Mock對照細胞專一性結合之經純 化之抗體另於Akt-激酶磷酸化之ELISA中測試，且進行測 定同型之ELISA。爲了純化大鼠抗體，上清液以5 000g離 心20分鐘接著經無菌過濾。添加500微升之蛋白G瓊脂糖 凝膠FF，且在轉盤上於41培養至少1小時。瓊脂糖凝膠經 離心沉澱，丟棄上清液，在利用檸檬酸緩衝液（1 00mM ) pH 2.1溶離蛋白質前以PBS清洗蛋白G基質二次。溶離組 分藉由添加1 Μ T r i s p Η 8 · 0被立即再緩衝至中性p Η並以 -44- 201105348 PBS透析。
在受測之寡株抗體中，91株與^^13丁3-八乂1^(^1.7纖維 母細胞但非NIH3T3-Mock對照細胞專一性結合，9株在相 同細胞中抑制Gas6誘發之Akt磷酸化，然而71株刺激Akt磷 酸化。四株拮抗性抗體（I11B7、I10D12、I6E7及III11D5 ，在下列實施例中分別稱爲1 1B7、10D12、6E7及1 1D5 ) 、二株協同性抗體（II 1D7及III2A1 ;在下列實施例中稱 爲1 1D7及2A1 )及一株對照抗體（III1D5 ;在下列實施例 中稱爲1 D5 )係經冷凍保存及次選殖。 實施例3 :抗AXL抗體之結構及特徵 3 · 1大鼠抗體可變結構域之核苷酸序列 大鼠抗AXL抗體可變結構域係自雜交瘤細胞選殖。利 用 RNA抽取套組 RNeasy(RNeasy midi-kit,凯基（Qiagen )公司）製備RNA。編碼抗體基因之cDNA係利用5’RACE φ 套組（英維特基公司）根據廠商指示加以製備。 簡言之，第一股cDNA係利用基因特異性GSP1-引子及 SuperScriptTM II逆轉錄酶自總RNA或RNA合成。在第一股 cDNA合成後，該原始之mRNA模板藉由RNase Mix之處理 加以移除。接著在該cDNA之3’端添加同聚物尾。PCR放大 係利用Taq DNA聚合酶 '與位於cDNA分子內之位置黏合 之巢式基因特異性引子（GSP2 )及該套組提供之錨定引 子進行。在放大後，5’RACE產物被選殖至p+LXSN-ESK載 體以供定序。爲了幫助選殖，該錨定引子（AP)包括Sail -45- 201105348 之識別序列，GSP2引子含有Xhol位置。 GSP1弓|子： kappa GSP1 : GATGGATGCATTGGTGCAGC new kappa GSP 1 : atagatacagttggtgcagc heavy GSP 1 ： CAGGGTCACCATGGAGTTA GSP2弓I子：
XhoI-hGSP2 ：
CCGCTCGAGCGGGCCAGTGGATAGACAGATGG XhoI-kGSP2 ： CCGCTCGAGCGGCCGTTTCAGCTCCAGCTTGG 利用GSP引子以選殖大鼠抗AXL單株抗體： 1 1 B7 ： kappa GSP 1 ; XhoI-kGSP2 heavy GSP 1 ; XhoI-hGSP2
10D12 : kappa_GSP 1 , n e w_k ap p a_ G S P 1 ; XhoI-kGSP2 heavy GSP 1 ； XhoI-hGSP2 11D5 : new_kappa_GSP 1 ; XhoI-kGSP2 heavy GSP 1 ； XhoI-hGSP2 3.2大鼠抗AXL抗體可變結構域之胺基酸序列 大鼠抗體可變結構域序列係自被選殖至 體中之定序基因轉譯。該給定之胺基酸序列始於該可變結 構域之位置1 °抗體與彼之目標專一性結合所需之互補決 定區（CDR)係根據卡巴（Kabat)之定義（1<^匕316131· Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth -46 - 201105348
Edition. NIH Publication No. 9 1 -3 242, 1 99 1 )。該卡巴定 義係基於可變結構域中之序列變異性。該等抗體之抗AXL 專一性CDR區係列於圖14及SEQ ID NO: 121至SEQ ID NO :132。該個別之CDR包括下列位置： CDR-L1 ： 24-34 CDR-L2 : 50-56 CDR-L3 ： 8 9-97
CDR-H 1 ： 3 1 -3 5b CDR-H2 ： 50-65 CDR-H3 ： 95-102 大鼠1 1 B 7抗體輕鏈及重鏈可變區之胺基酸序列係分別 以SEQ ID NO: 140及141表示。大鼠11B7抗體之輕鏈及重 鏈亞型分別爲kappa及IgGl。 大鼠11D5抗體輕鏈及重鏈可變區之胺基酸序列係分 別以SEQ ID NO: 142及143表示。大鼠11D5抗體之輕鏈及 φ 重鏈亞型分別爲kappa及IgG2a。 3.3大鼠抗體之表現及純化 雜交瘤係於37°C、5-7% C02之Celline CL 1 000生物反 應器（英特格拉生物科技（Integra Biosciences)公司） 中使用包括4.5克/升葡萄糖、1%麩醯胺酸、1%丙酮酸鹽 、1% Pen/Strep之DMEM培養。FCS添加係1% FCS之營養 組成及5%低IgG FCS之細胞組成。每周進行二次收集及更 換培養基。細胞分裂1 /1 -> 1 /3 ’依細胞生長而定。產率藉 -47- 201105348 由SDS-PAGE分析每周測定一次。上清液儲存於_20°C直到 純化。持續培養物之黴漿菌測試每周進行一次。
抗體係利用蛋白A或G瓊脂糖凝膠FF ( GE醫療集團） 經由A k t a E X p 1 〇 r e r 1 0 0系統（G E醫療集團）純化。每次純 化分開裝塡管柱。管柱大小係經調整至各批量之預期產率 及大小（通常爲50至500毫克）。含有蛋白質之溶液係保 持於只要可能之冰上或4 °C中。無菌緩衝液及雙蒸餾水係 用於整個過程。 上清液經解凍後以50 mM TRIS pH 8.5緩衝，離心後 經0.22微米之膜過濾並裝載至管柱上。在以8倍管柱體積 (CV)之50 mM P04 pH 8.5清洗後，該抗體係於10 CV 100 mM甘胺酸pH 3.3內溶離。溶離組分藉由添加1/5 1 Μ Tris pH 8.0(每4毫升溶離組分添加1毫升Tris)被立即再 緩衝至中性pH ’接著以rSDS-P AGE分析。混合含有純抗體 之組分，以PBS於4°C透析並經無菌過濾。
緩衝系統之需求係根據各抗體之個別性質調整。特定 地，大鼠IgG2a抗體11D5係與蛋白G 4 FF基質（GE翳療集 團）結合並於高鹽條件（2M NaCl)下清洗。大鼠抗體 IgGl 11B7係於如11D5之高鹽條件下經由rProteinA ( GE醫 療集團）純化。抗體溶離係於pH 5.5進行。大鼠抗體純化 之流速必須保持低速以增加結合效率。 以第一純化步驟而言，可進行離子交換層析法（在個 別適當之條件下）或製備型大小排除層析法（P B S，p Η 7.4 )。 -48- 201105348 純化抗體之品質控制的標準程序包括： rSDS-PAGE凝膠分析；考馬斯或銀染色 BCA測試（皮爾斯（Pierce ) #23 227 BCA蛋白質測定 套組；大鼠IgG標準物#31233) 分析性大小排除（Superdex 200 Tricorn 10/300 GL， 約2 50毫克於25 0微升中；0.5毫升/分鐘，Akta Explorer 100 )
內毒素測試（LAL，Cambrex QCL-1000®發色性LAL終 點測定法#US50-648U ) 細胞式活性測定法（FACS結合；pAkt; pAXL ) 純化抗體係儲存於4°C或-20°C無菌條件下之PBS pH 7 · 4中，視彼等之穩定性而定。 該獲得之大鼠抗體中之一者11 B7係應用於實施例5、6 及1 6中。 3.4以FACS斯卡查德（scatchard )法測定抗體親和 性 人AXL過度表現NIH3T3細胞藉由以10 mM於PBS中之 EDTA培養收集，並以每毫升6百萬個細胞重懸於FACS緩 衝液（PBS pH 7.4, 3% FCS, 0.1% NaN3)。在圓底微滴板 中，將100微升之細胞懸浮液加入100微升之抗體溶液中， 該抗體溶液含有介於40至0.002微克/毫升（ 266至0.01 nM )於FACS緩衝液中之濃度的抗體1187、1105、（：111187-IgGl、chllB7-IgG2、chllD5-IgGl 或 chllD5-IgG2。允許 -49- 201105348
抗體結合於冰上進行2小時。接著，細胞以每孔250微升之 FACS緩衝液清洗二次，並重懸於200微升之經FACS緩衝 液稀釋50倍之二級抗體（抗-大鼠-PE ;傑克森公司）中。 經45分鐘之培養後，細胞再次以FACS緩衝液清洗二次， 並重懸於500毫升之PBS中以供FACS分析。分析以貝克曼 庫爾特公司之FACS FC500儀器進行。爲了測定表觀親和 常數KDapp，以平均螢光値對平均螢光與該對應之抗體濃 度（[M])之比作圖。得自該直線之逆斜率的經計算之 K D a ρ ρ列示於下： 克隆 KD値（ιιΜ ) 1 1 B7 0.38 chi 1 B7-IgG 1 0.6 1 1 D5 0.8 1 Chi 1 D5-IgGl 0.4 上列之KD値包括於實施例4所獲得之嵌合抗體之値。
實施例4 :大鼠抗AXL抗體之嵌合化 人/C輕鏈及重鏈IgG 1/2基因係如下述自人志願者之周 邊血液單核細胞（PBMC)選殖： 自全血製備PBMC。血液於室溫中經含10單位/毫升肝 素之PBS/2 mM EDTA稀釋1/2,5，浮置於15毫升之Biocoll 溶液之上並蓋上隔膜（diaphragm ) ( 35毫升/試管） [Biocoll購自拜爾控（Biochrom )公司#L61 15]。樣本於室 溫中以400xg離心30分鐘，倒掉血清（約15毫升）。使用 •50- 201105348
巴斯德吸管小心收集含有PBMC之介面。以PBS/2 mM EDTA清洗PBMC二次（第一次清洗100毫升，第二次清洗 50毫升），300xg離心10分鐘。細胞沉澱物以RPMI/10% FCS ( 25毫升）重懸，產生5.5x1 07 PBMC。利用購自凱基 公司之RNeasy套組（#7 5 1 42 )，遵照製造商指示自PBMC 製備RNA。經純化之RNA ( 30微克）係等分儲存於-80°C
抗體IgG gamma 1及2與kappa鏈之cDNA係自經分離之 RNA藉由使用Superskript III逆轉錄酶（英特維基公司 # 1 8 08 0-93 )之RT-PCR根據製造商指示加以製備，並利用 下列引子=
1 ) RT-gamma : GCG TGT AGT GGT TGT GCA
GAG 2) RT-gamma2 : ggg ctt gcc ggc cgt g
3) RT-kappa ： TGG AAC TGA GGA GCA GGT GG
4) 5’Blp : AG A TA A GCT TTG CTC AGC GTC CAC CAA GGG CCC ATC GGT
5) 3’Bam ( GAG) ： AG A TGG ATC CTC ATT T AC CCG GAG ACA GGG AGA G
6) 5’Bsi : AGA TA A GCT TCG TAC GGT GGC TGC ACC ATC TGT CTT CAT
7) 3’Bam(CTT) ： AGA TGG ATC CCT AAC ACT CTC CCC TGT TGA AGC TCT 引子溶解成l〇〇y M。RT-PCR反應係分別利用2 pmol -51 - 201105348 之寡RTr及RT/c進行，加入1微克之RNA、1〇mM之dNTP 混合物及加熱5分鐘至65 °C。添加4微升第一股緩衝液、1 微升0.1M DTT、1微升RNase抑制劑（40 U/微升，富酶泰 斯（Fermentas)公司 #EO0311)及 2微升 Superscript III RT，混合並於5〇°C培養1小時’之後於7〇t進行熱去活步 驟1 5分鐘。
2微升之第一股反應物被用於使用Taq聚合酶（優羅控 (Eurochrom)公司#EME0 1 000 1 )之第二步pcR以產生抗 體固定結構域之雙股DNA。利用下列PCR條件，使用引子 5’B1p及 3’Bam ( GAG)放大 r 鏈’ 5’Bsa3，Bam ( cTT) 放大/c鏈固定區：
/C鏈放大： 9 4〇C 1 2 0秒 9 4〇C 3 0秒 5 5〇C 3 0秒 7 2〇C 45秒循環35次 7 2〇C 10分鐘 r鏈放大： 9 4〇C 1 2 0秒 9 4〇C 3 0秒 4 5〇C 3 0秒 7 2〇C 6 0秒循環5次 -52- 201105348 9 4〇C 3 0秒 5 0°C 3 0秒 7 2〇C 60秒循環35次 7 2〇C 1 0分鐘
PCR產物係於TAE緩衝之2%洋菜凝膠上分析。發現/c 輕鏈有一條約350 bp之亮帶及重鏈r 1及r 2有一條約1000 bp之亮帶。該PCR產物利用Qiagen膠體抽取套組（凱基， #28784)根據製造商指示加以純化。爲了將該PCR片段選 殖至pcDNA3載體（英特維基公司）之多克隆位點， pCDNA3 載體及 PCR 片段係經 Hindlll ( 5，）及 BamHI ( 3，） 限制性內切酶之消化。限制性位點係於該等PCR引子內編 碼。經消化之片段利用Qiagen PCR純化套組（凱基， 28104)純化，編碼該γΐ、γ2及/c鏈之DNA由T4 DNA連 接酶於16°C隔夜作用被連接至pcDNA3載體。連接酶於65 °C去活1 〇分鐘。經連接之D N A質體利用標準程序被直接轉 形至CaCl2勝任大腸桿菌中，接著被接種至含安比西林（ Ampicillin )之LB板。於37°C隔夜培養後，挑選單獨菌落 '使懸浮於10微升H20，藉由PCR證實含有個別抗體鏈攜 帶質體（5微升懸浮細胞、T a q聚合酶、用於7 1 / r 2菌落 之引子5Β1ρ及3Bam ( GAG)及用於/c菌落之5Bsi及3Bam (CTT ))： 9 4 °C 1 2 0 秒 9 4 °C 3 0 秒
5 5〇C 3 0秒 -53- 201105348 72°C 60秒循環35次 72〇c 10分鐘 樣本係於1 .5%洋菜凝膠上分析PCR產物。選擇含有抗 體基因之菌落以接種於5毫升之LB/安比西林培養基。於37 C隔夜培養後，收集大腸桿菌並利用Qiagen miniprep套組 (凱基’ #12123 )製備DNA。對照消化物（Hindlll， BamHI )顯示預期大小之所有^及了鏈基因插入物；序列 於麥迪基諾米（Medigenomix)公司以DNA定序確認。 大鼠可變結構域係藉由PCR自pLXSN-ESK載體放大， 並經選殖至gl/g2及k PcDNA3載體以產生嵌合全長抗體。 可變VL結構域係由下列引子放大，該等引子在5’端含有 Hindlll及BsmI位點及在3,端含有BsiWI位點：
VL-11B7-5’ ： AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA
CAT CCA GAT GAC CCA GGC TCC
VL-1 1B7-35 ： AGA TCG TAC GTT TCA GCT CCA
GCT TGG TGC CTC
VL-1 1D5-55 ： AGA TAA GCT TGT GCA TTC CGA CAT CCA GAT GAC CCA GTC TCC ATC
VL-11D5-3’ ： AGA TCG TAC GTT TCA GCT TGG
TCC CAG 可變VH結構域係由下列引子放大，該等引子在5 ’端 含有Hindlll及BsmI位點及在3’端含有BlpI位點：
VH-1 1B7/1 1D5-55 ： AGA TAA GCT TGT GCA TTC
CGA GGT GCA GCT TCA GGA GTC AGG -54- 201105348
VH-l 1B7/1 1D5-35 ： AGA TGC TGA GCT GAC AGT
GAC CAT GAC TCC TTG GCC 輕鏈之BsiWI及重鏈之BlpI係位於固定區5’端之單獨 位點，使能與該變異結構域基因之3 ’端直接融合。 與源自 pLNOH2載體(Norderhaug et al. J. Immunol.
Methods 204, 1 997; Neuberger EΜB O J. 1 983; 2(8): 1 3 73 -8, 1 98 3 )之前導序列SEQ ID NO: 133融合，編碼該
嵌合抗體鏈之基因係選殖至pCEP載體系統以供重組表現 。輕鏈基因以Nhel(5’）及Xh〇I(3’）被選殖至PCEP4( 英特維基），重鏈基因以Kpul ( 5’）及Xhol ( 3’）被選殖 至 pCEP-Pu ( Kohfeld FEBS Vol 41 4; ( 3 ) 5 57ff, 1 997 )。 種於20x20公分板上之HEK293細胞利用標準CaP04轉 染方法經1微克/毫升之編碼輕鏈及重鏈基因之各個質體共 轉染以供瞬時表現。培養條件爲37°C、5% C02於含有5% 低IgG FCS、1%丙酮酸鹽、1%麩醯胺酸、1%青黴素（ penicillin) /鏈黴素（streptomycin)之 DMEM/F12 高葡萄 糖培養基。轉染24小時後，以新鮮培養基更換培養基。每 2至3天收集上清液共約3周。利用1毫升Hitrap rProtein A 管柱（GE醫療集團）自約600毫升之上清液純化嵌合抗體 ，使用如大鼠抗體純化所述之標準緩衝條件（裝載：5 0 mM Tris pH 8·5 ;清洗·· 50 mM P04 pH 8.5 ;溶離：1〇〇 mM甘胺酸pH 3.3 )。 該獲得之源自大鼠1 1 B7抗體之嵌合分子中之一者係.由 以SEQ ID NO : 136 (圖14 )之胺基酸序列爲代表之人 -55- 201105348
IgGl重鏈及以SEQ ID NO: 135(圖14)之胺基酸序列爲 代表之人/c輕鏈所組成。 該獲得之源自大鼠11 D5抗體之嵌合分子中之一者係 由以SEQ ID NO : 138 (圖14 )之胺基酸序列爲代表之人 IgGl重鏈及以SEQ ID NO: 137(圖14)之胺基酸序列爲 代表之人/C輕鏈所組成。
該等嵌合性11B7及11D5抗體（分別稱爲chllB7-IgGl 及chllD5-IgGl)係用於實施例3、13、14及17至20。 實施例5 :本發明之大鼠抗AXL抗體減少裸鼠中人前 列腺癌之生長
治療性抗體之抗腫瘤療效通常於人異種移植腫瘤試驗 中評估。在該些模型系統中，人腫瘤以異種移植物生長於 免疫不全小鼠，治療療效係由腫瘤生長抑制之程度加以測 量。此試驗之目的係評估本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體 1 1 B7是否干擾裸鼠中人前列腺癌細胞之腫瘤生長。簡言之 ，在第〇天時，7至8周齡之NMRrnu/nu公鼠（適應環境後體 重約30克）以1.5至2.0體積百分比之異氟烷於2升/分鐘之 氧氣流速麻醉，將lxl〇6 PC-3-LN細胞於25微升PBS中原位 移植至前列腺。PC-3-LN細胞係源自PC-3前列腺癌細胞系 ，該細胞系受編碼螢光素酶-新黴素融合蛋白之逆轉錄病 毒感染。腫瘤生長之發生及腫瘤生長進程因此可經由活體 內生物發光造影加以測量。爲達此目的，將螢光素經腹腔 內（i.P·)注射至小鼠，注射後1〇分鐘利用NightOWL LB -56- 201105348
981生物發光造影系統（德國伯托技術（Berthold Technologies )公司）測量光發射。在第一次治療前，小 鼠經隨機分組並進行統計測試以確保各包括丨〇隻動物之治 療組間起始腫瘤體積（平均値、中位數及標準差）之一致 性。第8天開始所有治療並持續至第34天，第35天進行屍 體剖檢。分別對第1及2組之動物經腹腔內（i · p.)投予2 5 毫克/公斤之同型對照抗體1D5及拮抗性大鼠抗AxL抗體 11B7每週3次（週一、週三、週五）。第3組動物接受口服 (ρ·ο.) 40毫克/公斤之舒癌特（Sutent) —天一次。第4 組動物接受三次12.5毫克/公斤之剋癌易（Taxotere)靜脈 (i.v.)注射’每次之間相隔4天。治療組之槪要如下所述
圖1 6顯示此實驗之結果。相較於同型對照抗體】D 5， 本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體11B7減少裸鼠中PC-3-LN 前列腺腫瘤之整體生長。
實施例6 :本發明之大鼠抗AXL抗體抑制人前列腺癌 之轉移 在如「本發明之大鼠抗AXL抗體減少裸鼠中人前列腺 癌之生長」所述之相同實驗中，在屍體解剖後分析P C _ 3 -LN腫瘤細胞移動至其他器官（轉移）以評估本發明之拮 抗性大鼠抗AXL抗體1 1B7之抗轉移效應。爲達此目的，經 選擇之器官（肝、脾、肺、股骨及腰椎之部分）係於屍體 解剖後收集、均質化，並添加螢光素。之後，利用 -57- 201105348
NightOWL LB 981生物發光造影系統（德國伯托技術公司 )測量光發射。 圖1 7顯示此實驗分析脾之結果。相較於同型對照抗體 1D5，本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體1 1B7減少脾轉移之 發生。値得注意的是，此實驗中1 1 B7之抗轉移效應相較於 紆癌特之效應爲強。在肝、肺、股骨及腰椎轉移方面得到 類似觀察。
實施例7 :人化抗體之設計 7.1 #11B7之人化版本之設計 7 . 1 · 1 # 1 1 B 7可變結構域之分子模擬
# 1 1 B 7可變結構域之分子模擬係根據該領域眾所周知 之同源模擬方法進行（Methods in Enzymology, 203，121-153 ( 1991))。在蛋白質資料庫（Nuc. Acid Res. 35, D301-D303 ( 2〇〇7))中登記之人免疫球蛋白可變結構域 之一級序列（可獲得源自X射線晶體結構之三維結構）係 與該經測定之#1 1B7可變結構域比較。結果顯示，UP T被 選擇爲與# U B 7輕鏈可變結構域具有最高序列同源性。另 外，1F8T被選擇爲與#1 1B7重鏈可變結構域具有最高序列 同源性。架構結構域之三維結構係根據藉由組合對應 #11B7輕鏈及重鏈之1JPT與1F8T的座標所獲得之「架構模 型」加以製備。以#11B7 CDR而言，根據索頓（Thornton )等人之分類（J. MoL Biol·，263, 800-815 ( 1996))， 將 CDRLi、CDRL2、CDRL3、CDRH,及 CDRH2分別分配至 -58- 201105348 集簇 11A、7A、9A' 10A及 9A。CDRH3根據 H3規則（FEBS letters 399，1-8(1996))被分類爲 k(3)。隨後，各 CDR之典型構型被納入該架構模型中。 最後，爲了獲得以能量而言#1 1 B7可變結構域之可能 的分子模型，進行能量計算以排除不利的原子間碰觸。這 些程序係利用可購得之三維蛋白質結構預測程式Prime及 座標搜尋程式MacroModel ( Schrddinger, LLC)進行。
7 . 1 . 2人化# 1 1 B 7之胺基酸序列之設計 人化#11B7抗體係根據該領域廣爲周知之CDR移植（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，1 0029- 1 0033 ( 1 989 ))方 法加以建構。接受者抗體係以二種根據該架構結構域內之 胺基酸同源性之方式選擇。 #11B7架構結構域之序列係與登錄於卡巴（Kabat)資 料庫（Nuc. Acid Res. 29，205-206 ( 2001))中有關抗體 φ 胺基酸序列之所有人架構區的序列比較。結果顯示’選擇 GM4672’CL抗體作爲接受者因爲彼等之架構結構域之間具 有72%之序列一致性。排列GM4672’CL之架構結構域的胺 基酸殘基與#11B7之對應胺基酸殘基以鑑別二者之間使用 不同胺基酸之位置。該些殘基之位置係利用B7因此建 構之三維模型分析。接著，將被移植至接受者之捐贈者殘 基係根據昆恩（Queen)等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，1 0029- 1 003 3 ( 1 989 ))所提供之標準加以選擇 -59- 201105348
1B7架構結構域之序列係與登錄於IgBLAST ( Nuc. Acid Res. 36，D25-D30 ( 2007))中之所有人架構區之序 列比較。結果顯示’選擇BAC01582作爲L鏈接受者因爲彼 等之架構結構域之間具有76%之序列一致性。選擇 A AF 8 002 8作爲Η鏈接受者因爲彼等之架構結構域之間具有 66%之序列一致性。排列BAC0 1 582 L鏈及AAF80028 Η鏈 中之架構結構域的胺基酸殘基與# 11 Β 7之對應胺基酸殘基 以鑑別彼等之間使用不同胺基酸之位置。該些殘基之位置 係利用# 1 1 Β 7因此建構之三維模型分析。接著，將被移植 至接受者之捐贈者殘基係根據昆恩（Queen)等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，10029-10033 ( 1989))所提供 之標準加以選擇。 在所有方法中，人化# 1 1 B 7序列係如下列實施例所述 藉由轉移一些經選擇之捐贈者殘基至該接受者抗體加以建 構。
7.1.3 #11B7輕鏈之人化（圖1、2及3) 7.1.3.1 h#llB7-TlL型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 140 (圖30B )所表示之 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、12 (脯胺酸 )、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、65 (絲胺酸）、66 (精胺 酸）、69 (絲胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）、73 (白胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺 -60- 201105348 酸）、85(天冬胺酸）、104(白胺酸）、106(白胺 及1 09 (脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、 酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、蘇 、苯丙胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸 丙胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所 之人化#11B7輕鏈可變區被稱爲“h#llB7-TlL”型輕 變區。 酸） 酪胺 胺酸 、苯 設計 鏈可
7.1.3.2 h#llB7-T2L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 140 (圖30B )所表 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、12 (脯 )、1 5 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、 絲胺酸）、66 (精胺酸）' 69 (絲胺酸）、72 (絲胺 、73 (白胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 硫胺酸）、85(天冬胺酸）、1〇4(白胺酸）、1〇6( φ 酸）及1 〇9 (脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺 丙胺酸、離胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸 丙胺酸 '麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、纈 、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 B 7輕鏈可 被稱爲“h#llB7-T2L”型輕鏈可變區。 7· 1 _3.3 h#l 1 B7-T3L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO ·· 140 (圖30B )所表 #11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸）、12(脯 示之 胺酸 65 ( 酸） (甲 白胺 酸、 '苯 胺酸 變區 示之 胺酸 -61 - 201105348 )、15 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、72 ( 絲胺酸）、7 9 (麩胺酸）、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸 )、85(天冬胺酸）、1〇4(白胺酸）、106(白胺酸）及 1 09 (脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸 、離胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺 酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 B 7 輕鏈可變區被稱爲"h#llB7-T3L”型輕鏈可變區。
7.1.3.4 h#llB7-T4L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B)所表示之 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、12 (脯胺酸 )、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、71 (酪胺 酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、100 (甘胺酸）、1〇6 ( 白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺 酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩 醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 B 7輕鏈 可變區被稱爲“h#llB7-T4L”型輕鏈可變區。 7. 1 .3.5 h#l 1 B7-T5L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B)所表示之 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、12 (脯胺酸 -62-
201105348 )、15 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸 精胺酸）、7 2 (絲胺酸）、7 9 (麩胺酸）、8 0 ( 、83 (甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、1〇〇 (甘 1 06 (白胺酸）及1 09 (腩胺酸）分別由絲胺酸、 纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩 脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺 酸取代所設計之人化# 1 1 B 7輕鏈可變區被稱爲 T5L”型輕鏈可變區。 7.1.3.6 11#1187-丁6]^型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B) #11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸）、12 )、1 5 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸 精胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 ( 、83 (甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、100 (甘 104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 (脯胺酸 絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘 胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、 、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人伯 鏈可變區被稱爲“h#llB7-T6L”型輕鏈可變區。 7.1.3.7 h#llB7-T7L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B) #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、I2 )、66 ( 絲胺酸） 胺酸）、 絲胺酸、 醯胺酸、 酸及蘇胺 ** h # 1 1 B 7 - 所表示之 (脯胺酸 )、66 ( 絲胺酸） 胺酸）' )分別由 胺酸、蘇 麩醯胺酸 :# 1 1 B 7 輕 所表示之 (脯胺酸 -63- 201105348
)、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸 )、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (天冬胺酸）、 1〇〇(甘胺酸）、1〇4(白胺酸）、106(白胺酸）及109( 脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺 酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙 胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取 代所設計之人化#1 1B7輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1B7-T7L” 型輕鏈可變區。 7.1.3.8 h#llB7-T8L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B)所表示之 #11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸）、12(脯胺酸 )、1 5 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 ( 甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸 )、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (天冬胺酸）、 1〇〇 (甘胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及1〇9 ( 脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺 酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙 胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取 代所設計之人化#1 1B7輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1B7-T8L” 型輕鏈可變區。 7.1.3.9 h#llB7-T9L型輕鏈： -64-
201105348 藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖 #11 B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸 )、15 (白胺酸）、4 3 (絲胺酸）、4 5 ( 精胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸） 、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 100 (甘胺酸）、104 (白胺酸）、106 (目 脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸 酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺 丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異 取代所設計之人化#1 1B7輕鏈可變區被稱 ”型輕鏈可變區。 7.1.3.10 h#llB7-T10L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 140 (圖 # 1 1 B 7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸 )、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、43 (精胺酸）' 47 (甲硫胺酸）、66 (精胺 酸）、7 9 (麩胺酸）、8 0 (絲胺酸）、8 3 85 (天冬胺酸）、100 (甘胺酸）、104 ( (白胺酸）及1 〇9 (脯胺酸）分別由絲胺丨 胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸 酸、麩醯胺酸、脯胺酸 '苯丙胺酸、蘇胺 纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之 可變區被稱爲“h#llB7-T10L”型輕鏈可雙
30B )所表示之 )、12 (脯胺酸 精胺酸）、66 ( 、79 (麩胺酸） (天冬胺酸）、 3胺酸）及109 ( 、丙胺酸、離胺 酸、脯胺酸、苯 白胺酸及蘇胺酸 U " h#11B7-T9L 3 0 B )所表示之 )、1 2 (脯胺酸 (絲胺酸）、45 酸）、7 2 (絲胺 (甲硫胺酸）、 白胺酸）、106 駿、絲胺酸、纈 、甘胺酸、蘇胺 酸、麩醯胺酸、 人化# 1 1 B 7輕鏈 |區。 -65- 201105348 7.1.3.11 h#llB7-TllL型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B)所表示之 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、12 (脯胺酸 )、1 5 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 ( 甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸 )、79(麩胺酸）、80(絲胺酸）、83(甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、1〇〇 (甘胺酸）、1〇4 (白胺酸）、106 ( 白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺 酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺 酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、 纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#1 1B7輕鏈 可變區被稱爲“h#llB7_TllL”型輕鏈可變區。 7.1.3.12 h#llB7-T12L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B)所表示之 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、12 (脯胺酸 )、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）' 66 (精胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸 )、79(麩胺酸）、80(絲胺酸）、83(甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、100 (甘胺酸）、1〇4 (白胺酸）、1〇6 ( 白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由絲胺酸 '絲胺酸' 纈月安 酸 '酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸 '苯丙胺酸、蘇胺 酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸’ -66-
201105348 纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之 可變區被稱爲“h#llB7-T12L”型輕鏈可缓 7.1.3.13 h#llB7-T13L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 140 (圖 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸 )、：15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、43 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺 酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、100(卞 白胺酸）、106 (白胺酸）及109 (脯胺酸 、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離 甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺 所設計之人化# 1 1 Β 7輕鏈可變區被稱爲“ 型輕鏈可變區。 7.1.3.14 h#llB7-T14L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 140 (圖 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸 )、15(白胺酸）、36(苯丙胺酸）、43 (精胺酸）、66 (精胺酸）、72 (絲胺酸 )、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 1〇〇(甘胺酸）、1〇6(白胺酸）及1〇9( 人化#1 1B7輕鏈 !區。 30B )所表示之 )、12 (脯胺酸 (絲胺酸）、45 酸）、71 (酪胺 (絲胺酸）、8 3 1安酸）、1 0 4 ( )分別由絲胺酸 胺酸、白胺酸、 脯胺酸、苯丙胺 酸及蘇胺酸取代 h#llB7-T13L" 30B )所表示之 )、12 (脯胺酸 (絲胺酸）、4 5 )、79 (麩胺酸 (天冬胺酸）、 丨甫胺酸）分別由 -67- 201105348 絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘 胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、 麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 B 7輕 鏈可變區被稱爲“h#llB7-T14L”型輕鏈可變區。 7.1.3.15 h#llB7-T15L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO : 140 (圖30B )所表示之 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、12 (脯胺酸 )、1 5 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 ( 甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸 )、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (天冬胺酸）、 1〇〇 (甘胺酸）、106 (白胺酸）及109 (脯胺酸）分別由 絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘 胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、 麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#Π B7輕 鏈可變區被稱爲“h#llB7-T15L”型輕鏈可變區。 7.1.3.16 h#llB7-T16L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 140 (圖30B )所表示之 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸）、12(腩胺酸 )、1 5 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、66 ( 精胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸） 、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、 1〇〇 (甘胺酸）、106 (白胺酸）及109 (脯胺酸）分別由 •68-
201105348 絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸 丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇 、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 輕鏈可變區被稱爲“h#UB7-T16L”型輕鏈可變區。 7.1.3.17 h#llB7-T17L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B)所表 #11B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸）、12(脯 )、1 5 (白胺酸）、3 6 (苯丙胺酸）、43 (絲胺酸） (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、72 ( 酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸 85(天冬胺酸）、100(甘胺酸）、106(白胺酸）2 (脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸 胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸 胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇 取代所設計之人化# 1 1 B 7輕鏈可變區被稱爲“ h# 1 T17L”型輕鏈可變區。 7.1.3.18 h#llB7-T18L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 140 (圖30B )所表 # 1 1 B 7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、1 2 (脯 )、1 5 (白胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、 甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲 )、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸） 、苯 胺酸 1 1 B7 示之 胺酸 、45 絲胺 )' t 109 、丙 、脯 胺酸 1B7- 示之 胺酸 47 ( 胺酸 -69 - '85 201105348 (天冬胺酸）、100 (甘胺酸）、106 (白胺酸）及109 ( 脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、丙胺酸、離胺 酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、腩 胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸 取代所設計之人化#11B7輕鏈可變區被稱爲“h#llB7-T 1 8 L ”型輕鏈可變區。
7.1.3.19 h#llB7-T19L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 140(圖30B)所表示之 # 1 1 B 7輕鏈可變區的胺基酸編號7 (丙胺酸）、1 2 (脯胺酸 )、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸 )、79(麩胺酸）、80(絲胺酸）、83(甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、1〇〇(甘胺酸）、1〇6(白胺酸）及1〇9( 脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺酸、酪胺酸、丙胺 酸、離胺酸、甘胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯 胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸 取代所設計之人化#〗1B7輕鏈可變區被稱爲“ h#llB7-T19L”型輕鏈可變區。 7.1.3.20 h#llB7-T20L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 140 (圖30B )所表示之 #1 1B7輕鏈可變區的胺基酸編號7(丙胺酸）、12(脯胺酸 )、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、43 (絲胺酸）、45 -70- 201105348
(精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、7 I (酪胺 酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、85 (天冬胺酸）、100 (甘胺酸）、106 ( 白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由絲胺酸、絲胺酸、纈胺 酸、酪胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、苯丙胺 酸' 蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩 醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#1 1B7輕鏈 可變區被稱爲“h#llB7-T20L”型輕鏈可變區。 7_1·4#11Β7重鏈之人化（圖4及5) 7.1.4.1 h#llB7-TlH型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 141(圖30C)所表示之 #ΠΒ7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸）、2(纈胺酸 )、1 7 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、39 ( 離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離胺 φ 酸）、45 (甲硫胺酸）、48 (甲硫胺酸）、67 (異白胺酸 )、68 (絲胺酸）、70 (蘇胺酸）、71 (精胺酸）、79 ( 苯丙胺酸）、81 (麩醯胺酸）、83 (天冬醯胺酸）、87 ( 絲胺酸）、88 (麩胺酸）、92 (蘇胺酸）、107 (纈胺酸 )及1 08 (甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、異白胺酸、蘇胺 酸、丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺 酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、纈胺 酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸 、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化# 1 1 B 7重鏈可變區被 -71 - 201105348 稱爲“h#llB7-TlH”型重鏈可變區。 7.1.4.2 h#llB7-T2H型重鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 141 (圖30C)所表示之 #11B7重鏈可變區的胺基酸編號1 (麩胺酸）、2 (纈胺酸 )、1 7 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、39 ( 離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離胺 酸）、45 (甲硫胺酸）、70 (蘇胺酸）、71(精胺酸）、 7 9(苯丙胺酸）、81 (麩醯胺酸）、83(天冬醯胺酸）、
8 7 (絲胺酸）、8 8 (麩胺酸）、92 (蘇胺酸）、107 (纈 胺酸）及1 08 (甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、異白胺酸、 蘇胺酸、丙胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、 甘胺酸、白胺酸、絲胺酸、纈胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲 胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所 設計之人化#11B7重鏈可變區被稱爲“h#llB7-T2H”型重 鏈可變區。 7. 1.4.3 h#l 1 B7-T3H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 141(圖30C)所表示之 #1 1B7重鏈可變區的胺基酸編號1 (麩胺酸）、17 (絲胺酸 )、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、40 (苯丙胺酸）、44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、79 (苯丙胺酸）' 81 (魅 醯胺酸）、8 3 (天冬醯胺酸）、8 7 (絲胺酸）、8 8 (麩胺 酸）、92(蘇胺酸）、107 (纈胺酸）及108 (甲硫胺酸） -72- 201105348 分別由麩醯胺酸、蘇胺酸、丙胺酸、絲胺酸、脯胺酸、甘 胺酸、白胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺 酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#1 1B7重 鏈可變區被稱爲“h#llB7-T3H”型重鏈可變區。 7.1.4.4 11#1187-丁411型重鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 141(圖30C)所表示之 #11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸）、6(麩胺酸 )、7 (絲胺酸）、9 (脯胺酸）、1 2 (纈胺酸）、1 6 (麩 醯胺酸）、1 7 (絲胺酸）、2 3 (絲胺酸）、2 5 (蘇胺酸） 、39(離胺酸）' 40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、48 (甲硫胺酸）、67 (異 白胺酸）' 6 8 (絲胺酸）' 70 (蘇胺酸）、79 (苯丙胺酸 )、8 1 (麩醯胺酸）、8 3 (天冬醯胺酸）、8 7 (絲胺酸） 、88(麩胺酸）、92(蘇胺酸）、107(纈胺酸）及1〇8( 甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸 、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸 、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸 、蘇胺酸 '絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、 丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化 #11B7重鏈可變區被稱爲“h#llB1-T4H”型重鏈可變區》 -73- 1 1.4.5 h#l 1B7-T5H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 141 (圖30C )所表示之 201105348
#11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸）、6(麩胺酸 )、7 (絲胺酸）、9 (脯胺酸）' 1 2 (纈胺酸）、16 (麩 醯胺酸）、1 7 (絲胺酸）、2 3 (絲胺酸）、2 5 (蘇胺酸） 、39(離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、7〇(蘇胺酸）、79(苯丙 胺酸）、8 1 (麩醯胺酸）、8 3 (天冬醯胺酸）、8 7 (絲胺 酸）、88 (麩胺酸）、92 (蘇胺酸）、107 (纈胺酸）及 1 08 (甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、 丙胺酸、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩 醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、絲胺酸、絲 胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺 酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11B7重鏈可變區被稱爲“ h#llB7-T5H” 型重鏈可變區》 7.1.4.6 11#1187-丁611型重鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 141 (圖30C)所表示之 #11Β·7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸）、16(麩醯胺 酸）、17 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、39 (離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離 胺酸）、45 (甲硫胺酸）、70 (蘇胺酸）、79 (苯丙胺酸 )、8 1 (麩醯胺酸）、8 3 (天冬醯胺酸）、8 7 (絲胺酸） 、88(麩胺酸）、92(蘇胺酸）、107(纈胺酸）及1〇8( 甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、 絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、 -74- 201105348 絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈 胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化# 1 1 B 7重鏈可變 區被稱爲“h#llB7-T6H”型重鏈可變區。 7·1·4·7 1ι#11Β7-Τ7Η型重鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 141(圖30C)所表示之 #11B7重鏈可變區的胺基酸編號ι(麩胺酸）、16(麩醯胺 酸）、17 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、39 (離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）·、44 (離 胺酸）、45 (甲硫胺酸）、48 (甲硫胺酸）、67 (異白胺 酸）、70(蘇胺酸）、79 (苯丙胺酸）、81 (麩醯胺酸） 、83(天冬醯胺酸）、87(絲胺酸）、88(麩胺酸）、92 (蘇胺酸）、1 07 (纈胺酸）及1 08 (甲硫胺酸）分別由麩 醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、 脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、 絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈 胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化# 1 1 B 7重鏈可變 區被稱爲“h#llB7-T7H”型重鏈可變區。 7.1.4.8 h#llB7-T8H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 141 (圖30C )所表示之 #11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸）、16(麩醯胺 酸）、17 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）'39 (離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離 -75- 201105348 胺酸）、45 (甲硫胺酸）、68 (絲胺酸）、70 (蘇胺酸） 、79(苯丙胺酸）、81(麩醯胺酸）、83(天冬醯胺酸） 、87 (絲胺酸）、88 (麩胺酸）、92 (蘇胺酸）、107 ( 纈胺酸）及1 〇 8 (甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩胺酸、 蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、 甘胺酸、白胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲 胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所 設計之人化#11B7重鏈可變區被稱爲“h#llB7-T8H”型重 鏈可變區。 7.1.4.9 h#llB7-T9H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 141(圖30C)所表示之 #11B7重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸）、16(麩醯胺 酸）、1 7 (絲胺酸）、2 3 (絲胺酸）、2 5 (蘇胺酸）、3 9 (離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）' 44 (離 胺酸）、4 5 (甲硫胺酸）、4 8 (甲硫胺酸）、6 7 (異白胺 酸）、6 8 (絲胺酸）、7 0 (蘇胺酸）、7 9 (苯丙胺酸）、 8 1 (麩醯胺酸）、8 3 (天冬醯胺酸）、8 7 (絲胺酸）、8 8 (麩胺酸）、9 2 (蘇胺酸）、1 0 7 (纈胺酸）及1 〇 8 (甲硫 胺酸）分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺 酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白 胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺 酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設 計之人化#11B7重鏈可變區被稱爲“ h#11B7-T9H”型重鏈 -76- 201105348 可變區。 7·1_4·101ι#11Β7-Τ10Η型重鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 141(圖30C)所表示之 #11B7重鏈可變區的胺基酸編號1 (鍵胺酸）、6 (魅胺酸 )、7 (絲胺酸）、9 (脯胺酸）、12 (纈胺酸）、16 (魅 醯胺酸）、1 7 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸） 、39(離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、48 (甲硫胺酸）、67 (異 白胺酸）、70(蘇胺酸）、79 (苯丙胺酸）、81(麩醯胺 酸）、8 3 (天冬醯胺酸）、8 7 (絲胺酸）、8 8 (麩胺酸） 、92 (蘇胺酸）、107 (纈胺酸）及108 (甲硫胺酸）分別 由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺 酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺 酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、絲胺酸、絲胺 酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸 及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 B 7重鏈可變區被稱爲“ h#llB7-T10H”型重鏈可變區。 7.1.4.11 h#llB7-TllH型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 141(圖30C)所表示之 # 1 1 B 7重鏈可變區的胺基酸編號1 (麩胺酸）、6 (麩胺酸 )、7 (絲胺酸）、9 (脯胺酸）、：1 2 (纈胺酸）、1 6 (麩 醯胺酸）、1 7 (絲胺酸）、2 3 (絲胺酸）、2 5 (蘇胺酸） -77- 201105348 、39(離胺酸）、40(苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、68 (絲胺酸）、70 (蘇胺 酸）、79(苯丙胺酸）、81 (麩醯胺酸）、83(天冬醯胺 酸）、8 7 (絲胺酸）、8 8 (麩胺酸）、9 2 (蘇胺酸）、
1 07 (纈胺酸）及1 08 (甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩醯 胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺酸' 蘇胺酸、蘇胺 酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺 酸、蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸 、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化 #11B7重鏈可變區被稱爲“h#llB7-TllH”型重鏈可變區 7_1·4·12 h#llB7-T12H型重鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 141(圖30C)所表示之 #11B7重鏈可變區的胺基酸編號！（麩胺酸）、6(麩胺酸 )' 7 (絲胺酸）、9 (脯胺酸）、12 (纈胺酸）、1 6 (麩 醯胺酸）、1 7 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸） ' 39(離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬胺酸）、44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、48 (甲硫胺酸）、67 (異 白胺酸）、68 (絲胺酸）、70 (蘇胺酸）、79 (苯丙胺酸 )、81 (麩醯胺酸）、83 (天冬醯胺酸）、87(絲胺酸） 、88(麩胺酸）、92(蘇胺酸）、1〇7(纈胺酸）及1〇8( 甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸 、白胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸 -78- 201105348 、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸 '蘇胺酸、絲胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、 丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化 #11B7重鏈可變區被稱爲“h#llB7-T12H”型重鏈可變區 7.2 #11D5之人化版本之設計
7.2 . 1 # 1 1 D 5可變結構域之分子模擬 #11 D5可變結構域之分子模擬係根據該領域眾所周知 之同源模擬方法進行（1^111〇£18 111£1^)〇11〇1〇§>^ 203,121-153 ( 1991))。在蛋白質資料庫（Nuc. Acid Res. 35, D3 0 1-D3 03 ( 2007 ))中登記之人免疫球蛋白可變結構域 之一級序列（可獲得源自X射線晶體結構之三維結構）係 與該經測定之# 1 1 D 5可變結構域比較。結果顯示，1 D 5 I被 選擇爲與#1 1D5輕鏈可變結構域具有最高序列同媽性。另 外，10RS被選擇爲與#11D5重鏈可變結構域具有最高序列 同源性。架構結構域之三維結構係根據藉由組合對應 #11D5輕鏈及重鏈之1D5I與10RS的座標所獲得之「架構模 型」加以製備。以#11D5 CDR而言，根據索頓（Thornton )等人之分類（J. Mol. Biol·，263，800-815 ( 1996))， 將 CDRL,、CDRL2、CDRL3、分別分配至 集簇 11A、7A、9A、10A及 9A。CDRH3 根據 H3規則（FEBS letters 3 99，1 -8 ( 1 996 ))被分類爲 k ( 3 )。隨後，各 CDR之典型構型被納入該架構模型中。 -79 - 201105348 最後，爲了獲得以能量而言# 1 1 D 5可變結構域之可能 的分子模型’進行能量計算以排除不利的原子間碰觸。這 些程序係利用可購得之三維蛋白質結構預測程式P ri m e及 座標搜尋程式 MacroModel ( Schr0dinger，LLC )進行。
7.2.2人化#1 1D5之胺基酸序列之設計 人化#11D5抗體係根據該領域廣爲周知之CDR移植（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，10029-10033 ( 1 989 ))方 法加以建構。接受者抗體係以二種根據該架構結構域內之 胺基酸同源性之方式選擇。
#11D5架構結構域之序列係與登錄於卡巴（Rabat)資 料庫（Nuc. Acid Res. 29，205-206 ( 2001))中有關抗體 胺基酸序列之所有人架構區的序列比較。結果顯示，選擇 T3 3-4’CL抗體作爲接受者因爲彼等之架構結構域之間具有 70%之序列一致性。排列T3 3-4’CL之架構結構域的胺基酸 殘基與#1 1D5之對應胺基酸殘基以鑑別二者之間使用不同 胺基酸之位置。該些殘基之位置係利用#1 1 D5因此建構之 三維模型分析。接著，將被移植至接受者之捐贈者殘基係 根據昆恩（Queen)等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1 0029- 1 003 3 ( 1 98 9 ))所提供之標準加以選擇。 #1 1D5架構結構域之序列係與登錄於IgB LAST ( Nuc. Acid Res· 36，D25-D30 ( 2007))中之所有人架構區之序 列比較。結果顯示，選擇1603 260B作爲L鏈接受者因爲彼 等之架構結構域之間具有74%之序列一致性。選擇 •80-
201105348 AAF8 002 8作爲Η鏈接受者因爲彼等之架構結構域之 66%之序列一致性。排列1 603260Β L鏈及AAF80028 之架構結構域的胺基酸殘基與#11D5之對應胺基酸 鑑別彼等之間使用不同胺基酸之位置。該些殘基之 利用# 1 1 D 5因此建構之三維模型分析。接著，將被 接受者之捐贈者殘基係根據昆恩（Queen )等人 Natl. Acad. Sci. USA 86, 1 0029- 1 0033 ( 1 989 )) 之標準加以選擇。 在所有方法中，人化# 1 1 D 5序列係如下列實施 藉由轉移一些經選擇之捐贈者殘基至該接受者抗體 構。 7.2.3 #11D5輕鏈之人化（圖6、7、8、9、10及 7.2.3.1 h#llD5-TlL型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所 φ #1】〇5輕鏈可變區的胺基酸編號2(異白胺酸）、 硫胺酸）、1 3 (蘇胺酸）、1 5 (白胺酸）、3 6 (苯 )、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸） 精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 ( )、7 1 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸） 絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、1 胺酸）、1 06 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由纈 白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺 胺酸、白胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺 間具有 Η鏈中 殘基以 位置係 移植至 (Proc. 所提供 例所述 加以建 11 ) 表示之 1 1 (甲 丙胺酸 ' 4 6 ( 絲胺酸 、80 ( 00 (絲 胺酸、 酸、離 酸、蘇 -81 - 201105348 胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸 、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#1 1 D5輕鏈可變區 被稱爲“h#llD5-TlL”型輕鏈可變區。 7.2.3.2 h#llD5-T2L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #1 1D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸）、13(蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、4 0 (纈胺酸）、4 3 (絲胺酸）、 46 (精胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、72 (絲胺 酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、 85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、1〇6 (白胺酸）及109 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙 胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯 胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、異白胺酸及蘇胺酸 取代所設計之人化#1 1D5輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1D5-T2L ”型輕鏈可變區。 7.2.3.3 h#llD5-T3L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 142 (圖30D )所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、7 2 (絲胺酸）、7 9 (麩胺酸）、 8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、1 0 6 (白胺酸）及1 〇 9 ( 脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、麩醯 胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計 -82- 201105348 之人化#11D5輕鏈可變區被稱爲“h#llD5-T3L”型輕 變區。 7.2.3.4 h#llD5-T4L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 1 42 (圖30D )所表 # 1 1 D5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、j 3 胺酸）、1 5 (白胺酸）、3 6 (苯丙胺酸）、4 0 (纈胺 、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）' 47 (甲硫胺酸）、 精胺酸）、69(絲胺酸）、70 (天冬胺酸）、71 (酪 )、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）' 甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、1 〇〇 (絲胺酸）、1 〇4 胺酸）、1 06 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺 丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸 胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸 醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、纈胺 異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 D 5輕鏈可變 稱爲“h#llD5-T4L”型輕鏈可變區。 7.2.3.5 h#l 1 D5-T5L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號n (甲硫胺酸）、13 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸 66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、72 (絲胺酸）、79 ( 酸）、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺 鏈可
示之 (蘇 酸） 66 ( 胺酸 83 ( (白 酸、 '白 、麩 酸、 區被 示之 (蘇 )' 麩胺 酸） -83 - 201105348 、100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙 胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯 丙胺酸、蘇胺酸、甘胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取 代所設計之人化#1 1D5輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1D5-T5L” 型輕鏈可變區。
7.2.3.6 h#llD5-T6L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 # 1 1 D 5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、1 3 (蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺 酸）、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）
、1 〇 〇 (絲胺酸）、1 0 4 (白胺酸）、1 0 6 (白胺酸）及1 0 9 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙 胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯 丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸 取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱爲“h#llD5-T6L ”型輕鏈可變區。 7.2.3.7 h#llD5-T7L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #1 1D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸）、13(蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸） -84- 201105348
、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 ( 精胺酸）、6 9 (絲胺酸）、7 0 (天冬胺酸）、71 (酪胺酸 )、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 ( 甲硫胺酸）、85 (異白胺酸）、1〇〇 (絲胺酸）、1〇4 (白 胺酸）、1 06 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺酸、 丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、腩胺酸、丙胺酸、離胺酸、白 胺酸' 甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩 醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸 、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#1 1 D5輕鏈可變區 被稱爲“h#llD5-T7L”型輕鏈可變區。 7.2.3.8 h#llD5-T8L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #1 1D5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲 胺酸）、70 (天冬胺酸）、7 1 (酪胺酸）、72 (絲胺酸） 、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、85 ( 異白胺酸）、1 〇〇 (絲胺酸）、1 04 (白胺酸）、1 06 (白 胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸 、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、 麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代 所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱爲"h#llD5-T8L”型 -85- 201105348 輕鏈可變區。 7.2.3.9 h#llD5-T9L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 # 1 1 D 5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、1 3 (蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸）
、43 (絲胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 ( 絲胺酸）、70 (天冬胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸 )、79(麩胺酸）、80(絲胺酸）、83(甲硫胺酸）、85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 ( 白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺 酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸 、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙 胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取 代所設計之人化#1 1D5輕鏈可變區被稱爲"h#l 1D5-T9L” 型輕鏈可變區。 7.2.3.10 h#llD5-T10L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫胺酸）、13(蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲 胺酸）、70 (天冬胺酸）、7 1 (酪胺酸）、72 (絲胺酸） 、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、85 ( -86- 201105348 異白胺酸）、100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白 胺酸）及109 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸 、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、 麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代 所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱爲“h#llD5-Tl〇L，， 型輕鏈可變區。
7,2.3.1111#1105-1'111^型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 1 42 (圖30D )所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號ιι(甲硫胺酸）、13(蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 ( 精胺酸）、69 (絲胺酸）、7 1 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）
、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、85 ( 異白胺酸）、100 (絲胺酸）、1 04 (白胺酸）、106 (白 胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸 、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、 蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙月安 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代 所設計之人化#1 1D5輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1D5-T1〗L” 型輕鏈可變區。 7.2.3.12 h#llD5-T12L型輕鏈： -87- 201105348 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸）、13( 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸 、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 精胺酸）、69 (絲胺酸）、70 (天冬胺酸）、72 (絲胺 )、7 9 (麩胺酸）、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、 (異白胺酸）、1〇〇 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈 酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、白胺酸、甘胺 、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取 所設計之人化#1 1D5輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1D5-T12L 型輕鏈可變區。 7.2.3.13 h#llD5-T13L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸）、13( 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸） 47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、70 ( 冬胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸 、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸） 1〇〇 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙 酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇 之 蘇 ) ( 酸 8 5 ( 胺 酸 胺 代 之 蘇 天 ( 胺 胺 -88- 201105348 酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸'麩醯胺酸、 纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11D5輕鏈 可變區被稱爲"h#llD5-T13L”型輕鏈可變區。 7.2.3.14 h#llD5-T14L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 # 1 1 D 5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、1 3 (蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 • 45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、7〇 (天冬 胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸），79 (麩胺酸）、 8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、1 〇〇 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及1〇9 (脯 胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸 、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸 、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈 胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 D 5輕鏈可 變區被稱爲“h#llD5-T14L”型輕鏈可變區。 7.2.3.15 h#llD5-T15L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 142 (圖30D )所表示之 #1 1D5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲 胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、 -89- 201105348 80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、1 04 (白胺酸）、1 〇6 (白胺酸）及109 (脯 胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸 、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸 、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈 胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 D 5輕鏈可 變區被稱爲“h#llD5-T15L”型輕鏈可變區。
7.2.3.16 h# 11 D5-T16L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 142 (圖30D )所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲 胺酸）、70 (天冬胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）
、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、 100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 ( 脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺 酸、離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸 、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈 胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#U D5輕鏈可 變區被稱爲“h#llD5-T16L”型輕鏈可變區。 7.2.3.17 h#llD5-T17L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 -90 - 201105348 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、：15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、70 (天 冬胺酸）、7 1 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸） 、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、
1 〇〇 (絲胺酸）、1 〇4 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 ( 脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺 酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺 酸、·麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、 纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#11 D5輕鏈 可變區被稱爲“h#llD5-T17L”型輕鏈可變區。 7.2.3.18 h#llD5-T18L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 # 1 1 D 5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、1 3 (蘇 φ 胺酸）、15(白胺酸）、36(苯丙胺酸）、40(纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 ( 絲胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸） ' 8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、 1〇〇 (絲胺酸）' 104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 ( 脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺 酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺 酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、 纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#1 1D5輕鏈 -91 - 201105348 可變區被稱爲“h#llD5-T18L”型輕鏈可變區。 7.2.3.19 h#llD5-T19L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、：15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸）
、43 (絲胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 ( 絲胺酸）、70 (天冬胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸 )、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、 100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 ( 脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺 酸、丙胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸 、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈 胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化# 1 1 D 5輕鏈可 變區被稱爲“h#llD5-T19L”型輕鏈可變區。
7.2.3.20 h#llD5-T20L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 142 (圖30D )所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸）、13(蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲 胺酸）、71 (酪胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、 80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、85 (異白胺酸）、1〇〇 (絲胺酸）、1 〇4 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 (脯 -92- 201105348 胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸 、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸 、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈 胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化D5輕鏈可 變區被稱爲“h#llD5-T20L”型輕鏈可變區。 7·2_3·21 h#llD5-T21L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 # 1 1 D5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、1 3 (蘇 胺酸）、15(白胺酸）、36(苯丙胺酸）、40(纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲 胺酸）、70 (天冬胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸） 、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、 1〇〇 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 ( 脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺 酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸 、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈 胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#1 1D5輕鏈可 變區被稱爲“h#llD5-T21L”型輕鏈可變區。 7·2·3·22 h#llD5-T22L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號η (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸） -93- 201105348 、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、47 (甲硫胺酸）' 66 ( 精胺酸）、6 9 (絲胺酸）、7 2 (絲胺酸）、7 9 (麩胺酸） 、8 0 (絲胺酸）、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、 100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、1〇6 (白胺酸）及109 ( 脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺 酸、丙胺酸' 離胺酸、白胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸 、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈 胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#1 1D5輕鏈可 變區被稱爲“h#llD5-T22L”型輕鏈可變區。 7.2.3.23 h#llD5-T23L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸）、13(蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、70 (天冬胺酸）、71 (酪 胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、 83 (甲硫胺酸）、85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、1 06 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺 酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸 、麩胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙 胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取 代所設計之人化#1 1D5輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1D5-T23L ”型輕鏈可變區。 -94-
201105348 7·2_3·24 h#llD5-T24L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D) #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫胺酸） 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲 4 7 (甲硫胺酸）、6 6 (精胺酸）、6 9 (絲胺酸） 胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲 8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、1 〇 〇 (絲胺篇 (白胺酸）、1 〇6 (白胺酸）及1 〇9 (脯胺酸）分 酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸 、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺 胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及 代所設計之人化# 1 1 D 5輕鏈可變區被稱爲“ h# 1 ”型輕鏈可變區。 7.2.3.25 h#llD5-T25L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D) #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫胺酸） 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲 47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸） 冬胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 ( 、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、1 〇〇 (絲 104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及1〇9 (脯胺酸 白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白 胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯
所表示之 、13 (蘇 胺酸）、 、71 (酪 胺酸）、 1) '104 別由白胺 、甘胺酸 酸、苯丙 蘇胺酸取 1D5-T24L 所表示之 ' 13 (蘇 胺酸）、 、70 (天 絲胺酸） 胺酸）、 )分別由 胺酸、甘 胺酸、苯 -95- 201105348 丙胺酸 '蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸 取代所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱爲“ h#llD5-T2 5L”型輕鏈可變區。 7.2.3.26 h#llD5-T26L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸）、13(蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、71 (酪胺 酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、1 00 (絲胺酸）、1 04 ( 白胺酸）、1 06 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺酸 、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、 蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代 所設計之人化#1 1D5輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1D5-T26L” 型輕鏈可變區。 7.2.3.27 h#llD5-T27L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 # 1 1 D5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、1 3 (蘇 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 45(精胺酸）、66(精胺酸）、69(絲胺酸）、70(天冬 胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、8 0 (絲胺酸）、 -96- 201105348 83 (甲硫胺酸）、85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸 (白胺酸）、1 〇6 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分另! 酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、 、蘇胺酸 '麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇辟 所設計之人化# 1 1 D 5輕鏈可變區被稱爲“ h# 1 1 D 5 . 型輕鏈可變區。 )' 1〇4 丨由白胺 甘胺酸 苯丙胺 :酸取代 • T 2 7 L ”
7.2.3.28 h#llD5-T28L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所 # 1 1 D 5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲肢 4 5 (精胺酸）、4 7 (甲硫胺酸）、6 6 (精胺酸）、 胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、8 0 (絲辟 8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、1 〇 〇 (絲胺酸 (白胺酸）、1 〇 6 (白胺酸）及1 〇 9 (脯胺酸）分gl 酸、丙胺酸、纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、 、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇辟 所設計之人化#11D5輕鏈可變區被稱爲“h#11D5. 型輕鏈可變區。 7.2.3.29 h#llD5-T29L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D) 表示之 13 (蘇 酸）、 69 (絲 酸）、 )'104 由白胺 白胺酸 苯丙胺 酸取代 T 2 8 L ” 表示之 -97- 201105348 # 1 1 D 5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、1 3 (蘇 胺酸）、15(白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40(纈胺酸）
、43 (絲胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、71 (酪 胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、 83 (甲硫胺酸）、85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、1 06 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺 酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸 、蘇胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙 胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取 代所設計之人化#1 1 D5輕鏈可變區被稱爲“ h#l 1 D5-T29L ”型輕鏈可變區。 7.2.3.30 h#llD5-T30L型輕鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO : 142 (圖30D )所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11(甲硫胺酸）、13(蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、70 (天 冬胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸） 、8 3 (甲硫胺酸）、8 5 (異白胺酸）、1 00 (絲胺酸）、 104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 (脯胺酸）分別由 白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘 胺酸、蘇胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯 丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸 取代所設計之人化#1 1D5輕鏈可變區被稱爲"h#l 1D5- -98- 201105348 T30L”型輕鏈可變區。 7.2.3.31 h#llD5-T31L型輕鏈·· 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #1 1D5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、15(白胺酸）、36(苯丙胺酸）、40(纈胺酸）
、43 (絲胺酸）、47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 ( 絲胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸） 、83 (甲硫胺酸）、85 (異白胺酸）、1〇〇 (絲胺酸）、 104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及109 (脯胺酸）分別由 白胺酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白 胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯 丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸 取代所設計之人化# 1 1 D 5輕鏈可變區被稱爲“ h # 1 1 D 5 -T31L”型輕鏈可變區》 7.2.3.32 h#llD5-T32L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 # 1 1 D 5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲硫胺酸）、1 3 (蘇 胺酸）、15 (白胺酸）、36 (苯丙胺酸）、40 (纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲 胺酸）、72 (絲胺酸）、79 (麩胺酸）、8 0 (絲胺酸）、 83(甲硫胺酸）、85(異白胺酸）、1〇〇(絲胺酸）、1〇4 (白胺酸）、1 06 (白胺酸）及1 09 (腩胺酸）分別由白胺 -99- 201105348 酸、丙胺酸、纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、 、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、 酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、纈胺酸、異白胺 所設計之人化# 1 1 D 5輕鏈可變區被稱爲“ 型輕鏈可變區。 7.2.3.33 h#llD5-T33L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 142 (圖 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫 胺酸）、15 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、 66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、7 1 (酪胺 酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、104 ( (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺 胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸 胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇 、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設討 鏈可變區被稱爲“h#llD5-T33L”型輕鏈ί 7.2.3.34 h#llD5-T34L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 142 (圖 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫 胺酸）、15 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、 66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、70 (天冬 丙胺酸、離胺酸 脯胺酸、苯丙胺 酸及蘇胺酸取代 h#l1D5-T32L" 30D )所表示之 胺酸）、13 (蘇 4 3 (絲胺酸）、 酸）、72 (絲胺 (甲硫胺酸）、 白胺酸）、106 酸、丙胺酸、纈 、苯丙胺酸、蘇 胺酸、麩醯胺酸 之人化# 1 1 D 5輕 ί變區。 3 0D )所表示之 胺酸）、1 3 (蘇 43 (絲胺酸）、 胺酸）、7 2 (絲 -100- 201105348 胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸） 、85 (異白胺酸）、1〇〇 (絲胺酸） 1 06 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別ΰ 纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇 胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、 、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所言 鏈可變區被稱爲“h#llD5-T34L”型輕 、8 3 (甲硫胺酸） 10 4 (白胺酸）、 丨白胺酸、丙胺酸、 :胺酸、麩胺酸、蘇 蘇胺酸、麩醯胺酸 泛計之人化# 1 1 D 5輕 鏈可變區。
7.2.3.35 h#llD5-T35L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142 ( #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲 胺酸）、15 (白胺酸）、40 (纈胺酸） 47 (甲硫胺酸）、66 (精胺酸）、69 ( 胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸） 、85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、 φ 106 (白胺酸）及109 (脯胺酸）分別由 纈胺酸、脯胺酸、丙胺酸、白胺酸、甘 胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、 、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所變 鏈可變區被稱爲“h#llD5-T35L”型輕 7.2.3.36 h#llD5-T36L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142 ( #1 1D5輕鏈可變區的胺基酸編號1 1 (甲 :圖30D )所表示之 硫胺酸）、13 (蘇 、4 3 (絲胺酸）、 絲胺酸）、7 2 (絲 、8 3 (甲硫胺酸） 104 (白胺酸）、 [白胺酸、丙胺酸、 1安酸、蘇胺酸、蘇 蘇胺酸、麩醯胺酸 乏計之人化#11D5輕 鏈可變區》 圖30D )所表示之 硫胺酸）、13 (蘇 -101 - 201105348 胺酸）、1 5 (白胺酸）、40 (纈胺酸）、43 (絲胺酸）、 45 (精胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、72 (絲胺 酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸）、 85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、106 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、纈 胺酸、脯胺酸、丙胺酸、離胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇胺 酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、 纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#U D5輕鏈 可變區被稱爲“h#llD5-T36L”型輕鏈可變區、 7.2.3.37 h#llD5-T37L型輕鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 142(圖30D)所表示之 #11D5輕鏈可變區的胺基酸編號11 (甲硫胺酸）、13 (蘇 胺酸）、15(白胺酸）、36(苯丙胺酸）、40(纈胺酸） 、43 (絲胺酸）、66 (精胺酸）、69 (絲胺酸）、72 (絲 胺酸）、79 (麩胺酸）、80 (絲胺酸）、83 (甲硫胺酸） 、85 (異白胺酸）、100 (絲胺酸）、104 (白胺酸）、 1 06 (白胺酸）及1 09 (脯胺酸）分別由白胺酸、丙胺酸、 纈胺酸、酪胺酸、脯胺酸、丙胺酸、甘胺酸、蘇胺酸、蘇 胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸 、纈胺酸、異白胺酸及蘇胺酸取代所設計之人化#1 1D5輕 鏈可變區被稱爲“h#llD5-T37L"型輕鏈可變區。 7.2.4 #11D5重鏈之人化（圖12及13) -102- 201105348 7.2.4.1 h#llD5-TlH型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 # 1 1 D5重鏈可變區的胺基酸編號1 (麩胺酸）、1 7 (絲胺 酸）、23 (絲胺酸）、25 '(蘇胺酸）、39 (離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、44(離胺酸）、45 ( 甲硫胺酸）、67 (異白胺酸）、68 (絲胺酸）、71 (精胺 酸）、75(精胺酸）、79 (苯丙胺酸）、81 (麩醯胺酸）
、83 (天冬醯胺酸）、87 (蘇胺酸）、88 (麩胺酸）、92 (蘇胺酸）、1 07 (纈胺酸）及1 08 (甲硫胺酸）分別由麩 醯胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、 甲硫胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、纈胺酸、 麩胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈 胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#1 1D5重鏈可變 區被稱爲“h#llD5-TlH”型重鏈可變區。 7.2.4.2 h#llD5-T2H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 D5重鏈可變區的胺基酸編號17 (絲胺酸）、23 (絲胺 酸）、25(蘇胺酸）、39(離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、 43(天冬醯胺酸）、44(離胺酸）、45(甲硫胺酸）、71 (精胺酸）、75 (精胺酸）、79 (苯丙胺酸）、8丨（魅釀 胺酸）、83 (天冬醯胺酸）、87(蘇胺酸）、88(魅胺酸 )、92(蘇胺酸）、1〇7 (纈胺酸）及108 (甲硫胺酸）分 別由蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、腩胺酸、甲硫 -103- 201105348 胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、麩胺酸、絲胺酸、離胺 酸、絲胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸 取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱爲“h#UD5-T2H ”型重鏈可變區。 7.2.4.3 h#l 1 D5-T3H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 #1 1D5重鏈可變區的胺基酸編號17 (絲胺酸）、23 (絲胺 酸）、25(蘇胺酸）、75(精胺酸）、79 (苯丙胺'酸）、 81(麩醯胺酸）、83(天冬醯胺酸）、87(蘇胺酸）、88 (麩胺酸）、92 (蘇胺酸）、107 (纈胺酸）及108 (甲硫 胺酸）分別由蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸 、離胺酸、絲胺酸、脯胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及 白胺酸取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱爲“ h#l 1D5-T3H"型重鏈可變區。 7.2.4.4h#llD5-T4H 型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 #1 1D5重鏈可變區的胺基酸編號丨（麩胺酸）、6 (麩胺酸 )、7 (絲胺酸）、9 (脯胺酸）、12 (纈胺酸）、16 (麩 醯胺酸）、1 7 (絲胺酸）、2 3 (絲胺酸）、2 5 (蘇胺酸） 、39(離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、 44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、67 (異白胺酸）、68 ( 絲胺酸）、7 5 (精胺酸）、7 9 (苯丙胺酸）、8 1 (麩醯胺 -104- 201105348 酸）、83(天冬醯胺酸）、87(蘇胺酸）、88(麩胺酸）
、92 (蘇胺酸）、107 (纈胺酸）及108 (甲硫胺酸）分別 由麩醯胺酸、麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、麩胺 酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺 酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、離胺酸、絲胺酸 、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及 白胺酸取代所設計之人化# 1 1 D 5重鏈可變區被稱爲" h#l 1 D5-T4H"型重鏈可變區。 7.2.4.5 h#l 1 D5-T5H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 #1 1D5重鏈可變區的胺基酸編號6(麩胺酸）、7(絲胺酸 )、9 (脯胺酸）、12 (纈胺酸）、16 (麩醯胺酸）、！ 7 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、39 (離胺酸 )、40(苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、44(離胺酸） 、45 (甲硫胺酸）、75(精胺酸）、79 (苯丙胺酸）、81 (麩醯胺酸）、83(天冬醯胺酸）、87(蘇胺酸）、88( 麩胺酸）、92(蘇胺酸）、1〇7(纈胺酸）及108(甲硫胺 酸）分別由麩醯胺酸、色胺酸、丙胺酸、白胺酸、魅胺酸 、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸 、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、 丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之 人化#11D5重鏈可變區被稱爲“h#llD5-T5H”型重鍵可變 區。 -105- 201105348 7.2.4.6 h#llD5-T6H 型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 # 1 1 D 5重鏈可變區的胺基酸編號1 6 (麩醯胺酸）、1 7 (絲 胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、39 (離胺酸）、 40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、44(離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、75 (精胺酸）、79 (苯丙胺酸）、81(麩 醯胺酸）、8 3 (天冬醯胺酸）、8 7 (蘇胺酸）、8 8 (麩胺 酸）、92(蘇胺酸）、107(纈胺酸）及1〇8(甲硫胺酸） 分別由麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯 胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺 酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸 取代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱爲“h#llD5-T6H ”型重鏈可變區。 7·2·4.7 h#llD5-T7H 型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 #11D5重鏈可變區的胺基酸編號ι(麩胺酸）、i6(麩醯 胺酸）、1 7 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、 39 (離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、44 (離胺酸）、4 5 (甲硫胺酸）、6 7 (異白胺酸）、6 8 (絲 胺酸）、7 5 (精胺酸）、7 9 (苯丙胺酸）、8 1 (麩醯胺酸 )、8 3 (天冬醯胺酸）' 8 7 (蘇胺酸）、8 8 (麩胺酸）、 92 (蘇胺酸）、107 (纈胺酸）及108 (甲硫胺酸）分別由 -106- 201105348 麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸 、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、 離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈 胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#1 1D5重鏈可變 區被稱爲“h#llD5-T7H”型重鏈可變區。 7.2.4.8 h#llD5-T8H型重鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 #1 1D5重鏈可變區的胺基酸編號16 (麩醯胺酸）’、17 (絲 胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、39 (離胺酸）、 40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、44(離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、67 (異白胺酸）、68 (絲胺酸）、75 (精 胺酸）、79(苯丙胺酸）、81(麩醯胺酸）、83(天冬酶 胺酸）、87(蘇胺酸）、88(麩胺酸）、92(蘇胺酸）、 1 〇7 (纈胺酸）及1 08 (甲硫胺酸）分別由麩胺酸、蘇胺酸 、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸 、白胺酸、纈胺酸、蘇胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、 絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸' 纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取# 所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱爲“h#llD5_T8H” ^ 重鏈可變區。 7.2.4.9 h#llD5-T9H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO : 143 (圖30E )所表示之 # 1 1 D5重鏈可變區的胺基酸編號1 (麩胺酸）、1 6 ( _酿 -107- 44 201105348 胺酸）、1 7 (絲胺酸）、2 3 (絲胺酸）、2 5 (蘇胺酸） 39(離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、68 (絲胺酸）、75 (精 酸）、79(苯丙胺酸）、81(麩醯胺酸）、83(天冬醯 酸）、87 (蘇胺酸）、88 (麩胺酸）、92 (蘇胺酸） 1 07 (纈胺酸）及1 〇8 (甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩 酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離 酸、甘胺酸、白胺酸、蘇胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺 、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸' 纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸 代所設計之人化#1 1D5重鏈可變區被稱爲“ h#l 1D5-T9H 型重鏈可變區。 7.2.4.10 h#llD5-T10H 型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示 #11D5重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸）、16(麩 胺酸）、1 7 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸） 39(離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、 (離胺酸）、45(甲硫胺酸）、67 (異白胺酸）、75 ( 胺酸）、79 (苯丙胺酸）、81 (麩醯胺酸）、83(天冬 胺酸）、87(蘇胺酸）、88(麩胺酸）、92(蘇胺酸） 1 07 (纈胺酸）及1 08 (甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩 酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離 酸、甘胺酸、白胺酸、纈胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺 、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸 胺 胺 、 胺 胺 酸 取 之 醯 44 精 醯 、 胺 胺 酸 取 -108- 201105348
代所設計之人化#11D5重鏈可變區被稱爲“ h#llD5-T10H ”型重鏈可變區。 7.2.4.11 h#llD5-TllH型重鏈：
藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 # 1 1 D 5重鏈可變區的胺基酸編號1 6 (麩醯胺酸）、1 7 (絲 胺酸）、2 3 (絲胺酸）、2 5 (蘇胺酸）、3 9 (離胺酸）、 40(苯丙胺酸）、43(天冬醯胺酸）、44(離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、6 8 (絲胺酸）、7 5 (精胺酸）、7 9 (苯丙 胺酸）、81(麩醯胺酸）、83(天冬醯胺酸）、87(蘇胺 酸）、88(麩胺酸）、92(蘇胺酸）、107(纈胺酸）及 1 〇 8 (甲硫胺酸）分別由魅胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲胺 酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、蘇胺 酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺酸 、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化# 1 1 D 5重鏈 可變區被稱爲“h#llD5-TllH”型重鏈可變區。 7.2.4.12 h#llD5-T12H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 #11〇5重鏈可變區的胺基酸編號16 (麩醯胺酸）、17 (絲 胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、3 9 (離胺酸）、 40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、67 (異白胺酸）、75 (精胺酸）、79 (苯 丙胺酸）、81(麩醯胺酸）、83(天冬醯胺酸）、87(蘇 -109- 201105348 胺酸）、88 (麩胺酸）、92 (蘇胺酸）、107 (纈胺酸） 及1 〇8 (甲硫胺酸）分別由麩胺酸、蘇胺酸、蘇胺酸、絲 胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白胺酸、纈 胺酸' 離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺 酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化#11 D5重 鏈可變區被稱爲“h#llD5-T12H”型重鏈可變區。 7.2.4.13 h#llD5-T13H型重鏈： 藉由將序列表SEQ ID NO: 143(圖30E)所表示之 #11D5重鏈可變區的胺基酸編號1(麩胺酸）、16(麩醯 胺酸）、1 7 (絲胺酸）、23 (絲胺酸）、25 (蘇胺酸）、 39(離胺酸）、40 (苯丙胺酸）、43 (天冬醯胺酸）、44 (離胺酸）、45 (甲硫胺酸）、75 (精胺酸）、79 (苯丙 胺酸）、8 1 (麩醯胺酸）、8 3 (天冬醯胺酸）、8 7 (蘇胺 酸）、88(麩胺酸）、92(蘇胺酸）、1〇7(纈胺酸）及 1 08 (甲硫胺酸）分別由麩醯胺酸、麩胺酸、蘇胺酸、蘇 胺酸、絲胺酸、麩醯胺酸、脯胺酸、離胺酸、甘胺酸、白 胺酸、離胺酸、絲胺酸、離胺酸、絲胺酸、丙胺酸、丙胺 酸、纈胺酸、蘇胺酸及白胺酸取代所設計之人化# 1 1 D 5重 鏈可變區被稱爲“h#llD5-T13H”型重鏈可變區。 實施例8 :建構通用載體以供人化抗體表現
8.1建構供人化抗體輕鏈表現之載體pEF6KCL 使用質體pEF6/V5-His B (英維特基公司）作爲模板 -110- 201105348 及下列引子進行PCR以獲得從緊接著BGHpA ( 2174 )至 Smal( 295 8 )之DNA片段（含有fl複製起點及SV40啓動子 及起點之DNA片段，以下稱爲「片段A」）： 5，-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3，（弓| 子 EFF1 : SEQ ID NO ： 1 )及 5，-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3，（弓| 子 EFsmaR ：SEQ ID NO ： 2 )
該獲得之片段A藉由重疊PCR與包含編碼人/c鏈分泌 信號、人/c鏈固定區及人多聚（A)加尾信號之DNA序列 的DNA片段（SEQ ID NO: 3;以下稱爲「片段B))連接 。該獲得之其中片段A與片段B連接之DNA片段（以下稱 爲「片段A + B」）係經限制酶ΚρηΙ及Smal消化，並與先前 已經限制酶ΚρηΙ及Smal消化之質體PEF6/V5-His B (英維 特基公司）連接，以建構具有信號序列、選殖位點、人/C 鏈固定區編碼序列及在EF1啓動子下游之人多聚（A)加 尾信號序列之人L鏈表現質體“PEF6KCL” （圖19)。
8.2建構供人化抗體重鏈表現之載體pEFl/FCCU-1 8.2.1 建構 pEFl/KCL 藉由上述方法獲得之質體PEF6KCL係經限制酶ΚρηΙ及 Smal消化。該形成之DNA片段與先前已經ΚρηΙ及Smal消 化之質體pEFl/myc-His B (英維特基公司）連接，以建構 質體 pEFl/KCL。 -111 - 201105348 8.2.2 建構 pEFl/FCCU-l 包含編碼人IgG 1之信號序列及固定區之胺基酸序列（ S E Q I D Ν Ο : 4 )的D N A序列之D N A片段係經限制酶N h e I 及Pmel消化，並與先前已經Nhel及Pmel消化之質體 pEF 1/KCL連接，以建構具有信號序列、選殖位點、人重 鏈固定區編碼序列及在EF1啓動子下游之人多聚（A)加 尾信號序列之人重鏈表現質體PEFl/FCCU-l。 實施例9:大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體基 因之產製 a )建構 h#llB7-TlL、h#11B7-T2L、h# 1 1 B 7-T3 L、 h#l1B7-T4L > h#l1B7-T5L ' h#l1B7-T6L > h#l1B7-T7L ' h#l1B7-T8L ' h#11B7-T9L ' h#l1B7-T10L ' h#l 1B7-T11L 、h#llB7-T12L 及 h#llB7-T13L 輕鏈表現載體 與分泌信號融合之各個含有編碼h#UB7-TlL、 h#l1B7-T2L ' h#l 1B7-T3L ' h#l1B7-T4L ' h#l1B7-T5L > h#l1B7-T6L ' h#l 1B7-T7L ' h#llB7-T8L、h#l1B7-T9L > h#1 1B 7-T10L、h#1 1B7-T1 1L、h#llB7-T12L 或 h#l 1B7-T13L輕鏈可變區（圖1及2 )(分別以序列表SEQ ID NO : 18、 19、 20、 21、 22、 23、 24、 25、 26、 27、 28' 29或30 之胺基酸編號21至129表示）之基因的DN A係經合成（ MBL醫學及生物實驗室有限公司之人工基因合成服務）且 經限制酶Nhel及BsiWI消化。該形成之DNA片段被分開導 入預先經限制酶Nhel及BsiWI消化之供人化抗體輕鏈表現 -112- 201105348 之通用載體（PEF6KCL)之位點以藉此建構h#llB7-TlL、 h#l 1 B7-T2L ' h#l 1 B7-T3L ' h#UB7-T4L、h#l 1B7-T5L ' h#l1B7-T6L ' h#l1B7-T7L ' h#l1B7-T8L ' h#l1B7-T9L ' h#l1B7-T10L 、 h#l1B7-T11L ' h#llB7-T12L 及 h#l1B7-T1 3 L輕鏈表現載體。該獲得之表現載體被稱爲" pEF6KCL/h#l 1B7-T1L”、 “ p E F 6 K C L/h # 1 1 B 7 - T 2 L，，、 “ pEF6KCL/h#l 1B7-T3L”、 “ p E F 6 K C L/h # 1 1 B 7 - T 4 L，，、 “
pEF6KCL/h#l 1 B7-T5L”、 “ pEF6KCL/h# 1 1 B 7-T6L”、 “ pEF6KCL/h#l 1 B7-T7L”、 “ p E F 6 K C L/h # 1 1 B 7 - T 8 L ”、 “ pEF6KCL/h#l 1 B7-T9L”、 “ p E F 6 KC L/h# 1 1 B 7 - T 1 0 L”、 “ pEF6KCL/h#l 1 B7-T1 1 L”、 “ p E F 6 K C L/h # 1 1 B 7 - T 1 2 L 或“ pEF6KCL/h#l 1B7-T13L”，且各表現載體之導入物係分別 以序列表之 SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16或17之核苷酸序列表示。 b )建構 h#l1B7-T1H、h#l1B7-T2H ' h#l 1B7-T3H ' h#l1B7-T4H ' h#l1B7-T5H ' h#l1B7-T6H > h#l1B7-T7H ' h#llB7-T8H及h#llB7-T9H重鏈表現載體 各個含有編碼h#llB7-TlH、 h#llB7-T2H、 h#llB7-T3H 、 h#l1B7-T4H ' h#l1B7-T5H ' h#l1B7-T6H ' h#l1B7- T7H、h#UB7-T8H 或 h#llB7-T9H 重鏈可變區（圖 4及 5) (分別以序歹IJ 表 SEQ ID NO : 40、41、42、43 ' 44、45、 46、47或48之胺基酸編號20至132表示）之基因的DNA係 經合成（MB L醫學及生物實驗室有限公司之人工基因合成 服務）且經限制酶BlpI消化。該形成之DNA片段被分開導 -113- 201105348 入預先經限制酶BlpI消化之供人化抗體重鏈表現之通用載 體（pEFl/FCCU-1 )之位點以藉此建構h#llB7-TlH、 h#1 1 B 7-T2H ' h#l1B7-T3H > h#llB7-T4H、h#l1B7-T5H ' h#l 1 B7-T6H ' h#l1B7-T7H ' h#11B7-T8H及 h#11B7-T9H重 鏈表現載體。該獲得之表現載體被稱爲 “ pEF 1/FCCU/h#l 1 B7-T 1 H”、 “ p E F 1 / F C C U/h # 1 1 B 7 - T 2 Η’，、 “ pEFl/FCCU/h#llB7-T3H”、 “ pEFl/FCCU/h#llB7-T4H” 、 “ pEFl/FCCU/h#l 1 B7-T5H”、 “ pEF 1/FCCU/h# 1 1 B7- T6H” 、 “ pEF 1/FCCU/h# 1 1 B7-T7H” 、 “ pEF 1/FCCU/h# 1 1 B7-T8H” 或"p E F 1/F C C U/h# 1 1 B 7 - T 9 H，，， 且各表現載體之導入物係分別以序列表之SEQ ID NO : 31 、32、33、34、35、36、37、38或39之核苷酸序列表示。 實施例10 :製備大鼠抗人AXL單株抗體#11 B7之人化 抗體 a )產製人化抗體 將1.5\108對數生長期之？1*^31丫16 293邛細胞種至100 毫升之新鮮Freestyle 293表現培養基（英維特基公司）， 於3 7°C、8% C02之培養箱中搖晃培養（125 rpm )。將1毫 克之聚乙烯亞胺（伯賽恩斯（Polyscience) #2476 5 )溶解 於4毫升之Opti-Pro SFM培養基（英特維基公司）中並於 室溫中留置5分鐘。利用PureLink HiPure質體套組（英特 維基公司）製備之重鏈表現載體（0.05毫克）及輕鏈表現 載體（0.1 5毫克）係懸浮於4毫升之Opti-Pro SFM培養基 -114- 201105348 (英特維基公司）。將該4毫升之表現載體/Opti-Pro SFM 混合溶液加至留置於室溫中5分鐘之4毫升聚乙烯亞胺 /Opti-Pro SFM混合溶液中，另外再留置於室溫中5分鐘。 接著，將8毫升之聚乙烯亞胺/表現質體/Opti-Pro SFM混合 溶液加入Freestyle 293 -F細胞懸浮液，繼續搖晃培養。於 3 7°C、8% C02中培養7天後，收集該培養上清液。
b )純化人化抗體 利用Protein A親和管柱層析法純化前段a )所獲得之 培養上清液。將100毫升之培養上清液置於有蓋之5 00毫升 角瓶中，接著加入1毫升經PBS平衡之Mab Select SuRe( GE醫療集團拜爾賽恩斯（Bio-science)公司）懸浮液（ 50%漿狀物）。該混合物於1(TC培養箱中以100 rpm攪拌 隔夜。該FreeStyle 293-F細胞培養上清液/MabSelect SuRe 懸浮液被加入空的5毫升Zeba Spin管柱（皮爾斯（PIERCE )公司）。全樹脂被置於管柱中，然後以1〇毫升之1M NaCl清洗。接著，加入1毫升之1M精胺酸溶液（pH 4.0) 以收集含抗體組分。該組分被加入離心過濾裝置（密理博 (Millipore)公司 Amicon Ultra-4，截留分子量：50K) ，接著以檸檬酸緩衝液進行溶液置換及濃縮調整至200微 升以製備經純化之樣本。 由 pEF6KCL/h#l 1B7-T1L 及 pEFl/FCCU/h#UB7-TlH 之 組合所獲得之人化抗體#11B7稱爲“ h#llB7-Tl” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T2L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T2H之組合所 -115- 201105348
獲得之人化抗體#1 1B7稱爲 “ h#llB7-T2” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T3L 及 pEFl/FCCU/h#UB7-T3H之組合所 獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#llB7-T3” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T4L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T4H之組合所 獲得之人化抗體稱爲 “ h#llB7-T4” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T5L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T5H之組合所 獲得之人化抗體#1 1B7稱爲 “ h#llB7-T5” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T6L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T6H之組合所 獲得之人化抗體#1 1B7稱爲 “ h#llB7-T6” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T7L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H之組合所 獲得之人化抗體#1 1B7稱爲 “ h#llB7-T7” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T8L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H之組合所 獲得之人化抗體#1 1B7稱爲 “ h#llB7-T8” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T9L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H之組合所 獲得之人化抗體#1 1B7稱爲 “ h#llB7-T9” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T10L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H 之組合 所獲得之人化抗體#ΠΒ7稱爲“ h#llB7-T10” ；由 pEF6KCL/h#llB7-TllL 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H 之組合 所獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#llB7-Tll” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T12L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H 之組合 所獲得之人化抗體#1 1B7稱爲“ h#l 1B7-T12” ； 由 pEF6KCL/h#llB7-T13L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H 之組合 所獲得之人化抗體#11B7稱爲“ h#llB7-T13” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T7L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H之組合所 -116- 201105348 獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#UB7-T14” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T8L及 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H之組合所 獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#llB7-T15” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T9L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H之組合所 獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#llB7_T16” ；由
pEF6KCL/h#llB7-T10L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H 之組合 所獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#llB7-T17” ；由 pEF6KCL/h#llB7-TllL 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H 之組合 所獲得之人化抗體稱爲 “ h#llB7-T18” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T12L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H 之組合 所獲得之人化抗體#HB7稱爲 “ h#l 1B7-T19” ：由 pEF6KCL/h#llB7-T13L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H 之組合 所獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#llB7-T20” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T7L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H之組合所 獲得之人化抗體#11B7稱爲 "h#llB7-T21” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T8L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H之組合所 獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#llB7-T22” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T9L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H之組合所 獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#l]B7-T23” ：由 pEF6KCL/h#llB7-T10L 及 pEFl/FCCU/h#UB7-T9H 之組合 所獲得之人化抗體#11B7稱爲“ h#llB7-T24” ；由 pEF6KCL/h#llB7-TllL 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H 之組合 所獲得之人化抗體#HB7稱爲“ h#llB7-T25” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T12L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H 之組合 -117- 201105348 所獲得之人化抗體#11B7稱爲 “ h#llB7-T26” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T13L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H 之組合 所獲得之人化抗體#1 1B7稱爲“ h#l 1B7-T27”。 表1
h#llB7 H質體 L質體 h#llB7-Tl pEFl/FCCU/h#llB7-TlH pEF6KCL/h#llB7-TlL h#llB7-T2 pEFl/FCCU/h#llB7-T2H pEF6KCL/h#l 1B7-T2L h#HB7-T3 pEFl/FCCU/h#llB7-T3H pEF6KCL/h#llB7-T3L h#llB7-T4 pEFl/FCCU/h#llB7-T4H pEF6KCL/h#llB7-T4L h#llB7-T5 pEFl/FCCU/h#llB7-T5H pEF6KCL/h#llB7-T5L h#llB7-T6 pEFl/FCCU/h#llB7-T6H pEF6KCL/h#llB7-T6L h#llB7-T7 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H pEF6KCL/h#llB7-T7L M11B7-T8 pEFl/FCCU/h#l 1B7-T7H pEF6KCL/h#llB7-T8L h#llB7-T9 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H pEF6KCL/h#llB7-T9L h#llB7-T10 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H pEF6KCL/h#llB7-T10L h#llB7-Tll pEFl/FCCU/h#llB7-T7H pEF6KCL/h#llB7-TllL h#llB7-T12 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H pEF6KCL/h#llB7-T12L h#llB7-T13 pEFl/FCCU/h#llB7-T7H pEF6KCL/h#llB7-T13L h#llB7-T14 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H pEF6KCL/h#l 1B7-T7L h#llB7-T15 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H pEF6KCL/h#llB7-T8L h#llB7-T16 pEFl/FCCU/h#l 1B7-T8H pEF6KCL/h#l 1B7-T9L h#llB7-T17 pEFl/FCCU/h#HB7-T8H pEF6KCL/h#llB7-T10L h#llB7-T18 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H pEF6KCL/h#llB7-TllL h#llB7-T19 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H pEF6KCL/h#llB7-T12L h#llB7-T20 pEFl/FCCU/h#llB7-T8H pEF6KCL/h#llB7-T13L h#llB7-T21 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H pEF6KCL/h#l 1B7-T7L h#llB7-T22 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H pEF6KCL/h#l 1B7-T8L M11B7-T23 pEFl/FCCU/h#l 1B7-T9H pEF6KCL/h#l 1B7-T9L h#llB7-T24 pEF 1 /FCCU/h# 11B7-T9H pEF6KCL/h#llB7-T10L h#llB7-T25 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H pEF6KCL/h#llB7-TllL h#llB7-T26 pEFl/FCCU/h#l 1B7-T9H pEF6KCL/h#llB7-T12L h#llB7-T27 pEFl/FCCU/h#llB7-T9H pEF6KCL/h#llB7-T13L -118- 201105348 實施例1 1 :大鼠抗人AXL單株抗體#1 1D5之人化抗體 基因之產製 a)建構 h#l1D5-T1L 、 h#l1D5-T2L > h#l1D5-T3L ' h#l 1 D5-T4L ' h#llD5-T5L 及 h#UD5-T6L 輕鏈表現載體 與分泌信號融合之各個含有編碼h#llD5-TlL、
h#l1D5-T2L ' h#l1D5-T3L ' h#11D5-T4L ' h#llD5-T5L及 h#l 1D5-T6L輕鏈可變區（圖6 )(分別以序列表SEQ ID NO: 55、56、57、58、59或60之胺基酸編號21至129表示 )之基因的DNA係經合成（MBL醫學及生物實驗室有限公 司之人工基因合成服務）且經限制酶Nhel及BsiWI消化。 該形成之DNA片段被分開導入預先經限制酶Nhel及BsiWI 消化之供人化抗體輕鏈表現之通用載體（PEF6KCL)之位 點以藉此建構 h#UD5-TlL、h#llD5-T2L、h#l 1D5-T3L ' h#l 1 D5-T4L ' h#llD5-T5L及 h#llD5-T6L輕鏈表現載體》 該獲得之表現載體被稱爲“ pEF6KCL/h#l 1D5-T1L”、 “ pEF6KCL/h#l 1 D5-T2L”、 “ p E F 6 K C L/h# 1 1 D 5 - T 3 L’，、 “ pEF6KCL/h#l 1D5-T4L”、 “ p E F 6 KC L/h# 1 1 D 5 - T 5 L，，或“ pEF6KCL/h#l 1D5-T6L”，且各表現載體之導入物係分別以 序列表之SEQ ID NO: 49、50、51、52、53或54之核苷酸 序列表不。 b )建構 h#1 1D5-T1 Η ' h#l1D5-T2H ' h#1 1 D5-T3H ' h#UD5-T4H、h#llD5-T5H 及 h#UD5-T6H 重鏈表現載體 各個含有編碼 h#llD5-TlH、 h#llD5-T2H、 h#llD5- -119- 201105348 T3H、h# 1 1 D5-T4H ' h # 1 1 D 5 - T 5 H 或 h # 1 1 D 5 - T 6 H 重鏈可變 區（圖12)(分別以序列表SEQ ID NO: 67、68、69、70 、71或72之胺基酸編號20至132表示）之基因的DN A係經 合成（MB L醫學及生物實驗室有限公司之人工基因合成服 務）且經限制酶BlpI消化。該形成之DNA片段被分開導入 預先經限制酶BlpI消化之供人化抗體重鏈表現之通用載體 (pEFl/FCCU-Ι ) 之位點以藉此建構h#llD5-TlH、 h#11D5-T2H ' h#l1D5-T3H > h#l1D5-T4H ' h#llD5-T5H及 h#llD5-T6H重鏈表現載體》該獲得之表現載體被稱爲“ pEFl/FCCU/h#llD5-TlH”、 “ pEFl/FCCU/h#llD5-T2H”、 “ pEFl/FCCU/h#llD5-T3H”、 “ pEFl/FCCU/h#llD5-T4H” 、“ pEF 1/FCCU/h# 1 1 D5-T5H” 或 “ pEF 1/FCCU/h# 1 1D5-T6H”，且各表現載體之導入物係分別以序列表之SEQ ID NO: 61、62、63、64、65或66之核苷酸序列表示。 實施例12 :製備大鼠抗人AXL單株抗體#1 1D5之人化 抗體 a )產製人化抗體 將1.5\108對數生長期之？“651716 293-?細胞種至100 毫升之新鮮Freestyle 293表現培養基（英維特基公司）， 於37°C、8% C02之培養箱中搖晃培養（125 rpm )。將1毫 克之聚乙稀亞胺（伯赛恩斯（Polyscience) #24765)溶解 於4毫升之〇pti-Pro SFM培養基（英特維基公司）中並於 室溫中留置5分鐘。利用PureLink HiPure質體套組（英特 -120- 201105348
維基公司）製備之重鏈表現載體（〇.〇5毫克）及輕鏈表現 載體（0.15毫克）係懸浮於4毫升之Opti-Pro SFM培養基 (英特維基公司）。將該4毫升之表現載體/Opti-Pro SFM
混合溶液加至留置於室溫中5分鐘之4毫升聚乙烯亞胺 /Opti-Pro SFM混合溶液中，另外再留置於室溫中5分鐘。 接著，將8毫升之聚乙烯亞胺/表現質體/〇pti-Pro SFM混合 溶液加入Freestyle 293-F細胞懸浮液，繼續搖晃培養。於 37°C、8% C02中培養7天後，收集該培養上清液。 b)純化人化抗體 利用Protein A親和管柱層析法純化前段a )所獲得之 培養上清液。將100毫升之培養上清液置於有蓋之5 00毫升 角瓶中，接著加入1毫升經PBS平衡之MabSelect SuRe( GE醫療集團拜爾賽恩斯（Bio-science)公司）懸浮液（ 50%漿狀物）。該混合物於1 0 °C培養箱中以1 00 rpm攪拌 隔夜。該Freestyle 293-F細胞培養上清液/ MabSelect SuRe 懸浮液被加入空的5毫升Zeba Spin管柱（皮爾斯（PIERCE )公司）。全樹脂被置於管柱中，然後以10毫升之1M NaCl清洗。接著，加入1毫升之1M精胺酸溶液（PH 4.0) 以收集含抗體組分。該組分被加入離心過濾裝置（密理博 (Millipore)公司 Amicon Ultra-4，截留分子量：50K) ，接著以檸檬酸緩衝液進行溶液置換及濃縮。終容量調整 至200微升以製備經純化之樣本。 由 pEF6KCL/h#llD5-TlLS_pEFl/FCCU/h#llD5-TlH；^ -121 - 201105348 組合所獲得之人化抗體#〗1D5稱爲“ h#UD5-Tl” ；由 pEF6KCL/h#UD5-T2L 及 pEFl/FCCU/h#llD5-T2H之組合所 獲得之人化抗體#1 1D5稱爲 “ h#llD5-T2” ；由 pEF6KCL/h#llD5-T3L 及 pEFl/FCCU/h#llD5-T3H之組合所 獲得之人化抗體#11D5稱爲 "h#llD5-T3” ；由 pEF6KCL/h#llD5-T4L 及 pEFl/FCCU/h#llD5-T4H之組合所 獲得之人化抗體#1 1D5稱爲 “ h#llD5-T4” ；由 pEF6KCL/h#llD5-T5L 及 pEFl/FCCU/h#llD5-T5H之組合所 獲得之人化抗體#11D5稱爲 “ h#llD5-T5” ；及由 pEF6KCL/h#llD5-T6L 及 pEFl/FCCU/h#UD5-T6H之組合所 獲得之人化抗體#11D5稱爲“h#llD5-T6，，。 實施例13:評估大鼠抗人AXL單株抗體#11B7對人 AXL-Fc融合蛋白之親和性 該源自大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體 h#llB7-Tl至h#llB7-T27藉由下列方法評估彼等對人AXL-Fc之親和性。人AXL-Fc ( R&D系統製造，#1 54-AL )係以 PBS稀釋成1微克/毫升。接著，將該溶液以ι〇〇微升/孔之 量分注至免疫板（Irnmuno Plate )(納爾杰諾科國際公司 (Nalge Nunc International K.K.)製造，#437111 )，於 4 °C留置隔夜以使蛋白質吸附在該板上。隔天，該孔槽以 PBS-T溶液（PBS 及 0.05%(v/v) Tween 20)清洗 5次。接 著’將經PBS稀釋至5。/。之含脫脂乳（森永（Morinaga)乳 業株式會社製造）溶液以1〇〇微升/孔之量分注，留置於室 -122- 201105348
溫中2小時。移除孔槽中之溶液，以PBS-Τ溶液清洗孔槽5 次。接著，將經純化之實施例1〇中製備之大鼠抗人AXL單 株抗體之人化抗體T1至T2 7以含0·5%脫脂乳之PBS溶 液分開稀釋成終濃度1微克/毫升至〇·〇〇256奈克/毫升（5倍 連續稀釋）。接著，該溶液以1〇〇微升/孔之量分注，留置 於室溫中2小時。在此程序中，各抗體濃度係如實施例1 5 所述測定。以PBS-Τ溶液清洗孔槽5次。接著，經TBS_T溶 液（TBS及0.05% ( Wv ) Tween 20 )稀釋2500倍之鹼性磷 酸酶共軛之AffiniPure羊抗人IgG(傑克森（Jackson)免 疫硏究實驗室製造，#109_05 5 -097 )以100微升/孔之量加 入，於室溫中留置1小時。移除孔槽中之溶液，以TBS-T 溶液清洗孔槽5次。接著，添加100微升/孔之螢光受質溶 液（羅氏診斷（R 〇 c h e D i a g η 〇 s t i c s K. K.)製造， #1 1 68 1 98200 1 )以進行螢光反應。在人AXL-Fc-吸附板上 之螢光強度於添加螢光受質溶液後15分鐘利用SpectraMax M5 (製造商分子儀器（Molecular Devices)公司）測量 。結果顯示，在檢測之27個大鼠抗人AXL單株抗體#1 1B7 之人化抗體樣本中，h#llB7-Tl及h#llB7-T4經證實相較 於人嵌合抗體具有較低之結合活性。然而，其他2 5個樣本 經證實與人嵌合抗體具有幾乎相同之抗體濃度依賴性人 AXL-Fc蛋白質結合活性（圖19、20、21及22)。 實施例14 :評估大鼠抗人AXL單株抗體#1 1D5對人 AXL-Fc融合蛋白之親和性 -123- 201105348 大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之人化抗體h#llD5-Tl 至h#l 1D5-T6藉由下列方法評估彼等對人AXL-Fc之親和性 。人AXL-Fc(R&D系統製造，#154-AL)係以PBS稀釋成1 微克/毫升。接著，將該溶液以100微升/孔之量分注至免 疫板（Immuno Plate)(納爾杰諾科國際公司（Nalge Nunc International K.K.)製造，#437111 )，於 4°C 留置 隔夜以使蛋白質吸附在該板上。隔天，該孔槽以PBS-T溶 液（PBS及0.05% ( v/v ) Tween 20 )清洗5次。接著，將經 PBS稀釋至5%之含脫脂乳（森永（Morinaga)乳業株式會 社製造）溶液以100微升/孔之量分注，留置於室溫中2小 時。移除孔槽中之溶液，以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接 著，將經純化之實施例1 2中製備之大鼠抗人AXL單株抗體 #1 1D5之人化抗體T1至T6以含0.5%脫脂乳之PBS溶液分開 稀釋成終濃度1微克/毫升至0.00256奈克/毫升（5倍連續稀 釋）。接著，該溶液以1 〇〇微升/孔之量分注，留置於室溫 中2小時。在此程序中，各抗體濃度係如實施例1 5所述測 定。以PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著，經TBS-T溶液（ TBS及0.05% ( v/v) Tween 20)稀釋2500倍之鹼性磷酸酶 共軛之AffiniPure羊抗人IgG(傑克森（jackson)免疫硏 究實驗室製造，#1 09-055-097 )以100微升/孔之量加入， 於室溫中留置1小時。移除孔槽中之溶液，以TBS-T溶液 清洗孔槽5次。接著，添加100微升/孔之螢光受質溶液（ 羅氏診斷（Roche Diagnostics Κ·Κ.)製造， #1 1 68 1 98200 1 )以進行螢光反應。在人AXL-Fc-吸附板上 -124- 201105348 之螢光強度於添加螢光受質溶液後15分鐘利用SpectraMax M5 (製造商分子儀器（Molecular Devices)公司）測量 。結果顯示，在檢測之6個大鼠抗人AXL單株抗體#1 1D5之 人化抗體樣本中，h#llD5-T4、 h#llD5-T5及 h#llD5-T6經 證實與人嵌合抗體具有幾乎相同之抗體濃度依賴性人 AXL-Fc蛋白質結合活性（圖23)。
實施例15 :大鼠抗人AXL單株抗體#11B7及#11D5之 人化抗體的吸光係數計算及直接蛋白質吸光測定 源自大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體h#llB7-T1至h#llB7-T2 7及源自大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之 h#llD5-Tl至h#llD5-T6的蛋白質濃度係由下列程序測定 。分別於實施例1 〇或1 2製備之大鼠抗人AXL單株抗體 #11B7或#11D5之各人化抗體係利用MX5自動化S微平衡器 (梅特勒托利多（METTLER TOLEDO))以彼之質量稀 釋。各抗體於28 0奈米之吸光度（A28 0 )係以DU-7400 UV-vis光譜儀（貝克曼庫爾特（Beckman Coulter)公司 )使用石英液槽於室溫中測定。各抗體之蛋白質濃度係由 吸光係數決定。各抗體之吸光係數係利用軟體Sednterp測 定，該軟體可自美國國家衛生硏究院的網站下載（http : //jphilo.mailway.com/download.htm )。結果列示於圖 24 (上圖 h#l1B7-T1 至 h#l1B7-T14 ;下圖 h#l1B7-T15 至 h#l1B7-T27 )及圖 25 ( h#l 1D5-T1至h#l1D5-T6 )。 -125- 201105348 實施例16 :測定大鼠抗人AXL單株抗體#1 1B7之結合 位置（表位） a)人AXL串聯IG結構域之表現及純化 與N端His標籤及凝血酶辨識序列連接之編碼包含人 AXL IG結構域之蛋白質（NCBI蛋白質資料庫登錄號 P — 3 05 3 0 : SEQ ID NO : 1 39胺基酸編號 26 至 220 )的 DNA 被納入載體pDEST14(英維特基公司，目錄編號11801-0 16)。大腸桿菌 Rosetta-gami B ( DE3)(諾維根（ Novagen)公司目錄編號71136-4)係以此質體轉形並培養 於TB培養基（英維特基公司目錄編號227 1 1 -022 )。如此 培養之細菌細胞經超音波破碎及離心，上清液利用 HisTrap HP管柱純化（GE醫療集團，目錄編號1 7-5247-0 1 )。收集該溶離液並以PD-10管柱去鹽（GE醫療集團，目 錄編號1 7-08 5 1 -0 1 )，接著以凝血酶（西格瑪奧德里奇（ Sigma-Aldrich )，目錄編號T-7009 )切除His標籤。經切 割之蛋白質接著以MONO Q 5/50 GL(GE醫療集團，目錄 編號 17-5166-01)及 Superdex 75 1 0/300 管柱（GE 醫療集 團，目錄編號17-5174-01)分離直到獲得分子量21 kDa之 單一條帶。 b )人AXL單一IG結構域之表現及純化 與N端His標籤及因子Xa辨識序列連接之編碼包含人 AXL IG結構域之蛋白質（NCBI蛋白質資料庫登錄號 P_3 0530胺基酸編號26至131及129至220)的DNA被納入載 -126- 201105348
體pDEST14(英維特基公司，目錄編號nsoi-ou)。大 腸桿菌 Rosetta-garni B ( DE3 )(諾維根（Novagen )公司 目錄編號7 1 1 3 6-4 )係以此質體轉形並培養於TB培養基（ 英維特基公司目錄編號2 2 7 Π - 0 2 2 )。如此培養之細菌細 胞經超音波破碎及離心，上清液利用HisTrap HP管柱純化 (GE醫療集團，目錄編號17-5247-01)。接著，該人AXL IG結構域使用Superdex 7 5 1 0/3 00管柱（GE醫療集團，目 錄編號17-5174-01 )純化，藉由電泳分離直到獲得分子量 1 1 kDa之單一條帶。 c)測定人AXL-IG結構域上與大鼠抗人AXL單株抗體 #11B7之結合位置（表位）
人AXL-IG結構域上與大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之 結合位置（表位）係利用下列方法評估：含有人AXL之二 個 IG 結構域（NHis-hAXL26-131 及 NHis-hAXL1 29-220 )中 之任一者之肽與含有人AXL之該二個IG結構域（hAXL26-220 )之肽分別以PBS稀釋成1微克/毫升。接著，將各溶液 以1〇〇微升/孔之量分注至免疫板（Immuno Plate)(納爾 杰諾科國際公司（Nalge Nunc International K.K.)製造’ #437 1 1 1 )，於留置隔夜以使肽吸附在該板上。隔天， 該孔槽以 PBS-T溶液（PBS 及 0.05% ( v/v ) Tween 20 )清 洗5次。接著，將經P B S稀釋至5 %之含脫脂乳（森永（ Morinaga)乳業株式會社製造）溶液以1〇〇微升/孔之量分 注，留置於室溫中2小時。移除孔槽中之溶液’以PBS-T -127- 201105348 溶液清洗孔槽5次。接著，將大鼠抗人AX L單株抗體#1 1B7 以含0.5%脫脂乳之PBS溶液稀釋成0.04微克/毫升。接著， 該溶液以100微升/孔之量分注，留置於室溫中2小時。以 PBS-T溶液清洗孔槽5次。接著，經TBS-T溶液（TBS及 0.05% (v/v) Tween 20)稀釋2500倍之鹼性磷酸酶共軛之 AffiniPure羊抗人IgG(傑克森（Jackson)免疫硏究實驗 室製造，#109-055-097 )以100微升/孔之量加入，於室溫 中留置1小時。移除孔槽中之溶液，以TBS-T溶液清洗孔 槽5次。接著，添加100微升/孔之螢光受質溶液（羅氏診 斷（Roche Diagnostics K.K.)製造，#11681982001)以 進行螢光反應。在人AXL-IG結構域-吸附板上之螢光強度 於添加螢光受質溶液後15分鐘利用SpectraMax M5 (製造 商分子儀器（Molecular Devices)公司）測量。該ELISA 之結果顯示，只有hAXL26-220及NHis-hAXL 1 29-220經證 實具有結合活性。因此，此結果顯示大鼠抗人AXL單株抗 體#1 1B7之表位係在人AXL之二個IG結構域中靠近羧基端 之結構域（含有NCBI蛋白質資料庫登錄號P_3 05 3 0: SEQ ID Ν Ο : 1 3 9胺基酸編號1 2 9至2 2 0之胺基酸殘基的結構域 ;圖 30A)(圖 26)。 實施例1 7 :本發明之人化抗AXL抗體於活體外抑制配 體誘導之AXL磷酸化 由生長停止特定基因6 ( Gas6)編碼之蛋白質代表受 體酪胺酸激酶AXL之天然配體。Gas6與AXL結合導致由受 -128- 201105348 體酪胺酸激酶磷酸化程度增加所反映之受體活化。在實施 例I7中描述之實驗係用於評估本發明之人化抗AXL抗體 h#llB7-T2 ' h#l1B7-T3 、 h#l1B7-T4 、 h#l1B7-T5 及 h#l 1B7-T6干擾Gas6媒介之受體酪胺酸激酶AXL活化之潛 力。 實施例17.1 :本發明之人化抗AXL抗體於活體外抑制
以ELIS A測定之配體誘導之AXL磷酸化 進行ELIS A實驗以探討本發明之人化抗AXL抗體是否 能阻斷配體Gas6誘導之AXL之磷酸化》簡言之，第1天時 ，將每孔3x1 〇4細胞接種於平底96孔板之正常生長培養基 中。隔天以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接 受飢餓處理隔夜達24小時。另外，黑色Maxi-Sorp 96孔板 (諾科（Nunc))於4t：中以2微克/毫升PBS之小鼠抗-磷-酪胺酸抗體4G10包覆隔夜。在第3天時，移除4G10抗體溶 液，Maxi-Sorp孔槽於室溫中以PBS、0.5% BSA封閉至少4 小時。同時，細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體 (西格瑪（Sigma )公司）、嵌合性抗Axl單株抗體#1 1B7 及人化抗 Axl抗體h#llB7-T2、 h#llB7-T3、 h#llB7-T4、 h#llB7-T5及h#llB7-T6 於37°C預先培養3小時，接著於 37°C以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統）處理15分鐘或不 經處理。接著輕彈出培養基，使細胞於冰上溶解於添加磷 酸酶及蛋白酶抑制劑（1 〇 mM Na4P2〇7，ImM苯甲磺醯氟 、11111^原釩酸鹽、1111河^?及0.5%抑肽酶）之溶解緩衝液 -129- 201105348 (50 mM HEPES pH 7.5, 1 50 mM NaCl, ImM EDTA, 10% 甘油及1 % Triton X-1 00 )中30分鐘。同時，移除封閉緩衝 液，以清洗緩衝液（PBS，0.05% Tween 20 )清洗Maxi-S〇rp板6次，之後移入溶解物並於4°C培養隔夜。當孔板於 第4天以清洗緩衝液清洗6次後，孔槽與0.5微克/毫升PBS 之生物素基化大鼠抗AXL抗體12B7於室溫中培養2小時。 孔板經清洗緩衝液清洗6次後，在各孔槽中添加經PBS稀 釋4000倍之AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白（加美公（ Chemicon) #SA110)並於室溫中培養30分鐘。之後，孔 槽以清洗緩衝液清洗6次並加入AttoPhos受質溶液（羅氏 #1 168 1 98 2 )。使用維克特（Victor )孔板讀取儀（珀金 埃爾默（Perkin Elmer))，收集各孔於激發波長430奈米 及發射波長5 8 0奈米之螢光。 圖27顯示HS578T乳癌細胞於此實驗之代表性結果。 相較於Gammagard對照抗體，該嵌合性抗AXL抗體#11B7 及本發明之人化抗AXL抗體h#llB7-T2、h#llB7-T3、 h#l 1B7-T4 ' h#llB7-T5 及 h#UB7-T6能在 Hs578T乳癌細胞 中阻斷或顯著降低Gas6媒介之AXL活化，如AXL酪胺酸磷 酸化程度降低所示。該相同組抗體之類似效應亦見於AXL 過度表現性NIH3T3-AXL cl.7纖維母細胞、肺癌細胞系 NCI-H292、黑色素瘤細胞系C-8161及前列腺癌細胞系PC-3 及 DU_ 1 45。 實施例1 7.2 :本發明之人化抗AXL抗體於活體外抑制 -130- 201105348 以西方墨點分析測定之配體誘導之AXL磷酸化
另外，進行西方墨點分析以證實該人化抗體干擾配體 Gas6誘導之AXL活化之能力。爲達此目的’第1天將 1·5χ106 Hs578T乳癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天， 以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處 理隔夜達24小時。在第3天時，細胞以1 〇微克/毫升之 Gammagard對照抗體（西格瑪（Sigma )公司）、嵌合性 抗AXL單株抗體#11B7及人化抗AXL抗體h#llB7-T2、 h#l 1B7-T3 ' h#llB7-T4、h# 1 1 B 7 - T 5 及 h # 1 1 B 7 - T 6 於 3 7 〇C 預先培養3小時，接著於37 °C以400奈克/毫升之Gas6 ( R&D系統）處理1 5分鐘或不經處理。之後移除培養基，使 細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑（1 〇 mM Na4P207, ImM苯甲磺醯氟、ImM原釩酸鹽、ImM NaF及 0.5 %抑肽酶）之1毫升溶解緩衝液（50 mM HEP ES pH 7.5, 150 mM NaCl, ImM EDTA，10% 甘油及 1% Triton X-100 )中30分鐘，於4°C以1 0,000xg離心10分鐘以去除細胞碎 片。爲進行免疫沉降作用，測定上清液之蛋白質濃度，並 將5 0 0微克之全細胞溶解物與3 0微升之蛋白A -瓊脂糖懸浮 液及1微克之大鼠抗AXL單株抗體12B7置於4°C之轉盤上培 養3小時。該沉澱物以0.7毫升之冰HNTG緩衝液（20 mM HEPES pH 7.5 ' 150 mM N aCl、0 · 1 % Triton-X-100、1 〇〇/〇 甘油及10 mM Na4P2〇7)清洗三次，懸浮及煮沸於40微升 之3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中，然後以SDS PAGE展開 。爲進行西方墨點分析，蛋白質被轉移至硝化纖維素膜。 -131 - 201105348 之後，該膜以NET-明膠封閉，與小鼠單株抗-磷-酪胺酸— 級抗體4G10 (昂普斯塔（Upstate ))隔夜培養。隔天以 NET-明膠清洗3次後，該膜於室溫中與HRP共軛之抗小鼠 二級抗體培養1小時，接著用NET-明膠再清洗3次。根據 廠商指示（GE醫療集團）使用化學發光偵測套組，該濾 膜最後暴露至底片（柯達（Kodak))。之後’該相同滤 膜以抗AXL抗體再次探測。 圖27顯示此實驗之代表性結果。相較於0&〇111^8&[(1對 照抗體，該嵌合性抗AXL抗體#11B7及本發明之人化抗 AXL 抗體 h#l 1 B7-T2、h#l 1 B7-T3、h# 1 1 B7-T4、h#l 1 B7-T5及h#llB7-T6能在Hs5 78T乳癌細胞中阻斷或顯著降低 Gas6誘導之AXL活化，如AXL酪胺酸磷酸化程度降低所示 實施例1 8 :本發明之人化抗AXL抗體於活體外抑制配 體誘導之AXL下游傳訊分子之磷酸化
Gas6誘導之受體酪胺酸激酶Axl之活化不僅藉由Axl本 身之酪胺酸磷酸化程度增加反應，同時亦關於誘導下游傳 訊級聯，包括ERK1/2及PKB/AKT途徑。我們因此繼續進 行實驗以評估本發明之人化抗Axl抗體h#UB7-T2、 h#llB7-T3 、 h#llB7-T4 、 h#llB7-T5 及 h#llB7-T6 干擾 Gas6媒介之ERK1、ERK2及AKT活化之潛力。另外，我們 發現傳訊分子GSK-3召、TSC2、mTOR及S6K1之磷酸化狀 態也在Gas6刺激時受到調節，因此同時探討本發明之人化 -132- 201105348 抗 Axl抗體 h#llB7-T2、h#l1B7-T3 > h#l1B7-T4 ' h#1 1 B7-T5及h#llB7-T6對這些分子之抑制效應。 實施例18.1 :本發明之人化11B7抗Αχ 1抗體於活體外 抑制配體誘導之ERK 1/2磷酸化
進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有 干擾Gas6誘導之ERK1/2活化之潛力。Gas6媒介之ERK1/2 活化係藉由彼之位置Thr202及Tyr204之磷酸化程度增加反 映。爲達此目的，第1天將5xl06 Hs578T乳癌細胞或3xl06 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天，以不 含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔 夜達24小時。在第3天時，細胞以1 0微克/毫升之 Gammagard對照抗體（百特（Baxter )公司）、嵌合性抗 Axl單株抗體chml 1B7及人化抗Axl抗體h#llB7-T2、 h#l 1 B7-T3 ' h#l 1 B7-T4 ' h# 1 1 B 7 - T 5 及 h # 1 1 B 7 - T 6 於 3 7 〇C 預先培養3小時，接著於37°C以400奈克/毫升之Gas6( R&D系統）處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基，使 細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑（1 0 mM Na4P207, ImM苯甲磺醯氟、ImM原釩酸鹽、ImM NaF及 0.5%抑肽酶）之8 00微升溶解緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, ImM EDTA, 10% 甘油及 1 % Triton X-100)中30分鐘，於4°C以1 0,000xg離心10分鐘以去除細胞 碎片。測定上清液中之蛋白質濃度，將50微克之全細胞溶 解物懸浮及煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中，然後 -133- 201105348 以SDS PAGE展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時， 該膜以NET-明膠封閉，並與兔多株抗-磷_p44/42 MAP激酶 (Thr202/Tyr204 )—級抗體（細胞傳訊科技（cell
Signaling Technologies ) ，#9 1 01 )隔夜培養。隔天以 NET-明膠清洗3次後，該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二 級抗體（戴爾諾華（Dianova) ，#111-036-045)培養1小 時’接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示（GE醫療 集團）使用化學發光偵測套組，濾膜最後暴露至底片（柯 達（Kodak ))。之後，該相同濾膜以抗p44/42 MAP激酶 抗體（聖塔克魯斯（Santa Cruz ) K-23，#sc-153 )再次探 測。 圖28A顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard 對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chml 1B7及本發明之人化 抗 Axl抗體 h#l1B7-T2 、 h#l1B7-T3 > h#11B7-T4 > h#l1B7-T5及h#llB7-T6干擾Hs578T乳癌細胞中由Gas6誘發之 ERK1/2活化微弱增加。然而由於ERK1/2在此細胞系中之 基礎活性甚高，這些如經Gas6刺激之細胞中ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降 低所示之效應似乎僅相對中等（上圖）。相對地，嵌合性 抗 Axl 抗體 chml 1B7及人化抗 Axl抗體11#1187-丁2、11#1187-T3、h#llB7-T4、h#llB7-T5 及 h#llB7-T6 在 NCI-H292 肺癌 細胞中所反映之對ERK1/2 Thr2〇2/Tyr204磷酸化之抑制效 應清楚得多（下圖）。 -134- 201105348 實施例18.2 :本發明之人化1 IB 7抗Axl抗體於活體外 抑制配體誘導之AKT磷酸化 進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有 干擾Gas6誘導之AKT活化之潛力。Gas6媒介之AKT活化係
藉由彼之位置Ser473之磷酸化程度增加反映。爲達此目的 ，第1天將5xl06 Hs5 7 8 T乳癌細胞或3xl〇6 NCI-H2 92肺癌 細胞接種至1〇公分培養皿上。隔天，以不含血清之培養基 更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在 第3天時，細胞以10微克/毫升之Gammagard對照抗體（百 特（Baxter)公司）、嵌合性抗Axl單株抗體chmllB7及人 化抗 Axl 抗體 h#llB7-T2 、 h#llB7-T3 、 h#llB7-T4 、 h#llB7-T5及h#llB7-T6 於371預先培養3小時，接著於 37°C以400奈克/毫升之Gas6 ( R&D系統）處理15分鐘或不 經處理。之後移除培養基，使細胞於冰上溶解於添加磷酸 酶及蛋白酶抑制劑（10 mM Na4P207，ImM苯甲磺醯氟、 1111]\4原釩酸鹽、11111^^?及0.5%抑肽酶）之800微升溶解 緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl, ImM E D T A, 10% 甘油及 1% Triton X-100)中 30 分鐘，於 4°C 以 1 0，0 0 0 x g離心1 0分鐘以去除細胞碎片。測定上清液中之蛋 白質濃度’將5 0微克之全細胞溶解物懸浮及煮沸於3倍 SDS Laemmli樣本緩衝液中，然後以SDS PAGE展開。當蛋 白質被轉移至硝化纖維素膜時，該膜以NET -明膠封閉， 並與兔多株抗AKT1/2/3 —級抗體（細胞傳訊科技（cell Signaling Technologies ) ，#92 72 )隔夜培養。隔天以 -135- 201105348 NET-明膠清洗3次後，該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二 級抗體（戴爾諾華（Dianova) ，#111-036-045)培養1小 時，接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示（GE醫療 集團）使用化學發光偵測套組，濾膜最後暴露至底片（柯 達（Kodak ))。之後，該相同濾膜以抗-磷-AKT ( SeM73 )抗體（細胞傳訊科技，#927 1 )再次探測。 圖28B顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard 對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chml 1B7及本發明之人化 抗 Axl抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、h #11B 7 -T 4 ' h#l1B7-T5及h#l 1B7-T6能顯著降低Hs5 78T乳癌細胞（上圖）及 NCI-H292肺癌細胞（下圖）中由Gas6誘發之AKT活化，如 經Gas6刺激之細胞中AKT Ser473磷酸化程度相較於對應 之未經刺激細胞降低所示。 實施例18.3 :本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外 抑制配體誘導之GSK-3 Θ磷酸化 進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有 干擾Gas6誘導之GSK-3召活化之潛力，該Gas6誘導之GSK-3召活化係藉由彼之位置Ser9之磷酸化程度增加反映。爲 達此目的，第1天將5xl06 Hs5 78T乳癌細胞或3xl06 NCI-H2 92肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天，以不含血 清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達 24小時。在第3天時，細胞以10微克/毫升之Gammagard對 照抗體（百特（Baxter )公司）、嵌合性抗Axl單株抗體 -136- 201105348 chmllB7 及人化抗 Axl 抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、
h#llB7-T4、h#llB7-T5 及 h#llB7-T6 於 37°C 預先培養 3 小 時，接著於37°C以4〇〇奈克/毫升之Gas6(R&D系統）處理 1 5分鐘或不經處理。之後移除培養基，使細胞於冰上溶解 於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑（1 0 mM Na4P207，〗mM苯 甲磺醯氟、ImM原釩酸鹽、ImM NaF及0.5%抑肽酶）之 8〇〇微升溶解緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM
NaCl, ImM EDTA，10% 甘油及 1% Triton X-100)中 30分 鐘，於4°C以1 0,000xg離心10分鐘以去除細胞碎片。測定 上清液中之蛋白質濃度，將5 0微克之全細胞溶解物懸浮及 煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中，然後以SDS PAGE 展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時，該膜以NET-明膠封閉，並與兔多株抗-磷-GSK-3；S (Ser9) —級抗體 (細胞傳訊科技，#93 3 6 )隔夜培養。隔天以NET-明膠清 洗3次後，該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二級抗體（戴 爾諾華，#111-〇36-045 )培養1小時，接著用NET-明膠再 清洗3次。根據廠商指示（GE醫療集團）使用化學發光偵 測套組，濾膜最後暴露至底片（柯達）。之後，該相同濾 0旲以抗GSK-3召抗體（必帝（Becton Dickinson)公司， #610201 )及HRP共轭之抗小鼠二級抗體（戴爾諾華， #315-036-045)再次探測。 圖28C顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard 對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化 抗 Axl抗體 h#l1B7-T2 、 h#11B7-T3 、 h#11B7-T4 、 h#11B7- -137- 201105348 T5及h#llB7-T6能顯著降低Hs 5 7 8 T乳癌細胞（上圖）及 NCI-H292肺癌細胞（下圖）中由Gas6誘發之GSK-3 /3活化 ，如經Gas6刺激之細胞中GSK-3 /3 Ser9磷酸化程度相較 於對應之未經刺激細胞降低所示。 實施例18.4 :本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外 抑制配體誘導之TSC2磷酸化
進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是否具有 干擾Gas6誘導及PI3K/AKT媒介之TSC2於彼之胺基酸殘基 Thrl462磷酸化之潛力。TSC2於Thrl462之磷酸化通常與 抑制TSC複合物之腫瘤抑制功能有關，及因此導致下游 mTOR途徑之活化。簡言之，第1天將5xl06 HS5 78T乳癌細 胞或3xl06 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔 天，以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢 餓處理隔夜達24小時。在第3天時，細胞以10微克/毫升之 Gammagard對照抗體（百特）、嵌合性抗Axl單株抗體 chmllB7 及人化抗 Axl 抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、 h#l 1 B7-T4 ' h#l 1B7-T5 及 h#l 1B7-T6 於 3 7 °C 預先培養 3 小 時，接著於37°C以400奈克/毫升之Gas6 ( R&D系統）處理 1 5分鐘或不經處理。之後移除培養基，使細胞於冰上溶解 於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑（10 mM Na4P207，ImM苯 甲磺醯氟、ImM原釩酸鹽、ImM NaF及0.5%抑肽酶）之 8〇〇微升溶解緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl, ImM EDTA，1 0% 甘油及 1 % Triton X-100 )中 30分 -138- 201105348
鐘，於4 °c以1 ο，ο ο 〇 X g離心1 0分鐘以去除細胞碎片。測定 上清液中之蛋白質濃度’將50微克之全細胞溶解物懸浮及 煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中，然後以SDS PAGE 展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時，該膜以NET-明膠封閉，並與兔多株抗TSC2—級抗體（細胞傳訊科技 ，#3612)隔夜培養。隔天以NET -明膠清洗3次後，該膜 於室溫中與HRP共軛之抗兔二級抗體（戴爾諾華，#111_ 036-045 )培養1小時，接著用NET-明膠再清洗3次。根據 廠商指示（G E醫療集團）使用化學發光偵測套組，濾膜 最後暴露至底片（柯達）。之後，該相同濾膜以抗-磷· TSC2(Thrl462)抗體（細胞傳訊科技，#3617)再次探 測。 圖28D顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard 對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化 抗 Axl抗體 h#llB7-T2、 h#l1B7-T3 > h#l1B7-T4 ' h#l1B7-φ T5及h#l 1B7-T6能顯著降低Hs578 T乳癌細胞（上圖）及 NCI-H292肺癌細胞（下圖）中由Gas6誘發之TSC2在 Thr 1462之磷酸化，如經Gas6刺激之細胞中此胺基酸殘基 之磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。 實施例18.5 :本發明之人化1 1B 7抗Axl抗體於活體外 抑制配體誘導之mTOR磷酸化 考慮TSC2磷酸化之效應，進行西方墨點分析以探討 本發明之人化抗體是否亦具有干擾Gas6誘導之mTOR活化 -139- 201105348 之潛力。Gas6媒介之mTOR活化係藉由彼之位置Ser2448之 磷酸化程度增加反映。爲達此目的，第1天將5x1 06 Hs578T乳癌細胞或3xl〇6 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分 培養皿上。隔天，以不含血清之培養基更換生長培養基以 使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。在第3天時，細胞以 10微克/毫升之Gammagard對照抗體（百特）、嵌合性抗 Axl單株抗體chmllB7及人化抗Axl抗體h#llB7-T2、 h#l 1 B7-T3 ' h#llB7-T4、h#llB7-T5 及 h#llB7-T6 於 37〇C 預先培養3小時，接著於37 °C以400奈克/毫升之Gas6 ( R&D系統）處理15分鐘或不經處理。之後移除培養基，使 細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑（1 〇 mM Na4P207, ImM苯甲磺醯氟、ImM原釩酸鹽、ImM NaF及 0.5°/。抑肽酶）之800微升溶解緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, ImM EDTA, 10% 甘油及 1 % T r i t ο η X-100)中30分鐘，於4°C以l〇,〇〇〇xg離心10分鐘以去除細胞 碎片。測定上清液中之蛋白質濃度，將5 0微克之全細胞溶 解物懸浮及煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中，然後 以SDS PAGE展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時， 該膜以NET-明膠封閉，並與兔多株抗-磷-mTOR ( Ser2448 )一級抗體（細胞傳訊科技’ #297 1 )隔夜培養。隔天以 NET-明膠清洗3次後，該膜於室溫中與HRP共軛之抗兔二 級抗體（戴爾諾華，# 1 1 1 -03 6-045 )培養1小時，接著用 NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示（GE醫療集團）使用 化學發光偵測套組，濾膜最後暴露至底片（柯達）。之後 -140- 201105348 ，該相同濾膜以抗-mTOR激酶抗體（細胞傳訊科技， #2972 )再次探測。 圖2 8 E顯示此實驗之代表性結果。該抗Axl抗體之抑制 效應在HS5 78T乳癌細胞（上圖）中相對微弱。然而，相 較於Gammagard對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7 及本發明之人化抗Axl抗體h#llB7-T2、h#llB7-T3、
h#l 1 B7-T4 ' h#l 1B7-T5 及 h#l 1B7-T6 倉g 干擾 NCI-H292 肺癌 細胞中由Gas6誘導之mTOR活化，如經Gas6刺激之細胞中 mTOR Ser2448磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降 低所示（下圖）。 實施例18.6 :本發明之人化1 1B7抗Axl抗體於活體外 抑制配體誘導之S6K1磷酸化 最後，進行西方墨點分析以探討本發明之人化抗體是 否具有干擾Gas6誘導之S6K1活化之潛力。Gas6媒介之 S6K1活化係藉由彼之位置Thr421及Ser424之磷酸化程度增 加反映。爲達此目的，第1天將5xl06 Hs578T乳癌細胞或 3xl06 NCI-H292肺癌細胞接種至10公分培養皿上。隔天， 以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處 理隔夜達24小時。在第3天時，細胞以1 0微克/毫升之 Gammagard對照抗體（百特）、嵌合性抗Axl單株抗體 chmllB7 及人化抗 Axl 抗體 h#llB7-T2、h#llB7-T3、 h#llB7-T4、h#llB7-T5 及 h#llB7-T6 於 37°C 預先培養 3 小 時，接著於37°C以400奈克/毫升之Gas6 ( R&D系統）處理 -141 - 201105348 1 5分鐘或不經處理。之後移除培養基，使細胞於冰上溶解 於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑（10 mM Na4P207，ImM苯 甲磺醯氟、ImM原釩酸鹽、ImM NaF及0.5%抑肽酶）之 800 微升溶解緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl, ImM EDTA，10% 甘油及 1% Triton X-100)中 30分 鐘，於4°C以1 0,000xg離心l〇分鐘以去除細胞碎片。測定 上清液中之蛋白質濃度，將50微克之全細胞溶解物懸浮及 煮沸於3倍SDS Laemmli樣本緩衝液中，然後以SDS PAGE 展開。當蛋白質被轉移至硝化纖維素膜時，該膜以NET-明膠封閉，並與兔多株抗-磷-p7〇 S6激酶1 (
Thr42 1/Ser424 )—級抗體（細胞傳訊科技，#9204 )隔夜 培養。隔天以NET-明膠清洗3次後，該膜於室溫中與HRP 共軛之抗兔二級抗體（戴爾諾華，#111-036-04 5)培養1 小時，接著用NET-明膠再清洗3次。根據廠商指示（GE醫 療集團）使用化學發光偵測套組，濾膜最後暴露至底片（ 柯達）。之後，該相同濾膜以抗-Θ -肌動蛋白抗體（細胞 傳訊科技，#4967 )再次探測。 圖28F顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard 對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chml 1B7及本發明之人化 抗 Axl抗體 h#l1B7-T2 、 h#l1B7-T3 ' h#llB7-T4、 h#11B7-T5及h#llB7-T6在Hs578T乳癌細胞中顯示對Gas6誘導之 S6K1活化之若干抑制效應，如經Gas6刺激之細胞中S6K1 Thr42 1/Ser424磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降 低所示（上圖）。然而，經嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及 -142- 201105348 本發明之人化抗Axl抗體h#UB7-T2、h#UB7-T3、 h#llB7-T4、h#llB7-T5 或 h#llB7-T6前處理之 NCI-H292肺 癌細胞（下圖）中可觀察到強烈許多之Gas6誘導之S6K1 Thr42 1/Ser424磷酸化及如此之活化降低。 實施例19 :本發明之人化1 1D5抗Axl抗體於活體外抑 制以ELIS A測定之配體誘導之Axl磷酸化
除 了人化 h#l1B7-T2 、 h#11B7-T3 、 h#l1B7-T4 、 h#llB7-T5及h#llB7-T6抗Axl單株抗體系列之特徵以外， 進行£[13八實驗以探討本發明之人化抗八\1抗體11#11〇5-丁2 、h#l1D5-T3 ' h#l1D5-T4 ' h#11D5-T5及 h#11D5-T6干擾
Gas6誘導之磷酸化及因此活化受體酪胺酸激酶Axl之潛力 。簡言之，第1天時，將每孔3xl〇4 Hs5 78T乳癌細胞接種 於平底96孔板之正常生長培養基中。隔天以不含血清之培 養基更換生長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時 。另外，黑色Maxi-Sorp 96孔板（諾科（Nunc))於4°C 中以2微克/毫升PBS之小鼠抗-磷-酪胺酸抗體4G10包覆隔 夜。在第3天時，移除4G10抗體溶液’ Maxi-Sorp孔槽於室 溫中以封閉溶液（PBS、0.5% BSA )封閉至少4小時。同 時，細胞以1 〇微克/毫升之Gammagard對照抗體（百特（ Baxter )公司）、嵌合性抗Axl單株抗體chml 1D5及人化抗
Axl 抗體 h#l 1D5-T2、h#l 1D5-T3、h#l 1D5-T4 ' h#l 1D5-T5 及h#llD5-T6於37t預先培養3小時，接著於37°C以400 奈克/毫升之Gas 6 (R&D系統）處理15分鐘或不經處理。 •143- 201105348 接著輕彈出培養基，使細胞於冰上溶解於添加磷酸酶及蛋 白酶抑制劑（10 mM Na4P2〇7, lmM苯甲擴醯氟、ImM原 釩酸鹽、ImM NaF及0.5 %抑肽酶）之每孔110微升溶解緩 衝液（50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, ImM EDTA, 10% 甘油及1% Triton X-100)中30分鐘。同時，移除封 閉緩衝液，以清洗緩衝液（PBS，0.05% Tween 20 )清洗 Maxi-Sorp板6次，之後移入每孔100微升之溶解物並於4°C 培養隔夜。當孔板於第4天以清洗緩衝液清洗6次後，孔槽 與0.125微克/毫升稀釋緩衝液（20mM Tris，50mM NaCl pH7.3，0.05% Tween 20，0.1% BSA)之生物素基化大鼠抗 Axl抗體12B 7於室溫中培養2小時。孔板經清洗緩衝液清洗 6次後，在各孔槽中添加經稀釋緩衝液稀釋20000倍之AP 共輞之鏈黴抗生物素蛋白（加美公（Chemicon) #SA110 )並於室溫中培養30分鐘。之後，孔槽以清洗緩衝液清洗 6次並加入At toPhos受質溶液（羅氏#11681982)。使用 SpectraMax-GeminiEM孔板讀取儀（分子儀器（Molecular Devices )公司），收集各孔於激發波長43 0奈米及發射波 長5 8 0奈米之螢光。 圖29顯示此實驗之代表性結果。相較於Gammagard對 照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chmllD5及本發明之人化抗 Axl 抗體 h#l1D5-T2、h#l1D5-T3 ' h#l1D5-T4 > h#l1D5-T5 及h#llD5-T6能阻斷或顯著降低Gas6媒介之Axl活化，如 經Gas6刺激之細胞中Axl酪胺酸磷酸化程度相較於對應之 未經刺激細胞降低所示。 -144- 201105348 實施例20 :本發明之大鼠及嵌合性抗Axl抗體於活體 外以類似程度抑制配體誘導之Axl磷酸化
大鼠抗Axl抗體1 1B7及1 1D5之嵌合性衍生物係經產製 以作爲本發明之部分（見上）。爲了探討本發明之大鼠抗 Axl抗體及該對應之本發明之嵌合性抗Axl抗體是否能以類 似程度於活體外抑制Gas6媒介之Axl活化，因此於CaSki子 宮頸癌細胞進行ELISA實驗。Gas6媒介之Axl活化因此藉 由受體酪胺酸磷酸化增加而偵測。簡言之，第1天時，將 每孔3x1 04細胞接種於平底96孔板之正常生長培養基中。 隔天以不含血清之培養基更換生長培養基以使細胞接受飢 餓處理隔夜達24小時。另外，黑色Maxi-Sorp 96孔板（諾 科（Nunc))於4°C中以2微克/毫升PBS之小鼠抗-磷-酪胺 酸抗體4G10包覆隔夜。在第3天時，移除4G10抗體溶液， Maxi-Sorp孔槽於室溫中以PBS、0.5% BSA封閉至少4小時 •同時，細胞以50奈克/毫升、100奈克/毫升、3 00奈克/毫 升、750奈克/毫升、1微克/毫升及10微克/毫升之大鼠抗 Axl抗體11B7或嵌合性抗Axl抗體chllB7於37°C預先培養 1小時，接著於37°c以400奈克/毫升之Gas6 ( R&D系統） 處理1 〇分鐘或不經處理。接著輕彈出培養基’使細胞於冰 上溶解於添加磷酸酶及蛋白酶抑制劑（10 mM Na4P2〇7, ImM苯甲磺醯氟、ImM原釩酸鹽、ImM NaF及0.5%抑肽酶 )之溶解緩衝液（50 mM HEPES pH 7_5，150 mM NaCl， ImM EDTA, 10% 甘油及 1 % Triton X-1 〇 〇 )中 3 0分鐘。同 -145- 201105348 時’移除封閉緩衝液，以清洗緩衝液（PBS，0.05% Tween 20)清洗Maxi-Sorp板6次，之後移入溶解物並於4°C培養 隔夜。當孔板於第4天以清洗緩衝液清洗6次後，孔槽與 0.5微克/毫升PBS之生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7於室溫 中培養2小時。孔板經清洗緩衝液清洗6次後，在各孔槽中 添加經PBS稀釋4000倍之AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白（加 美公（Chemicon) #SA110)並於室溫中培養30分鐘。之 後，孔槽以清洗緩衝液清洗6次並加入AttoPhos受質溶液
I (羅氏#11681982) »使用維克特（Victor)孔板讀取儀 (珀金埃爾默（Perkin Elmer))，收集各孔於激發波長 430奈米及發射波長580奈米之螢光。圖31顯示子宮頸癌細 胞系CaSki於此實驗之代表性結果。如相對Axl磷酸化之濃 度依賴性降低所示，本發明之大鼠抗Axl抗體1 1 B 7 ( A ) 及嵌合性抗Axl抗體chi 1B7 ( B )能以類似程度阻斷配體 誘導之受體酪胺酸激酶Axl之活化。使用相同實驗設計之 黑色素瘤細胞系C-8 161可觀察到類似效應。 實施例21:大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體 基因之產製 a)建構h#llB7-T15L及h#llB7-T18L輕鏈表現載體 與分泌信號融合之各個含有編碼h#l 1B7-T15L或 h#llB7-T18L輕鏈可變區（圖32A )(分別以序列表SEQ ID NO: 146或147之胺基酸編號21至129表示）之基因的 DN A係經合成（MB L醫學及生物實驗室有限公司之人工基 -146 - 201105348 因合成服務）且經限制酶Nhel及BsiWI消化。該形成之 DNA片段被分開導入預先經限制酶Nhel及BsiWl消化之供 人化抗體輕鏈表現之通用載體（PEF6KCL)之位點以藉此 建構h#llB7-T15L及h#llB7-T18L輕鏈表現載體。該獲得 之表現載體被稱爲 “ pEF6KCL/h#l 1B7-T15L或 “ pEF6KCL/h#l 1B7-T18L”，且各表現載體之導入物係分別 以序列表SEQ ID NO : 144或145之核苷酸序列表示。
b)建構h#llB7-TllH及h#llB7-T12H重鏈表現載體 各個含有編碼h#UB7-TllH或h#llB7-T12H重鏈可變 區（圖32B)(分別以序列表SEQ ID NO : 1 50或1 5 1之胺 基酸編號20至132表示）之基因的DNA係經合成（MBL醫 學及生物實驗室有限公司之人工基因合成服務）且經限制 酶BlpI消化。該形成之DNA片段被分開導入預先經限制酶 BlpI消化之供人化抗體重鏈表現之通用載體（pEFl/FCCU-1)之位點以藉此建構h#llB7-TllH及h#llB7-T12H重鏈表 現載體。該獲得之表現載體被稱爲“pEFl/FCCU/h#llB7-T11H”或 “pEFl/FCCU/h#llB7-T12H”，且各表現載體之導 入物係分別以序列表S E Q ID Ν Ο : 1 4 8或1 4 9之核苷酸序列 表示。 實施例22:製備大鼠抗人Axl單株抗體#11B7之人化 抗體 a )產製人化抗體 -147- 201105348 見實施例10之a)。 b )純化人化抗體 利用Protein A親和管柱層析法純化前段a )所獲得之 培養上清液。將1〇〇毫升之培養上清液置於有蓋之500毫升 角瓶中，接著加入1毫升經PBS平衡之Mab Select SuRe( GE醫療集團拜爾賽恩斯（Bio-science )公司）懸浮液（ 50%漿狀物）。該混合物於10 °C培養箱中以100 rpm攪拌 隔夜。該Freestyle 293 -F細胞培養上清液/MabSelect SuRe 懸浮液被加入空的5毫升Zeba Spin管柱（皮爾斯（PIERCE )公司）。全樹脂被置於管柱中，然後以1〇毫升之1M NaCl清洗。接著，加入1毫升之1M精胺酸溶液（pH 4.0) 以收集含抗體組分。該組分被加入離心過濾裝置（密理博 (Millipore)公司 Amicon Ultra-4，截留分子量：50K) ，接著以檸檬酸緩衝液進行溶液置換及濃縮調整至200微 升以製備經純化之樣本。 由 pEF6KCL/h#UB7-T15L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-TUH 之組合所獲得之人化抗體#11B7稱爲“h#llB7-T28”；由 pEF6KCL/h#UB7-T18L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-TllH之組合 所獲得之人化抗體#11B7稱爲“ h#llB7-T29” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T15L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T12H之組合 所獲得之人化抗體#11B7稱爲 "h#llB7-T30” ；由 pEF6KCL/h#llB7-T18L 及 pEFl/FCCU/h#llB7-T12H之組合 所獲得之人化抗體#1 1B7稱爲“ h#l 1B7-T31”。 -148- 201105348 表2
h#llB7 H質體 L質體 h#llB7-T28 pEFl/FCCU/h#llB7-TllH pEF6KCL/h#llB7-T15L h#llB7-T29 pEFl/FCCU/h#llB7-TllH pEF6KCL/h#llB7-T18L h#llB7-T30 pEFl/FCCU/h#llB7-T12H pEF6KCL/h#llB7-T15L h#llB7-T31 pEFl/FCCU/h#l 1B7-T12H pEF6KCL/h#llB7-T18L
實施例23 :評估大鼠抗人AXL單株抗體#11B7對人 AXL-Fc融合蛋白之親和性 該源自大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體 h#l 1B7-T28至h#l 1B7-T31藉由下列方法評估彼等對人 AXL-Fc之親和性。人AXL-Fc (R&D系統製造，#154-AL) 係以PBS稀釋成1微克/毫升。接著，將該溶液以100微升/ 孔之量分注至免疫板（Immuno Plate)(納爾杰諾科國際 公司（Nalge Nunc International K.K.)製造，#437111 ) ，於4 °C留置隔夜以使蛋白質吸附在該板上。隔天，該孔 槽以 PBS-T 溶液（PBS 及 0.05% ( v/v ) Tween 20)清洗 5次 。接著，將經PBS稀釋至5%之含脫脂乳（森永（Morinaga )乳業株式會社製造）溶液以1 〇〇微升/孔之量分注，留置 於室溫中2小時。移除孔槽中之溶液，以P B S - T溶液清洗 孔槽5次。接著，將經純化之實施例1 0中製備之大鼠抗人 八乂!^單株抗體#1187之人化抗體丁28至丁31以含0.5%脫脂乳 之PBS溶液分開稀釋成終濃度1微克/毫升至0.00256奈克/ 毫升（5倍連續稀釋）。接著，該溶液以100微升/孔之量 分注，留置於室溫中2小時。在此程序中，各抗體濃度係 -149- 201105348 如實施例15所述測定。以PBS-Τ溶液清洗孔槽5次。接著 ，經 TBS-T溶液（TBS 及 0.05% ( v/v) Tween 20)稀釋 2500倍之鹼性磷酸酶共軛之AffiniPure羊抗人IgG (傑克森 (Jackson)免疫硏究實驗室製造，#109-055-097)以100 微升/孔之量加入，於室溫中留置1小時。移除孔槽中之溶 液，以TBS-T溶液清洗孔槽5次。接著，添加100微升/孔之 螢光受質溶液（羅氏診斷（Roche Diagnostics K.K.)製 造，# 1 1 6 8 1 982 00 1 )以進行螢光反應。在人AXL-Fc-吸附 板上之螢光強度於添加螢光受質溶液後1 5分鐘利用 SpectraMax M5(製造商分子儀器（Molecular Devices) 公司）測量。結果顯示，該大鼠抗人AXL單株抗體之人化 抗體h#llB7-T28至h#llB7-T31經證實與人嵌合抗體具有 幾乎相同之抗體濃度依賴性人AXL-Fc蛋白質結合活性（ 圖1 9及3 3 )。 實施例24:大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體 的HPLC測定 源自大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之人化抗體h#llB7-T2 8至h#llB7-T31的蛋白質濃度係由下列程序測定。各人 化抗體樣本係經注射至大小排除管柱（東曹（Tosoh ) SW3 000XL )，蛋白質濃度由所形成之HPLC (安捷倫（ Agilent) 1 200 SL)尖峰面積及各抗體之吸光係數決定， 利用泰加吐珠單抗（tigatuzumab) (IgGl型人化抗人DR5 單株抗體）作爲標準物。泰加吐珠單抗抗體標準樣本之濃 -150- 201105348 度係由實施例1 5所述之直接吸光測定法測定。結果摘列於 圖34。 實施例25 :使用微差掃描熱卡計（DSC )測量人化抗 體之熱穩定性 比較抗體性質之指標的一個實例包括抗體穩定性。抗 體穩定性指標之實例包括熱穩定性。
熱變性中點（Tm )低之抗體極可能被變性。該經變 性之抗體易於集結，也被認爲具有較高之抗原性。相反地 ，高Tm之抗體較不易變性（展開）或去活化，可被製備 成可長時間穩定儲存之溶液調製劑。 微差掃描熱卡計（D S C )是一種可快速、準確地測量 Tm之儀器，Tm被當作蛋白質之相對結構穩定性之良好指 標。Tm値可利用DSC測量，比較該些測量値以藉此決定其 間之熱穩定性差異。 測量 h#llB7-Tl 、 h#llB7-T2 、 h#l1B7-T3 、 h#l1B7-T4 、 h#l1B7-T5 、 h#11B7-T6 、 h#l1B7-T7 ' h#11B7-T8 、 h#11B 7-T9 、 h#11B7-T10 、 h#l1B7-T11 、 h#l1B7-T12 、 h#l1B7-T13 h#l1B7-T17 h#l1B7-T21 h#l1B7-T14 h#l1B7-T18 h#l1B7-T22 h#l1B7-T15 h#l1B7-T19 h#l1B7-T23 h#l1B7-T16 h#l1B7-T20 h#l1B7-T24 h#l1B7-T25 、 h#l1B7-T26 、 h#11B7-T27 、 h#l1B7-T28 、 h#l1B7-T29 ' h#l1B7-T30 > h#11B7-T31 及嵌合性 11B7之 熱穩定性。分別調整該些樣本之濃度至0.5毫克/毫升（ -151 - 201105348 CBS溶液），取400微升等分以作爲DSC測量之樣本溶液。 該DSC測量條件設定如下：初始溫度20°C、終末溫度1〇〇 °C、溫度上升速率每小時60°C及過濾時間10秒。使用CBS 作爲參考溶液。由美國麥克卡公司（Micro Cal Inc.，US) 製造之VP-Capillary DSC平台被用來做爲DSC測量儀器。 基準校正藉由從樣本溶液獲得之掃描曲線減去基準値（將 參考溶液裝塡至樣本槽所獲得之掃描曲線）進行。
圖35(1)顯示11#1187-1'1之熱譜圖；圖35(2)顯示 11#1187-丁2之熱譜圖；圖35(3)顯示11#1187-丁3之熱譜圖 ;圖35(4)顯示11#1187-丁4之熱譜圖；圖35(5)顯示 11#1187-丁5之熱譜圖；圖35(6)顯示11#1187-丁6之熱譜圖 ;圖35(7)顯示11#1187-丁7之熱譜圖；圖35(8)顯示 11#1187-丁8之熱譜圖；圖35(9)顯示11#1187-丁9之熱譜圖 ;圖35(10)顯示11#1187-1'10之熱譜圖；圖35(11)顯示 h#llB7-Tll之熱譜圖；圖35 ( 12)顯示h#llB7-T12之熱 譜圖；圖35 ( 13)顯示h#llB7-T13之熱譜圖；圖35 ( 14) 顯示h#llB7_T14之熱譜圖；圖35 ( 15)顯示h#llB7-T15 之熱譜圖；圖35(16)顯示11#1187-丁16之熱譜圖；圖35( 17)顯示h#llB7-T17之熱譜圖；圖35 ( 18)顯示h#llB7- 丁18之熱譜圖；圖35(19)顯示11#1187-1'19之熱譜圖；圖 35 ( 20)顯示h#llB7-T20之熱譜圖；圖35 ( 21)顯不 h#llB7-T21之熱譜圖；圖35 ( 22)顯不h#l〗B7_T22之熱 譜圖；圖35 ( 23)顯示11#1187-丁23之熱譜圖；圖35 ( 24) 顯示h#llB7-T24之熱譜圖；圖35 ( 25)顯不h#11B7-T25 -152- 201105348 之熱譜圖；圖35(26)顯示h#l 1B7-T2 6之熱譜圖；圖35 ( 27)顯示11#1187-丁27之熱譜圖；圖35(28)顯不11#1187· T28之熱譜圖；圖35 ( 29)顯Tpch#llB7-T29之熱譜圖；圖 35 ( 30)顯示11#1137-丁30之熱譜圖；圖35(31)顯示 h#l 1B7-T31之熱譜圖；圖3 5 ( 32 )顯示嵌合性h#UB7之 熱譜圖。 在本文中，全熱譜圖之峰頂値係定義爲Fab區之熱變 性中點Tm。測量之結果顯示，h#llB7-Tl之Tm爲7 1.6°C ; h#l 1 B7-T2 之 Tm 爲 77.2 °C h#llB7-T4 之 Tm 爲 70.2°C h#llB7-T6 之 Tm 爲 79.0°C h#llB7-T8 之 Tm 爲 83.5°C h#llB7-Tl〇 之 Tm 爲 77.4°C h#llB7-T12 之 Tm 爲 76.6°C h#llB7-T14 之 Tm 爲 75.8°C h#llB7-T16 之 Tm 爲 82.2°C h#llB7-T18 之 Tm 爲 83.0°C h#llB7-T20 之 Tm 爲 76.9°C h#llB7-T22 之 Tm 爲 83.6°C h#llB7-T24 之 Tm 爲 77.6°C h#llB7-T26 之 Tm 爲 76.9°C h#llB7-T28 之 Tm 爲 77.4°C h#llB7-T30 之 Tm 爲 77.8°C 及嵌合性之Tm爲73.1C。 ；h#l 1 B7-T3 之 Tm 爲 73.0 °C ； ;h#llB7-T5 之 Tm 爲 73_1°C ; ;h#l 1 B7-T7 之 Tm 爲 76.5 °C ； ；h#l 1 B7-T9 之 Tm 爲 82.5 〇C ； ;h#llB7-Tll 之 Tm 爲 83.5°C ; ;h#llB7-T13 之 Tm 爲 77.6°C ； ;h#llB7-T15 之 Tm 爲 83_1°C ; ;h#UB7-T17 之 Tm 爲 76.6°C ； ;h#llB7-T19 之 Tm 爲 75.9°C ； ；h#llB7-T21 之 Tm 爲 76.6°C ； ：h#UB7-T23 之 Tm 爲 83.0〇C ； ；h#l 1 B7-T25 之 Tm 爲 83.9 〇C ； ；h#l 1B7-T27 之 Tm 爲 77.9。。； ；h#l 1B7-T29 之 Tm 爲 77.4〇C ； ；h#l 1B7-T3 I 之 Tm 爲 77.9°C ； -153- 201105348 實施例26 :本發明之人化1 1B7抗Axl抗體於活體外抑 制以ELISA測定之配體誘導之Axl磷酸化
由生長停止特定基因6 ( Gas6 )編碼之蛋白質代表受 體酪胺酸激酶Axl之天然配體。Gas6與Axl結合導致由受體 酪胺酸激酶磷酸化程度增加所反映之受體活化。進行 ELISA實驗以評估本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、 11B7-T6及 11B7-T6之衍生物 11B7-T11 、 11B7-T23及 11B7-T25干擾Gas6誘導之磷酸化及因此受體酪胺酸激酶Axl活化 之潛力。
簡言之，第1天時，將每孔3x1 04細胞接種於平底96孔 板之正常生長培養基中。隔天以不含血清之培養基更換生 長培養基以使細胞接受飢餓處理隔夜達24小時。另外，黑 色Maxi-Sorp 96孔板（諾科（Nunc))於4°C中以2微克/ 毫升PBS之小鼠抗-磷-酪胺酸抗體4G10包覆隔夜。在第3天 時，移除4G10抗體溶液，Maxi-Sorp孔槽於室溫中以封閉 緩衝液（PBS、0.5% BSA )封閉至少4小時。同時，細胞 以10微克/毫升之Gammagard對照抗體（百特（Baxter)公 司）及人化抗 Axl抗體 11B7-T5、 11B7-T6、 11B7-T11、 1 1 B 7 - T 2 3及1 1 B 7 - T 2 5 於3 7 °c預先培養3小時，接著於3 7 °C以400奈克/毫升之Gas6 ( R&D系統）處理15分鐘或不經 處理。接著輕彈出培養基，使細胞於冰上溶解於添加磷酸 酶及蛋白酶抑制劑（1〇 mM Na4P207, ImM苯甲磺醯氟、 1111]^原釩酸鹽、11111^^?及0.5%抑肽酶）之11〇微升溶解 -154- 201105348
緩衝液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl, ImM EDTA, 1 0% 甘油及 1 % Triton X-1 00 )中 30分鐘。同時， 移除封閉緩衝液，以清洗緩衝液（PBS，0.05% Tween 20 )清洗Maxi-Sorp板6次，之後移入每孔100微升之溶解物 並於培養隔夜。當孔板於第4天以清洗緩衝液清洗6次 後，孔槽與0.125微克/毫升稀釋緩衝液（20mM Tris， 50mM NaCl pH7.3，0.05% Tween 20，0.1% BSA)之生物素 基化大鼠抗Axl抗體12B7於室溫中培養2小時。孔板經清洗 緩衝液清洗6次後，在各孔槽中添加經稀釋緩衝液稀釋 20000倍之AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白（加美公（ Chemicon) #SA110)並於室溫中培養30分鐘。之後，孔 槽以清洗緩衝液清洗6次並加入AttoPhos受質溶液（羅氏 # 1 1 6 8 1 9 8 2 )。使用 SpectraMax-GeminiEM 孔板讀取儀（分 子儀器（Molecular Devices )公司），收集各孔於激發波 長43 0奈米及發射波長580奈米之螢光。 圖37顯示Hs5 78 T乳癌細胞（上圖）及NCI-H292肺癌 細胞（下圖）於此實驗之代表性結果。相較於Gammagard 對照抗體，本發明之人化抗Axl抗體1 1B7-T5、1 1B7-T6、 11B7-T11 ' 11B7-T23及11B7-T25在二種細胞系中顯著降 低Gas6媒介之Axl活化，如經Gas6刺激之細胞中Axl酪胺酸 磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。 實施例27:本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑 制以ELISA測定之配體誘導之Akt磷酸化 -155- 201105348 另外，進行ELISA實驗以評估本發明之人化抗Axl抗 體 11B7-T5 、 11B7-T6及 11B7-T6之衍生物 11B7-T11 、 1 1B7-T23及1 1B7-T25是否能阻斷配體Gas6媒介之Akt激酶 活化。0^6媒介之八1^-激酶活化係藉由蛋白質（3^473 ) 磷酸化增加加以偵測。 簡言之，第1天時，將每孔2x1 04細胞接種於平底96孔 板中。隔天以不含血清之培養基更換正常生長培養基以使 細胞接受飢餓處理達3 6小時。之後，細胞維持不經處理或 以10微克/毫升之Gammagard對照抗體（百特（Baxter)公 司）及人化抗 Axl 抗體 11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11、 11B7-T23及11B7-T25 於37t：預先培養1小時，接著於37 °匚以400奈克/毫升之Gas6(R&D系統）處理15分鐘或不經 處理。輕彈出培養基，細胞於室溫中以4%甲醛於PBS ( pH 7.5)中固定30分鐘。移除甲醛溶液，細胞以清洗緩衝液 (P B S，0 _ 1 % T w e e η 2 0 )清洗二次。細胞以 1 % Η 2 Ο 2、 0.1% NaN3於清洗緩衝液中淬熄（quenched)並於室溫中 培養20分鐘。之後，移除該淬熄溶液，細胞以清洗緩衝液 清洗二次，於室溫中以PBS、0.5% BS A封閉4小時。添加 以 PBS、0.5% BSA > 5mM EDTA 稀釋 500 倍之抗-磷- Akt( Ser47 3 )—級抗體（多株兔抗體；細胞傳訊科技（Cell Signaling Technologies) #9271)於 4 °C 中隔夜培養。第 4 天時，移除抗體溶液，以清洗緩衝液清洗該板3次。接著 在各孔中加入經PBS、0.5% BSA稀釋25〇0倍之HRP共軛之 抗兔二級抗體（戴爾諾華（Dianova) #111-036-045)， -156- 201105348 於室溫中培養1.5小時。該板以清洗緩衝液清洗3次及PBS 清洗2次，每次各5分鐘。加入四甲基聯苯胺（TMB，卡柏 肯（Calbiochem ))，並以620奈米監測。該反應藉由添 加1〇〇微升之2 5 0 nM HC1停止，使用Vmax孔板讀取儀（熱 實驗室系統（Thermo Lab Systems)公司）於波長450奈 米處讀取吸光度，參考波長爲620奈米。
圖38顯示Hs578T乳癌細胞（上圖）及NCI-H292肺癌 細胞（下圖）於此實驗之代表性結果。相較於Gammagard 對照抗體，本發明之人化抗AX1抗體11B7-T5、11B7-T6、 11B7-T11、11B7-T23及11B7-T25在二種細胞系中能阻斷 或降低Gas6媒介之Akt激酶活化，如經Gas6刺激之細胞中 Akt ( Ser473 )磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降 低所示。 實施例28:本發明之人化11B7抗Axl抗體誘導Axl受體 內化
Axl已被認定爲可影響腫瘤細胞遷移及存活之因子， 該影響透過Axl媒介之信號傳導途徑包括上述之Akt途徑。 因此，若可藉由受體內化而自細胞表面/細胞膜有效地清 除Axl，細胞傳訊及因此之細胞維持及腫瘤生長及轉移最 後可被減少或抑制。 爲了探討本發明之人化抗Axl抗體1 1B7-T5、1 1B7-T6 及 11B7-T6之衍生物 11B7-T11 、 11B7-T23及 11B7-T25是否 能誘導加速之Axl內吞作用，比較細胞與本發明之人化抗 -157- 201105348
Axl抗體經過2、4、6及20小時之培養後在細胞表面上Axl 分子之相對量。 簡言之，第1天時，將2 X 1 05細胞接種於6孔板之正常 生長培養基中，使其隔夜生長。隔天，移除該培養基，以 不含血清之培養基清洗細胞。之後，細胞維持不經處理或 與10微克/毫升之Gammagard對照抗體（百特（Baxter)公 司）及人化抗 Axl 抗體 11B7-T5、11B7-T6' 11B7-T11、
11B7-T23 及 11B7-T25 於 4。。添力卩1〇 mM HEPES 之不含血 清培養基中培養40分鐘。隨後將細胞轉移至37°C中所示時 間，以允許內化發生。之後，以10 mM EDTA使細胞脫離 ，重懸於10 0微升之清洗緩衝液（PBS，3%FCS)。後續之 固定作用係當劇烈搖晃細胞時滴加100微升於PBS中之2% 多聚甲醛。於室溫中培養20分鐘後，細胞經過清洗並重懸 於1 〇〇微升之清洗緩衝液中以存放在冰箱中直到收集所有 樣本。爲了最後染色細胞之Axl表現程度，將樣本轉移至 圓底96孔板並於4 °C之清洗緩衝液中與3微克/毫升之大鼠 抗Axl單株抗體2A1培養1小時。以清洗緩衝液清洗細胞2 次，與經1〇〇倍稀釋之驢抗大鼠IgG-PE二級抗體（戴爾諾 華（Dianova))於中培養60分鐘，以清洗緩衝液再次 清洗細胞2次，以FACS (貝克曼庫爾特（Beckman Coulter )EPICS, EXP032 )進行分析。 圖38之代表性資料顯示，Hs5 7 8 T乳癌細胞經人化抗 Axl 抗體 11B7-T5 、 11B7-T6 、 11B7-T11 、 11B7-T23 及 11B7-T25處理導致Axl受體之內化，然而Gammagard對照 -158- 201105348 抗體不具任何效應。此圖顯示相對Axl表現程度之百分比 ，其係定義爲在個別處理時間時經抗Axl單株抗體處理樣 本相較於未經處理樣本之平均螢光強度。 實施例29 :本發明之人化11B7抗Axl抗體於活體外抑 制球體式細胞性血管新生
Axl係多重血管新生行爲之關鍵調節物，包括活體外 之內皮細胞遷移、增生及微管形成（Holland et al.， Cancer Res: 65, 9294-9303, 2005 )。因此，測試本發明 之人化抗Axl抗體11B7-T5、11B7-T6及11B7-T6之衍生物 11B7-T11、11B7-T23 及 11B7-T25 對 Gas6誘導之 HUVEC 球 體細胞之血管芽生之抑制效應。該等實驗調整原本發表之 程序（Korff and Augustin : J Cell Sci 112 : 3249-58, 1 999 ) 〇 簡言之，球體細胞係如所述製備（Korff and Augustin ： J Cell Biol 143 ： 1 34 1 -52，1 998 )，將 500個人 臍靜脈內皮細胞（HUVEC )與VEGF-A ( 25奈克/毫升）懸 滴在塑膠培養皿上，留置隔夜以使球體聚集。50個 HUVEC球體細胞接著被接種於0.9毫升之膠原蛋白溶液中 (2毫克/毫升），並吸取至24孔板之各孔槽以允許聚合作 用。經30分鐘後，藉由吸取100微升之10倍濃縮之工作稀 釋液至該聚合膠體之上以添加濃度漸減之Gammagard對照 抗體（百特（Baxter)公司）或人化抗Axl抗體11B7-T5、 11B7-T6、1 1B7-T1 1、11B7-T23 及 1 1B7-T25 ( 1χ10·6Μ， -159- 201105348 3 χ 1 (Γ7 Μ，1 χ 1 〇·7 Μ，3 χ 1 0-8 Μ，1 χ 1 Ο·8 μ，3 x 1 (Γ9Μ，1 x 1 Ο-丨 0Μ )與人GAS6 ( R&D系統）（人GAS6終濃度1微克/毫升） 。孔板於37°C培養24小時，並藉由添加4% Roti-Histofix (德國喀斯魯羅斯（Roth)公司）加以固定。HUVEC球體 之發芽強度係由影像分析系統定量，該系統利用倒置顯微 鏡及數位影像軟體分析3.2 (德國明斯特軟影像系統（Soft imaging system )公司）測定每個球體之累積發芽長度。 分析10個隨機選擇球體之累積發芽長度的平均値以作爲各 資料點。 圖3 9顯示此實驗之代表性結果。 【圖式簡單說明】 圖1:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之輕鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llB7-TlL至h#llB7_ T7L。 圖2 :此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#1 1B7之輕鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llB7-T8L至h#llB7-T1 4L » 圖3:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之輕鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llB7-T15L至 h#11B 7-T20L。 圖4 :此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#1 1B7之重鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llB7-TlH至h#llB7-T6H。 -160- 201105348 圖5 :此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#1 1B7之重鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llB7-T7H至h#llB7-T 1 2H。 圖6:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之輕鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#UD5-TlL至h#llD5- T7L °
圖7 :此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#1 1D5之輕鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llD5-T8L至h#llD5-T1 4L。 圖8 :此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11 D5之輕鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llD5-T15L至 h#l 1 D5-T21L。 圖9 :此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#1 1D5之輕鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llD5-T22L至 h#l 1D5-T28L。 圖10 :此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#1 1D5之輕鏈 的人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llD5-T29L至 h#l1D5-T35L。 圖11此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之輕鏈的 人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#llD5-T36及h#llD5-T37L。 圖12:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之重鏈 的人化可變區之胺基酸序列，命名爲h#l 1D5-T1H至 h#l1D5-T7H 。 -161 - 201105348 圖13:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11D5之重鏈 的人化可變區之胺基酸序列’命名爲h#HD5-T8H至 h#l1D5-T13H 。
圖14 :此圖說明引子EFF1及EfsmR、包含分泌信號及 人/C鏈之固定區及多聚（A)加尾信號之片段B、編碼包 含人IgGl信號及固定結構域之多肽的DN A片段及前導序列 的核苷酸序列，以及該大鼠抗人Axl單株抗體1 1B7及1 1D5 之CDR、嵌合#11B7抗體重鏈及輕鏈（IgGl//c)、嵌合 #1 1D5抗體重鏈及輕鏈（IgGl / /c )及前導序列之胺基酸序 列。
圖15A: Ratl-Mock及Ratl-AXL cl.2纖維母細胞之細胞 表面AXL的流式細胞分析。收集以pLXSN及pLXSN-hAXL 單嗜性病毒分別感染Rati纖維母細胞所產製之Ratl-Mock 多株細胞及Ratl-AXL cl.2種系細胞，並利用3微克/毫升之 小鼠對照抗體72A1 (左圖）或小鼠抗AXL MAB154—級抗 體（右圖）及PE共軛之抗小鼠二級抗體染色。詳見內文。 染色Ratl-AXL cl.2細胞導致平移3個數量級且證實AXL在 該些細胞之表面過度表現。 圖 15B: NIH3T3-Mock 及 NIH3T3-AXL cl.7 纖維母細胞 之細胞表面AXL的流式細胞分析。收集以pLXSN及pLXSN-AXL單嗜性病毒分別感染NIH3T3纖維母細胞所產製之 NIH3T3-Mock多株細胞及NIH3T3-AXL cl.7種系細胞，並 利用3微克/毫升之小鼠對照抗體72A1 (左圖）或小鼠抗 AXL MAB 1 54—級抗體（右圖）及PE共軛之抗小鼠二級抗 -162- 201105348 體染色。詳見內文。染色NIH3T3-AXL cl.7細胞導致平移2 個數量級且證實AXL在該些細胞之表面過度表現。
圖16 :探討大鼠抗AXL抗體對於裸鼠中人前列腺癌生 長之效應的原位異種移植模型。P C - 3 - LN前列腺癌細胞經 原位接種至NMRI-nu/nu小鼠之前列腺。動物被隨機分成4 組，接受2S毫克/公斤之同型對照抗體1D5或拮抗性大鼠抗 八乂1^抗體1187及40毫克/公斤之妤癌特（5^4111)或12.5毫 克/公斤之剋癌易（Taxotere)。在該治療期間，原位生長 性PC-3-LN腫瘤之生長以及周邊轉移係於第15、23、29及 3 4天經由活體內生物發光造影每周監測一次。詳見內文》 相較於同型對照抗體1D5，拮抗性大鼠抗AXL抗體1 1B7減 少裸鼠中PC-3-LN前列腺腫瘤之整體生長。 圖17 :探討大鼠抗AXL抗體對於裸鼠中人前列腺癌轉 移之效應的原位異種移植模型。P C - 3 - LN前列腺癌細胞係 經原位接種至NMRI-nu/nu小鼠之前列腺。動物被隨機分 φ 成4組，接受25毫克/公斤之同型對照抗體1D5或拮抗性大 鼠抗AXL抗體11B7及40毫克/公斤之妤癌特（Sutent)或 12.5毫克/公斤之剋癌易（Taxotere )。在屍體解剖後，收 集經選擇之器官（肝、脾、肺、股骨及腰椎之部分），藉 由生物發光造影分析轉移之存在。詳見內文。相較於同型 對照抗體1D5，本發明之拮抗性大鼠抗AXL抗體1 1B7減少 脾轉移之發生。値得注意的是，此實驗中11B7之抗轉移效 應相較於紆癌特之效應爲強。 圖18:此圖描述載體PEF6KCL之建構。 -163- 201105348 圖19:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#llB7-Tl至 h#llB7-T6之結合活性，使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測 定。 圖20:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#llB7-T7至 h#llB7-T13之結合活性，使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測 定。 圖21:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#llB7-T14至 h#llB7-T20之結合活性，使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測 定。 圖22:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#llB7-T21至 h#llB7-T27之結合活性，使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測 定。 圖23:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#llD5-Tl至 h#llD5-T6之結合活性，使用人AXL-Fc包覆板由ELISA測 定。 圖24 (上圖及下圖）：此圖描述大鼠抗人AXL人化抗 體h#llB7-Tl至h#llB7-T27之蛋白質濃度，以直接蛋白質 吸光度試驗測定。 圖25:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#llD5-Tl至 h#l 1D5-T6之蛋白質濃度，以直接蛋白質吸光度試驗測定 〇 圖26:此圖描述在人AXL抗原上與大鼠抗人AXL單株 抗體#11 B7結合之結構域的決定基。 圖27:探討人化11B7抗Axl抗體對Axl受體磷酸化之效 -164- 201105348
應的ELISA實驗。Hs578T乳癌細胞（上）及NCI-H292肺癌 細胞（下）係經飢餓處理，以10微克/毫升之Gammagard 對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chml 1B7 ( IgGl/Kappa )及本發明之人化抗Axl抗體h#l 1B7-T2、h#l 1B7-T3、 h#l 1B7-T4 ' h#UB7-T5 及 h#llB7-T6 ( T2-T6 )預先培養 ，經400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理，然後溶解》 溶解物被轉移至抗-磷-酪胺酸抗體4G10-包覆之Maxi-Sorp 96孔板，該板接著經過清洗並與0.125微克/毫升之生物素 基化大鼠抗Axl抗體12B 7、AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白及 AttoPhos受質溶液培養以收集螢光強度。詳見內文。相較 於Gammagard對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chml 1B7及本 發明之人化抗 Axl 抗體11#1187-丁2、11#1187-丁3、11#1187-T4、h#l 1B7-T5及h#l 1B7-T6能在二種細胞系中阻斷或顯 著降低Gas6媒介之Axl活化，如經Gas6刺激之細胞中Axl酪 胺酸磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示。 圖28A :探討人化1 1B7抗Axl抗體對ERK1/2磷酸化之 效應的西方墨點實驗。Hs578T乳癌細胞（上）及NCI-H292肺癌細胞（下）係經飢餓處理，在經400奈克/毫升之 mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對 照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chml 1B7 ( IgGl/Kappa ) 或本發明之人化抗Axl抗體h#UB7-T2、h#llB7-T3、 h#UB7-T4、h#llB7-T5 及 h#llB7-T6 (T2-T6)預先培養 ，然後溶解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離，利用抗-磷-p44/42 MAP激酶（Thr202/Tyr204 )抗體進行西方墨點 -165- 201105348 分析。隨後，該相同濾膜以抗P44/42 MAP激酶抗體抗體 再次探測。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體，該嵌 合性抗Axl抗體Chm 1 1B7及本發明之人化抗Axl抗體 h#l 1 B7-T2 、 h#l 1 B7-T3 、 h#l 1 B7-T4.、 h# 1 1 B7-T5 及 h#llB7-T6干擾Hs578T乳癌細胞中由Gas6誘發之ERK1/2活 化微弱增加。然而由於ERK 1/2在此細胞系中之基礎活性 甚高，這些如經Gas6刺激之細胞中ERK1/2 Thr202/Tyr204 磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低所示之效應似 乎僅相對中等。相對地，嵌合性抗Axl抗體chm 1 1B7及人 化抗 Axl 抗體 h#l1B7-T2 、 h#l1B7-T3 、 h#11B7-T4 、 h#llB7-T5及h#llB7-T6在NCI-H292肺癌細胞中所反映之 對ERK1/2 Thr202/Tyr204磷酸化之抑制效應清楚得多。 圖28B:探討人化11B7抗Axl抗體對AKT磷酸化之效應 的西方墨點實驗。Hs5 78T乳癌細胞（上）及NCI-H292肺 癌細胞（下）係經飢餓處理，在經400奈克/毫升之mGas6 處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對照抗 體、嵌合性抗Axl單株抗體chmllB7 ( IgGl/Kappa)或本 發明之人化抗 Axl 抗體 h#UB7-T2、h#llB7-T3、h#llB7-T4、h#llB7-T5及h#llB7-T6預先培養，然後溶解。全細 胞溶解物經SDS-PAGE分離，利用抗AKT1/2/3抗體進行西 方墨點分析。隨後，該相同濾膜以抗-磷-AKT ( Ser473 ) 抗體再次探測。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體， 該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體 h#l1B7-T2 ' h#l1B7-T3 、 h#l1B7-T4 、 h#l1B7-T5 及 -166- 201105348 h#llB7-T6能顯著降低Hs5 7 8T乳癌細胞（上）及NCI-H292 肺癌細胞（下）中由Gas6誘發之AKT活化，如經Gas6刺激 之細胞中AKT Ser473磷酸化程度相較於對應之未經刺激細 胞降低所示。
圖28C:探討人化11B7抗Axl抗體對GSK-3冷磷酸化之 效應的西方墨點實驗。Hs578T乳癌細胞（上）及NCI-H292肺癌細胞（下）係經飢餓處理，在經400奈克/毫升之 mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對 照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chmllB7 ( IgGl/Kappa) 或本發明之人化抗Axl抗體h#llB7-T2、h#llB7-T3、 h#l 1 B7-T4 ' h#l 1B7-T5 及 h#l 1B7-T6 預先培養，然後溶 解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離，利用抗-磷-GSK-3/9 (Ser9 )抗體進行西方墨點分析。隨後，該相同濾膜以 抗-GSK-3冷抗體再次探測。詳見內文。相較於Gammagard 對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化 抗 Axl抗體 h#llB7-T2、 h#l1B7-T3 ' h#l1B7-T4 ' h#l1B7-T5及h#llB7-T6能顯著降低Hs57 8T乳癌細胞（上）及NCI-H292肺癌細胞（下）中由Gas6誘發之GSK-3 /5活化，如經 Gas6刺激之細胞中GSK-3召 Ser9磷酸化程度相較於對應 之未經刺激細胞降低所示。 圖28D:探討人化11B7抗Axl抗體對TSC2磷酸化之效 應的西方墨點實驗。Hs5 7 8T乳癌細胞（上）及NCI-H292 肺癌細胞（下）係經飢餓處理’在經400奈克/毫升之 mGas6處理或不經處理之前以1〇微克/毫升之Gammagard對 -167- 201105348
照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chml 1B7 ( IgGl/Kappa ) 或本發明之人化抗Axl抗體h#UB7-T2、h#llB7-T3、 h#llB7-T4、h#UB7-T5 及 h#llB7-T6 預先培養，然後溶 解。全細胞溶解物經S D S - P A G E分離，利用抗-T S C 2抗體 進行西方墨點分析。隨後，該相同濾膜以抗-磷-TSC2 ( Thrl 462 )再次探測。詳見內文。相較於Gammagard對照 抗體，該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl 抗體 h#llB7-T2 、 h#l1B7-T3 、 h#llB7-T4 、 h#llB7-T5及 h#llB7-T6能顯著降低Hs5 78T乳癌細胞上）及NCI-H292 肺癌細胞（下）中由Gas6誘發之TSC2在Thrl 462之磷酸化 ，如經Gas6刺激之細胞中此胺基酸殘基之磷酸化程度相較 於對應之未經刺激細胞降低所示。
圖28E:探討人化11B7抗Axl抗體對mTOR磷酸化之效 應的西方墨點實驗。HS5 78 T乳癌細胞（上）及NCI-H292 肺癌細胞（下）係經飢餓處理，在經400奈克/毫升之 mGas6處理或不經處理之前以10微克/毫升之Gammagard對 照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chmllB7 ( IgGl/Kappa) 或本發明之人化抗Axl抗體h#llB7-T2、h#llB7-T3、 h#l 1B7-T4 ' h#l 1 B7-T5 及 h#l 1 B7-T6 預先培養，然後溶 解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離，利用抗-磷-mTOR ( Ser2448 )抗體進行西方墨點分析。隨後，該相同濾膜以 抗-mTOR抗體再次探測。詳見內文。該抗Axl抗體之抑制 效應在Hs5 78T乳癌細胞（上）中相對微弱。然而，相較 於Gammagard對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及 -168- 201105348 本發明之人化抗Axl抗體h#llB7-T2、h#llB7-T3、 h#llB7-T4、h#llB7-T5 及 h#llB7-T6 能干擾 NCI-H292 肺癌 細胞中由Gas6誘導之mTOR活化’如經Gas6刺激之細胞中 mTOR S er244 8磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降 低所示（下圖）。
圖28F:探討人化11B7抗Axl抗體對S6K1磷酸化之效 應的西方墨點實驗。HS5 78 T乳癌細胞（上）及NCI-H292 肺癌細胞（下）係經飢餓處理，在經4〇〇奈克/毫升之 mGas6處理或不經處理之前以1〇微克/毫升之Gammagard對 照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體chml 1B7 ( IgGl/Kappa ) 或本發明之人化抗Axl抗體h#llB7-T2、h#llB7-T3、 h#l 1 B7-T4 ' h#l 1B7-T5 及 h#l 1B7-T6 預先培養，然後溶 解。全細胞溶解物經SDS-PAGE分離，利用抗-磷-p70 S6 激酶1 ( Thr421/Ser424 )抗體進行西方墨點分析。隨後， 該相同濾膜以抗肌動蛋白抗體再次探測。詳見內文。 相較於Gammagard對照抗體，該嵌合性抗Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#llB7-T2、h#llB7-T3、 h#l1B7-T4 ' h#llB7-T5及h#llB7-T6在 Hs578T乳癌細胞中 顯示對Gas6誘導之S6K1活化之若干抑制效應，如經Gas6 刺激之細胞中S6K1 Thr421/Ser424磷酸化程度相較於對應 之未經刺激細胞降低所示（上圖）。然而，經嵌合性抗 Axl抗體chm 11B7及本發明之人化抗Axl抗體h#llB7-T2、 h#l1B7-T3 ' h#l1B7-T4 ' h#llB7-T5或 h#llB7-T6前處理 之NCI-H292肺癌細胞（下圖）中可觀察到強烈許多之 -169- 201105348
Gas6誘導之S6K1 Thr421/Ser424磷酸化及如此之活化降低 圖29:探討人化11D5抗Axl抗體對Axl受體磷酸化之 效應的ELISA實驗。HS578T乳癌細胞係經飢餓處理，以10 微克/毫升之Gammagard對照抗體、嵌合性抗Axl單株抗體 chmllD5 ( IgGl/Kappa )及本發明之人化抗Axl抗體 h#l 1D5-T2 、 h#l1D5-T3 、 h#l 1D5-T4 、 h#l1D5-T5 及 h#llD5-T6預先培養，經400奈克/毫升之mGas6處理或不 經處理，然後溶解。溶解物被轉移至抗-磷-酪胺酸抗體 4G10-包覆之Maxi-Sorp 96孔板，該板接著經過清洗並與 0.125微克/毫升之生物素基化大鼠抗Axl抗體12B7、AP共 軛之鏈黴抗生物素蛋白及AttoPhos受質溶液培養以收集螢 光強度。詳見內文。相較於Gammagard對照抗體，該嵌合 性抗Axl抗體chmllD5及本發明之人化抗Axl抗體h#llD5-T2、 h#l1D5-T3 ' h#l1D5-T4 > h#llD5-T5及 h#llD5-T6能 阻斷或顯著降低Gas6媒介之Axl活化，如經Gas6刺激之細 胞中Axl酪胺酸磷酸化程度相較於對應之未經剌激細胞降 低所示。 圖3 0A :人Axl ( NCBI蛋白質資料庫登錄號P_30530) 之胺基酸序列。 圖3 0B :大鼠抗人Axl單株抗體1 1B7之輕鏈可變區的 胺基酸序列。 圖3 0C :大鼠抗人Axl單株抗體1 1B7之重鏈可變區的 胺基酸序列。 170- 201105348 圖3 0D:大鼠抗人Axl單株抗體11D5之輕鏈可變區的 胺基酸序列。 圖30E:大鼠抗人Axl單株抗體11D5之重鏈可變區的 胺基酸序列。
圖31 :比較大鼠及嵌合抗Axl抗體對Axl磷酸化之效應 的ELISA實驗。CaSki子宮頸癌細胞係經飢餓處理，以50 奈克/毫升、奈克/毫升、3 00奈克/毫升、75 0奈克/毫升 、1微克/毫升及1〇微克/毫升之大鼠抗Axl抗體11B7(A) 或嵌合性抗Axl抗體chll B7(B)預先培養，經400奈克/ 毫升之mGas6處理或不經處理，然後溶解。溶解物被轉移 至抗-磷-酪胺酸抗體4G10-包覆之Maxi-Sorp 96孔板。之後 ，孔板經過清洗並與0.5微克/毫升之生物素基化大鼠抗 Axl抗體12B7、AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白及AttoPhos受 質溶液培養以收集螢光強度。詳見內文。如子宮頸癌細胞 系CaSki中相對Axl磷酸化之濃度依賴性降低所示，本發明 之大鼠抗Axl抗體1 1B7 ( A )及嵌合性抗Axl抗體chi 1B7 ( B )能以類似程度阻斷配體誘導之受體酪胺酸激酶Axl之活 化。 圖32A:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之輕 鏈的人化可變區之胺基酸序列，分別稱爲h#l 1B7-T1 5L及 h#l1B7-T18L。 圖32B:此圖說明大鼠抗人AXL單株抗體#11B7之重鏈 的人化可變區之胺基酸序列，分別稱爲h#llB7-TllH及 h#l1B7-T12H 。 -171 - 201105348 圖33:此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#llB7-T28至 h#llB7-T31之結合活性，使用人AXL-Fc包覆板（ELISA) 由E LI S A測定。 圖34 :此圖描述大鼠抗人AXL人化抗體h#llB7-T28至 h#l 1B7-T3 1之蛋白質濃度，以HPLC測定（見實施例24 ) 圖35(1)至35 (32):這些圖式說明大鼠抗人AXL 人化抗體h#llB7-Tl至h#llB7-T31及嵌合性h#llB7抗體之 Tm測定，使用微差掃描熱卡計（DSC )測定。 圖36:探討人化11B7抗Axl抗體對Axl受體磷酸化之效 應的£1^13八實驗。^5 7 8 1[乳癌細胞（上）及1^(：1-日292肺癌 細胞（下）係經飢餓處理，以無抗體或1 〇微克/毫升之 Gammagard對照抗體及本發明之人化抗Axl抗體1 1B7-T5、 11B7-T6、 11B7-T11、 11B7-T23及 11B7-T25預先培養，經 400奈克/毫升之mGas6處理或不經處理，然後溶解。溶解 物被轉移至抗-磷-酪胺酸抗體4G10-包覆之Maxi-Sorp 96孔 板，該板接著經過清洗並與0.1 25微克/毫升之生物素基化 大鼠抗Axl抗體12B7、AP共軛之鏈黴抗生物素蛋白及 AttoPhos受質溶液培養以收集螢光強度。詳見內文。相較 於Gammagard對照抗體，本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5 、11B7-T6、11B7-T11、11B7·T23及 11B7-T25在二種細胞 系中顯著降低Gas6媒介之Axl活化，如經Gas6刺激之細胞 中Axl酪胺酸磷酸化程度相較於對應之未經刺激細胞降低 所示。 -172- 201105348 圖37:探討人化11B7抗Axl抗體對Akt激酶磷酸化之效 應的ELISA實驗。HS5 78T乳癌細胞（上）及NCI-H292肺癌 細胞（.下）係經飢餓處理，以無抗體或1 〇微克/毫升之 Gammagard對照抗體及本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、 11B7-T6、 11B7-T11、 11B7-T23及 11B7-T25預先培養，經
400奈克/毫升之mGaS6處理或不經處理，然後以甲醛固定 。細胞經過清洗、淬熄（quenched )並與抗-磷-Akt ( Ser473 ) —級抗體、HRP共軛之抗兔二級抗體及四甲基聯 苯胺溶液培養以測量吸光強度。詳見內文。相較於 Gammagard對照抗體，本發明之人化抗Axl抗體11B7-T5、 11B7-T6、 11B7-T11 、 11B7-T23及 11B7-T25在二種細胞系 中能阻斷或降低Gas6媒介之Akt激酶活化，如經Gas6刺激 之細胞中Akt ( Ser473 )磷酸化程度相較於對應之未經刺 激細胞降低所示。 圖38:探討人化11B7抗Axl抗體對Axl受體內化之效應 φ .的FACS分析。Hs5 7 8T乳癌細胞係經飢餓處理，以無抗體 或1 〇微克/毫升之Gammagard對照抗體及本發明之人化抗 Axl 抗體 11B7-T5、11B7-T6、11B7-T11 ' 11B7-T23 及 1 1B7-T2 5培養所示時間’然後以甲醛固定。細胞係經大鼠 抗Axl單株抗體2A1—級抗體及PE共軛之驢抗大鼠IgG二級 抗體染色，然後進行FACS分析。詳見內文。與 Gammagard對照抗體不同的是，以人化抗Αχί抗體11B7-T5 、11B7-T6、 11B7-T11、 11B7-T23及 11B7-T25處理 Hs578T 乳癌細胞導致Axl受體之內化。此圖顯示相對Αχί表現程度 -173- 201105348 之百分比，其係定義爲在個別處理時間時經抗Axl單株抗 體處理樣本相較於未經處理樣本之平均螢光強度。 圖39 A + B:探討人化11B7抗Axl抗體對Gas6誘導之內 皮細胞芽生之效應的球體式細胞性血管新生測定法。經 VEGF-A預處理之HUVEC球體細胞係包埋於3D膠原蛋白凝 膠中，以1微克/毫升之人Gas6刺激，並經所示濃度之 Gammagard對照抗體及本發明之人化抗Axl抗體1 1B7-T5、 11B7-T6、 11B7-T11、 11B7-T23及 11B7-T25處理24小時。 分析各資料點10個隨機選擇球體之累積發芽長度的平均値 ± S EM (左圖），並測定抗體之相對抑制作用（右圖）。 IC50曲線之擬合及IC5〇數値之計算係利用GraphPad Prism 4.03進行。詳見內文。 序列說明 [SEQ ID NO: 1]用於放大片段A之引子的核苷酸序列 ，稱爲引子EFF1
[SEQ ID NO : 2]用於放大片段A之引子的核苷酸序列 ，稱爲引子EFsmaR
[SEQ ID NO: 3]片段B之核苷酸序列，其包含分泌信 號及人/C鏈之固定區及添加多聚（A)之信號 [SEQ ID NO: 4] DNA片段之核苷酸序列，其包含編 碼人IgG 1之信號序列及固定區的胺基酸序列之核苷酸序列 [SEQ ID NO: 5]編碼 h#llB7-TlL信號序列（1-60) 、可變區（61-387)、固定區（388-702)之胺基酸序列 -174- 201105348
的核苷酸序列 [SEQ ID NO : 6] 、可變區（61-387)、 的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 7] 、可變區（ 61-387)、 的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 8] 、可變區（ 61-387)、 的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 9] 、可變區（6 1 -3 8 7 ) ' 的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 10] )、可變區（ 61-387) 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 11] )、可變區（ 61-387) 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO : 12] )、可變區（ 61-387) 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 13] )、可變區（6 1 -3 8 7 ) 編碼h#l 1B7-T2L信號序列 固定區（ 388-702)之胺 編碼h#l 1B7-T3L信號序列 固定區（ 388-702)之胺 編碼h#l 1B7-T4L信號序列 固定區（ 388-702)之胺 編碼h#l 1B7-T5L信號序列 固定區（ 388-702)之胺 編碼h#l 1 B7-T6L信號序 、固定區（3 8 8- 702 )之 編碼h#l 1B7-T7L信號序 、固定區（3 8 8- 702 )之 編碼h#l 1B7-T8L信號序 、固定區（3 8 8- 702 )之 編碼h#l 1B7-T9L信號序 、固定區（3 8 8 - 702 )之 1-60 ) 酸序列 (1 -60 ) 酸序列 1 -60 ) 酸序列 1 -60 ) 酸序列 (1-60 基酸序 (1-60 基酸序 (1-60 基酸序 (1-60 基酸序 -175- 201105348 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 1 4]編碼 h#llB7-T10L 信號序列（1-60 )、可變區（61-387)、固定區（388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 15]編碼 h#llB7-TllL 信號序列（1-60 )、可變區（61-387)、固定區（388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 16]編碼 h#llB7-T12L 信號序列（1-60 )、可變區（61-387)、固定區（388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 17]編碼 h#llB7-T13L信號序列（1-60 )、可變區（61-387)、固定區（388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO : 18] h#l 1B7-T1L信號序列（1-20 )、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 19] h#llB7-T2L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 20] h#llB7-T3L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 21] h#llB7-T4L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 22] h#llB7-T5L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 23] h#llB7-T6L信號序歹!1 (卜 20)、可 -176- 201105348 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO ： 24] h#llB7-T7L 信號序歹丨J ( 1 -20 )、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 25] h#llB7-T8L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 26] h#llB7-T9L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列
[SEQ ID NO: 27] h#llB7-T10L信號序列（1-20)、 可變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 28] h#llB7-TllL 信號序列（1-20)、 可變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 29] h#UB7-T12L 信號序列（1-20)、 可變區（21-129)、固定區（130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 30] h#llB7-T13L信號序列（1-20) ' 可變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO ： 31]編碼 h# 1 1 B 7 -T 1 Η 信號序列（1 -5 7 )、可變區（58-396)、固定區（ 397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 0£(5 1〇>^〇:3 2]編碼11#1137-丁2}1信號序列（卜5 7 )、可變區（ 58-396)、固定區（ 397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 33]編碼 h#llB7-T3H信號序列（1-57 )、可變區（ 58-396)、固定區（ 397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 -177- 201105348 [SEQ ID NO : 3 4]編碼 h# 1 1 B 7-T4H 信號序列（1 - 5 7 )、可變區（ 58-396)、固定區（397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 35]編碼 h#llB7-T5H 信號序列（1-57 )、可變區（ 58-396)、固定區（397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 36]編碼 h#llB7-T6H 信號序列（1-57 )、可變區（ 58-396)、固定區（397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 37]編碼 h#llB7-T7H 信號序列（1-57 )、可變區（ 58-396) '固定區（ 397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 38]編碼 h#llB7-T8H 信號序列（1-57 )、可變區（ 58-396)、固定區（ 397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 39]編碼 h#llB7-T9H信號序列（1-57 )、可變區（ 58-396)、固定區（ 397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 40] h#llB7-TlH 信號序列（1-19)、可 變區（20-132)、固定區（133_462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 41] h#llB7-T2H信號序列（1-19)、可 變區（ 20-132)、固定區033-462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 42] h#llB7-T3H信號序列（1-19)、可 變區（20-132)、固定區（ 133-462)之胺基酸序列 -178- 201105348 [SEQ ID NO: 43] h#llB7-T4H 信號序列（1-19)、可 變區（20-132)、固定區（133-462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 44] h#l 1 B7-T5H信號序列（1-19 )、可 變區（20-132)、固定區（133-462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 45] h#llB7-T6H信號序列（1-19)、可 變區（20-132)、固定區（133-462)之胺基酸序列
[SEQ ID NO: 46] h#UB7-T7H信號序列（1-19)、可 變區（20- 1 32 )、固定區（1 33 -462 )之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 47] h#llB7-T8H信號序列（1-19)、可 變區（20- 1 32 )、固定區（1 33-462 )之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 48] h#llB7-T9H信號序列（1-19)、可 變區（ 20-132)、固定區（133_462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 49]編碼 h#llD5-TlL 信號序列（1-60 )、可變區（ 61-387)、固定區（ 388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 5〇]編碼 h#llD5-T2L 信號序列（1-60 )、可變區（61-387)、固定區（ 388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO : 5 丨]編碼 h#llD5-T3L 信號序列（1-60 )、可變區（ 61-387)、固定區（ 388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO ： 52]編碼 h # 1 1 D 5 - T 4 L 信號序列（1 - 6 0 )、可變區（61-387)、固定區（388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 -179- 201105348 [SEQ ID NO : 53]編碼 h#llD5-T5L 信號序列（1-60 )、可變區（61-387)、固定區（388-702)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 54]編碼 h#llD5-T6L 信號序列（1-60 )、可變區（ 61-387)、固定區（388-702)之B女基酸序 列的核苷酸序列
[SEQ ID NO: 55] h#llD5-TlL 信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 56] h#llD5-T2L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 57] h#llD5-T3L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 58] h#llD5-T4L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列
[SEQ ID NO: 59] h#llD5-T5L信號序列（1-20)、可 變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 60] h#llD5-T6L信號序歹丨J ( 1-20)、可 變區（2卜129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [SEQ ID NO ： 6 1]編碼 h#llD5-TlH 信號序列（1-57 )、可變區（ 58-396)、固定區（397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 62]編碼 h#llD5-T2H 信號序列（1-57 )、可變區（ 58-396)、固定區（ 397-1386)之胺基酸序 列的核苷酸序列 -180-
201105348 [SEQ ID NO: 63]編碼 h#llD5-T3H 信號序列 )、可變區（58-396)、固定區（397-1386)之胺I 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 64]編碼 h#llD5-T4H 信號序列 )、可變區（58-396)、固定區（397-1386)之胺差 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 65]編碼 h#llD5-T5H 信號序列 )、可變區（58-396)、固定區（397-1386)之胺· 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 66]編碼 h#llD5-T6H 信號序列 )、可變區（ 58-396)、固定區（ 397-1386)之胺3 列的核苷酸序列 [SEQ ID NO ·· 6 7] h#l 1D5-T1H信號序列（1-19) 變區（20-132)、固定區（ 133-462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 68] h#llD5-T2H信號序歹IJ ( 1-19) 變區（20-132)、固定區（ 133-462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 69] h#llD5-T3H信號序歹IJ ( 1-19) 變區（20-132)、固定區（ 133-462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 70] h#llD5-T4H信號序歹!J ( 1-19) 變區（ 20-132)、固定區（ 133-462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 71] h#llD5-T5H信號序列（1-19) 變區（2 0- 132)、固定區（ 1 33-462 )之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 72] h#llD5-T6H信號序列（1-19) 變區（20- 1 3 2 )、固定區（1 3 3 -462 )之胺基酸序列 (1-57 &酸序 (1-57 ε酸序 (1-5 7 g酸序 (1-57 g酸序 、可 、可 、可 、可 ' 可 ' 可 -181 - 201105348
[SEQ ID NO : 73] h#l 1B7-T14L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 74] h#l 1B7-T15L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 75]h#llB7-T16L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 76]h#llB7-T17L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 77] h#llB7-T18L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO ： 78] h#l 1B7-T19L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 7 9] h#llB7-T2 0L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 8 0]h#llB7-T10H可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 81]h#llB7-TllH可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 82]h#llB7-T12H可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 83] h#llD5-T7L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 84]h#llD5-T8L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 85]h#llD5-T9L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 86]h#llD5-T10L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 87]h#llD5-TllL可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 8 8] h#l 1D5-T12L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 89]h#llD5-T13L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 90] h#llD5-T14L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 91] h#llD5-T15L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 92] h#llD5-T16L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 93] h#llD5-T17L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 94] h#llD5-T18L可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 95]h#llD5-T19L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 96] h#llD5-T20L可變區之胺基酸序列 -182- 201105348
[SEQ ID NO: 97] h#llD5-T2 1L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 98] h#llD5-T22L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 99] h#llD5-T23L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 100] h#llD5-T24L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO ： 101]h#llD5-T25L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 102] h#llD5-T26L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 103] h#llD5-T27L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO ： 104] h#llD5-T28L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 105] h#llD5-T29L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO ·_ 106] h#llD5-T30L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 107] h#llD5-T31L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 108] h#llD5-T32L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 109] h#llD5-T33L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 110] h#llD5-T34L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 111] h#llD5-T35L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 112] h#llD5-T36L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 113] h#UD5-T37L可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 114] h#llD5-T7H可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 115] h#llD5-T8H可變區之胺基酸序列 [SEQIDNO: 116]h#llD5-T9H可變區之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 117] h#llD5-T10H可變區之胺基酸序 [SEQ ID NO: 118] h#llD5-TllH可變區之胺基酸序 列 -183- 201105348 [SEQ ID NO: 119] h#llD5-T12H可變區之胺基酸序 列 [SEQ ID NO: 120] h#llD5-T13H可變區之胺基酸序 列
[SEQ ID NO: 121] 11B7輕鏈CDRL4之胺基酸序歹IJ [SEQ ID NO: 122] 11B7輕鏈CDRL5之胺基酸序歹IJ [SEQ ID NO: 123] 11B7輕鏈CDRL6之胺基酸序歹IJ [SEQIDNO: 124] 11B7重鏈CDRH1之胺基酸序列 [SEQIDNO: 125] 11B7重鏈CDRH2之胺基酸序列 [SEQIDNO: 126] 11B7重鏈CDRH3之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 127] 11D5輕鏈CDRL4之胺基酸序歹IJ [SEQ ID NO: 128] 11D5輕鏈CDRL5之胺基酸序列 [SEQIDNO: 129] 11D5輕鏈CDRL6之胺基酸序列 [SEQIDNO: 130] 11D5重鏈CDRH1之胺基酸序列 [SEQIDNO: 131] 11D5重鏈CDRH2之胺基酸序歹IJ [SEQIDNO: 132] 11D5重鏈CDRH3之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 133]前導序列之核苷酸序列 [SEQ ID NO : 134]前導序列之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 135] #11B7嵌合輕鏈之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 136] #11B7嵌合重鏈之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 137] #11D5嵌合輕鏈之胺基酸序列 [SEQ ID NO : 138] #11D5嵌合重鏈之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 139]人Axl(NCBI蛋白質資料庫登錄 號？_3 05 3 0 )之胺基酸序列，亦描述於圖30A -184- 201105348 [SEQ ID NO: 140]大鼠抗人Axl單株抗體11B7輕鏈 可變區之胺基酸序列，其亦描述於圖30B且係與嵌 合輕鏈（SEQ ID NO: 135)之胺基酸1至108的胺基酸序 列相同 [SEQ ID NO: 141]大鼠抗人Axl單株抗體11B7重鏈 可變區之胺基酸序列，其亦描述於圖30C且係與#1!B7嵌 合重鏈（SEQ ID NO: 136)之胺基酸1至113的胺基酸序
列相同 [SEQ ID NO: 142]大鼠抗人Axl單株抗體11D5輕鏈 可變區之胺基酸序列，其亦描述於圖30D且係與#11D5嵌 合輕鏈（SEQ ID NO: 137)之胺基酸1至108的胺基酸序 列相同 [SEQ ID NO: 143]大鼠抗人Axl單株抗體11D5重鏈 可變區之胺基酸序列，其亦描述於圖30E且係與#1 1D5嵌 合重鏈（SEQ ID NO: 138)之胺基酸1至113的胺基酸序 列相同 [SEQ ID NO ： 144]編碼 h # 1 1 B 7 - T 1 5 L 信號序列（1-60)、可變區（ 6 1 -3 8 7 )、固定區（ 3 8 8-702 )之胺基酸 序列的核苷酸序列 [SEQ ID NO: 145]編碼 h#llB7-T18L 信號序列（1-60)、可變區（61-387)、固定區（ 388-702)之胺基酸 序列的核苷酸序列 [SEQ ID NO : 146] h#l 1 B7-T1 5L信號序歹IJ ( 1-20 )、 可變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 -185- 201105348 [sEQ ID NO: 147] h#llB7-T18L信號序列（1-20)、 可變區（21-129)、固定區（ 130-234)之胺基酸序列 [sEq ID NO: 148]編碼 h#llB7-TllH 信號序列（1-57)、可變區（ 58-396)、固定區（ 397-1386)之胺基酸 序列的核苷酸序列 [sEQ ID NO: 149]編碼 h#llB7-T12H 信號序列（1-57)、可變區（ 58-396)、固定區（397-1386)之胺基酸 序列的核苷酸序列 [S E Q ID Ν Ο : 1 5 0 ] h # 1 1 B 7 - T 1 1 Η 信號序歹 IJ ( 1 -1 9 )、 可變區（ 20-132)、固定區（ 133-462)之胺基酸序列 [SEQ ID NO: 15 1] h#llB7-T12H信號序歹lj ( 1-19)、 可變區（20-132)、固定區（ 133-4 62 )之胺基酸序列 -186- 201105348 861871 序列表 <110> U3醫藥公司 <]20>人化AXL抗體類 <130> 45430P TW <160> 169 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 弓[子EFF1 <400> 1 28 30 ccacgcgccc tgtagcggcg cattaagc
<210> 2 <211> 30 <212> DNA <213>人工 <220> _ <223> 弓[子EFsmaR <400> 2 aaacccggga gctttttgca aaagcctagg <210〉 3 <211> 1704 <212> DNA <213>智人 <400> 3 ggtaccaccc aagctggcta ggtaagcttg ctagcgccac catggtgctg cagacccagg 60 tgttcatctc cctgctgctg tggatctccg gcgcatatgg cgatatcgtg atgattaaac 120 gtacggtggc cgccccctcc gtgttcatct tccccccctc cgacgagcag ctgaagtccg 180
gcaccgcctc cgtggtgtgc ctgctgaata acttctaccc cagagaggcc aaggtgcagt 240 ggaaggtgga caacgccctg cagtccggga actcccagga gagcgtgacc gagcaggaca 300 gcaaggacag cacctacagc ctgagcagca ccctgaccct gagcaaagcc gactacgaga 360 agcacaaggt gtacgcctgc gaggtgaccc accagggcct gagctccccc gtcaccaaga 420 gcttcaacag gggggagtgt taggggcccg tttaaacggg tggcatccct gtgacccctc 480 cccagtgcct ctcctggccc tggaagttgc cactccagtg cccaccagcc ttgtcctaat 540 aaaattaagt tgcatcattt tgtctgacta ggtgtccttc tataatatta tggggtggag 600 gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta 660 ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg 720 ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac 780 caggctcacc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct 840 ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt 900 acaggcgtga accactgctc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 960 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 1020 201105348 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 1080 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 1140 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 1200 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 1260 cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 1320 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1380 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1440 agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1500 tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 1560 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1620 cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1680 aggcttttgc aaaaagctcc cggg 1704 <210> 4 <211> 1120 <212> DNA <213>智人 <400> 4 tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg 60 ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg gttagctcag cctccaccaa gggcccaagc 120 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctggcg gcacagccgc cctgggctgc 180 ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg accgtgagct ggaactcagg cgccctgacc 240 agcggcgtgc acaccttccc cgctgtcctg cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 300 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 360 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 420 acatgcccac cctgcccagc acctgaactc ctggggggac cctcagtctt cctcttcccc 480 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 540 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 600 cataatgcca agacaaagcc ccgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 660 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 720 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg ccagccccgg 780 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 840 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 900 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 960 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcagggcaa cgtcttctca 1020 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacaccc agaagagcct ctccctgtct 1080 cccggcaaat gagatatcgg gcccgtttaa acgggtggca 1120 <210〉 5 <211> 702 <212> DNA <213>人工 201105348 <220> <223> h#llB7-TlL 輕鏈(DNA) <220> <221> misc feature <222> (1).:(60) <223> 信號序列 <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 5 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60
gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggtacca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgct gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaaccggatc tggcaccgac ttcaccttca ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggcgga 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 6 <211> 702 <212> mk <213> ΛΧ <220> <223> h#llB7-T2L 麵(DNA) <220> <221> mi sc feature <222> (1)..(60) <223> mmmm <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 6 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 201105348 cggttctctg gaaccggatc tggcaccgac tacaccttca ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggcgga 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210〉 7 <211> 702 <212> DNA <213> ΛΧ <223> h#llB7-T3L 輕鏈(DNA) <220〉 <221> misc feature <222> (1)..(60) <223>禧號序列 <220〉 <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221〉 C region <222> (388)..(702) <400> 7 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagccggtc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggcgga 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 8 <211> 702 <212> DNA <213> ΛΧ <220> <223>
h#llB7-T4L 輕鏈(DNA) • 4_ <220> 201105348 <221> misc feature <222> (1).7(60) <223> 槍號序列 <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 8
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggtacca gcagaagcct ggaaaggccc ctaagctgct gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac ttcaccctga ccatcagctc tctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt <210> <211> <212> <213〉 <220> <223> 9 702 DNA人工 h#llB7-T5L 輕鏈(DNA) <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <220> <221> <222> misc feature (1).7(60)信號序列 V.region (61)..(387) C region (388)..(702) 9 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag ggcaccaagc tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc <400〉 201105348 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 10 <211> 702 <212> <213> DNA AX <220> <223> h#llB7_T6L 輕鏈(DNA) <220> <221> misc feature <222> (1).7(60) <223> 信號序列 <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 10
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 11 <211> 702 <212> DNA <213> Ai <220> <223> h#llB7-T7L 輕鏈(DNA) <220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) •信號序列 <220> <221> V^region 201105348 <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 11 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggtacca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 12 <211> 702 <212> DNA <213> AX <223> h#llB7-T8LM(DNA) <220> <221> misc—feature <222> (1)..(60) <223>信號序列 <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 12 60 120 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgct gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac tacaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 201105348
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 13 <211> 702 <212> DNA
<213> AX <223> h#llB7-T9L 輕鏈(DNA) <220> <221> misc feature <222> (1)..(60) <223>信號序列 <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 13 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggttcca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac ttcaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 14 <211> 702 <212> DNA <213> ΛΧ <220〉 <223> h#llB7-T10L@^(DNA) <220> misc feature
<221> <222> <223> <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_rcgion <222> (388)..(702) 201105348 <400> 14 atggtgctgc gacatccaga atcacctgtc ggaaaggccc cggttctctg gaggacttcg ggcaccaagg tccgacgagc cccagagagg gagagcgtga ctgagcaaag ctgagctccc agacccaggt tgacccagag gggccagcca ctaagctgct gaagcggatc ccacctacta tggagatcaa agctgaagtc ccaaggtgca ccgagcagga ccgactacga ccgtcaccaa gttcatctcc ccctagctct ggacatcggc gatcagcggc tggcagcgac ctgtctgcag gcgtacggtg cggcaccgcc gtggaaggtg cagcaaggac gaagcacaag gagcttcaac ctgctgctgt ctgagcgcct aactacctga gccaccaacc tacaccctga agcaaggagt gccgccccct tccgtggtgt gacaacgccc agcacctaca gtgtacgcct aggggggagt ggatctccgg ctgtgggcga gatggtacca tggccgccgg ccatcagctc ctccttggac ccgtgttcat gcctgctgaa tgcagtccgg gcctgagcag gcgaggtgac gt cgcatatggc ccgggtgacc gcagaagcct cgtgcctagc tctgcagcct cttcggccag cttccccccc taacttctac gaactcccag caccctgacc ccaccagggc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 702
<210> 15 <211> 702 <212> DNA <213> AT <223> h#llB7-TllL@M(DNA) <220〉 <221> mi sc_feature <222> (1)..(60)•信號序列 <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400〉 15 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga ggaaaggccc ctaagctgct gatcagcggc gccaccaacc cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac ttcaccctga gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt ggatctccgg ctgtgggcga gatggttcca tggccgccgg ccatcagctc ctccttggac ccgtgttcat gcctgctgaa tgcagtccgg gcctgagcag gcgaggtgac gt cgcatatggc ccgggtgacc gcagaagcct cgtgcctagc tctgcagcct cttcggccag cttccccccc taacttctac gaactcccag caccctgacc ccaccagggc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 702 <210> 16 201105348 <211> 702 <212> DNA <213> ΛΧ <220〉 <223> h#llB7-T12L 輕鏈(DNA) <220> <221> <222> <223> misc^feature <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C.region <222> (388)..(702) <400> 16 atggtgctgc agacccaggl gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggtacca gcagaagcct 180 ggaaaggccc ctaagctgat gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc 240 cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac ttcaccctga ccatcagctc tctgcagcct 300 gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210〉 17 <211> 702 <212> DNA <213>人工
<220> <223〉 h#llB7-T13L 輕鏈(DNA) <220> <221> misc feature <222> (1)..(60) •信號序列 <220> <221> V region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 17 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaga tgacccagag ccctagctct ctgagcgcct ctgtgggcga ccgggtgacc 120 atcacctgtc gggccagcca ggacatcggc aactacctga gatggtacca gcagaagcct 180 -10- 240 201105348 ggaaaggccc ctaagctgct gatcagcggc gccaccaacc tggccgccgg cgtgcctagc cggttctctg gaagcggatc tggcagcgac ttcaccctga ccatcagctc tctgcagcct gaggacttcg ccacctacta ctgtctgcag agcaaggagt ctccttggac cttcggccag ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt
300 360 420 480 540 600 660 702 <210> 18 <211> 234 <212> PRT <213> Χχ h#llB7-TlL 輕鏈(AA) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223>可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>齒定區 <400> 18
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<220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定虛 <400> 19
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Met lie Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 -12- 201105348
Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr lie Ser 85 90 95
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Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 20 <211> 234 <212> PRT <213>人工 <223> h#llB7-T3L 輕鏈(AA) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223>可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定窗 <400> 20
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 -13- 201105348 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Met lie Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys 100 105 110
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 21 <211> 234 <212> PRT <213> AX <223> h#llB7-T4L 輕鏈(AA) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222〉 （21),.(129) <223〉可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定區 <400〉 21
-14· 201105348
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Leu lie Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys 100 105 110
Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 22 <211> 234 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> h#llB7-T5L 輕鍵(AA) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220>
<221> SITE -15- 201105348 <222> (21)..(129) <223>可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定虛 <400> 22
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Met He Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys 100 105 110
Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 23 <211> 234 <212> PRT <213>入工 -16- 201105348 <220> <223> h#llB7-T6L 輕鏈(AA) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223〉可變區 <220〉 <221> SITE <222> (130)..(234) <223〉固萣虛 <400> 23
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Met lie Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys 100 105 110
Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 -17- 201105348
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210〉 24 <211> 234 <212> PRT <213>人工 <223> h#llB7-T7L 輕鏈(AA) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223>可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定區 <400〉 24
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Met lie Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys 100 105 110
Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 丁yr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr -18- 201105348 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 195 200
Ala Asp Tyr Glu 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin 210 215
Gly Leu Ser Ser220
Lys Pro
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210〉 <211〉 <212> <213> <220> <223> 輕8L T B7 hRTy· -2ρλ^ h <220><221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220〉 <221> SITE <222> (21)..(129) <223>可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234)<223>画定區 <400> 25 Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu 1 5 10
Leu Leu Trp lie 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser 20 25
Pro Ser Ser Leu 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 35 40
Arg Ala Ser Gin 45 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Phe Gin Gin Lys 50 55
Pro Gly Lys Ala 60
Lys Leu Leu lie Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala 65 70 75
Ala Gly Val Pro
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr 85 90
Thr Leu Thr lie 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 100 105
Cys Leu Gin Ser 110
Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys 115 120
Val Glu lie Lys 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro 130 135
Pro Ser Asp Glu 140
Ser Ser Asp Pro Ser 80 Ser Lys Arg Gin -19- 201105348
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210〉 26 <211> 234 <212〉 PRT <213>入工 <220〉 <223> h#llB7-T9L 輕鏈(AA) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223>可變區 <220> (234)
<221> SITE <222> (130).. <223>固走區
<400〉 26
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Met lie Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys -20- 201105348 100 105 110
Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 27 <211> 234 <212> PRT <213〉 人工 SS h#llB7-T10L 輕鏈(AA) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223〉可變區 <220〉 <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定齒 <400> 27
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<220> <221> misc_feature <222> (1)..(60) 〈奶〉信號序列 <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 52 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc gacatccaaa tgacccagag cccttccagc ctgtccgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggcctccca agacatcggc aactacctga gctggtacca gcaaaagcct ggcaaggccc ctaagagact tatctacggc gccatcaagc tggccgtggg agtgccttcc cggtttagcg gctccggcag cggcaccgag tttaccctga ccatctccag ccttcagcct gaggactttg ccacctacta ctgtctgcaa tacatccagt ttcctctgac ctttggcgga ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 60 120 180 240 300 360 420 480 -53- 201105348 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 53 <211> 702 <212> DNA <213> ΛΧ <223> h#llD5-T5L 輕鏈(DNA) <220> <221> misc—feature <222> (1)..(60) <223>捨號序列 <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 53 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gacatccaaa tgacccagag cccttccagc ctgtccgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120 atcacctgtc gggcctccca agacatcggc aactacctga gctggtttca gcaaaagcct 180 ggcaaggccc ctagacggat gatctacggc gccatcaagc ttgccgtggg agtgccttcc 240 agatttagcg gctccggcag cggcaccgac tacaccctga ccatctccag cctgcagcct 300 gaggactttg ccacctacta ctgtcttcaa tacatccagt ttcctctgac ctttggcgga 360 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 54 <211> 702 <212> DNA <213>人工 <223> h#llD5-T6L 輕鏈(DNA) <220> <221> misc feature <222> (1)..(60) •信號序列 <220> <221> V region <222> (61)..(387) -54- 201105348 <220> <221> C_region <222> (388)..(702) <400> 54
atggtgctgc agacccaggt gtlcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc gacatccaaa tgacccagag cccttccagc ctgtccgcca gcgtgggcga cagagtgacc atcacctgtc gggcctccca agacatcggc aactacctga gctggtttca gcaaaagcct ggcaaggccc ctagacggat gatctacggc gccatcaagc ttgccgtggg agtgccttcc agatttagcg gctccggcag cggcaccgac tacaccctga ccatctccag cctgcagcct gaggactttg ccacctacta ctgtcttcaa tacatccagt ttcctctgac ctttggccaa ggaaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt <210> 55 <211> 234 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 702 h#llD5-TlL 輕鏈(AA) <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223>可變區 <220〉 <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定區 <400> 55
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Glv Ala Tvr Gly Asp Val Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45
He Gly Asn Tvr Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Leu lie Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 55- 201105348
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr lie 100 105 110
Gin Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 56 <211> 234 <212> PRT <213>人工 <220> <223> h#llD5-T2L 輕鏈(AA)
<220〉 <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223>可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定區 <400> 56
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 -56- 201105348 lie Gly Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Arg Leu Met lie Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr lie 100 105 110
Gin Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Olu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230
<210〉 57 <211> 234 <212> PRT <213〉入工 h#llD5_T3L 輕鏈(AA) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222> (21)..(129) <223〉可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定區 <400〉 57 -57- 201105348
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn 丁yr Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Val Gly Lys Ser Pro 50 55 60
Arg Arg Met lie Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala lie Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr lie 100 105 110
Gin Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 58 <211> 234 <212> PRT <213> 人工 <220> <223> h#llD5-T4L 輕鏈(AA) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220>
<221> SITE -58- 201105348 <222> (21)..(129) <223>可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>画定齒 <400> 58
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro
Lys Arg Leu lie Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr lie 100 105 110
Gin Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
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<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220〉 <221> SITE <222> (21)..(129) <223〉可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223>固定區 <400> 59
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Arg Arg Met lie Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr lie 100 105 110
Gin Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala. Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 -60- 201105348
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 60 <211> 234 <212> PRT <213>人工 <220> <223〉h#llD5-T6L 輕鏈(AA) <220>
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <22\> SITE <222> (21)..(129) <223>可變區
<220〉 <22i> SITE <222> (130)..(234) <223>固定區 <400> 60
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 15 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Arg Arg Met lie Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr lie 100 105 110
Gin Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr -61- 201105348 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 61 <211> 1386 <212> DNA <213> AX <220> <223> h#llD5-TlH 重鏈(DNA)
<220> <221> mi sc_feature <222> (1)..(57) •信號序列 <220> <221> V_region <222> (58)..(396) <220> <221> C region <222> (297)..(1386) <400> 61 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccaa 60 gtgcaactgc aagagagcgg ccctggcctg gtgaagcctt cccaaaccct tagcctgacc 120 tgtaccgtga gcggctactc catcaccagc aactactggg gctggatcag acaacctcct 180 ggcatgggcc tggagtggat cggacacatc accaatagcg gcaacaccac ctacaatccc 240 tcccttaaga gccgggtgac catctccgtg gacaccagcg agaaccaatt ttccctgaag 300
ctgtcttccg tgacccctgc cgacaccgcc gtgtactact gtgccaaggg cgcctttgac 360 tactggggcc aaggaaccct tgtgaccgtg agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctggcggca cagccgccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 -62- 201105348 acctgcctgg tcaaaggctt cagcccgaga acaactacaa ctctacagca agctcaccgt tccgtgatgc atgaggctct ggcaaa ctatcccagc gacatcgccg gaccacccct cccgtgctgg ggacaagagc aggtggcagc gcacaaccac tacacccaga tggagtggga gagcaatggc actccgacgg ctccttcttc agggcaacgt cttctcatgc agagcctctc cctgtctccc 1200 1260 1320 1380 1386 <220> <223>
<210〉 62 <211> 1386 <212> DNA <213>人工 h#llD5-T2H 重鏈(DNA) <220〉 <221> misc feature <222> (1).7(57) 〈砂搶號序刿 <220> <221> V_region <222> (58)..(396) <220> <221> C_region <222> (297)..(1386) <400> 62 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag gtgcaactgc aagagagcgg ccctggcctg gtgaagcctt cccaaaccct tagcctgacc tgtaccgtgt ccggctacag catcacctcc aactactggg gctggatcag acaacctcct ggcatgggcc tggagtggat cggacacatc accaatagcg gcaacaccac ctacaatccc tcccttaaga gccggatctc catcagcgtg gacacctccg agaaccaatt tagcctgaag ctgtccagcg tgacccctgc cgacaccgcc gtgtactact gtgccaaggg cgcctttgac tactggggcc aaggaaccct tgtgaccgtg agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 -63- 1200 1260201105348 cagcccgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa 1320 1380 1386 <210> 63 <211> 1386 <212> DNA <213> ΛΧ <220> <223〉 h#llD5-T3H 重鏈(DNA) <220> <221> <222〉 <223> misc—feature (1)..(57) 號序列 <220〉 <221〉 V region <222> (58)..(396) <220> <221> C region <222> (297)..(1386) <400> 63 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag gtgcaactgc aagagagcgg ccctggcctg gtgaagcctt cccaaaccct tagcctgacc tgtaccgtgt ccggctacag catcacctcc aactactggg gctggatcag aaagtttcct ggcaacaaga tggagtggat cggacacatc accaatagcg gcaacaccac ctacaatccc tccctgaaga gccggatctc catcagccgg gacacctcca agaaccaatt tagccttaag ctgtccagcg tgacccctgc cgacaccgcc gtgtactact gtgccaaggg cgcctttgac tactggggcc aaggaaccct ggtgaccgtg agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc-64- 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320
201105348 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa <210> 64 <211> 1386 <212> <213〉 DNA ΛΧ <220> <223> h#llD5-T4H fiTONA) <220> <221> misc feature <222〉 (1)..(57) <223> 信號序列 <220> <221> V region <222> (58)..(396) <220> <221> C region <222> (297)..(1386) <400> 64 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccaa gtgcaactgc aacaatgggg cgccggcctg cttaagccta gcgagaccct gtccctgacc tgtaccgtga gcggctactc catcaccagc aactactggg gctggatcag acaacctcct ggcaagggcc ttgagtggat cggacacatc accaattccg gcaacaccac ctacaatccc agcctgaagt cccgggtgac catcagcaga gacacctcca agaaccaatt tagcctgaag ctttccagcg tgaccgccgc cgacaccgcc gtgtactact gtgccaaggg cgcctttgac tactggggcc aaggaaccct ggtgaccgtg agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacccaga agagcctctc cctgtctccc 1380 1386 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 -65- 1380 201105348 ggcaaa 1386 <210> 65 <211> 1386 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> h#llD5-T5H 重鏈(DNA) <220> <221> misc.feature <222> (1)..(57) •信號序列 <220> <221> V region <222> (58)..(396) <220> <221> C region <222> (297)..(1386) <400> 65 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag 60 gtgcaactgc aacaatgggg cgccggcctg cttaagccta gcgagaccct gtccctgacc 120 tgtaccgtga gcggctactc catcaccagc aactactggg gctggatcag acaacctcct 180 ggcaagggcc ttgagtggat cggacacatc accaattccg gcaacaccac ctacaatccc 240 agcctgaagt cccggatcag catctccaga gacaccagca agaaccaatt ttccctgaag 300 ctttccagcg tgaccgccgc cgacaccgcc gtgtactact gtgccaaggg cgcctttgac 360 tactggggcc aaggaaccct ggtgaccgtg agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc 420 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctggcggca cagccgccct gggctgcctg 480 gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc 540 ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc 1200 cagcccgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacccaga agagcctctc cctgtctccc 1380 ggcaaa 1386 -66-
201105348 <210> 66 <211> 13S6 <212> DNA <213>人工 <220> <223> h#llD5-T6H 重鏈(DNA) <220> <221> misc.feature <222> (1)..(57) 鲁信號序列 <220> <221〉 V region <222〉 （58)..(396) <220> <221> C_region <222> (297)..(1386) <400> 66 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagcgag gtgcaactgc aagagagcgg ccctggcctg gtgaagcctt ccgagaccct tagcctgacc tgtaccgtgt ccggctacag catcacctcc aactactggg gctggatcag acaacctcct ggcaagggcc tggagtggat cggacacatc accaatagcg gcaacaccac ctacaatccc tcccttaaga gccggatctc catcagcaga gacacctcca agaaccaatt tagcctgaag ctgtccagcg tgaccgccgc cgacaccgcc gtgtactact gtgccaaggg cgcctttgac tactggggcc aaggaaccct tgtgaccgtg agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa
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Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr lie Gin Phe Pro Leu 85 90 95
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Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Met lie 35 40 45
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Ser
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Tyr lie Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 -104- 201105348 <210> 126 <211> 5 <212> PRT <213>人工 <223> llB7fi^CDRH3 <400> 126
Thr Thr Phe Tyr Tyr
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<400> 127
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Ser Asn Tyr Trp Gly
<210> 131 <211> 16 <212> PRT 201105348 <213〉人工 <220> <223> 11D5 重鏈CDRH2 <400〉 131
His lie Thr Asn Ser Gly Asn Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 15 10 15 <210> 132 <211> 5 <212> PRT <213>人工 <220> <223> 11D5 重鏈CDRH3 <400> 132
Gly Ala Phe Asp Tyr <210> 133 <211> 51 <212> DNA <213>人工 <220> _ <223>前導序列撕_列） <400> 133 51
atgggtgaca atgacatcca ctttgccttt ctctccacag gtgtgcattc c <210> 134 <211> 17 <212> PRT <213>人工 <220> <223>前導序列（胺基鹏列） <400> 134
Met Gly Asp Asn Asp lie His Phe Ala Phe Leu Ser Thr Gly Val His 15 10 15
Ser <210> 135 <211> 214 <212> PRT <213>人工 <220> <223> #11B7嵌合輕鏈 <400> 135
Asp lie Gin Met Thr Gin Ala Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Gly Asn Tyr 20 25 30
Leu Arg Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Arg Leu Met lie 35 40 45 -106- 201105348
Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 SO
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Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 ' 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
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Glu Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser lie Thr Ser Asn 20 25 30
Tyr Trp Gly Trp lie Arg Lys Phe Pro Gly Asp Lys Met Glu Trp Met 35 40 45
Gly Tyr lie Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg lie Ser lie Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Phe Leu 65 70 75 80 -107- 201105348
Gin Leu Asn Ser Val Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 lie Thr Thr Phe Tyr Tyr Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser 100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr 145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 180 185 190
Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 225 230 235 240
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn 260 265 270
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 275 280 285
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Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser 305 310 315 320
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys 325 330 335
Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp 340 345 350
Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 355 360 365
Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu 370 375 380
-108- 201105348
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe 385 390 395 400
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 405 410 415
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr 420 425 430
Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 137 <211> 214 <212> PRT <213>人工 •<220> <223> #11D5嵌合輕鏈 <400> 137
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Ser Thr Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Gly Asn Tyr 20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Val Gly Lys Ser Pro Arg Arg Met lie 35 40 45
Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp Met Ala lie Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr lie Gin Phe Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly 115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140
Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin 145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 -109- 201105348
Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205
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Ser Arg lie Ser lie Ser Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gin Phe Phe Leu 65 70 75 80
Gin Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Lys Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Val Met Val Thr Val Ser 100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp 130 135 140
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Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr 165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin 180 185 190
Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 210 215 220
-110- 201105348
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Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro 230 235 240
Pro Lys Pro Lys
Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255
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Asn Lys Ala Leu
Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys 325 330 335
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Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly 405 410 415
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Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 440 <210> <211> <212> <213〉 97t>a 1388PR智 <400> 139 Met Gly Arg Val 1 Cys Met Ala Pro 20
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Leu Gly Glu Asp Glu Gin Asp Asp Trp lie Val Val Ser Gin Leu Arg 85 90 95 lie Thr Ser Leu Gin Leu Ser Asp Thr Gly Gin Tyr Gin Cys Leu Val 100 105 110
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Glu Gly Leu Pro Tyr Phe Leu Glu Glu Pro Glu Asp Arg Thr Val Ala 130 135 140
Ala Asn Thr Pro Phe Asn Leu Ser Cys Gin Ala Gin Gly Pro Pro Glu 145 150 155 160
Pro Val Asp Leu Leu Trp Leu Gin Asp Ala Val Pro Leu Ala Thr Ala 165 170 175
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Thr Ser Ser Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Ala Lys Gly Val Thr Thr 195 200 205
Ser Arg Thr Ala Thr lie Thr Val Leu Pro Gin Gin Pro Arg Asn Leu 210 215 220
His Leu Val Ser Arg Gin Pro Thr Glu Leu Glu Val Ala Trp Thr Pro 225 230 235 240
Gly Leu Ser Gly lie Tyr Pro Leu Thr His Cys Thr Leu Gin Ala Val 245 250 255
Leu Ser Asp Asp Gly Met Gly lie Gin Ala Gly Glu Pro Asp Pro Pro 260 265 270
Glu Glu Pro Leu Thr Ser Gin Ala Ser Val Pro Pro His Gin Leu Arg 275 280 285
Leu Gly Ser Leu His Pro His Thr Pro Tyr His lie Arg Val Ala Cys 290 295 300
Thr Ser Ser Gin Gly Pro Ser Ser Trp Thr His Trp Leu Pro Val Glu 305 310 315 320
Thr Pro Glu Gly Val Pro Leu Gly-Pro Pro Glu Asn lie Ser Ala Thr 325 330 335
Arg Asn Gly Ser Gin Ala Phe Val His Trp Gin Glu Pro Arg Ala Pro 340 345 350
-112- 201105348
Leu Gin Gly Thr Leu Leu Gly Tyr Arg Leu Ala Tyr Gin Gly Gin Asp 355 360 365
Thr Pro Glu Val Leu Met Asp lie Gly Leu Arg Gin Glu Val Thr Leu 370 375 380
Glu Leu Gin Gly Asp Gly Ser Val Ser Asn Leu Thr Val Cys Val Ala 385 390 395 400
Ala Tyr Thr Ala Ala Gly Asp Gly Pro Trp Ser Leu Pro Val Pro Leu 405 410 415
Glu Ala Trp Arg Pro Gly Glu Ala Gin Pro Val His Gin Leu Val Lys 420 425 430
Glu Pro Ser Thr Pro Ala Phe Ser Trp Pro Trp Trp Tyr Val Leu Leu 435 440 445
Gly Ala Val Val Ala Ala Ala Cys Val Leu lie Leu Ala Leu Phe Leu 450 455 460
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Tyr Ser Arg Arg Thr Thr Glu Ala Thr Leu Asn Ser Leu Gly lie Ser 500 505 510
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Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Ser 65 70 75 80
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Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp lie Gly Asn Tyr 20 25 30
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Tyr Gly Ala lie Lys Leu Ala Val Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Tyr Trp Gly Trp lie Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Met Glu Trp lie 35 40 45
Gly His lie Thr Asn Ser Gly Asn Thr Thr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60
Ser Arg lie Ser lie Ser Arg Asp Thr Ser Arg Asn Gin Phe Phe Leu 65 70 75 80
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Ser
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atcacatgta gggcatctca ggatatcggg aattacctta ggtggttcca gcaaaagccc 180 ggaaaagctc ccaaactgtt gatttctggg gccaccaatc ttgccgcagg ggtgccctca 240 aggttctccg ggtccggcag cggatccgat tataccttga caatttctag tttgcagcct 300 gaggatttcg caacttacta ctgtcttcag agcaaggaat ctccatggac cttcggacag 360 gggactaaac tcgaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 145 <211> 702 <212> DNA <213〉人工 h#llB7-T18L輕鏈 <220> <223> <220> <221> misc feature <222> (1)..(60) 愚信號序列 <220> <221> V_region <222> (61)..(387) <220> <221> C region <222> (388)..(702) <400> 145 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcatatggc 60 gatattcaga tgacacagag cccatcctcc cttagcgcat ccgttgggga tagagttacc 120 attacctgca gagccagcca ggacatcggc aactacctgc gctggttcca gcagaagcct 180 ggcaaagcgc ccaaactgct tatcagcgga gccacaaacc tggccgccgg tgtgccctct 240 -117- 201105348 cggttcagcg ggtctggcag cgggagcgat ttcactctta caatatcttc ccttcagccc 300 gaagatttcg cgacatatta ctgcttgcaa tccaaggaaa gtccctggac attcggccaa 360 ggaactaaac tggaaattaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480 cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600 ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660 ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702 <210> 146 <211> 234 <212> PRT <213>人工
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20 25 30
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Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys 100 105 110
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Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 147 <211> 234 <212> PRT <213>人工 <223> h#llB7-T18L@® <220〉
<221> SIGNAL <222> (1)..(20) <220> <221> SITE <222〉 （21)..(129) <223〉可變區 <220> <221> SITE <222> (130)..(234) <223〉固走區 <400> 147
Met Val Leu Gin Thr Gin Val Phe lie Ser Leu Leu Leu Trp lie Ser 1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Asp 35 40 45 lie Gly Asn Tyr Leu Arg Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro 50 55 60
Lys Leu Leu He Ser Gly Ala Thr Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ser 65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser 85 90 95 -119- 201105348
Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Lys 100 105 110
Glu Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 165 170 175
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 148 <211> 1386 <212> DNA <213〉人工 <220>
<221> misc feature <222> (1)..(57) <223>信號序列 <220> <221> V_region <222> (58)..(396) <220> <221> C.region <222> (397)..(1386) <400> 148 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60 gttcaactgc agcagtgggg tgctggtctg ttgaagccaa gtgaaacctt gtctctgacc 120 tgcacagtca gcggatatag tattacatct aactactggg gctggatcag acagccccct 180 ggcaaggggc tggagtggat ggggtatatt acgtattctg ggtcaacatc ttataatccc 240 tccctgaagt cccgcattac catcagccgc gacacttcca agaaccagtt ttcacttaag 300 ctgtctagcg taacagccgc ggacactgca gtgtattatt gcgctattac cactttctat 360 tattgggggc agggcacgac ggtaacggtg agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc 420 -120-
<220> <223> 201105348 ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagcccgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacccaga agagcctctc cctgtctccc ggcaaa <210> 149 <211> 1386 <212> DNA <213>人工 h#llB7-T12H 重鏈 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(57) <223>信號序列 <220> <221> V^region <222> (58)..(396) <220> <221> C region <222> (397)..(1386) <400> 149 atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag gttcagctgc aacagtgggg agctgggttg ctgaagccaa gtgaaaccct gtcccttaca tgtaccgtct ctggttacag tattacctcc aactactggg ggtggatcag acagcctcca ggtaaagggc tggagtggat aggatatatt acctattccg gctccacgtc ttataatcca tccctgaaat ctagggtgac catctctagg gacacttcaa aaaatcaatt tagcctcaaa ctttcttctg tcacagccgc cgataccgct gtctactact gtgcgatcac cacattuac tattggggcc aggggacaac agtgaccgtt agctcagcct ccaccaaggg cccaagcgtc ttccccctgg caccctcctc caagagcacc tctggcggca cagccgccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga acccgtgacc gtgagctgga actcaggcgc cctgaccagc 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1386 60 120 180 240 300 360 420 480 540 -121- 201105348
ggcgtgcaca ccttccccgc tgtcctgcag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg 600 gtgaccgtgc cctccagcag cttgggcacc cagacctaca tctgcaacgt gaatcacaag 660 cccagcaaca ccaaggtgga caagagagtt gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 720 tgcccaccct gcccagcacc tgaactcctg gggggaccct cagtcttcct cttcccccca 780 aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac 840 gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat 900 aatgccaaga caaagccccg ggaggagcag tacaacagca cgtaccgggt ggtcagcgtc 960 ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac 1020 aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc atctccaaag ccaaaggcca gccccgggaa 1080 ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg gaggagatga ccaagaacca ggtcagcctg 1140 acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc 1200 cagcccgaga acaactacaa gaccacccct cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc 1260 ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc aggtggcagc agggcaacgt cttctcatgc 1320 tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac tacacccaga agagcctctc cctgtctccc 1380 ggcaaa 1386 <210〉 150 <211> 462 <212> PRT <213>人工 <220> <223> h#llB7-TllH重鏈 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <220〉 <221> SITE <222> (20)..(132)
<223>可變區 <220> <221> SITE <222> (133)..(462) <223>面定區 <400> 150
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 15 10 15
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45
Thr Ser Asn Tyr Trp Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Met Gly Tyr He Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 65 70 75 80 -122- 201105348
Ser Leu Lys Ser Arg lie Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin 85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110
Tyr Cys Ala lie Thr Thr Phe Tyr Tyr Ττρ Gly Gin Gly Thr Thr Val 115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 180 185 190
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205
Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro 260 265 270
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 275 280 285
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320
Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330. 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 340 345 350
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val -123- 201105348 370 375 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445
Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210〉 151 <211> 462 <212> PRT <213>人工 <220> <223> h#llB7-T12應鏈 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <220> <221> SITE <222> (20)..(132) <223>可變區 <220> <221> SITE <222> (133),.(462) <223>固定區 <400> 151
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 15 10 15
Val Leu Ser Gin Val Gin Leu Gin Gin Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys 20 25 30
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser lie 35 40 45
Thr Ser Asn Tyr Trp Gly Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp lie Gly Tyr lie Thr Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro 65 70 75 80
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gin 85 90 95
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 -124- 201105348
Tyr Cys Ala lie Thr Thr Phe Tyr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val 115 120 125
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 130 135 140
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 145 150 155 160
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 165 170 175
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser 180 185 190
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 195 200 205
Gly Thr Gin Thr Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 210 215 220
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 225 230 235 240
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 245 250 255
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Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 290 295 300
Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 305 310 315 320
Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 325 330 335
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser 340 345 350
Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro 355 360 365
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 370 375 380
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Me Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 385 390 395 400
Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 405 410 415 -125- 201105348
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 420 425 430
Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 435 440 445
Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213>人工艺您引子Kappa_GSH <400> 152 gatggatgca ttggtgcagc <210〉 153 <211> 20 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> 引子 ne w_Kappa_GSP 1 <400> 153 atagatacag ttggtgcagc 20 <210> 154 <211> 19 <212> DNA <213>人工 <220〉 <223> 引子 heavy_GSPl <400> 154 cagggtcacc atggagtta 19 <210> 155 <211> 32 <212> DNA <213>人工 <220><223> 引子Xh〇l_hGSP2 <400> 155 ccgctcgagc gggccagtgg atagacagat gg
32
<210> 156 <211> 32 <212> DNA <213>人工 <220> i 一<223> 引子Xhol一kGSK <400> 156 ccgctcgagc ggccgtttca gctccagctt gg <210〉 157 -126- 32 21 201105348 <211> 21 <212> DNA <213>人工 <220> <223> 引子 RT-gamma <400> 157 gcgtgtagtg gttgtgcaga g
<210〉 158 <211> 16 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子 RT_gamma2 <400〉 158 gggcttgccg gccgtg 16 <210〉 159 <211> 20 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子 RT_kappa <400> 159 tggaactgag gagcaggtgg 20 <21〇> 160 <211> 39 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子5·Β1ρ <400〉 160 agataagctt tgctcagcgt ccaccaaggg cccatcggt 39
<210> 161 <211> 34 <212> DNA <213>人工 <223> 引子3，Bam(GAG) 34 <400> 161 agatggatcc tcatttaccc ggagacaggg agag <210> 162 <211> 39 <212> DNA <213> 人工 <220> <223> 引子5'Bsi <400> 162 agataagctt cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcat 39 <210> 163 <211> 36 <212> DNA <213>人工 -127- 201105348 <223> 引子3'Βμ((：ΤΤ) <400> 163 agatggatcc ctaacactct cccctgttga agctct 36 <210> 164 <211> 42 <212> DNA <213>人工 <220> <223> 引子 VL-11B7-5 <400> 164 agataagctt gtgcattccg acatccagat gacccaggct cc 42 <210> 165 <211> 33 <212> DNA <213〉人工 <220> <223>
引子 VL-11B7-3* <400> 165 agatcgtacg tttcagctcc agcttggtgc etc 33 <210> 166 <211> 45 <212> DNA <213>人工 <223> 引子VL-11D5-5* <400> 166 agataagctt gtgcattccg acatccagat gacccagtct ccatc 45 <210> 167 <211> 27 <212> DNA <213>人工 <223> 弓丨子VL-11D5-3* <400> 167 agatcgtacg tttcagcttg gtcccag
27 <210> 168 <211> 42 <212> DNA <213>人工 <220> <223> 引子 VH-llb7/llD5-5_ <400> 168 agataagctt gtgcattccg aggtgcagct teaggagtea gg <210> 169 <211> 36 <212> DNA <213>人工 <220> <223> 弓 I子VH-11B7/11D5-3, -128- 42 201105348 <400> 169 agatgctgag ctgacagtga ccatgactcc ttggcc 36
-129-

Claims (1)

  1. 201105348 七、申請專利範圍： 1 · 一種單株人化抗體，其與AXL之細胞外結構域結合 且至少部分地抑制AXL活性。 2 ·如申請專利範圍第1項之單株人化抗體，其減少及/ 或阻斷AXL媒介性信號傳導、AXL磷酸化、細胞增生、血 管新生、細胞遷移、腫瘤轉移及/或AXL媒介性抗細胞凋亡 作用。
    3 ·如申請專利範圍第2項之單株人化抗體，其減少及/ 或阻斷配體誘導之AXL下游傳訊分子（諸如ERK1/2、AKT ' GSK-3 β、TSC2、mTOR及/或 S6K1 )之磷酸化。 4.如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗體 ，該抗體係源自嵌合抗AXL抗體11B7(SEQ ID NO: 135, 136)或 11D5(SEQ ID NO: 137，138)中之一者，且該抗 體含有於11B7或UD5之至少一個可變結構域之架構區中之 至少一個突變。 5 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗體 ，其包含選自SEQ ID NO: 40至SEQ ID NO: 48之重鏈胺 基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有至少 9 0 %序列一致性之胺基酸序列， 或選自SEQ ID NO: 80至SEQ ID NO: 82之重鏈胺基 酸序列的可變結構域，或與彼等具有至少9 0 %序列一致性 之胺基酸序列， 及/或選自SEQ ID NO: 18至SEQ ID NO: 30之輕鏈胺 基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有至少 201105348 90%序列一致性之胺基酸序列， 或選自SEQ ID NO: 73至SEQ ID NO: 79之輕鏈胺基 酸序列的可變結構域，或與彼等具有至少9 0 %序列一致性 之胺基酸序列， 或彼等之片段，該片段辨識AXL之細胞外結構域上之 相同表位。 6 ·如申請專利範圍第5項之單株人化抗體，其係選自
    由 h#llB7-Tl 、 h#llB7-T2 、 h#llB7-T3 、 h#llB7-T4 、 h#11B7-T5 、 h#l1B7-T6 、 h#l1B7-T7 、 h#l1B7-T8 、 h#llB7-T9 、 h#llB7-T10 、 h#llB7-Tll 、 h#llB7-T12 、 h#llB7-T13 、 h#llB7-T14 、 h#llB7-T15 、 h#llB7-T16 、 h#llB7-T17 、 h#llB7-T18 、 h#llB7-T19 、 h#llB7-T20 、 h#l1B7-T2 1、h#l 1B7-T22、h#l 1B7-T23、h#l 1B7-T24、 h#l1B7-T25 、 h#l1B7-T26 、 h#llB7-T27或 h#llB7-T28所 組成之人化h#llB7抗體類。
    7 .如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗體 ，其包含選自SEQ ID NO: 67至SEQ ID NO: 72之重鏈胺 基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有至少 90%序列一致性之胺基酸序列， 或選自SEQ ID NO: 114至SEQ ID NO: 120之重鏈胺 基酸序列的可變結構域，或與彼等具有至少90%序列一致 性之胺基酸序列， 及/或選自SEQ ID NO: 55至SEQ ID NO: 60之輕鏈胺 基酸序列或至少彼等之可變結構域，或與彼等具有至少 -2- 201105348 90%序列一致性之胺基酸序列， 或選自SEQ ID NO: 83至SEQ ID NO: 113之輕鏈胺基 酸序列的可變結構域，或與彼等具有至少90%序列一致性 之胺基酸序列， 或彼等之片段，該片段辨識AXL之細胞外結構域上之 相同表位。 8.如申請專利範圍第7項之單株人化抗體，其係選自
    由 h#llD5-Tl 、 h#l1D5-T2 、 h#l1D5-T3 、 h#l1D5-T4 、 h#llD5-T5或h#llD5-T6所組成之人化h#llD5抗體類。 9.如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗體 ，其係與標記基團偶聯。 1 〇.如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗 體，其係與效應基團偶聯。 1 1. 一種經分離之核酸分子，其係選自： (a )編碼如申請專利範圍第1至1 0項中任一項之單株 人化抗體、抗體片段或彼之衍生物之核酸序列， (b )如選自 SEQ ID NO: 5 至 SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 31 至 SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO: 49 至 SEQ ID NO: 54 或 SEQ ID NO: 61 至 SEQ ID NO: 66 中之 SEQ ID NO之一者所示之核酸序列， (c )編碼選自 SEQ ID NO: 18 至 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 40 至 SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 55 至 SEQ ID NO: 60' SEQ ID NO: 66 至 SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 73 至 SEQ ID NO: 120 或 SEQ ID NO: ]2l 至 SEQ ID 201105348 NO: 132之多肽之核酸序列， (d )與（a )至（c )中任一者之序列互補之 或 (e )能在嚴謹條件下與（a ) 、 （ b ) 、 （ c ) )雜交且編碼多肽之核酸序列，其中包含該多肽之 彼之功能性片段與AXL之細胞外結構域結合。 1 2.—種載體，其包含如申請專利範圍第1 1項 分子。 1 3 .如申請專利範圍第1 2項之載體，其係表現 該核酸序列係與控制序列可操作地連接。 1 4 . 一種宿主，其包含如申請專利範圍第1 2或 載體。 1 5 .如申請專利範圍第Μ項之宿主，其係人、 動物、真菌、二棲動物或植物細胞。 16. 如申請專利範圍第14之宿主，其係非人基 動物。 17. —種製備如申請專利範圍第1至10項中任一 株人化抗體之方法，該方法包含自如申請專利範圍 I5或I6項之宿主獲得該多肽之步驟。 18. —種醫藥組成物，其包含人化抗AXL抗體， 如申請專利範圍第1至丨〇項中任—項之單株人化抗 申請專利範圍第1 1項之核酸分子，如申請專利範圍 13項之載體，如申請專利範圍第14、15或16項之宿 如申請專利範圍第1 7項之方法所產製之多肽。 核酸， 或（d 抗體或 之核酸 載體且 13項之 細菌、 因轉殖 項之單 第14、 較佳地 體，如 第12或 主，或
    -4 - 201105348 1 9 ·如申請專利範圍第i 8項之醫藥組成物，其包含醫 藥上可接受之載劑、稀釋劑及/或佐劑。 20.如申請專利範圍第18項之醫藥組成物，其包含其 他活性劑。 2 1 .如申請專利範圍第1 8至2 0項中任一項之醫藥組成 物，其係用於診斷、預防或治療過度增生性疾病。
    22.如申請專利範圍第18至20項中任一項之醫藥組成 物’其中該過度增生性疾病係與AXL表現、過度表現及/或 活性過高有關。 23.如申請專利範圍第22項之醫藥組成物，其中該過 度增生性疾病係選自乳癌、肺癌、其他AXL表現性或過度 表現性癌或腫瘤轉移形成。 2 4.如申請專利範圍第1至3項中任一項之單株人化抗 體，其係用於診斷、預防或治療過度增生性疾病。 25·—種如申請專利範圍第1至10項中任一項之單株人 化抗體於製備供診斷、預防或治療過度增生性疾病的醫藥 組成物之用途。 26.如申請專利範圍第25項之用途，其中該過度增生 性疾病係如申請專利範圍第22或23項所定義之過度增生性 疾病。 27.—種診斷與AXL表現有關之症狀之活體外方法，該 方法包含使樣本與如申請專利範圍第1至1 0項中任一項之 單株人化抗體接觸，及偵測AXL之存在。 28 .如申請專利範圍第27項之方法，其中該症狀係如 201105348 申請專利範圍第22或23項所定義之過度增生性疾病。 2 9 . —種套組，其包含抗A X L抗體，較佳地如申請專利 範圍第1至1 〇項中任—項之單株人化抗體，如申請專利範 圍第1 1項之核酸分子，或如申請專利範圍第1 2或1 3項之載 體。 30·如申請專利範圍第29項之套組，其另包含其他抗 腫瘤劑。
    3 1 .—種如申請專利範圍第1至1 0項中任一項之單株人 化抗體於製備供治療藥物抗性癌症的醫藥組成物之用途。 3 2 · —種如申請專利範圍第1至9項中任一項之單株人 化抗體於製備與抗腫瘤劑共同投予以治療過度增生性疾病 的藥物之用途。
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